KR102436043B1 - 재조합 헤모글로빈 및 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 산소운반능력이 개량된 재조합 헤모글로빈 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 뇌졸중, 출혈성 쇼크, 말초 동맥 질환(PAD), 급성 고산병(AMS), 암 및 파킨슨병(PD)과 같은 산소 결핍 관련 질병 또는 상태(condition)를 치료하는데 유용한 재조합 헤모글로빈을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 2월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/799,829 의 우선권 혜택을 주장하며, 그 내용은 모든 목적을 위해 전체가 이하에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 재조합 헤모글로빈 및 이의 제조 방법, 정제 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 재조합 헤모글로빈을 포함하는 약학적 조성물 및 상기 재조합 헤모글로빈을 토대로 제조된 약학적 조성물을 뇌졸중(stroke), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), 말초 동맥 질환(peripheral arterial disease; PAD) 및 급성 고산병(acute mountain sickness; AMS)과 같은 산소 결핍 관련 질병 및 암 또는 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)과 같은 기타 질병 또는 상태(condition)를 치료하는데 사용하는 방법에 관한 것이다.
헤모글로빈(Hb)은 순환계를 통한 혈류를 통해 신체 조직에 산소를 전달하는 적혈구가 풍부한 산소 운반 단백질이다. 상기 산소를 운반하는 단백질은 4개의 관련 폴리펩티드 사슬(2 개의 알파 사슬과 2 개의 베타 사슬)로 구성되며, 철 원자(iron atoms)가 일시적으로 폐의 산소와 결합하여 신체 전체로 방출하는 헴(heme)이라는 기(group)를 가지고 있다. 헤모글로빈은 또한 일산화탄소(CO)와 결합하여 (일산화탄소)헤모글로빈(HbCO)을 형성할 수 있으며, 이는 신체에 산소를 전달하는 데 사용할 수 있는 Hb의 총량을 감소시킬 수 있다.
저산소증(Hypoxia)은 암에서 흔히 볼 수 있는 현상으로서, 종양 세포에서 이들 제제의 세포독성 활성에 필수적인 산소를 제거함(depriving)으로써 전리 방사선(ionizing radiation) 및 화학요법(chemotherapy)에 대한 내성을 유도할 수 있다. 저산소증은 또한 단백질 상의(proteomic) 및 게놈 상의(genomic) 변화를 포함하는 하나 이상의 간접적 메커니즘을 통해 방사선 요법 및 화학요법에 대한 종양 민감성을 감소시킬 수 있다.
적혈구에서 추출한 헤모글로빈은 저산소 조직으로의 산소 전달을 위한 혈액 대체물로 사용되어왔다. 그러나 적혈구에서 정제된 비변형 무세포 (unmodified cell-free) Hb을 사용 시, 오염, 공급의 제한, 보조인자 2,3-디포스포글리세레이트(2,3-DPG)의 손실로 인한 산소 친화도의 증가, 및 신장 여과에 의해 제거되고 장기간 신장 손상을 일으킬 수 있는 Hb 사량체(tetramers)의 αβ 이량체로의 해리 등과 같은 몇 가지 제약사항이 있을 수 있다.
개량된 재조합 헤모글로빈의 개발은 상기 언급한 문제들의 일부 또는 전부를 해결할 수 있다. 그러나 기존의 재조합 헤모글로빈은 낮은 산소운반능력의 문제점이 있고, 기존의 헤모글로빈 제조방법은 고된 작업으로서, 헤모글로빈의 용해도가 낮으면서도(soluble yields) 불순물 함량이 높은 문제점이 있다. 예를 들어, 기존의 재조합 헤모글로빈 생산에서 흔히 발생하는 부산물인 프로토포르피린-IX(protoporphyrin-IX; PPIX)는 상기 재조합 헤모글로빈의 전반적인 산소 운반체 기능을 손상시킬 수 있다.
기존의 재조합 헤모글로빈의 제조방법은 일반적으로 PPIX 와 같은 불순물을 제거하기 위한 열처리 단계를 포함한다. 그러나, 제조 방법에 열처리 단계를 포함하면 비용이 증가하고 단백질 제품의 수율이 감소할 수 있다. 또한, 열처리 및 이의 하류공정(downstream processes)에서 상기 재조합 헤모글로빈의 안정성을 유지하기 위하여 상기 재조합 헤모글로빈에 CO 가 필요하다. 그러나, 최종 제품에서 CO 는 바람직하지 않기 때문에 기존 제조 방법에는 일반적으로 CO 제거 단계가 필요하며, 이로 인하여 기존 방법들은 많은 비용과 시간이 요구된다.
따라서, 높은 산소운반능력을 가진 개량된 재조합 헤모글로빈이 필요한 상황이며, 고수율, 고순도의 재조합 헤모글로빈의 간편한 제조 방법 역시 필요하다.
본 발명은 전체적으로 재조합 헤모글로빈 및 이의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 상기 재조합 헤모글로빈은 개량된 산소 운반 능력을 가질 수 있다. 상기 기재된 재조합 헤모글로빈은 암, 뇌졸중, 출혈성 쇼크, 급성 고산병(AMS), 말초 동맥 질환(PAD) 및 파킨슨병(PD)과 같은 질병의 치료에 유용하다.
본 발명은 또한 전반적으로 본원에 기재된 재조합 헤모글로빈의 제조 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법을 이용하여 제조된 상기 재조합 헤모글로빈은 감소된 양의 PPIX, HbCO 가 거의 없거나 또는 전혀 없을 수 있으며, 최적의 헴(heme)/단백질 비율 및 사량체/이량체 분포를 가질 수 있다.
본 발명의 제 1 양태에서, 디-알파 사슬과 2 개의 베타 사슬을 포함하는 재조합 헤모글로빈에 있어서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 과 98.93% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치와 143 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌이어야 하며, 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치의 아미노산은 글루타민이어야 하는 것인, 재조합 헤모글로빈이 제공된다.
본 발명의 상기 제 1 양태의 제 1 실시예에서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 과 99.29% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 상기 제 1 양태의 제 2 실시예에서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 과 99.64% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 상기 제 1 양태의 제 3 실시예에서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1을 갖는 폴리펩티드 서열이다.
본 발명의 상기 제 1 양태의 제 4 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 2 와 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기서 1 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 한다.
본 발명의 상기 제 1 양태의 제 5 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 2 를 갖는 폴리펩티드 서열이다.
본 발명의 상기 제 1 양태의 제 6 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 3 과 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며, 여기서 1 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 82 번 위치의 아미노산은 아스파르트산이어야 하며, 108 번 위치의 아미노산은 라이신이어야 한다.
본 발명의 상기 제 1 양태의 제 7 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 3 과 98.63% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 상기 제 1 양태의 제 8 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 3 과 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 상기 제 1 양태의 제 9 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 3의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 제 2 양태에서, 상기 언급된 재조합 헤모글로빈 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 제 3 양태에서, 치료적 유효량의 상기 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 산소 결핍 관련 질병을 이를 필요로 하는 상기 개체에서 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 상기 제 3 양태의 제 1 실시예에서, 상기 산소 결핍 관련 질병은 암, 뇌졸중, 출혈성 쇼크, 급성 고산병(AMS), 말초 동맥 질환(PAD) 또는 파킨슨병(PD)을 포함하는 상기 개체에서 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 4 양태에서, (a) 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 디-알파 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 베타 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 숙주 세포가 재조합 헤모글로빈을 발현하도록 유도하여, 상기 재조합 헤모글로빈을 생산하는 단계, 를 포함하는 상기 재조합 헤모글로빈을 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명의 상기 제 4 양태의 제 1 실시예에서, 상기 디-알파 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 베타 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 서열 번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 상기 제 4 양태의 제 2 실시예에서, 상기 디-알파 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 베타 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 서열 번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 상기 제 4 양태의 제 3 실시예에서, 상기 숙주 세포는 lambda DE3 를 포함하는 JM109 E. coli 박테리아 균주, lambda DE3 를 포함하지 않는 BL21-AI E. coli 박테리아 균주, 및 lambda DE3 를 포함하지 않는 SHuffle E. coli 박테리아 균주로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 상기 제 4 양태의 제 4 실시예에서, 상기 숙주 세포는 HemH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
본 발명의 상기 제 4 양태의 제 5 실시예에서, 상기 숙주 세포는 Heme-수송체(transporter)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
본 발명의 상기 제 4 양태의 제 6 실시예에서, 상기 재조합 헤모글로빈을 생산하는 방법은 (a) 상기 숙주세포의 재조합 헤모글로빈 발현을 유도하는 단계 후에 상기 숙주세포를 파쇄하여 재조합 헤모글로빈을 포함하는 용액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 재조합 헤모글로빈을 정제하여 정제된 재조합 헤모글로빈을 수득하는 단계, 를 포함하는 방법이다.
본 발명의 제 5 양태에서, 상기 재조합 헤모글로빈 생산 시스템에 있어서, 상기 시스템은 대장균(E. coli) 또는 비-대장균(non-E. coli) 숙주 세포를 포함하는 것으로서:
HemH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
헴(heme)-수송체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
여기서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 과 98.93% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열(여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치와 143 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌이어야 하고, 및 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치의 아미노산은 글루타민이어야 하며)을 포함하며; 및 상기 베타 사슬은 서열 번호 2 와 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열 (여기서, 1 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 함) 또는 서열 번호 3 과 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열 (여기서, 1 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 82 번 위치의 아미노산은 아스파르트산이어야 하며, 및 108 번 위치의 아미노산은 라이신이어야 함)을 포함하는 것인, 시스템이 제공된다.
당업자는 본원에 기재된 개시내용이 구체적으로 기재된 것 이외의 변형 및 변경이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것으로 생각된다.
본 개시내용의 다른 양태 및 이점은 이하 기재의 검토로부터 당업자에게 명백할 것으로 생각된다.
도 1 은 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 디-알파 사슬에 대한 폴리펩티드 서열들인 서열 번호 1 과 서열 번호 11; 및 베타 사슬에 대한 폴리펩티드 서열들인 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 12 를 보여 준다.
도 2a 는 플라스미스 맵을 보여주며, 여기서 pACYCDuet-CT는 ChuA 유전자와 TonB 를 발현하는 유전자를 운반하는 벡터를, pET-HemHm1-TB는 HemH 돌연변이와 TB를 발현하기 위한 서열을 갖는 일반적인 플라스미드로서, 여기서 TB는 TBN, TBM1 또는 TBM9 를 발현하는 서열일 수 있다.
도 2b 는 도 2a의 플라스미드에 의한 상이한 세포주에서의 TBN, TBM1 및 TBM9 발현의 SDS-PAGE 분석을 보여주며, 여기서 #83 은 lambda DE3가 없는 SHuffle E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM1 에 대한 결과이고, #84는 lambda DE3가 없는 SHuffle E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM9 에 대한 결과이고, #85 는 lambda DE3가 없는 JM109 T7CT CRISPR/Cas9 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM1 에 대한 결과이고, #86 은 lambda DE3가 없는 JM109 T7CT CRISPR/Cas9 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM9 에 대한 결과이고, #43 은 lambda DE3 를 포함하는 JM109 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBN에 대한 결과이다.
도 2c 는 도 2a의 플라스미드에 의한 상이한 세포주에서의 TBN, TBM1 및 TBM9 발현의 SDS-PAGE 분석을 보여주며, 여기서 #83 은 lambda DE3가 없는 SHuffle E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM1 에 대한 결과이고, #84 는 lambda DE3가 없는 SHuffle E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM9 에 대한 결과이고, #85 는 lambda DE3가 없는 JM109 T7CT CRISPR/Cas9 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM1 에 대한 결과이고, #86 은 lambda DE3가 없는 JM109 T7CT CRISPR/Cas9 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM9 에 대한 결과이고, #43 은 lambda DE3 를 포함하는 JM109 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBN에 대한 결과이다.
도 3a 는 마우스 모델에서 간 산소 수준 측정의 예시를 보여준다.
도 3b 는 TBN, TBM1, TBM9, YQ(소의 푸마릴 가교 헤모글로빈; bovine fumaryl crosslinked Hb) 및 RA-버퍼(대조군)의 투여 후 180 분에 걸친 마우스 모델의 간 산소 수치의 변화를 보여준다.
도 4a 는 TBN의 염기서열을 포함하는 이전의 플라스미드를 사용하여 발현된 정제된 단백질의 heme 및 PPIX 수치를 나타내는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 크로마토그램을 보여준다 (도 4a).
도 4b 는 HemH 돌연변이체, Heme 트랜스포터 시스템(ChuA 및 TonB) 및 TBN의 염기서열을 포함하는, 신규 개량된 플라스미드를 사용하여 발현된 정제된 단백질의 heme 및 PPIX 수치를 나타내는 UPLC 크로마토그램을 보여준다 (도 4b).
도 5a 는 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 상이한 재조합 인간 헤모글로빈(TBN, TBM1, 및 TBM9)에 대한 산소 평형 곡선을 보여준다.
도 5b 는 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 2,3-DPG가 있거나 없는 상이한 재조합 인간 헤모글로빈(TBN, TBM1, 및 TBM9)의 p50 값의 표를 보여준다.
도 5c 는 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 2,3-DPG가 있거나 없는 TBM1 의 산소 평형 곡선을 보여준다.
도 6 은 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 정제 흐름도를 보여준다.
도 7 은 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 HemH 돌연변이체 폴리뉴클레오티드의 서열 번호 8(상단) 및 HemH 돌연변이체 단백질의 서열 번호 13(하단)을 보여준다.
도 8 은 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 ChuA 폴리뉴클레오티드의 서열 번호 9(상단) 및 ChuA 단백질의 서열 번호 14(하단)를 보여준다.
도 9 는 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 TonB 폴리뉴클레오티드의 서열 번호 10(상단) 및 TonB 단백질의 서열 번호 15(하단)를 보여준다.
도 10 은 TBN, TBM1 및 TBM9 의 아지드-유도 산화율(kaz) 값을 나타내는 그래프(상단) 및 표(하단)를 보여준다.
도 11 은 시험관 내(in vitro)에서 4T1 유방암 세포의 증식을 억제하는 재조합 인간 헤모글로빈 TBM1 및 TBM9 에 대한 MTT 분석 결과를 보여준다.
도 12a 는 생체 내(in vivo)에서 4T1 유방암 세포의 성장을 억제하는 재조합 인간 헤모글로빈(TBM1)을 보여준다.
도 12b는 생체 내(in vivo)에서 4T1 유방암 세포의 성장을 억제하는 재조합 인간 헤모글로빈(TBM1)을 보여주는 막대 그래프를 보여준다.
도 13 은 식염수 및 재조합 인간 헤모글로빈(TBM1)을 사용한 뮤린(murine) PAD 모델의 결과를 보여준다.
도 14 는 Balb/c 및 ICR 마우스에서 재조합 인간 헤모글로빈(TBM1) 처리 후 체중 결과를 보여준다.
도 2a 는 플라스미스 맵을 보여주며, 여기서 pACYCDuet-CT는 ChuA 유전자와 TonB 를 발현하는 유전자를 운반하는 벡터를, pET-HemHm1-TB는 HemH 돌연변이와 TB를 발현하기 위한 서열을 갖는 일반적인 플라스미드로서, 여기서 TB는 TBN, TBM1 또는 TBM9 를 발현하는 서열일 수 있다.
도 2b 는 도 2a의 플라스미드에 의한 상이한 세포주에서의 TBN, TBM1 및 TBM9 발현의 SDS-PAGE 분석을 보여주며, 여기서 #83 은 lambda DE3가 없는 SHuffle E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM1 에 대한 결과이고, #84는 lambda DE3가 없는 SHuffle E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM9 에 대한 결과이고, #85 는 lambda DE3가 없는 JM109 T7CT CRISPR/Cas9 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM1 에 대한 결과이고, #86 은 lambda DE3가 없는 JM109 T7CT CRISPR/Cas9 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM9 에 대한 결과이고, #43 은 lambda DE3 를 포함하는 JM109 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBN에 대한 결과이다.
도 2c 는 도 2a의 플라스미드에 의한 상이한 세포주에서의 TBN, TBM1 및 TBM9 발현의 SDS-PAGE 분석을 보여주며, 여기서 #83 은 lambda DE3가 없는 SHuffle E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM1 에 대한 결과이고, #84 는 lambda DE3가 없는 SHuffle E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM9 에 대한 결과이고, #85 는 lambda DE3가 없는 JM109 T7CT CRISPR/Cas9 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM1 에 대한 결과이고, #86 은 lambda DE3가 없는 JM109 T7CT CRISPR/Cas9 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBM9 에 대한 결과이고, #43 은 lambda DE3 를 포함하는 JM109 E. coli 박테리아 균주에서 발현된 TBN에 대한 결과이다.
도 3a 는 마우스 모델에서 간 산소 수준 측정의 예시를 보여준다.
도 3b 는 TBN, TBM1, TBM9, YQ(소의 푸마릴 가교 헤모글로빈; bovine fumaryl crosslinked Hb) 및 RA-버퍼(대조군)의 투여 후 180 분에 걸친 마우스 모델의 간 산소 수치의 변화를 보여준다.
도 4a 는 TBN의 염기서열을 포함하는 이전의 플라스미드를 사용하여 발현된 정제된 단백질의 heme 및 PPIX 수치를 나타내는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 크로마토그램을 보여준다 (도 4a).
도 4b 는 HemH 돌연변이체, Heme 트랜스포터 시스템(ChuA 및 TonB) 및 TBN의 염기서열을 포함하는, 신규 개량된 플라스미드를 사용하여 발현된 정제된 단백질의 heme 및 PPIX 수치를 나타내는 UPLC 크로마토그램을 보여준다 (도 4b).
도 5a 는 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 상이한 재조합 인간 헤모글로빈(TBN, TBM1, 및 TBM9)에 대한 산소 평형 곡선을 보여준다.
도 5b 는 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 2,3-DPG가 있거나 없는 상이한 재조합 인간 헤모글로빈(TBN, TBM1, 및 TBM9)의 p50 값의 표를 보여준다.
도 5c 는 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 2,3-DPG가 있거나 없는 TBM1 의 산소 평형 곡선을 보여준다.
도 6 은 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 정제 흐름도를 보여준다.
도 7 은 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 HemH 돌연변이체 폴리뉴클레오티드의 서열 번호 8(상단) 및 HemH 돌연변이체 단백질의 서열 번호 13(하단)을 보여준다.
도 8 은 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 ChuA 폴리뉴클레오티드의 서열 번호 9(상단) 및 ChuA 단백질의 서열 번호 14(하단)를 보여준다.
도 9 는 본원에 기재된 특정 실시예에 따른 TonB 폴리뉴클레오티드의 서열 번호 10(상단) 및 TonB 단백질의 서열 번호 15(하단)를 보여준다.
도 10 은 TBN, TBM1 및 TBM9 의 아지드-유도 산화율(kaz) 값을 나타내는 그래프(상단) 및 표(하단)를 보여준다.
도 11 은 시험관 내(in vitro)에서 4T1 유방암 세포의 증식을 억제하는 재조합 인간 헤모글로빈 TBM1 및 TBM9 에 대한 MTT 분석 결과를 보여준다.
도 12a 는 생체 내(in vivo)에서 4T1 유방암 세포의 성장을 억제하는 재조합 인간 헤모글로빈(TBM1)을 보여준다.
도 12b는 생체 내(in vivo)에서 4T1 유방암 세포의 성장을 억제하는 재조합 인간 헤모글로빈(TBM1)을 보여주는 막대 그래프를 보여준다.
도 13 은 식염수 및 재조합 인간 헤모글로빈(TBM1)을 사용한 뮤린(murine) PAD 모델의 결과를 보여준다.
도 14 는 Balb/c 및 ICR 마우스에서 재조합 인간 헤모글로빈(TBM1) 처리 후 체중 결과를 보여준다.
본 발명은 산소운반능력을 갖는 재조합 헤모글로빈에 관한 것이다. 본원에 기재된 상기 재조합 헤모글로빈은 디-알파 사슬과 2 개의 베타 사슬을 포함한다.
용어 정의
본원에서 사용된 용어들의 정의는 생명공학 분야에서 각 용어에 대해 인정되는 최신 정의들을 통합하는 것을 의미하며, 적절한 경우 예시가 제공된다. 상기 정의는 특정 사례에서 개별적으로 또는 더 큰 그룹의 일부로서 별도로 제한되지 않는 한 본 명세서 전체에서 사용되는 용어들에 적용된다.
본원에서 사용된 용어 "재조합(recombinant) 헤모글로빈(들)"은 약 65kDa 이상의 분자 크기를 갖는 헤모글로빈 분자 및/또는 이의 변이체를 나타내며, 임의의 동물이나 인간에서 분리되거나 정제되지 않고 표준 분자 생물학 기술에 의해 합성된다.
본원에서 사용된 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 2 개 이상의 아미노산 단량체 및/또는 이의 유사체로 구성된 유기 고분자를 나타낸다. 상기 용어 "폴리펩티드"는 전장(full length)의 단백질 및 펩티드뿐 아니라 이의 유사체(analog) 및 단편을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 고분자를 포함한다. 3 개 이상의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드는 올리고펩티드로도 불리운다. 본원에 사용된 용어 "아미노산", "아미노산 단량체" 또는 "아미노산 잔기"는 비천연 측쇄를 가지고 D 및 L 광학 이성질체를 모두 포함하는 합성 아미노산을 포함하는 20 개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 것을 지칭한다. 상호교환적으로 사용되는 용어 "아미노산 유사체" 및 "유사체"는 하나 이상의 개별 원자가 다른 원자, 동위 원소 또는 다른 작용기와 대체된 아미노산을 의미하지만, 이 외에는 천연 아미노산 유사체와 동일하고 천연 아미노산 유사체와 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "변이체(variant)"는 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하지만, 이의 필수적 특성들은 유지한다. 일반적으로 변이체는 전반적으로 매우 유사하며 많은 영역에서 상기 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하다.
변이체는 예를 들어, 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모(parent) 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적 또는 추가적으로, 상기 변이체는 적어도 하나의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 모 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우, 비-보존적 아미노산 치환이 기능적 변이체의 생물학적 활성을 방해하거나 저해하지 않는 것이 바람직하다. 비-보존적 아미노산 치환은 상기 변이체의 생물학적 활성을 향상시켜 상기 변이체의 생물학적 활성이 모 폴리펩티드와 비교하여 증가될 수 있다.
본 명세서에서 "아미노산 변형(modification)"이라는 용어는 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실 등을 지칭한다. 상기 기재된 폴리펩티드의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 특정 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 하나의 아미노산이 동일하거나 유사한 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 교환되는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 하나의 산성/음전하 극성 아미노산을 다른 산성/음전하 극성 아미노산(예: Asp 또는 Glu)으로 치환, 비극성 측쇄를 갖는 하나의 아미노산을 비극성 측쇄를 갖는 다른 아미노산(예: Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val 등)으로 치환, 하나의 염기성/양전하 극성 아미노산을 다른 염기성/양전하 극성 아미노산(예: Lys, His, Arg 등)으로 치환, 극성 측쇄를 갖는 하나의 비하전 아미노산을 극성 측쇄를 갖는 다른 비하전 아미노산(예: Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr 등)으로 치환, 베타 분지 측쇄를 갖는 하나의 아미노산을 베타 분지 측쇄를 갖는 다른 아미노산(예: Ile, Thr 및 Val)으로 치환, 방향족 측쇄가 있는 다른 아미노산(예: His, Phe, Trp 및 Tyr)이 방향족 측쇄를 갖는 하나의 아미노산을 방향족 측쇄를 갖는 다른 아미노산(예: His, Phe, Trp 및 Tyr), 등의 아미노산 치환을 포함한다
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드 변형(modification)"은 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 결실 등을 지칭한다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용될 때 용어 "백분율 서열 상동성(percentage sequence homology)"은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 간의 비교를 의미하며, 비교 창에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정된다. 여기서 상기 비교 창에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 상기 두 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 삽입(insertions) 또는 결실(deletions)(즉, 갭(gaps))을 포함할 수 있다. 상기 백분율은 상기 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 산출하기 위하여 일치하는 위치의 수를 결정 후 일치하는 위치의 수를 비교 창에서 더 긴 서열에 대한 총 위치 수로 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 상동성의 백분율을 산출한다. 상동성은 당업계에 공지된 임의의 다양한 서열 비교 알고리즘 및 프로그램을 이용하여 평가된다. 이러한 알고리즘 및 프로그램에는 TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA 및 CLUSTALW (Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680; Higgins et al. 1996, Methods Enzymol. 266:383-402; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3:266-272) 가 포함되지만, 이에 결코 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 장애 및/또는 이와 관련된 증상을 감소 또는 개선하는 것을 지칭한다. 비록 배제되지는 않지만, 장애 또는 상태(condition)를 치료하는 것은 그 장애, 병태 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하지는 않는다는 점을 이해하여야 한다. 특정 실시예에서, 치료는 장애 또는 상태(condition), 및/또는 이와 관련된 증상의 예방을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "뇌졸중"은 뇌로의 열악한 혈류가 세포 사멸을 초래하는 의학적 상태를 나타낸다. 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중과 출혈성 뇌졸중을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "출혈성 쇼크(hemorrhagic shock)"는 세포 기능에 필요한 산소 및 영양소의 부적절한 전달을 초래하는 감소된 조직 관류(tissue perfusion)의 상태를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "급성 고산병(acute mountain sickness)"은 낮은 수준의 산소 및 감소된 기압을 갖는 높은 고도에 노출될 때 발병하는 상태를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "허혈성 질환(ischemic disease)" 또는 "허혈성 질환 (ischemia)"은 하기와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 신체의 임의의 조직에 대한 감소된 산소화(oxygenation)를 특징으로 하는 질환 및/또는 상태를 지칭한다: 허혈성 심장 질환(ischemic heart disease), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 심장 허혈(cardiac ischemia), 뇌졸중(stroke), 재관류 손상(reperfusion injury), 창자 허혈(bowel ischemia), 장 허혈(intestinal ischemia), 말초 동맥 질환(peripheral artery disease), 임계 사지 허혈(critical limb ischemia), 장간막허혈(mesenteric ischemia), 뇌허혈(brain ischemia), 다리허혈(leg ischemia), 심근경색(myocardial infarction), 말초혈관질환(peripheral vascular disease), 관상동맥질환(coronary artery disease), 협심증(angina), 상처치유(wound healing), 신동맥질환(renal artery disease), 당뇨병성 궤양치유(diabetic ulcer healing), 울혈성심부전(congestive heart failure), 및 간허혈(hepatic ischemia). 허혈은 빈혈, 뇌졸중 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 포함하는 여러 상태(conditions)에 의해 초래될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 다수의 질병, 예를 들어, 뇌혈관 허혈(cerebrovascular ischemia), 신장 허혈(renal ischemia), 폐 허혈(pulmonary ischemia), 사지 허혈(limb ischemia), 심근 허혈(myocardial ischemia) 및 허혈성 심근병증(ischemic cardiomyopathy)이 허혈로부터 발생한다.
본원에 사용된 용어 "말초 동맥 질환(peripheral artery disease)" 또는 "PAD"는 다리, 위, 팔 및/또는 머리에 작용하는(serving) 것과 같은 말초 동맥(peripheral arteries)이 좁아지는 상태를 지칭한다.
본원의 "p50 값(p50 value)"이라는 용어는 헤모글로빈이 50% 포화된 산소 장력(oxygen tension)을 나타낸다. p50의 값은 기질 친화도(substrate affinity)와 음의 상관관계가 있다; 낮은 값은 높은 친화도에 해당하고 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본원에 사용된 용어 "산소운반능력(oxygen carrying capacity)"은 조성물의 산소 운반 능력을 나타낸다. 상기 산소 운반하는 능력은 두 가지 측면을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 과도한 혈액 손실(예: 출혈성 쇼크)로 인한 조직의 저산소증(hypoxia)의 경우에는 산소 친화도가 낮은 재조합 헤모글로빈을 함유하는 조성물을 사용한다. 보다 낮은 산소 친화도는 상기 물질이 보다 높은 산소 친화도를 가진 물질보다 더 쉽게 목표물에 산소를 "전달할(offload)" 수 있음을 지칭한다. 보다 높은 산소 친화도를 갖는 조성물은 상기 경우에 보다 느린 산소 전달 속도가 요구되는 암 치료에서 산소화 보조 요법(oxygenation adjunct therapies)으로서 유용하다. "개선된 산소운반능력"이란 신속한 산소화 또는 낮은 산소 전달에 관계없이 조성물에 의해 운반되는 산소 수준이 증가함을 지칭한다.
용어 "공동-형질전환하다(co-transform)", "공동-형질전환하는 것(co-transforming)", "공동-형질전환된(co-transformed)" 등은 외인성 DNA를 포함하는 하나 이상의 플라스미드 또는 벡터를 동시에 숙주 세포로 전달하는 과정을 지칭한다. 상기 숙주 세포는 일반적으로 박테리아, 효모, 곤충, 포유동물 및 식물 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 외인성 DNA를 보유하는 플라스미드 또는 벡터를 수용하기 위한 임의의 기타 합리적인 숙주 세포 역시 본 발명의 범위 내에 있다. DNA 작제물(construct)을 숙주 세포로 형질전환하는 방법은 화학적 형질전환, 전기천공 또는 유전자총법(particle bombardment)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. DNA 작제물을 숙주 세포로 형질전환하기 위한 기타 합리적인 방법 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에 사용된 용어 "플라스미드", "발현 플라스미드", "벡터", "DNA 작제물" 등은 프로모터 세그먼트, 제한효소 부위(restriction site), 5′프라이머 부위, 3′프라이머 부위, 복제 기점(origin of replication) 세그먼트, 항생제 내성 유전자 세그먼트, 선택 가능한 마커 세그먼트 등과 같은 기타 기능적 DNA 세그먼트 및/또는 부위뿐 아니라, 관심 있는 하나 이상의 외인성 DNA 서열을 운반하는 유전적 구조를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 유전적 구조는 항상 그런 것은 아니지만 일반적으로 염색체 DNA에서 물리적으로 분리되고 독립적으로 복제할 수 있는 원형 DNA 분자들이다. 본원에 사용된 용어 "외인성(exogenous) DNA", "목표로 하는 외인성 DNA 서열" 등은 숙주 세포 외부로부터 기원하는 데옥시리보핵산을 지칭하고, 특정 관심 단백질 또는 이의 서브유닛을 코딩하는 유전자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "재조합 헤모글로빈 발현 플라스미드"는 하나의 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 플라스미드, 하나 또는 두 개의 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 플라스미드, 또는 디-알파 사슬과 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 플라스미드를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "HemH"는 헴(heme)의 생성을 촉매하는 철결합효소(ferrochelatase)와 같은 임의의 효소를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "헴-수송체(Heme-transporter)"는 헴(heme) 및/또는 철의 흡수를 촉진하는 단백질을 지칭하며, 이러한 단백질로서 ChuA, TonB, 헴 운반체 단백질 1(heme carrier protein 1; HCP1), 2가 금속 수송체 1(DMT1), 뮤코리핀-1(mucolipin-1; TRPML1 이라고도 함), HRG1 및 헤모펙신(hemopexin)을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "HemH 플라스미드"는 헴(heme)의 생성을 촉매하는 임의의 효소, 예컨대 철결합효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 플라스미드를 지칭하고, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 변형을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "헴-수송체 플라스미드(들)(Heme-transporter plasmid(s))"는 헴(heme) 및/또는 철의 흡수를 촉진하는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 하나 이상의 플라스미드를 지칭하며, 이러한 단백질로서 ChuA, TonB, 헴 운반체 단백질 1(heme carrier protein 1; HCP1), 2가 금속 수송체 1(DMT1), 뮤코리핀-1(mucolipin-1; TRPML1 이라고도 함), HRG1 및 헤모펙신(hemopexin)을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다.
상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 과 적어도 98.93%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 98.93% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 1 에 대해 최대 3 개의 아미노산 변형, 즉 0, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 변형을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 과 적어도 99.29%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 99.29% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 최대 2 개의 아미노산 변형, 즉, 서열 번호 1 에 대해 0 개, 1 개 또는 2 개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 과 99.64% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 99.64% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 최대 1 개의 아미노산 변형, 즉 서열 번호 1 에 대해 0 개 또는 1 개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 의 폴리펩티드 서열로 이루어진다. 상기 1 개, 2 개, 또는 3 개의 아미노산 변형은, 서열 번호 1 의 1 번, 29 번, 58 번, 143 번, 171 번 및 200 번 위치를 제외하고, 서열 번호 1 에 존재하는 임의의 아미노산에서 발생할 수 있으며, 여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치와 143 번 위치는 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치는 페닐알라닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치는 글루타민이어야 한다.
상기 디-알파 사슬의 폴리펩티드 서열은 제 1 알파 서브유닛의 N-말단을 제 2 알파 서브유닛의 C-말단과 연결하는 링커를 포함하거나, 또는 제 1 알파 서브유닛의 N-말단이 제 2 알파 서브유닛의 C-말단과 직접 연결된다. 링커가 상기 디-알파 사슬에 존재하는 경우, 상기 링커는 글리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 링커는 Gly-Ser)n, (Gly-Gly-Gly-Ser)n, (Gly-Gly-Ser-Gly)n, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, (Gly-Gly-Ser)n, (Gly-Ser)n 또는 Glyn 이고, 여기서 n 은 1 내지 10 이다. 특정 실시예에서, 상기 링커는 Glyn 링커이고, 여기서 n 은 1 내지 4 이다. 특정 실시예에서, 상기 링커는 Gly 이다.
상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 2 와 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 2 에 대하여 최대 3 개의 아미노산 변형, 즉, 0 개, 1 개, 2 개 또는 3 개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 2 와 98.63% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 98.63% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 2 에 대하여 최대 2 개의 아미노산 변형, 즉, 0 개, 1 개 또는 2 개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 2 와 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 2 에 대하여 최대 1 개의 아미노산 변형, 즉 0 개 또는 1 개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 2 의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 1 개, 2 개, 또는 3 개의 아미노산 변형은, 메티오닌이어야 하는 서열 번호 2 의 1 번 위치를 제외하고, 서열 번호 2 에 존재하는 임의의 아미노산에서 발생할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 3 과 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 3 에 대하여 최대 3 개의 아미노산 변형 즉, 0 개, 1 개, 2 개 또는 3 개의 아미노산 변형을 갖는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 3 과 98.63% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 98.63% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 3 에 대하여 최대 2 개의 아미노산 변형, 즉, 0 개, 1 개 또는 2 개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 3 과 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 3 에 대하여 최대 1 개의 아미노산 변형, 즉 0 개 또는 1 개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 3의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 상기 1 개, 2 개, 또는 3 개의 아미노산 변형은, 메티오닌이어야 하는 서열 번호 3의 1 번, 82 번, 및 108 번 위치를 제외하고, 서열 번호 3 에 존재하는 임의의 아미노산에서 발생할 수 있으며, 여기서, 서열 번호 3의 1 번 위치는 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 3의 82 번 위치는 아스파르트산이어야 하며, 및 서열 번호 3의 108 번 위치는 라이신이어야 한다.
서열 번호 11 의 폴리펩티드 서열을 갖는 디-알파 사슬과 서열 번호 12 의 폴리펩티드 서열을 갖는 2 개의 베타 사슬이 재조합 헤모글로빈 TBN을 형성한다. 서열 번호 1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 디-알파쇄와 서열 번호 2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 2 개의 베타 사슬이 2 개가 재조합 헤모글로빈 TBM1을 형성한다. 서열 번호 1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 디-알파 사슬과 서열 번호 3의 폴리펩티드 서열을 갖는 2 개의 베타 사슬이 재조합 헤모글로빈 TBM9 를 형성한다.
동일한 조건에서 제조된 TBN, TBM1 및 TBM9 의 PPIX 농도는 표 1 에 표시된 바와 같다. p50 값, 사량체의 순도, met-헤모글로빈(Met-Hb)% 및 헴(heme)/단백질 비율은 표 2 에 나타낸 바와 같다. 본원에서 설명하는 재조합 헤모글로빈을 제조하는 방법은 간단하고 비용 효율적이다. 이론에 구속됨 없이 디-알파 사슬과 베타 사슬의 돌연변이로 인해서 상기 재조합 헤모글로빈의 구조적 변화가 일어나는 것으로 추정되며, 헴(heme)과 PPIX의 통합의 역동학에 영향을 미치고, 궁극적으로 정제된 재조합 헤모글로빈에서 PPIX의 비율(%)을 변화시킨다.
표 1. 다양한 정제된 재조합 헤모글로빈의 PPIX%
표 2. 정제된 재조합 헤모글로빈의 특성
본 발명은 또한 본원에 기재된 헤모글로빈을 발현, 발효 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 숙주 세포에서 본원에 기재된 재조합 헤모글로빈을 코딩하는 플라스미드, 철결합효소(ferrochelatase; HemH) 플라스미드, 및 헴-수송체 플라스미드를 공동 발현시키는 것을 포함한다. 표 3 에 기재된 다양한 숙주 세포들을 시험하였으며, 이들 숙주 세포 중 JM109(DE3)(lambda DE3 보유)(즉, DE3 를 보유하는 JM109 lambda E. coli 박테리아 균주), BL21-T7 또는 AI E. coli 박테리아 균주(lambda DE3 를 보유하지 않음) 및 SHuffle® T7 컴피턴트(Competent) E. coli(lambda DE3 를 보유하지 않음)(즉, lambda DE3 를 보유하지 않은 SHuffle E. coli 박테리아 균주)는 최고의 수율과 품질을 보유한다. 이들 4 개의 숙주 세포는 규모의 조절이 용이하고(easily scalable), 그 내부에서 형질전환된 플라스미드를 신속히 발현할 수 있고, 매우 저렴하고, 간단한 배양 조건을 필요로 하고, 확립된 레귤러토리 트랙 레코드(regulatory track record)를 보유한다. HemH 플라스미드는 야생형이거나 특정 돌연변이를 포함할 수 있다. 헴-수송체 플라스미드는 E. coli 헴-활용(heme-utilization) 유전자(ChuA)를 벡터에 삽입함으로써 구축할 수 있다. 상기 ChuA 유전자는 E. coli에서 헴의 흡수(uptake)를 촉진하는 69 kDa 외막 단백질을 코딩한다. 상기 ChuA에 의한 헴의 흡수(uptake)는 TonB 라는 내막 단백질에 의존한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 바람직하게는 재조합 헤모글로빈 플라스미드, HemH 플라스미드, ChuA 플라스미드 및 TonB 플라스미드를 상기 선택된 숙주 세포들(즉, lambda DE3 를 보유하지 않는 JM109 E. coli 박테리아 균주, BL21-T7 또는 lambda DE3 를 보유하지 않는 AI E. coli 박테리아 균주 및 lambda DE3 를 보유하지 않는 SHuffle E. coli 박테리아 균주)로 공동 형질전환시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 상기 방법들은 또한 ChuA 플라스미드 단독으로 또는 재조합 헤모글로빈 플라스미드 및 HemH 플라스미드와 함께 상기 선택된 숙주 세포들로 공동-형질전환시킬 수 있다.
상기 철결합효소(HemH) 및 헴-수송체를 코딩하는 유전자는 또한 CRISPR/Cas9 게놈 편집 방법(editing method)에 의해 E. coli 박테리아 균주의 게놈에 삽입되어 철결합효소 철결합효소(HemH) 및 헴-수송체를 내생적으로(endogenously) 발현할 수 있다. 상기 방법에 의하여, BL21-T7 및 Jm109-T7 E. coli 박테리아 균주를 BL21-T7-CT(CRISPR/Cas9) 및 Jm109-T7-CT(CRISPR/Cas9) 균주로 변형시켜 재조합 헤모글로빈 단백질을 발현시켰다.
표 3. 다양한 숙주 세포들
상기 방법은 유리하게 가열 단계를 필요로 하지 않고 일산화탄소를 사용하지 않는 정제 단계를 추가로 포함한다. 정제 단계는 도 6 에 도시된 바와 같다. 본원에 기재된 방법으로 제조된 재조합 헤모글로빈은 프로토포르피린-IX(PPIX)의 양을 표 1 에 기재된 같이 감소된 양(예를 들어 1%(중량 기준) 미만)을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 재조합 헤모글로빈은 0.08% 내지 1%, 0.11% 내지 1%, 0.08% 내지 0.20%, 0.08% 내지 0.15%, 또는 0.08% 내지 0.11%(중량)의 PPIX 를 갖는다. 이와 같이, 본원에 기재된 방법들은 기존의 재조합 헤모글로빈 제조 방법들에 비해 간단하고, 불순물 수준이 감소된 가용성 재조합 헤모글로빈을 보다 높은 수율로 수득할 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 재조합 헤모글로빈 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 상기 약학적 조성물은 아미노산 및 당과 같은 기타 부형제를 포함한다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 과 98.93% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 디-알파 사슬을 코딩하며, 여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치의 아미노산과 143 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치의 아미노산은 글루타민이어야 한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 과 99.29% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 디-알파 사슬을 코딩하며, 여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치와 143 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치의 아미노산은 글루타민이어야 한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 과 99.64% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 디-알파 사슬을 코딩하며, 여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치의 아미노산과 143 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치의 아미노산은 글루타민이어야 한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 의 폴리펩티드 서열을 포함하는 디-알파 사슬을 코딩한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 의 폴리펩티드 서열로 구성된 디-알파 사슬을 코딩한다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2 와 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 베타 사슬을 코딩한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2 와 98.63% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 베타 사슬을 코딩한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2 와 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 베타 사슬을 코딩한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2 의 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 베타 사슬을 코딩한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2 의 폴리펩티드 서열로 구성된 폴리펩티드 서열을 포함하는 베타 사슬을 코딩한다.
특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3 과 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 베타 사슬을 코딩한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3 과 98.63% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 베타 사슬을 코딩한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3 과 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 베타 사슬을 코딩한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3의 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 베타 사슬을 코딩한다. 특정 실시예에서, 상기 산 변형(acid modifications)은 서열 번호 3의 3 번 위치, 82 번 위치, 108 번 위치를 제외한 서열 번호 3 에 존재하는 모든 아미노산에서 발생할 수 있으며, 여기서 서열 번호 3의 1 번 위치는 메티오닌이어야 하고, 82 번 위치는 아스파르트산이어야 하고, 108 번 위치는 라이신이어야 한다.
특정 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 바와 같은 디-알파 사슬 및 본원에 기재된 바와 같은 베타 사슬을 코딩한다. 특정 실시예에서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 과 98.93% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치와 143 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치의 아미노산은 글루타민이어야 하고; 상기 2 개의 베타 사슬은 서열 번호 2 와 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기서 1 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하거나; 또는 서열 번호 3 과 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기서 1 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 82 번 위치의 아미노산은 아스파르트산이어야 하고, 108 번 위치의 아미노산은 라이신이어야 한다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열들은 하나 이상의 벡터를 사용하여 원하는 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는 통상적으로 세포에서 벡터의 전파(propaganda)를 지휘하거나 벡터의 일부를 세포의 게놈으로 삽입하는 서열 및 개체에서 상기 벡터의 존재 여부를 스크리닝할 수 있도록 하는 유전자를 포함하는 추가 서열을 포함한다. 벡터의 일반적인 예로서, 세포의 게놈에 삽입하도록 설계된 플라스미드, 인공 염색체, 바이러스 및 선형 폴리뉴클레오티드 단편들을 들 수 있다. 벡터는 당업자에게 잘 알려진 도구이며, 당업자는 문헌이나 ATCC 와 같은 바이오뱅크에서 특정 유기체에 대한 적절한 벡터를 쉽게 찾을 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 기재된 바와 같은 디-알파 사슬 및 베타 사슬 중 적어도 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 본원에 개시된다. 특정 실시예에서, 상기 벡터는 세포의 게놈에 삽입하도록 설계된 플라스미드, 인공 염색체, 바이러스, 또는 선형 폴리뉴클레오티드 단편이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 재조합 헤모글로빈을 생산하기 위한 시스템에 관한 것으로서, 상기 시스템은 대장균(E. coli) 또는 비-대장균(non-E. coli) 숙주 세포를 포함하는 것으로서: HemH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 헴-수송체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서, 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 과 98.93% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열(여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치와 143 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌이어야 하고, 및 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치의 아미노산은 글루타민이어야 하며)을 포함하며; 및 상기 베타 사슬은 서열 번호 2 와 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열(여기서, 1 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 함) 또는 서열 번호 3 과 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열(여기서, 1 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 82 번 위치의 아미노산은 아스파르트산이어야 하며, 및 108 번 위치의 아미노산은 라이신이어야 함)을 포함하는 것인, 시스템이다. 특정 실시예에서, HemH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 헴-수송체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 세포의 게놈에 삽입하도록 설계된 플라스미드, 인공 염색체, 바이러스 및 선형 폴리뉴클레오티드 단편으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 벡터에 존재한다. 특정 실시예에서, 상기 HemH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 헴-수송체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CRISPR/CAS9 를 사용하여 숙주 세포의 게놈에 삽입된다. 특정 실시예에서, 상기 HemH 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 헴-수송체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 플라스미드로서 숙주 세포에 존재한다.
특정 실시예에서, 본원에 기재된 상기 재조합 헤모글로빈 생산 시스템은 대장균(E. coli) 또는 비-대장균(non-E. coli) 숙주 세포를 포함하는 것으로서: HemH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 디-알파 사슬, 및 2 개의 베타 사슬을 포함하는 제 1 플라스미드를 포함하며, 여기서 상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1 과 98.93% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열(여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치와 143 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌이어야 하고, 및 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치의 아미노산은 글루타민이어야 하며)을 포함하고; 및 상기 2 개의 베타 사슬은 서열 번호 2 와 99.31% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열(여기서, 1 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 함); 또는 서열 번호 3 과 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열(여기서, 1 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 82 번 위치의 아미노산은 아스파르트산이어야 하며, 및 108 번 위치의 아미노산은 라이신이어야 함)을 포함하며; 및 Heme-수송체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 플라스미드를 포함한다.
본원에 기재된 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 및 선택가능한 마커를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 벡터에는 임의의 프로모터를 사용할 수 있다. 적절한 프로모터의 선택은 당업자의 기술 영역 내에 있다. 프로모터의 예로서 lac, lac, trp, tac, trc, ara, araB, T5, T7, 및 T7lac 을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 는 않는다.
오퍼레이터로서 lac 오퍼레이터, λ 오퍼레이터, trp 오퍼레이터, gal 오퍼레이터, ara 오퍼레이터 및 Arg 오퍼레이터를 포함할 수 있다. 필요한 경우, 해당 프로모터는 이의 오퍼레이터와 기능적으로 연관될 수 있다.
선택 가능한 마커는 종종 특정 조건 하에 이를 포함하는 분자 또는 세포에 대해 또는 이의 선택을 허용하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 이들 마커는 RNA, 펩티드 또는 단백질의 생산과 같은 활성을 코딩할 수 있지만 이에 제한되지 않고, 또는 RNA, 펩티드, 단백질, 무기 및 유기 화합물 또는 조성물 등에 대한 결합 부위를 제공할 수 있다. 당업계의 임의의 선택가능한 마커를 본원에 기재된 발현 시스템 및 방법과 관련하여 사용할 수 있다. 선택 가능한 마커의 예로서 항생제와 같이 독성일 수도 있는 화합물에 대한 내성을 제공하는 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; tRNA 유전자 및 영양요구 마커(auxotrophic markers)와 같이 숙주 세포(recipient cell)에 결여되어 있는 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 유전자 생성물의 활성을 억제하는 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 쉽게 식별가능한 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(예: β-갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 세포 표면 단백질과 같은 표현형 마커들) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시예에서, 상기 선택 가능한 마커는 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), 에리쓰로마이신(erythromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 겐타마이신(gentamycin), 카스가마이신(kasugamycin), 리팜피신(rifampicin), 스펙티노마이신(spectinomycin), D-사이클로세린(D-cycloserine), 날리딕식산(nalidixic acid), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline) 등과 같은 항균제에 대한 내성을 부여하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 하기 단계들을 포함하는 재조합 헤모글로빈을 생산하는 방법에 관한 것이다: (a) 상기 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 2 개의 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 디-알파 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 2 개의 베타 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 숙주 세포가 재조합 헤모글로빈을 발현하도록 유도하여 상기 재조합 헤모글로빈을 생산하는 단계. 특정 실시예에서, 상기 HemH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 헴-수송체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 2 개의 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포의 게놈에 삽입하도록 설계된 플라스미드, 인공 염색체, 바이러스 및 선형 폴리뉴클레오티드 단편으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 벡터에 존재한다. 특정 실시예에서, 상기 HemH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 헴-수송체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 2 개의 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CRISPR/CAS 9 를 이용하여 숙주 세포의 게놈에 삽입된다. 특정 실시예에서, 상기 HemH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 헴-수송체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 2 개의 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 플라스미드로서 숙주 세포에 존재한다.
특정 실시예에서, 본원에 기재된 상기 재조합 헤모글로빈을 생산하는 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 상기 디-알파 사슬 및 상기 2 개의 베타 사슬을 코딩하는 하나 이상의 재조합 헤모글로빈 발현 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 디-알파 사슬 및 상기 2 개의 베타 사슬을 코딩하는 상기 하나 이상의 재조합 헤모글로빈 발현 플라스미드를 포함하는 숙주 세포가 재조합 헤모글로빈을 발현하도록 유도하여 상기 재조합 헤모글로빈을 생산하는 단계.
특정 실시예에서, 상기 디-알파 사슬 및 상기 2 개의 베타 사슬을 코딩하는 상기 하나 이상의 재조합 헤모글로빈 발현 플라스미드는 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 서열 번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 디-알파 사슬 및 상기 2 개의 베타 사슬을 코딩하는 상기 하나 이상의 재조합 헤모글로빈 발현 플라스미드는 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 서열 번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 숙주 세포는 lambda DE3 를 포함하는 JM109 E. coli 박테리아 균주, lambda DE3 를 포함하지 않는 BL21-AI E. coli 박테리아 균주, 및 lambda DE3 를 포함하지 않는 SHuffle E. coli 박테리아 균주로 이루어진 군에서 선택된다.
특정 실시예에서, 상기 숙주 세포는 HemH 를 코딩하는 플라스미드를 추가로 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 숙주 세포는 헴-수송체를 코딩하는 1 개 또는 2 개의 플라스미드를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 디-알파 사슬 및 본원에 기재된 바와 같은 2 개의 베타 사슬로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 본원에 기재된 적어도 하나의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 본원에 제공된다. 특정 실시예에서, 상기 적어도 하나의 벡터는 플라스미드이다. 특정 실시예에서, 상기 숙주 세포는 하나 이상의 플라스미드를 포함한다.
헴(heme)의 존재 상태에서 숙주세포 내부에서 디-알파 사슬 1 개와 베타사슬 2 개를 발현하여 재조합 헤모글로빈을 형성할 수 있다. 다양한 숙주 세포를 테스트하여 그 결과를 표 3 에 표시한다. 일부 실시예에서, 상기 숙주 세포는 최상의 수율을 갖는 lambda DE3 를 포함하는 JM109 E. coli 박테리아 균주, BL21-T7 또는 lambda DE3 를 포함하지 않는 AI E. coli 박테리아 균주, 또는 람다 lambda DE3 를 포함하지 않는 SHuffle E. coli 박테리아 균주이거나, 또는 최고의 품질과 조작의 용이성(easy manipulation)을 가지는 BL21-T7-CT(CRISPR/Cas9) 및 Jm109-T7-CT(CRISPR/Cas9)이다. 상기 디-알파 사슬과 베타 사슬들의 발현은 하나의 디-알파 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 플라스미드와 2 개의 베타 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 플라스미드를 함께 상기 숙주 세포로 공동-형질전환함으로써 실현될 수 있으며, 여기서 디-알파 폴리펩티드 사슬에 대한 플라스미드와 2 개의 베타 폴리펩티드 사슬에 대한 플라스미드의 비율은 대략 1:1 이다. 상기 디-알파 사슬과 베타 사슬들의 발현은 하나의 디-알파 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 플라스미드와 1 개의 베타 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 플라스미드를 함께 상기 숙주 세포로 공동-형질전환함으로써 실현될 수 있으며, 여기서 디-알파 폴리펩티드 사슬에 대한 플라스미드와 1 개의 베타 폴리펩티드 사슬에 대한 플라스미드의 비율은 대략 1:2 이다. 상기 디-알파 사슬 및 베타 사슬의 발현은 또한 하나의 디-알파 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 2 개의 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 모두를 보유하는 플라스미드를 상기 숙주 세포로 형질전환함으로써 실현될 수 있다.
특정 실시예에서, 본원에 기재된 상기 재조합 헤모글로빈 발현용 플라스미드는 서열 번호 1 과 98.93% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치와 143 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌이어야 하며, 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치의 아미노산은 글루타민이어야 하며)와 2 개의 베타 사슬(여기서, 각각은 서열 번호 2 와 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기서 서열 번호 2 의 1 번 위치는 메티오닌이어야 함)을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 재조합 헤모글로빈 발현용 플라스미드는 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열(TBM1 및 TBM9 에 대한 디-알파 사슬) 및 서열 번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열(TBM1 에 대한 베타 사슬)을 포함한다. 이들 플라스미드의 맵은 도 2a에 도시되어 있다. 특정 실시예에서, 상기 숙주 세포는 K12 균주(SHuffle® T7 Competent E. coli)이다. 특정 실시예에서, 상기 재조합 헤모글로빈 발현용 플라스미드는 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열(TBM1 및 TBM9 에 대한 디-알파 사슬) 및 서열 번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열(TBM1 에 대한 베타 사슬)을 포함하고, 상기 숙주 세포는 K12 균주(NEB#C3026)이다.
특정 실시예에서, 본원에 기재된 상기 재조합 헤모글로빈 발현용 플라스미드는 서열 번호 1 과 98.93% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 서열 번호 1 의 1 번 위치와 143 번 위치의 아미노산은 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 1 의 29 번 위치와 171 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌이어야 하며, 서열 번호 1 의 58 번 위치와 200 번 위치의 아미노산은 글루타민이어야 하며)와 2 개의 베타 사슬(여기서, 각각은 서열 번호 3 과 97.94% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하고, 여기서 서열 번호 3의 1 번 위치는 메티오닌이어야 하고, 서열 번호 3의 82 번 위치는 아스파르트산이어야 하며, 서열 번호 3의 200 번 위치는 라이신이어야 함)을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 재조합 헤모글로빈 발현용 플라스미드는 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열(TBM1 및 TBM9 에 대한 디-알파 사슬) 및 서열 번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열(TBM9 에 대한 베타 사슬)(도 2a에 도시된 플라스미드 맵)을 포함하고, 상기 숙주 세포는 K12 균주(SHuffle® T7 컴피턴트 E. coli)이다.
특정 실시예에서, 상기 디-알파 사슬, 베타 사슬 및/또는 이들의 조합을 발현하기 위한 플라스미드들은 헴(heme)의 생성을 촉매하는 철결합효소(ferrochelatase) 또는 임의의 기타 효소의 발현용 플라스미드와 공동-형질전환된다. 특정 실시예에서, 상기 철결합효소 또는 임의의 기타 효소의 발현용 플라스미드는 HemH 플라스미드로서, 여기서 상기 HemH 플라스미드는 임의의 HemH 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 HemH 플라스미드는 서열 번호 7(야생형) 또는 서열 번호 8(돌연변이)의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지고 있다
특정 실시예에서, 헤민(hemin)은 디-알파 사슬, 베타 사슬 및/또는 이들의 조합을 발현하는 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포를 포함하는 용액에 첨가된다.
특정 실시예에서, 헴-수송체 발현용 플라스미드도 재조합 헤모글로빈 발현용 플라스미드 및/또는 헴 생산 효소 발현용 플라스미드와 함께 동시 형질전환된다. 상기 헴-수송체는 ChuA 유전자에 의해 코딩된 69 kDa 외막 단백질 및 (ChuA에 의한 헴의 흡수가 의존되는) TonB로 명명된 내막 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 헴의 흡수(uptake)를 촉진할 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 헴 운반체 단백질 1(heme carrier protein 1; HCP1), 2가 금속 운반체 1(divalent metal transporter 1; DMT1), 뮤코리핀-1(mucolipin-1; TRPML1로도 알려짐), HRG1, 헤모펙신(hemopexin) 등과 같은 임의의 기타 헴 및/또는 철 수송체(iron transporters)도 본 발명의 고려 대상이다.
특정 실시예에서, 상기 헴-수송체 플라스미드는 서열 번호 9와 98%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. ChuA 의 DNA 서열은 도 8에 도시되어 있다. 특정 실시예에서, 상기 헴-수송체 플라스미드는 서열 번호 9와 99%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 헴-수송체 플라스미드는 서열 번호 9 의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 헴-수송체 플라스미드는 서열 번호 10 과 98%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. TonB을 코딩하는 DNA 서열은 도 9 에 도시되어 있다. 특정 실시예에서, 상기 헴-수송체 플라스미드는 서열 번호 10 과 99%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 헴-수송체 플라스미드는 서열 번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시예에서, ChuA를 보유하는 헴-수송체 플라스미드만이 디-알파 사슬, 베타 사슬 및/또는 이들의 조합을 발현하기 위한 플라스미드들과 함께 공동-형질전환된다. 특정 실시예에서, 상기 ChuA를 보유하는 헴-수송체 플라스미드만이 디-알파 사슬, 베타 사슬 및/또는 이들의 조합을 발현하기 위한 플라스미드들 및 및 헴 생산 효소 발현용 플라스미드와 함께 공동-형질전환된다. 특정 실시예에서, 상기 ChuA 유전자를 포함하는 플라스미드 및 TonB 발현용 플라스미드는 모두 디-알파 사슬, 베타 사슬 및/또는 이들의 조합을 발현하기 위한 플라스미드들과 공동-형질전환된다. 특정 실시예에서, 상기 ChuA 유전자를 포함하는 플라스미드 및 TonB 발현용 플라스미드는 모두 디-알파 사슬, 베타 사슬 및/또는 이들의 조합을 발현하기 위한 플라스미드, 및 헴 생산 효소 발현용 플라스미드와 함께 공동-형질전환된다.
일부 실시예에서, 다양한 단백질 발현 시스템을 테스트하였으며(표 4 에 도시), 클론 번호 12 및 19 를 위한 단백질 발현 시스템은 재조합 헤모글로빈에 대한 최상의 수율 및 품질을 보여준다. pETDuet-1 벡터는 2 개의 T7 프로모터를 가진다. 제 1 T7 프로모터는 T1 이고, 제 2 T7 프로모터는 T2 이다. 단백질은 pETDuet-1 벡터의 T1 또는 T2 의 제어 하에 발현될 수 있다. 유사하게, pRSFDuet-1 벡터는 2 개의 T7 프로모터를 가지고, 제 1 T7 프로모터는 R1 이고, 제 2 T7 프로모터는 R2 이다. 단백질은 pRSFDuet-1 벡터의 T1 또는 T2 의 제어 하에 발현될 수 있다.
표 4. 다양한 단백질 발현 시스템
발현 시스템을 위한 구성 요소는 (1) T7 프로모터/lac 오퍼레이터 및 (2) 개시 코돈 및 종료 코돈을 포함하는 단백질 발현을 위한 서열을 포함한다. 각각의 Duet 플라스미드는 2 개의 T7 프로모터/lac 오퍼레이터(T1 및 T2)를 가진다. 본원의 발명자들은 단백질 발현 수준을 테스트하기 위해 제 1 또는 제 2 T7 프로모터/lac 오퍼레이터의 제어 하에 다른 유전자들을 삽입하였다. 플라스미드의 항생제 내성과 레플리콘(replicon)은 표 4 에 도시하였다. 클론 번호 12 및 19는 재조합 헤모글로빈에 대하여 최상의 수율 및 품질을 나타낸다. 클론 12는 2 개의 플라스미드를 포함하고 있다. 제 1 플라스미드는 T1 하에서 디-알파 및 베타 사슬을 발현하고 T2 에서 HemH 를 발현하는 pETDuet-1(암피실린)이고; 제 2 플라스미드는 R2 하에서 ChuA 와 TonB 를 발현하는 pRSFDuet-1(카나마이신) 이다. 클론 19 는 2 개의 플라스미드를 포함하고 있다. 제 1 플라스미드는 T1 에서 디-알파 및 베타 사슬을 발현하고 T2 에서 HemH 를 발현하는 pETDuet-1-Kana(카나마이신)이고; 제 2 플라스미드는 A2 하에서 ChuA 및 TonB 를 발현하는 pACYCDuet-1(클로람페니콜) 이다.
상기 언급된 플라스미드들 중 하나 이상을 함유하는 숙주 세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 인큐베이션 및 발효될 수 있다. 박테리아 세포에 의해 생성된 상기 재조합 헤모글로빈은, 가열 단계를 필요로 하지 않고 일산화탄소의 사용을 필요로 하지 않는 단순화된 절차를 사용하여 정제될 수 있다(도 6). 상기 재조합 헤모글로빈은 본원에 기재된 정제 절차를 사용하여 정제될 수 있고, HbCO를 거의 함유하지 않거나 전혀 함유하지 않고 PPIX의 양이 적은 (예를 들어 1% 미만을 갖는) 정제된 헤모글로빈을 생성할 수 있다. UPLC 결과는 헴(heme) : 단백질 비율이 TBM1 및 TBM9 에 대해 더 높고 TBM9 에 대해 가장 높다는 것을 보여준다 (표 2). 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 결과는 하기 표 5에 나타낸 바1와 같이 TBN, TBM1 및 TBM9 의 8량체: 4량체: 이량체 분포를 나타낸다.
표 5. 다양한 재조합 헤모글로빈용 HPLC 결과
본원에 기재된 상기 재조합 헤모글로빈을 정제하면, 도 4 및 표 1 및 2 에 도시된 바와 같이, 열처리 단계 없이도 고순도의 단백질 생성물을 얻을 수 있다. 이러한 예상치 못한 기술적 효과는 재조합 헤모글로빈을 제조하는 기존 방식의 문제점을 하나 이상 해결한다. 예를 들어, 본원에 기재된 상기 재조합 헤모글로빈의 정제 시 안정성에는 영향을 미치지 않으므로 열처리 시 재조합 헤모글로빈의 안정성을 유지하기 위해 CO가 필요하지 않을 것이다. 따라서, 원하지 않는 CO를 제거하기 위한 추가 단계가 요구되지 않는다. 이와 같이 본원에 기재된 재조합 헤모글로빈의 정제 공정은 열처리 및 CO 제거를 필요로 하지 않으므로 공정을 더 간단하고 저비용으로 산업적으로 적용가능하다.
상기 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 재조합 헤모글로빈을 180 분 동안 간의 산소 레벨(liver oxygen level)을 측정하기 위해 마우스 모델에 주입하였다(도 3). 실험 결과, 디-알파 사슬은 서열 번호 1, 2 개의 베타 사슬은 서열 번호 2 를 가지는, 재조합 헤모글로빈 TBM1을 투여 시, 버퍼를 투여하고 YQ(소 가교 헤모글로빈, 배치 번호 ER007)를 투여한 대조군과 (도 3b) 비교하여, 투여 30 분 후 간의 산소압(liver oxygen pressure)을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다. 180 분에 걸친 간의 산소압 측정은 간 산소압이 TBM9 투여 후 20 내지 30 분에 안정기(plateau)에 도달하고 TBM1 투여 후 약 70 분에 안정기에 도달함을 나타내며, 두 경우에 있어 모두 YQ, 버퍼 또는 TBN을 투여하여 도달한 안정기보다 더 높다(여기서, 도 1 에 도시된 바와 같이, 디-알파 사슬은 서열 번호 11 을, 2 개의 베타 사슬은 서열 번호 12 를 가짐). TBN, TBM1 및 TBM9 의 p50 값은 표 6 에 요약되어 있다.
표 6. TBN, TBM1, 및 TBM9 의 p50 값 및 내산화성(oxidation resistance)
상기 본원에 기재된 재조합 헤모글로빈은 약학적 허용가능한 담체를 하나 이상 포함하는 약학적 조성물로 제조할 수 있다. 약학적 허용가능한 담체는 활성 화합물과 같이 투여되는 희석제, 보조제(adjuvants), 부형제, 비히클(vehicles), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 비히클은 물 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것(예; 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등)을 포함하는 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 식염수와 0.3% 글리신을 사용할 수 있다. 특정 실시예에서, 이러한 비히클은 수크로오스 또는 트레할로스이다. 이들 용액은 살균된 것으로서 일반적으로 미립자 물질을 포함하지 않는다. 이들은 잘 알려진 통상적인 살균 기술(예: 여과)에 의해 살균될 수 있다. 이들 조성물은 pH 조절제 및 버퍼(완충제), 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건을 근사화하는(approximate) 데 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 물질(auxiliary substances)을 함유할 수 있다. 이러한 약학적 제형에서 단백질의 농도는 상당히 변동 폭이 클 수 있으며, 예를 들어 약 0.5% 미만으로, 대개 적어도 약 1 중량% 또는 1 중량% 내지 최대 15 또는 20 중량%으로, 주로 요구되는 용량, 유체 부피(fluid volumes), 점도 등에 기초하여 선택된 특정 투여 방식에 따라 선택하게 된다. 적합한 비히클 및 제형은 수크로오스, 트레할로스, 아미노산, 인산염 버퍼를 포함한다.
상기 본원에 기재된 재조합 헤모글로빈은 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo) 조직에 산소를 공급하는 제제(agent)로 사용할 수 있다. 이들 제제는 산소 결핍이 질병 및/또는 상태의 원인이거나 또는 산소 결핍이 질병 및/또는 상태의 치료 효능과 관련이 있는 임의의 질병 또는 상태의 치료에 유용하다. 이들 질병 또는 상태에는 암, 뇌졸중, 출혈성 쇼크, AMS, PAD, PD 및 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 폐기종(emphysema), 기관지염(bronchitis), 폐렴(pneumonia), 폐부종(pulmonary edema), 빈혈(anemia), 천식(asthma), 심장병(heart disease), 당뇨병(diabetes), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 간질(epilepsy) 및 발작(seizures), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD) 및 레이노병(Raynaud's disease) 이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. TBM1 및 TBM9 의 요구되는 투여량은 본원에 기재된 동물 연구에 의해 입증된 바와 같이 상당히 감소될 수 있다.
본 발명은 또한 예를 들어 본원에 기재된 재조합 헤모글로빈의 순도를 향상시킬 수 있는 발현 클론(expression clones)을 제공한다. 도 4 및 표 7 에 도시된 바와 같이, HemH 및 TBN, TBM1 또는 TBM9 의 염기서열을 포함하는 이전 발현 클론을 사용하여 발현된 정제된 단백질은 UPLC-PDA 분석에서 PPIX에 대한 피크를 갖는 반면에, HemH 돌연변이체, 헴 수송체 시스템(Heme transporter system; ChuA 및 TonB), 및 TBN, TBM1 또는 TBM9 의 염기 서열을 보유하는 새로운 개선된 발현 클론을 사용하여 발현된 정제된 단백질에서는 이러한 피크가 사라졌다. 이러한 결과는 본원에 기재된 발현 클론이 상기 생산된 헤모글로빈에서 상기 헤모글로빈의 산소운반 기능을 향상시키는 헴 혼입(heme incorporation)의 퍼센티지(%)를 상당히 증가시킬 수 있음을 보여주며, 상기 생산된 재조합 헤모글로빈의 산소운반 기능을 손상시킬 수 있는 부산물이자 주요 불순물인 PPIX를 현저히 감소시킨다.
표 7. 햄(Heme) 및 PPIX 함량의 UPLC-PDA 분석 결과
생체 내(in vivo) 조건을 모방하기 위해, 2,3-DPG 를 상기 재조합 헤모글로빈에 첨가한다. 2,3-DPG 의 존재 하에서 상기 재조합 헤모글로빈의 p50 값은 2,3-DPG를 포함하지 않는 인간 재조합체(human recombinant)와 비교하여 증가하였다(도 5B).
실시예 1: TBN, TBM1, TBM9, HemH, ChuA 및 TonB 발현 플라스미드의 구축
플라스미드는 통상적인 클로닝 방법으로 구축하였으며, 각각의 플라스미드에 사용된 벡터 및 제한효소 절단 부위는 하기 표 8에 나타내었다.
표 8. 다양한 플라스미드 정보
실시예 2: 단백질 발현
소규모 단백질 발현: 스크리닝용
원하는 플라스미드를 원하는 균주로 형질전환시켰다. 신선한 배양 플레이트에서 콜로니를 선택한 후 2 mL LB 배지와 적절한 항생제(카나마이신 50 g/mL; 클로람페니콜 34 g/mL)가 포함된 15 mL 튜브에 넣고 32℃, 250rpm에서 밤새 배양하였다. 생성된 배양물을 50 mL 팔콘 튜브에 포함된 적절한 항생제가 포함된 10 mL TB 배지에서 1:100 로 희석하였다. OD600 이 0.6 에 도달하면 25℃ 에서 0.4 mM IPTG를 이용하여 표적 단백질을 유도하였다. 20 시간 유도 후, 박테리아를 4,000 x g에서 15 분 동안 원심분리하여 수득하였다.
발효:
원하는 플라스미드로 형질전환된 E. coli 클론을 200 mL 의 종자 배양 배지(6% 효모 추출물 및 1% NaCl)에 접종하고 32℃에서 250 rpm에서 밤새 진탕하면서 배양하였다. 발효는 10-L 생물반응기(Sartorius C plus)에서 수행하였다. 종자 배양 플라스크를 최종 OD600 이 0.05 인 10 L 생물 반응기(bioreactor) 내의 6.5 L의 배지(1% 효모 추출물, 1.6% 트립톤, 15 mM K2HPO4, 37 mM KH2PO4, 15 mM NaCl, 15 mM (NH4)2SO4, 2 mM L-프롤린, 2% 글리세롤)에 접종 후, 32℃ 및 pH 7.0 에서 6 L/min의 기류 및 400 rpm의 초기 교반 속도로 배양하였고, 이때 용존 산소는 20% 보다 높게 유지하였다.
10 L 생물 반응기에서 재조합 단백질 생산의 유가식(fed-batch) 공정은 두 단계로 나누어 수행하였다. 제 1 단계로서, 32℃ 에서 7 시간 동안 호기성 배치 배양을 하였다. 제 2 단계는 최종 농도 0.4 mM의 이소프로필-β-d-티오갈락토사이드(IPTG)와 OD600 4.0 의 박테리아를 이용하여 25℃ 에서 18 시간 동안 유도하여 재조합 단백질의 발현을 유도하는 과정이었다. 80 g/L 의 글리세롤과 100 mg/L 의 헤민(hemin)을 연속적으로 공급하여, 8 L/min의 기류와 600 내지 800 rpm 의 교반 속도와 더불어 박테리아에 요구되는 특정 성장 속도를 유지하는 25℃ 에서 18 시간 동안 유가식 배양을 수행하였고, 이때 용존 산소는 약 4% 로 유지하였다. 최종 OD600 30 내지 40 의 박테리아를 원심분리에 의해 수득한 후 향후 사용을 위해 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 단백질 정제
니켈 비드에 의한 소규모 단백질 정제: 스크리닝용
10 mL의 TB 배지로부터 수득한 세포 펠릿을 인산염 버퍼(pH 7.4)에 현탁 후 0.1 mm 유리 비드로 파쇄하였다. 가용성 단백질을 4℃에서 15 분 동안 15,000 x g에서 원심분리하여 수확하였다. 니켈 하전 비드에 결합된 표적 단백질을 0.4 M 이미다졸을 사용하여 용출하였다.
단백질 정제
조 단백질(crude protein) 샘플의 세포 용해 및 정제(clarification)
발효로부터 수득한 세포 펠릿을 1 g 세포 대 7 mL 버퍼 비율을 갖는 가용화 버퍼(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.5)에 재현탁하였다. 상기 현탁액을 800 bar(2 사이클)에서 고압 균질화기를 통해 처리하였다. 그 결과 수득한 세포 용해물은 중공 섬유 시스템(hollow fiber system)에 의해 정화하였다(clarified).
크로마토그래피 정제
불순물을 제거하기 위하여, 상기 가용성 분획물을 일련의 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 TBN, TBM1, 또는 TBM9 단백질을 분리하였다.
첫째, 상등액을 아연 친화성 컬럼(zinc affinity column)에 로딩하였다. 버퍼(20 mM Tris, 30 mM NaCl, pH 8.5)로 충분히 컬럼을 세척한 후, 용출 버퍼(20 mM Tris, 100 mM 이미다졸, pH 8.3)로 표적 단백질을 용출하였다.
둘째, 상기 회수된 분획물을 DEAE 음이온-교환 컬럼에 로딩하였다. 용출 버퍼(20 mM NaPi, pH 6.0)로 표적 단백질을 용출하였다.
최종적으로, 상기 정제된 TBN/TBM1/TBM9 샘플들을 50 mg/mL로 농축하였다. 이들 단백질 샘플을 유리 바이알에서 적절한 부형제와 함께 동결건조시켰다.
실시예 4: 발현 단백질의 특성화(Characterization)
(a) UPLC
샘플의 단백질 농도는 Bradford 단백질 분석을 통하여 측정하였다. 이들 샘플을 약 10 mg/mL의 단백질 농도로 희석하였다. 50 mL 의 정제된 단백질을 400 mL 의 산성 아세톤과 혼합하였다. 격렬하게 교반한 후, 혼합물을 원심분리에 의해 분리하였다. 아세토니트릴(ACN, 400 mL, 유기 용매에 대한 샘플 혼합 비율은 1:8 임)을 용액에 첨가한 후, 14,000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이후, 상기 샘플들을 UPLC 분석에 적용하였다(Acquity H-class UPLC system; Waters, Milford, MA, USA).
PPIX는 Waters Acquity UPLC® BEH C18 1.7 μm, 2.1 × 50 mm 컬럼을 사용하여 25℃ 에서 15 분 동안 0.40 mL/분으로 분리하였다. (용리액: A: H2O; B: ACN [0.1% TFA]) 구배: 30% B 내지 50% B로 6 분 동안, 50% B 내지 80% B로 12 분 동안, 80% B 내지 30% B로 13 분 동안, 30% B로 15 분 동안. (400 nm에서 검출 파장: 400 nm). 상업적으로 입수한 PPIX(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준으로 사용하였다. PPIX의 피크를 식별한 후, 교정 표준 및 샘플의 피크 면적을 기록하였다. 상기 교정 표준의 피크 면적은 작업 표준의 PPIX 농도에 대해 플로팅하였다. 따라서, 보정 곡선과 관련 방정식을 사용하여 PPIX의 상대적인 양을 산출하였다.
(b) 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)
샘플들을 약 1 mg/mL의 단백질 농도로 희석하였다. 정제된 단백질 10 μL 을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 적용하였다(Waters Breeze2 HPLC system; Waters, Milford, MA, USA).
이들 단백질을 Yarra 3 μm, SEC-2000, 7.8 x 300 mm 컬럼으로 0.50 mL/분으로 25℃에서 20 분 동안 분리하였다(이동상: 0.75 M 염화 마그네슘, 0.2 M Tris, 116 μm EDTA). (410 nm에서의 검출 파장).
실시예 5: 재조합 헤모글로빈의 산소 운반 능력 측정
(a) 옥시헤모글로빈 해리 곡선(ODC) 및 p50 값의 측정
p50 값은 HEMOX-분석기를 이용하여 결정하였다. 1.5 mg 의 정제된 단백질을 2,3-DPG(4 mM)를 포함하거나 불포함하는 버퍼(HEPES 100 mM, KCl 100 mM, pH 7.3) 3.5 mL에 희석하였다. 샘플 버퍼를 큐벳에 넣고 혼합물의 온도를 평형화하고 37℃에 맞춘 후, 상기 샘플을 공기로 100% 까지 산소화하였다. pO2 값을 조정한 후, 상기 샘플을 질소로 탈산소화하였다. 탈산소 과정 동안 곡선이 기록된다. p50 값은 x축 상에서 O2 포화도가 50% 인 지점으로 외삽된다(extrapolated).
(b) 랫트(rat) 모델에서 간의 산소 수준 측정(180 분)
간 조직의 산소화(간 pO2)는 Buffalo 랫트(rat)의 허혈(ischemia) 및 재관류(reperfusion) 과정 동안 OxyLab® 생체 내(in vivo) 모니터링 시스템(Oxford Optronix, UK)을 이용하여 직접 모니터링하였다. 간단히 말해서, 대면적 표면(largearea-surface; LAS) 산소 센서(oxygen sensor; Oxford Optronix, UK)는 랫트(rat)의 간의 우측 간엽(hepatic lobe)과 삼각형 엽(triangle lobe) 사이에 배치하였다. 우측 및 삼각형 엽에 간동맥(hepatic artery)과 문맥(portal vein)의 가지(branch)를 클램프로 고정하였다. YQ(소 푸마릴 가교 헤모글로빈(bovine fumaryl cross-linked hemoglobin) - 양성 대조군)(0.2 g/kg), TBM1/TBM9(0.2 g/kg) 또는 링거의 아세테이트 버퍼(대조군)를 정맥 내 투여하였다. 간의 허혈 재관류 손상(hepatic ischemia reperfusion injury) 동안 간의 산소 장력(Liver oxygen tension)을 지속적으로 측정하였다: (1) 기준선(baseline); (2) YQ, TBM1/TBM9 또는 링거 아세테이트 버퍼 주입 후.
실시예 6: 아지드 유도 산화 측정(Azide-induced oxidation measurement)
재조합 헤모글로빈을 실온 pH 7.0 에서 0.1 M 인산나트륨 + 1 mM EDTA 를 이용하여 1 mg/mL 로 희석하였다. 샘플 용액은 실온에서 20 분 동안 Hemox Analyzer(TCS science)를 이용하여 압축 공기로 산소화하였다(oxygenated). 아지드-유도 산화는 55.6 μL 의 2 M 아지드화 나트륨(sodium azide)을 1 mL 의 산소 샘플 용액에 첨가함으로써 개시되었다. 그 후, 상기 샘플 용액을 지체하지 않고 바로 큐벳으로 옮기고 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 밀봉하였다. 400 nm 내지 800 nm 의 가시 스펙트럼은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24 및 48 시간의 빠른 모드에서 실온 하에 AuDROP 플레이트(thermos science)가 구비된 Multiskan GO 를 이용하여 기록하였다. 578 nm, 630 nm 및 700 nm에서의 판독값을 이용하여 하기 방정식으로 oxy-Hb의 농도를 계산하였다:
[oxy-Hb] = 16.2 * (A578 -A700) - 68 * (A630 - A700).
초기 산화 속도(initial rate of oxidation)는 데이터의 처음 6 시간의 지수 피팅(exponential fitting)을 이용하여 계산하였다.
실시예 7: 4T1 의 유방암 세포 증식 연구
(a) 4T1 의 시험관 내(in vitro) 연구
시험관 내(in vitro) 암세포 증식 억제를 결정하기 위하여, 4T1 유방암 세포(2,000 개 세포/웰)를 96 웰 플레이트에 접종하고 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 안정화 후, 배양 배지를 TBM1 또는 TBM9 를 함유하는 배양 배지 100 μL 로 교체하고, 48 시간 후 MTT 분석에 의해 세포 생존율을 평가하였다. TBM1 또는 TBM9 처리 후, 세포 증식에 대한 MTT assay 결과를 도 11에 나타내었다. TBM1과 TBM9 는 0.1 내지 10 μM 농도에서 암세포 증식을 상당히 억제할 수 있다.
(b) 4T1 의 생체 내(in vivo) 연구 - 마우스
6주령 암컷 BALB/c 누드 마우스에 4T1 암세포(마우스당 5,000 개의 세포)를 피하 주사하였다. 종양 부피(mm3)는 (가장 긴 직경) × 0.5 × (가장 짧은 직경)2 의 표준 공식에 따라 계산하였다. 종양 부피가 100 mm3 에 도달한 후, TBM1 단백질(100 mg/kg, n=8)을 2주 동안 주 1 회 꼬리 정맥으로 주사하였다. 대조군(n=8)에는 PBS 를 주입하였다. 종양 부피는 1 주일에 2 번 모니터링하였다. 도 12a 에 나타낸 바와 같이, PBS로 처리한 마우스(대조군)에서 처리 후 약 14 일 만에 종양이 빠르게 성장하였다. 종양 성장은 대조군과 비교하여 TBM1 군의 마우스에서 유의미하게 느려졌다(p < 0.05). 도 12B 는 TBM1 처리 14 일 후의 종양 부피를 보여 준다. 대조군의 경우 종양의 부피가 800 mm3 에 도달하여 TBM1 처리군(377 mm3)보다 상당히 높았다.
실시예 8: 말초동맥질환(Peripheral arterial disease; PAD) 모델
쥐 모델(murine model)을 사용하여 임계 사지 허혈(critical limb ischemia)에 대한 TBM1의 잠재적 치료 효과를 평가하였다. 간단히 말해서, 자일라진(20 mg/kg) 및 케타민(100 mg/kg)을 복강 내 주사하여 마우스를 마취시켰다. 좌측 대퇴 동맥(femoral artery)을 절제 후, 외장골 동맥(external iliac artery)의 가지(branch)인 근위 기점(proximal origin)에서 복재 동맥과 슬와 동맥(saphenous and popliteal arteries)으로 분기하는 원위 지점(distal point)까지 결찰하였다. 대퇴 동맥을 성공적으로 결찰 24 시간 후, 마우스를 꼬리 정맥을 통하여 생리 식염수(n=2) 및 TBM1(800 mg/kg, n=2)를 단회(single) 정맥 내 투여를 받도록 무작위로 할당하였다.
뒷다리의 조직 관류(tissue perfusion)는 기준선(baseline)에서, 대퇴 동맥 결찰(femoral artery ligation) 직후, 그리고 레이저 도플러 이미징 시스템(laser Doppler imaging system; Moor Instruments, Devon, UK)을 사용하여 할당된 치료를 투여한 후 7일째에 연속적으로 평가하였다(Moor instruments, Devon, UK). 상기 측정 과정 동안 마우스를 마취시켰다. 디지털 색상으로 구분된(color-coded) 이미지를 캡처 후 분석하여 무릎 관절에서 발가락까지 해당 영역의 혈류를 정량화하였다.
도 13 에 도시된 바와 같이, "우측 대퇴동맥 결찰 직후" 시점에서, 본 실시예의 결과는 비허혈성 대조군 사지(non-ischemic control limbs)에서 평균 상대 혈액 관류(mean relative blood perfusion)가 88.8%에서 5.2%로 상당히 감소하였음을 나타냄으로써, 급성 뒷다리 허혈을 성공적으로 유도함을 확인하였다. 흥미롭게도, 7일째에 TBM1 치료를 받은 마우스의 허혈성 사지에서 조직 혈액 관류가 크게 개선되었다. 구체적으로, 평균 상대 조직 혈액 관류는 7일째 정상 식염수 군의 비허혈성 대조군 사지의 11.7%에 해당하였고, 이는 800 mg/kg (30.1%)에서 TBM1 을 투여한 상대(counterparts) 보다 상당히 낮았다.
결론적으로, 800 mg/kg의 단회 정맥 내 TBM1 주사는 임계 사지 허혈의 쥐 모델에서 조직 관류의 개선을 가져온다.
실시예 9: 마우스와 랫트에서 TBM1 의 다중 투여 및 단일 투여
(a) 마우스에서 TBM1 의 다중 투여:
마우스(Balb/C 마우스 및 ICR 마우스 모두)를 무작위로 3 개의 군(n=6)으로 나눈 후, 주사(TBM1 100, 200 mg/kg 또는 대조군으로서 PBS)를 꼬리 정맥을 통해 4 회 연속 매주 투여하였다. 종료 시점에, 상기 마우스를 마취 후, 혈액 샘플을 수집하여 혈액학적 분석을 수행하였다. 주요 장기(간, 비장, 신장, 폐)를 수득한 후, 이들을 포르말린에 고정하고 조직학적 평가(H&E 염색)를 수행하였다.
도 14 에 도시된 바와 같이. TBM1 처리군과 대조군(Balb/C 마우스 및 ICR 마우스 모두) 간에 체중의 유의한 차이는 보이지 않았다. 헝클어진 털(ruffled fur), 거식증(anorexia), 악액질(cachexia), (탈수로 인한) 피부 텐팅(skin tenting), 피부 궤양(skin ulcerations) 또는 독성 사망(toxic deaths)과 같은 마우스에서 약물 독성의 다른 일반적인 징후는 사용된 용량에서 나타나지 않았다.
(b) 랫트에서 TBM1 단일 용량(심근병증(cardiomyopathy) 확인용):
SD 랫트(n=6)에 단일 용량(TBM1 400 및 800 mg/kg, 정맥 주입)을 투여하였다. 간략히 말해서, 경정맥 카테터(jugular catheter)는 투여일로부터 최소한 4 일 전에 랫트의 우측 경정맥(jugular vein)에 외과적으로 이식되었다. 투여일에 동물의 체중을 측정하고 수컷 및 암컷의 절반으로 그룹 당 6 마리로 할당하였다. TBM1 을 주사기로 빼낸 후 주입용 0.22 μm 필터가 있는 확장 튜브에 연결하였다. 상기 주입은 전동 주사기 펌프를 이용하여 일정한 속도로 수행하였다. 72시간 후, 상기 랫트들을 희생시키고 심장을 수거 후, 포르말린에 고정하고 조직학적 평가를 수행하였다 (H&E 염색). 총 6 마리의 랫트에서 약물 유발성 심근병증(drug induced cardiomyopathy)의 증거를 발견하지 못하였다.
본 발명은 특정 실시예와 관련하여 설명되었지만, 당업자에게 있어서 자명한 기타 실시예도 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 이하의 청구범위에 의해서만 정의되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 암, 뇌졸중, 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), 급성 고산병(acute mountain sickness; AMS), 말초동맥질환(peripheral arterial disease; PAD), 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)과 같은 산소결핍(oxygen deficiency)과 관련된 질병 또는 상태의 치료에 유용한 헤모글로빈을 제공한다. 본원에 기재된 상기 재조합 헤모글로빈은 증가된 산소운반능력(oxygen carrying capacity)을 갖는다. 본원에 기재된 상기 재조합 헤모글로빈을 포함하는 약학적 조성물의 치료학적 사용은 감소된 임상 투여량이 요구될 수 있으며, 이는 이를 필요로 하는 개체에서 이러한 치료학적 사용의 안전성을 증가시킨다. 또한, 상기 재조합 헤모글로빈을 고수율 및 고순도로 제조, 수득, 발효 및/또는 정제하기 위한 단순화된 방법 및/또는 공정이 제공된다. 이들 방법은 기존의 기존 방법에 비해 비용 효과적이고 불순물이 발생률이 적은(less impurity-prone) 산업적 규모로 사용될 수 있다.
<110> Cheer Global Limited
<120> Recombinant hemoglobins and methods of preparation and use
thereof
<130> P20263PCT00
<150> US Provisional Patent Application No. 62/799,829
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<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> di-alpha chain, synthesized in lab
<400> 1
Met Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys
1 5 10 15
Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Phe Glu Arg Met
20 25 30
Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu
35 40 45
Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly Gln Gly Lys Lys Val Ala Asp
50 55 60
Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala Leu
65 70 75 80
Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val
85 90 95
Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala His
100 105 110
Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe
115 120 125
Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Met Leu
130 135 140
Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys Val Gly
145 150 155 160
Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Phe Glu Arg Met Phe Leu
165 170 175
Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu Ser His
180 185 190
Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly Gln Gly Lys Lys Val Ala Asp Ala Leu
195 200 205
Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala Leu Ser Ala
210 215 220
Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val Asn Phe
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Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala His Leu Pro
245 250 255
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Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
275 280
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta chain, synthesized in lab
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1 5 10 15
Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu
20 25 30
Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu
35 40 45
Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly
50 55 60
Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp Asn
65 70 75 80
Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu
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Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln Ala
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Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln Ala
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atgctgtctc cggcagataa aacgaatgtt aaagcagcct ggggtaaagt cggcgctcac 60
gcgggcgaat acggtgcaga agcctttgaa cgtatgtttc tgtccttccc gaccacgaaa 120
acctattttc cgcatttcga tctgagtcac ggctccgcgc aggtgaaagg tcagggcaaa 180
aaagttgcag acgctctgac gaacgcggtg gcccacgttg atgacatgcc gaatgcactg 240
tcagctctga gcgatctgca cgcgcacaaa ctgcgtgttg atccggtgaa ctttaaactg 300
ctgagccatt gcctgctggt caccctggcg gcacacctgc cggcagaatt tacgccggcg 360
gttcatgcca gcctggataa attcctggcg agcgtgagca ccgtcctgac gtctaaatac 420
cgcggcatgc tgtctccggc agataaaacg aatgttaaag cagcctgggg taaagtcggc 480
gctcacgcgg gcgaatacgg tgcagaagcc tttgaacgta tgtttctgtc cttcccgacc 540
acgaaaacct attttccgca tttcgatctg agtcacggct ccgcgcaggt gaaaggtcag 600
ggcaaaaaag ttgcagacgc tctgacgaac gcggtggccc acgttgatga catgccgaat 660
gcactgtcag ctctgagcga tctgcacgcg cacaaactgc gtgttgatcc ggtgaacttt 720
aaactgctga gccattgcct gctggtcacc ctggcggcac acctgccggc agaatttacg 780
ccggcggttc atgccagcct ggataaattc ctggcgagcg tgagcaccgt cctgacgtct 840
aaataccgct aa 852
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gacgaagtcg gcggcgaagc actgggccgt ctgctggttg tgtatccgtg gacccagcgc 120
tttttcgaat cttttggtga tctgtctacg ccggacgctg ttatgggcaa cccgaaagtc 180
aaagcgcatg gcaaaaaagt cctgggtgcc tttagtgatg gcctggcaca cctggacaat 240
ctgaaaggca ccttcgcgac gctgagcgaa ctgcattgcg ataaactgca cgtggacccg 300
gaaaacttcc gtctgctggg taatgttctg gtctgtgtgc tggcccatca ctttggcaaa 360
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tttttcgaat cttttggtga tctgtctacg ccggacgctg ttatgggcaa cccgaaagtc 180
aaagcgcatg gcaaaaaagt cctgggtgcc tttagtgatg gcctggcaca cctggacaat 240
ctggacggca ccttcgcgac gctgagcgaa ctgcattgcg ataaactgca cgtggacccg 300
gaaaacttcc gtctgctggg taaagttctg gtctgtgtgc tggcccatca ctttggcaaa 360
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caggatctga aagatcgcta cgaggctatc gggggtattt ctcctttggc acagattacc 180
gaacaacaag cccataatct tgaacaacat ctgaatgaaa ttcaagacga aattaccttc 240
aaggcctaca ttggcttgaa acatattgag ccttttatcg aggatgccgt ggctgaaatg 300
cataaggatg gaatcaccga agccgtttct atcgtgctgg ccccacattt ttccacgttc 360
tcagtacaaa gctacaataa acgcgcaaaa gaagaagccg agaagcttgg gggcttgaca 420
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gtaaaggaga cctatgccag tatgcccgag gatgaacgcg aaaacgccat gttaatcgtt 540
agtgctcact cgctaccgga gaaaatcaaa gaatttggtg acccgtaccc tgaccagctt 600
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<223> ChuA, Synthesized in lab
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ttcccgcaag caaaaatcga ttttagctcc ggctggctac aggatgagat caccttacgc 1140
gatctgccga ttaccctgct tggcggaacc cgctatgaca gttatcgcgg tagcagtgac 1200
ggttacaaag atgttgatgc cgacaaatgg tcatctcgtg cggggatgac tatcaatccg 1260
actaactggc tgatgttatt tggctcttat gcccaggcat tccgcgcccc gacgatgggc 1320
gaaatgtata acgattctaa gcacttctcg attggtcgct tctataccaa ctattgggtg 1380
ccaaacccga acttacgtcc ggaaactaac gaaactcagg agtacggttt tgggctgcgt 1440
tttgatgacc tgatgttgtc caatgatgct ctggaattta aagccagcta ctttgatacc 1500
aaagcgaagg attacatctc cacgaccgtc gatttcgcgg cggcgacgac tatgtcgtat 1560
aacgtcccga acgccaaaat ctggggctgg gatgtgatga cgaaatatac cactgatctg 1620
tttagccttg atgtggccta taaccgtacc cgcggcaaag acaccgatac cggcgaatac 1680
atctccagca ttaacccgga tactgttacc agcactctga atattccgat cgctcacagt 1740
ggcttctctg ttgggtgggt tggtacgttt gccgatcgct caacacatat cagcagcagt 1800
tacagcaaac aaccaggcta tggcgtgaat gatttctacg tcagttatca aggacaacag 1860
gcgctcaaag gtatgaccac tactttggtg ttgggtaacg ctttcgacaa agagtactgg 1920
tcgccgcaag gcatcccaca ggatggtcgt aacggaaaaa ttttcgtgag ttatcaatgg 1980
taa 1983
<210> 10
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TonB, Synthesized in lab
<400> 10
atgacccttg atttacctcg ccgcttcccc tggccgacgt tactttcggt ctgcattcat 60
ggtgctgttg tggcgggtct gctctatacc tcggtacatc aggttattga actacctgcg 120
cctgcgcagc cgatttctgt cacgatggtt gcgcctgctg atctcgaacc gccacaagcc 180
gttcagccgc caccggagcc ggtggtagag ccagaaccgg aacctgagcc gatccccgaa 240
ccgccaaaag aagcaccggt ggtcattgaa aagccgaagc cgaaacctaa gccaaaaccg 300
aagccggtga aaaaggtaca ggagcagcaa aaacgcgatg tcaaacccgt agagtcgcgt 360
ccggcatcac cgtttgaaaa tacggcaccg gcacgcccga catcaagtac agcaacggct 420
gcaaccagca agccggttac cagtgtggct tcaggaccac gcgcattaag ccgtaatcag 480
ccgcagtatc cggcacgagc acaggcattg cgcattgaag ggcaggttaa agttaaattt 540
gacgtcacgc cggatggtcg cgtggataac gtacaaatcc tctcagccaa gcctgcgaac 600
atgtttgagc gtgaggtgaa aaatgcgatg cgcagatggc gttatgagcc gggtaagcca 660
ggcagtggga ttgtggtgaa tatcctgttt aaaattaacg gcaccaccga aattcagtaa 720
720
<210> 11
<211> 283
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Di-alpha chain, Synthesized in lab
<400> 11
Met Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys
1 5 10 15
Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met
20 25 30
Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu
35 40 45
Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala Asp
50 55 60
Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala Leu
65 70 75 80
Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val
85 90 95
Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala His
100 105 110
Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe
115 120 125
Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg Gly Met Leu
130 135 140
Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys Val Gly
145 150 155 160
Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met Phe Leu
165 170 175
Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu Ser His
180 185 190
Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala Asp Ala Leu
195 200 205
Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala Leu Ser Ala
210 215 220
Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val Asn Phe
225 230 235 240
Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala His Leu Pro
245 250 255
Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe Leu Ala
260 265 270
Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg
275 280
<210> 12
<211> 146
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta chain, Synthesized in lab
<400> 12
Met His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp Gly
1 5 10 15
Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu
20 25 30
Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu
35 40 45
Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly
50 55 60
Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp Asn
65 70 75 80
Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu
85 90 95
His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Cys
100 105 110
Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln Ala
115 120 125
Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys
130 135 140
Tyr His
145
<210> 13
<211> 310
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HemH mutant, synthesized in the lab
<400> 13
Met Ser Arg Lys Lys Met Gly Leu Leu Val Met Ala Tyr Gly Thr Pro
1 5 10 15
Tyr Lys Glu Glu Asp Ile Glu Arg Tyr Tyr Thr His Ile Arg Arg Gly
20 25 30
Arg Lys Pro Glu Pro Glu Met Leu Gln Asp Leu Lys Asp Arg Tyr Glu
35 40 45
Ala Ile Gly Gly Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ile Thr Lys Gln Gln Ala
50 55 60
His Asn Leu Glu Gln His Leu Asn Glu Ile Gln Asp Glu Ile Thr Phe
65 70 75 80
Lys Ala Tyr Ile Gly Leu Lys His Ile Glu Pro Phe Ile Glu Asp Ala
85 90 95
Val Ala Glu Met His Lys Asp Gly Ile Thr Glu Ala Val Ser Ile Val
100 105 110
Leu Ala Pro His Phe Ser Thr Phe Ser Val Gln Ser Tyr Asn Lys Arg
115 120 125
Ala Lys Glu Glu Ala Glu Lys Leu Gly Gly Leu Thr Ile Thr Ser Val
130 135 140
Glu Ser Trp Tyr Asp Glu Pro Lys Phe Val Thr Tyr Trp Val Asp Arg
145 150 155 160
Val Lys Glu Thr Tyr Ala Ser Met Pro Glu Asp Glu Arg Glu Asn Ala
165 170 175
Met Leu Ile Val Ser Ala His Ser Gln Pro Glu Lys Ile Lys Glu Phe
180 185 190
Gly Asp Pro Tyr Pro Asp Gln Leu His Glu Ser Ala Lys Leu Ile Ala
195 200 205
Glu Gly Ala Asp Val Ser Glu Tyr Ala Val Gly Trp Gln Ser Glu Gly
210 215 220
Asn Thr Pro Asp Pro Trp Leu Gly Pro Asp Val Gln Asp Leu Thr Arg
225 230 235 240
Asp Leu Phe Glu Gln Lys Gly Tyr Gln Ala Phe Val Tyr Val Pro Val
245 250 255
Gly Phe Val Ala Asp His Leu Glu Val Leu Tyr Asp Asn Asp Tyr Glu
260 265 270
Cys Lys Val Val Thr Asp Asp Ile Gly Ala Ser Tyr Tyr Arg Pro Glu
275 280 285
Met Pro Asn Ala Lys Pro Glu Phe Ile Asp Ala Leu Ala Thr Val Val
290 295 300
Leu Lys Lys Leu Gly Arg
305 310
<210> 14
<211> 660
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ChuA, Synthesized in lab
<400> 14
Met Ser Arg Pro Gln Phe Thr Ser Leu Arg Leu Ser Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ala Val Ser Ala Thr Leu Pro Thr Phe Ala Phe Ala Thr Glu Thr Met
20 25 30
Thr Val Thr Ala Thr Gly Asn Ala Arg Ser Ser Phe Glu Ala Pro Met
35 40 45
Met Val Ser Val Ile Asp Thr Ser Ala Pro Glu Asn Gln Thr Ala Thr
50 55 60
Ser Ala Thr Asp Leu Leu Arg His Val Pro Gly Ile Thr Leu Asp Gly
65 70 75 80
Thr Gly Arg Thr Asn Gly Gln Asp Val Asn Met Arg Gly Tyr Asp His
85 90 95
Arg Gly Val Leu Val Leu Val Asp Gly Val Arg Gln Gly Thr Asp Thr
100 105 110
Gly His Leu Asn Gly Thr Phe Leu Asp Pro Ala Leu Ile Lys Arg Val
115 120 125
Glu Ile Val Arg Gly Pro Ser Ala Leu Leu Tyr Gly Ser Gly Ala Leu
130 135 140
Gly Gly Val Ile Ser Tyr Asp Thr Val Asp Ala Lys Asp Leu Leu Gln
145 150 155 160
Glu Gly Gln Ser Ser Gly Phe Arg Val Phe Gly Thr Gly Gly Thr Gly
165 170 175
Asp His Ser Leu Gly Leu Gly Ala Ser Ala Phe Gly Arg Thr Glu Asn
180 185 190
Leu Asp Gly Ile Val Ala Trp Ser Ser Arg Asp Arg Gly Asp Leu Arg
195 200 205
Gln Ser Asn Gly Glu Thr Ala Pro Asn Asp Glu Ser Ile Asn Asn Met
210 215 220
Leu Ala Lys Gly Thr Trp Gln Ile Asp Ser Ala Gln Ser Leu Ser Gly
225 230 235 240
Leu Val Arg Tyr Tyr Asn Asn Asp Ala Arg Glu Pro Lys Asn Pro Gln
245 250 255
Thr Val Gly Ala Ser Glu Ser Ser Asn Pro Met Val Asp Arg Ser Thr
260 265 270
Ile Gln Arg Asp Ala Gln Leu Ser Tyr Lys Leu Ala Pro Gln Gly Asn
275 280 285
Asp Trp Leu Asn Ala Asp Ala Lys Ile Tyr Trp Ser Glu Val Arg Ile
290 295 300
Asn Ala Gln Asn Thr Gly Ser Ser Gly Glu Tyr Arg Glu Gln Ile Thr
305 310 315 320
Lys Gly Ala Arg Leu Glu Asn Arg Ser Thr Leu Phe Ala Asp Ser Phe
325 330 335
Ala Ser His Leu Leu Thr Tyr Gly Gly Glu Tyr Tyr Arg Gln Glu Gln
340 345 350
His Pro Gly Gly Ala Thr Thr Gly Phe Pro Gln Ala Lys Ile Asp Phe
355 360 365
Ser Ser Gly Trp Leu Gln Asp Glu Ile Thr Leu Arg Asp Leu Pro Ile
370 375 380
Thr Leu Leu Gly Gly Thr Arg Tyr Asp Ser Tyr Arg Gly Ser Ser Asp
385 390 395 400
Gly Tyr Lys Asp Val Asp Ala Asp Lys Trp Ser Ser Arg Ala Gly Met
405 410 415
Thr Ile Asn Pro Thr Asn Trp Leu Met Leu Phe Gly Ser Tyr Ala Gln
420 425 430
Ala Phe Arg Ala Pro Thr Met Gly Glu Met Tyr Asn Asp Ser Lys His
435 440 445
Phe Ser Ile Gly Arg Phe Tyr Thr Asn Tyr Trp Val Pro Asn Pro Asn
450 455 460
Leu Arg Pro Glu Thr Asn Glu Thr Gln Glu Tyr Gly Phe Gly Leu Arg
465 470 475 480
Phe Asp Asp Leu Met Leu Ser Asn Asp Ala Leu Glu Phe Lys Ala Ser
485 490 495
Tyr Phe Asp Thr Lys Ala Lys Asp Tyr Ile Ser Thr Thr Val Asp Phe
500 505 510
Ala Ala Ala Thr Thr Met Ser Tyr Asn Val Pro Asn Ala Lys Ile Trp
515 520 525
Gly Trp Asp Val Met Thr Lys Tyr Thr Thr Asp Leu Phe Ser Leu Asp
530 535 540
Val Ala Tyr Asn Arg Thr Arg Gly Lys Asp Thr Asp Thr Gly Glu Tyr
545 550 555 560
Ile Ser Ser Ile Asn Pro Asp Thr Val Thr Ser Thr Leu Asn Ile Pro
565 570 575
Ile Ala His Ser Gly Phe Ser Val Gly Trp Val Gly Thr Phe Ala Asp
580 585 590
Arg Ser Thr His Ile Ser Ser Ser Tyr Ser Lys Gln Pro Gly Tyr Gly
595 600 605
Val Asn Asp Phe Tyr Val Ser Tyr Gln Gly Gln Gln Ala Leu Lys Gly
610 615 620
Met Thr Thr Thr Leu Val Leu Gly Asn Ala Phe Asp Lys Glu Tyr Trp
625 630 635 640
Ser Pro Gln Gly Ile Pro Gln Asp Gly Arg Asn Gly Lys Ile Phe Val
645 650 655
Ser Tyr Gln Trp
660
<210> 15
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TonB, Synthesized in lab
<400> 15
Met Thr Leu Asp Leu Pro Arg Arg Phe Pro Trp Pro Thr Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Cys Ile His Gly Ala Val Val Ala Gly Leu Leu Tyr Thr Ser Val
20 25 30
His Gln Val Ile Glu Leu Pro Ala Pro Ala Gln Pro Ile Ser Val Thr
35 40 45
Met Val Ala Pro Ala Asp Leu Glu Pro Pro Gln Ala Val Gln Pro Pro
50 55 60
Pro Glu Pro Val Val Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Ile Pro Glu
65 70 75 80
Pro Pro Lys Glu Ala Pro Val Val Ile Glu Lys Pro Lys Pro Lys Pro
85 90 95
Lys Pro Lys Pro Lys Pro Val Lys Lys Val Gln Glu Gln Gln Lys Arg
100 105 110
Asp Val Lys Pro Val Glu Ser Arg Pro Ala Ser Pro Phe Glu Asn Thr
115 120 125
Ala Pro Ala Arg Pro Thr Ser Ser Thr Ala Thr Ala Ala Thr Ser Lys
130 135 140
Pro Val Thr Ser Val Ala Ser Gly Pro Arg Ala Leu Ser Arg Asn Gln
145 150 155 160
Pro Gln Tyr Pro Ala Arg Ala Gln Ala Leu Arg Ile Glu Gly Gln Val
165 170 175
Lys Val Lys Phe Asp Val Thr Pro Asp Gly Arg Val Asp Asn Val Gln
180 185 190
Ile Leu Ser Ala Lys Pro Ala Asn Met Phe Glu Arg Glu Val Lys Asn
195 200 205
Ala Met Arg Arg Trp Arg Tyr Glu Pro Gly Lys Pro Gly Ser Gly Ile
210 215 220
Val Val Asn Ile Leu Phe Lys Ile Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln
225 230 235
Claims (21)
- 디-알파 사슬과 2 개의 베타 사슬을 포함하는 재조합 인간 헤모글로빈에 있어서,
상기 디-알파 사슬은 서열 번호 1을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며,
상기 재조합 인간 헤모글로빈은 비변형 인간 헤모글로빈과 비교하여 더 높은 안정성 및 증가된 산소 수송 능력 중 하나 이상을 갖는, 재조합 헤모글로빈. - 제1항에 있어서,
상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 2 를 갖는 폴리펩티드 서열인, 재조합 헤모글로빈. - 제1항에 있어서,
상기 2 개의 베타 사슬 각각은 서열 번호 3의 폴리펩티드 서열을 포함하는, 재조합 헤모글로빈. - 제1항의 재조합 헤모글로빈 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암, 뇌졸증(stroke), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), 급성 고산병(acute mountain sickness; AMS), 말초 동맥 질환(peripheral arterial disease; PAD) 또는 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)을 치료하기 위한 약학적 조성물.
- (a) 제1항의 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 제1항의 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 디-알파 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 베타 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 숙주 세포가 재조합 헤모글로빈을 발현하도록 유도하여, 제1항의 재조합 헤모글로빈을 생산하는 단계;
를 포함하는, 제1항의 재조합 헤모글로빈을 생산하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 디-알파 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 베타 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 서열 번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 디-알파 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 베타 사슬을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 서열 번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 서열 번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 숙주 세포는 lambda DE3 벡터를 포함하는 JM109 E. coli 박테리아 균주, lambda DE3 벡터를 포함하지 않는 BL21-AI E. coli 박테리아 균주, 및 lambda DE3 벡터를 포함하지 않는 SHuffle E. coli 박테리아 균주로 이루어진 군에서 선택되는, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 숙주 세포는 "HemH" 박테리아 철결합효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 숙주 세포는 헴-수송체(heme-transporter)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 방법. - 제5항에 있어서,
(a) 상기 숙주 세포의 재조합 헤모글로빈 발현을 유도하는 단계 후에 상기 숙주 세포를 파쇄하여 재조합 헤모글로빈을 포함하는 용액을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 재조합 헤모글로빈을 정제하여 정제된 재조합 헤모글로빈을 수득하는 단계;
를 더 포함하는, 방법. - 제1항의 인간 재조합 헤모글로빈 생산 시스템에 있어서, 상기 시스템은 대장균(E. coli) 또는 비-대장균(non-E. coli) 숙주 세포를 포함하는 것으로서:
박테리아 HemH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
박테리아 헴(Heme)-수송체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
상기 디-알파 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 베타 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
여기서, 상기 디-알파 사슬은 서열번호 1을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하며; 그리고
상기 베타 사슬은 서열번호 2를 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는, 시스템. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
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