KR102498068B1 - 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜, 그 제조 방법, 및 그 결합체 - Google Patents

분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜, 그 제조 방법, 및 그 결합체 Download PDF

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Abstract

식 (1)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 (X1 및 Y1은 각각 생체기능성 분자에 존재하는 관능기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 관능기를 적어도 포함하는 원자단을 나타내며, 단, 원자단 X1이 포함하는 상기 관능기와 원자단 Y1이 포함하는 상기 관능기는 서로 상이하고, n은 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 수를 나타내며, 6 내지 30의 정수이고, E는 L2에 대한 2가의 결합 가수 및 L3에 대한 1가의 결합 가수를 가지는 분기 부위이며, 글리세롤 부위를 나타내고, L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 또는 2가의 유기기를 나타내고, L3은 단결합, -L4-(CH2)m1- 또는 -L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-을 나타내고, L4는 에테르 결합, 아미드 결합 및 우레탄 결합 중 어느 하나를 나타내고, L5는 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 나타내고, m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수를 나타낸다.)

Description

분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜, 그 제조 방법, 및 그 결합체
본 발명은 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체 및 그 제조 방법, 및 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 결합체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 생체 기능성 고분자, 약물 수송계에 있어서의 약물 또는 약물 담체, 진단용 재료 또는 장치 등의 수식에 사용되며, 특히 항체-결합의약용 링커로서 유용한, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜에 관한 것이다.
근년, 의약품 분야에 있어서, 약제를 링커를 통해 항체와 결합시켜, 항원 제시 세포에 약물을 능동적으로 운반할 수 있는, 항체 결합의약(Antibody-Drug Conjugate: ADC)이 실용화되어 높은 주목을 끌고 있다(Toxins, 2011, 3, p. 848-883 (비특허문헌 1), J. Med. Chem., 2011, 54, p. 3606-3623 (비특허문헌 2)).
일반적으로 약제는 소수성인 것이 많기 때문에, ADC로서 사용했을 때에 응집이 생기는 일이 종종 있다. 따라서, 검토되고 있는 링커 중 하나가, 친수성 링커인 헤테로형 단분산 폴리에틸렌 글리콜이다.
헤테로형 단분산 폴리에틸렌 글리콜이란, 약제와 항체를 각각 양 말단에 구별하여 결합시키기 위해서, 양 말단에 서로 상이한 관능기를 가지며(헤테로형), 한편, 의약품 신청 및 ADC 제조, 정제, 분석을 간편하게 하기 위하여, 특정 에틸렌 글리콜 쇄장을 가지는 화합물이 90% 이상 포함되는 화합물을 의미한다.
상기 ADC에서는, 상기 헤테로형 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 링커로서 그 각 말단에 항체와 약제를 구별하여 결합시키기 위해, 상기 헤테로형 단분산 폴리에틸렌 글리콜 중에, 양 말단에 서로 같은 관능기들을 가지는 화합물(호모형 폴리에틸렌 글리콜 등)이 불순물로서 존재하면, 항체가 2개 결합한 화합물 또는 약제가 2개 결합한 화합물을 생성한다. 항체가 2개 결합한 화합물은, 약제가 결합하고 있지 않기 때문에 ADC의 효과를 나타내지 않는다. 약제가 2개 결합한 화합물은 항체가 결합하고 있지 않기 때문에 항원 제시 세포 이외의 개소에 운반되고 부작용을 일으키는 원인이 된다. 또한, 목적하는 관능기를 가지는 헤테로형 폴리에틸렌 글리콜과 다른 조합으로 관능기를 가지는 다른 헤테로형 화합물이 불순물로서 존재하는 경우도, 목적하는 항체 또는 목적하는 약제 중 하나가 결손한 화합물이 생성하기 때문에, 상기와 같은 문제가 또한 생긴다. 따라서, 약제의 사용 및 효과의 관점으로부터, 상기 헤테로형 단분산 폴리에틸렌 글리콜로서는, 그 양 말단에 서로 다른 관능기를 가지는 헤테로형 폴리에틸렌 글리콜을 고순도로 함유하는데, 즉 관능기 순도가 높은 것이 중요하다고 할 수 있다.
또한, 근년, 상기 ADC에 있어서 약물의 운반 효율을 향상시키는 것을 목적으로 하고, 항체에 대해서 복수개의 약제를 결합시킨 ADC를 사용하는 것이 바람직하며, 그 하나로서 분기형의 구조를 가지는 링커를 사용하는 방법이 시도되고 있다.
예를 들면, 특허문헌 1(US20130052130A1)에서는, 트리스히드록시아미노메탄(Tris)이나, 예를 들면, 리신 등의 아미노산으로 구성되는 분기 부위에 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 결합시키는 것으로, 상기 에틸렌 글리콜쇄가 3개 또는 4개 도입된 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜이 개시되고 있다.
또한, 특허 문헌 2(CN104530415A)에서는, 글리세롤 또는 티오글리세롤로 구성되는 분기 부위에 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 결합시키는 것으로, 상기 에틸렌글리콜쇄가 3개 도입된 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜이 개시되고 있다.
특허 문헌 1 및 특허 문헌 2에서 공통적으로, 분기 부위의 결합 지점의 모두에 단분산 폴리에틸렌 글리콜이 결합되고, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말단에 항체나 약물에 결합 가능한 관능기가 결합하고 있다. 이것을 하기와 같이 개략적으로 나타낼 수 있다:
(X-PEG1-)n-B-PEG2-Y
(식 중, X 및 Y는 각각 서로 상이한 관능기를 나타내고, n은 2 또는 3의 정수를 나타낸다. B는 분기 골격을 나타낸다. PEG1 및 PEG2는 각각 직쇄형 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 나타낸다.)
특허 문헌 1 및 특허 문헌 2에 있어서, 상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는 방법으로서는, 말단 관능기가 서로 다른 2 종류의 직쇄형 단분산 폴리에틸렌 글리콜(X-PEG1 및 PEG2-Y)을 준비하고, 우선 X-PEG1으로 분기 부위를 반응시키고, 그 후, PEG2-Y를 반응시키거나, 또는, 우선 PEG2-Y와 분기 부위를 반응시키고, 그 후, X-PEG1을 반응시키는 방법이 기재되어 있다. 우선 PEG2-Y를 분기 부위와 반응시키는 경우의 예를 하기 식에 나타낸다.
제1 단계
B + PEG2-Y → B-PEG2-Y
제2 단계
X-PEG1 + B-PEG2-Y → (X-PEG1-)n-B-PEG2-Y
(식 중, X 및 Y는 각각 서로 상이한 관능기를 나타내고, n은 2 또는 3의 정수를 나타낸다. B는 분기 부위를 나타낸다. PEG1 및 PEG2는 각각 직쇄형 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 나타낸다.)
상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조에 있어서, 제1 단계에서의 분기 부위 B와 PEG2-Y 사이의 반응에서는, 하기 식에 나타내는 바와 같이 PEG2-Y가 잔존할 가능성이 있다. 이 화합물은 목적하는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜과 단지 편말단만 같은 관능기를 가지고 있다. 따라서, 과잉을 첨가한 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 ADC의 제조에 이용하는 경우, 관능기 순도가 낮기 때문에, 목적하는 항체 또는 목적하는 약제 중 어느 하나를 결손한 화합물이 생성하여, 약제로서의 유효성이 저하하는 원인이 된다.
B + PEG2-Y → B-PEG2-Y + PEG2-Y
또한, 제2 단계에서의 X-PEG1와의 반응에서는, 하기 식에 나타내는 바와 같이 과잉을 첨가한 X-PEG1가 잔존할 가능성이 있다. 이 화합물은 목적하는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜과 단지 편말단만 같은 관능기를 가지고 있다. 따라서, 과잉을 첨가한 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 ADC의 제조에 이용하는 경우, 관능기 순도가 낮기 때문에, 목적하는 항체 또는 목적하는 약제 중 어느 하나를 결손한 화합물이 생성하여, 약제로서의 유효성이 저하하는 원인이 된다.
X-PEG1 + B-PEG2-Y → (X-PEG1-)n-B-PEG2-Y + X-PEG1
US20130052130A1 CN104530415A
Toxins, 2011, 3, p. 848-883 J. Med. Chem., 2011, 54, p. 3606-3623
이상과 같이, 특허 문헌 1 및 특허 문헌 2에 기재된 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜에 있어서, 말단 관능기가 다른 2종류의 직쇄형 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 상기 2 단계들에서 반응시킬 필요가 있기 때문에, 과잉을 첨가한 직쇄형 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 잔존에 의해, 목적하는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 순도가 저하하여, 약제의 사용 및 효과의 관점에서 문제가 될 가능성이 있다.
또한, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 정제 방법으로서는, 재결정, 컬럼 정제 등을 들 수 있다. 특허 문헌 1 및 특허 문헌 2에서는, 과잉을 첨가한 단분산 폴리에틸렌 글리콜(PEG2-Y 및 X-PEG1)을, 컬럼 크로마토그래피에 의해 제거한다. 그러나, 같은 말단 관능기를 가지는 단분산 폴리에틸렌 글리콜은 쇄장이 다른 경우에도, 유사한 물성을 가지기 때문에, 상기 컬럼 정제는 어렵고, 수율을 저하시키는 원인이 된다.
본 발명의 과제는, 그의 양 말단에 서로 다른 관능기를 고순도로 가지는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜, 상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜과 생체기능성 분자가 결합되어 있는 헤테로형 단분산 폴리에틸렌 글리콜 결합체, 및 상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체를 얻는 것이다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성할 수 있도록 열심히 연구를 거듭한 결과, 식(1)로 나타내는 바와 같이, 그의 양 말단에 각각 다른 관능기를 고순도로 가지며, 분기 부위의 3개의 결합점 중 하나에 단분산 폴리에틸렌 글리콜이 결합하고 있지 않는 분기형 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻을 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 제조하기 위한 중간체를, 말단에 특정의 관능기를 이용하여 합성하는 것으로서, 컬럼 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하지 않아도, 간단한 분액 추출만으로, 그의 양 말단에 서로 다른 관능기를 고순도로 가지는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻을 수 있는 것을 발견하였고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 하기의 (1) 내지 (11)을 제공한다.
(1) 식 (1)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜:
Figure 112019035204716-pct00001
(식 (1) 중,
X1 및 Y1은 각각 생체기능성 분자에 존재하는 관능기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 관능기를 적어도 포함하는 원자단을 나타내며, 단, 원자단 X1이 포함하는 상기 관능기와 원자단 Y1이 포함하는 상기 관능기는 서로 상이하고,
n은 6 내지 30의 정수이고,
E는 L2에 대한 2가의 결합 가수 및 L3에 대한 1가의 결합 가수를 가지는 분기 부위이며, 글리세롤 부위를 나타내고,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 또는 2가의 유기기를 나타내고,
L3은 단결합, -L4-(CH2)m1- 또는 -L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-을 나타내고, L4는 에테르 결합, 아미드 결합 및 우레탄 결합 중 어느 하나를 나타내고, L5는 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 나타내고, m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수를 나타낸다.)
(2) L3은 -L4-(CH2)m1- 또는 -L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-를 나타내고, L4는 에테르 결합, 아미드 결합 및 우레탄 결합 중 어느 하나를 나타내고, L5는 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 나타내고, m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수를 나타내는, (1)의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜.
(3) 식 (1) 중의 L2가 에테르 결합인, (1) 또는 (2)의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜.
(4) 식 (2)로 표시되는, (1) 또는 (2)의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜:
Figure 112019035204716-pct00002
(식 (2) 중,
X1 및 Y1은 각각 생체기능성 분자에 존재하는 관능기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 관능기를 적어도 포함하는 원자단을 나타내며, 단, 원자단 X1이 포함하는 상기 관능기와 원자단 Y1이 포함하는 상기 관능기는 서로 상이하고,
n은 6 내지 30의 정수이고,
L1은 단결합 또는 2가의 유기기를 나타내고,
L3은 단결합, -L4-(CH2)m1- 또는 -L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-을 나타내고, L4는 에테르 결합, 아미드 결합 및 우레탄 결합 중 어느 하나를 나타내고, L5는 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 나타내고, m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수를 나타낸다.)
(5) 식 (3)으로 표시되는, (4)의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체:
Figure 112019035204716-pct00003
(식 (3) 중,
n은 6 내지 30의 정수를 나타내고,
Y2는 -NH2 또는 -O-(CH2)m4-NH2를 나타내고, m4는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.)
(6) (5)의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 제조하는 방법으로서,
하기 식(4)로 표시되는 단분산 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 하기 식(5)로 표시되는 화합물을, 수용액 중에서의 pKa가 15 내지 20인 염기 촉매를 이용하여 커플링시켜, 하기 식(6)으로 표시되는 화합물을 얻는 공정(1),
Figure 112019035204716-pct00004
(식 (4) 중,
A는 수산기의 보호기를 나타내고,
B는 이탈기를 나타내고,
n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다),
Figure 112019035204716-pct00005
(식 (5) 중,
Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타낸다),
Figure 112019035204716-pct00006
(식 (6) 중,
A는 수산기의 보호기를 나타내고,
Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고,
n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다);
상기 식(6)으로 표시되는 화합물의 보호기 A를 탈보호시켜, 하기 식(7)로 표시되는 화합물을 얻는 공정(2),
Figure 112019035204716-pct00007
(식 (7) 중,
Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고,
n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다);
상기 식(7)로 표시되는 화합물에 분액 정제를 실시하는(subjecting) 공정(3); 및
상기 식(7)로 표시되는 화합물에 탈보호 처리 또는 환원 처리를 실시하고 식(3)으로 표시되는 상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 얻는 공정(4)
를 상기의 순서로 포함하는, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 제조하는 방법.
(7) 상기 염기 촉매가, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 칼륨 3차(tert)-부톡시드 및 나트륨 3차-부톡시드 중 어느 하나인, (6)의 방법.
(8) (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜에, 생체기능성 분자가 결합되어 있는(conjugated) 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 결합체.
(9) 식 (40)으로 표시되는, (4)의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체:
Figure 112019035204716-pct00008
(식 (40) 중,
n은 6 내지 30의 정수를 나타내고,
Y2는 -NH2 또는 -O-(CH2)m4-NH2를 나타내고, m4는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.)
(10) (9)의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 제조하는 방법으로서,
하기 식 (41)로 표시되는 단분산 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 하기 식 (42) 로 표시되는 화합물을, 수용액 중에서의 pKa가 15 내지 20인 염기 촉매를 이용하여 커플링시켜, 하기 식 (43)으로 표시되는 화합물을 얻는 공정 (1'),
Figure 112019035204716-pct00009
(식 (41) 중,
Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고,
B는 이탈기를 나타내고,
n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다),
Figure 112019035204716-pct00010
(식 (42) 중,
A는 수산기의 보호기를 나타낸다),
Figure 112019035204716-pct00011
(식 (43) 중,
A는 수산기의 보호기를 나타내고,
Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고,
n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다),
상기 식 (43)으로 표시되는 화합물의 보호기 A를 탈보호시켜, 하기 식 (44)로 표시되는 화합물을 얻는 공정 (2'),
Figure 112019035204716-pct00012
(식 (44) 중,
Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고,
n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다);
상기 식 (44)로 표시되는 화합물에 탈보호 처리 또는 환원 처리를 실시하고 식 (40)으로 표시되는 상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 얻는 공정 (3'); 및
상기 식 (40)으로 표시되는 화합물에 분액 정제를 실시하는 공정 (4')
를 상기의 순서로 포함하는, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 제조하는 방법.
(11) 상기 염기 촉매가, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 칼륨 3차-부톡시드 및 나트륨 3차-부톡시드 중 어느 하나인, (10)의 방법.
본 발명의 상기 식(1) 또는 상기 식(2)로 표시되는 화합물은, 그의 양 말단에 서로 다른 관능기를 고순도로 가지기 위하여, ADC로서 사용하는 경우, 목적하는 항체 또는 목적하는 약제 중 어느 하나가 결손한 화합물의 생성이 억제되어 상기 ADC의 효과의 향상을 기대할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 식(1) 또는 상기 식(2)로 표시되는 화합물의 제조 방법에서는, 분기 부위의 3개의 결합점 중 하나에 단분산 폴리에틸렌 글리콜이 결합하고 있지 않기 때문에, 그의 양 말단에 서로 다른 관능기를 고순도로 가지는 상기 식 (1) 또는 상기 식(2)로 표시되는 화합물을 용이하게 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 식(3)으로 표시되는 화합물의 제조 방법에서는, 상기 공정 (1)에 있어서 특정 염기 촉매를 이용함으로써, 부반응을 억제하고, 한편 상기 공정 (1) 내지 공정 (4)를 이 순서로 실시하는 것으로써, 공정(1)에서 과잉을 첨가한 상기 식(4)로 표시되는 화합물 유래의 불순물을, 분액 정제만으로 제거할 수 있기 때문에, 높은 쇄장 순도 및 높은 관능기 순도를 가지는 상기 식(3)으로 표시되는 화합물을 용이하게 얻을 수 있다.
또한, 상기 공정 (1')에 있어서 특정 염기 촉매를 이용함으로써, 부반응을 억제하고, 한편 상기 공정 (1') 내지 공정 (4')를 이 순서로 실시하는 것으로써, 공정 (1')에서 과잉을 첨가한 상기 식(41)로 표시되는 화합물 유래의 불순물을, 분액 정제만으로 제거할 수 있기 때문에, 높은 쇄장 순도 및 높은 관능기 순도를 가지는 상기 식(40)으로 표시되는 화합물을 용이하게 얻을 수 있다.
이하에서, 본 발명의 바람직한 실시 형태에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜이란, 말단에 2종의 관능기를 고순도로 가지고, 분기 부위의 3개의 결합점 중 하나에 단분산 폴리에틸렌 글리콜이 결합하고 있지 않는 화합물이다. 또한, 고순도의 말단 관능기는, 특정 조합의 관능기를 가지는 화합물의 순도(이하, 관능기 순도라고 한다)가 95% 이상인 것을 의미한다. 또한, 단분산 폴리에틸렌 글리콜이란, 특정 에틸렌 글리콜쇄장을 가지는 화합물의 순도(이하, 쇄장 순도라고 한다)가 90% 이상인 것을 의미한다.
분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜은 식 (1)로 표시된다.
Figure 112019035204716-pct00013
식 (1) 중, X1 및 Y1은 각각 생체기능성 분자에 존재하는 관능기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 관능기를 적어도 포함하는 원자단을 나타내며, 단, 원자단 X1이 포함하는 상기 관능기와 원자단 Y1이 포함하는 상기 관능기는 서로 상이하다. n은 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 수를 나타내고, 6 내지 30의 정수이다. E는 L1에 대한 2가의 결합 가수 및 L3에 대한 1가의 결합 가수를 가지는 분기 부위이며, 글리세롤 부위를 나타낸다. L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 또는 2가의 유기기를 나타낸다. L3은 단결합, -L4-(CH2)m1- 또는 -L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-을 나타내고, L4는 에테르 결합, 아미드 결합 및 우레탄 결합 중 어느 하나를 나타내고, L5는 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 나타내고, m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
상기 식 (1)에 있어서, X1 및 Y1은, 서로 상이한 관능기이며, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜에 의한 수식의 대상이 되는, 생체기능성 분자(단백 약제, 폴리펩티드, 효소, 항체, 항체의약, 유전자, 올리고핵산 등을 포함하는 핵산 화합물, 핵산의약, 항암제, 저분자량 약물 등의 그 외 약제)에 존재하는 관능기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기이면 특히 제한은 없다. 그 중에서도, X1 및 Y1은 각각 독립적으로, 단백질로 대표되는 천연적으로 발생하는 생체기능성 분자에 존재하는 기(예를 들면, 아미노기, 티올기, 알데히드기 또는 카복실기)나 상기 생체기능성 분자에 인공적으로 도입 가능한 기(예를 들면, 말레이미드기, 케톤기, 아지드기 또는 알키닐기)에 온화한 조건 하에서, 또한, 높은 반응 효율로 반응할 수 있는 관능기인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 알데히드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 요오드아세트아미드기, 브로모아세트아미드기, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 카복실기, 아미노기, 아미노옥시기, 티올기, 알릴기, 비닐기, 알키닐기 또는 아지드기인 것이 바람직하다. 또한, 반응 효율 등을 고려하면, X1 및 Y1은 각각 말레이미드기, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 알키닐기, 아지드기, 요오드아세트아미드기 또는 브로모아세트아미드기인 것이 보다 바람직하다.
또한, X1 및 Y1은, 각각 독립적으로, 대상으로 하는 생체기능성 분자에 존재하는 관능기가 아미노기인 경우에는, 알데히드기, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 카복실기 또는 케톤기인 것이 바람직하고; 대상으로 하는 생체기능성 분자에 존재하는 관능기가 티올기인 경우에는, 말레이미드기, 비닐술폰기, 요오드아세트아미드기, 브로모아세트아미드기, 알릴기 또는 비닐기인 것이 바람직하고; 대상으로 하는 생체기능성 분자에 존재하는 관능기가 알데히드기 또는 케톤기인 경우에는, 아미노기인 것이 바람직하고; 대상으로 하는 생체기능성 분자에 존재하는 관능기가 카복실기인 경우에는, 아미노기, 아미노옥시기 또는 티올기인 것이 바람직하고; 대상으로 하는 생체기능성 분자에 존재하는 관능기가 말레이미드기인 경우에는, 티올기인 것이 바람직하고; 대상으로 하는 생체기능성 분자에 존재하는 관능기가 아지드기인 경우에는 알키닐기인 것이 바람직하고; 대상으로 하는 생체기능성 분자에 존재하는 관능기가 알키닐기인 경우에는 아지드기인 것이 바람직하다.
X1 및 Y1의 바람직한 조합에 있어서, 예를 들면, X1이 활성 에스테르기인 경우, Y1은 말레이미드기, 아지드기, 알키닐기, 요오드아세트아미드기, 브로모아세트아미드기, 비닐술폰기, 옥시아미노기, 티올기, 알릴기 또는 비닐기인 것이 바람직하고; X1이 활성 카보네이트기인 경우, Y1은 말레이미드기, 아지드기, 알키닐기, 요오드아세트아미드기, 브로모아세트아미드기, 비닐술폰기, 옥시아미노기, 티올기, 알릴기 또는 비닐기인 것이 바람직하고; X1이 말레이미드기인 경우, Y1은 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 아지드기, 알키닐기, 알데히드기, 카복실기, 아미노기, 옥시아미노기 또는 케톤기인 것이 바람직하고; X1이 아지드기인 경우, Y1은 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 말레이미드기, 요오드아세트아미드기, 브로모아세트아미드기, 알데히드기, 비닐술폰기, 카복실기, 아미노기, 옥시아미노기, 티올기, 알릴기, 비닐기 또는 케톤기인 것이 바람직하고; X1이 알키닐기인 경우, Y1은 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 말레이미드기, 요오드아세트아미드기, 브로모아세트아미드기, 알데히드기, 비닐술폰기, 카복실기, 아미노기, 옥시아미노기, 티올기, 알릴기, 비닐기 또는 케톤기인 것이 바람직하다.
상기 식 (1)에 있어서, L1은, 폴리에틸렌 글리콜쇄와 X1 사이의 결합을 담당하는 링커이며, 공유 결합에 의해서 구성되는 부위이면 특히 제한은 없지만, 바람직하게는, 단결합, 2가의 포화 탄화수소기, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 카보네이트 결합 또는 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합 또는 카보네이트 결합을 포함하는 2가의 포화 탄화수소기이다. 상기 포화 탄화수소기로서는, 탄소수가 10 이하인 것이 바람직하고, 예를 들면, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 프로필렌기, 이소프로필렌기, 테트라메틸렌기, 부틸렌기, 이소부틸렌기, 펜타메틸렌기 및 헥사메틸렌기 등을 들 수 있다.
식 (1)에 있어서, L3은, Y1과 분기 부위 E 사이의 결합을 담당하는 링커이며, 단결합, -L4-(CH2)m1- 또는 -L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-로 나타내진다. L4는, 에테르 결합, 아미드 결합 및 우레탄 결합 중의 어느 하나를 나타내고, L5는, 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 나타내고, m1, m2, m3는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
본 발명에 있어서 L4가 에테르 결합이며, L5가 아미드 결합인 경우의 L3의 바람직한 예로는, 다음의 식:
-O-(CH2)m2-C(O)NH-(CH2)m3- (8)
-O-(CH2)m2-NHC(O)-(CH2)m3- (9)
중 어느 하나로 나타낸다.
본 발명에 있어서의 말레이미드기란, L1 또는 L3을 포함하는 다음의 식으로 나타내지는 기이며, 예를 들면, 티올기 등의 구핵성기와 반응하는 기이다.
Figure 112019035204716-pct00014
상기 식 (10) 중, R1으로서는, 수소 원자 또는 메틸기인 것이 바람직하고, 수소 원자인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서 X1 또는 Y1이 말레이미드기인 경우,-L1-X1 또는 -L3-Y1의 바람직한 예는 다음의 식:
Figure 112019035204716-pct00015
으로 나타내진다.
상기 식(11) 중, a는 1 내지 5의 정수를 나타내고, R1은 상기 식(10) 중의 R1과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 있어서의 활성 에스테르기란, L1 또는 L3을 포함하는 다음의 식으로 나타내지는 기이며, 예를 들면, 아미노기 등의 구핵성기와 반응한다.
Figure 112019035204716-pct00016
상기 식(12) 중, R2는, 페닐기, 3-피리딜기, 숙신이미드기, 2-벤조티아졸기 또는 1-벤조트리아졸기인 것이 바람직하고, 숙신이미드기 또는 1-벤조트리아졸기인 것이 보다 바람직하고, 숙신이미드기인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서 X1 또는 Y1이 활성 에스테르기인 경우,-L1-X1 또는 -L3-Y1의 바람직한 예로는 다음의 식:
Figure 112019035204716-pct00017
으로 나타내진다.
상기 식 (13) 중, b는 1 내지 5의 정수를 나타내고, R2은 상기 식 (12) 중의 R2와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 있어서의 활성 카보네이트기란, L1 또는 L3을 포함하는 다음의 식으로 나타내지는 기이며, 예를 들면, 아미노기 등의 구핵성기와 반응한다.
Figure 112019035204716-pct00018
상기 식 (14) 중, R3은, 페닐기, 3-피리딜기, 숙신이미드기, 4-니트로페닐기, 2-벤조티아졸기 또는 1-벤조트리아졸기인 것이 바람직하고, 숙신이미드기 또는 1-벤조트리아졸기인 것이 보다 바람직하고, 숙신이미드기인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서 X1 또는 Y1이 활성 카보네이트기인 경우,-L1-X1 또는 -L3-Y1의 바람직한 예로는 다음의 식:
Figure 112019035204716-pct00019
으로 나타내진다.
상기 식 (15) 중, R3은 상기 식 (14) 중의 R3과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 있어서의 알키닐기란, L1 또는 L2을 포함하는 다음의 식들:
Figure 112019035204716-pct00020
Figure 112019035204716-pct00021
Figure 112019035204716-pct00022
Figure 112019035204716-pct00023
중 하나로 나타내지는 기이며, 아지드기와 반응한다.
상기 식 중, R4는, 탄소수 8 이하의 포화 탄화수소기 또는 수소 원자인 것이 바람직하고, 수소 원자인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서 X1 또는 Y1이 알키닐기인 경우,-L1-X1 또는 -L3-Y1의 바람직한 예로는 다음의 식들:
Figure 112019035204716-pct00024
Figure 112019035204716-pct00025
Figure 112019035204716-pct00026
로 나타내진다.
상기 식 (20) 중, c는 2 내지 5의 정수를 나타내고, R4는 상기 식 (21) 중의 R4와 동일한 의미를 갖는다. 또한, 상기 식 (22) 중, d는 1 내지 6의 정수를 나타낸다.
본 발명에 있어서 X1 또는 Y1이 요오드아세트아미드기 또는 브로모아세트아미드기인 경우의 X1 또는 Y1 이란, L1 또는 L3을 포함하는 다음의 식들:
Figure 112019035204716-pct00027
Figure 112019035204716-pct00028
로 나타내지고, 티올기와 반응한다.
n은 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 수를 나타내고, 6 내지 30의 정수이다. ADC용의 링커로서 사용하는 관점에서는, n은 6 내지 24의 정수인 것이 바람직하다.
E는 L2에 대한 2가의 결합 가수 및 L3에 대한 1가의 결합 가수를 가지는 분기 부위이며, 글리세롤 부위를 나타낸다.
본 발명에 있어서 글리세롤 부위란, L2 및 L3을 포함하는 다음의 식들:
Figure 112019035204716-pct00029
Figure 112019035204716-pct00030
중 어느 하나로 나타내지고, 원료 순도의 관점에서는, 식 (25)로 표시되는 구조를 갖는 것이 바람직하다.
L2는, 폴리에틸렌 글리콜쇄와 분기 부위 E 사이의 결합을 담당하는 링커이며, 공유 결합에 의해서 구성되는 부위이면 특히 제한은 없지만, 예를 들면, 단결합, 2가의 포화 탄화수소기, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 카보네이트 결합 및 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합 또는 카보네이트 결합을 포함하는 2가의 포화 탄화수소기를 들 수 있다. L2는 우레탄 결합, 아미드 결합 및 에테르 결합 중 어느 하나인 것이 바람직하고, 원료 순도의 관점에서는 에테르 결합인 것이 보다 바람직하다. 상기 포화 탄화수소기로서는, 탄소수가 10 이하인 것이 바람직하고, 예를 들면, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 프로필렌기, 이소프로필렌기, 테트라메틸렌기, 부틸렌기, 이소부틸렌기, 펜타메틸렌기 및 헥사메틸렌기 등을 들 수 있다.
상기 식 (1)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 바람직한 예로서는, 하기 식 (28)로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
Figure 112019035204716-pct00031
본 발명에 있어서 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체는, 하기 식 (29)로 표시된다.
Figure 112019035204716-pct00032
상기 식 (29)에 있어서, n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다. X2 및 Y2는, 서로 다른 관능기이며, X2는 수소 원자, 또는 2가의 포화 탄화수소기를 포함하는 아미노기 및 카복실기 중 어느 하나를 나타낸다. Y2는 -NH2, -O-(CH2)m4-NH2, -COOH 및 -O-(CH2)m6-COOH 중 어느 하나를 나타낸다. m4 및 m6은 각각 1 내지 5의 정수를 나타낸다. L2는 2가의 유기기를 나타낸다. E는 L2에 대한 2가의 결합 가수 및 Y2에 대한 1가의 결합 가수를 가지는 분기 부위이며, 글리세롤 부위를 나타낸다.
상기 식 (29)에 있어서, n은 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 수를 나타내고, 6 내지 30의 정수이다. ADC용의 링커로서 사용하는 관점에서는, n은 6 내지 24의 정수인 것이 바람직하다.
상기 식 (29)에 있어서, X2는, 식 (1) 중의 X1으로 변환 가능한 관능기이면 특히 한정되지 않지만, 수소 원자 또는 2가의 포화 탄화수소기를 포함하는 아미노기 및 카복실기 중 어느 하나인 것이 바람직하고, 수소 원자인 것이 보다 바람직하다. 상기 포화 탄화수소기로서는, 탄소 수가 10 이하인 것이 바람직하고, 예를 들면, 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 프로필렌기, 이소프로필렌기, 테트라메틸렌기, 부틸렌기, 이소부틸렌기, 펜타메틸렌기 및 헥사메틸렌기를 들 수 있다.
상기 식 (29)에 있어서, Y2는, 식(1) 중의 Y1으로 변환 가능한 관능기이면 특히 한정되지 않지만, -NH2, -O-(CH2)m4-NH2, -COOH 및 -O-(CH2)m6-COOH 중 어느 하나인 것이 바람직하고, 합성 용이성의 관점에서는, -NH2 또는 -O-(CH2)m4-NH2인 것이 보다 바람직하다. m4 및 m6는, 각각 1 내지 5의 정수를 나타낸다.
상기 식(29)에 있어서, X2 및 Y2는, 상기 식(1)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 합성하는 관점으로부터, 서로 다른 관능기인 것이 바람직하다. X2 및 Y2의 바람직한 조합으로서는, 예를 들면, Y2가 -COOH 또는 -O-(CH2)m6-COOH인 경우, X2는 수소 원자 또는 2가의 포화 탄화수소기를 포함하는 아미노기인 것이 바람직하고, Y2가 -NH2 또는 -O-(CH2)m4-NH2인 경우에는, X2는 수소 원자 또는 2가의 포화 탄화수소기를 포함하는 카복실기인 것이 바람직하다.
상기 식(29)에 있어서, L2는, 폴리에틸렌 글리콜쇄와 분기 부위 E 사이의 결합을 담당하는 링커이며, 상기 식 (1) 중의 L2와 동일한 의미를 갖는다. 원료 순도의 관점에서는, 상기 식(29) 중의 L2로서는, 에테르 결합인 것이 바람직하다.
E는 L2에 대한 2가의 결합 가수 및 Y2에 대한 1가의 결합 가수를 가지는 분기 부위이며, 상기 식(25) 또는 상기 식(26)으로 표시되는 글리세롤 부위를 나타낸다. 원료 순도의 관점에서는, E는 상기 식(25)로 표시되는 분기 부위인 것이 바람직하다.
상기 식(29)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 바람직한 예로서는, 식(3)으로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
Figure 112019035204716-pct00033
상기 식(29)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체를 이용하여 상기 식(1)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는 방법으로서는, 공지된 합성 방법으로 얻을 수 있는 화합물을 적당하게 이용할 수 있다. 예를 들면, 말레이미드기를 도입하는 방법으로서는 3-말레이미도프로피온산 또는 말레이미도뷰티르산 등을 예를 들면, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염 등의 축합제와 반응시킨 후, 식(29)로 표시되는 본 발명의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 아미노기와 반응시키는 방법 및, 예를 들면, 트리에틸아민 등의 염기의 존재 하에, 식(29)로 표시되는 본 발명의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 아미노기와 3-말레이미도프로피온산 N-숙신이미딜 또는 말레이미도뷰티르산 N-숙신이미딜을 반응시키는 방법을 들 수 있다.
또한, 예를 들면, 활성 에스테르기를 도입하는 방법으로서는, 식(29)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 카복실기를 예를 들면, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염 등의 축합제의 존재 하에서, N-히드록시숙신이미드와 반응시키는 방법, 및 예를 들면, 트리에틸아민의 염기의 존재 하에서, 식 (29)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 수산기를 디숙신이미딜 카보네이트와 반응시키는 방법을 들 수 있다.
또한, 예를 들면, 요오드아세트아미드기를 도입하는 방법으로서는, 식 (29)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 아미노기를, 예를 들면, 트리에틸아민의 염기의 존재 하에서, 디(요오드아세틱) 무수물 등과 반응시키는 방법을 들 수 있다.
또한, 예를 들면, 알키닐기를 도입하는 방법으로서는, 식 (29)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 아미노기를 예를 들면, 트리에틸아민의 염기의 존재 하에서, 프로파길 클로로포름산염, (1R, 8S, 9S)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 N-숙신이미딜 카보네이트, 디벤조시클로옥틴-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 등을 반응시키는 방법을 들 수 있다.
상기 식 (29)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체를 이용하여 상기 식(1)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는 방법의 전형적인 예로서는, 하기와 같은 공정을 들 수 있다.
(a) 말단에 활성 카보네이트기 및 말레이미드기를 가지는 화합물의 합성
Figure 112019035204716-pct00034
상기 식(30)으로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 아미노기에, 클로로포름 용매 중, 트리에틸아민의 존재 하에서, 3-말레이미도프로피온산 N-숙신이미딜을 반응시켜, 하기 식(31)로 표시되는 화합물을 얻는다.
Figure 112019035204716-pct00035
상기 식(31)로 표시되는 화합물의 수산기를, 디클로로메탄 용매 중의, 트리에틸아민의 존재 하에서, 디숙신이미딜 카보네이트를 반응시켜, 하기 식(32)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는다. 식(32)로 표시되는 화합물은, 상기 식(1) 중의 X1이 활성 에스테르기이며, Y1이 말레이미드기인 화합물과 동일하다.
Figure 112019035204716-pct00036
(b) 말단에 활성 에스테르기 및 요오드아세트아미드기를 가지는 화합물의 합성
Figure 112019035204716-pct00037
상기 식(33)으로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 아미노기에, 클로로포름 용매 중의, 트리에틸아민의 존재 하에서, 디(요오드아세틱)무수물을 반응시켜, 하기 식(34)로 표시되는 화합물을 얻는다.
Figure 112019035204716-pct00038
상기 식(34)로 표시되는 화합물의 카복실기에, 디클로로메탄 용매 중의, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염의 존재 하에서, N-히드록시숙신이미드를 반응시켜, 하기 식(35)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는다. 식(35)로 표시되는 화합물은, 상기 식(1) 중의 X1이 활성 에스테르기이며, Y1이 요오드아세트아미드기인 화합물과 동일하다.
Figure 112019035204716-pct00039
(c) 말단에 알키닐기 및 활성 에스테르기를 가지는 화합물의 합성
Figure 112019035204716-pct00040
상기 식(36)으로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 아미노기에, 클로로포름 용매 중의, 트리에틸아민의 존재 하에서, (1R, 8S, 9S)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 N-숙신이미딜 카보네이트를 반응시켜, 하기 식(37)로 표시되는 화합물을 얻는다.
Figure 112019035204716-pct00041
상기 식(37)로 표시되는 화합물의 카복실기에, 디클로로메탄 용매 중의, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염의 존재 하에서, N-히드록시숙신이미드를 반응시켜, 하기 식(38)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻는다. 식(38)로 표시되는 화합물은, 상기 식(1) 중의 X1이 알키닐기이며, Y1이 활성 에스테르기인 화합물과 동일하다.
Figure 112019035204716-pct00042
또한, 본 발명에 있어서의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체는, 하기 식(40)로 표시된다.
Figure 112019035204716-pct00043
(식 (40) 중, n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다. Y2는,-NH2 또는 -O-(CH2)m4-NH2를 나타내고, m4는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.)
［쇄장 순도의 측정］
상기 식(1)로 표시되는 화합물의 쇄장 순도는, 역상 크로마토그래피에 의해 측정한 상기 식(3)으로 표시되는 화합물의 쇄장 순도를 이용하였다. 이것은 상기 식(1)로 표시되는 화합물이 X1 또는 Y1에서 활성 에스테르기 또는 활성 카보네이트기를 가지는 화합물인 경우, 측정 중에 이의 분해가 발생하고, 역상 크로마토그래피에 의한 정확한 쇄장 순도의 측정을 수행할 수 없기 때문이다. 또한, 상기 식(3)으로 표시되는 화합물로부터 상기 식(1)로 표시되는 화합물을 얻는 반응은, 산 염화물과 산 무수물 사이의 축합 반응이기 때문에, 쇄장 순도에 영향을 미치지 않는다.
［관능기 순도의 측정］
상기 식(1)로 표시되는 화합물의 관능기 순도는, 상기 식(3)으로 표시되는 화합물의 관능기 순도의 1H-NMR 측정을 기초로 하여 구해진다. 상기와 마찬가지로, 상기 식(1)로 표시되는 화합물의 역상 크로마토그래피에 의한 정확한 관능기 순도의 측정을 수행할 수 없기 때문이다. 측정 방법으로서는, 우선 상기 식(3)으로 표시되는 화합물의 역상 크로마토그래피에 의해, 상기 식(3)으로 표시되는 화합물의 관능기 순도를 측정한다. 그 다음에, 상기 식(1)로 표시되는 화합물 및 상기 식(3)으로 표시되는 화합물의 1H-NMR 측정을 실시하여 관능기 X1 및 Y1의 도입율을 구하며, 하기 식(F1):
식 (1)로 표시되는 화합물의 관능기 순도 = ｛(식(3)으로 표시되는 화합물의 관능기 순도) ×(X1의 도입율)×(Y1의 도입율)｝··· (F1)
에 따라 상기 관능기 순도를 산출한다.
상기 역상 크로마토그래피 측정에 있어서는, 검출기로서 질량 분석계를 이용하여 각 피크의 동정을 실시한 후에, 검출기로서 시차 굴절률계를 이용하여 산출된 각 피크의 면적값으로부터 순도를 구한다. 측정 조건으로서는, 각각의 피크가 개별적으로 검출되고 있으면 특히 제한은 없지만, 검출기로서 질량 분석계를 이용하는 경우에는, 예를 들면 하기의 조건으로 측정을 실시한다.
검출기： Waters(주) 사제 Quattro micro 탠덤형 질량 분석계
컬럼： Tosoh(주) 사제 TSKgel ODS-80Ts(입자 지름: 5μm, 컬럼 사이즈: 4.6mm×25 cm)
전개 용매: 5 mM 아세트산 암모늄 메탄올/증류수 = j/k
j 및 k는, 메탄올과 증류수의 체적비를 나타내고, j 및 k는, 측정하는 화합물의 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 수 n 및 말단 관능기의 종류에 따라 적절하게 선택된다.
검출기로서 시차 굴절률계를 이용하는 경우, 예를 들면 하기의 조건 하에서 측정을 실시하였다.
검출기：Tosoh(주) 사제 RI-8020
컬럼：Tosoh(주) 사제 TSKgel ODS-80Ts(입자 지름: 5μm, 컬럼 사이즈: 4.6mm×25 cm)
전개 용매：5 mM 아세트산 암모늄 메탄올/증류수 = j/k
j 및 k는, 메탄올과 증류수의 체적비를 나타내고, 검출기로서 질량 분석계를 이용하는 경우의 측정 조건에서 이용하는 j 및 k와 동일한 의미를 갖는다.
상기 1H-NMR 측정에 있어서, 관능기 X1 및 Y1의 도입율은, 상기 식(3)으로 표시되는 화합물로부터 상기 식(1)로 표시되는 화합물을 얻는 반응에 의해 영향을 받지 않는 피크의 적분값을 기준으로 이용함으로써, 관능기 X1 및 Y1로부터 유래하는 피크의 적분값으로부터 산출한다. 기준으로서 사용하는 피크는, 관능기 X1 및 Y1의 종류에 따라 적절하게 선택된다.
＜분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 제조 방법＞
상기 특정 조건을 만족하는 본 발명의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체는, 본 발명의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 제조 방법에 의해 얻을 수 있다. 상기 식(3)으로 표시되는 본 발명의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 제조 방법은, 하기의 공정(1), 공정(2), 공정(3) 및 공정(4)를 적어도 이 순서로 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
[공정 (1)]
본 발명에 따른 공정(1)은, 하기 식(4)로 표시되는 단분산 폴리에틸렌 글리콜 유도체
Figure 112019035204716-pct00044
와 하기 식(5)로 표시되는 화합물
Figure 112019035204716-pct00045
을 수산화칼륨, 수산화나트륨, 칼륨 3차-부톡시드 및 나트륨 3차-부톡시드 중 어느 하나를 염기 촉매로서 이용하여 커플링시켜, 하기 식 (6)
Figure 112019035204716-pct00046
으로 표시되는 화합물을 얻는 공정이다.
상기 식(4)로 표시되는 단분산 폴리에틸렌 글리콜 유도체로서, 공지의 방법이 이용 가능하며, 예를 들면 『Polym. Chem., 2016, 7, 2389-2394』에 기재되어 있는 방법이 유효하다.
A는 수산기의 보호기이며, 상기 커플링에서 사용되는 염기 촉매에 대해서 안정적인 보호기이면 특히 제한은 없지만, 예를 들면, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 2-메톡시에톡시메틸기, 테트라하이드로피라닐기, 알릴기, 벤질기, 4-메톡시벤질기, 트리메틸벤질기, 트리페닐메틸기, 트리에틸실릴기, 트리이소프로필실릴기, 3차-부틸디메틸실릴기 및 3차-부틸디페닐실릴기 등을 들 수 있다. 합성 용이성의 관점에서는, A는 벤질옥시메틸기, 테트라하이드로피라닐기, 벤질기, 트리메틸벤질기 또는 트리페닐메틸기인 것이 바람직하고, 벤질기 또는 트리페닐메틸기인 것이 보다 바람직하다.
B는 이탈기이며, 상기 커플링에 있어서 반응성을 가지는 이탈기이면 특히 제한은 없지만, 예를 들면, 클로로기, 브로모기, 요오드기, 메실레이트기, 토실레이트기, 클로로메탄술포네이트기 및 트리플루오로메탄술포네이트기 등을 들 수 있다. 합성 용이성의 관점에서는, B는 브로모기, 메실레이트기, 토실레이트기 또는 클로로메탄술포네이트기인 것이 바람직하고, 메실레이트기인 것이 보다 바람직하다.
n은 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 수를 나타내고, 6 내지 30의 정수이다. ADC용의 링커로서 사용하는 관점에서는, n은 6 내지 24의 정수인 것이 바람직하다.
상기 식(5)로 표시되는 화합물은, 시판의 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올로부터 공지된 방법을 적절하게 이용하여 합성 가능하다.
상기 식(5)로 표시되는 화합물에 있어서, Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1으로 나타낸다. m5는, 1 내지 5의 정수를 나타낸다. 합성 용이성의 관점에서는, Z는 -Z1, -O-(CH2)2-Z1, -O-(CH2)3-Z1 및 -O-(CH2)5-Z1 중 어느 하나인 것이 바람직하다. Z1은 상기 커플링에 사용되는 염기 촉매에 대하여 안정적인 관능기이면 특히 제한되지 않는다. 상기 식(4)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체를 제조하는 관점에서는, Z1은 아미노기에 변환 가능한 질소 원자를 포함하는 원자단인 것이 바람직하고, 예를 들면 아미노기의 보호체, 아지드기 또는 시아노기인 것이 바람직하다.
또한, 아미노기의 보호체란, 아미노기 및 보호기의 결합체를 의미한다. 보호기로서는, 상기 커플링으로 사용되는 염기 촉매에 대하여 안정적인 보호기이면 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 9-플루오레닐메틸카보닐기, 3차-부톡시카보닐기, 벤질옥시카보닐기 및 디벤질기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 3차-부톡시카보닐기, 벤질옥시카보닐기 및 디벤질기를 들 수 있다.
상기 식(4) 중의 보호기 A 및 상기 식(5) 중의 Z1과의 조합으로서는, Z1이 공정 (2)에 있어서의 보호기 A의 탈보호 조건에 대하여 안정적이면 특히 제한은 없다. 공정 (2)에 있어서의 탈보호가 산성 조건 하에서의 가수분해 반응인 경우, Z1으로서는, 아미노기의 9-플루오레닐메틸카보닐기의 보호체, 아미노기의 3차-부톡시카보닐기의 보호체, 아미노기의 벤질옥시카보닐기의 보호체, 아미노기의 디벤질기의 보호체, 아지드기 또는 시아노기인 것이 바람직하다. 공정 (2)에 있어서의 탈보호가 접촉 수소 첨가인 경우, Z1으로서는, 아미노기의 9-플루오레닐메틸카보닐기의 보호체 또는 아미노기의 3차-부톡시카보닐기의 보호체인 것이 바람직하다.
상기 커플링에 사용되는 염기 촉매로서는, 반응이 진행하는 염기 촉매이면 특히 제한은 없다. 수용액 중에서의 pKa가 15 내지 20의 염기 촉매인 것이 바람직하고, 예를 들면, 수산화칼륨 (pKa = 15.7), 수산화나트륨 (pKa = 15.7), 칼륨 3차-부톡시드 (pKa = 19), 나트륨 3차-부톡시드 (pKa = 15.7), 나트륨 메톡시드 (pKa = 15.5) 및 나트륨 에톡시드 (pKa = 16) 등을 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 칼륨 3차-부톡시드 및 나트륨 3차-부톡시드를 들 수 있다. 예를 들면, 수소화 나트륨 등의, 수용액 중에서의 pKa가 20을 넘는 염기 촉매를 사용하는 경우, 염기 촉매와의 반응에 의해 상기 식 (5)로 표시되는 분기 부위가 분해하여, 커플링에 있어서의 수율 및 순도가 저하한다. 한편, 예를 들면, 트리메틸아민 등의 수용액 중에서의 pKa가 15 미만의 염기 촉매를 사용하는 경우, 상기 커플링의 진행이 늦어지는 경향이 있다. 또한, 상기 염기 촉매의 사용량으로서는, 반응이 진행하면 문제가 없지만, 상기 식(5)로 표시되는 화합물에 대해서, 통상, 몰비로 2.0 내지 10배, 바람직하게는 2.1 내지 5 배이다. 상기 염기 촉매의 사용량이 상기의 하한 미만인 경우, 반응이 완전하게 진행하지 않고, 상기 식(5)로 표시되는 화합물의 수산기에 단분산 폴리에틸렌 글리콜쇄가 도입되지 않고 수산기가 남는 경향이 있다. 한편, 사용량이 상기 상한을 넘는 경우, 과잉의 염기에 의해서 부반응이 진행할 우려가 있다.
상기 커플링에 있어서는, 용매 중에서 반응을 실시할 수 있다. 상기 용매로서는, 상기 식(4)로 표시되는 화합물 및 상기 식(5)로 표시되는 화합물과 반응하지 않는 용매이면 특히 한정되지는 않고, 예를 들면, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, DMF, 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 비프로톤성 극성 용매, 및 이의 혼합물을 들 수 있다. 상기 용매의 사용량으로서는, 상기 식(4)로 표시되는 화합물에 대하여, 통상, 질량비로 1 내지 100배, 바람직하게는 2 내지 50배, 가장 바람직하게는 3 내지 30배이다. 상기 용매의 사용량이 상기 상한을 넘는 경우, 상기 커플링의 진행이 늦어지는 경향이 있다.
상기 커플링의 반응 온도로서는, 사용하는 용매 등에 따라 다르지만, 통상 0 내지 100℃이다. 상기 반응 온도가 상기 하한 미만인 경우에는, 반응의 진행이 늦어질 우려가 있다. 한편, 상기 반응 온도가 상기 상한을 넘는 경우에는, 과잉인 온도에 의해서 부반응이 진행할 우려가 있다. 또한, 상기 커플링의 반응 시간으로서는, 예를 들면, 상기 반응 온도 등의 조건에 따라 다르지만, 통상 대략 1 내지 48시간 정도가 바람직하다.
상기 커플링에 있어서의 상기 식 (4)로 표시되는 화합물의 사용량으로서는, 상기 식(5)로 표시되는 화합물에 대해서, 통상, 몰비로 2.0 내지 10배, 바람직하게는 2.1 내지 4배이다. 상기 식(4)로 표시되는 화합물의 사용량이 상기 하한 미만인 경우, 반응이 완전하게 진행하지 않고, 상기 식 (5)로 표시되는 화합물의 수산기에 단분산 폴리에틸렌 글리콜쇄가 도입되지 않고 수산기가 남는 경향이 있다. 한편, 사용량이 상한을 넘는 경우, 과잉의 상기 식(4)로 표시되는 화합물이 소용 없게 되어, 제조 코스트가 증가할 뿐만 아니라, 과잉의 상기 식(4)로 표시되는 화합물을 반응 생성물인 상기 식(6)으로 표시되는 화합물로부터 분리하는 것이 곤란하기 때문에, 수율이 저하한다.
공정 (1)에 있어서는, 전술한 바와 같은 커플링에 의해, 상기 식(6)으로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다. 상기 화합물은 정제 없이 다음 공정(2)에 이용될 수 있거나 또는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피, 흡착제 처리 등에 의해 정제한 후 이용할 수도 있다. 그러나, 본 발명에 있어서는, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제를 수행하지 않고도 고순도의 본 발명의 헤테로형 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻을 수 있다.
[공정 (2)]
본 발명에 따른 공정(2)는, 상기 식(6)으로 표시되는 화합물의 보호기 A를 탈보호시켜, 하기 식(7)로 표시되는 화합물을 얻는 공정이다.
Figure 112019035204716-pct00047
상기 식 (7) 중, Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고, n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다. 상기 아미노기의 보호체는, 상기 식(6)으로 표시되는 화합물 중의 Z1으로부터 유래하는 것이며, 상기 식 (6) 중의 Z1과 동일한 의미이다.
상기 식(6)으로 표시되는 화합물의 보호기 A를 탈보호시키는 방법은, 보호기의 종류에 따라 다르지만, 공지의 방법을 이용하여 탈보호를 실시하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, A가 예를 들면, 메톡시메틸기, 테트라하이드로피라닐기 또는 트리틸기 등의 에테르계 보호기인 경우, 탈보호는 산성 조건 하에서 가수분해에 의한 방법을 들 수 있다. 또한, 예를 들면, A가 벤질기 또는 트리틸기 등의 벤질기를 포함하는 보호기인 경우, 탈보호는 촉매 존재 하에서 접촉 수소 첨가에 의한 방법을 들 수 있다. 또한, 예를 들면, A가 트리에틸실릴기 등의 실릴계 보호기인 경우, 탈보호는 불화 테트라부틸암모늄 등의 불화물 이온에 의한 탈실릴화 반응을 들 수 있다.
상기 탈보호가 가수분해인 경우, 용매 중에서 가수분해를 실시할 수 있다. 상기 용매로서는, 예를 들면, 물, 메탄올 또는 에탄올 등의 프로톤성 극성 용매, 및 그의 혼합물을 들 수 있다. 또한, 예를 들면, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴, 또는 DMF을 물과 임의의 비율로 혼화하는 유기 용매를 포함할 수 있다. 상기 용매의 사용량으로서는, 상기 식(6)으로 표시되는 화합물에 대해서, 통상, 질량비로 1 내지 100배, 바람직하게는 2 내지 50배, 가장 바람직하게는 3 내지 30 배량이다. 상기 용매의 사용량이 상기 상한을 넘는 경우, 상기 가수분해의 진행이 늦어지는 경향이 있다. 상기 가수분해는, 산 촉매를 이용하여 반응을 실시한다. 상기 산 촉매로서는, 예를 들면, 염산, 황산 또는 인산 등의 무기산이나, 예를 들면, p-톨루엔술폰산 일수화물 또는 메탄술폰산 등의 유기산, 및 예를 들면, Amberlyst의 양이온 교환 수지를 들 수 있다. 상기 산촉매의 당량으로서는, 상기 식(6)으로 표시되는 화합물에 대해서, 통상, 몰비로 0.1 내지 2배, 바람직하게는 0.2 내지 1배이다. 상기 가수분해의 반응 온도로서는, 사용하는 용매 등에 의해 다르지만, 통상 0 내지 100℃이다. 상기 반응 온도가 상기 하한 미만인 경우에는, 반응의 진행이 늦어질 우려가 있다. 한편, 상기 반응 온도가 상기 상한을 넘는 경우에는, 과잉인 온도에 의해서 부반응이 진행할 우려가 있다. 또한, 상기 가수분해의 반응 시간으로서는, 상기 반응 온도 등의 조건에 따라 다르지만, 통상 대략 1 내지 48시간 정도가 바람직하다.
상기 탈보호가 접촉 수소 첨가인 경우, 촉매 존재 하에서 반응을 실시한다. 상기 촉매로서는, 예를 들면, 팔라듐 탄소 또는 수산화팔라듐 탄소 등을 들 수 있다. 상기 촉매의 당량으로서는, 상기 식(6)으로 표시되는 화합물에 대해서, 통상, 중량비로 0.01 내지 1배, 바람직하게는 0.05 내지 0.2배이다. 상기 접촉 수소 첨가는, 용매 중에서 반응을 실시할 수 있다. 상기 용매로서는, 예를 들면, 물, 메탄올, 에탄올, 테트라하이드로푸란, 아세트산 에틸, DMF 및 그의 혼합물을 들 수 있다. 상기 용매의 사용량으로서는, 상기 식(6)으로 표시되는 화합물에 대해서, 통상, 질량비로 1 내지 100배, 바람직하게는 2 내지 50배, 가장 바람직하게는 3 내지 30 배량이다. 상기 용매의 사용량이 상기 상한을 넘는 경우에는, 상기 접촉 수소 첨가의 진행이 늦어지는 경향이 있다. 상기 접촉 수소 첨가의 반응 온도로서는, 사용하는 용매 등에 의해 다르지만, 통상 0 내지 100℃이다. 상기 반응 온도가 상기 하한 미만인 경우에는, 반응의 진행이 늦어질 우려가 있다. 한편, 상기 반응 온도가 상기 상한을 넘는 경우에는, 과잉인 온도에 의해서 부반응이 진행할 우려가 있다. 또한, 상기 가수분해의 반응 시간으로서는, 상기 반응 온도 등의 조건에 따라 다르지만, 통상 대략 1 내지 48시간 정도가 바람직하다.
상기 탈보호가 탈실릴화 반응인 경우, 산 가수분해에 의한 탈보호와 불화물이온에 의한 탈보호를 들 수 있다. 산 가수분해에 의한 탈보호는, 상기 에테르계 보호기의 가수분해에 의한 탈보호와 같은 방법으로 실시할 수 있다. 불화물 이온에 의한 탈보호는, 불화 테트라부틸암모늄 또는 불화 수소 등의 불화물 이온을 가지는 시약을 이용하여 실시한다. 상기 불화물 이온을 가지는 시약의 당량으로서는, 상기 식(6)으로 표시되는 화합물에 대해서, 통상, 몰비로 1.0 내지 2배, 바람직하게는 1.1 내지 1.5배이다. 상기 불화물 이온에 의한 탈보호는, 용매 중에서 반응을 실시할 수 있다. 상기 용매로서는, 예를 들면, 물, 메탄올, 에탄올, 테트라하이드로푸란, 아세트산 에틸, DMF 및 그의 혼합물을 들 수 있다. 상기 용매의 사용량으로서는, 상기 식(6)으로 표시되는 화합물에 대하여, 통상, 질량비로 1 내지 100배, 바람직하게는 2 내지 50배, 가장 바람직하게는 3 내지 30 배량이다. 상기 용매의 사용량이 상기 상한을 넘는 경우, 상기 접촉 수소 첨가의 진행이 늦어지는 경향이 있다. 상기 불화물 이온에 의한 탈보호의 반응 온도로서는, 사용하는 용매 등에 의해 다르지만, 통상 0 내지 100℃이다. 상기 반응 온도가 상기 하한 미만인 경우에는, 반응의 진행이 늦어질 우려가 있다. 한편, 상기 반응 온도가 상기 상한을 넘는 경우에는, 과잉인 온도에 의해서 부반응이 진행할 우려가 있다. 또한, 상기 접촉 수소 첨가의 반응 시간으로서는, 상기 반응 온도 등의 조건에 의해 다르지만, 통상 대략 1 내지 48시간 정도가 바람직하다.
공정 (2)에 있어서는, 상기의 탈보호에 의해, 상기 식(7)로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다. 상기 화합물은, 정제 없이 다음 공정(3)에 이용할 수 있거나 또는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피, 흡착제 처리 등에 의해 정제한 후 이용할 수도 있다. 그러나, 본 발명에 있어서는, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제를 수행하지 않고도 고순도의 본 발명의 헤테로형 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 얻을 수 있다.
[공정 (3)]
본 발명에 따른 공정 (3)은, 상기 식(7)로 표시되는 화합물을 함유하는 반응 생성물에 분액 정제를 실시하는 공정이다.
예를 들면, 상기 공정(1)에 있어서, 과잉을 첨가한 상기 식(4)로 표시되는 화합물은, 반응 생성물인 상기 식(6)으로 표시되는 화합물 중 잔존한다. 상기 식(4)로 표시되는 화합물의 보호기 A는, 공정 (2)에 있어서 상기 식(6)으로 표시되는 화합물과 동일하게 탈보호되어 하기 식(39)로 표시되는 화합물을 형성한다.
Figure 112019035204716-pct00048
상기 식 (39) 중, B는 이탈기이며, n은 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위수를 나타내고, 6 내지 30의 정수이다. 상기 이탈기는, 상기 식(4)로 표시되는 화합물 중의 B로부터 유래하는 것이며, 상기 식(4) 중의 B와 동일한 의미를 갖는다.
상기 공정 (3)은, 유기 용매에 용해된 상기 식 (7)로 표시되는 목적하는 화합물에 포함되는 상기 식(39)로 표시되는 화합물을, 수용액으로 분액 세정하는 공정이다.
상기 공정(3)에 이용하는 유기용매로서는, 예를 들면, 아세트산 에틸, 톨루엔, 클로로포름 또는 디클로로메탄 등을 들 수 있고, 목적하는 화합물의 용해성의 관점에서는, 클로로포름 또는 디클로로메탄이 바람직하다. 상기 유기 용매의 사용량으로서는, 상기 식(7)로 표시되는 화합물과 상기 식(39)로 표시되는 화합물을 포함하는 반응 생성물에 대하여, 통상, 질량비로 2 내지 30배, 바람직하게는 3 내지 20배이다. 상기 유기 용매의 사용량이 상기 하한 미만인 경우에는, 상기 식(7)로 표시되는 화합물이 수용액 중에 용해될 우려가 있다. 한편, 상기 사용량이 상기 상한을 넘는 경우에는, 상기 식(39)로 표시되는 화합물의 세정 효율이 저하하는 경향이 있다.
상기 공정 (3) 중에 이용하는 수용액으로서는, 상기 식(39)로 표시되는 화합물을 용해 가능하면 특히 한정되지 않고, 예를 들면, 이온 교환수 및 염화나트륨, 염화칼륨 등의 저염 농도를 갖는 수용액을 들 수 있다. 상기 수용액의 사용량으로서는, 상기 식(7)로 표시되는 화합물과 상기 식(39)로 표시되는 화합물을 포함하는 반응 생성물에 대하여, 통상, 질량비로 2 내지 30배, 바람직하게는 3 내지 20배이다. 상기 수용액의 사용량이 상기 하한 미만인 경우에는, 상기 식(39)로 표시되는 화합물의 세정 효율이 저하한다. 한편, 상기 사용량이 상기 상한을 넘는 경우에는, 상기 식(7)로 표시되는 화합물이 수성 층에 용해될 우려가 있다.
상기 공정 (3)에 있어서, 상기 유기용매와 상기 수용액과의 비율로서는, 통상, 질량비로 유기용매/수용액의 값이, 0.2 내지 3.0이며, 0.5 내지 2.0인 것이 바람직하다.
상기 공정 C의 온도는, n에 따라 다르다. n이 6 내지 10인 경우, 상기 온도로서는, 1 내지 25℃인 것이 바람직하고, 5 내지 20℃인 것이 보다 바람직하다. n이 11 내지 30인 경우, 상기 온도로서는, 1 내지 15℃인 것이 바람직하고, 5 내지 10℃인 것이 보다 바람직하다. 상기 온도가 상기 상한을 넘는 경우, 상기 식(39)로 표시되는 화합물이 유기층에 용해되기 때문에 제거할 수 없다. 또한, 상기 분액 세정을 실시하는 횟수로서는, 특히 한정은 없고, TLC, MS 측정 등에 의해서 유기 용매 중에 포함되는 상기 식(39)로 표시되는 화합물을 확인하면서 여러 차례 실시하는 것이 바람직하다.
[공정 (4)]
본 발명에 따른 공정(4)는, 상기 식(7)로 표시되는 화합물에 탈보호 처리 또는 환원 처리를 실시하고 상기 식(3)으로 표시되는 상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체를 얻는 공정이다.
상기 공정 (4)에 이용하는 처리는, 상기 식(39)로 표시되는 화합물 중의 Z1의 종류에 따라서 다르지만, Z1의 종류에 의해서 공지의 방법에 의해 적절하게 실시할 수 있다. 예를 들면, Z1이 아미노기의 보호체인 경우, 상기 공정(4)에 이용하는 처리는, 탈보호 처리이다. 상기 탈보호 처리는, 상기 아미노기의 보호체에 있어서의 보호기의 종류에 따라서 다르지만, 보호기가 9-플루오레닐메틸카보닐기인 경우, 탈보호는 예를 들면, 피페리딘 또는 피롤리딘 등의 2급 아민을 이용한 반응을 들 수 있다. 보호기가 3차-부톡시카보닐기인 경우, 탈보호는 트리플루오로아세트산, 4N 염산 등을 이용한 반응을 들 수 있다. 보호기가 벤질옥시카보닐기인 경우, 탈보호는, 팔라듐 탄소 촉매 존재 하에서의 접촉 수소 첨가를 들 수 있다. 예를 들면, Z1이 아지드기 또는 시아노기인 경우, 상기 공정(4)에 이용하는 처리는, 환원 처리이다. 상기 환원 처리는, Z1의 종류에 따라서 다르지만, Z1이 아지드기인 경우, 환원은 트리페닐포스핀을 환원제로서 이용하는 슈타우딩거(Staudinger) 환원 및 팔라듐 탄소 촉매 존재 하에서의 접촉 수소 첨가를 들 수 있다. Z1이 시아노기인 경우, 환원은 팔라듐 탄소 촉매 또는 니켈 촉매 등의 존재 하에서의 접촉 수소 첨가 등을 들 수 있다.
상기 반응 생성물은, 상기 공정(3)에 있어서의 분액 정제 처리에 의해, 불순물을 제거하는 것이 가능하기 때문에, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 등에 의한 정제가 불필요하다. 추가적으로, 수득되는 상기 식(3)으로 표시되는 화합물을 함유하는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체는, 그대로 상기 본 발명의 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조에 이용하는 것이 가능하지만, 또한 정석(crystallization), 흡착제 처리 또는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피등의 처리에 의해 정제한 후에 이용할 수 있다.
전술한 제조 방법에 따라, 상기 식(3)으로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체를 얻을 수 있다. 본 발명의 상기 식(3)으로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체는, 높은 쇄장 순도 및 높은 관능기 순도를 가지기 때문에, 예를 들면, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 등의 처리에 의한 정제를 실시하지 않고, 상기 식 (1) 또는 상기 식(2)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 높은 쇄장 순도 및 높은 관능기 순도로 얻을 수 있다.
상기 식 (3)으로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 쇄장 순도 및 관능기 순도는, 역상 크로마토그래피 측정에 의해 구할 수 있다.
식 (1)로 표시되는 화합물 중 L3이 단결합인 경우, 식(40)으로 표시되는 화합물의 수산기에, 디클로로메탄 용매 중의, 트리에틸아민의 존재 하에서, 디숙신이미딜 카보네이트를 반응시킴으로써 얻을 수 있다.
상기 식 (40)으로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 제조 방법은 하기의 공정 (1') 내지 공정 (4')를 적어도 이 순서로 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
[공정 (1')]
하기 식 (41)로 표시되는 단분산 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 하기 식 (42) 로 표시되는 화합물을, 수용액 중에서의 pKa가 15 내지 20인 염기 촉매를 이용하여 커플링시켜, 하기 식 (43)으로 표시되는 화합물을 얻는 공정 (1')을 포함한다.
Figure 112019035204716-pct00049
(식 (41) 중, Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고, B는 이탈기를 나타내고, n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다.),
Figure 112019035204716-pct00050
(식 (42) 중, A는 수산기의 보호기를 나타낸다.),
Figure 112019035204716-pct00051
(식 (43) 중, A는 수산기의 보호기를 나타내고, Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고, n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다.),
[공정 (2')]
공정 (2')는 상기 식 (43)으로 표시되는 화합물의 보호기 A를 탈보호시켜, 하기 식 (44)로 표시되는 화합물을 얻는 것을 포함한다.
Figure 112019035204716-pct00052
(식 (44) 중, Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고, n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다.)
[공정 (3')]
공정 (3')은 상기 식 (44)로 표시되는 화합물에 탈보호 처리 또는 환원 처리를 실시하고, 식 (40)으로 표시되는 상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 얻는 것을 포함한다.
[공정 (4')]
공정 (4')는 상기 식 (40)으로 표시되는 화합물에 분액 정제를 실시하는 것을 포함한다.
상기 염기 촉매는, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 칼륨 3차-부톡시드 및 나트륨 3차-부톡시드 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 식(40)으로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 쇄장 순도 및 관능기 순도는, 역상 크로마토그래피 측정에 의해 구할 수 있다.
<분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 결합체>
본 발명의 상기 식(1) 또는 식(2)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜을 이용하는 것으로서, 상기 화합물(헤테로형 폴리에틸렌 글리콜)과 생체기능성 분자가 결합되어 있는 헤테로형 단분산 폴리에틸렌 글리콜 결합체를 얻을 수 있다.
상기 생체 기능성 분자로서는, 단백 약제, 폴리펩티드, 효소, 항체, 항체의약, 유전자, 올리고핵산 등을 포함하는 핵산 화합물, 핵산의약, 항암제, 저분자량 약물 등의 그 외 약제를 들 수 있다.
상기 헤테로형 단분산 폴리에틸렌 글리콜 결합체를 얻는 방법으로서는, 예를 들면, 우선, 상기 식(1) 또는 상기 식(2)로 표시되는 화합물의 X1에 대해서 항암제 또는 단백 약제라고 하는 약제를 도입하고, 다른 말단 Y1에 항체를 결합하는 예를 들 수 있다. 상기 식(1) 또는 상기 식(2)로 표시되는 화합물은, 그의 양 말단에 서로 다른 관능기를 고순도로 가지며, ADC로서 사용하는 경우, 목적하는 항체 또는 목적하는 약제 중 어느 하나를 결손한 화합물의 생성을 억제시키기 위해, 상기 ADC의 효과의 향상을 기대할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 근거해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
또한, 각 합성예에 있어서, 핵자기 공명(1H-NMR) 측정에는 JEOL사제 JMTC-400을 이용하고, 질량 분석(ESI-MS) 측정에는 Waters(주)사제 Quattro micro 탠덤형 질량 분석계를 이용하였다.
(실시예 1-1)
식(5)로 표시되는 Z 1 이 아지드기인 화합물 4의 합성
Figure 112019035204716-pct00053
(식 중, Ms는 메탄술포닐기를 나타낸다.)
가지형 플라스크(eggplant-shaped flask)에 화합물 1 (20.0 g, 0.151 mol) 및 톨루엔(200 mL)을 넣고 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였고, 트리에틸아민 (18.4 g, 0.182 mol)을 이에 첨가하였다. 0℃에서 염화 메탄술포닐 (19.1 g, 0.167 mol)을 이에 적가하였고, 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 1의 소실을 확인하였고, 150 mL의 1M의 염산을 이에 첨가하여 분액하였다. 유기 상을 150 mL의 1M 염산으로 1회, 150 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액으로 2회, 150 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정했다. 유기상에 황산 나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 2를 얻었다.
Figure 112019035204716-pct00054
(식 중, Ms는 메탄술포닐기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 화합물 2 (20.8 g, 0.099 mol) 및 N,N'-디메틸포름아미드 (100 mL)를 넣고, 이에 아지드화나트륨 (7.72 g, 0.119 mol)를 첨가하여 100℃에서 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후에, 1H-NMR 측정에 의해 화합물 2의 소실을 확인하였고, 150 mL의 아세트산 에틸로 희석하였다. 얻어진 용액을 100 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회, 60 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 2회 세정하였다. 또한, 첫번째로 사용된 포화 염화나트륨 수용액에 100 mL의 아세트산 에틸을 첨가하고 추출하여, 이 유기상을 50 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 2회 세정하였다. 2개의 유기 상을 합하여, 황산나트륨을 여기에 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 3을 얻었다.
수량: 15.3 g
Figure 112019035204716-pct00055
가지형 플라스크에 화합물 3 (13.3 g, mol), 테트라하이드로푸란 (5 mL) 및 1M 염산 (10 mL)을 넣고, 상기 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 3의 소실을 확인하였고, 반응 용액을 감압 농축하였다(테트라하이드로푸란만). 잔사에 아세트산 에틸 (50 mL)을 첨가하고 분액하여, 유기 상을 30 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 3회 세정하였다. 유기 상에 황산 나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 4를 얻었다.
수량: 2.01 g
MS (ESI+): 화합물 4 118.1 [M+H]+
1H-NMR (CDCl3, 400MHz): 3.89 (m, 1H), 3.71 (dd, 1H), 3.61 (dd, 1H), 3.41 (m, 2H)
(실시예 1-2)
식 (3)으로 표시되는 Y 2 가 -NH 2 , n이 12인 화합물 9의 합성
Figure 112019035204716-pct00056
(식 중, Trt는 트리페닐메틸기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에『Polym. Chem., 2016, 7, 2389-2394』에 기재된 방법으로 얻을 수 있는 화합물 5(50.0g,63.4 mmol) 및 톨루엔 (250 mL)을 넣었다. 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였고, 트리에틸아민 (10.5 mL, 76.1 mmol)을 이에 첨가하였다. 0℃에서 염화 메탄술포닐 (5.4 mL, 69.8 mol)을 이에 적가하였고, 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 5의 소실을 확인하였고, 100 mL의 1M 염산을 이에 첨가하여 분액하였다. 유기 상을 100 mL의 1M 염산으로 1회, 100 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액으로 2회, 100 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정했다. 유기상에 황산나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 6을 얻었다.
수량: 52.0 g
[공정 (1)]
Figure 112019035204716-pct00057
(식 중, Trt는 트리페닐메틸기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 화합물 4 (1.64 g, 14.0 mmol) 및 화합물 6 (36.4 g, 42.0 mmol)를 넣고 톨루엔 공비(30mL×2)하였다. 테트라하이드로푸란 (270 mL)을 이에 첨가하였고, 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였다. 수산화칼륨(분말, 2.36 g, 42 mmol)을 이에 첨가하고 혼합물을 가열 환류 하에서 7시간 동안 교반하였다. 7시간 후, ESI-MS측정에 의해 화합물 4의 소실을 확인하였고, 10 mL의 포화 염화암모늄 수용액을 이에 첨가하고 반응을 퀀치하였다(quench). 이 용액을 감압하에 농축하였고 (테트라하이드로푸란만), 잔사를 150 mL의 톨루엔에 용해시켰다. 상기 용액을 100 mL의 이온 교환수로 2회, 100 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액으로 1회, 100 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 황산 나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 7을 얻었다.
수량: 35.5 g
[공정 (2) 내지 (3)]
Figure 112019035204716-pct00058
(식 중, Trt는 트리페닐메틸기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 화합물 7 (35.5 g) 및 메탄올 (180 mL)을 넣었다. P-톨루엔술폰산 일수화물 (3.99 g, 21.0 mmol) 및 헥산 (150 mL)을 이에 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 30분 후, 헥산 층을 제거하였고, 그 다음 헥산 (150 mL)을 이에 첨가하여, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 같은 조작을 4회 수행한 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 7의 소실을 확인하였고, 120 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액을 이에 첨가하였다. 이 혼합 용액을 150 ml의 헥산으로 2회 세정하였다. 생성물의 용액을 감압 하에 농축하였고, 잔사에 180 ml의 디클로로메탄을 첨가하였고, 180 mL 의 이온 교환수로 3회, 180 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정했다(10℃). 유기상에 황산 나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 갈색 고체로서 화합물 8을 얻었다.
수량: 11.5 g
[공정 (4)]
Figure 112019035204716-pct00059
가지형 플라스크에 화합물 8 (11.5 g) 및 메탄올 (60 mL)을 넣었고, 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였다. 팔라듐 탄소 (1.2 g)를 이에 첨가하였고, 가지형 플라스크 내를 수소로 퍼지하였고, 이어서 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 8의 소실을 확인하였고, 반응 용액을 여과하였다(유리 섬유 여과지). 여액을 감압 농축하여, 잔사를 60 mL의 디클로로메탄에 용해시켰다. 이 용액을 60 mL의 1M 염산으로 1회 추출하고, 60 mL의 디클로로메탄으로 2회 세정하였다. 수성 상에 염화나트륨을 첨가하여 포화시켰고, 60 mL의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기 상을 합하여, 황산나트륨을 여기에 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 9를 얻었다. 화합물 4를 기준으로 한 3 공정의 몰 수율은 51.0%이었다. 그 결과를 표 1에 요약하였다.
수량: 9.6 g
MS (ESI+): 화합물 9 1148.2 [M+H]+
1H-NMR (CDCl3, 400MHz): 3.62 (m, 99H), 3.16 (dd, 1H), 3.04 (dd, 1H))
(실시예 1-3)
X 1 이 활성 카보네이트기, Y 1 이 말레이미드기, L 2 가 에테르 결합, L 3 이 -NHC(O)-(CH 2 ) 2 - 이고 n이 12인, 식 (1)로 표시되는 화합물 11의 합성
Figure 112019035204716-pct00060
가지형 플라스크에, 3-말레이미도프로피온산 N-숙신이미딜 (301 mg, 1.1 mmol), 디부틸히드록시톨루엔 (4 mg, 0.018 mmol) 및 클로로포름 (30 mL)을 넣었다. 화합물 9 (1.0 g, 0.87 mmol) 및 트리에틸아민 (0.17 mL, 1.2 mmol)을 클로로포름 (20 mL)에 용해하였고, 용액을 실온에서 플라스크로 적가하였다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후, ESI-MS의 측정에 의해 화합물 9의 소실을 확인하였고, 50 mL의 포화 염화나트륨 수용액 (pH = 2.0)를 이에 첨가하여 분액하였다. 유기상을 50 mL의 포화 염화나트륨 수용액 (pH = 2.0)로 세정하여, 감압 농축하였다. 잔사에 50 mL의 시트르산 버퍼 (pH = 3.0)를 첨가하였고, 혼합물을 50 mL의 톨루엔-클로로포름(10:3 w/w)으로 3회 세정하였다. 수성 상을 클로로포름 50 mL로 3회 추출했다. 유기상을 합하였고, 황산마그네슘을 여기에 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 백색 고체로서 화합물 10을 얻었다.
수량: 928 mg
Figure 112019035204716-pct00061
가지형 플라스크에, 화합물 10 (928 mg, 0.71 mmol), 트리에틸아민 (0.32 mL, 2.3 mmol), 디부틸히드록시톨루엔 (3 mg, 0.014 mmol) 및 디클로로메탄 (45 mL)을 넣었다. 디숙신이미딜 카보네이트 (538 mg, 2.1 mmol)를 여기에 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후, ESI-MS의 측정에 의해 화합물 10의 소실을 확인하였고, 45 mL의 염화나트륨 수용액 (pH = 2.0)을 이에 첨가하여 분액하였다. 유기 상을 45 mL의 염화나트륨 수용액 (pH = 2.0)으로 세정하였고, 감압 농축하였다. 잔사에 45 mL의 1M 염산을 첨가하였고, 혼합물을 45 mL의 아세트산 에틸로 2회 세정하였고, 수성 상을 45 mL 의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 유기상을 합하였고, 45 mL의 20% 염화나트륨 수용액으로 2회 세정한 후, 유기 상을 합하였고, 황산마그네슘을 여기에 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 백색 고체로서 화합물 11을 얻었다.
수량: 994 mg
MS (ESI+): 화합물 11 1598.7 [M+NH4]+
1H-NMR (CD3OD, 400MHz): 6.83 (s, 2H), 4.47 (m, 4H), 3.62 (m, 97H), 3.38 (dd, 1H), 3.18 (dd, 1H), 2.83 (s, 8H), 2.49 (t, 2H)
(실시예 2-1)
Z 1 이 아미노기의 보호체, m5가 3인, 식 (5)로 표시되는 화합물 15의 합성
Figure 112019035204716-pct00062
2-구(two-necked) 가지형 플라스크에, 3-보카미노(Bocamino)-1-프로판올 12 (5.0 g, 28.5 mmol) 및 톨루엔 (25 mL)을 넣었고, 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였고, 트리에틸아민 (5.14 mL, 37.1 mmol)을 이에 첨가하였다. 0℃에서 염화 메탄술포닐 (2.43 mL, 31.4 mmol)을 적가하였고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 12의 소실을 확인하였고, 25 mL의 1M 염산을 이에 첨가하여 분액하였다. 유기상을 25 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액으로 1회, 25 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 3 g의 황산나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 13을 얻었다.
수량: 6.9 g
Figure 112019035204716-pct00063
(식 중, Ms는 메탄술포닐기를 나타낸다.)
4-구 가지형 플라스크에 수소화나트륨(1.5 g)을 넣었고, 이어서 질소 퍼지하였다. 10 mL의 헥산으로 2회 세정하고, 30 mL의 N,N'-디메틸포름아미드를 여기에 첨가하였고, 혼합물을 0℃로 냉각하였다. 20 mL의 N,N'-디메틸포름아미드를 화합물 1 (5.31 g, 40.2 mmol)에 혼합하였고, 상기 혼합물을 적하 깔대기에 넣었고, 30분에 걸쳐 적가하였다. 적가 종료 후, 화합물 13 (6.87 g, 28.7 mmol)에 20 mL의 N,N'-디메틸포름아미드를 혼합하였고, 혼합물을 동일한 적하 깔대기에 넣고, 15분에 걸쳐 적가하였다. 적가 종료 후, 반응 혼합물의 온도를 40℃로 상승시켰고, 이어서 3시간 동안 교반하였다. 3시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 13의 소실을 확인하였고, 반응 혼합물을 실온으로 방랭하였다. 반응 혼합물에 150 mL의 아세트산 에틸을 첨가하였고, 100 mL의 포화 염화암모늄 수용액으로 1회, 100 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 2회 세정하였다. 유기상에 15 g의 황산나트륨 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 14를 얻었다.
수량: 6.9 g
Figure 112019035204716-pct00064
가지형 플라스크에, 화합물 14 (6.90 g, 23.8 mmol), 테트라하이드로푸란 (20 ml) 및 1M 염산 (20 mL)을 넣었고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 14의 소실을 확인하였고, 반응 혼합물에 50 mL의 아세트산 에틸을 첨가하였다. 이 혼합 용액을 50 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 2회 세정하였다. 유기상에 5 g의 황산나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 15를 얻었다.
수량: 1.7 g
MS (ESI+): 화합물 15 250.2 [M+H]+
1H-NMR (CDCl3, 400MHz): 4.83 (s, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.70 (dd, 1H), 3.64 (dd, 1H), 3.51 (m, 4H), 3.25 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 1.44 (s, 9H)
(실시예 2-2)
Y 1 이 -O-(CH 2 ) 3 -NH 2 이고 n이 24인 식 (3)으로 표시되는 화합물 23의 합성
Figure 112019035204716-pct00065
(식 중, Bn은 벤질기, Trt는 트리페닐메틸기를 나타낸다.)
1-리터 4-구 가지형 플라스크에 수소화나트륨 (1.83 g)을 넣었고, 이어서 질소 퍼지하였다. 탈수 헥산 (20 mL)으로 2회 세정하였고, 80 mL의 아세토니트릴을 이에 첨가하였고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 20 mL의 톨루엔으로 3회 공비 탈수를 실시한 화합물 5 (30.0 g, 38.0 mmol)를 40 mL의 아세토니트릴과 혼합하였고, 상기 혼합물을 적하 깔대기에 넣었고, 30분에 걸쳐 적가하였다. 적가 종료 후, 반응 혼합물의 온도를 40℃로 상승시켰고, 이어서 30분 동안 교반시켰다. 염화벤질 (4.15 mL, 36.1 mmol)을 동일한 적하 깔대기에 넣고, 15분에 걸쳐 적가하였다. 적가 종료 후, 반응 혼합물의 온도를 40℃로 상승시켰고, 이어서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, 박층 크로마토그래피 (헥산:아세트산 에틸 = 4:1 by vol.)를 이용해 염화 벤질의 소실을 확인하였고, 반응 혼합물을 실온으로 방랭하였다. 반응 혼합물에 20 mL의 포화 암모늄 수용액을 첨가한 후, 상기 혼합물을 감압 농축하였고, 잔사에 100 ml의 톨루엔을 첨가하였다. 이 톨루엔 용액을 100 mL의 포화 염화암모늄 수용액으로 2회, 100 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 10 g의 황산나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 16을 얻었다.
수량: 30.9 g
Figure 112019035204716-pct00066
(식 중, Bn은 벤질기, Trt는 트리페닐메틸기를 나타낸다.)
1-리터 가지형 플라스크에 화합물 16 (30.9 g, 35.1 mmol) 및 메탄올 (240 mL)을 넣은 후, p-톨루엔술폰산 일수화물 (3.3 g , 17.6 mmol) 및 헥산 (90 mL)을 이에 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 30분 후, 상층으로서 헥산층을 제거한 후에 헥산 (90 mL)을 이에 첨가하였고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 같은 조작을 6회 동안 실시한 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 16의 소실을 확인하였고, 0℃에서 100 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액을 첨가하였다. 이 혼합 용액을 90 mL의 헥산으로 2회 세정하였다. 생성물의 용액을 감압 농축하여, 100 mL의 이온 교환수에 잔사를 용해하였고, 100 mL의 톨루엔으로 2회 세정하였다. 하층으로서 수용액에 30 g의 염화나트륨을 첨가하여 포화 농도를 달성한 후에, 100 mL의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 추출한 유기상에 20 g의 황산나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 17을 얻었다.
수량: 15.6 g
Figure 112019035204716-pct00067
(식 중, Trt는 트리페닐메틸기, Bn은 벤질기를 나타낸다.)
2-구 가지형 플라스크에, 수소화나트륨 (219 g, 50.2 mmol)을 넣고, 이어서 질소 퍼지하였다. 탈수 헥산(25mL×2회)으로 2회 세정하였고, 50 mL의 아세토니트릴을 이에 첨가하여, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 화합물 17(22.8 g, 35.8 mmol)을 15 mL의 톨루엔으로 3회 공비 탈수를 실시한 후에, 25 mL의 아세토니트릴과 혼합하였고, 상기 혼합물을 적하 깔대기에 넣었고, 30분에 걸쳐 적가하였다. 50 mL의 톨루엔으로 3회 공비 탈수를 실시한 화합물 6 (52.8 g, 60.9 mmol)과 30 mL의 아세토니트릴을 혼합하여, 동일한 적하 깔대기에 넣었고, 15분에 걸쳐 적가하였다. 적가 종료 후, 반응 혼합물의 온도를 80℃로 상승시켰고, 이어서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, ESI-MS측정에 의해 화합물 16의 소실을 확인하였고, 나트륨 메톡시드의 메탄올 용액(3.5 mL)을 이에 첨가하였고, 이어서 30분 동안 교반하였다. 30분 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 16의 소실을 확인하였고, 반응 혼합물을 실온으로 방랭하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하였고, 잔사에 350 mL의 톨루엔을 첨가하였다. 톨루엔 용액을 350 mL의 포화 염화암모늄 수용액으로 2회, 350 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 황산나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 18을 얻었다.
수량: 55.8 g
Figure 112019035204716-pct00068
(식 중, Trt는 트리페닐메틸기, Bn은 벤질기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 화합물 18 (55.8 g) 및 메탄올 (300 mL)을 넣었다. p-톨루엔술폰산 일수화물 (3.76 g , 19.8 mmol) 및 헥산 (320 mL)을 이에 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 30분 후, 헥산층을 제거한 후에, 헥산 (200 mL)을 이에 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 같은 조작을 6회 수행한 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 18의 소실을 확인하였고, 300 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액을 이에 첨가하였다. 이 혼합 용액을 200 mL의 헥산으로 2회 세정하였다. 생성물의 용액을 감압 농축하고, 잔사에 400 mL의 디클로로메탄을 첨가하고 400 mL의 이온 교환수로 3회, 400 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 황산나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 백색 고체로서 화합물 19를 얻었다.
수량: 39.3 g
Figure 112019035204716-pct00069
(식 중, Bn은 벤질기, Ms는 메탄술포닐기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 화합물 19 (14.7 g, 12.6 mmol) 및 톨루엔 (70 ml)을 넣었다. 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였고, 트리에틸아민 (2.1 mL, 15.1 mmol)을 이에 첨가하였다. 0℃에서 염화 메탄술포닐 (1.1 mL, 13.9 mmol)를 적가하였고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 19의 소실을 확인하였고, 70 mL의 1M 염산을 이에 첨가하여 분액하였다. 유기상을 70 mL의 1M 염산으로 1회, 70 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액으로 2회, 70 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 황산 나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 백색 고체로서 화합물 20을 얻었다.
수량: 12.7 g
Figure 112019035204716-pct00070
가지형 플라스크에 화합물 15 (0.82 g, 3.29 mmol) 및 화합물 20 (12.7 g, 10.2 mmol)를 넣고 톨루엔 공비(15 mL×2)하였다. 테트라하이드로푸란 (60 mL)을 이에 첨가하였고, 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였다. 수산화나트륨 (408 mg, 10.2 mmol)을 이에 첨가하고, 혼합물을 가열 환류 하에서 7시간 동안 교반하였다. 7시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 15의 소실을 확인하였고, 20 mL의 포화 염화암모늄 수용액을 이에 첨가하고 반응을 퀀치하였다. 이 용액을 감압하에 농축하였고 (테트라하이드로푸란만), 잔사를 60 mL의 톨루엔에 용해시켰다. 상기 용액을 60 mL의 포화 염화암모늄 수용액으로 1회, 60 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 황산 나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 백색 고체로서 화합물 21을 얻었다.
수량: 8.5 g
Figure 112019035204716-pct00071
가지형 플라스크에 화합물 21 (8.5 g) 및 메탄올 (40 mL)을 넣었고, 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였다. 팔라듐 탄소 (900 mg)를 이에 첨가하였고, 가지형 플라스크 내를 수소로 퍼지하였고, 이어서 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 21의 소실을 확인하였고, 반응 용액을 여과하였다(유리 섬유 여과지). 여액을 감압 농축하여, 잔사를 40 mL의 디클로로메탄에 용해시켰다. 이 용액을 40 mL의 이온 교환수로 3회 세정하였다. 유기 상에 황산나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 백색 고체로서 화합물 22를 얻었다.
수량: 3.9 g
Figure 112019035204716-pct00072
가지형 플라스크에 화합물 22 (3.9 g, 1.6 mmol) 및 디클로로메탄 (20 mL)을 넣고, 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였다. 0℃에서 트리플루오로아세트산 (0.15 mL, 1.9 mmol)을 이에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 22의 소실을 확인하였고, 트리에틸아민 (0.31 mL, 2.2 mmol)을 이에 첨가하고 반응을 퀀치하였다. 이 용액을 20 mL의 1M 염산으로 3회 추출하였다. 수성 상을 합쳐서, 20 mL 의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기상을 합쳐서 황산 나트륨을 이에 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체의 화합물 23을 얻었다.
수량: 3.4 g
(실시예 2-3)
X 1 이 아지드기, Y 1 이 브로모아세트아미드기, L 1 이 -(CH 2 ) 2 -, L 2 가 에테르 결합, L 3 이 -O-(CH 2 ) 3 - 이고, n이 23인 식 (1)로 표시되는 화합물 25의 합성
Figure 112019035204716-pct00073
가지형 플라스크에 화합물 23 (1.0 g, 0.44 mmol), 5-아지도펜타노익산 (68.7 mg, 0.48 mmol) 및 클로로포름 (5 mL)을 넣었다. 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염 (104 mg, 0.53 mmol)을 이에 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 4시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 23의 소실을 확인하였고, 반응 용액을 여과하였다. 여액을 5 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액로 3회, 5 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 황산마그네슘을 이에 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 백색 고체로서 화합물 24를 얻었다.
수량: 1.0 g
Figure 112019035204716-pct00074
가지형 플라스크에, 화합물 24 (1.0 g 0.42 mmol), 트리에틸아민 (0.32 mL, 1.0 mmol), 디부틸히드록시톨루엔 (3 mg, 0.014 mmol) 및 디클로로메탄 (50 mL)을 넣었다. 디숙신이미딜 카보네이트 (237 mg, 0.92 mmol)를 이에 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 24의 소실을 확인하였고, 50 mL의 염화나트륨 수용액 (pH = 2.0)를 이에 첨가하여 분액하였다. 유기상을 50 mL의 염화나트륨 수용액 (pH = 2.0)으로 세정하여 감압 농축하였다. 잔사에 50 mL의 1M 염산을 첨가하였고, 혼합물을 50 mL의 아세트산 에틸으로 2회 세정하였고, 수성 상을 50 mL의 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 유기상을 합하였고, 50 mL의 20% 염화나트륨 수용액으로 2회 세정하였고, 그 다음 유기상을 합하였고, 황산마그네슘을 이에 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 백색 고체로서 화합물 25를 얻었다.
수량: 1.0 g
MS (ESI+): 화합물 25 1352.6 [M+2NH4]2+
1H-NMR (CD3OD, 400MHz): 4.43 (m, 4H), 3.64 (m, 195H), 3.41 (m, 2H), 3.22 (m, 2H), 2.80 (s, 8H), 2.71 (t, 2H), 1.74 (m, 2H), 1.46 (m, 4H)
(실시예 3-1)
X 1 이 활성 카보네이트기, Y 1 이 브로모아세트아미드기, L 2 가 에테르 결합이고, n이 12인, 식 (1)로 표시되는 화합물 27의 합성
Figure 112019035204716-pct00075
가지형 플라스크에 실시예 1-2에서 수득한 화합물 9 (1.0 g, 0.87 mmol) 및 톨루엔 (5 mL)을 넣었다. 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였고, 트리에틸아민 (0.145 mL, 1.04 mmol)을 이에 첨가하였다. 0℃에서 브로모아세틸브로미드 (0.083 mL, 0.95 mmol)를 이에 적가하였고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 9의 소실을 확인하였고, 5 mL의 1M 염산을 이에 첨가하여 분액하였다. 유기상을 5 mL의 1M 염산으로 1회, 5 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액으로 2회, 5 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 황산나트륨을 첨가하여 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 26을 얻었다.
수량: 1.03 g
Figure 112019035204716-pct00076
가지형 플라스크에, 화합물 26 (1.03 g, 0.81 mmol) 및 톨루엔 (5 mL)을 넣었다. 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였고, 트리에틸아민 (0.27 mL, 1.94 mmol)을 이에 첨가하였다. 0℃에서 4-니트로페닐 클로로포름산염 (359 mg, 1.78 mmol)을 이에 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 26의 소실을 확인하였고, 5 mL의 1M 염산을 이에 첨가하여 분액하였다. 유기상을 5 mL의 1M 염산으로 1회, 5 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 황산나트륨을 첨가하였고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 백색 고체로서 화합물 27을 얻었다.
수량: 1.20 g
MS (ESI+): 화합물 27 816.8 [M+2NH4]2+
1H-NMR (CD3OD, 400MHz): 8.37 (d, 2H), 7.44 (d, 2H), 4.31 (m, 4H), 4.10 (s, 2H), 3.64 (m, 95H), 3.41 (m, 2H)
(실시예 4-1)
X 1 이 활성 에스테르기, Y 1 이 알키닐기, L 1 이 -(CH 2 ) 2 -, L 2 가 에테르 결합, L 3 이 -NHC(O)-(CH 2 ) 2 -이고 n이 12인, 식 (1)로 표시되는 화합물 31의 합성
Figure 112019035204716-pct00077
가지형 플라스크에 디벤조시클로옥틴-N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (198 mg, 0.48 mmol) 및 클로로포름 (2 mL)을 넣었다. 실시예 1-2로 수득한 화합물 9 (500 mg, 0.44 mmol) 및 트리에틸아민 (0.072 mL, 0.52 mmol)을 클로로포름 (1 mL) 중에 용해하였고, 상기 용액을 실온에서 플라스크로 적가하였다. 실온에서 4시간 교반한 후, ESI-MS 측정에 의해 디벤조시클로옥틴-N-히드록시숙신이미딜 에스테르의 소실을 확인하였고, 5 mL의 1M 염산을 이에 첨가하여 분액하였다. 유기상을 5 mL의 1M 염산으로 1회, 5 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하여, 감압 농축하였다. 유기상에 황산마그네슘을 첨가하였고, 건조 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여 백색 고체로서 화합물 28을 얻었다.
수량: 613 mg
Figure 112019035204716-pct00078
가지형 플라스크에 화합물 28 (613 mg, 0.43 mmol) 및 염화 메틸렌 (12 mL)을 넣었다. 0℃에서 수산화칼륨 (분말, 24 mg, 0.43 mmol) 이에 첨가하였고, 아크릴산 3차-부틸 (0.38 mL, 2.58 mmol)을 적가하였고, 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 1.5 시간 후, ESI-MS 측정에 의해 반응의 진행을 확인하였고, 2시간 후, 5 mL의 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하였다. 이 혼합 용액을 분액한 후, 유기상을 5 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 황산마그네슘을 첨가하여 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 29를 얻었다.
수량: 715 mg
Figure 112019035204716-pct00079
가지형 플라스크에 화합물 29 (715 mg, 0.42 mmol) 및 1M 염산 (3 mL)을 넣었고, 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, ESI－MS측정에 의해 화합물 29의 소실을 확인하였고, 혼합물을 실온으로 냉각하였다. 반응 용액에 5 mL의 디클로로메탄을 첨가하고 분액하였다. 유기상을 5 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액으로 1회, 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 황산마그네슘을 첨가하였고 건조 이어서, 여과하였다. 여액을 감압 농축하여 백색 고체로서 화합물 30을 얻었다.
수량: 641 mg
Figure 112019035204716-pct00080
가지형 플라스크에 화합물 30 (641 mg, 0.41 mmol), N-히드록시숙신이미드 (112 mg, 0.97 mmol) 및 클로로포름 (5 mL)을 넣었다. 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염 (202 mg, 1.05 mmol)를 이에 첨가하였고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 4시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 30의 소실을 확인하였고, 반응 용액을 여과하였다. 여액을 5 mL의 시트르산 버퍼 (pH = 3.0)로 3회, 5 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 여기에 황산마그네슘을 첨가하였고 건조 이어서, 여과하였다. 여액을 감압 농축하여 백색 고체로서 화합물 31을 얻었다.
수량: 633 mg
MS (ESI+): 화합물 31 904.3 [M+2NH4]2+
1H-NMR (CD3OD, 400MHz): 7.48 (m, 8H), 5.13 (d, 1H), 3.64 (m, 104H), 3.40 (m, 2H), 2.98 (m, 4H), 2.83 (s, 8H), 2.66 (t, 4H)
<식 (1)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 쇄장 순도 및 관능기 순도>
(실시예 5-1)
[쇄장 순도의 측정]
실시예 1-3으로 합성한 화합물 11의 쇄장 순도는, 실시예 1-2로 합성한 화합물 9의 쇄장 순도를 이용하였다.
화합물 9의 역상 크로마토그래피 측정의 결과, 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 수를 나타내는 n이 12인 분기형 단분산 폴리에틸렌 글리콜이 93.4%이고, n이 12가 아닌 화합물의 합계가 6.6%으로 포함되어 있었기 때문에, 쇄장 순도는 93.4%이었다. 결과를 표 1에 요약하였다.
추가적으로, 상기 역상 크로마토그래피 측정에 있어서는, 검출기로서 질량 분석계를 이용하여 각 피크의 동정을 실시한 후에, 검출기로서 시차 굴절률계를 이용하여 산출된 각 피크의 면적값으로부터 순도를 구한다. 검출기로서 질량 분석계를 이용하는 경우는, 기기로서 Waters(주) 사제 Alliance 2695를, 검출기(질량 분석계)로 Waters(주) 사제 Quattro micro 탠덤형 질량 분석계를, 컬럼으로 Tosoh(주) 사제 TSKgel ODS-80Ts(입자 지름: 5μm, 컬럼 사이즈: 4.6mm×25 cm)를, 전개 용매로 5 mM 아세트산 암모늄 메탄올/증류수 = 45/55를, 각각 이용하여 유속 0.6 mL/min, 컬럼 온도 45℃, 샘플 농도 0.01 mg/g, 주입량 5μL의 조건으로 측정을 수행하였다. 검출기로서 시차굴절률계를 이용하는 경우는, 기기로 Tosoh(주) 사제 build GPC system HLC-8220을, 검출기(시차굴절률계)로서 Tosoh(주) 사제 RI-8020을, 컬럼으로서 Tosoh(주) 사제 TSKgel ODS-80Ts(입자 지름: 5μm, 컬럼 사이즈: 4.6mm×25 cm)를, 전개 용매로서 5 mM 아세트산 암모늄 메탄올/증류수 = 45/55를, 각각 이용하여 유속 0.6 mL/min, 컬럼 온도 45℃, 샘플 농도 0.2 mg/mL, 주입량 40μL의 조건으로 측정을 수행하였다.
[관능기 순도의 측정]
실시예 1-3으로 합성한 화합물 11의 관능기 순도는, 화합물 9의 관능기 순도를 기초로 하여, 1H-NMR 측정에 의해 구하였다.
구체적으로는, 화합물 9의 역상 크로마토그래피 측정의 결과로서, 말단에 수산기를 2개, 아미노기를 1개 가지는 화합물이 99.9%, 말단 관능기의 조합이 다른 화합물이 0.1% 포함되어 있었기 때문에, 관능기 순도는 99.9%이었다. 또한, 화합물 9로부터 화합물 10을 얻는 반응에 있어서, 화합물 9의 아미노기의α-위치의 메틸렌기 유래의 피크(3.16, 3.04 ppm, 2H)가 소실하였고, 3.38 및 3.18 ppm에서 새로운 피크가 관측되었다. 반응에 있어서 적분값이 변화하지 않는 피크(3.62 ppm, 97H)를 기준으로 했을 경우, 새로운 피크의 적분값은, 합계로 1.997이었기 때문에, 말레이미드기의 도입율은 99.9%(=1.997÷2×100)이었다.
후속적으로, 화합물 11의 1H-NMR 스펙트럼에 있어서의 말레이미드기 유래의 피크(6.83 ppm, 2H)의 적분값을 기준(2.0)으로 했을 경우, 활성 카보네이트기 유래의 피크(4.47 ppm, 4 H)의 적분값은 3.840이었고, 따라서 활성 카보네이트기의 도입율은 96.0%(=3.840÷4)이었다. 따라서, 화합물 11의 관능기 순도는, 95.8%(=99.9×0.999×0.96)이었다. 결과를 표 1에 요약하였다.
(실시예 5-2)
[쇄장 순도의 측정]
실시예 2-3으로 합성한 화합물 25의 쇄장 순도로서, 실시예 2-2로 합성한 화합물 23의 쇄장 순도를 이용하였다.
화합물 23의 역상 크로마토그래피 측정의 결과, 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 수를 나타내는 n이 24인 분기형 단분산 폴리에틸렌 글리콜이 91.6%, n이 24가 아닌 화합물이 합계가 8.4%로 포함되어 있었기 때문에, 쇄장 순도는 91.6%이었다. 결과를 표 1에 요약하였다. 역상 크로마토그래피 측정은, 전개 용매로서 5 mM 아세트산 암모늄 메탄올/증류수 = 55/45를 이용한 것을 제외하고는, 실시예 5-1과 같은 방법으로 수행하였다.
[관능기 순도의 측정]
실시예 2-3으로 합성한 화합물 25의 관능기 순도는, 실시예 7-1과 동일한 방법으로 1H-NMR 측정에 의해 구하였다.
화합물 23의 역상 크로마토그래피 측정의 결과, 관능기 순도는 99.9%이었다. 또한, 화합물 23으로부터 화합물 24를 얻는 반응에 있어서, 화합물 23의 아미노기의α-위치의 메틸렌기 유래의 피크(3.10 ppm, 2 H)가 소실하였고, 3.41 ppm에서 새로운 피크가 관측되었다. 반응에 있어서 적분값이 변화하지 않는 피크(3.64 ppm, 195 H)를 기준으로 했을 경우, 새로운 피크의 적분값은, 합계로 1.990 이었기 때문에, 아지드기의 도입율은 99.5%(=1.990÷2×100)이었다. 후속적으로, 화합물 25의 1H-NMR 스펙트럼에 있어서의 아지드기 유래의 피크(3.22 ppm, 2H)의 적분값을 기준(2.0)으로 했을 경우, 활성 카보네이트기 유래의 피크(4.43 ppm, 4 H)의 적분값은 3.905이었고, 따라서, 활성 카보네이트기의 도입율은 97.6%(=3.905÷4)이었다. 따라서 화합물 25의 관능기 순도는, 97.0%(=99.9×0.995×0.976)이었다. 결과를 표 1에 요약하였다.
(실시예 5-3)
[쇄장 순도의 측정]
실시예 3-1로 합성한 화합물 27의 쇄장 순도는, 실시예 5-1과 같은 방법으로 구하였다. 쇄장 순도는 93.4%이었다. 결과를 표 1에 요약하였다.
[관능기 순도의 측정]
실시예 3-1로 합성한 화합물 27의 관능기 순도는, 실시예 5-1과 같은 방법으로 1H-NMR 측정에 의해 구하였다.
화합물 9의 역상 크로마토그래피 측정의 결과로서, 관능기 순도는 99.9%이었다. 또한, 화합물 9로부터 화합물 26을 얻는 반응에 있어서, 화합물 9의 아미노기의α-위치의 메틸렌기 유래의 피크(3.16, 3.04 ppm, 2 H)가 소실하였고, 3.41 ppm에서 새로운 피크가 관측되었다. 반응에 있어서 적분값이 변화하지 않는 피크(3.62 ppm, 97 H)를 기준으로 했을 경우, 새로운 피크의 적분값은 1.992이었기 때문에, 브로모아세트아미드기의 도입율은 99.6%(=1.992÷2×100)이었다. 후속적으로, 화합물 27의 1H-NMR 스펙트럼에 있어서의 브로모아세트아미드기 유래의 피크(4.13 ppm, 2 H)의 적분값을 기준(2.0)으로 했을 경우, 활성 카보네이트기 유래의 피크(4.31 ppm, 4 H)의 적분값은 3.896이었다. 따라서 활성 카보네이트기의 도입율은 97.4%(=3.896÷4)이었다. 따라서 화합물 27의 관능기 순도는, 96.9%(=99.9×0.996×0.974)이었다. 결과를 표 1에 요약하였다.
(실시예 5-4)
[쇄장 순도의 측정]
실시예 4-1로 합성한 화합물 31의 쇄장 순도는, 실시예 5-1과 같은 방법으로 구하였다. 쇄장 순도는 93.4%이었다.
[관능기 순도의 측정]
실시예 4-1로 합성한 화합물 31의 관능기 순도는, 1H-NMR 측정에 의해 구하였다.
화합물 30의 역상 크로마토그래피 측정의 결과로서, 관능기 순도는 99.9%이었다. 또한, 화합물 9로부터 화합물 28을 얻는 반응에 있어서, 화합물 9의 아미노기의α-위치의 메틸렌기 유래의 피크(3.16, 3.04 ppm, 2H)가 소실하였고, 3.40 ppm에서 새로운 피크가 관측되었다. 반응에 있어서 적분값이 변화하지 않는 피크(3.62 ppm, 97H)를 기준으로 했을 경우, 새로운 피크의 적분값은 1.998이었기 때문에, 알키닐기의 도입율은 99.9%(=1.998÷2×100)이었다. 후속적으로, 화합물 31의 1H-NMR 스펙트럼에 있어서의 알키닐기 유래의 피크(2.98 ppm, 4 H)의 적분값을 기준(4.0)으로 했을 경우, 활성 에스테르기 유래의 피크(2.83 ppm, 8 H)의 적분값은 7.624이었다. 따라서 활성 에스테르기의 도입율은 95.3%(=7.624÷8)이었다. 따라서 화합물 31의 관능기 순도는, 95.1%(=99.9×0.999×0.953)이었다. 결과를 표 1에 요약하였다.
샘플 쇄장 순도 (%) 관능기 순도 (%)
실시예 5-1 실시예 1-3에서 얻은 화합물 11 93.4 95.8
실시예 5-2 실시예 2-3에서 얻은 화합물 25 91.6 97.5
실시예 5-3 실시예 3-1에서 얻은 화합물 27 93.4 96.9
실시예 5-4 실시예 4-1에서 얻은 화합물 31 93.4 95.2
<식 (3)으로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 제조용 중간체의 쇄장 순도 및 관능기 순도>
(실시예 6-1)
화합물 4와 화합물 6 사이의 반응에 있어서의 염기 촉매로서 수산화칼륨 대신에 수산화나트륨을 이용한 것 외에는, 실시예 1-2와 동일한 방법으로 화합물 9를 얻었다. 화합물 4를 기준으로 한 3 공정의 몰수율은, 48.3%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
(실시예 6-2)
화합물 4와 화합물 6 사이의 반응에 있어서의 염기 촉매로서 수산화칼륨 대신에 칼륨 3차-부톡시드를 이용한 것 외에는, 실시예 1-2와 동일한 방법으로 화합물 9를 얻었다. 화합물 4를 기준으로 한 3 공정의 몰수율은, 50.1%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
(실시예 7-1)
실시예 1-2로 합성한 화합물 9의 순도는, 역상 크로마토그래피 측정에 의해 구하였다.
측정 조건은 실시예 5-1의 것과 같은 방법이었다. 그 결과, 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 수를 나타내는 n이 12인 분기형 단분산 폴리에틸렌 글리콜이 93.4%이고, n이 12가 아닌 화합물의 합계가 6.6%으로 포함되어 있었기 때문에, 쇄장 순도는 93.4%이었다. 또한, 말단에 수산기를 2개, 아미노기를 1개 가지는 화합물이 99.9%, 말단 관능기의 조합이 다른 화합물이 0.1%로 포함되어 있었기 때문에, 관능기 순도는 99.9%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
(실시예 7-2)
실시예 6-1로 합성한 화합물 9의 순도는, 실시예 5-1과 같은 방법으로 구하였다. 쇄장 순도는 91.8%이었고, 관능기 순도는 99.9%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
(실시예 7-3)
실시예 6-2로 합성한 화합물 9의 쇄장 순도는, 실시예 5-1과 같은 방법으로 구하였다. 쇄장 순도는 92.6%이었고, 관능기 순도는 99.7%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
(참고예 1-1: 공정(1)의 염기 촉매를 변경하는 경우)
화합물 4와 화합물 6 사이의 반응에 있어서의 염기 촉매로서 수산화칼륨 대신에 수소화나트륨을 이용한 것 외에는, 실시예 1-2와 동일한 방법으로 화합물 9를 얻었다. 화합물 4를 기준으로 한 3 공정의 몰수율은, 23.2%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
(참고예 1-2: 공정(3)의 분액 온도를 변경하는 경우)
공정(3)에 있어서의 분액 세정 시의 온도를 25℃로 변경한 것 외에는, 실시예 1-2와 동일한 방법으로 화합물 9를 얻었다. 화합물 4를 기준으로 한 3 공정의 몰수율은, 52.8%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
(참고예 1-3: 청구항 5 기재의 보호기 A와 관능기 Z가 바람직하지 않은 조합의 경우)
화합물 6 대신에 화합물 35를 이용한 것 외에는, 실시예 1-2와 동일한 방법으로 화합물 9를 얻었다. 화합물 4를 기준으로 한 3 공정의 몰수율은, 36.2%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
Figure 112019035204716-pct00081
(식 중, Bn은 벤질기, Ms는 메탄술포닐기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 화합물 17 (15.6 g, 24.5 mmol) 및 톨루엔 (80 ml)을 넣었다. 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였고, 트리에틸아민 (4.1 mL, 29.4 mmol)을 이에 첨가하였다. 0℃에서 염화 메탄술포닐 (2.1 mL, 27.0 mol)을 이에 적가하였고, 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 17의 소실을 확인하였고, 80 mL의 1M 염산을 이에 첨가하여 분액하였다. 유기 상을 80 mL의 1M 염산으로 1회, 80 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액으로 2회, 80 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정했다. 유기상에 황산나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 32를 얻었다.
수량: 16.7 g
Figure 112019035204716-pct00082
(식 중, Bn은 벤질기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 화합물 4 (1.64 g, 14.0 mmol) 및 화합물 32 (30.0 g, 42.0 mmol)를 넣고 톨루엔 공비(30mL×2)하였다. 테트라하이드로푸란 (270 mL)을 이에 첨가하였고, 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였다. 수산화칼륨 (분말, 2.36 g, 42 mmol)을 이에 첨가하고 혼합물을 가열 환류 하에서 7시간 동안 교반하였다. 7시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 4의 소실을 확인하였고, 10 mL의 포화 염화암모늄 수용액을 이에 첨가하고 반응을 퀀치하였다. 이 용액을 감압하에 농축하였고 (테트라하이드로푸란만), 잔사를 150 mL의 톨루엔에 용해시켰다. 상기 용액을 100 mL의 이온 교환수로 2회, 100 mL의 포화 중탄산나트륨 수용액으로 1회, 100 mL의 포화 염화나트륨 수용액으로 1회 세정하였다. 유기상에 황산 나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 33을 얻었다.
수량: 30.2 g
Figure 112019035204716-pct00083
(식 중, Bn은 벤질기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 화합물 33 (30.2 g) 및 메탄올 (150 mL)을 넣었고, 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였다. 팔라듐 탄소 (3.0 g)를 이에 첨가하였고, 가지형 플라스크 내를 수소로 퍼지하였고, 이어서 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후, ESI-MS 측정에 의해 화합물 33의 소실을 확인하였고, 반응 용액을 여과하였다(유리 섬유 여과지). 여액을 감압 농축하여, 잔사를 150 mL의 디클로로메탄에 용해시켰다. 이 용액을 150 mL의 이온 교환수로 5회 세정하였다. 유기 상에 황산나트륨을 첨가하고 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 담황색 투명 액체로서 화합물 9를 얻었다. 화합물 4를 기준으로 한 2 공정의 몰 수율은 36.2%이었다. 그 결과를 표 2에 요약하였다.
수량: 5.8 g
(참고예 2-1)
참고예 1-1로 합성한 화합물 9의 순도는, 실시예 9-1과 같은 방법으로 구하였다. 쇄장 순도는 64.9%이었고, 관능기 순도는 70.4%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
(참고예 2-2)
참고예 1-2로 합성한 화합물 9의 순도는, 실시예 9-1과 같은 방법으로 구하였다. 쇄장 순도는 86.1%이었고, 관능기 순도는 92.2%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
(참고예 2-3)
참고예 1-3으로 합성한 화합물 9의 순도는, 실시예 9-1과 같은 방법으로 구하였다. 쇄장 순도는 92.7%이었고, 관능기 순도는 99.3%이었다. 결과를 표 2에 요약하였다.
샘플 몰수율 (%) 쇄장 순도 (%) 관능기 순도 (%)
실시예 7-1 실시예 1-2에서 얻은 화합물 9 51.0 93.4 99.9
실시예 7-2 실시예 6-1에서 얻은 화합물 9 48.3 91.8 99.9
실시예 7-3 실시예 6-2에서 얻은 화합물 9 50.1 92.6 99.7
참고예 2-1 참고예 1-1에서 얻은 화합물 9 23.2 64.9 70.4
참고예 2-2 참고예 1-2에서 얻은 화합물 9 52.8 86.1 92.2
참고예 2-3 참고예 1-3에서 얻은 화합물 9 36.2 92.7 99.3
상기의 결과로부터, 실시예 1-2, 실시예 6-1 또는 실시예 6-2로 얻을 수 있는 화합물 9는, 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단위 수를 나타내는 n이 12인 화합물의 순도(쇄장 순도)가 90% 이상이며, 한편 말단에 수산기를 2개, 아미노기를 1개 가지는 화합물의 순도(관능기 순도)가 95% 이상인 것이 확인되었다.
또한, 참고예 1-1로 얻을 수 있는 화합물 9는, 공정 (1)의 커플링에 있어서 염기 촉매로서 수소화나트륨을 이용했기 때문에, 분기 부위의 분해나 부반응에 의해 구조 불명의 불순물을 복수로 생성하여, 몰수율이나 쇄장 순도 및 관능기 순도가 저하하였다. 참고예 1-1로 얻을 수 있는 화합물 9를 이용해 상기 식(1)로 표시되는 화합물을 합성하는 경우, 낮은 쇄장 순도와 낮은 관능기 순도를 갖는 화합물을 얻을 수 있고, 순도 향상을 위해서 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하는 경우, 몰수율이 더욱 저하한다.
또한, 참고예 1-2로 얻을 수 있는 화합물 9로서, 공정 (3)의 분액 정제에 있어서의 온도가 높기 때문에, 상기 식(39)로 표시되는 단분산 폴리에틸렌 글리콜이 분리되지 않았다. 이 불순물은 직쇄형이며, 말단 관능기가 수산기 및 메실레이트기의 조합이기 때문에, 화합물 9의 쇄장 순도 및 관능기 순도가 저하하였다.
참고예 1-2로 얻을 수 있는 화합물 9를 이용하여 예를 들면, 실시예 1-3과 동일한 방식으로 화합물 11을 얻는 경우, 상기 불순물은, 직쇄형이며, 말단에 활성 카보네이트기 및 메실레이트기를 가지는 화합물을 형성하기 위해, 화합물 11의 쇄장 순도 및 관능기 순도가 저하한다. 순도 향상을 위해서 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하는 경우, 몰수율이 저하한다.
또한, 참고예 1-3로 얻을 수 있는 화합물 9는, 공정(2)에 있어서 상기 식(6)으로 표시되는 화합물의 보호기 A(벤질기)의 탈보호와 관능기 Z1 (아지드기)의 환원 처리가 동시에 행해지기 위하여, 공정(3)의 분액 정제에 있어서 상기 식(39)로 표시되는 단분산 폴리에틸렌 글리콜과 함께 상기 식(3)으로 표시되는 화합물이 수성상에 용해되기 때문에, 몰수율이 저하한다. 이 화합물 9를 이용하여 상기 식(1)로 표시되는 화합물을 합성하는 경우, 쇄장 순도는 90% 이상이며, 관능기 순도는 95%이상이 되지만, 몰수율이 낮다.
(실시예 8-1)
Y 2 가 -NH 2 이고 n이 12인 식 (40)으로 표시되는 화합물 45의 합성
Figure 112019035204716-pct00084
(식 중, Trt는 트리페닐메틸기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 화합물 15 (15 g, 19.0 mmol) 및 디클로로메탄 (71 mL)을 넣고 용해시켰다. 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였고, 프탈이미드 (3.92 g, 26.6 mmol) 및 트리페닐 포스핀 (6.98 g, 26.6 mmol)을 이에 첨가하였다. 디클로로메탄 (15 mL) 중에 용해한 디이소프로필 아조디카복실레이트 (4.61 g, 22.8 mmol)을 20℃에서 30℃로 이에 적가하였고, 25℃에서 1시간 교반하였다. 1시간 후, 박층 크로마토그래피 (TLC) 측정에 의해 화합물 5의 소실을 확인하였고, 메탄올 (0.73 mL, 22.8 mmol)을 이에 첨가하였고, 반응을 정지하였다. 반응 용액을 감압 농축하여 투명 액체로서 화합물 46을 얻었다.
Figure 112019035204716-pct00085
(식 중, Trt는 트리페닐메틸기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 상기 화합물 46 전량 및 메탄올 (59.4 mL) 및 에틸렌디아민 일수화물 (22.28 g, 285 mmol)을 넣었고 이어서 질소 퍼지하여, 용해시켰다. 혼합물을 35℃에서 45℃로 1시간 동안 교반시켰다. 1시간 후, NMR 측정에 의해 화합물 46의 소실을 확인하였다. 톨루엔 (75 mL) 및 20% 염화나트륨 수용액 (75 mL)을 첨가하여 3회 세정하였고, 유기상을 감압 농축하였다. 그 후, 잔사를 이온 교환수 (45 mL)에 용해하였고, 5% 인산 이수소 나트륨 수용액 (120 mL)을 이에 첨가하였고, pH를 6으로 조정하였다. 상기 용액을 아세트산 에틸 (190 mL)로 3회 세정하여, 화합물 47의 수용액을 얻었다.
Figure 112019035204716-pct00086
가지형 플라스크 중의 상기 화합물 47의 수용액 전량에, 6N 염산을 소량 첨가하여 pH를 1로 조정하였고, 혼합물을 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후, 박층 크로마토그래피 (TLC) 측정에 의해 화합물 47의 소실을 확인하였고, 석출한 고체를 여과하였다. 소량의 400 g/L 수산화나트륨 수용액으로 pH를 7.5로 조절하였고, 클로로포름 (200 mL)을 이에 첨가하여 1회 세정하였다. 얻어진 수용액에 염화나트륨을 첨가하여 포화 염화나트륨을 형성하였고, 클로로포름 (45 mL) 및 이소프로판올 (15 mL)을 여기에 첨가하여 목적하는 화합물을 유기상으로 추출하였고, 유기상을 감압 농축하고, 클로로포름 (75 mL)으로 재용해하였고, 무수 황산나트륨 (10 g)을 이에 첨가하여 탈수시켰다. 이 용액을 여과하였고 무수 황산나트륨을 제거한 후, 톨루엔 (35 mL)을 첨가하면서 감압 농축하여, 투명 액체로서 화합물 48을 얻었다.
수량: 6.51g
Figure 112019035204716-pct00087
가지형 플라스크에 화합물 48 (5.93 g, 10.9 mmol), 물 (30 mL) 및 테트라하이드로푸란 (33 mL)을 넣어 용해시켰다. 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였고, 탄산수소나트륨 (2.66 g, 31.6 mmol) 및 디-3차-부틸 디카복실레이트 (3.46 g, 15.8 mmol)를 이에 첨가하여, 혼합물을 20℃에서 30℃로 6시간 동안 교반하였다. 6시간 후, 박층 크로마토그래피(TLC) 측정에 의해 화합물 48의 소실을 확인하였다. 헥산 (45 mL)을 첨가하여 수성 상을 4회 세정하였고, 그 다음 디클로로메탄 (22.4 mL)을 이에 첨가하여 목적하는 화합물을 유기상으로 추출하였다. 이 유기상에 무수 황산나트륨 (6 g)을 첨가하여 탈수하였고, 이 용액을 여과하여 무수 황산나트륨을 제거하였다. 그 후, 용액을 감압 농축하여, 투명 액체로서 화합물 49를 얻었다.
수량: 6.31g
Figure 112019035204716-pct00088
(식 중, Ms는 메탄술포닐기를 나타낸다.)
가지형 플라스크에 화합물 49 (6.2 g, 9.6 mmol) 및 톨루엔 (36 mL)을 넣고 용해시켰다. 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하여, 트리에틸아민 (1.33 g, 13.1 mmol) 및 염화 메탄술포닐 (1.29 g, 11.3 mmol)를 이에 첨가하였고, 혼합물을 20℃에서 30℃로 4시간 동안 교반하였다. 4시간 후, 박층 크로마토그래피(TLC) 측정에 의해 화합물 49의 소실을 확인하였다. 25% 암모니아 수용액(30 mL)을 이에 첨가하였고 유기상을 3회 세정하고, 그 다음 포화 염화나트륨 수용액 (30 mL)을 이에 첨가하여 유기상을 1회 세정하였다. 유기상에 무수 황산나트륨(6 g)을 첨가하여 탈수하였고, 이 용액을 여과하여 무수 황산나트륨을 제거했다. 그 후, 용액을 감압 농축해, 투명 액체로서 화합물 50을 얻었다.
수량: 5.87g
[공정 (1')]
Figure 112019035204716-pct00089
Figure 112019035204716-pct00090
가지형 플라스크에, 화합물 50 (4.0 g, 5.5 mmol), 화합물 51 (0.47 g, 2.6 mmol) 및 탈수 테트라하이드로푸란 (6.0 mL)을 넣었고, 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하여 용해시켰다. 수산화칼륨 (분말, 0.15 g)을 이에 첨가하였고, 혼합물을 20℃에서 30℃으로 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, NMR 측정에 의해 화합물 50의 잔존을 확인하였고, 수산화칼륨 (분말, 0.15 g)을 이에 첨가하였고, 혼합물을 20℃에서 30℃로 2시간 동안 교반했다. 그 후, 에틸렌 디아민 일수화물 (10.78 g, 138 mmol)을 이에 첨가하였고, 반응을 정지시킨 후, 톨루엔 (46 mL)을 이에 더하여 희석하였다. 25% 암모니아 수용액(20 mL)을 이에 첨가하였고 유기상을 4회 세정하였고, 유기상에 무수 황산나트륨(4 g) 첨가하고 건조 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 투명 액체로서 화합물 52를 얻었다.
수량: 3.2g
[공정 (2')]
Figure 112019035204716-pct00091
가지형 플라스크에, 화합물 52 (3.0 g, 2.1 mmol), 메탄올 (120 mL) 및 5% Pd/C (1.5 g)을 넣었다. 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였고, 시클로헥센 (4.1 g)을 이에 첨가하였고, 혼합물을 50℃에서 60℃로 4시간 동안 교반하였다. 30℃로 냉각한 후, 클로로포름 (300 mL)을 이에 첨가하였고, Pd/C를 여과하여 제거하였고, 톨루엔(100 mL)을 첨가하면서 감압 건조하여, 최종적으로 톨루엔(40 mL)으로 용매를 치환하였다. 유기 상에 무수 황산나트륨 (3 g)을 첨가하였고 건조 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 투명 액체로서 화합물 53을 얻었다.
수량: 2.2g
[공정 (3') 내지 (4')]
Figure 112019035204716-pct00092
가지형 플라스크에, 화합물 53 (2.0 g, 1.48 mmol) 및 디클로로메탄 (16 mL)을 넣었고, 가지형 플라스크 내를 질소로 퍼지하였다. 트리플루오로아세트산 (3 g)을 이에 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, 박층 크로마토그래피(TLC) 측정에 의해 화합물 53의 소실을 확인하였고, 물(40 mL)을 첨가하여 목적하는 화합물을 수성 상에서 추출하였다. 이 수용액에 400 g/L 수산화 나트륨 수용액을 소량 더하였고 pH를 7.5로 조정하였고, 염화나트륨을 이에 첨가하여 포화 염화나트륨 수용액을 형성하였다. 그 후에, 클로로포름 (9 mL) 및 이소프로판올(3 mL)을 이에 첨가하였고 목적하는 화합물을 유기상으로 추출하였고, 유기상을 포화 중탄산나트륨 수용액 (20 mL) 및 포화 염화나트륨 수용액 (20 mL)의 순서로 세정하였다. 이 유기상을 감압 농축하여, 클로로포름 (20 mL) 중에서 재용해시키고, 황산나트륨을 이에 첨가하여 건조, 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 투명 액체로서 화합물 45를 얻었다. 화합물 50을 기준으로 한 3 공정의 몰수율은 51.8%이었다. 쇄장 순도는 94.8%, 관능기 순도는 98.2%이었다.
수량: 1.4g
(실시예 8-2)
X 1 이 말레이미드기, Y 1 이 활성 카보네이트기이고 L 3 이 단결합인, 식 (1)로 표시되는 화합물 54의 합성
Figure 112019035204716-pct00093
Figure 112019035204716-pct00094
가지형 플라스크에, 3-말레이미도프로피온산 N-숙신이미딜 (667 mg, 2.5 mmol), 디부틸히드록시톨루엔 (1 mg) 및 디클로로메탄 (130 mL)을 넣었다. 화합물 45 (1.2 g, 1.05 mmol) 및 트리에틸아민 (0.38 mL, 2.7 mmol)을 디클로로메탄 (8 mL)에 용해하였고, 용액을 실온에서 플라스크로 적가하였다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 박층 크로마토그래피 (TLC) 측정에 의해 화합물 45의 소실을 확인하였고, 유기상을 용해된 15% 염화나트륨을 포함하는 시트르산 버퍼(pH = 3.0)(50 mL)로 3회 세정하였고, 감압 농축 하였다. 잔사에 시트르산 버퍼 (pH = 3.0) (50 mL)를 첨가하였고, 톨루엔-디클로로메탄 (10:3 w/w) (50 mL)으로 3회 세정하였다. 수성 상을 50 mL의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기 상을 합하였고, 무수 황산마그네슘(1 g)을 이에 첨가하여 건조 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 투명 액체로서 화합물 55를 얻었다.
수량: 890mg
가지형 플라스크에, 화합물 55 (780 mg, 0.54 mmol), 트리에틸아민 (0.12 mL, 0.86 mmol), 디부틸히드록시톨루엔 (1 mg) 및 디클로로메탄 (15 mL)을 넣었다. 디숙신이미딜 카보네이트 (208 mg, 0.81 mmol)를 이에 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후, NMR 측정에 의해 화합물 55의 소실을 확인하였고, 용해된 15% 염화나트륨을 포함하는 시트르산 버퍼(pH = 3.0)(25 mL)를 첨가하였고 3회 세정하였다. 유기상을 합하였고 무수 황산 나트륨(1 g)을 이에 첨가하여 건조 이어서 여과하였다. 여액을 감압 농축하여, 투명 액체로서 화합물 54를 얻었다. 쇄장 순도는 93.2%, 관능기 순도는 95.8%이었다.
수량: 705mg

Claims (11)

  1. 식 (1)로 표시되고, 쇄장 순도가 90% 이상인 것을 특징으로 하는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜:
    Figure 112022096856417-pct00095

    (식 (1) 중,
    X1 및 Y1은 각각 생체기능성 분자에 존재하는 관능기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 관능기를 적어도 포함하는 원자단을 나타내며, 단, 원자단 X1이 포함하는 상기 관능기와 원자단 Y1이 포함하는 상기 관능기는 서로 상이하고,
    n은 6 내지 30의 정수이고,
    E는 L2에 대한 2가의 결합 가수 및 L3에 대한 1가의 결합 가수를 가지는 분기 부위이며, 글리세롤 부위를 나타내고,
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 단결합 또는 2가의 유기기를 나타내고,
    L3은 단결합, -L4-(CH2)m1- 또는 -L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-을 나타내고, L4는 에테르 결합, 아미드 결합 및 우레탄 결합 중 어느 하나를 나타내고, L5는 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 나타내고, m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수를 나타내고,
    상기 생체기능성 분자에 존재하는 관능기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 관능기는, 알데히드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 요오드아세트아미드기, 브로모아세트아미드기, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 카복실기, 아미노기, 아미노옥시기, 티올기, 알릴기, 비닐기, 알키닐기 또는 아지드기이다.)
  2. 청구항 1에 있어서, L3은 -L4-(CH2)m1- 또는 -L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-를 나타내고, L4는 에테르 결합, 아미드 결합 및 우레탄 결합 중 어느 하나를 나타내고, L5는 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 나타내고, m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수를 나타내는 것을 특징으로 하는, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 식 (1) 중에 포함되는 L2가 에테르 결합인 것을 특징으로 하는, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 식 (2)로 표시되는 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜:
    Figure 112022096856417-pct00096

    (식 (2) 중,
    X1 및 Y1은 각각 생체기능성 분자에 존재하는 관능기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 관능기를 적어도 포함하는 원자단을 나타내며, 단, 원자단 X1이 포함하는 상기 관능기와 원자단 Y1이 포함하는 상기 관능기는 서로 상이하고,
    n은 6 내지 30의 정수이고,
    L1은 단결합 또는 2가의 유기기를 나타내고,
    L3은 단결합, -L4-(CH2)m1- 또는 -L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-을 나타내고, L4는 에테르 결합, 아미드 결합 및 우레탄 결합 중 어느 하나를 나타내고, L5는 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 나타내고, m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수를 나타내고,
    상기 생체기능성 분자에 존재하는 관능기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 관능기는, 알데히드기, 말레이미드기, 비닐술폰기, 요오드아세트아미드기, 브로모아세트아미드기, 활성 에스테르기, 활성 카보네이트기, 카복실기, 아미노기, 아미노옥시기, 티올기, 알릴기, 비닐기, 알키닐기 또는 아지드기이다.)
  5. 식 (3)으로 표시되는, 청구항 4에 기재된 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체:
    Figure 112019035204716-pct00097

    (식 (3) 중,
    n은 6 내지 30의 정수를 나타내고,
    Y2는 -NH2 또는 -O-(CH2)m4-NH2를 나타내고, m4는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.)
  6. 청구항 5에 기재된 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 제조하는 방법으로서,
    하기 식(4)로 표시되는 단분산 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 하기 식(5)로 표시되는 화합물을, 수용액 중에서의 pKa가 15 내지 20인 염기 촉매를 이용하여 커플링시켜, 하기 식(6)으로 표시되는 화합물을 얻는 공정(1),
    Figure 112019046857723-pct00098

    (식 (4) 중,
    A는 수산기의 보호기를 나타내고,
    B는 이탈기를 나타내고,
    n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다),
    Figure 112019046857723-pct00099

    (식 (5) 중,
    Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타낸다),
    Figure 112019046857723-pct00100

    (식 (6) 중,
    A는 수산기의 보호기를 나타내고,
    Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고,
    n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다);
    상기 식(6)으로 표시되는 화합물의 보호기 A를 탈보호시켜, 하기 식(7)로 표시되는 화합물을 얻는 공정(2),
    Figure 112019046857723-pct00101

    (식 (7) 중,
    Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고,
    n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다);
    상기 식(7)로 표시되는 화합물에 분액 정제를 실시하는(subjecting) 공정(3); 및
    상기 식(7)로 표시되는 화합물에 탈보호 처리 또는 환원 처리를 실시하고 식(3)으로 표시되는 상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 얻는 공정(4)
    를 상기의 순서로 포함하는 것을 특징으로 하는, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 제조하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 염기 촉매가, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 칼륨 3차(tert)-부톡시드 및 나트륨 3차-부톡시드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜에, 생체기능성 분자가 결합되어 있는(conjugated) 것을 특징으로 하는, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜 결합체.
  9. 식 (40)으로 표시되는, 청구항 4에 기재된 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체:
    Figure 112019035204716-pct00102

    (식 (40) 중,
    n은 6 내지 30의 정수를 나타내고,
    Y2는 -NH2 또는 -O-(CH2)m4-NH2를 나타내고, m4는 1 내지 5의 정수를 나타낸다.)
  10. 청구항 9에 기재된 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 제조하는 방법으로서,
    하기 식 (41)로 표시되는 단분산 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 하기 식 (42) 로 표시되는 화합물을, 수용액 중에서의 pKa가 15 내지 20인 염기 촉매를 이용하여 커플링시켜, 하기 식 (43)으로 표시되는 화합물을 얻는 공정 (1'),
    Figure 112019046857723-pct00103

    (식 (41) 중,
    Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고,
    B는 이탈기를 나타내고,
    n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다),
    Figure 112019046857723-pct00104

    (식 (42) 중,
    A는 수산기의 보호기를 나타낸다),
    Figure 112019046857723-pct00105

    (식 (43) 중,
    A는 수산기의 보호기를 나타내고,
    Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고,
    n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다),
    상기 식 (43)으로 표시되는 화합물의 보호기 A를 탈보호시켜, 하기 식 (44)로 표시되는 화합물을 얻는 공정 (2'),
    Figure 112019046857723-pct00106

    (식 (44) 중,
    Z는 -Z1 또는 -O-(CH2)m5-Z1을 나타내고, Z1은 아미노기의 보호체, 아지드기 및 시아노기 중 어느 하나를 나타내고, m5는 1 내지 5의 정수를 나타내고,
    n은 6 내지 30의 정수를 나타낸다);
    상기 식 (44)로 표시되는 화합물에 탈보호 처리 또는 환원 처리를 실시하고 식 (40)으로 표시되는 상기 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 얻는 공정 (3'); 및
    상기 식 (40)으로 표시되는 화합물에 분액 정제를 실시하는 공정 (4')
    를 상기의 순서로 포함하는 것을 특징으로 하는, 분기형 헤테로 단분산 폴리에틸렌 글리콜의 제조용 중간체를 제조하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 염기 촉매가, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 칼륨 3차-부톡시드 및 나트륨 3차-부톡시드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 방법.
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