KR102484278B1 - 피부 미용 개선용 펩티드 및 원료 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펩티드, 원료 조성물 및 이들의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 탄력, 미백, 주름 등을 개선하는 기능성 펩티드, 이들이 포함된 식품 또는 화장품을 제조하는 데 사용할 수 있는 원료 조성물 및 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

피부 미용 개선용 펩티드 및 원료 조성물{Peptide And Raw Material Composition For Improving Skin Beauty}
본 발명은 펩티드, 원료 조성물 및 이들의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 탄력, 미백, 주름 등을 개선하는 기능성 펩티드, 이들이 포함된 식품 또는 화장품을 제조하는 데 사용할 수 있는 원료 조성물 및 이들의 용도에 관한 것이다.
피부는 표피, 진피, 피하조직으로 이루어지고, 그 중 진피는 엘라스틴, 콜라겐, 히알루론산으로 구성된다. 진피는 콜라겐, 콜라겐을 연결하는 엘라스틴 및 그 사이를 메우는 히알루론산 등으로 피부의 탄력을 형성한다. 피부 주름이나 처짐은 엘라스틴과 콜라겐 섬유가 손상되기 때문에 발생하는데, 스트레스나 흡연 등에 의한 활성산소나 자외선 등 외부요인에 의해 엘라스틴 섬유가 끊어지거나 너무 두껍거나 너무 가는 불량 엘라스틴이 늘어나면 섬유 구조의 균형이 무너지고, 이로써 탄력이 떨어져 주름이 생기며, 피부와 지방이 근육과 뼈에 흡착하는 능력 또한 저하되어 피부 및 지방이 처지게 된다.
엘라스틴은 진피의 섬유아세포에서 만들어지며, 신축하는 성질을 가져서, 피부의 진피, 혈관, 인대 등 체내에서 탄력성과 신축성이 필요한 조직에 다량 존재하는데 인체 조직의 경우 인대의 약 80%, 동맥의 약 50%, 폐의 약 20%, 피부 진피의 약 5%를 차지한다. 엘라스틴이 갖는 신축성과 섬유 구조 때문에 엘라스틴은 피부 및 인대의 탄력, 동맥 경화 방지(혈류 개선), 혈소판 응집 억제 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 체내 수용성 엘라스틴 농도가 동맥 경화의 지표로도 활용되고 있다. 특히, 콜라겐은 조직의 강도에 관여하는 물질이어서 탄성이 미미하고 히알루론산 등 당단백질에는 신축성과 같은 성질이 존재하지 않기 때문에, 엘라스틴이 당단백질 섬유 속으로 점차 들어감으로써 비로소 신축성을 갖게 되므로 피부의 탄력, 인대의 신축성, 그리고 폐와 혈관의 수축성 모두 엘라스틴 없이는 만들어지지 않는다.
엘라스틴은 0세 아기 때에는 많지 않다가 25세 무렵을 정점으로 나이가 들수록 완만하게 감소하며, 40대 이후에 들어서면 급격하게 감소하게 된다. 반면 히알루론산은 0세 때 가장 많고, 나이가 들면서 점차 감소하다가 20세가 되면 출생시의 약 절반이 된다. 실제로 엘라스틴이 적은 대신 히알루론산이 풍부한 0세 무렵에는 피부가 부드러운 것이 특징이며, 20대 후반이 되면 피부가 가장 탄력이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 피부의 탄력과 그 유지에는 히알루론산뿐만 아니라 엘라스틴의 존재가 매우 중요한 것이다.
엘라스틴은 소의 대동맥, 힘줄, 연골, 닭껍질, 생선 등에 많이 포함되어 있는데, 이러한 재료를 이용한 식품을 자주 섭취하더라도 가교된 엘라스틴의 경우 물 등 용매에 잘 녹지 않아 체내 흡수율이 떨어지고, 가교를 절단하기 위해서는 120℃이상에서 16시간 이상 처리해야 하는 등 까다롭기 때문에, 보충제를 통해 엘라스틴의 분해물을 섭취하여 체내 엘라스틴 합성을 보완하는 것이 효율적이다. ㈜일본햄 중앙연구소에서 실시한 연구에 따르면, 건강한 성인 남녀 13명을 대상으로, 엘라스틴을 함유한 건강 음료를 매일 한 병씩, 8주간 복용하게 한 후 음료를 마시기 전과 마신 후 각각 4주 후, 8주후, 총 3번에 걸쳐 뺨 부위의 탄력(피부가 원 상태로 돌아가는 탄성률)을 측정기를 이용해서 측정했을 때, 엘라스틴이 첨가된 식품을 복용하는 경우, 엘라스틴을 합성하는 세포(섬유아세포)가 활성화되거나, 콜라겐의 생산이 늘어나는 것으로 확인되었다.
엘라스틴 영양제는 2003년경 등장하였으며, 참치, 가다랑어, 방어 등의 동맥구 혹은 돼지의 혈관 등을 원료로 하였는데, 이러한 원료에서 추출할 수 있는 엘라스틴 양이 무척 소량이기 때문에, 대부분의 영양제는 콜라겐, 히알루론산, 플라젠타(태반), 황산 콘드로이틴 등이 함께 배합된 경우가 많았다.
따라서 가다랑어 등의 원료로부터 엘라스틴을 최대한 추출하여 엘라스틴의 함량을 높이는 한편, 추출한 엘라스틴을 적절히 분해함으로써 체내 흡수율을 높이고 체내 엘라스틴 합성을 활성화하여 엘라스틴의 다양한 이점을 쉽게 취할 수 있도록 하는 엘라스틴 분해 조성물이 요구된다.
본 발명은 이러한 문제를 해결하기 위한 것으로, 동물 원료로부터 추출한 엘라스틴을 처리하여, 피부 탄력, 수분량 및 미백 등 피부 건강을 개선할 수 있는 펩티드 및 이를 포함하는 원료 조성물을 제안하고자 한다.
상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 서열 1의 펩티드를 필수 성분으로 포함하고,
하기 서열 2 내지 10의 펩티드군에서 선택된 하나 이상의 펩티드를 추가로 포함하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
서열 1-(발린-글리신-프롤린-글리신)
서열 2-(발린-글리신-프롤린-글리신-글리신)
서열 3-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-글리신-알라닌-글리신)
서열 4-(트레오닌-글리신-글리신-프롤린-글리신)
서열 5-(글리신-발린-글리신-글리신-프롤린-글리신)
서열 6-(페닐알라닌-글리신-글리신-프롤린)
서열 7-(발린-글리신-프롤린-글리신-루신)
서열 8-(발린-글리신-프롤린-글리신-페닐알라닌)
서열 9-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-루신)
서열 10-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-페닐알라닌)
바람직하게는, 상기 서열 1의 펩티드를 0.5 내지 5 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 서열 2 및 서열 3의 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 서열 2 펩티드를 포함하되,
상기 서열 2 펩티드의 함량은 0.1 내지 1.5 중량%인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 서열 3 펩티드를 포함하되,
상기 서열 3 펩티드의 함량은 0.01 내지 1.2 중량%인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 원료 조성물은 피부 또는 조직의 보습성을 개선하거나, 탄력 또는 주름을 개선하거나, 또는 색소침착을 완화하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 것인, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 원료 조성물은 액상 용액, 현탁액, 고형물 또는 분말 형태인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 원료 조성물은 식품 또는 화장품 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 원료 조성물이 고형물 또는 분말 형태로 식품에 포함되는 경우,
상기 원료 조성물의 용량은 25 mg/day 내지 500 mg/day인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 원료 조성물이 식품에 포함되는 경우,
상기 식품은 음료, 빙과, 면류, 과자류, 수산물, 가공 식품, 유제품, 유지 및 유지 가공 식품, 레토르트 파우치(retort pouch) 식품, 비타민 복합체, 일반 식품, 건강식품, 보건 기능 식품, 의약 부외품, 의약품 및 영양 보조 식품을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 원료 조성물이 화장품에 포함되는 경우,
상기 화장품은 액상 용액, 현탁액, 파우더, 에멀젼, 로션, 스프레이, 에어로졸, 연고, 크림, 폼(Foam), 팩, 젤리, 립크림, 립스틱, 입욕제 및 아스트린젠트를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
바람직하게는, 상기 원료 조성물은 비타민A, 비타민K, 비타민E, 미녹시딜(minoxidil), 에스트라디올(estradiol), 콜라겐, 히알루론산, 항산화물질, 식품 첨가제, 부형제 및 첨가제를 포함하는 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 하기 펩티드 서열에서 선택되는, 피부 미용 개선용 펩티드가 제공된다.
서열 2-(발린-글리신-프롤린-글리신-글리신)
서열 3-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-글리신-알라닌-글리신)
본 발명에 따른 펩티드 및 원료 조성물은 동물 원료에서 획득한 엘라스틴을 올리고펩티드 이하의 수준으로 분해하여 체내 흡수를 높이고, 이로써 체내 엘라스틴 합성을 활성화할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 펩티드 및 원료 조성물은 특수한 제조 방법으로 동물 원료 및 그로부터 획득한 엘라스틴을 처리하여 엘라스틴 유래 펩티드의 함량이 높다.
특히 본 발명에 따른 원료 조성물은 피부의 탄력, 수분 그리고 칙칙함을 개선하는 효능을 가진 펩티드의 함량이 높고, 구체적으로 동물 원료의 7.5% 내지 13중량%, 바람직하게는 8% 내지 11중량%의 엘라스틴 유래 펩티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 원료 조성물에는 일정한 조성비로 피부 미용 개선 효과가 있는 특정 서열의 펩티드가 포함되어 있어, 피부의 탄력, 수분 그리고 칙칙함 등을 개선하는 효과가 있다.
도 1a는 각질형성세포인 HaCaT 세포에 대한 원료 조성물의 농도별 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 1b는 HS27 인간섬유아세포에 대한 원료 조성물의 농도별 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 1c는 B16F10 멜라닌생성 세포에 대한 원료 조성물의 농도별 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 2는 자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 피부보습 관련 인자인 UGTrel7, GlcNAc, Elastin의 유전자 발현을 측정한 결과이다.
도 3은 자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 피부보습 관련 인자인 LCB1 (SPT), DEGS1의 유전자 발현을 측정한 결과이다.
도 4는 자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 피부보습 관련 인자인 HAS2, CerS4(LASS4)의 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 5는 자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 hyaluronic acid 분비량 및 sphingomyelin 분비량을 측정한 결과이다.
도 6은 UVB를 조사하여 피부보습을 저하시킨 마우스의 등 조직에서 측정한 경표피 수분함량을 측정한 결과이다.
도 7은 자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 피부보습 관련 인자인 UGTrel8, GlcNAc, Fibrillin-1의 유전자 발현을 측정한 결과이다.
도 8은 자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 피부보습 관련 인자인 LCB1(SPT), DEGS1의 유전자 발현을 측정한 결과이다.
도 9는 자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 피부보습 관련 인자인 HAS2, CerS4(LASS4)의 단백질 발현 측정한 결과이다.
도 10은 자외선 조사한 HS27 인간섬유아세포에서 주름생성 관련 인자인 TGFβR1, procollagen type Ⅰ, Collagen type Ⅰ의 유전자 발현을 측정한 결과이다.
도 11 및 12는 자외선 조사한 HS27 인간섬유아세포에서 주름생성 관련 인자인 MAPK8 (JNK), c-Fos, c-Jun, MMP's (1, 3, 9), Smad3의 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 13은 자외선 조사한 HS27 인간섬유아세포에서 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, TNF-α) 분비량을 측정한 결과이다.
도 14는 실험동물의 피부에 자외선을 조사한 뒤 등 피부 조직의 형태학적 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실험동물의 피부에 자외선을 조사한 뒤 등 피부 조직에서 H&E 염색을 통하여 조직병리학적 변화를 관찰한 것이다.
도 16은 자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 주름생성 관련 인자인 TGFβR1, procollagen type Ⅰ, collagen type Ⅰ의 유전자 발현을 측정한 결과이다.
도 17 및 18은 자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 주름생성 관련 인자인 MAPK8 (JNK), c-Fos, c-Jun, MMP's (1, 3, 9), Smad3의 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 19는 자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 항산화효소인 SOD, Catalase, GPx activity를 측정한 결과이다.
도 20은 IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌생성세포에서 멜라닌 생성억제능을 측정한 결과이다.
도 21 및 22는 IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌생성세포에서 미백 관련 인자인 PKA, CREB, MITF, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 23은 IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌생성세포에서 tyrosinase activity 측정 결과이다.
도 24는 IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌생성세포에서 Nitric oxide (NO), Glutathione (GSH), cAMP level의 측정 결과이다.
도 25 및 26은 자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 미백 관련 인자인 PKA, CREB, MITF, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현 측정 결과이다.
도 27은 자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 tyrosinase activity 측정 결과이다.
도 28은 자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 nitric oxide (NO) level 및 cAMP level의 측정 결과이다.
도 29는 상기 서열 1 펩티드의 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 30은 합성된 상기 서열 1 펩티드를 정제 및 건조하는 과정을 나타낸 것이다.
이하에서 본원 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본원 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것은 본원 명세서의 설명에서 생략한다.
<펩티드를 포함하는 원료 조성물>
본 발명의 일 측면에서, 하기 서열 1의 펩티드를 필수 성분으로 포함하고, 하기 서열 2 내지 10의 펩티드군에서 선택된 하나 이상의 펩티드를 추가로 포함하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물을 제공한다.
서열 1-(발린-글리신-프롤린-글리신)
서열 2-(발린-글리신-프롤린-글리신-글리신)
서열 3-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-글리신-알라닌-글리신)
서열 4-(트레오닌-글리신-글리신-프롤린-글리신)
서열 5-(글리신-발린-글리신-글리신-프롤린-글리신)
서열 6-(페닐알라닌-글리신-글리신-프롤린)
서열 7-(발린-글리신-프롤린-글리신-루신)
서열 8-(발린-글리신-프롤린-글리신-페닐알라닌)
서열 9-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-루신)
서열 10-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-페닐알라닌)
바람직하게는, 상기 피부 미용 개선용 원료 조성물은 상기 서열 2 및 서열 3의 펩티드를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 피부 미용 개선용 원료 조성물은 상기 서열 1의 펩티드를 0.5 내지 5 중량%로 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는, 1 내지 3 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 상기 서열 2의 펩티드를 더 포함하는 경우, 상기 서열 2 펩티드를 0.1 내지 1.5 중량%의 함량으로 포함할 수 있으며, 상기 서열 3의 펩티드를 더 포함하는 경우 상기 서열 3 펩티드를 0.01 내지 1.2 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.
본 발명의 원료 조성물은 피부 또는 조직을 보존, 복원 및 강화할 수 있으며, 구체적으로 피부 또는 조직의 보습성을 개선하고, 주름의 생성을 억제하여 탄력 또는 주름을 개선하며, 자외선 등에 의한 색소 침착을 완화하여 미백에 도움을 줄 수 있다. 상기 서열 1 펩티드를 1 내지 3 중량%로 포함하는 것이 피부의 탄력 저하, 건조 및 미백 개선에 큰 역할을 하며, 바람직하게는, 상기 서열 3의 펩티드를 0.01 내지 1.2 중량%의 함량으로 추가로 포함하는 것이 상기 효과를 더욱 상승시키며, 더욱 바람직하게는, 상기 서열 2 펩티드를 0.1 내지 1.5 중량%의 함량으로 추가로 포함하는 것이 상기 효과를 더욱 상승시킬 수 있다.
본 발명의 원료 조성물은 액상 용액, 현탁액, 고형물 또는 분말 등의 형태를 가질 수 있다.
본 발명의 원료 조성물은 식품 또는 화장품에 포함될 수 있다. 식품 또는 화장품에 포함된다 함은, 식품 또는 화장품의 유효 성분 또는 첨가제로서 포함되는 것을 모두 포함한다. 화장품에 포함될 경우에는 필요에 따라서는 본 발명의 목적 및 작용 효과를 해치지 않는 범위에서, 화장품 원료에 통상 사용되는 각종 주제, 조제 및 그 외의 성분과 함께 첨가되는 것을 포함한다. 그 외의 성분으로서는, 본 발명의 피부의 탄력, 수분량 및 미백 개선 작용에 방해가 되지 않는 이상 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 수렴제, 살균제, 항균제, 자외선 흡수제, 보습제, 세포 활력제, 유지류, 탄화수소류, 지방산류, 알코올류, 에스테르류, 계면활성제, 향료 등을 들 수 있다. 이들의 성분은 상기 원료 조성물과 함께 병용했을 경우, 상승적으로 작용해, 통상 기대되는 이상이 뛰어난 작용 효과를 가져오는 경우가 있다.
본 발명의 원료 조성물이 고형물 또는 분말 형태로 식품에 포함되는 경우, 상기 원료 조성물의 용량은 25 mg/day 내지 500 mg/day로 포함될 수 있다. 바람직하게는 25 mg/day 내지 300 mg/day이고, 더욱 바람직하게는 25 mg/day 내지 170 mg/day이다. 상기 수치범위에서 피부의 탄력 저하, 건조 및 미백 개선 효과가 탁월하면서 상기 식품의 제조가 용이하고 섭취용량이 적절하다.
본 발명의 원료 조성물을 식품 또는 화장품으로 사용할 경우에는, 상기 원료 조성물의 총중량에 대하여, 상기 서열 1 펩티드를 0.5 내지 5중량%로 포함하는 것이 피부의 탄력 저하, 건조 및 미백 개선에 큰 역할을 하며, 바람직하게는 1 내지 3 중량%이고, 더욱 바람직하게는, 상기 서열 3의 펩티드를 0.01 내지 1.2 중량%의 함량으로 추가로 포함하는 것이 상기 효과를 더욱 상승시키며, 더욱 바람직하게는, 상기 서열 2 펩티드를 0.1 내지 1.5 중량%의 함량으로 추가로 포함하는 것이 상기 효과를 더욱 상승시킬 수 있다.
본 발명의 피부 미용 개선용 원료 조성물을 식품에 첨가하여 사용할 경우에는 상기에서와 같이 함량으로 섭취할 수 있는 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 식품은 사람의 건강에 위해를 줄 우려가 적고, 통상의 사회 생활에 있어서, 경구 또는 소화관 투여에 의해 섭취되는 것을 말하고, 식품, 의약품, 의약 부외품 등의 구분으로 제한되는 것이 아니고, 예를 들면, 경구적으로 섭취되는 일반 식품, 건강식품, 보건 기능 식품, 의약 부외품, 의약품 등을 폭넓게 포함하는 것을 의미한다. 또한, 상기 식품은 상기 원료 조성물의 활성을 방해하지 않게 배합한 것이어도 되고, 상기 원료 조성분을 주성분으로 하는 영양 보조 식품이어도 된다.
본 발명의 원료 조성물이 식품에 포함되는 경우, 상기 식품의 예로서, 청량 음료, 탄산음료, 영양 음료, 과실 음료, 유산 음료 등의 음료; 아이스크림, 빙수 등의 빙과;우동, 소면, 중화면, 즉석면(noodle) 등의 면류; 푸딩, 엿, 캔디, 껌, 초콜릿, 정과, 스낵 과자, 비스킷, 젤리, 잼, 크림, 구운과자, 빵 등의 과자류; 게, 연어, 바지락, 마구로, 정어리, 새우, 가다랭이, 고등어, 고래, 꽁치, 오징어, 가리비, 전복, 성게 등의 수산물; 어묵, 햄, 소시지 등의 수산·축산 가공 식품; 가공유, 발효유 등의 유제품; 샐러드기름, 튀김유, 마가린, 마요네즈, 쇼트닝, 휘핑크림, 드레싱 등의 유지 및 유지 가공 식품; 소스, 조미료; 카레, 스튜, 오야코동, 죽, 잡탕죽, 중화사발, 하이라이스, 소고기 덮밥, 미트 소스, 계란 수프(soup), 오므라이스, 만두, 찐만두, 햄버거, 미트볼 등의 레토르트 파우치(retort pouch) 식품; 비타민 복합체 등 여러 가지의 형태의 건강식품이나 영양 보조 식품;정제, 캡 슐제, 드링크제, 트로키 등의 의약품, 의약 부외품 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 식품을 제조할 때 통상 사용되는 보조적 원료, 첨가물 등을 포함할 수 있으며, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적당하게 선정할 수 있지만, 예를 들면, 포도당, 과당, 자당, 말토오스(maltose), 솔비톨, 스테비오사이도, 루부소사이드, 옥수수시럽, 유당, 구연산, 주석산, 린고산, 호박 산, 유산, L-아스코르브산, dl-α-토코페롤, 에리소르빈산나트륨, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 아라비아검, 카라기난, 카제인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B류, 니코틴산아미드, 판토텐산 칼슘, 아미노산류, 칼슘 염류, 색소, 향료, 저장제 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 피부 미용 개선용 원료 조성물이 음료수에 첨가될 경우에는 해당 음료수의 일반적인 제조 방법으로 제조하되, 상기 피부 미용 개선용 원료 조성물은 액상 용액, 현탁액, 고형물 또는 분말 등의 형태로 다른 첨가제 등과 동일하게 첨가될 수 있다.
상기 식품에서 본 발명의 원료 조성물의 첨가량은 대상이 되는 식품의 종류에 따라 달라 통틀어 규정할 수 없으나, 해당 식품 본래의 맛을 해치지 않는 범위에서 첨가하면 좋고, 각종 식품에 대해, 0.001~50질량%가 바람직하고, 0.01~20 질량%가 보다 바람직하다. 또한, 과립, 정제 또는 캡슐 형태의 식품의 경우에는, 0.01 질량%~100 질량%가 바람직하고, 5 질량%~100 질량%가 보다 바람직하다.
본 발명의 원료 조성물이 화장품에 포함되는 경우, 상기 화장품의 예로서, 액상 용액, 현탁액, 파우더, 에멀젼, 로션, 스프레이, 에어로졸, 연고, 크림, 폼(Foam), 팩, 젤리, 립크림, 립스틱, 입욕제, 아스트린젠트 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 피부 미용 개선용 원료 조성물이 크림에 첨가될 경우에는 해당 크림의 일반적인 제조 방법으로 제조하되, 상기 크림 전체에서 배합량은 화장품 원료의 종류나 추출물의 생리 활성 등에 의하여 적당하게 조정할 수 있으며, 바람직하게는 0.0001~10 질량%로 배합하고, 더욱 바람직하게는 0.001~1 질량%로 배합할 수 있다. 상기 피부 미용 개선용 원료 조성물은 액상 용액, 현탁액, 고형물 또는 분말 등의 형태로 다른 첨가제 등과 동일하게 첨가될 수 있다.
본 발명의 원료 조성물은 상기한 펩티드군 외에 비타민A, 비타민K, 비타민E, 미녹시딜(minoxidil), 에스트라디올(estradiol), 콜라겐, 히알루론산, 항산화물질, 식품 첨가제, 부형제 및 첨가제를 포함하는 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
비타민A, 비타민K, 미녹시딜(minoxidil) 및 에스트라디올(estradiol)은 체내 엘라스틴 합성을 늘리는 데에 도움을 주며, 콜라겐 및 히알루론산 등은 피부 진피를 구성하는 물질로서 함께 섭취하면 상승 작용이 기대된다. 체내 엘라스틴 감소에 큰 영향을 주는 것으로 알려진 활성산소를 감소시키기 위하여 항산화물질, 특히 천연 항산화제로 알려진 비타민E와 함께 사용하면 효능이 상승된다.
본 발명의 원료 조성물에 사용되는 펩티드는 화학적으로 합성을 하여도 되고, 동물 또는 어류의 동맥구로부터 추출하여도 된다. 본 발명에서는 상기 추출 방법 및 상기 서열 1 펩티드의 합성방법에 대하여 기재한다.
<원료 조성물의 제조방법>
상기한 본 발명의 원료 조성물은 동물의 조직(동물 원료)를 선별 및 가공 처리하여 얻을 수 있고, 구체적으로 돼지, 소 등 포유류뿐만 아니라 가다랑어, 참치, 새치류, 대구, 방어, 연어 등 어류의 동맥구로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 가다랑어의 동맥구로부터 얻을 수 있다. 대량 입수, 동맥구 중량, 동맥구에 포함된 엘라스틴 함량 등을 고려할 때, 가다랑어(Katsuwonus pelamis)의 심장에서 동맥구를 분리하고 효소처리를 하여 얻는 것이 바람직하다. 또한, 상기 원료 조성물에 포함된 각 펩티드를 합성 및 가공하여 본 발명의 원료 조성물을 제조할 수 있다.
1. 동물 원료로부터 추출하는 방법
이하에서, 동물 원료(예컨데, 돼지의 피부조직 또는 가다랑어의 동맥구)를 이용하여 본 발명의 원료 조성물을 제조하는 방법을 살펴본다. 본 발명은 이하의 제조방법으로 한정되는 것은 아니고, 종래에 공지된 방법을 이용할 수 있다.
(1) 동물 원료 준비 및 다지기
엘라스틴을 함유하는 동물 원료를 준비하고, 상온에서 미트 초퍼(Meat chopper) 등을 이용하여 잘게 절단한다.
(2) 알칼리성 처리, 중화 및 세척
1) 절단한 동물 원료에 알칼리성 용액을 가하고, 80 내지 90℃에서 40~60분 동안 교반해 준다. 구체적으로, 상기 동물 원료 중량의 3배 중량의 0.1mol/L NaOH를 첨가할 수 있다. 이러한 알칼리성 처리를 통해 엘라스틴을 제외한, 동물 원료에 포함된 콜라겐 등 불필요한 단백질들을 제거할 수 있다.
2) 상기 알칼리성 용액과 동일한 몰 수의 산성 용액 첨가해 중화한다. 강산을 사용할 경우 동물 원료에 포함된 엘라스틴까지 분해될 염려가 있다. 예를 들면 구연산을 사용할 수 있으며, 섭취도 가능하므로 식품류 또는 화장품류로 제조할 경우 안전성이 있다. 첨가되는 약산에 따라 다를 수 있으나, 구연산의 경우 80 내지 90℃에서 25~35분 동안 교반하여 중화시킨다.
3) 중화시킨 후, 원료 동맥구 중량의 약 2배 중량의 물을 가하여 상온에서 약 25 내지 35분 동안 세척해 준다. 세척은 바람직하게는 2회 이상 실시한다.
세척 후 엘라스틴을 포함한 불용물을 얻게 되며, 원료 동맥구 중량의 50~70%의 중량을 가진다.
(3) 효소 처리
2 이상의 단백질 분해 효소(프로테아제)를 이용해, 상기 불용물을 각 효소별로 분해하여, 여러가지 폴리펩티드를 포함한 엘라스틴 분해물을 얻게 된다. 구체적으로, 하기와 같이 Thermoase(예를 들면, Thermoase C160) 및 파파인(예를 들면, Papain W-40)을 불용물 중량에 따라 첨가하고, 상기 효소들을 각각 처리하여 2단계에 걸쳐 분해 반응시키면 종래의 방법보다 더 많은 엘라스틴 유래 원료 조성물을 얻을 수 있다.
Thermoase C160 및 Papain W-40를 사용할 경우, 분해 반응 가능한 pH 범위가 6.5~7.5에서 중복되므로, 각각의 효소 처리 시에 별도로 pH 조절이나 pH 확인단계를 거칠 필요가 없다. 또한 상기 pH 범위는 중성에 가까운 범위이므로, 별도의 완충용액 등을 요하지 않으며, 물만으로도 pH 범위를 쉽게 조절할 수 있다.
1) Thermoase에 의한 처리
상기 세척 후 남아있는 불용물에 물과 Thermoase를 첨가한다. 이때 물은 불용물 중량의 약 1.5~2.5배 중량, 바람직하게는 2배 중량으로 하고, Thermoase는 불용물 중량의 약 0.5 내지 0.7%를 첨가한다. 약 65~80℃, 바람직하게는 약 65~70℃, 더욱 바람직하게는 70℃이고, pH는 6.5~8.5, 바람직하게는 pH 7.0~8.5, 더욱 바람직하게는 pH 7.0~7.5이고, 2~3시간, 바람직하게는 약 2~2.5시간 동안 교반하며 반응시킨다.
2) 파파인(Papain)에 의한 처리
상기 세척 후 남아있는 불용물 중량에 대하여 1.3 내지 1.7% 중량의 파파인을 첨가하고, 약 75~80℃, 바람직하게는 약 80℃이고, pH는 6.5~7.5, 바람직하게는 pH 7.0이고, 2~3시간, 바람직하게는 약 2~2.5시간 동안 교반하며 반응시킨다.
3) 효소 실활
반응이 완료된 후, 90 내지 95℃, 바람직하게는 약 90℃에서 25~35분 동안 가열하여 효소들을 실활한다.
(4) 탈지 및 탈취
소량의 물에 활성탄을 녹여서 사용하되, 상기 활성탄은 효소 처리 전 불용물 중량의 약 3% 중량으로 사용한다. 물에 녹인 활성탄을 효소 처리 완료된 엘라스틴 분해물과 함께 90 내지 95℃에서 25~35분 동안 교반하여 탈지 및 탈취할 수 있다.
활성탄은 일반적으로 탈취, 탈색 등의 용도가 있으나, 그 중 일부는 엘라스틴 분해물에 포함된 펩티드를 걸러낼 우려가 있다. 활성탄은 2가지 이상의 활성탄을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 엘라스틴 분해물에 포함된 펩티드를 걸러내지 않는 2가지 이상의 활성탄을 사용할 수 있고, 더욱 바람작하게는, 상기 엘라스틴 분해물에 포함된 서열 1 내지 10의 펩티드를 걸러내지 않는 2가지 이상의 활성탄을 사용할 수 있다. 첨가되는 활성탄의 총량은 효소 처리 전 불용물 중량의 약 3% 중량으로 한다. 구체적으로, 상기 서열 1 내지 10의 펩티드를 걸러낼 우려가 적고 탈취, 탈지 및 탈색 효과를 가진 F-WY 및 F-GZW60을 사용할 수 있으며, 각각을 단독으로 2단계에 걸쳐 사용하거나, 혼합하여 사용할 수 있다.
(5) 여과 및 농축
규조토를 이용하여 1차 여과한 후, 메쉬(예컨데, 200메쉬)를 통해 2차 여과한다. 여과는 약 60℃에서 50~90분 동안 진행될 수 있다.
약 50~65℃ 및 진공도 -0.08 ~ -0.1MPa에서 5~6시간 동안 증발기(Evaporator)를 이용하여 4~10배로 농축할 수 있다.
(6) 살균 및 건조
저온살균기를 이용하여 80 내지 85℃에서 25~35분 동안 저온살균한 후, 최종적으로 60℃에서 200메쉬를 통과시켜 불순물을 제거한다. 고온살균의 경우 원료 조성물에 포함된 펩티드의 파괴 우려가 있으므로, 저온 살균이 권장된다.
80 내지 150℃에서 건조할 수 있으며, 구체적으로 펩티드의 파괴 방지와 건조 효율을 고려하여, 분무건조기(Spray dryer, in-let 온도는 150℃, out-let 온도는 88℃)를 이용하여 약 6시간 동안 건조할 수 있다. 원료 조성물을 파우더 형태로 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 따라 제조된 원료 조성물은 하기 서열 1의 펩티드를 필수 성분으로 포함하고, 하기 서열 2 내지 10의 펩티드군에서 선택된 하나 이상의 펩티드를 추가로 포함한다.
서열 1-(발린-글리신-프롤린-글리신)
서열 2-(발린-글리신-프롤린-글리신-글리신)
서열 3-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-글리신-알라닌-글리신)
서열 4-(트레오닌-글리신-글리신-프롤린-글리신)
서열 5-(글리신-발린-글리신-글리신-프롤린-글리신)
서열 6-(페닐알라닌-글리신-글리신-프롤린)
서열 7-(발린-글리신-프롤린-글리신-루신)
서열 8-(발린-글리신-프롤린-글리신-페닐알라닌)
서열 9-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-루신)
서열 10-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-페닐알라닌)
본 발명에 따른 제조방법에 따라 제조된 원료 조성물은 상기 서열 1의 펩티드는 0.5 내지 5 중량%로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 원료 조성물은 서열 2 펩티드를 추가로 포함하되, 0.1 내지 1.5 중량%로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 원료 조성물은 서열 3 펩티드를 추가로 포함하되, 0.01 내지 1.2 중량%로 포함할 수 있다.
[동물 원료를 이용한 제조방법의 실시예]
이하에서, 가다랑어(Katsuwonus pelamis)의 심장 동맥구를 이용하여 본 발명의 원료 조성물을 제조하는 방법을 살펴본다.
(1) 가다랑어 동맥구 준비 및 다지기
가다랑어의 동맥구 500kg을 준비하고, 상온에서 미트 초퍼(Meat chopper)를 이용하여 잘게 다져준다.
(2) 알칼리성 처리, 중화 및 세척
1) 원료인 동맥구 중량의 약 3배 중량(1500kg)의 0.1mol/L NaOH를 동맥구에 가하고, 약 85℃에서 40~60분 동안 교반해 준다.
2) 상기 NaOH와 동일한 몰 수의 구연산(수용액)을 첨가하여, 약 85℃에서 약 30분 동안 교반하여 중화시킨다.
3) 중화시킨 후, 원료 동맥구 중량의 약 2배 중량(1000kg)의 물을 가하여 상온에서 약 30분 동안 세척하되, 2회 세척하였다.
세척 후 엘라스틴을 포함한 불용물을 약 250kg 얻었다.
(3) 효소 처리
2 단계에 걸쳐 효소(프로테아제) 처리를 하였으며, 동맥구의 엘라스틴이 여러가지 폴리펩티드로 분해된다. 하기와 같이 Thermoase C160(Amano Enzyme INC.) 및 파파인(Papain W-40, Amano Enzyme INC.)을 불용물 중량에 따라 첨가하고, 2단계에 걸쳐 각각 분해 반응시켜 종래의 방법보다 더 많은 엘라스틴 유래 원료 조성물을 얻었다.
1) Thermoase C160에 의한 처리
상기 세척 후 남아있는 불용물에 물과 Thermoase를 첨가한다. 이때 물은 불용물 중량의 약 2배 중량(500kg)으로 하고, Thermoase는 불용물 중량의 약 0.6%(1.5kg)를 첨가한다. 약 70℃에서 2시간 동안 교반하며 반응시켰다.
2) 파파인(Papain W-40)에 의한 처리
상기 세척 후 남아있는 불용물 중량에 대하여 약 1.5% 중량(3.75kg)의 파파인을 첨가하고, 약 80℃에서 2시간 동안 교반하여 반응시켰다.
3) 효소 실활
반응이 완료된 후, 약 90℃로 30분 동안 가열하여 효소들을 실활하였다.
(4) 탈지 및 탈취
소량의 물에 활성탄 F-GZW60 및 F-WY을 녹여서 사용하되, 상기 활성탄들은 효소 처리 전 불용물 중량의 약 1.5% 중량(각각 3.75kg)씩 혼합사용하였다. 효소 처리 완료된 엘라스틴 분해물과 함께 약 90℃에서 30분 동안 교반하여 탈지 및 탈취하였다.
(5) 여과 및 농축
규조토를 이용하여 1차 여과한 후, 200메쉬를 통해 2차 여과하였다. 여과는 약 60℃에서 약 60분 동안 진행하였다.
여과 후 엘라스틴 분해물 및 물의 총 중량은 약 625kg이었다.
약 50~65℃ 및 진공도 -0.08 ~ -0.1MPa에서 5시간 동안 증발기(Evaporator)를 이용하여 약 5배로 농축하였다.
(6) 살균 및 건조
저온살균기를 이용하여 약 85℃에서 30분 동안 저온살균한 후, 최종적으로 60℃에서 200메쉬를 통과시켜 불순물을 제거하였다.
분무건조기(Spray dryer, in-let 온도는 150℃, out-let 온도는 88℃)를 이용하여 약 6시간 동안 건조하여, 원료 조성물을 45kg을 파우더 형태로 얻었다.
같은 방법으로 5회 더 실시하여 얻은 원료 조성물(총 N=6)에 포함된 서열 1 내지 3의 펩티드 함량을 Agilent 6470 Triple Quad LC/MS/MS로 분석한 결과는 아래와 같다.
Figure 112022050111039-pat00001
상기 제조방법에 의하여 제조된 원료 조성물에는, 상기 서열 1의 펩티드가 1.279 내지 1.771 중량%의 범위에서 평균 1.55중량%로 나타났고, 상기 서열 2의 펩티드가 0.708 내지 1.302 중량%의 범위에서 평균 1.03중량%로 나타났으며, 상기 서열 3의 펩티드가 0.622 내지 1.022 중량%의 범위에서 평균 0.87 중량%로 나타났다.
종래의 제조방법인, 일본특허등록5087042호의 실시예 1(문단번호 [0030] 내지 [0033])을 살펴보면, 가용성 고형분(Brix)을 측정한 용액은 정제한 엘라스틴 10g, 서몰리신 0.05g, 파파인 0.05g 및 1/15N의 인산완충액(pH7.0) 30 ml이다. 가용성 고형분(Brix)은 100g의 용액 속에 용질량(g)을 나타내며, 상기 인산완충액의 질량은 기재되지 않았으나, 엘라스틴과 효소만을 고려할 때, 효소에 의한 가용성 고형분은 0.1/10.1*100=0.99% 이므로, 인산완충액이 상기 가용성 고형분에 미치는 영향은 매우 작다고 판단된다. 따라서 정제된 엘라스틴 유래 펩티드양은 약 5.0%이므로, 약 0.5g 추출된 것을 알 수 있다. 그러므로 종래 제조방법에 의하여는, 정제된 엘라스틴으로부터 약 5%의 펩티드를 추출할 수 있고, 원료 동맥구로부터 정제된 엘라스틴은 약 77%(206g/266g*100)를 얻을 수 있으므로 원료 동맥구(266g)로부터는 약 3.87%의 펩티드를 추출할 수 있는 것이다.
이와 비교하여, 본 발명의 제조방법을 이용하는 경우, 원료 동맥구 500kg을 사용하여, 효소처리 후 정제 엘라스틴을 약 250~325kg 얻을 수 있고, 최종적으로 펩티드를 포함하는 원료 조성물(분말)을 약 45kg 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 제조방법에 의하면, 정제된 엘라스틴으로부터 약 13.8~18%의 펩티드를 추출할 수 있고, 원료 동맥구로부터 약 9%의 펩티드를 추출할 수 있다. 그러므로 종래 제조방법과 비교하여, 정제된 엘라스틴으로부터는 176~206% 정도로 더 많은 펩티드를 추출할 수 있게 된 것이며, 원료 동맥구로부터는 약 133% 정도로 더 많은 펩티드를 추출할 수 있게 된 것이다.
본 발명의 제조방법에 의하면 동물 원료의 7.5% 내지 13중량%, 바람직하게는 8% 내지 11중량%의 엘라스틴 유래 펩티드를 얻을 수 있다.
2. 서열 1 펩티드의 화학 합성 방법
이하에서, 화학 합성을 통하여 본 발명의 원료 조성물에 포함되는 상기 서열 1의 펩티드를 제조하는 방법을 살펴본다. 본 발명은 이하의 제조방법으로 한정되는 것은 아니다. 이하의 화학 합성 과정은 도 29 및 30을 참고할 수 있다.
상기 서열 1의 펩티드는 Val-Gly-Pro-Gly 의 4개의 아미노산으로 구성되어 있는 펩티드이며, 화학식은 C14H24N4O5으로 표현되며, 구조식은 하기와 같다.
Figure 112022050111039-pat00002
(1) Crude peptide를 합성하는 과정
1) Fmoc-AA-wang resin을 고상으로 DMF를 이용하여 팽윤시키고, 20%(v/v) 피페리딘(Piperidine)을 가한다.
2) DMF를 이용하여 잔여 피페리딘을 배출하고 세척한다.
3) 아미노산(발린) 및 커플링 시약(HBTU)를 포함하는 혼합액을 상기 수지에 첨가한다.
4) DMF를 이용하여 잔여 아미노산 혼합액을 세척하고, 아미노산의 아민기를 보호하고 있는 Fmoc기 제거하기 위하여, 20% 피페리딘으로 처리한다.
5) DMF를 이용하여 잔여 피페리딘을 배출하고 세척한다.
6) 아미노산(글리신) 및 커플링 시약(HBTU)를 포함하는 혼합액을 준비하여 상기 3) 내지 5)단계를 반복한다.
7) 아미노산(프롤린) 및 커플링 시약(HBTU)를 포함하는 혼합액을 준비하여 상기 3) 내지 5)단계를 반복한다.
8) 아미노산(글리신) 및 커플링 시약(HBTU)를 포함하는 혼합액을 준비하여 상기 3) 내지 5)단계를 반복한다.
9) 상기 resin 상에 펩티드가 합성된다.
10) Trifluoroacetic acid(TFA)를 가하여 펩티드를 회수한다.
11) 여과 및 건조한다.
(2) Crude peptide로부터 서열 1 펩티드를 정제하는 과정
1) 상기 과정에서 얻어진 Crude peptide를 H2O/Acetonitrile에 용해한다.
2) 상기 용해액, 0.05% TFA/Purified water 및 0.05% TFA/Acetonitrile를 HPLC에 통과시켜 서열 1의 펩티드를 분리한다.
3) 동결 건조하여 서열 1의 펩티드를 최종 수득한다.
이상과 같은 방법으로 상기 서열 2 내지 10의 펩티드 또한 합성할 수 있다.
[실시예 1] 원료 조성물
본 발명에 따른 원료 조성물의 일 실시예는 상기한 제조방법에 의하여 가다랑어 동맥구로부터 얻은 엘라스틴 분해물로서, 상기 서열 1의 펩티드를 약 1.55 중량%, 상기 서열 2의 펩티드를 약 1.03 중량%, 상기 서열 3의 펩티드를 약 0.87 중량%로 함유한다.
[실시예 2] 서열 1 펩티드
본 발명에 따른 펩티드의 일 실시예는 상기한 제조방법 중 화학합성방법에 의하여 얻는 서열 1의 펩티드로서, Purity 98,1%(Shimadzu HPLC LabSolution)이고, 분자량은 328.3 Da(AXIMA Assurance, MALDI-TOF, Shimadzu)으로 측정되었다.
[실시예 3] 서열 2 펩티드
서열 2 펩티드는 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 합성하되, 구성하는 아미노산서열에 따라 발린, 글리신, 프롤린, 글리신, 글리신 순서대로 투입하여 합성하였다.
Purity 95.2%(Shimadzu HPLC LabSolution)이고, 분자량은 386.2 Da(AXIMA Assurance, MALDI-TOF, Shimadzu)으로 측정되었다.
[실시예 4] 서열 3 펩티드
서열 3 펩티드는 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 합성하되, 구성하는 아미노산서열에 따라 페닐알라닌, 글리신, 프롤린, 글리신, 글리신, 알라닌, 글리신 순서대로 투입하여 합성하였다.
Purity 99.3%(Shimadzu HPLC LabSolution)이고, 분자량은 562.2 Da(AXIMA Assurance, MALDI-TOF, Shimadzu)으로 측정되었다.
<펩티드 및 원료 조성물의 기능성 확인>
1. 서열 1 내지 3 펩티드 및 원료 조성물의 기능성 연구방법
1) 연구목적
본 연구는 in vitro 체계에서 상기 실시예 1의 원료 조성물 및 실시예 2 내지 4의 펩티드의 피부건강(미백, 주름, 보습) 개선 효능을 평가하기 위함이다.
2) 양성대조물질
① Melanin 생성 억제능 평가: arbutin
② 콜라겐 생성 평가: retinol
③ 보습 활성 평가: N-acetylglucosamine (GlcNAc)
상기한 각각의 양성대조물질은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용함.
3) Tyrosinase 활성 저해능 측정방법
DOPA를 DOPA quinone으로 산화하는 tyrosinase의 DOPA oxidase 활성 저해능을 평가하였다. 시험물질(서열 1 내지 3 펩티드 및 원료 조성물)을 증류수에 녹여 다양한 농도로 희석한 시험액을 각 시험물질별로 준비하였다.
0.1M phosphate buffer(pH 7.0) 170μL, 각각의 희석된 시험액 10μL, 10mM L-DOPA 10μL 및 2000 unit/mL mushroom tyrosinase 10μL를 순차적으로 넣은 후 혼합하여 37℃에서 15분 동안 반응시키고, 475nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
공시험액의 흡광도는 시험액 대신 증류수를 넣어 동일한 방법으로 반응하여 측정하였으며, 효소 활성 저해능은 아래의 식으로 산출하였다.
효소 활성 저해능(%) = {(A-B)/A}x100
A: 공시험액의 반응 후 흡광도, B: 시험액의 반응 후 흡광도
4) Collagenase 활성 저해능 측정방법
마찬가지로 시험물질을 증류수에 녹여 다양한 농도로 희석한 시험액을 준비하고, 기질액은 4-phenylazobenzyloxy carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg을 4mM CaCl2를 함유한 0.1M tris-HCl buffer(pH 7.5)를 사용하여 0.3mg/mL 농도로 제조하였다.
각각의 희석된 시험액 0.1 mL, 기질액 0.25 mL 및 0.2mg/mL collagenase 0.15mL를 순차적으로 넣은 후 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켰다.
이후 6% Citric acid 0.5mL를 넣어 반응을 정지시키고, ethyl acetate 2mL를 첨가하여 320nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 효소 활성 저해능은 아래의 식으로 산출하였다.
공시험액의 흡광도는 시험액 대신 증류수를 넣어 동일한 방법으로 반응하여 측정하였다.
효소 활성 저해능(%) = {(A-B)/A}x100
A: 공시험액의 반응 후 흡광도, B: 시험액의 반응 후 흡광도
5) B16F10 세포에서 Melanin 생성 억제능 평가방법
① 세포 생존율 측정
B16F10 세포의 생존율은 MTT Assay(Denizot F and Lang R. J Immunologocal Method 89: 271-277, 1986)을 실시하여 측정하였다.
B16F10 세포를 5x104 cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 24시간 배양하고, 다양한 농도로 희석된 시험물질을 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환한 후, 72시간 배양한다. 그 후 배양액을 제거하고 1mg/mL MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 첨가하여 2시간 추가 배양하였다. MTT 용액을 제거하고, isopropanol을 첨가(푸른색의 formazan 용해)한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
② B16F10 세포에서 생성된 Melanin 함량 측정
B16F10 세포를 5x104 cells/well이 되도록 12-well plate에 분주하여 24시간 배양하고, 100nM α-melanocyte-stymulating hormone(α-MSH) 및 다양한 농도로 희석된 시험물질을 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환한 후, 72시간 배양한다. 세포 단층을 PBS로 세척한 후 0.25% Trypsin-2.65mM EDTA를 처리하여 세포를 회수하고, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 pellet을 얻었다. pellet에 10% dimethylsulfoxide(DMSO)를 함유한 1N NaOH를 넣어 60℃에서 용해시킨 후 490nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
BCA protein assay kit를 사용하여 단백질을 측정하고 melanin 생성량을 단백질 양으로 표준화한 후, α-MSH 만을 처리한 군의 값을 100으로 하여 상대적인 값으로 나타냈다.
6) HS68 세포에서 피부 주름 개선 평가방법
① 세포 생존율 측정
HS68 세포를 1x104 cells/well이 되도록 48-well plate에 분주하여 24시간 배양하고, 다양한 농도로 희석된 시험물질을 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환한 후, 24시간 배양한다. 그리고 B16F10 세포에서와 동일하게 MTT assay를 실시하였다.
② HS68 세포에서 생성 분비한 collagen 및 MMP-1 함량 측정
HS68 세포를 5x104 cells/well이 되도록 48-well plate에 분주하여 24시간 배양하고, 다양한 농도로 희석된 시험물질을 함유한 serum-free 배양액으로 세포배양액을 교환한 후, 24시간 배양한다. 세포배양액을 수거하여 5,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리한 후 상층액을 취해 -70℃에 보관하였다.
세포배양액 내의 collagen 및 MMP-1 함량은 procollagen type I C-peptide(PIP) EIA kit (Takara)와 Human MMP-1 ELISA kit (Sigma-Aldrich)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.
7) HaCaT 세포에서 피부 보습 개선 평가방법
① 세포 생존율 측정
HaCaT 세포를 5x104 cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 24시간 배양하고, 다양한 농도로 희석된 시험물질을 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환한 후, 24시간 배양한다. 그리고 B16F10 세포에서와 동일하게 MTT assay를 실시하였다.
② HaCaT 세포에서 생성 분비한 Hyaluronic acid(HA) 함량 측정
HaCaT 세포를 5x104 cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하여 24시간 배양하고, 다양한 농도로 희석된 시험물질을 함유한 배양액으로 세포배양액을 교환한 후, 24시간 배양한다. 세포배양액을 수거하여 5,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리한 후 상층액을 취해 -70℃에 보관하였다.
세포배양액 내의 HA 함량은 Hyaluronan ELISA kit(R&D Systems)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.
8) 통계처리
모든 분석 수치는 mean±SEM으로 나타냈다. 수집된 결과는 GraphPad Prism 5.0 프로그램을 이용하여 분석하고, 시험물질 처리군과 대조군의 차이를 비교하기 위하여 Student`s t-test 및 one-way analysis variance를 이용하였다. p < 0.05 이상일 때만 통계적으로 유의성 있는 것으로 판단하였다.
2. Tyrosinase 활성 저해능 평가
4종의 시험물질이 melanin 생성 과정의 주요한 제한 효소인 Tyrosinase의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Tyrosinase의 DOPA oxidase 활성 저해능을 평가하였다. 측정 결과는 하기 표 1(Tyrosinase 활성 저해능(%))에 나타냈다.
Figure 112022050111039-pat00003
E는 실시예 1에 따른 원료 조성물, P1은 실시예 2에 따른 서열 1의 펩티드, P2는 실시예 3에 따른 서열 2의 펩티드, P3은 실시예 4에 따른 서열 3의 펩티드를 표시한 것이다.
표 1을 살펴보면, 전반적으로 P1은 P2 및 P3에 대하여 상대적으로 높은 Tyrosinase 활성 저해능이 나타났다.
P1은 농도가 증가할수록 저해능도 점차 높아졌으며, 따라서 1,000μg/mL에서 31.9±1.2%로 가장 높게 측정되었다.
E 및 P2는 50μg/mL에서 각각 13.6±1.9%, 3.6±1.4%의 최고 값을 나타냈고, E는 1.7±0.6% ~ 13.6±1.9%의 범위의 값이 나타났고, P2는 2.0±0.3% ~ 3.6±1.4%의 범위의 값이 나타났다.
P3은 농도가 증가할수록 저해능도 점차 높아졌으며, 1,000μg/mL에서 6.8±1.7%로 가장 높게 측정되었다.
결론적으로 P1 내지 3 및 E는 Tyrosinase 활성 저해능이 나타났다.
3. Collagenase 활성 저해능 평가
4종의 시험물질이 Collagen 분해를 담당하는 효소인 Collagenase의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Collagenase의 활성 저해능을 평가하였다. 측정 결과는 하기 표 2(Collagenase 활성 저해능(%))에 나타냈다.
Figure 112022050111039-pat00004
E는 3.0±0.4% ~ 17.2±3.8% 범위의 저해능을 나타냈고, 400μg/mL에서 최고 값이 나타났다.
P1은 5.2±1.0% ~ 16.9±1.7% 범위의 저해능을 나타냈고, 200μg/mL에서 최고 값이 나타났다.
P2는 5.2±1.4% ~ 17.4±2.6% 범위의 저해능을 나타냈고, 100, 200 및 400μg/mL에서 각각 17.4±2.0%, 17.4±1.6% 및 17.4±2.6% 값이 나타났다.
P3은 3.5±2.0% ~ 17.4±2.5% 범위의 저해능을 나타냈고, 100 및 200μg/mL에서 각각 17.4±2.5% 및 17.4±1.3% 값이 나타났다.
결론적으로 P1 내지 3 및 E는 Collagenase 활성 저해능이 나타났다.
4. B16F10 세포에서 Melanin 생성 억제능 평가
1) 세포독성 평가
B16F10 세포의 세포 생존율은 시험물질을 처리하지 않은 대조군 (0μg/mL)에 대한 백분율로 나타냈다. 측정 결과는 하기 표 3(B16F10 세포의 생존율 (% of control))에 나타냈다.
Figure 112022050111039-pat00005
4종의 시험물질처리는 대조군과 비교하여 모두 세포 생존율을 유의적으로 증가시켰다. 이는 시험물질이 B16F10 세포에 세포독성을 나타내지 않음을 제시하며, 상기 시험물질들의 각 농도 모두에 대하여 melanin 생성 억제능 연구를 수행하였다.
2) B16F10 세포에서 Melanin 생성 억제능 평가
4종의 시험물질이 melanin 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 α-MSH로 melanin 생성을 유도한 B16F10 세포에 4종의 시험물질을 처리한 후, 세포 내 melanin 함량을 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 4(B16F10 세포의 melanin 생성 (% of control))에 나타냈다.
Figure 112022050111039-pat00006
표 4를 살펴보면, α-MSH를 처리하지 않은 군과 비교하여 α-MSH를 처리한 군에서 melanin 생성이 현저히 증가하였다.
양성대조물질인 arbutin을 200μg/mL 처리한 경우, α-MSH를 처리한 군과 비교하여 melanin 생성이 현저히 감소하였다.
P1 내지 P3 및 E 모두에서 농도가 증가할수록 melanin 생성이 감소되는 양상이 나타났다.
E는 α-MSH를 처리한 군과 비교하여, 200 및 400μg/mL 처리한 경우에 각각 89.3±2.2% 및 82.9±4.4%로 유의적으로 감소하였다.
P1 및 P2는 α-MSH를 처리한 군과 비교하여, 5μg/mL 처리한 경우부터 melanin 함량이 유의적으로 감소하였고, 최고 농도(40μg/mL)에서 각각 85.8±3.1% 및 81.9±3.8%로 유의적으로 감소하였다.
P3은 α-MSH를 처리한 군과 비교하여, 1μg/mL 처리한 경우부터 melanin 함량이 유의적으로 감소하였고, 최고 농도(40μg/mL)에서 각각 82.2±1.3%로 유의적으로 감소하였다.
결론적으로 P1 내지 3 및 E는 α-MSH로 melanin 생성을 유도한 B16F10 세포에서 유의적으로 melanin 생성을 억제하였다.
5. HS68 세포에서 피부탄력(주름) 개선 효능 평가
1) 세포독성 평가
HS68 세포의 세포 생존율은 시험물질을 처리하지 않은 대조군 (0μg/mL)에 대한 백분율로 나타냈다. 측정 결과는 하기 표 5(HS68 세포의 생존율 (% of control))에 나타냈다.
Figure 112022050111039-pat00007
4종의 시험물질처리는 대조군과 비교하여 모두 세포 생존율을 유의적으로 증가시켰다. 이는 시험물질이 HS68 세포에 세포독성을 나타내지 않음을 제시하며, 상기 시험물질들의 각 농도 모두에 대하여 collagen 생성 분비 연구를 수행하였다.
2) HS68 세포에서 collagen 생성 분비 효능 평가
4종의 시험물질이 피부 섬유아세포인 HS68 세포의 Collagen 생성 분비에 미치는 영향을 조사하기 위하여 세포가 condition한 세포배양액을 수거하여 collagen 함량을 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 6(HS68 세포의 collagen 생성 (% of control))에 나타냈다.
Figure 112022050111039-pat00008
표 6을 살펴보면, 양성대조물질인 retinol을 0.5μM 처리한 경우, 대조군과 비교하여 153.3±16.0%로 collagen이 유의적으로 증가하였다.
P1 내지 P3 및 E 모두에서 대체적으로 농도가 증가할수록 collagen 생성이 증가하는 양상이 나타났다.
E는 대조군과 비교하여, 50μg/mL 처리한 경우부터 collagen 함량이 유의적으로 증가하였고, 최고 농도(400μg/mL)에서 199.5±7.4%로 유의적으로 증가하였다.
P1은 대조군과 비교하여, 5μg/mL 처리한 경우부터 collagen 함량이 유의적으로 증가하였고, 최고 농도(40μg/mL)에서 188.8±11.7%로 유의적으로 증가하였다.
P2 및 P3는 대조군과 비교하여, 1μg/mL 처리한 경우부터 collagen 함량이 유의적으로 증가하였고, 최고 농도(40μg/mL)에서 각각 189.8±15.2% 및 228.8±9.4%로 유의적으로 증가하였다.
3) HS68 세포에서 MMP-1 생성 분비 효능 평가
4종의 시험물질이 피부 섬유아세포인 HS68 세포의 MMP-1 생성 분비에 미치는 영향을 조사하기 위하여 세포가 condition한 세포배양액을 수거하여 MMP-1 함량을 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 7(HS68 세포의 MMP-1 생성 (% of control))에 나타냈다.
Figure 112022050111039-pat00009
표 7을 살펴보면, 양성대조물질인 retinol을 0.5μM 처리한 경우, 대조군(0μg/mL)과 비교하여 83.2±2.2%로 MMP-1이 유의적으로 감소하였다.
E는 대조군과 비교하여, MMP-1 생성이 감소하는 경향은 보였으며, 200μg/mL에서 MMP-1 생성이 88.4±6.8%로 감소하였다.
P1 내지 P3은 대조군과 비교하여, 10μg/mL 처리한 경우부터 MMP-1 생성이 유의적으로 감소하였다.
P1 및 P3은 최고 농도(40μg/mL)에서 각각 73.0±7.7% 및 70.2±3.0%로 유의적으로 감소하였고, P2는 20μg/mL에서 76.6±5.0%로 유의적으로 감소하였다.
결론적으로 P1 내지 3 및 E는 HS68 세포에서 유의적으로 Collagen 생성을 증가시켰고, MMP-1의 생성을 유의적으로 감소하였다.
6. HaCaT 세포에서 피부 보습 개선 효능 평가
1) 세포독성 평가
HaCaT 세포의 세포 생존율은 시험물질을 처리하지 않은 대조군 (0μg/mL)에 대한 백분율로 나타냈다. 측정 결과는 하기 표 8(HaCaT 세포의 생존율 (% of control))에 나타냈다.
Figure 112022050111039-pat00010
4종의 시험물질처리는 대조군과 비교하여 모두 세포 생존율에 유의적인 영향을 미치지 않거나, 유의적으로 증가시켰다. 이는 시험물질이 HaCaT 세포에 세포독성을 나타내지 않음을 제시하며, 상기 시험물질들의 각 농도 모두에 대하여 HA 생성 분비 연구를 수행하였다.
2) HaCaT 세포에서 HA 생성 분비 효능 평가
4종의 시험물질이 HaCaT 세포의 HA 생성 분비에 미치는 영향을 조사하기 위하여 세포가 condition한 세포배양액을 수거하여 HA 함량을 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 9(HaCaT 세포의 Hyaluronic acid 생성 (% of control))에 나타냈다.
Figure 112022050111039-pat00011
표 9를 살펴보면, 양성대조물질인 GlcNAc을 1μM 처리한 경우, 대조군(Oμg/mL)과 비교하여 161.8±12.6%로 HA이 유의적으로 증가하였다.
P1 내지 P3 및 E 모두에서 대체적으로 농도가 증가할수록 HA 생성이 증가하는 양상이 나타났다.
E는 대조군과 비교하여, 10μg/mL 처리한 경우부터 HA 함량이 유의적으로 증가하였고, 200μg/mL에서 169.5±4.4%의 최대값으로 유의적으로 증가하였다.
P1은 대조군과 비교하여, 10μg/mL 처리한 경우부터 HA 함량이 유의적으로 증가하였고, 최고 농도(40μg/mL)에서 191.5±13.7%로 유의적으로 증가하였다.
P2 및 P3는 대조군과 비교하여, 1μg/mL 처리한 경우부터 HA 함량이 유의적으로 증가하였고, 최고 농도(40μg/mL)에서 각각 170.7±9.9% 및 180.4±16.3%로 유의적으로 증가하였다.
결론적으로 P1 내지 3 및 E는 HaCaT 세포에서 유의적으로 HA 생성을 증가시켰다.
이상의 결과는 in vitro 체계에서 P1 내지 3 및 E가 피부 미백, 보습 및 주름 개선 효과가 있음을 나타낸다.
<UVB 조사에 의한 피부 손상 모델에서 원료 조성물의 효능 평가>
UVB 조사에 의한 피부 손상 모델에서 피부보습, 주름억제 및 미백활성 효능을 in vitro 및 in vivo 체계에서 확인하였다.
하기 가다랑어 엘라스틴 분말은 상기 실시예 1의 원료 조성물을 분말로 만든 것을 말한다.
1. 재료 및 방법
1) in vitro 실험
하기 표에 기재된 바와 같이, 각각의 기능과 관련된 세포를 배양하여 세포독성 시험(MTT assay)한 후, 자외선을 조사(UVB 조사량: 50 mJ/cm2)하고, 세포독성 시험 결과에 따른 허용 가능한 농도의 원료 조성물과 하기 측정방법을 활용하여, 각 항목을 측정 및 평가하였다.
Figure 112022050111039-pat00012
시험그룹은 NC (Normal Control), C (Control), PC 1 (Positive Control 1, L-ascorbic acid 100 ㎍/mL), PC 2 (Positive Control 2, Arbutin 100 ㎍/mL), KE 50 (Skipjack Tuna [Katsuwonus pelamis], KE 50 ㎍/mL), KE 100 (KE 100 ㎍/mL), KE 200 (KE 200 ㎍/mL), KE 400 (KE 400 ㎍/mL)으로 구성하였다.
① 세포배양
각 세포는 High-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA)에 10% fetal bovine serum (Hyclone laboratories, Logan, Utah, USA), 100 mg/L penicillin-streptomycin (Hyclone laboratories, Logan, Utah, USA), 2 mmol/L L-glutamine (Hyclone laboratories, Logan, Utah, USA), sodium pyruvate (Hyclone laboratories, Logan, Utah, USA), 100 mg/L penicillin-streptomycin (Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA)을 포함하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
② 세포독성시험
세포독성시험 (MTT assay)은 Berridge 등의 방법을 참고하여 수행하였다. 각 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well로 분주하고 overnight하여 안정화 시킨 후 각 well에 시료를 농도별로 처리하였다. 24시간 뒤, 5 mg/mL 농도의 MTT solution을 20 μL 첨가하여 4시간 동안 배양시키고 배지 제거 후 DMSO 100 μL/well 씩 첨가하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
③ RT-PCR (RNA추출 및 실시간 정량 PCR)
각 세포를 6 well plate에 5×105 cells/well씩 분주하고 overnight하여 안정화 시킨 뒤 DPBS로 세척하고 UVB lamp (5 Sankyo Denki G5T5 lamps, Sankyo Denki Co., Yokohama, Japan)를 이용하여 50 mJ/cm2 조사하고 양성대조군인 L-ascorbic acid 100 μg/mL 및 가다랑어 엘라스틴 분말을 50, 100, 200, 400 μg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 뒤, 0.25% trypsin-EDTA로 세포를 수집하고 RNasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 RNA를 추출 한 뒤 iScript™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green (iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 CFX ConnectTM real-time PCR detection system (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)을 사용하였다. 유전자 증폭 반응에 사용할 각각의 Primer 염기서열은 Table 1 및 2에 나타내었다. 95℃에서 10min 동안 hot start 한 후 95℃에서 15s, 57℃에서 15s, 72℃에서 30s 간 40 cycling으로 PCR 분석을 시행하였다. 모든 cycle이 완료된 후, primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 BioRad에서 제공하는 CFX Maestro™ Analysis Software (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)로 분석하였다.
Figure 112022050111039-pat00013
Figure 112022050111039-pat00014
④ Western blot
각 세포를 6 well plate에 5×105 cells/well씩 분주하고 overnight하여 안정화 시킨 뒤, DPBS로 세척하고 UVB lamp (5 Sankyo Denki G5T5 lamps, Sankyo Denki Co., Yokohama, Japan)를 이용하여 50 mJ/cm2 조사하고 양성대조군인 L-ascorbic acid 100 μg/mL 및 가다랑어 엘라스틴 분말을 50, 100, 200, 400 μg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 뒤, 배지를 제거하고 protease inhibitor 첨가된 lysis buffer를 넣어 균질화하여 ice에 두어 일정 시간 유지 후 원심분리 (12,000 rpm, 20분, 4℃)하여 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 BSA와 bio-rad protein assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad, Hercules, CA USA)를 이용하여 Bradford법으로 정량하였다. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE, 10%)을 이용하여 각 샘플 당 20 μL씩 loading하여 전기영동으로 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이한 후, TBST buffer에 용해시킨 5% skim milk (TBS containing 0.5% Tween 20)로 1시간 동안 blocking을 하고, 1차 항체 HAS2, CerS4 (LASS4), beta-actin, MAPK8 (JNK), c-Fos, c-Jun, MMP’s (1, 3, 9), Smad3, PKA, CREB, MITF, TRP-1, TRP-2 (Cell signaling Technology, Beverly, MA, USA) 상온에서 3시간 반응시킨 뒤 membrane을 HRP가 중합된 2차 항체 (Cell signaling Technology, Beverly, MA, USA) 에 60분간 반응시키고, enhanced chemiluminescent (ECL, Amershampharmacia Biotech, UK)를 이용해 발색한 후 Easy photo를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 Western blot band 이미지들은 Image J software (NIH, Bethesda, MD)를 사용하여 band의 밀도를 측정하였다.
⑤ Hyaluronan (hyaluronic acid) 분비량 측정
HaCaT 세포를 배양하여 96 well plate에 1×104 cells/well 분주하고 overnight하여 안정화 시킨 뒤, DPBS로 세척하고 UVB lamp (5 Sankyo Denki G5T5 lamps, Sankyo Denki Co., Yokohama, Japan)를 이용하여 50 mJ/cm2 조사한 후 양성대조군인 L-ascorbic acid 100 μg/mL 및 가다랑어 엘라스틴 분말을 50, 100, 200, 400 μg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 뒤, 상층액을 분리하고 Hyaluronic acid (HA) ELISA Kit (Biovision Inc., CA, USA)를 이용하여 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
⑥ Sphingomyelin 함량 측정
Hyaluronan 분비량 측정과 동일하게 시료를 준비하되, 시료 제조 후 24시간 지난 뒤, 세포를 homogenizing (1% Triton X-100 in chloroform)하여 원심분리 (13,000 rpm, 10min) 후, 상층액을 수집하여 50℃에서 chloroform을 제거하고, 남은 pellet을 assay buffer로 녹여 Sphingomyelin Assay Kit (abcam, cambridge, UK)를 이용하여 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
⑦ pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α)분비량 측정
HS27 세포를 배양하여, Hyaluronan 분비량 측정과 동일하게 시료를 준비하되, 시료 제조 후 24시간 지난 뒤, 상층액을 이용하여 IL-1β, IL-6, TNF-α의 분비량을 Duoset ELISA kit (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 655 nm에서 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
⑧ Tyrosinase activity 측정
B16F10 세포를 배양하여 6 well plate에 2×105 cells/well에 분주하고 overnight하여 안정화 시킨 뒤, 양성대조군인 Arbutin 100 μg/mL과 가다랑어 엘라스틴 분말 50, 100, 200, 400 μg/mL을 분화시약인 IBMX 250 μM과 함께 처리하여 3일간 멜라닌 색소의 분화를 유도하였고 24시간마다 시료와 배지를 교체하였다. 72시간 뒤, assay buffer를 이용하여 homogenizing한 뒤, 원심분리 (10,000×g, 15min, 4℃)하여 얻은 상층액으로 Tyrosinase activity Assay Kit (abcam, cambridge, UK)를 사용하여 490 nm에서 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
⑨ 멜라닌 생성 억제 실험
B16F10 세포를 배양하여 24 well plate에 5×104 cells/well에 분주하고 overnight하여 안정화 시킨 뒤, 양성대조군인 Arbutin 100 μg/mL과 가다랑어 엘라스틴 분말 50, 100, 200, 400 μg/mL을 분화시약인 IBMX 250 μM과 함께 처리하여 3일간 멜라닌 색소의 분화를 유도하였고 24시간마다 시료와 배지를 교체하였다. 72시간 뒤, 각 well을 DPBS로 세척하고 Cell lysis reagent buffer 125 μL를 분주하여 세포를 분리하고 얻은 상층액을 Bradford Dye Reagent로 단백질을 정량하고, 세포에 1N NaOH에 10% DMSO가 함유된 용액을 300 μL를 첨가하여 100℃에서 10분 동안 용해시켜 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
⑩ Nitric oxide (NO) 생성량 측정
B16F10 세포를 배양하여 6 well plate에 2×105 cells/well에 분주하고 overnight하여 안정화 시킨 뒤, 양성대조군인 Arbutin 100 μg/mL과 가다랑어 엘라스틴 분말 50, 100, 200, 400 μg/mL을 분화시약인 IBMX 250 μM과 함께 처리하여 3일간 멜라닌 색소의 분화를 유도하였고 24시간마다 시료와 배지를 교체하였다. 72시간 뒤, assay buffer를 이용하여 homogenizing한 뒤, 원심분리 (13,000 rpm, 5min, 4℃)하여 얻은 상층액으로 Nitric Oxide Assay Kit (abcam, cambridge, UK)를 사용하여 540 nm에서 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
⑪ Glutathione (GSH) 생성량 측정
B16F10 세포를 배양하여 6 well plate에 2×105 cells/well에 분주하고 overnight하여 안정화 시킨 뒤, 양성대조군인 Arbutin 100 μg/mL과 가다랑어 엘라스틴 분말 50, 100, 200, 400 μg/mL을 분화시약인 IBMX 250 μM과 함께 처리하여 3일간 멜라닌 색소의 분화를 유도하였고 24시간마다 시료와 배지를 교체하였다. 72시간 뒤, assay buffer를 이용하여 세포를 lysis하여 얻은 상층액으로 Glutathione Assay Kit (BioVison Inc., Mountain View, CA, USA)를 사용하여 405 nm에서 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
⑫ cAMP level 측정
B16F10 세포를 배양하여 6 well plate에 2×105 cells/well에 분주하고 overnight하여 안정화 시킨 뒤, 양성대조군인 Arbutin 100 μg/mL과 가다랑어 엘라스틴 분말 50, 100, 200, 400 μg/mL을 분화시약인 IBMX 250 μM과 함께 처리하여 3일간 멜라닌 색소의 분화를 유도하였고 24시간마다 시료와 배지를 교체하였다. 72시간 뒤, 0.1M HCl를 이용하여 세포를 lysis하여 얻은 상층액으로 cAMP ELISA Kit (Enzo Life Sciences, PA, USA)를 사용하여 540 nm에서 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
2) in vivo 실험
① 실험동물처리
본 연구에 사용된 실험동물은 ㈜새론바이오에서 20g 내외의 5주령 male SKH-Ⅰ hairless mice를 공급받아 동물 사육실에서 온도는 23±2℃, 명암은 12 hr (light/dark cycle), 습도는 50±5℃으로 일정한 조건 하에 일주일 동안 안정화시킨 후 실험에 이용하였다. 적응기간 중 체중을 측정하여 무작위법으로 평균 체중에 가까운 8마리씩 군을 나누었다. 정해진 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 연구는 경희대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다. (KHGASP-20-347) 하기 표 10에 Experimental design animals (n=8/group)을 나타냈다.
Groups UVB Dietary administration
Normal Control - AIN 93G diet
Control + AIN 93G diet
PC1 + AIN 93G diet + L-ascorbic acid 200 mg/kg·b.w.
PC2 + AIN 93G diet + Arbutin 200 mg/kg·b.w.
KE10 + AIN 93G diet + Katsuwonus pelamis Elastin 10 mg/kg·b.w.
KE20 + AIN 93G diet + Katsuwonus pelamis Elastin 20 mg/kg·b.w.
KE30 + AIN 93G diet + Katsuwonus pelamis Elastin 30 mg/kg·b.w.
PC1: Positive Control 1, L-ascorbic acid 200 mg/kg b.w.
PC2: Positive Control 2, Arbutin 200 mg/kg b.w.
KE 10: Skipjack Tuna [Katsuwonus pelamis], KE 10 mg/kg b.w.
KE 20: Skipjack Tuna [Katsuwonus pelamis], KE 20 mg/kg b.w.
KE 30: Skipjack Tuna [Katsuwonus pelamis], KE 30 mg/kg b.w.
② 투여 방법
본 실험에서 사용한 가다랑어 엘라스틴 분말의 농도는 인체시험 적용 농도인 100 mg/day를 실험동물 기준에 맞추기 위하여 mouse conversion factor (12.33)를 이용하여 계산한 값에 농도 의존적인 결과를 확인하기 위하여 저농도 및 고농도를 추가하여 10, 20, 30 mg/kg·b.w.로 설정하였으며, 양성대조군인 L-ascorbic acid 및 Arbutin은 200 mg/kg·b.w.로 설정하였다. AIN 93G를 기본 식이로 제공하였으며 각 군당 시료는 경구로 투여하였다.
하기 표에 기재된 바와 같이, 허용 가능한 농도의 원료 조성물과 하기 측정방법을 활용하여, 각각의 기능과 관련된 각 항목을 측정 및 평가하였다.
Figure 112022050111039-pat00015
UGTrel8; UDP-glucuronic acid, GlcNAc; UDP-N-acetylglucosamine, LCB1 (SPT); Long chain base 1 (Serine palmitoyltransferase), DEGS1; Dihydroceramide desaturase 1, GAPDH; glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
③ 자외선 조사에 의한 보습저하 유도
자외선 조사는 UVB lamp (5 Sankyo Denky G5T5 lamps, Sankyo Denki Co., Yokohama, Japan)를 이용하여 최소 홍반량 (minimal erythromal dose, MED)을 150 mJ/cm2으로 하여 1주일에 3회씩 마우스의 등 부위에 조사하였으며, 1주는 1MED (150 mJ/cm2), 2주는 2MED (300 mJ/cm2), 3주는 3MED (450 mJ/cm2), 4주부터 8주까지 4MED (600 mJ/cm2) 로 조사하여 보습저하를 유도하였다. 8주의 시험 종료 후 각 군의 실험동물을 희생시켜 혈액과 피부 조직을 얻었다.
④ 경표피 수분 증발량 (TEWL:transepidermal water loss) 측정
경표피 수분함량의 측정은 Lee 등의 연구방법을 참고하였다. 피부의 보습 능력을 판정하기 위해 수분측정기 (howskin)의 전자단자를 마우스 등 부분에 접합하여 본 실험 8주차에 피부 경표피 수분 손실량을 측정하였다.
⑤ 마우스 피부조직으로부터 RNA 추출 및 실시간 정량 PCR
실험동물 희생 후, 분리한 피부조직을 수집하여 1 mL Trizol (QIAZEN)에 보관하여 homogenizing한 뒤, 200 μL Chloroform을 넣어 상층액을 수거하여 RNasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 RNA를 추출한다. 이후의 과정은 상기 in vitro 체계에서 RT-PCR 과정과 동일하다. 유전자 증폭 반응에 사용할 각각의 Primer 염기서열은 Table 3 및 4에 나타내었다.
Figure 112022050111039-pat00016
Figure 112022050111039-pat00017
⑥ Western blot
실험동물 희생 후, 분리한 피부조직을 수집하여 protease inhibitor 첨가된 lysis buffer를 넣어 homogenizing하고 ice에 두어 일정 시간 유지 후 원심분리 (12,000 rpm, 20분, 4℃)하여 단백질을 분리하였다. 이후의 과정은 상기 in vitro 체계에서 Western blot 과정과 동일하다.
⑦ 피부 조직병리학적 관찰
피부 조직병리학적 관찰을 위해 Kim 등의 연구방법에서 H&E 염색방법을 참고하였다. 조직 준비를 위해 mouse를 희생시킨 후 등 쪽 피부를 떼어내어 filter paper에 편평하게 부착한 후 10% 중성 포르말린에 고정시킨 다음 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하여 조직절편기 (RM2125, Leica, Wetzlar, Germany)를 이용해 4 μm의 두께로 절단한 다음 polylysine으로 coating된 slide에 붙였다. 조직절편은 xylene을 이용하여 paraffin을 제거하고 alcohol과 증류수로 10분간 함수시켜 증류수로 세척한 후, 피부조직의 변화양상을 관찰하기 위하여 H&E (Hemaoxylin & Eosin)염색을 실시하였다.
⑧ 피부의 형태학적 관찰
형태학적 관찰은 Wu 등의 연구방법에서 주름사진 촬영 방법을 참고하였다. 형태학적인 변화를 관찰하기 위해 디지털 카메라로 mouse의 등 부위를 근접 촬영하였다.
⑨ 항산화 효소 활성 측정
실험동물 희생 후, 분리한 피부조직을 수집하여 superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) 활성을 각각 SOD Assay kit, Catalase Assay kit, Glutathione Peroxidase Activity Assay Kit (BioVison Inc., Mountain View, CA, USA)를 이용하여 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)로 655 nm에서 흡광도를 측정하였다.
⑩ Tyrosinase activity 측정
실험동물 희생 후, 분리한 피부조직을 수집하여 assay buffer를 이용하여 homogenizing한 뒤, 원심분리 (10,000g, 15min, 4℃)하여 얻은 상층액으로 Tyrosinase activity Assay Kit (abcam, cambridge, UK)를 사용하여 490 nm에서 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
⑪ Nitric oxide (NO) 생성량 측정
실험동물 희생 후, 분리한 피부조직을 수집하여 assay buffer를 이용하여 homogenizing한 뒤, 원심분리 (13,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 얻은 상층액으로 Nitric Oxide Assay Kit (abcam, cambridge, UK)를 사용하여 540 nm에서 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
⑫ cAMP level 측정
실험동물 희생 후, 분리한 피부조직을 수집하여 0.1M HCl를 이용하여 homogenizing한 뒤, 원심분리 (13,000 rpm, 5min, 4℃)하여 얻은 상층액으로 cAMP ELISA Kit (Enzo Life Sciences, PA, USA)를 사용하여 540 nm에서 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
3) 통계처리
본 실험 결과의 분석은 통계프로그램 SPSS (Statistical package for social science version 23.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였으며, 각 실험 항목의 측정 결과를 평균±표준편차 (mean±SD)로 표시하였다. 그룹 간 평균 차이는 one-way ANOVA로 확인하였고 통계적 유의성은 Duncan’s test를 실시하여 P<0.05 수준에서 검정하였다.
2. 결과 및 고찰
1) 피부보습
가) in vitro 결과
① HaCaT 세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말의 세포독성실험
가다랑어 엘라스틴 분말의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 각질형성세포인 HaCaT 세포에 대한 가다랑어 엘라스틴의 농도별 세포 생존율을 도 1a에 나타냈다. 가다랑어 엘라스틴 분말을 농도별로 처리한 결과, 모든 농도군은 시료를 처리하지 않은 0 μg/mL군과 유의적인 차이를 보이지 않았으며 가다랑어 엘라스틴 분말이 세포독성에 영향을 미치지 않은 것으로 판단되어 이를 바탕으로 농도 설정 후 연구를 진행하였다.
② 자외선 조사한 HaCaT 세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 피부보습 관련 유전자 발현에 미치는 영향
자외선 (UV)에 의한 광노화는 진피와 표피의 세포 수 감소 및 기능 저하, 색소 침착, 건조, 두꺼운 피부, 탄력 저하 등을 특징으로 하는 외인성 노화이다. 피부의 가장 바깥쪽에 위치한 각질층은 외부 자극으로부터 피부 보호 및 수분과 지질 조성을 유지하는 역할을 하며, 피부 장벽 기능을 유지하기 위해선 피부 수분 공급이 필요하다. 피부의 세포 외 기질 (ECM)의 구성요소인 히알루론산은 수분 균형에 필수적인 역할을 하는데, 히알루론산은 이당류 (UDP-Glucuronic acid, UGTrel)로 구성되고 각각의 활성화된 뉴클레오티드 당 (UDP-N-AcetylGlucosamine, GlcNAc)과의 반복 단위로 구성되어져 상당량의 수분을 함유할 수 있게 되어 피부장벽 기능 조절과 세포외 기질을 수화시켜 조직 내 수분 항상성을 유지시킨다. 각질층에서 세라마이드는 지질의 약 35-40%를 구성하며 일반적으로 de novo 경로를 따르며 그 중 하나인 serine palmitoyl transferase (SPT; LCB1)에 의해 시작되어 ceramide synthase (CerS4)와 Dihydroceramide desaturase 1(DEGS1) 등의 효소들의 작용으로 합성된다. 본 연구에서 자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 피부보습 관련 인자인 UGTrel7, GlcNAc, Elastin, LCB1 (SPT), DEGS1의 유전자 발현 측정하였으며 결과를 도 2 및 3에 나타냈다.
UGTrel7의 유전자 발현량 측정 결과(도 2의 (A)), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE100, KE200, KE400은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 89.8, 31.5, 56.8, 102.4% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE400군은 양성대조군(PC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE50군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
GlcNAc의 유전자 발현량 측정 결과((도 2의 (B)), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE100, KE200, KE400은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 72.9, 33.2, 39.5, 86.5% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE400군은 양성대조군(PC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE50군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
Elastin의 유전자 발현량 측정 결과(도 2의 (C)), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 57.5, 32.6, 64.1, 69.3, 99.7% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE400군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
LCB1 (SPT)의 유전자 발현량 측정 결과(도 3의 (A)), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 90.4, 45.9, 62.6, 75.3, 73.4% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE200군은 양성대조군(PC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
DEGS1의 유전자 발현량 측정 결과(도 3의 (B)), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 95.9, 59.9, 60.8, 86.0, 115.1% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE400군은 정상대조군(NC) 및 양성대조군(PC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
③ 자외선 조사한 HaCaT 세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 피부보습 관련 단백질 발현에 미치는 영향
히알루론산은 조직의 수분, 탄력 및 구조 조절, 조직 복구, 자유 라디칼 제거 등의 역할을 하며 세 가지의 isoform 효소인 HAS-1, HAS-2, HAS-3에 의해 합성된다. HAS는 UV조사에 의해 하향조절 된다고 보고되어져 있으며 이는 히알루론산의 손실로 이어진다. 세라마이드는 스핑고지질 대사의 중심 대사산물이며 글리코스핑고지질 및 스핑고미엘린 합성의 핵심 중간체이며, 각질층에서 전체 지질 종의 약 절반은 차지하고 표피 장벽 항상성 유지에 핵심 역할을 한다. 본 연구에서 자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 피부보습 관련 인자인 HAS2, CerS4(LASS4)의 단백질 발현 측정하였으며 결과를 도 4에 나타냈다.
HAS2의 단백질 발현량 측정 결과(도 4의 상단 및 왼쪽 아래), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 61.9, 45.9, 121.2, 119.2, 99.9% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE100, KE200, KE400군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
CerS4 (LASS4)의 단백질 발현량 측정 결과(도 4의 상단 및 오른쪽 아래), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 22.4, 19.8, 18.5, 31.9, 42.6% 유의적으로 증가한 결과를 보였다.
④ 자외선 조사한 HaCaT 세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 hyaluronic acid 분비량에 미치는 영향
자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 hyaluronic acid 분비량에 미치는 영향을 측정하였으며 결과를 도 5에 나타냈다.
Hyaluronic acid 분비량 측정 결과(도 5의 왼쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE100, KE200, KE400은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 23.8, 37.3, 42.3, 47.5% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE400군은 정상대조군(NC) 보다 유의적으로 증가한 결과를 보였다. KE50군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
⑤ 자외선 조사한 HaCaT 세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 sphingomyelin 분비량에 미치는 영향
자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 sphingomyelin 분비량에 미치는 영향을 측정하였으며 결과를 도 5에 나타냈다.
Sphingomyelin 분비량 측정 결과(도 5의 오른쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 46.4, 18.8, 36.8, 40.1, 63.2% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE400군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
나) in vivo 결과
① 실험동물의 표피 수분함량에 미치는 영향
건강한 피부표피의 각질층은 30-40%의 수분을 함유하며 수분함량이 10% 이하로 떨어지면 피부가 건조해지고 윤기와 탄력이 없어져 주름생성으로 이어진다. UVB를 조사하여 피부보습을 저하시킨 마우스의 등 조직에서 측정한 경표피 수분함량을 측정하였으며 결과를 도 6에 나타냈다.
UVB를 조사하여 피부보습을 저하시킨 실험동물의 등 조직에서 경표피 수분함량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 26.7, 13.8, 13.0, 25.6, 33.3% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE30군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
② 실험동물의 등 피부조직에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 피부보습 관련 유전자 발현에 미치는 영향
자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 피부보습 관련 인자인 UGTrel8, GlcNAc, Fibrillin-1, LCB1 (SPT), DEGS1의 유전자 발현 측정하였으며 결과를 도 7 및 8에 나타냈다.
UGTrel8의 유전자 발현량 측정 결과(도 7의 왼쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE20, KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 146.2, 80.7, 37.2, 99.3% 유의적으로 증가한 결과를 보였다. KE10군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
GlcNAc의 유전자 발현량 측정 결과(도 7의 가운데), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 76.1, 37.9, 49.6% 유의적으로 증가한 결과를 보였다. KE10, KE20군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
Fibrillin-1의 유전자 발현량 측정 결과(도 7의 오른쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE20, KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 105.1, 69.4, 72.2, 78.4% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE20, KE30은 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)와 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE10군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
LCB1 (SPT)의 유전자 발현량 측정 결과(도 8의 왼쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE20, KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 74.2, 47.5, 62.7, 70.7% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE20, KE30은 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)와 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE10군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
DEGS1의 유전자 발현량 측정 결과(도 8의 오른쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1 (PC1; L-ascorbic acid) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE20, KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 77.9, 48.3, 66.8% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE30은 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)와 유의적인 차이를 보이지 않았다. 양성대조군2 (PC2; Arbutin) 및 KE10군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
③ 실험동물의 등 피부조직에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 피부보습 관련 단백질 발현에 미치는 영향
자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 피부보습 관련 인자인 HAS2, CerS4 (LASS4)의 단백질 발현 측정하였으며 결과를 도 9에 나타냈다.
HAS2의 단백질 발현량 측정 결과(도 9의 상단 및 왼쪽 아래), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 64.8, 46.6, 42.4% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE30은 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)와 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE10, KE20군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
CerS4 (LASS4)의 단백질 발현량 측정 결과(도 9의 상단 및 오른쪽 아래), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 28.6, 26.5, 24.1% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE30은 정상대조군(NC) 및 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)와 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE10, KE20군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
2) 주름억제
가) in vitro 결과
① HS27세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말의 세포독성실험
가다랑어 엘라스틴 분말의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. HS27 인간섬유아세포에 대한 가다랑어 엘라스틴의 농도별 세포 생존율을 도 1b에 나타냈다. 가다랑어 엘라스틴 분말을 농도별로 처리한 결과, 모든 농도군은 시료를 처리하지 않은 0 μg/mL군에 비해 유의적으로 증가한 결과를 보였으며 가다랑어 엘라스틴 분말이 세포독성에 영향을 미치지 않은 것으로 판단되어 이를 바탕으로 농도 설정 후 연구를 진행하였다.
② 자외선 조사한 HS27세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 주름생성 관련 유전자 발현에 미치는 영향
UVB 조사는 진피의 섬유아세포에 영향을 미치며 procollagen 합성의 주요 조절인자인 TGF-β와 Smad 경로를 통하여 procollagen type Ⅰ 생성을 감소시켜 collagen의 손실을 일으킨다. Collagen type Ⅰ은 피부 조직 내 가장 많은 부분을 차지하여 피부에 탄력을 부여하는데 collagenase로 알려진 MMP’s에 의해 분해 및 생성 억제된다. 본 연구에서 자외선 조사한 HS27 인간섬유아세포에서 주름생성 관련 인자인 TGFβR1, procollagen type Ⅰ, Collagen type Ⅰ의 유전자 발현 측정 결과를 도 10에 나타냈다.
TGFβR1의 유전자 발현량 측정 결과(도 10의 왼쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 126.4, 79.9, 104.5, 112.6, 172.1% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE400군은 정상대조군(NC)와 유의적인 차이를 보이지 않았다.
Procollagen type Ⅰ의 유전자 발현량 측정 결과(도 10의 가운데), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 74.5, 40.1, 60.2, 66.2, 100.7% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE400군은 정상대조군(NC)와 유의적인 차이를 보이지 않았다.
Collagen type Ⅰ의 유전자 발현량 측정 결과(도 10의 오른쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 P200, P400은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 66.3, 42.1, 71.2% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE200, KE400군은 양성대조군(PC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE50, KE100군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
③ 자외선 조사한 HS27세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 주름생성 관련 단백질 발현에 미치는 영향
UVB 조사는 활성산소종(ROS)을 생성하여 MAPK경로를 활성화시킨다. MAPK경로 중 JNK의 인산화는 c-Fos 및 c-Jun의 인산화를 통해 MMP의 발현을 더욱 증가시킨다. 특히, MMP 중 1,3,9의 발현을 유도하여 collagen 및 기타 결합 조직 구성요소를 분해한다. MMP-1은 collagenase로서 피부 진피의 주요 구성 성분인 collagen type Ⅰ을 분해하고, MMP-3은 활성화되지 않은 pro-MMP-1을 활성화시키며, MMP-9은 콜라겐 조각을 추가로 가수분해 시킨다. 본 연구에서 자외선 조사한 HS27 인간섬유아세포에서 주름생성 관련 인자인 MAPK8 (JNK), c-Fos, c-Jun, MMP’s (1, 3, 9), Smad3의 단백질 발현을 측정하였으며 결과를 도 11 및 도 12에 나타냈다.
MAPK8 (JNK)의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 40.6, 33.1, 38.4, 54.3, 56.1% 유의적으로 감소한 결과를 보였다.
c-Fos의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 23.7, 29.0, 57.3, 62.2, 55.9% 유의적으로 감소한 결과를 보였다. 특히, KE100, KE400군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았으며, KE200군은 정상대조군(NC) 보다 감소한 결과를 보였다.
c-Jun의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 40.0, 14.2, 47.7, 47.4, 46.7% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE100, KE200, KE400군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
MMP-1의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 29.2, 25.0, 22.6, 26.6, 32.3% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE50, KE200, KE400군은 양성대조군(PC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
MMP-3의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 14.8, 28.9, 26.4, 23.9% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE100, KE200, KE400군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 양성대조군(PC)은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
MMP-9의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 44.4, 29.3, 39.1, 37.5, 50.1% 유의적으로 감소한 결과를 보였다.
Smad3의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE400은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 64.0, 26.8% 유의적으로 증가한 결과를 보였다. KE50, KE100, KE200은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
④ 자외선 조사한 HS27세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, TNF-α)의 분비량에 미치는 영향
UVB에 노출되면 표피 증식, 홍반 등이 나타나며 이러한 과정에서 염증성 사이토카인이 방출된다. 과도하게 증가한 활성산소종 (ROS)는 세포 표면의 다양한 수용체와 성장 인자를 활성화하고 NF-kB, AP-1, MAPK와 같은 전사 인자의 활성화를 증가시킨다. 이후, 염증성 사이토카인과 MMP의 과발현을 초래하고 procollagen의 합성을 감소시킨다. 피부에서 가장 많이 발현되는 사이토카인으로 IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, IL-10이 있으며 이들 인자는 세포 외 기질의 분해를 통해 염증, 면역 억제 및 주름 형성의 원인이 된다. 본 연구에서 자외선 조사한 HS27 인간섬유아세포에서 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6, TNF-α) 분비량에 미치는 영향을 측정하였으며 결과를 도 13에 나타냈다.
IL-1β 분비량 측정 결과(도 13의 왼쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE100, KE200, KE400은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 24.1, 19.8, 19.5, 29.8% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE400은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE50군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
IL-6 분비량 측정 결과(도 13의 가운데), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 37.0, 17.0, 33.7, 37.5, 40.2% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE100, KE200, KE400군은 양성대조군(PC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
TNF-α 분비량 측정 결과(도 13의 오른쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 36.4, 19.5, 24.3, 32.9, 35.9% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE100, KE200, KE400군은 양성대조군(PC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
나) in vivo 결과
① 실험동물 피부의 형태학적 관찰
실험동물의 피부에 자외선을 조사한 뒤 등 피부 조직의 형태학적 관찰 결과를 도 14에 나타냈다. UVB 조사 후, 4주차부터 주름 형성이 눈에 띄게 증가하기 시작하였으며 광노화로 인한 건조함으로 각질형성 및 탄력 저하도 증가하였다. 8주 후 실험동물 희생 전 주름의 형성 정도를 확인한 결과, 자외선 조사군(C)은 정상대조군(NC)에 비해 깊은 주름 및 각질이 형성된 것을 확인하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 주름의 형성 정도가 억제된 것을 확인할 수 있었으며, 특히 KE30군에서 육안으로 구별이 가능할 정도로 주름 형성 및 각질 형성이 상당히 억제된 것을 확인할 수 있었다.
② 실험동물 피부의 조직병리학적 관찰 (H&E staining)
피부장벽기능이 손상되면 각질층이 수분함량 저하 및 경표피 수분 손실의 증가와 같은 이상증상이 관찰된다. 이를 정상으로 유지하기 위해 수분 보존 물질이 세라마이드의 비정상적인 대사와 과도한 분해가 일어나며 표피의 비후화와 각질층의 비정상적인 두께 증가로 피부표면은 거칠어진 상태로 변화한다. 이를 확인하기 위하여 실험동물의 피부에 자외선을 조사한 뒤 등 피부 조직에서 H&E 염색을 통하여 조직병리학적 변화를 관찰하였으며 그 결과를 도 15에 나타냈다.
H&E 염색을 통하여 관찰한 결과, 자외선 조사군(C)이 정상대조군(NC)에 비해 표피의 두께가 상당히 증가한 것을 확인하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 표피의 두께가 감소하였으며 특히, KE20, KE30군에서 상당히 감소한 결과를 나타냈다.
③ 실험동물의 등 피부조직에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 주름생성 관련 유전자 발현에 미치는 영향
자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 주름생성 관련 인자인 TGFβR1, procollagen type Ⅰ, collagen type Ⅰ의 유전자 발현 측정 결과를 도 16에 나타냈다.
TGFβR1의 유전자 발현량 측정 결과(도 16의 왼쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 (KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 63.4, 37.6, 47.0, 89.9% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE30은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 양성대조군2(PC2; Arbutin)군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
Procollagen type Ⅰ의 유전자 발현량 측정 결과(도 16의 가운데), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE20, KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 129.5, 51.0, 61.8, 83.7% 유의적으로 증가한 결과를 보였다. KE10은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
Collagen type Ⅰ의 유전자 발현량 측정 결과(도 16의 오른쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 93.7, 42.5, 26.8, 35.2, 94.9% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE30은 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)와 유의적인 차이를 보이지 않았다.
④ 실험동물의 등 피부조직에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 주름생성 관련 단백질 발현에 미치는 영향
자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 주름생성 관련 인자인 MAPK8 (JNK), c-Fos, c-Jun, MMP’s (1, 3, 9), Smad3의 단백질 발현 측정 결과를 도 17및 18에 나타냈다.
MAPK8 (JNK)의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 19.0, 29.6, 30.5, 32.7, 36.0% 유의적으로 감소한 결과를 보였다.
c-Fos의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 39.4, 44.1, 37.3, 47.9, 49.0% 유의적으로 감소한 결과를 보였다. 특히, KE10군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았으며, KE20, KE30군은 정상대조군(NC) 보다 감소한 결과를 보였다.
c-Jun의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 18.9, 36.2, 30.3, 31.9, 37.8% 유의적으로 감소한 결과를 보였다. 특히, KE10, KE20군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았으며, KE30은 정상대조군(NC) 보다 감소한 결과를 보였다.
MMP-1의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 30.1, 17.0, 11.8, 17.1, 29.5% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE30군은 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)와 유의적인 차이를 보이지 않았다.
MMP-3의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE20, KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 16.7, 7.9, 23.1, 30.6% 유의적으로 감소한 결과를 보였다. KE10군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
MMP-9의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 37.6, 30.2, 36.0, 30.8% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE20군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
Smad3의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 122.5, 47.2, 20.8, 21.0, 78.2% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE30은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
⑤ 실험동물의 등 피부조직에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 항산화효소 (SOD, Catalase, GPx) 활성에 미치는 영향
UVB에 과도하게 노출되면 생성되는 활성산소종 (ROS)는 세포 손상 및 세포 사멸을 일으키고 광노화를 촉진한다. 또한, 지질, 단백질, 콜라겐, DNA 등의 손상, 세포 간 항산화제의 고갈, 세포 내 지질 과산화 농도 증가에 의한 세포 기능 저하, 피부 염증 등을 일으켜 산화적 손상을 유발한다. UVB 조사에 의해 생성된 유해산소는 SOD에 의해 H2O2로 전환되고 Catalase와 GPx가 해독 작용을 하여 과산화수소를 제거하는 항산화 작용을 한다. 본 연구에서 자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 항산화효소인 SOD, Catalase, GPx activity를 측정하였으며 결과를 도 19에 나타냈다.
SOD activity 측정 결과(도 19의 왼쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE20, KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 34.8, 25.0, 18.9, 21.6% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE30군은 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)와 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE10군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
Catalase activity 측정 결과(도 19의 가운데), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 90.0, 53.4, 36.3, 69.4, 72.9% 유의적으로 증가한 결과를 보였다.
GPx activity 측정 결과(도 19의 오른쪽), 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 46.7, 31.0, 14.7, 31.5, 37.3% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE30군은 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)와 유의적인 차이를 보이지 않았다.
3) 미백
가) in vitro 결과
① B16F10세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말의 세포독성실험
가다랑어 엘라스틴 분말의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. B16F10 멜라닌생성 세포에 대한 가다랑어 엘라스틴의 농도별 세포 생존율을 도 1c에 나타냈다. 가다랑어 엘라스틴 분말을 농도별로 처리한 결과, 모든 농도군은 시료를 처리하지 않은 0 μg/mL군에 비해 점차적으로 증가하는 결과를 보였으며, 가다랑어 엘라스틴 분말이 세포독성에 영향을 미치지 않은 것으로 판단되어 이를 바탕으로 농도 설정 후 연구를 진행하였다.
② B16F10세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 멜라닌 생성억제에 미치는 영향
멜라닌 합성은 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2로부터 촉매 작용을 받는 효소 과정에서 melanocytes와 melanoma세포에서 발생하며, 멜라닌 생성 효소 활성에 의해 증가된 멜라닌 세포 수에 의해 피부에 과도한 색소 침착이 발생한다. IBMX는 MITF 및 CREB와 같은 전사 인자의 활성화를 조절하여 PKA 경로를 통해 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 발현을 증가시키며 특히, MITF는 tyrosinase 활성에 중요한 전사 조절제로 멜라닌 세포의 증식, 분화 및 색소 침착에 관여한다. 본 연구에서 IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌생성세포에서 멜라닌 생성억제능을 측정하였으며 결과를 도 20에 나타냈다.
멜라닌생성 억제능 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 분화대조군(C)이 유의적으로 증가하여 IBMX에 의해 멜라닌 합성이 유도되었음을 확인하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 분화대조군(C)에 비해 각각 63.1, 28.6, 30.7, 32.6, 43.2% 유의적으로 감소한 결과를 보였다.
③ B16F10세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 미백 관련 단백질 발현에 미치는 영향
멜라닌은 α-melanocyte 자극 호르몬, cAMP, nitric oxide (NO), 에스트로겐 등 다양한 요인에 의해 생성된다. 세포 내 증가한 cAMP는 PKA를 활성화시켜 CREB의 인산화를 증가시키며 이는 MITF의 활성화로 연결된다. MITF는 멜라닌 합성 속도 제한 효소인 tyrosinase와 멜라닌 세포에서 후속 합성 단계를 조절하는 TRP-1, TRP-2와 같은 멜라닌 생성에 관여하는 효소들을 활성화하여 멜라닌 세포의 성장, 분화 및 기능을 조절한다. 본 연구에서 IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌생성세포에서 미백 관련 인자인 PKA, CREB, MITF, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현을 측정하였으며 결과를 도 21 및 22에 나타냈다.
PKA의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 분화대조군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE100, KE200, KE400은 분화대조군(C)에 비해 각각 39.0, 24.5, 31.2, 35.9% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, 양성대조군(PC)와 KE200, KE400군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE50군은 분화대조군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
CREB의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 분화대조군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 분화대조군(C)에 비해 각각 13.3, 19.9, 35.2, 30.9, 56.0% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE400군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
MITF의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 분화대조군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 분화대조군(C)에 비해 각각 45.9, 16.3, 33.8, 72.5, 76.0% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE200, KE400군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
TRP-1의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 분화대조군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 분화대조군(C)에 비해 각각 44.8, 45.7, 48.6, 53.8, 46.4% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE200군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
TRP-2의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 분화대조군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 분화대조군(C)에 비해 각각 16.8, 24.6, 27.5, 28.9, 49.4% 유의적으로 감소한 결과를 보였다.
④ B16F10세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 tyrosinase 활성에 미치는 영향
IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌생성세포에서 tyrosinase activity 측정 결과를 도 23에 나타냈다.
Tyrosinase activity 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 분화대조군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 분화대조군(C)에 비해 각각 43.4, 15.3, 18.3, 24.4, 34.8% 유의적으로 감소한 결과를 보였다.
⑤ B16F10세포에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 Nitric oxide (NO), Glutathione (GSH), cAMP level에 미치는 영향
Nitric oxide (NO)는 자유라디칼 가스로서 세포 내 및 세포 간 메신저 분자로 간주되며 guanylate cyclase의 활성화를 통해 cGMP 함량을 증가시키고 MITF를 증가시켜 멜라닌 합성을 일으킨다. Glutathione (GSH)은 활성산소로 인한 세포 손상을 방지할 수 있는 항산화제로 세포내에서 주로 환원된 형태 (GSH)로 많이 존재하는데 활성산소 (ROS)와 같은 산화적 스트레스에 의해 산화된 형태 (GSSG)가 증가하게 되면 환원된 형태의 glutathione (GSH)의 양이 감소하거나 합성이 억제된다. cAMP의 증가는 PKA 경로 활성화를 통해 멜라닌 합성을 증가시킨다. 본 연구에서 IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌생성세포에서 Nitric oxide (NO), Glutathione (GSH), cAMP level을 측정하였으며 결과를 도 24에 나타냈다.
Nitric oxide (NO) 측정 결과(도 24의 왼쪽), 정상대조군(NC)에 비해 분화대조군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 분화대조군(C)에 비해 각각 54.3, 28.9, 29.5, 33.2, 40.8% 유의적으로 감소한 결과를 보였다.
Glutathione (GSH) 측정 결과(도 24의 가운데), 정상대조군(NC)에 비해 분화대조군(C)이 유의적으로 감소하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 분화대조군(C)에 비해 각각 105.2, 21.7, 46.2, 46.0, 97.6% 유의적으로 증가한 결과를 보였으며, KE400군은 양성대조군(PC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
cAMP 측정 결과(도 24의 오른쪽), 정상대조군(NC)에 비해 분화대조군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군(PC) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE50, KE100, KE200, KE400)은 분화대조군(C)에 비해 각각 51.2, 25.1, 27.5, 35.9, 43.2% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE400군은 양성대조군(PC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
나) in vivo 결과
① 실험동물의 등 피부조직에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 미백 관련 단백질 발현에 미치는 영향
자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 미백 관련 인자인 PKA, CREB, MITF, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현 측정 결과를 도 25 및 26에 나타냈다.
PKA의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE20, KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 27.4, 27.9, 18.6, 17.7% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE20, KE30군은 양성대조군2(PC2; Arbutin)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. KE10군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
CREB의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 24.0, 26.0, 19.2, 20.8, 29.5% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE30군은 정상대조군(NC) 및 양성대조군2(PC2; Arbutin)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
MITF의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 39.2, 55.9, 23.4, 29.3, 40.5% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE30군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
TRP-1의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 24.7, 32.1, 15.3, 20.4, 33.1% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE30군은 정상대조군(NC) 및 양성대조군2(PC2; Arbutin)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
TRP-2의 단백질 발현량 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 43.3, 64.0, 54.1, 66.8, 65.8% 유의적으로 감소한 결과를 보였으며, KE20, KE30군은 양성대조군2(PC2; Arbutin)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
② 실험동물의 등 피부조직에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 tyrosinase 활성에 미치는 영향
자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 tyrosinase activity 측정 결과를 도 27에 나타냈다.
Tyrosinase activity 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 21.6, 37.5, 14.6, 24.2, 28.6% 유의적으로 감소하였다.
③ 실험동물의 등 피부조직에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 nitric oxide (NO) levels에 미치는 영향
자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 nitric oxide (NO) level 측정 결과를 도 28 왼쪽에 나타냈다.
Nitric oxide (NO) 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군(KE10, KE20, KE30)은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 29.4, 34.4, 11.3, 22.5, 28.1% 유의적으로 감소하였으며, KE30군은 양성대조군2(PC2; Arbutin)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
④ 실험동물의 등 피부조직에서 가다랑어 엘라스틴 분말이 cAMP levels에 미치는 영향
자외선 조사한 실험동물의 등 피부조직에서 cAMP level 측정 결과를 도 28 오른쪽에 나타냈다.
cAMP 측정 결과, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)이 유의적으로 증가하였다. 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid), 양성대조군2(PC2; Arbutin) 및 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 KE20, KE30은 자외선 조사군(C)에 비해 각각 23.2, 39.0, 23.8, 24.4% 유의적으로 감소하였다. KE10군은 자외선 조사군(C)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
4. 결론
1) 보습
- 가다랑어 엘라스틴 분말의 실험 적정 농도 확인을 위해 세포 생존율을 확인한 결과, 100-1000 μg/mL 농도까지 시료를 처리하지 않은 0 μg/mL과 유의적인 차이가 없었으며, 1000 μg/mL 농도까지 안전범위 농도로 생각하고 50, 100, 200, 400 μg/mL을 실험진행 농도로 설정하였다.
- 자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 피부 보습 관련 유전자 발현을 측정한 결과, UGTrel7, GlcNAc, Elastin, DEGS1은 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL의 농도에서 가장 많은 증가를 보였으며, Elastin과 DEGS1의 400 μg/mL군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. LCB1 (SPT)는 자외선 조사군 대비(C) 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 200 μg/mL군에서 가장 많은 증가를 보였다.
- 자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 피부 보습 관련 단백질 발현을 측정한 결과, HAS2는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 50 μg/mL의 농도를 제외한 모든 군들이 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았으며, CerS4 (LASS4)는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL군에서 가장 많은 증가를 보였다.
- 자외선 조사한 HaCaT 각질형성세포에서 hyaluronic acid와 sphingomyelin 분비량을 측정한 결과, 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL의 농도에서 가장 많은 증가를 보였으며, hyaluronic acid의 400 μg/mL군은 정상대조군(NC) 보다 더 증가하였고, sphingomyelin의 400 μg/mL군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말의 동물실험 진행 농도는 인체시험 적용 농도인 100 mg/day를 기준으로 mouse conversion factor (12.33)을 이용하여 계산한 10, 20, 30 mg/kg·b.w.으로 설정하였다.
- 동물실험 진행 동안 가다랑어 엘라스틴 분말이 실험동물의 체중변화와 식이 섭취량, 식이 효율 및 장기무게에 미치는 영향을 확인한 결과, 모두 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았기에 가다랑어 엘라스틴 분말의 섭취가 실험에 영향을 주지 않았음을 확인하였다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말의 섭취가 실험동물의 표피 수분함량에 미치는 영향을 확인한 결과, 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 군들은 자외선 조사군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 특히, 30 mg/kg·b.w.군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 실험동물의 피부 조직에서 보습 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, UGTrel8, GlcNAc, Fibfillin-1, LCB1 (SPT), DEGS1 모두 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 증가하였으며, Fbrillin-1, LCB1 (SPT), DEGS1의 30 mg/kg·b.w.군은 양성대조군1(PC1; L-ascorbic acid)와 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 실험동물의 피부 조직에서 보습 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, HAS2와 CerS4 (LASS4) 모두 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 증가하였으며, CerS4 (LASS4)의 30 mg/kg·b.w.군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
2) 주름
- 가다랑어 엘라스틴 분말의 실험 적정 농도 확인을 위해 세포 생존율을 확인한 결과, 100-1000 μg/mL 농도까지 시료를 처리하지 않은 0 μg/mL군에 비해 유의적으로 증가하였으며, 1000 μg/mL 농도까지 안전범위 농도로 생각하고 50, 100, 200, 400 μg/mL을 실험진행 농도로 설정하였다.
- 자외선 조사한 HS27 인간 섬유아세포에서 주름생성 관련 유전자 발현을 측정한 결과, TGFβR1, procollagen type Ⅰ, collagen type Ⅰ 모두 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL군에서 가장 많이 증가하였으며, 특히, TGFβR1와 procollagen type Ⅰ의 400 μg/mL군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 자외선 조사한 HS27 인간 섬유아세포에서 주름생성 관련 단백질 발현을 측정한 결과, MAPK (JNK)는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 200, 400 μg/mL군에서 가장 많은 감소를 보였고, c-Fos는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 200 μg/mL군에서 가장 많은 감소를 보였으며 정상대조군(NC) 보다 감소한 결과를 보였다. c-Jun은 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 100, 200, 400 μg/mL군이 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았으며, MMP-1 및 MMP-9은 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL군에서 가장 많이 감소하였다. MMP-3는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 분말 처리군 중 100, 200, 400 μg/mL군이 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. Smad3는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 분말 처리군 중 400 μg/mL군에서 가장 많은 증가를 보였다.
- 자외선 조사한 HS27 인간 섬유아세포에서 염증성 사이토카인 분비량을 측정한 결과, IL-1β, IL-6, TNF-α 모두 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL군에서 가장 많이 감소하였으며, IL-1β의 400 μg/mL군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말의 동물실험 진행 농도는 인체시험 적용 농도인 100 mg/day를 기준으로 mouse conversion factor (12.33)을 이용하여 계산한 10, 20, 30 mg/kg·b.w.로 설정하였다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말의 섭취가 실험동물의 피부 주름 형성에 미치는 영향을 확인한 결과, 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 주름 형성 및 각질 형성이 가장 억제되었다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 실험동물의 피부 조직을 조직병리학적 관찰한 결과, 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 20, 30 mg/kg·b.w.군에서 표피의 두께가 가장 많이 감소한 결과를 보였다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 실험동물의 피부 조직에서 주름생성 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, TGFβR1, procollagen type Ⅰ, collagen type Ⅰ 모두 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많은 증가를 보였으며, 특히, TGFβR1의 30 mg/kg·b.w.군은 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 실험동물의 피부 조직에서 주름생성 관련 단백질 발현을 측정한 결과, MAPK (JNK)는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였다. c-Fos는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 20, 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였으며, 정상대조군(NC) 보다 감소한 결과를 보였다. c-Jun은 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였으며 정상대조군(NC) 보다 감소하였다. MMP-1 및 MMP-3은 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였으며, MMP-9은 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 20 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였고 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. Smad3는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 증가하였으며, 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 실험동물의 피부 조직에서 항산화효소 활성을 측정한 결과, SOD 및 GPx는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 증가하였으며, Catalase는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 분말 섭취군 중 20, 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 증가하였다
3) 미백
- 가다랑어 엘라스틴 분말의 실험 적정 농도 확인을 위해 세포 생존율을 확인한 결과, 100-1000 μg/mL 농도까지 시료를 처리하지 않은 0 μg/mL군에 비해 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타냈으며, 1000 μg/mL 농도까지 안전범위 농도로 생각하고 50, 100, 200, 400 μg/mL을 실험진행 농도로 설정하였다.
- IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌 생성세포에서 멜라닌 생성 억제능을 측정한 결과, 분화대조군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL군에서 가장 많은 감소를 보였다.
- IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌 생성세포에서 미백 관련 단백질 발현을 측정한 결과, PKA, CREB, MITF는 분화대조군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL군에서 가장 많이 감소하였으며 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. TRP-1은 분화대조군(C) 대비 가다랑어 분말 처리군 중 200 μg/mL군에서 가장 많이 감소하였으며 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. TRP-2는 분화대조군(C) 대비 가다랑어 분말 처리군 중 400 μg/mL군에서 가장 많이 감소하였다.
- IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌 생성세포에서 tyrosinase 활성을 측정한 결과, 분화대조군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL군에서 가장 많이 감소하였다.
- IBMX로 분화시킨 B16F10 멜라닌 생성세포에서 nitric oxide (NO), glutathione (GSH), cAMP level을 측정한 결과, nitric oxide (NO)와 cAMP는 분화대조군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL 농도에서 가장 많이 감소한 결과를 보였으며, glutathione (GSH)는 분화대조군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 처리군 중 400 μg/mL군에서 가장 많은 증가를 보였다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말의 동물실험 진행 농도는 인체시험 적용 농도인 100 mg/day를 기준으로 mouse conversion factor (12.33)을 이용하여 계산한 10, 20, 30 mg/kg·b.w.로 설정하였다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 실험동물의 피부 조직에서 미백 관련 단백질 발현을 측정한 결과, PKA는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 20 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였다. CREB, MITF 및 TRP-1은 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였으며 정상대조군(NC)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. TRP-2는 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 20, 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 실험동물의 피부 조직에서 tyrosinase 활성을 측정한 결과, 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 실험동물의 피부 조직에서 nitric oxide (NO) level을 측정한 결과, 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였다.
- 가다랑어 엘라스틴 분말을 섭취한 실험동물의 피부 조직에서 cAMP level을 측정한 결과, 자외선 조사군(C) 대비 가다랑어 엘라스틴 분말 섭취군 중 20, 30 mg/kg·b.w.군에서 가장 많이 감소하였다.
위의 결과들로 미루어 보아, 가다랑어 엘라스틴 분말은 세포실험에서 400 μg/mL 농도와 동물실험에선 30 mg/kg·b.w. 농도가 보습, 주름 및 미백 관련 기전에서 가장 효과적인 농도인 것으로 보인다. 이는 가다랑어 엘라스틴 분말이 보습 인자들의 발현을 증가시켜 피부의 수분함량 증가에 도움을 주고, 주름 생성 관련 인자들의 발현 억제에 도움을 주어 피부 탄력에도 영향을 줄 수 있을 것으로 판단되며 멜라닌 생성 관련 인자들의 발현을 조절하여 미백에도 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
<원료 조성물의 기능성 확인을 위한 임상시험 연구>
1. 피부 주름 개선 및 보습에 미치는 가다랑어 엘라스틴의 유효성 및 안전성을 평가하기 위한 12주, 무작위배정, 이중눈가림, 위약대조 인체적용시험
1) 시험과정
인체 적용시험은 만 35세 이상이고 만 60세 미만인 주름이 있고, 피부가 건조한 남녀를 대상으로 하였다.
시험 대상자 수는 아래와 같다.
Figure 112022050111039-pat00018
시험 식품은 상기 실시예 1에 따른 원료 조성물(가다랑어 엘라스틴)을 시험식품으로 하고, 대조식품(placebo)를 이용하며, 시험대상자들은 시험식품 또는 대조식품을 12주 동안 1일 1회, 1회 1캡슐 섭취(시험식품은 100mg/day)하였다. 시험대상자들은 성별, 연령(50세 이하, 50세 초과)에 따라 시험군 또는 대조군으로 무작위배정하였다. 시험진행 과정은 아래와 같다.
Figure 112022050111039-pat00019
2) 유효성 및 안전성 평가 변수
1차 유효성 평가 변수는 피부 주름(육안평가, Mark-Vu, PRIMOSlite)과 피부수분량이며, 2차 유효성 평가 변수는 경피수분손실량, 피부 탄력, 미백, eye wrinkle volume, 인체적용시험 시험자의 개선도 평가, 인체적용시험 대상자의 개선도 평가이다.
안전성 평가 변수는 이상반응, 임상병리검사(혈액학적/혈액화학적검사, 뇨검사), 활력징후(혈압, 맥박), 신체계측(체중)이다.
2. 유효성 평가 결과
1) 1차 유효성 평가
본 인체적용시험의 1차 유효성 평가는 피부 주름(육안평가, Mark-Vu, PRIMOSlite)과 피부 수분의 변화량으로서 시험군과 대조군의 개선 정도를 분석 및 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 있는지 평가하였다.
육안평가와 Mark-Vu로 측정된 좌ㆍ우 눈꼬리 부위의 피부 주름 Grade 변화량을 PP Set으로 분석한 결과에서 섭취 12주 후 시험군은 0.05±0.34 감소하였고(p=0.3047), 대조군은 0.14±0.41 증가하여(p=0.0325) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p=0.0365(W)).
FA set으로 분석한 결과에서는 섭취 12주 후 시험군은 0.04±0.31 감소하였고(p=0.3047), 대조군은 0.14±0.40 증가하여(p=0.0325) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p=0.0278(W)).
PRIMOSlite로 측정된 좌ㆍ우 눈꼬리 부위의 Ra(평균 거칠기) 변화량을 PP set으로 분석한 결과에서 섭취 12주 후 시험군은 1.48±0.92μm 감소하였고(p<0.0001), 대조군은 0.09±1.22μm 증가하여(p=0.6090) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.0001(W)).
FA set으로 분석한 결과에서는 섭취 12주 후 시험군은 1.58±1.01 μm 감소하였고(p<0.0001), 대조군은 0.09±1.21μm 증가하여(p=0.6288) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.0001(W)).
PRIMOSlite로 측정된 좌ㆍ우 눈꼬리 부위의 Rmax(최대 높이: 산 높이와 골 깊이의 합) 변화량을 PP Set으로 분석한 결과에서 섭취 12주 후 시험군은 7.45± 8.53μm 감소하였고(p<0.0001), 대조군은 1.70±10.40μm 증가하여(p=0.2782) 섭취 군간 유의한 차이가 나타났다(p<0.0001[3]).
FA set으로 분석한 결과에서는 섭취 12주 후 시험군은 8.69±8.85 μm 감소하였고(p<0.0001), 대조군은 1.42±10.26μm 증가하여(p=0.3480) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.0001[3]).
PRIMOSlite로 측정된 좌ㆍ우 눈꼬리 부위의 Rp(최대 단면 산 높이) 변화량을 PP Set으로 분석한 결과에서 섭취 12주 후 시험군은 4.20±9.03μm 감소하였고(p=0.0061), 대조군은 0.08±8.43μm 증가하여(p=0.9510) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p=0.0420[3]).
FA set으로 분석한 결과에서는 섭취 12주 후 시험군은 4.95±9.25μm 감소하였고(p=0.0006), 대조군은 0.33±8.55 μm 감소하여(p=0.7897) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p=0.0141[3]).
PRIMOSlite로 측정된 좌ㆍ우 눈꼬리 부위의 Rv(최대 단면 골 높이) 변화량을 PP Set으로 분석한 결과에서 섭취 12주 후 시험군은 4.72±7.28μm 감소하였고(p=0.0004), 대조군은 1.12±6.90μm 증가하여(p=0.2820) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p=0.0003(W)).
FA set으로 분석한 결과에서는 섭취 12주 후 시험군은 5.34±7.20 μm 감소하였고(p<0.0001), 대조군은 1.20±6.93μm 증가하여(p=0.2401) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.0001(W)).
PRIMOSlite로 측정된 좌ㆍ우 눈꼬리 부위의 Rz(10점 평균 거칠기) 변화량을 PP Set으로 분석한 결과에서 섭취 12주 후 시험군은 6.87±4.15μm 감소하였고(p<0.0001), 대조군은 0.69±6.10μm 증가하여(p=0.4500) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.0001[3]).
FA set으로 분석한 결과에서는 섭취 12주 후 시험군은 7.55±4.69μm 감소하였고(p<0.0001), 대조군은 0.67±6.05μm 증가하여(p=0.4485) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.0001[3]).
Corneometer® CM825로 측정된 좌ㆍ우 눈꼬리와 코끝 직각교차부위의 피부 수분 변화량을 PP Set으로 분석한 결과에서 섭취 12주 후 시험군은 4.24±2.66AU 증가하였고(p<0.0001), 대조군은 3.06± 2.15 AU 증가하여(p<0.0001) 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p=0.0160(W)).
FA set으로 분석한 결과에서 섭취 12주 후 시험군은 4.20± 2.97 AU 증가하였고(p<0.0001), 대조군은 3.02± 2.12AU 증가하여(p<0.0001) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p=0.0327(W)).
2) 2차 유효성 평가
2차 유효성 평가는 미백 및 Eye Wrinkle Volume 평가의 변화량으로써 시험군과 대조군의 개선 정도를 분석 및 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 있는지 평가하였다.
Mexameter® MX 18로 측정된 좌ㆍ우 눈꼬리와 코끝 직각교차부위의 미백 멜라닌지수 변화량을 PP Set으로 분석한 결과에서 섭취 12주 후 시험군은 2.86± 7.24 감소하였고(p=0.0181), 대조군은 0.13± 7.43 감소하여(p=0.9047) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p=0.0303[3]).
FA set으로 분석한 결과에서는 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.
PRIMOSlite로 측정된 좌ㆍ우 Eye Wrinkle Volume 변화량을 PP Set으로 분석한 결과에서 섭취 12주 후 시험군은 4.10± 2.56 mm3 증가하였고(p<0.0001), 대조군은 0.05± 2.93 mm3 감소하여(p=0.6131) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.0001(W)).
FA set으로 분석한 결과에서는 섭취 12주 후 시험군은 4.00± 2.54 mm3 증가하였고(p<0.0001), 대조군은 0.13± 2.89 mm3 감소하여(p=0.7946) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.0001(W)).
3) 안전성 평가
안전성 평가는 인체적용시험에 무작위배정된 후 인체적용시험용 식품을 한번이라도 섭취한 인체적용시험 대상자를 분석 대상자(Safety Set)로 하였으며, 총 99명(시험군 50명, 대조군 49명)의 인체적용시험 대상자가 Safety Set에 포함되었다.
시험군에서는 총 2명(4.00 %)의 인체적용시험 대상자에게서 3건의 이상반 응이 있었고, 대조군에서는 총 3명(6.12 %)의 인체적용시험 대상자에게서 3 건의 이상반응이 있었으나 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다(p=0.6777(F)).
시험군에서는 총 3건의 이상반응이 발생하였으며, 발생한 이상반응은 만성복합치주염(Gastro-intestinal system disorders, 2.00%), 일시적 불안(Psychiatric disorders, 2.00%), Chilblains([UNKNOWN], 2.00%)이었다. 대조군에서는 총 3건의 이상반응이 발생하였으며, 발생한 이상반응은 어깨통증(Musculo-skeletal system disorders, 2.04%), Acute vaginitis(Reproductive disorders, female, 2.04 %), 접촉성 피부염(Skin and appendages disorders, 2.04 %)이었다.
이 중 중대한 이상반응은 발생하지 않았으며, 이상반응으로 인한 중도탈락자 또한 없었다.
이상반응의 증상정도 조사에서 시험군은 경도(Mild) 3건이었으며, 대조군은 경도(Mild) 3건이었다.
인체적용시험용 식품과의 관련성에서 시험군은‘명확히 관련이 없다고 생각됨’이 3건이었고 대조군은‘명확히 관련이 없다고 생각됨’이 3건으로 시험자에 의해 판단되었으며, 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.
본 인체적용시험에서 안전성 평가를 위한 임상병리검사는 방문1과 방문5에서 시행되었다. 검사항목은 혈액학적검사, 혈액화학적검사, 뇨검사로 나누어 평가되었다.
혈액학적검사의 중 WBC 항목에서 섭취 12주 후 시험군은 0.53±1.14 x103/μL 증가하였고(p=0.0010), 대조군은 0.06±1.37 x 103/μL 감소하여(p=0.8796) 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이가 나타났으나(p=0.0089(W)), 시험자에 의해 임상적으로 의미가 있다고 판단된 대상자는 없었다. 섭취 12주 후의 시험군의 평균 및 표준편차는 5.81±1.51x103/μL, 대조군의 평균 및 표준편차는 4.96±1.22x103/μL로, 모두 정상범위인 4.0 x 103/μL ~ 10.0 x 103/μL 내외의 결과를 나타냈다.
이외 혈액학적검사의 항목에서는 섭취 12주 후 섭취 군간 통계학적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.
혈액화학적검사의 모든 항목에서는 섭취 12주 후 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.
모든 뇨검사 항목에서는 시험군, 대조군 모두 섭취 전후 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.
활력징후(혈압, 맥박), 신체계측(체중)에서 섭취 12주 후 섭취 군간 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.
본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고, 본 발명의 기술적 요지를 벗어나지 아니하는 범위 내에서 다양하게 수정 또는 변형되어 실시될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.
<110> DAEHAN CHEMTECH CO., LTD <120> Peptide And Raw Material Composition For Improving Skin Beauty <130> P22-0181 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide derived from an elastin extracted from Katsuwonus pelamis arterae occipitalis <400> 1 Val Gly Pro Gly 1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide derived from an elastin extracted from Katsuwonus pelamis arterae occipitalis <400> 2 Val Gly Pro Gly Gly 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide derived from an elastin extracted from Katsuwonus pelamis arterae occipitalis <400> 3 Phe Gly Pro Gly Gly Ala Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide derived from an elastin extracted from Katsuwonus pelamis arterae occipitalis <400> 4 Thr Gly Gly Pro Gly 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide derived from an elastin extracted from Katsuwonus pelamis arterae occipitalis <400> 5 Gly Val Gly Gly Pro Gly 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide derived from an elastin extracted from Katsuwonus pelamis arterae occipitalis <400> 6 Phe Gly Gly Pro 1 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide derived from an elastin extracted from Katsuwonus pelamis arterae occipitalis <400> 7 Val Gly Pro Gly Leu 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide derived from an elastin extracted from Katsuwonus pelamis arterae occipitalis <400> 8 Val Gly Pro Gly Phe 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide derived from an elastin extracted from Katsuwonus pelamis arterae occipitalis <400> 9 Phe Gly Pro Gly Leu 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide derived from an elastin extracted from Katsuwonus pelamis arterae occipitalis <400> 10 Phe Gly Pro Gly Phe 1 5

Claims (13)

  1. 하기 서열 1의 펩티드를 필수 성분으로 포함하고,
    하기 서열 2 내지 10의 펩티드군에서 선택된 하나 이상의 펩티드를 추가로 포함하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
    서열 1-(발린-글리신-프롤린-글리신)
    서열 2-(발린-글리신-프롤린-글리신-글리신)
    서열 3-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-글리신-알라닌-글리신)
    서열 4-(트레오닌-글리신-글리신-프롤린-글리신)
    서열 5-(글리신-발린-글리신-글리신-프롤린-글리신)
    서열 6-(페닐알라닌-글리신-글리신-프롤린)
    서열 7-(발린-글리신-프롤린-글리신-루신)
    서열 8-(발린-글리신-프롤린-글리신-페닐알라닌)
    서열 9-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-루신)
    서열 10-(페닐알라닌-글리신-프롤린-글리신-페닐알라닌)
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열 1의 펩티드를 0.5 내지 5 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열 2 및 서열 3의 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열 2 펩티드를 포함하되,
    상기 서열 2 펩티드의 함량은 0.1 내지 1.5 중량%인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 서열 3 펩티드를 포함하되,
    상기 서열 3 펩티드의 함량은 0.01 내지 1.2 중량%인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 원료 조성물은 피부 또는 조직의 보습성을 개선하거나, 탄력 또는 주름을 개선하거나, 또는 색소침착을 완화하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 것인, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 원료 조성물은 액상 용액, 현탁액, 고형물 또는 분말 형태인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 원료 조성물은 식품 또는 화장품 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 원료 조성물이 고형물 또는 분말 형태로 식품에 포함되는 경우,
    상기 원료 조성물의 용량은 25 mg/day 내지 500 mg/day인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 원료 조성물이 식품에 포함되는 경우,
    상기 식품은 음료, 빙과, 면류, 과자류, 수산물, 가공 식품, 유제품, 유지, 유지 가공 식품, 레토르트 파우치(retort pouch) 식품, 비타민 복합체, 일반 식품, 건강식품, 보건 기능 식품, 의약 부외품, 의약품 및 영양 보조 식품을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 원료 조성물이 화장품에 포함되는 경우,
    상기 화장품은 액상 용액, 현탁액, 파우더, 에멀젼, 로션, 스프레이, 에어로졸, 연고, 크림, 폼(Foam), 팩, 젤리, 립크림, 립스틱, 입욕제 및 아스트린젠트를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 원료 조성물은 비타민A, 비타민K, 비타민E, 미녹시딜(minoxidil), 에스트라디올(estradiol), 콜라겐, 히알루론산, 항산화물질, 식품 첨가제, 부형제 및 첨가제를 포함하는 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는, 피부 미용 개선용 원료 조성물.
  13. 삭제
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