KR102424439B1 - 네트린-1 방해 약물 및 화학요법 약물을 조합한 치료 - Google Patents

Abstract

약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클(vehicle) 내에, 화학 요법 약물 및 네트린-1 방해 약물 또는 인비보(in vivo)에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 약학적 조성물. 화학 요법 약물은 암 세포 내 네트린-1의 과발현을 유도할 수 있는 것들로부터 선택된다. 조합은 시너지적 항암 효과와 관련된다.

Description

네트린-1 방해 약물 및 화학요법 약물을 조합한 치료{Combined treatment with netrin-1 interfering drug and chemotherapeutic drug}

본 발명은 암을 치료하는 신규의 조합된 조성물 및 방법에 관한 것이다.

축색(axon) 네비게이션(navigation) 단서(1)로서 초기에 발견된 네트린-1(Netrin-1) 용해성 단백질은 세포자멸(apoptosis)의 조절(2, 3)을 통해 암 진전(progression)에 중대한 역할을 수행하는 것으로 최근에 제안되었다. 실제로, 네트린-1 수용체 DCC 및 UNC5H, -- 즉, UNC5H1, UNC5H2, UNC5H3 및 UNC5H4는 또한 UNC5A, UNC5B, UNC5C 또는 UNC5D로 불린다 - 소위 의존성 수용체 패밀리 (4) (5) (6)에 속함. 이들 의존성 수용체는 그들의 리간드로부터 풀릴 때(disengaged) 세포 사멸을 유도하는 그들의 능력 때문에, 그들의 각각 리간드 (7)에 의존하는 세포 상태를 생성하고 결과적으로, 그들이 리간드 불이용(unavailability)의 환경에서 발달하는 종양 세포를 제거하므로 종양 억제자로서 행동할 수 있다. 이점에 대해, 전-세포사멸 활성이 비활성화된 DCC 수용체를 갖는 쥐는 자발적 대장암을 발달시켰으며 장내 종양 진행 (9)이 되기가 더 쉽다. 유사하게, 위장관 내 쥐 내 UNC5H3/C의 불활성화는 장의 종양 진행(10)과 관련된다.

따라서, 의존 수용체 패러다임(paradigm)에 따라, 공격적인 인간 종양의 진행은 이러한 사멸 경로의 불활성화가 요구된다. 이러한 생존적 이점을 달성하기 위한 적어도 세가지 방법이 있다: DCC 또는/및 UNC5H (10-13)에 인간 결장암 내 광범위하게 설명된 것처럼, 네트린-1 수용체 발현의 감소; DCC 또는 UNC5H에 의해 유도된 다운스트림 사멸 신호전달의 감소; 리간드의 자가분비(autocrine) 또는 주변분비(paracrine) 발현의 증가. 흥미롭게도, 네트린-1은 염증 관련 직장암 및 신경아세포종에서, 전이성 유방, 폐, 난소 및 췌장 암의 상당한 부분에 상위 조절(up-regulated)됨을 보였다(14-19). 암의 인비트로(in vitro) 및 쥐 또는 닭 모델에서, 컨셉 연구의 증명은 네트린-1 siRNA에 의한 네트린-1의 침묵(silencing) 또는 네트린-1-수용체 상호작용에 방해는 종양 세포 사멸 및 종양 성장 및 전이의 억제와 관련됨을 보였다 (14-18). 수용체에 결합하는 네트린-1을 방해하는 제안된 이들 나중 연구는 네트린-1이 자가분비 또는 주변분비 방식으로 발현되는 대부분의 암에 효과적인 항암 전략을 나타낼 수 있다. 이른 약물 개발은 네트린-1과 상호작용하는 수용체를 모방하는 생물제제-바이오로직(biologic)-에 집중되었다(20).

혈관형성을 조절하는 희망으로 혈관형성에 네트린-1 및 이의 수용체의 역할에 강조된 일부 다른 연구는 종양 진행의 억제를 도울 수 있었다. 네트린-1 수용체 활성의 조절을 개시한 US2006/0153840은 혈관생성을 활성화 또는 억제할 수 있으며 혈관생성을 감소 또는 증가시키는 전략을 제안하였다. 상기 문헌은 전-혈관 생성 물질로서 네트린-1 수용체 또는 이의 절편의 용도 및 네트린-1 수용체 및 전-혈관생성 폴리펩타이드와 같은 면역글로불린의 Fc 절편을 포함하는 융합 단백질을 개시하였다. 상기 문헌은 네트린-1 유도된 항 종양생성 효과는 UNC5H2 (소위 UNC5B)와 같이, 이의 수용체에 네트린-1의 차단 유효성(availability)에 의해 역전될 수 있으며 네트린-1 수용체 활성의 억제(inhibiting) 또는 차단(blocking)은 강한 혈관생성을 유도함을 교시하였다. WO2010/059821은 UNC5B가 대기 성인 혈관(quiescent adult vasculature)에서 하위-조절되나, 이식된 종양에서 혈관생성이 시작하는 동안 재발현되며, 작용제(네트린-1)와 함께 UNC5B를 발현하는 네오베슬(neovessels)의 자극은 혈관생성을 억제하였고 UNC5B의 기능의 유전적 손실은 혈관생성 억제와 매개된 네트린-1을 감소시킬 수 있음을 개시하였다. 상기 문헌은 UNC5B 활성화가 혈관생성 시작을 억제하며 UNC5B가 잠재적 항-혈관생성 목표임을 제시하였다. 상기 문헌은 이후 항-혈관생성제로서 및 암과 같이 비정상정 혈관생성에 의해 특징화되는 질병을 치료하는 제제로서, UNC5B 활성화를 억제시키거나 이의 수용체에 네트린-1의 결합을 억제하는 항-UNC5B 항체의 용도를 제안하였다. WO2006/054000은 항-혈관생성제로서 항-네트린-1 항체의 용도 및 암 치료를 위한 조성물 내 이의 용도를 개시하였다. 상기 문서 모두는 기존의 화학 요법 약물에 항-UNC5B 또는 항-네트린-1 항체를 조합하는 것을 추가적으로 제안한다. 이들 모순되는 공개 문헌에 일치하는 실험 결과의 부재에, 통상의 기술자는 잠재적 항 종양 활성에 혈관생성에 단독으로 항-네트린-1 또는 항-UNC5H2 항체의 발생에 대한 명확한 가르침에 도달하기 어렵다. 또한 혈관을 형성하는 대기 내피 세포(quiescent endothelial cells)가 아닌 증식 종양 세포에 영향을 주는 것으로 알려진 화학 요법 약물 및 항-네트린-1 또는 항-UNC5H2 항체에 기초한 항-혈관생성 치료 사이에 생물학적 연결을 만드는 것은 통상의 기술자에게 어렵다.

본 발명은 그러나 종양 세포에 의한 스트레스 반응의 결과로서, 네트린-1에 종양 세포 생존에 대한 의존성을 증가시키는 네트린-1 방해에 기초한 치료 및 화학 요법 약물을 조합하는 것에 대한 생물학적 근거를 제공한다.

실제로, 조기 임상 평가 동안 네트린-1 방해에 기초한 치료를 받을 수 있는 암 환자 일부의 연구는 네트린-1 및 네트린-1 수용체 발현에 기존의 화학 요법 치료의 효과를 실험하도록 현재 발명자를 이끈다. 독소루비신(Doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil, 5FU), 파클리탁셀(paclitaxel, Taxol) 및 시스플라틴(Cisplatin)은 실제로 "전통적" 화학치료이며 여전히 유방, 폐, 직장 뿐만 아니라 국재화(localized) 및 진행된(advanced) 종양을 갖는 환자 모두에 고형 종양의 다른 형태에 광범위하게 사용된다. 그러나, 그들의 효율에도 불구하고, 전통적 제제의 사용은 독성 및 저항성의 출현에 의해 제한된다. 본 발명자들은 이들 화학 요법 치료가 비록 그들이 다른 세포 메커니즘에 작용하더라도 네트린-1 및 이의 수용체의 현저한 증가를 유발함을 여기에 보였다. 본 발명자들은 이러한 증가는 인비트로(in vitro)에서 네트린-1에 의한 증가된 세포 사멸 유도와 관련됨을 보였다. 결과적으로, 본 발명자들은 독소루비신과 약물 후보를 방해하는 네트린-1의 조합은 동물 모델에서 종양 성장을 억제하는 효과를 증가시킴(potentiates)을 보였다.

전임상 데이터는 통상적인 약물 더하기 네트린-1 방해의 조합은 통상적인 약물의 감소된 농도와 함께 예상치 못한 증가된 효과를 일으킬 수 있다는 관점을 지지함을 여기에 보였다. 함께 이들 데이터는 통상적인 화학 요법과 조합된 치료에 기초한 네트린-1 방해는 시너지적 항암 효과와 관련되는 근거를 지지한다. 네트린-1 방해에 기초한 치료는 첫째로 네트린-1/수용체 결합을 억제해야하는 세포자멸(apoptosis) 또는 세포 사멸의 유도(소위 네트린-1 수용체 유도된 세포자멸), 둘째로 네트린-1 및/또는 수용체 발현에 화학 요법 유도된 증가의 잠재적으로 해로운 효과가 네트린-1/수용체 결합 및 이의 항-세포자멸 효과의 억제에 의해 평형되는(counter-balanced), 두가지 양성 효과를 갖는 것으로 보인다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클(vehicle) 내에, 화학 요법 약물 및 네트린-1 방해 약물 또는 인비보(in vivo)에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서, 조성물 및 방법은 네트린-1을 발현 또는 과발현하는 암의 치료를 위한 것이며, 상기 이러한 발현 또는 과발현은 암 그 자체에 연결되거나 화학 요법 약물 치료 단독, 또는 모두에 의해 유도된다.

본 발명의 목적은 화학 요법 약물 및 네트린-1 방해 약물 또는 인비보(in vivo)에서 네트린-1 방해 약물을 발현하는 벡터를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 조합된 항암 치료 방법이다. 화학 요법 약물 및 네트린-1 방해 약물은 효과적인 양이다.

본 발명의 다른 목적은 환자에게 화학 요법 약물과 함께 조합하여 사용되는 항암 약제(medicament)로서 용도를 위한 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물이다. 본 발명은 또한 화학 요법 약물로 치료되는 환자에게 항암 약제로서 용도를 위한 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인비보에서 네트린-1 방해 약물 또는 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터와 조합하여 환자에게 사용되는 항암 약제로서 용도를 위한 화학 요법 약물을 포함하는 조성물이다. 본 발명은 또한 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터로 치료되는 환자에게 항암 약제로서 용도를 위한 화학 요법 약물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 환자에게 동시에, 별도로(separate) 또는 순차적인 투여를 위해, 화학 요법 약물 및 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물 또는 파트(parts)의 키트에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 항암 약제 또는 항암 치료로서 사용을 위해, 환자에게 동시에, 별도로 또는 순차적인 투여를 위해, 화학 요법 약물 및 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물 또는 파트의 키트이다.

본 발명의 다른 목적은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클(vehicle) 내에, 화학 요법 약물 및 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항암 약제로서 사용을 위해, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 내에, 화학 요법 약물 및 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물이다.

또 다른 목적은 화학 요법 약물과 함께 환자의 조합된 치료를 위한 항암 약제의 제조를 위한 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터의 용도이다.

또 다른 목적은 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터와 함께 환자의 조합된 치료를 위한 항암 약제의 제조를 위한 화학 요법 약물의 용도이다.

또 다른 목적은 조합된 항암 약제의 제조를 위한 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터 및 화학 요법 약물의 용도이다.

또 다른 목적은 환자에게 동시에, 별도로 또는 순차적 투여를 위한, 조합된 항암 약제 조성물 또는 파트의 키트의 제조를 위한 네트린-1 방해 약물 또는 인비보에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터 및 화학 요법 약물의 용도이다.

본 발명의 중요한 특징에 따르고 하기 추가적 설명과 같이, 화학 요법 약물은 암 세포 내 네트린-1의 과발현을 유도하는 약물이며 네트린-1 방해 약물은 네트린-1 수용체 유도된 세포 자멸 또는 세포 사멸을 촉진한다.

환자는 포유 동물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간이다.

요법적 치료는 예방(prophylaxy) 및 치료(therapy)를 망라한다.

이들 목적에 대한 보다 상세한 실시예에 대해서 설명한다.

화학 요법 약물은 특히 암 세포 내 네트린-1의 과발현을 유도하는 약물이다. 약물이 네트린-1 과발현을 유도하는 결정은 세포 라인 또는 생체 검사(biopsy)로부터 세포와 같이, 어떠한 암 세포에도 쉽게 수행될 수 있다. 실시예에서, 분석은 생체 검사로부터 예시에 대해, 치료되는 암으로부터 세포에서 수행된다. 다른 실시예에서, 분석은 치료되는 암에 대한 대표적인 세포 라인과 같은 세포에서 수행된다. 다른 실시예에서, 분석은 A549 또는 H460 세포 라인에서 만들어진다. 분석은 화학 요법 약물이 처리된 세포 및 처리되지 않은 세포 사이에 네트린-1 유전자 발현을 비교하는 것을 포함할 수 있다. 발현은 예를 들어 본 발명에 개시되고 제공된 프라이머(SEQ ID NO: 11 및 12)를 사용하여, PCR, 특히 정량적 RT-PCR로 측정될 수 있다. 이러한 과발현을 유도하는 그들의 패밀리에서 약물의 분류는 도 1을 참조하여, A549 또는 H460 세포 라인에 하기 대상 및 방법(Material and Method)에서 셜명된 방법에 따라 간단하게 수행될 수 있다.

화학 요법 약물은 특히 세포독성 약물이다.

일부 바람직한 실시예에서, 약물은 독소루비신, 5-플루오로우라실(5FU), 파클리탁셀(예를 들어 탁솔(Taxol)), 또는 시스플라틴이다.

실시예에서, 약물은 세포독성 항생제이다. 세포독성 항생제는 액티노마이신(actinomycin), 안트라사이클린(anthracycline), 블레오마이신(bleomycin), 플리카마이신(plicamycin) 또는 미토마이신(mitomycin)일 수 있다. 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 이다루비신(idarubicine) 또는 에피루비신(epirubicine)일 수 있다.

실시예에서, 약물은 알킬화제이다. 알킬화제는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatine)과 같은 플래티넘 유도체 또는 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 이포스파마이드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 티오테파(thiotepa)와 같은 알킬화제일 수 있다. 다른 분류(classes)는 에피포도필로톡신(epipodophylotoxines), 예를 들어 에토포사이드(etoposide), 토포이소머라제 억제자(캠프토테신(camptotecines)), 예를 들어 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), DNA의 마이너 그루브의 알킬화제, 예를 들어 트라벡테딘(Trabectedine)(YONDELIS), 메토트레세이트(methotrexate), 페메트렉시드(pemetrexed), 랄티트렉스드(raltitrexed)를 포함한다.

실시예에서, 약물은 탁센(taxane) 또는 다른 튜불린(tubulin) 타게팅 제제이다. 탁센은 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel) 또는 에리불린(eribuline, 최근 유방암에 증명됨)일 수 있다.

실시예에서, 약물은 하기와 같은 항종양제(antineoplastic agent)이다:

- 유방 호르몬 치료제: 예를 들어 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑시메스탄, 파스로덱스;

- 전립선 호르몬 치료제: 예를 들어 LHRH 길항제, 비칼루타마이드(bicalutamide), 아비라테론(abiraterone);

- 단일클론 항체: 예를 들어 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 베바시주맙(bevacizumab);

- 인산화효소 억제자: 예를 들어 이마티닙(imatinib), 닐로티닙(nilotinib), 다사티닙(dasatinib), 에를로티닙(erlotinib), 게피티닙(gefitinib), 아파티닙(afatinib), 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 파조페닙(pazopanib), 크리조티닙(crizotinib), 액시티닙(axitinib).

본 발명은 화학 요법 약물의 복용량 요법(regimen)의 변화를 암시하거나 하지 않을 수 있다. 그러나, 네트린-1 방해 약물과 함께 발생하는 시너지는 환자에게 낮은 복용량 요법을 사용하는 것을 허용할 수 있다. 숙련된 기술자는 본 발명에 제공된 조합된 치료의 맥락에서 최적의 복용량 요법을 결정할 수 있다.

본 발명은 또한 치료 과정에 적어도 두 화학 요법 약물이 병합된 의미에서, 상기 화학 요법이 이미 조합된 화학 요법인 환자의 조합된 치료에 관한 것이다. 즉 본 발명의 다른 목적에 따르는 방법, 조성물, 파트의 키트 및 용도는 적어도 하나의 네트린-1 방해 약물 및 적어도 두(예를 들어 2, 3, 4 또는 5) 화학 요법 약물을 조합한다.

네트린-1 방해 약물은 네트린-1 수용체와 상호 작용하는 네트린-1 능력을 방해하거나 네트린-1 수용체의 이량체화(dimerization) 또는 다량체화(multimerization)를 유도하는 네트린-1의 능력을 방해하거나, 더욱 일반적으로 네트린-1 수용체 유도된 세포자멸을 촉진하는 약물이다. 통상의 기술자는 네트린-1 수용체 유도된 세포자멸이 촉진되는, 네트린-1 및 이의 수용체 사이의 방해, 네트린-1 및 수용체 사이의 상호작용 또는 결합의 감소 또는 억제, 또는 네트린-1 수용체의 이량화 또는 다량화를 유도하는 네트린-1의 능력의 감소 또는 억제를 개시한 WO2007/099133를 참조할 수 있다.

실시예에서, 이는 이중 가닥 RNA (dsRNA) (즉 10 내지 50 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있음)이며 네트린-1을 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 또는 siRNA이다. 첫번째 가닥의 일부는 목표 유전자에 상보적이다, 즉 이는 목표 유전자에 혼성화하기 충분한 상보성, 예를 들어 목표 유전자 또는 이의 일부에 적어도 80% 상동성을 갖는다. AP: 인간 네트린-1 mRNA 서열 접근 번호(accession　number): NM_004822. 사용될 수 있는 siRNA 서열: 서열 NM_004822의 위치 94-114에 상응하는 SEQ ID NO: 10 AAGCUGGACGCAGCAUGAUGC (센스(sense)).

두번째 실시예에서, 방해 약물은 네트린-1에 결합하는 하나이며 네트린-1은 방해 약물의 결합 또는 네트린-1 수용체, 특히 DCC 및/또는 UNC5의 이량화/다량화 유도에 의해 이의 수용체에 결합할 수 없도록 만들어진다. 실시예에서, 이러한 약물은 네트린-1에 결합하는 항체이다. 이는 특히 네트린-1에 결합하는 다중클론 또는 단일클론 항체이다. 다른 실시예에서, 이러한 약물은 네트린-1 수용체의 세포외 도메인 또는 상기 세포외 도메인의 절편을 포함하는 화합물이다. 예를 들어 네트린-1 수용체의 세포외 도메인 또는 상기 세포외 도메인의 절편의 아미노산 서열은 UniProt Sequence ID　[세포외 도메인 위치 범위]: UNC5A　: Q6ZN44 [aas 26-306, 또는 절편 34-240]; UNC5B　: Q8IZJ1 [aas 27-377 또는 절편 29-244]; UNC5C　: O95185 [aas 41-380 또는 절편 61-258]; UNC5D　: Q6UXZ4 [aas 33-379]; DCC　: P43146 [aas 26-1097]에 주어졌다. 이러한 약물은 네트린-1에 결합할 수 있다. 네트린-1 수용체는 DCC, UNC5A, UNC5B, UNC5C 또는 UNC5D일 수 있다. 본 발명의 방법은 다른 네트린-1 수용체로부터, 세포외 도메인 또는 이의 일부를 각각 포함하는 둘 또는 그 이상의 화합물을 만들 수 있다. 예를 들어, 약물은 DCC로부터 및 UNC5, 예를 들어 UNC5A로부터, 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 두 화합물을 포함한다.

세번째 실시예에서, 방해 약물은 네트린-1 수용체에 결합하는 하나이다. 네트린-1 수용체는 DCC, UNC5A, UNC5B, UNC5C 또는 UNC5D일 수 있다. 본 발명의 방법은 각각 다른 네트린-1 수용체에 결합하는 둘 또는 그 이상의 방해 약물을 만들 수 있다. 예를 들어, 약물은 두 방해 약물, DCC에 결합하는 하나 및 UNC5, 예를 들어 UNC5A에 결합하는 다른 것을 포함할 수 있다. 실시예에서, 이러한 약물은 네트린-1 수용체에 결합하는 항체이다. 이는 바람직하게 네트린-1 수용체에 특이적으로 결합하는 다중클론 또는 단일클론 항체이다. 다른 실시예에서, 이러한 약물은 네트린-1 수용체에 결합할 수 있는 화합물, 특히 펩타이드 부분(moiety), 또는 작은 분자를 포함하며, 이러한 결합은 네트린-1 수용체에 의해 세포자멸 유도를 차단하는, 특히 수용체의 이량화 또는 다량화를 유도하는 네트린-1 능력을 방지할 수 있는 화합물이다.

"항체"는 네트린-1에 결합할 수 있는 어느 항체를 지정하는 넓은 의미로 사용되며, 상기 이러한 결합은 네트린-1 및 네트린 1 수용체 사이의 결합을 지연시킨다.

"항체"는 목적하는 생물학적 활성을 보이는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 단일사슬 항체, 이들 항체의 항원 결합 절편을 포함한다. 단일클론 항체는 쥣과(murine), 키메라(chimeric) 또는 인간화(humanized)일 수 있다. 용어 "항체"는 상기 항체가 항원 화합물의 적어도 하나의 항원 결정기(determinant)에 결합하는 것을 허용하는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하거나, 구성하는, 어느 전체 길이 항체 또는 항체의 기능적 절편(유전자 조작에 의해 얻어지거나 그렇지 않음)을 말한다. 항체 절편의 예로서, 절편 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 단일 사슬 가변 절편 (scFv 사슬)을 들 수 있다. 본 발명에 사용된 항체는 항원에 특이적인 항체이다. 그들은 바람직하게 단일클론 항체 또는 단일 특이적(monospecific) 다중클론 항체이며, 즉 그들은 오직 하나의 에피토프(epitope)를 인지한다. 본 발명의 맥락에서 유용한, 단일클론 항체 또는 단일 특이적 다중클론 혈청, 또는 유전체 라이브러리 스크리닝을 통해 얻어진 항체의 생산은 통상적인 기술이다.

항-네트린 1 다중클론 항체는 그 중에서도 선택된 아미노산 서열의 도움과 함께 토끼, 쥐 등과 같은 동물을 면역화 수집 및 이후, 예를 들어 통상의 기술자에게 그 자체로 알려진 방법에 따른 수용체를 포함하는 면역 흡착제(immunoadsorbent)에서 얻어진, 항혈청을 감소시킴으로써 얻어질 수 있다.

네트린-1 아미노산 서열(신호 펩타이드가 없는)은 SEQ ID NO:13로 묘사된 것과 같으며 네트린-1은 항체를 설계하는데 전체 또는 일부로 사용될 수 있다.

일반적으로, 단일클론 항체는 Kohler and Milstein, (1975)에 설명된 림프절 융합 및 하이브리도마 배양의 통상적인 방법에 따라 수득될 수 있다. 단일클론 항체를 제조하는 다른 방법은 또한 알려져 있다 (Harlow et al., ed., 1988 "Antibodies: a laboratory manual"). 단일클론 항체는 포유동물(예를 들어, 쥐, 랫, 토끼 또는 인간 등)을 면역화하고 하이브리도마를 이끄는 림프절 융합 기술을 사용하여 제조될 수 있다 (Kohler and Milstein, 1975).

이러한 관습적인 기술에 대안 기술은이 존재한다. 예를 들어, 하이브리도마로부터 복제된 핵산을 발현시킴으로써 단일클론 항체를 생산하는 것이 가능하다. 또한 파지의 표면에 유전자 라이브러리 V를 보이는 전형적인 사상(filamentous) 파지인, 벡터로 항체에 대한 cDNAs를 도입하는 파지 디스플레이 기술에 의해 항체를 생산하는 것이 가능하다 (예를 들어 E. coli에 대한 fUSE5 Scott, 1990). 이들 항체 라이브러리를 건설하는 프로토콜(Protocols)은 Marks et al. (1991)에 개시되었다. 신호 서열 (SEQ ID NO: 14)을 갖는 전체 길이 네트린-1 또는 이의 적절한 절편에 상응하는 cDNA는 이들 방법에 따라 단일클론 항체를 생산하는데 사용되었다.

바람직한 실시예에서, 방해 약물은 네트린-1 수용체의 세포외 도메인 또는 상기 세포외 도메인의 절편을 포함한다. 네트린-1 수용체는 DCC, UNC5A, UNC5B, UNC5C 또는 UNC5D일 수 있다.

실시예에서, 세포외 도메인 또는 이의 일부는 항체 Fc 일부에 결합된다. 바람직한 실시예에서, Fc 일부는 인간 IgG의 Fc 또는 이의 일부이다. 인간 IgG는 즉 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3일 수 있다. 바람직한 실시예에서 IgG는 IgG1이다.

실시예에서, 융합 단백질은 단일 사슬이며, 이는 각각 DCC의 넷째 또는 다섯째 피브로넥틴 유사 도메인 또는 UNC5 및 화합물의 약학적 파라미터(parameters)를 향상시키는 펩타이드 또는 단백질 서열의 두 Ig-유사 도메인을 포함하거나 이루어지는 단백질이 DCC 또는 UNC5 절편으로 이루어짐을 의미한다.

다른 바람직한 실시예에서, 융합 단백질은 이중 사슬이며, 이는 융합 단백질이 각각 DCC의 네번째 또는 다섯번째 피브로넥틴 유사 도메인 또는 UNC5 및 항체 Fc 일부의 두 Ig 유사 도메인을 각각 포함하거나 이루어지는 두 사슬로 이루어짐을 의미하며, 상기 두 사슬은 바람직하게 하나 또는 그 이상, 예를 들어 둘, 이황화결합으로 서로 연결된다.

실시예에서, 약물은 DCC의 다섯번째 피브로넥틴 도메인 (Fn5 또는 5Fbn)을 포함한다. 바람직하게, 약물은 항체 Fc 일부에 융합된 이러한 Fn5를 포함하는 DCC-융합 단백질을 포함한다. 바람직한 실시예에서, Fc 일부는 인간 IgG의 Fc 또는 이의 일부이다. 인간 IgG는 즉 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3일 수 있다. 바람직한 실시예에서, IgG는 IgG1이다. DCC 유전자는 예를 들어 NCBI로부터, ID 1630 (2012년 7월 14일에 업데이트됨) 하에 가능하며, 이는 2012년 7월 11일에 업데이트된 Uniprot P43146과 같은 DCC 수용체 단백질을 코딩한다. 본 발명에서 유용하며 Fn5를 포함하는 DCC 융합 단백질은 WO2012025618에서 설명되었다. 실시예에서, 융합 단백질은 WO2012025618에 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2, 3 또는 4를 가진다. 실시예에서, 융합 단백질은 WO2012025618에 DNA 서열 SEQ ID NO: 1에 의해 코딩된다. Fn5를 포함하는 융합 단백질의 다른 예시는 WO2007099133, Fitamant et al. (14) 및 Delloye-Bourgeois (16)에서 설명된 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (DCC-5Fbn-GST)를 갖는 DCC-5-피브로넥틴 융합 단백질이다.

실시예에서, 약물은 UNC5의 두 Ig 유사 도메인을 포함한다. 바람직하게 약물은 항체 Fc 일부에 융합된 UNC5의 두 Ig 유사 도메인을 포함하는 UNC5-융합 단백질을 포함한다. 인간 IgG는 즉 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3이다. 바람직한 실시예에서, IgG는 IgG1이다. 실시예에서, UNC5는 UNC5A이다. 다른 실시예에서, UNC5는 UNC5B이다. 다른 실시예에서, UNC5는 UNC5C이다. 또 다른 실시예에서, UNC5는 UNC5D이다.

실시예에서, UNC5A 융합 내 UNC5A 단백질은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 20 내지 217을 포함하거나 구성된다. 융합 단백질은 추가로 SEQ ID NO: 1의 아미노산 220 내지 446을 포함하거나 구성되는 IgG1을 포함할 수 있다. Fc는 예를 들어 GT와 같은 연결자를 통해, UNC5A 단백질에 융합된다. 실시예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1: 카파2(Kappa2) 신호 펩타이드 서열: aas 1 내지 19; UNC5A의 Ig 유사 도메인: aas 20 내지 217; 연결자(Linker): aas 218-219; 인간 IgG1 Fc: aas 220 내지 446의 아미노산 서열을 포함하거나 구성되는 UNC5A 단백질의 UNC5A- 융합에 관련된다. 실시예에서, 성숙 융합 단백질은 카파2 신호 펩타이드 서열을 포함하지 않는다. 바람직한 실시예에서, 융합 단백질은 이중 사슬이다. 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1의 아미노산 20-446 또는 20-217 아미노산 서열 전체 길이에, 동일하거나 90% 이상, 바람직하게 96, 95, 94, 93, 92 또는 91% 이상, 상동성의 백분율을 갖는 변이체 서열을 포함한다. 아미노산 치환은 예를 들어 SEQ ID NO: 1 또는 20-217 아미노산 서열의 전체 길이에 9, 72, 74, 87, 144, 164, 170, 193 및/또는 210 위치의 하나 또는 몇몇에 발생할 수 있다.

다른 실시예에서, UNC5B-융합 내 UNC5B 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 20 내지 215를 포함하거나 구성된다. 융합 단백질은 추가적으로 SEQ ID NO: 2의 아미노산 218 내지 444를 포함하거나 구성되는 IgG1 Fc를 포함할 수 있다. Fc는 예를 들어, GT와 같은 연결자를 통해, UNC5A 단백질에 융합된다. 실시예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2: 카파2(Kappa2) 신호 펩타이드 서열: aas 1 내지 19; UNC5B의 Ig 유사 도메인: aas 20 내지 215; 연결자(Linker): aas 216-217; 인간 IgG1 Fc: aas 218 내지 444의 아미노산 서열을 포함하거나 구성되는 UNC5B 단백질의 UNC5B- 융합에 관련된다. 실시예에서, 성숙 융합 단백질은 카파2 신호 펩타이드 서열을 포함하지 않는다. 바람직한 실시예에서, 융합 단백질은 이중 사슬이다. 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 20-444 또는 20-215 아미노산 서열의 전체 길이에, 동일하거나 90% 이상, 바람직하게 96, 95, 94, 93, 92 또는 91% 이상의 상동성의 백분율을 갖는 변이체 서열을 포함한다. 아미노산 치환은 예를 들어 SEQ ID NO: 2 또는 20-215 아미노산 서열의 전체 길이에 위치 29, 74, 100, 109, 113, 146, 149, 155, 172, 184, 189, 201, 213 및/또는 214의 하나 또는 몇몇에 발생할 수 있다.

또 다른 실시예에서, UNC5C-융합 내 UNC5C 단백질은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 20 내지 217을 포함하거나 구성된다. 융합 단백질은 추가적으로 SEQ ID NO: 3의 아미노산 220 내지 446을 포함하거나 구성되는 IgG1 Fc를 포함할 수 있다. 이러한 Fc는 예를 들어 GT와 같은 연결자를 통해, UNC5A 단백질에 융합된다. 실시예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3: 카파2 신호 펩타이드 서열: aas 1 내지 19; UNC5C의 Ig 유사 도메인: aas 20 내지 217; 연결자: aas 218-219; 인간 IgG1 Fc: aas 220 내지 446의 아미노산 서열을 포함하거나 구성되는 UNC5C 단백질의 UNC5C 융합에 관련된다. 실시예에서, 성숙 융합 단백질은 카파2 신호 펩타이드 서열을 포함하지 않는다. 바람직한 실시예에서, 융합 단백질은 이중 사슬이다. 본 발명은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 20-446 또는 20-217 아미노산 서열의 전체 길이에, 동일하거나 90% 이상, 바람직하게 96, 95, 94, 93, 92 또는 91% 이상의 상동성의 백분율을 갖는 변이체 서열을 포함한다. 아미노산 치환은 예를 들어 SEQ ID NO: 3 또는 20-217 아미노산 서열의 전체 길이에 위치 33, 66, 109, 129, 136, 178, 189 및/또는 211의 하나 또는 몇몇에 발생할 수 있다.

또 다른 실시예에서, UNC5D 융합 내 UNC5D 단백질은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 20 내지 217을 포함하거나 구성된다. 융합 단백질은 추가적으로 SEQ ID NO: 4의 아미노산 220 내지 446을 포함하거나 구성되는 IgG1을 포함할 수 있다. Fc는 예를 들어 GT와 같은 연결자를 통해, UNC5A 단백질에 융합된다. 실시예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 4: 카파 2 신호 펩타이드 서열: aas 1 내지 19; UNC5D의 Ig 유사 도메인: aas 20 내지 217; 연결자: aas 218-219; 인간 IgG1 Fc: aas 220 내지 446의 아미노산 서열을 포함하거나 구성되는 UNC5D 단백질의 UNC5D 융합에 관련된다. 실시예에서, 성숙 융합 단백질은 카파2 신호 펩타이드 서열을 포함하지 않는다. 바람직한 실시예에서, 융합 단백질은 이중 사슬이다. 본 발명은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 20-446 또는 20-217 아미노산 서열의 전체 길이에, 동일하거나 90% 이상, 바람직하게 96, 95, 94, 93, 92 또는 91% 이상의 상동성의 백분율을 갖는 변이체 서열을 포함한다. 아미노산 치환은 예를 들어 SEQ ID NO: 4 또는 20-217 아미노산 서열의 전체 길이에 위치 38, 79, 80, 115, 131, 178, 186, 201 및/또는 212의 하나 또는 몇몇에 발생할 수 있다.

본 발명은 하기 핵산 분자를 제공한다:

- SEQ ID NO: 5 코딩 UNC5A 단백질; nt (뉴클레오티드); nt 1-6 HindIII 제한 부위, nt 7-15 코작(kozak) 서열, nt 16-72 카파2 신호 펩타이드, nt 73-666 UNC5A 코딩 서열, nt 667-672 XpnI 제한 부위;

- SEQ ID NO: 6 코딩 UNC5B 단백질; nt (뉴클레오티드); nt 1-6 HindIII 제한 부위, nt 7-15 코작 서열, nt 16-72 카파2 신호 서열, nt 73-660 UNC5B 코딩 서열, nt 661-666 XpnI 제한 부위;

- SEQ ID NO: 7 코딩 UNC5C 단백질; nt (뉴클레오티드); nt 1-6 HindIII 제한 부위, nt 7-15 코작 서열, nt 16-72 카파2 신호 서열, nt 73-666 UNC5C 코딩 서열, nt 667-672 XpnI 제한 부위;

- SEQ ID NO: 8, 코딩 an UNC5D 단백질; nt (뉴클레오티드); nt 1-6 HindIII 제한 부위, nt 7-15 코작 서열, nt 16-72 카파2 신호 서열, nt 73-666 UNC5C 코딩 서열, nt 667-672 XpnI 제한 부위;

- 위치 1-6에 Kpnl 제한 부위 및 위치 694-699에 Xbal 제한 부위를 갖는, SEQ ID NO: 9 코딩 인간 IgG1 Fc (힌지(hinge) + CH2 + CH3 DNA 서열, nt 7-693).

본 발명의 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다. 그들은 또한 올리뉴클레오티드 티오포스페이트(oligonucleotide thiophosphates), 치환된 리보 올리고뉴클레오티드(substituted ribo-oligonucleotides), LNA(Locked nucleic acid) 분자, PNA(펩타이드 핵산) 분자, GNA(글리콜 핵산) 분자, TNA(트레오스 핵산) 분자, 몰폴리노 폴리뉴클레오티드(morpholino polynucleotides), 또는 안타고미르(antagomir)(콜레스테롤 결합된) 핵산 분자와 같은 핵산 유사체(analogues) 또는 기술분야에 알려진 이의 어느 변형일 수 있다 (변형의 예시로서, 예를 들어 US 5,525,711, US 4,711,955, US 5,792,608 또는 EP 302 175 참조). 본 발명의 맥락에서 핵산 분자는 자연 발생 핵산 잔기 또는 인공적으로 생산된 핵산 잔기일 수 있다. 핵산 잔기의 예시는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 티민 (T), 우라실 (U), 잔틴 (X), 및 하이포잔틴 (HX)이다. 본 발명의 맥락에서, 티민 (T) 및 우라실 (U)은 핵산 분자의 각각 형태에 의존하여 교환하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이, DNA의 일부로서 티민 (T)은 전사된 mRNA에 상응하는 일부로서 우라실 (U)에 대응한다. 본 발명의 핵산 분자는 다른 표시가 없다면, 크기에 제한 없이, 단일 또는 이중 가닥, 선형 또는 원형, 자연 또는 합성일 수 있다. 핵산 분자는 또한 하기 본 발명에 추가적으로 설명된 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 상동성(homologous) 또는 이종성(heterologous)일 수 있다. 바람직한 실시예에서 본 발명에 제공된 핵산 분자는 이러한 프로모터의 통제 하에 있다.

일반적으로, 본 발명에 사용된, 본 발명에 제공된 서열의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 핵산 서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 벡터로 복제될 수 있다. 통상의 기술자는 본 발명에서 수행하는 데 사용될 수 있는, 벡터 및 벡터를 제조하는 방법 및 그들의 용도를 개시한 WO2007/099133를 참조할 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "벡터"는 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 및 유전 공학에 일반적으로 사용되는 다른 벡터를 말한다. 바람직한 실시예에서, 이들 벡터는 세포, 진균 세포와 같은 진핵 세포, 효모 또는 원핵 세포와 같은 미생물의 세포의 형질전환에 적합하다. 특히 바람직한 실시예에서, 이러한 벡터는 박테리아 세포의 안정한 형질전환에, 예를 들어 본 발명의 핵산 분자를 전사하는 데 적합하다. 예를 들어 벡터는 pUC18일 수 있다. 특히, WO2007/099133는 WO2007/099133의 실시예 1에 7800 및 7809 처럼 식별된 벡터와 같은, DCC에 기초한 융합 단백질을 발현하는 벡터를 개시한다. 따라서 본 발명은 DCC 융합 단백질에 대해, WO2012025618에 SEQ ID NO: 2, 3 또는 4의 융합 단백질을 코딩하는 벡터, 또는 WO2012025618에 벡터 DNA 서열 SEQ ID NO: 1을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 설명되고 제공된 융합 단백질을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 pUC18과 같은 벡터를 제공한다. UNC5에 관한 것 까지, 따라서 본 발명은 함께 융합된 SEQ ID NO: 1의 아미노산 20-217 및 220-446, 또는 서열 SEQ ID NO: 1; 함께 융합된 SEQ ID NO: 2의 아미노산 20-215 및 218-444, 또는 서열 SEQ ID NO: 2; 함께 융합된 SEQ ID NO: 3의 아미노산 20-217 및 220-446, 또는 서열 SEQ ID NO: 3; 또는 함께 융합된 SEQ ID NO: 4의 아미노산 20-217 및 220-446, 또는 서열 SEQ ID NO: 4를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 pUC18과 같은 벡터와 관련된다. 특히, 본 발명은 SEQ ID NO : 5의 뉴클레오티드 서열 73-666, 또는 SEQ ID NO : 6의 73-660, 또는 SEQ ID NO : 7의 73-666 또는 SEQ ID NO : 8의 73-666을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 pUC18과 같은 벡터를 제공한다. 또한 이들 벡터는 SEQ ID NO : 9의 뉴클레오티드 서열, 특히 뉴클레오티드 7-693을 포함한다. 일반적으로, 벡터는 진핵 숙주 세포 내 상기 핵산 분자를 발현할 수 있다.

제공된 벡터는 발현 벡터이다. 일반적으로, 발현 벡터는 문헌(literature)에서 광범위하게 설명되었다. 발현 벡터는 선발 표지(selection marker) 유전자 및 숙주 내 복제를 보정하는 복제 원점을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 프로모터를 포함할 수 있다. 그(He)는 추가적으로 전사를 위한 말단 신호를 포함할 수 있다. 프로모터와 말단 신호 사이에, 바람직하게는 발현을 목적으로 하는 핵산 서열/분자의 삽입이 가능한 적어도 하나의 제한 부위 또는 다중연결자(polylinker)가 있다. 실시예에서, 벡터는 인비보(in vivo)에서 단백질을 발현할 수 있으며, 상기 벡터가 환자에게 투여되면 인시추(in situ)에서 단백질을 발현할 수 있다.

본 발명에 제공된 벡터가 본 발명의 맥락에서 적절하게 수행되는 프로모터를 이미 포함하는 선행기술에서 알려진 발현 벡터의 장점을 가지고 발생될 때, 예를 들어 본 발명에 설명된 UNC5-융합 단백질의 발현, 결과(resulting) 벡터가 바람직하게 본 발명의 맥락에서 적절하게 수행되는 오직 하나의 프로모터를 포함하는 환경에서 핵산 분자가 벡터로 삽입되는 것으로 이해된다. 프로모터는 일반적으로 동종성 또는 이종성일 수 있다. 본 발명에 설명된 벡터는 또한 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있으며, 각각 프로모터는 이종성 또는 동종성일 수 있다. 통상의 기술자는 어떻게 이러한 삽입이 실행될 수 있는지 알 것이다. 예를 들어, 프로모터는 핵산 구조 또는 결합 전 발현 벡터로부터 절단될 수 있다.

본 발명에 따른 단백질은 바람직하게 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게, 단백질 발현은 차후 폴리펩타이드의 분리 및 약학적으로 허용가능한 순도로 보통 정제를 갖는 진핵 세포 내이다. 단백질 발현을 위해, 단백질을 코딩하는 핵산은 일반적인 방법에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 발현은 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포와 같이 적절하게 안정적인 진핵 숙주 세포에서 수행되며, 단백질은 세포(용해 이후 상청액 또는 세포)로부터 회복된다. HEK293 세포는 이러한 목적에 매우 적합한 것으로 나타나며 특정한 실시예를 형성한다.

실시예에서, 본 발명의 핵산 분자 및/또는 본 발명에 설명된 폴리뉴클레오티드에 복제된 벡터는 숙주 세포로 형질도입(transduced), 형질전환(transformed) 또는 감염(transfected) 또는 다른 방법으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포, 바람직하게는 진핵 세포이다. 비제한적 예시로서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명에 설명된 숙주 세포는 본 발명에 설명되고 제공된 UNC5-융합 단백질을 발생키는데 특히 유용한 것이다.

일반적으로, 상기 본 발명에 설명된 숙주 세포는 본 발명에 제공된 핵산 분자 또는 본 발명에 설명된 벡터 또는 이러한 세포로부터 유도된 세포를 포함하며 본 발명에 설명된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포, 바람직하게 진핵 세포일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 숙주 세포, 즉 본 발명의 핵산 분자 또는 이러한 방식으로 본 발명에 설명된 벡터와 함께 유전적으로 변형된 것은 포함하며 이는 유전체에 통합된 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 설명된 이러한 숙주 세포는 인간, 효모, 또는 진균 세포일 수 있다. 특정한 일 양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 핵산 분자를 전사할 수 있다. 예를 들어 본 발명에 설명된 숙주 세포를 발생시키는데 사용되는 발현 시스템에 다르게 상응하는 실시예의 개관(overview)은 Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, in Bitter (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)에, Sawers (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463)에, 및 Griffiths (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)에 포함된다. 본 발명의 핵산 분자 또는 본 발명에 설명된 벡터로 숙주 세포의 형질 전환 또는 유전자 조작은 예를 들어 Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CHS Press, Cold Spring Harbor, NY USA ; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990에 설명된 일반적인 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 제공된 핵산 분자 또는 본 발명에 설명된 벡터를 포함하는 숙주 세포는 HEK293 세포 또는 HEK293-프리스타일 세포(Freestyle cell) (인간 배아 신장 세포 라인 293 (Human embryonic kidney cell line 293), Invitrogen)일 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명에 제공되고 설명된 DCC 및 UNC5 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 적절한 숙주 세포 내 본 발명에 제공되고 설명된 핵산 분자를 발현하는, 특히 본 발명에 설명된 것처럼, 및 상기 세포 또는 세포 배양물 상청액으로부터 DCC 또는 UNC5-융합 단백질을 회복하는 단계를 포함한다.

본 발명은 네트린-1 방해 약물을 포함하는 조성물에 관련된다. 이는 특히 본 발명에 제공된 DCC 및/또는 UNC5-융합 단백질을 포함하는 조성물 또는 DCC 및/또는 UNC5-융합 단백질을 코딩하는 인비보 발현 벡터와 관련된다. 또한 이는 특히 항-네트린 1 항체를 포함하는 조성물과 관련된다. 이들 조성물은 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 약학적 공동 성분(co-ingredient) 또는 약(pharmaceutical)으로 사용될 수 있으며 화학 요법 약물과 조합하거나 동일한 환자에게 치료를 위해 사용되는, 약학적 조성물 또는 약제(medicament)를 형성한다.

실시예에서, 본 발명에 제공된 DCC 및/또는 UNC5-융합 단백질 또는 DCC 및/또는 UNC5-융합 단백질을 코딩하는 인비보 발현 벡터 및 화학 요법 약물 모두는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제와 함께 동일한 조성물 내에 있다.

다른 실시예에서, 그들은 분리된 약학적 형태 하에 존재한다. 이는 환자에게 동시에, 별도로 또는 순차적인 투여를 위해, 화학 요법 약물 및 네트린-1 방해 약물을 포함하는 조성물 또는 일부의 키트를 형성한다.

치료 방법, 용도 및 사용을 위한 조성물의 실시예에서, 투여는 순차적이다. 바람직한 실시예에서, 화학 요법 약물은 우선, 네트린-1 방해 약물이 이후에 투여된다. 양쪽 투여 사이에 간격은 적어도 5, 10, 15, 20 또는 24 시간, 바람직하게 24 및 96 시간 사이, 더욱 바람직하게 24 및 72 시간 사이, 특히 24 및 48시간 사이, 예를 들어 24시간일 수 있다. 실시예에서, 네트린-1 방해 약물은 화학 요법 약물의 투여 다음 날 단순히 투여된다.

이들 다른 약학적 형태들은 충분한 양으로, 본 발명의 치료 방법에 사용될 수 있다.

적절한 약학적 담체의 예시는 기술분야에 공지되었다. 그들은 포스페이트 버퍼 식염수 용액, 물, 오일/워터 에멀전과 같은 에멀전, 습윤제의 다양한 형태, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 약학적 조성물은 알려진 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

이들 약학적 조성물은 적절한 투여량, 즉, 네트린-1 방해 약물에 대해 적어도 1 mg/kg 체중, 예를 들어 약 10 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 암이 있는 개체의 중량으로 치료되는 개체에 투여될 수 있다. 화학 요법 약물은 보통의 투여량 또는 조합이 시너지 효과를 갖는 한 보통의 투여량에 비해 감소된 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어 화학 요법 약물의 투여량은 10, 20, 30, 40, 50%, 또는 그 이상 감소된다. 조성물의 투여는 다른 방법들, 예를 들어 경구로, (예를 들어 알약(pill), 정제(tablet), 버컬(buccal), 설하(sublingual), 붕해(disintegrating), 캡슐, 얇은 막, 액체 용액 또는 현탁액, 파우더, 고체 결정 또는 액체), 직장으로 (예를 들어 좌약, 관장제) 주사를 통해 (예를 들어 정맥 내(intravenously), 피하 (subcutaneously), 근육 내(intramuscularly), 복강 내(intraperitoneally), 피내(intradermally) 흡입을 통해 (예를 들어 기관지 내(intrabronchially)), 국소적(topically), 질(vaginally), 에피큐테니우스(epicutaneously), 비강내(intranasally)에 의해 영향을 받거나 투여될 수 있다. 복용량 요법(dosage regimen)은 주치 의사 및 임상적 요소에 의해 결정될 것이다. 의료 기술 분야에서 잘 알려진 것처럼, 어느 한 환자에게 투여량은 환자의 크기, 체면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별 투여 시간 및 경로, 일반적 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하는 많은 요소에 의존한다.

본 발명의 조성물 및 약학적 조성물은 국소적 또는 조직적(systemically)으로 투여될 수 있다. 투여는 정맥내 또는 피하로 되는 것이 바람직하다. 또한 조성물 및 약학적 조성물은 예를 들어 내부 또는 외부에 목표 부위에 바이오리스틱(biolistic) 전달을 통해 또는 동맥 내 부위에 카테터를 통해, 목표 부위에 직접적으로 투여될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제조는 멸균 수용성 또는 비수용성 용액, 현탁액, 및 에멀전을 포함한다. 비수용성 용액의 예시는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스터이다. 수용성 담체는 식염수 및 버퍼 매체(media)를 포함하는, 물, 알코올/수용성 용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트 링거, 또는 불휘발성 오일(fixed oils)을 포함한다. 정맥 주사 담체는 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (링거 덱스트로스에 기초한 것들과 같은) 등을 포함한다. 또한 보존제 및 다른 첨가제는 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등과 같이 존재할 수 있다. 나아가, 또한 상기 설명된 모범적 범위에 미달하거나 초과하는 투여량은 특히 전술된 요소를 고려하여, 구상중이다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 네트린-1 과발현 암을 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물에 관련된다.

암의 일부 실시예는 전이성 유방암(metastatic breast cancer), 비소형 폐암(non-small cell lung cancer), 공격적 신경아세포종(aggressive neuroblastoma), 췌장 선암(pancreatic adenocarcinoma), 1차 흑색종(primary melanoma) (n=7), 흑색종 전이(melanoma metastasis) (n=6), 난소암(ovarian cancers), 교아종(glioblastoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 공격적 B-세포 림프종(aggressive B-cell lymphoma), 육종(sarcoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 두경부암(head and neck cancers), 고환암(Testicular cancers) (예를 들어 태생성 암종(embryonal carcinoma), 기형종(teratoma), 난황낭 종양(yolk sac tumors)), 신장암(kidney cancers), 위암(stomach cancers), 자궁암(uterus cancers)을 포함한다. 암의 예시는 아래(infra)에 나열된다.

주어진 세포가 표면에 의존성 수용체 DCC 및/또는 UNC5를 발현하는지 및/또는 네트린-1 유전자 발현의 현저한 상위 조절을 보이는지 여부를 결정하는 방법은 기술분야에 공지되어 있으며, FACS (형광 활성 세포 분리 분석, Fluorescence activated cell sorting)의 IHC (면역조직화학, Immunohistochemistry), 정량적 PCR (예를 들어 헥사머 대비(primed) cDNA와 함께) 또는 발색 안료(chromogenic dye) (실버 또는 쿠마시(coomassie) 블루 염색과 같은) 기초 단백질 검출 기술과 짝을 이루는 대안적 웨스턴 블롯(alternatively Western Blot) 또는 용액 및 겔, 블롯(blots)상에 단백질에 대한 형광-(fluorescence-) 및 발광-(luminescence-) 기초 검출 방법 및 면역 염색법(immunostaining)과 같은 마이크로어레이 뿐만 아니라, 면역 침전법(immunoprecipitation), ELISA, 마이크로어레이, 및 질량 분석법(mass spectrometry)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 맥락에서, 치료되는 암의 예시는 언급된 암의 어느 난치성 형태(refractory versions)를 포함하여 본 발명에 나열된다.

본 발명의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클(vehicle) 내에, 화학 요법 약물 및 네트린-1 방해 약물 또는 인비보(in vivo)에서 네트린-1 방해 약물을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 시너지적 항암 효과를 가진다.

본 발명은 이제 하기 도면을 참조하여, 보다 상세하게 설명되나, 이에 제한되지 않는다:
도 1-4: 네트린-1 및 이의 의존성 수용체는 독소루비신 치료에 상위 조절된다.
도 1: 폐암 세포 라인 A549 및 H460은 24시간 동안 2μM 독소루비신으로 치료되었고 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디히드로게나제(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)와 함께 정상화된 네트린-1 유전자 발현은 비치료된 세포와 비교하여 정량적 PCR에 의해 측정되었다. 독소루비신 치료는 네트린-1 유전자 발현의 강한 유도를 양쪽 세포 라인에 유도하였다. 결과는 다섯가지 독립적 실험의 평균 값을 나타낸다. 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트가 수행되었고, P 값이 표시되었다. DoxoR, Doxorubicin; Act.D, Actinomycin D; NT, 비치료됨.
도 2: A549 세포는 48시간 동안 1μM 및 2μM 독소루비신으로 치료되었고 네트린-1 단백질 수준은 웨스턴 블롯팅에 의해 측정되었다. β-actin에 정상화된 네트린-1 단백질은 독소루비신 치료한 이후에 강하게 축적되었다.
네트린-1 상위 조절은 48 시간 동안 2μM 독소루비신으로 치료한 이후에, 면역 형광 염색에 의해 확인되었다. 핵은 Hoescht 염색(푸른색)으로 대비염색(counterstained) 되었다. (나타내지 않음)
도 3: 네트린-1 수용체 유전자 발현은 독소루비신 치료 이후에 A549 세포 내 측정되었다. UNC5A, UNC5B 및 DCC 유전자 발현은 UNC5C 및 UNC5D이 비현저한 변화(variations)를 보이는 반면, 독소루비신에 의해 현저하게 상위 조절되었다. 만-휘트니 실험이 수행되었고, P 값이 표시되었다. DoxoR, Doxorubicin; Act.D, Actinomycin D; NT, 비치료됨.
도 4: 독소루비신 유도된 네트린-1 상위 조절은 유전자 전사에 의해 직접 의존한다. A549 세포는 2μM 독소루비신 및 24시간 동안 잠재적 RNA 중합효소 억제자 액티노마이신(Actinomycin) D (100μg/ml)로 치료되었다. 액티노마이신 D는 독소루비신 치료 (Doxo..) 이후 네트린-1 상향 조절을 강하게 억제하였다. 만-휘트니 테스트는 수행되었고, P 값이 표시되었다. DoxoR, Doxorubicin; Act.D, Actinomycin D; NT, 비치료됨, Doxo., Doxorubicin + Actinomycin D.
도 5-9: 네트린-1 및 이의 수용체 발현은 세포독성 약물로 치료에 몇몇 암 세포 라인 및 난소 종양에서 증가되었다.
도 5-8: 네트린-1 (NTN1), DCC, UNC5B 및 UNC5D의 발현 수준은 정량적 RT-PCR을 통해 측정되었다. 유방암 (HBL100), 폐암 (A549, H322, H358), 대장암 (HCT116, HCT8), 췌장암 (MiaPacA-2, Panc-1), 신경아세포종 (SH-Sy5y, IMR32), 교아종 (SF767, U87MG) 및 난소암 (PA-1, TOV-112D, NIH-OVCAR3) 세포 라인은 각각 세포 라인 및 24시간 약물 치료에 대해 계산된 IC₅₀ 값에 따라 다른 약물 농도로 전통적 화학 요법 약물(독소루비신, 시스플라틴, 5-플루오로우라실 및 탁솔)로 치료되었다. 네트린-1 및 이의 수용체 유전자 발현은 대조군과 비교되었고, 비치료된 세포 및 변화들은 하기와 같이 점수화되었다: -, 변화가 없거나 하위 조절; +, 유전자 발현의 2 내지 4배 과조절; ++, 4 내지 100 배 과조절; +++, 100 배 초과 과조절; n.d., 비결정됨; n.e., 비발현됨. 양성 세포 라인은 2배 과조절 이상 유전자 발현 변화에 대해 결정되었다. 회색 박스는 저항성 (즉, 최대 약물 농도로 치료한 이후 50% 이상의 세포 생존) 암 세포 라인을 나타낸다.
도 9: 네트린-1은 화학 요법 치료 이후 난소 종양 환자에게 과발현되었다. 하우스키핑 유전자로 사용된, GAPDH로 일반화된, 네트린-1 수준은 카보플라틴/탁솔(carboplatin/taxol) 치료의 화학 요법 사이클 전 후에 수득된 환자로부터 종양의 난소 생체 검사로부터 추출된 RNA에서 분석되었다. 네트린-1의 중간 수준은 각 그룹에 대해 계산되었다.
도 10-15: 네트린-1 사일런싱은 독소루비신에 A549 세포를 민감하게 만들었고 UNC5B 수용체를 통해 세포자멸(apoptotic) 세포 사멸을 유도하였다.
도10-12: 네트린-1 사일런싱은 독소루비신에 종양 세포를 민감하게 하였다. A549 세포는 스크램블(scramble) siRNA(siCTRL, siRNA Universal Negative Control #1, Sigma-Aldrich) 또는 특이적 siRNA 타게팅 네트린-1 (siNet, sequence SEQ ID NO: 10: AAGCUGGACGCAGCAUGAUGC)로 형질전환되었다. 형질전환 24시간 이후, 세포는 독소루비신의 증가하는 농도로 치료되었다. 대상 및 방법(materials and methods) 섹션에서 설명된 톡실라이트(toxilight) 키트에 의해 측정된 세포 사멸 속도 (도 10), 및 세포 생존 (도 11)은 치료 48시간 이후 측정되었다. 결과는 대조군, 비치료된 세포에 일반화되었다. 스크램블 siRNA-형질전환된 세포가 독소루비신 치료에 일반적인 저항성을 보이는 반면, 네트린-1 사일런싱은 독소루비신 존재 하에 세포 사멸 및 감소된 세포 생존을 강하게 유도하였다. 대상 및 방법 섹션에서 설명된 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 배제(exclusion)에 의해 측정된 세포 사멸의 백분율 (도 12)의 평가는 네트린-1 siRNA가 0.5μM 내지 2μM 독소루비신 치료에 A549 세포를 민감화시키는 것을 확인하였다. *, P<0.05; **, P<0.01. DoxoR, 독소루비신(Doxorubicin).
도 13-14: 네트린-1 사일런싱은 독소루비신 치료와 조합된 세포 자멸을 유발하였다. A549 세포는(도 10-12)에서와 같이 형질전환 되었고, 24시간 동안 표지된 독소루비신 농도로 치료되었다. 비치료된 세포에 일반화된 활성 카스파제(caspase)-3 (도 13) 및 DNA 절편 (도 14)은 대상 및 방법 섹션에서 설명된 것처럼 평가되었다. 독소루비신이 스크램블 siRNA (siCTRL)로 형질전환된 A549 세포에 세포 자멸을 유도하는 것을 실패하는 반면, 네트린-1에 대해 사일런스된(silenced) 세포는 세포 자멸 속도에 강한 증가를 보였다. *, P<0.05; **, P<0.01. DoxoR, 독소루비신.
도 15: 네트린-1 사일런싱 및 독소루비신 치료의 조합은 네트린-1 수용체 UNC5B를 통해 세포 사멸을 유도하였다. A549 세포는 스크램블 siRNA (siCTRL), 네트린-1 특이적 siRNA(siNet), UNC5B-특이적 siRNA (siUnc5B) 및 네트린-1 및 UNC5B-타겟팅 siRNA의 조합으로 형질전환 되었다. 형질전환 24시간 이후, 세포는 48시간 동안 표시된 독소루비신 농도로 치료되었고, 세포 사멸 속도는 톡실라이트로 측정되었고 대조군, 비치료된 세포에 일반화되었다. 네트린-1 사일런싱(siNet)이 siCTRL-형질전환된 세포에 비해, 독소루비신 치료에 A549 세포를 민감하게 만드는 반면, 네트린-1 및 UNC5B (siNet+siUnc5B)의 동시 사일런싱은 siNet 및 독소루비신 치료에 의한 세포 사멸 유도를 구조하였다. *, P<0.05; **, P<0.01. DoxoR, 독소루비신.
도16-21: 네트린-1 및 이의 수용체 상호 작용에 방해는 세포독성 약물에 종양세포를 민감하게 한다.
도16-17: A549 세포는 2μg/mL TRAP-netrin^DCC (도 16) 및 TRAP-netrin^Unc5A (도 17)이 존재하거나 존재하지 않는 표시된 독소루비신 농도로 48시간 동안 치료되었다. 독소루비신 및 두가지 재조합 융합 단백질의 공동 치료는 독소루비신- 및 PBS- 치료된 세포에 비해, 톡실라이트에 의해 측정된 세포 사멸 속도를 증가시켰다. 결과는 비치료된 세포에 일반화되었다. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001. DoxoR, 독소루비신.
도 18-19: A549 세포는 5-플루오로우라실 (5-FU, 도 18) 또는 시스플라틴 (도 19)의 표시된 농도의 존재 하에, PBS 또는 2μg/mL TRAP-netrin^Unc5A으로 치료되었다. 공동 치료 48시간 이후, 세포 생존은 MTS로 측정되었고 비치료된 세포에 일반화되었다. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001. DoxoR, 독소루비신.
도 20-21: MiaPacA 세포는 5-FU (도 20) 또는 독소루비신 (도 21)의 표시된 농도의 존재 하에, PBS 또는 2μg/mL TRAP-netrin^Unc5A로 치료되었다. 공동 치료 48시간 이후, 세포 생존은 MTS를 통해 측정되었고 비치료된 세포에 일반화되었다. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001. DoxoR, 독소루비신.
도 22: 네트린-1 방해는 전임상 동물 모델 내 독소루비신 항-암 효과를 강력하게 한다. A549 세포는 7주령 암컷 가슴선 없는(athymic nude) 쥐에 접목되었다. 종양이 100mm³-부피에 달하면, 쥐는 2주 동안 1주에 두번, TRAP-netrin^UNC5A (20mg/kg), 독소루비신 (2mg/kg) 또는 두 약물의 조합으로 복강내 치료되었다. 대조군으로서, 쥐는 PBS로 주사되었다. 막대 그래프(Histogram)는 후기-이종이식(post-xenografts) 기간의 기능과 같이 각 그룹에 종양 부피 성장을 나타낸다. 두 약물 각각은 종양 성장을 감소시킬 수 없는 반면, TRAP-netrin^UNC5A 및 독소루비신의 조합 치료는 종양 성장을 현저하게 감소시켰다.
도 23-27- 세포독성 약물 치료에 따른 네트린-1 수용체 유전자 발현.
도 23-24: 암 세포는 도 5에 개시된 것처럼 치료되었고, UNC5A 및 UNC5C 유전자 발현은 약물 치료 이후에 측정되었다. 점수화 시스템은 도 5에 사용된 것과 동일하다. 두 수용체는 비치료된 세포에 비해, 치료 이후 약한 발현 수준 변화를 보였다.
도 25-27: 카보플라틴/탁솔 치료 전 후 환자로부터 종양의 난소 생체 검사에 네트린-1 수용체 발현 수준. 중간 값은 각 그룹으로부터 계산되었다. UNC5B (도 25), UNC5D (C=도 26) 및 DCC (도 27) 유전자 발현은 화학 요법 치료 이후 유사한 상위 조절을 보였다. 유전자 발현 수준은 하우스키핑 유전자로 사용된 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디히드로게나제 (GAPDH)에 일반화되었다.
도 28: 세포독성 약물에 대한 세포 민감도. 시스플라틴, 5-플루오로우라실 (5FU), 독소루비신, 및 파클리탁셀 (탁솔)에 반응하는 억제 농도 (IC) IC₁₀, IC₃₀ 및 IC₅₀는 MTS 분석에 의해 표시된 세포 라인에 대해 결정되었다. IC₅₀ 값은 이중역비례선(double reciprocal plots)의 선형 회귀(linear regression)를 통해 계산되었다. 회색 박스로 나타낸, 저항성 암 세포 라인(즉, 최대 약물 농도 IC_MAX로 치료 후 50% 세포 생존 이상)에 대하여, IC_MAX 및 부분(fractions)이 계산되었다.
도 29: 발현 플라스미드 NP-X의 지도.

서열 리스트:

SEQ ID NO:	아미노산 서열	핵산 서열
1	펩타이드 신호를 갖는 UNC5A-TRAP
2	펩타이드 신호를 갖는 UNC5B-TRAP
3	펩타이드 신호를 갖는 UNC5C-TRAP
4	펩타이드 신호를 갖는 UNC5D-TRAP
5		UNC5A
6		UNC5B
7		UNC5C
8		UNC5D
9		인간 IgG1 Fc
10		siRNA 가닥 (센스)
11		프라이머
12		프라이머
13	네트린-1
14		네트린-1

I. 대상 및 방법(Materials and Methods):

1. 네트린-1 발현 또는 과발현을 평가하는 정량적 RT-PCR:

총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 NucleoSpin^® RNA II Kit (Macherey Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 추출되었다. RT-PCR 반응은 iScript^® cDNA Synthesis Kit (Biorad)로 수행되었다. 일 νg 총 RNA는 하기 프로그램을 사용하여 역전사되었다: 5분 동안 25°C, 30분 동안 42°C 및 5분 동안 85°C. 발현 연구를 위해, 타겟 전사체는 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Kit (Roche Applied Science)를 사용하여 LightCycler^® 2.0 apparatus (Roche Applied Science)에서 증폭되었다. 타겟 유전자의 발현은 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디히드로게나제 (GAPDH) 및 하우스키핑 유전자로서 사용된 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 유전자에 일반화되었다. 하우스키핑 유전자에 일반화된 타겟 전사체의 양은 비교 C_T 방법을 사용하여 계산되었다. 입증 실험이 타겟의 효율을 증명하기 위해 수행되었고 하우스키핑 유전자는 거의 동일하였다. 프라이머 서열은 하기와 같다:

포워드 프라이머(Forward primer): aaaagtactgcaagaaggactatgc SEQ ID NO:11.

리버스 프라이머(Reverse primer): ccctgcttatacacggagatg SEQ ID NO:12.

2. 인간 암 세포 내 네트린-1 단백질 정량:

면역블롯 분석(immunoblot analysis)을 위해, 세포는 변형된 RIPA 버퍼(50mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 프로테아제 억제 칵테일(protease inhibitor cocktail) 및 5mM DTT)에 초음파 분해로 용해되고 4°C에서 1시간 배양되었다. 세포 파편(Cellular debris)이 원심분리(4°C에서 10.000g 15')로 펠렛화 되었고 단백질 추출물(레인 당 200 νg)은 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로드되었고 PVDF 시트(sheets) (Millipore Corporation, Billerica, MA, U.S.A.)에 블롯되었다. 필터는 10% 무지방 분유 및 PBS/0.1% Tween 20 (PBS-T) 내 5% BSA로 밤새 차단되었고 이후 토끼 다중클론 α-네트린-1 (희석1:500, 클론(clone) H104, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 및 마우스 단일클론 β-엑틴 (Santa Cruz Biotechnologies) 항체로 2시간 동안 배양되었다. PBS-T로 세번 세척 이후, 필터는 1시간 동안 적절한 HRP-결합된 이차 항체(1:10000, Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK)와 배양되었다. 검출은 West Dura Chemiluminescence System (Pierce, Rockford, IL, U.S.A.)을 사용하여 수행되었다.

면역형광 연구를 위해, 세포는 분리되고, 시토스피너(cytospiner) (Shandon Cytospin 3, Thermo Scientific)로 커버 슬립에 원심분리되고 4% (v/v) 파라포름알데히드로 30분 동안 고정되었다. 이후 세포는 0.2% Triton X-100/PBS에 30분 동안 투과 가능하게 되었고 2% BSA 및 2% 일반 당나귀 혈청을 포함하는 PBS에 차단되었다. 내인성(Endogenous) 네트린-1은 토끼 단일클론 α-네트린-1 항체(R&D systems) 및 Alexa-488 당나귀 항-랫(Donkey anti-rat) IgG (Molecular probes)를 사용하여 염색되었다. 핵인은 Hoescht staining (Sigma)을 사용하여 대비염색 되었다.

3. 세포 사멸 분석 및 통상적 약물 치료:

세포 사멸은 다른 방법의 수단으로 측정되었다. 총 세포 사멸 분석을 위해, 웰(well) 당 5*10³ 세포는 혈청-부족 배지 내 96-웰 플레이트에서 생장되었고 독소루비신으로 치료되었다. 48시간 이후, 세포 사멸은 제조자의 지시에 따라, 생물발광 세포독성 분석 ToxiLight (Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하여 측정되었다. 그렇지 않으면, 세포 독성 백분율은 NucleoCounter NC-3000 system (ChemoMetec A/S, AllerØd, Denmark)를 사용하여 아크리딘 오렌지 및 DAPI 염색을 통해 측정되었다. 간단히, 5*10⁴ 세포는 12-웰 플레이트에 플레이트되고 독소루비신으로 치료되었다. 치료 48시간 이후, 부유 및 부착 세포는 수집되었고, PBS에 현탁되고 두가지 다른 염료, 전체 세포수를 염색하는 아크리딘 오렌지, 및 비생존(non-viable) 세포를 염색하는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 혼합되었다. 이후 총 세포수에 DAPI-양성 세포로서 측정된 세포 사멸 속도는 제조자의 어플리케이션 노트(application note)에 따라, NucleoCounter NC-3000에 의해 결정되었다. 세포 생존은 96-웰 플레이트에서 MTS 분석(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)으로 측정되었다. MTS 분석은 16시간 동안 세럼 부족 배지에서 자란 3*10³ 세포에 제조자의 절차에 따라 수행되었고 그 다음 무혈청 배지에 표시된 독소루비신 농도로 48시간 동안 치료되었다. 카스파제-3 활성 분석은 제조자의 지시에 따라, 카스파제 3/CPP32 Fluorimetric Assay Kit (Gentaur Biovision, Brussel, Belgium)를 사용하여 상기 설명된 것처럼 (21) 수행되었다. 카스파제 활성 (활성 / 분(min) / 단백질의 마이크로그램)은 분광형광계 (405nm / 510nm, Infinite F500, Tecan, Mannedorf, Switzerland) 상에 판독하는(reading) 1시간 키네틱 사이클(kinetic cycle)로부터 계산되었다.

4. 후보 약물:

TRAP-netrin^DCC 및 TRAP-netrin^UNC5A은 각각 DCC 엑토도메인의 다섯번째 피브로넥틴 도메인 및 IgG1 Fc 일부에 융합된 UNC5A 엑토도메인의 두 면역글로빈 (Ig1-Ig2) 도메인이다. 이들 두 재조합 단백질은 293-프리스타일(free-style) 및 CHO-프리스타일에서 각각 생산되었다.

TRAP-netrin^DCC은 플라스미드 7800을 사용하여 WO2012025618의 실시예 1-4에 따라 생산되었다. 유사한 융합 단백질은 WO2012025618의 이들 실시예에 또한 개시된 벡터 7809를 사용하여 생산될 수 있다.

TRAP-netrin^UNC5A은 하기 5.에 설명된 방법을 사용하여 생산되었다.

5. TRAP-netrin ^UNC5A (UNC5A-Fc), TRAP-netrin ^UNC5B (UNC5B-Fc) 및 TRAP-netrin ^UNC5C (UNC5C-Fc)의 생산

플라스미드 구조(Plasmid construction)

표준 방법은 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에서 설명된 조작(manipulate) DNA에 사용되었다. 분자 생물학적 시약이 제조자의 지시에 따라 사용되었다. 목적하는 유전자 부분(segments)은 유전자 합성에 의해 제조되었다. 합성된 유전자 절편은 구체화된 발현 벡터에 복제되었다. 서브클로닝된 유전자 절편의 DNA 서열은 DNA 서열화에 의해 확인되었다.

발현 플라스미드는 도 11에 나타냈고 PS-UNC5-Fc-NP-X (펩타이드 신호에 대한 PS, 및 X는 UNC5A에 대한 V-01, UNC5B에 대한 V-02 및 UNC5C에 대한 V-03일 수 있음) 기재되었다(noted).

벡터는, 예를 들어 인간 UNC5A, B, 또는 C 수용체의 Ig 유사 도메인이 2 아미노산 인공 연결자 서열의 도입부(introduction)와 인간 IgG 1 항체(Fc 불변 영역(constant region); 힌지(Hinge)-CH2-CH3)의 힌지 영역에 융합된 인공 Ig Fc 융합 단백질의 일시적 발현을 위한, 발현 플라스미드이다.

화학적 유전자 합성은 각각 5'- 및 3'- 말단에 HindIII 및 KpnI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 플랭크된(flanked) 672 (SEQ ID NO: 5, 7) 또는 676 bps (SEQ ID NO: 6)의 DNA 조각을 제조하는데 사용되었다. 유사하게, 각각 5'- 및 3'-말단에 고유한 KpnI 및 XbaI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 플랭크된 699 bps (SEQ ID N0: 9)의 DNA 조각이 제조되었다. N-말단 위치에 카파 2 신호 펩타이드를 갖는 목적하는 UNC5-융합 단백질 (UNC5-Fc 융합 단백질)의 오픈 리딩 프레임 (ORF)를 코딩하는 DNA 조각은 상기 인용된 두 DNA 조각의 연결로 얻어졌다. 유전자는 CMV-IE의 즉각 프로모터 및 인헨서 hE1 및 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 위치에 발현 벡터 (NP-V) 내로 도입되었다.

UNC5-융합 단백질 (UNC5-융합 단백질)은 쥣과 신호 서열 (SEQ ID NO: 1, 2 또는 3의 아미노산 1 내지 19), 인간 UNC5 수용체의 두 면역글로불린 유사 도메인 (UNC5A : SEQ ID NO: 1의 아미노산 20 내지 217; 아미노산 서열 UniProt ID: Q6ZN44의 UNC5A의 34 내지 240 아미노산에 상응; UNC5B : SEQ ID NO: 2의 아미노산 20 내지 215; 아미노산 서열 UniProt ID: Q8IZJ1의 UNC5B의 아미노산 49 내지 244에 상응; UNC5C : SEQ ID NO: 3의 아미노산 20 내지 217; 아미노산 서열 UniProt ID: O95185의 UNC5C의 아미노산 61 내지 258에 상응; 두 아미노산 연결자 (클로닝 위치로부터; SEQ ID NO: 3의 아미노산 199 내지 200) 및 인간 IgGI 항체 항체 Fc 불변 영역(SEQ ID NO: 1 또는 3의 아미노산 220 내지 446; SEQ ID NO: 2의 아미노산 218 내지 444)으로 구성된다. 성숙 UNC5-Fc 융합 단백질은 신호 펩타이드가 부족하다.

일시적 형질전환, 발현 및 정제

재조합 단백질은 37°C에서 8　% CO₂로 293 Freestyle 배양 배지 (Invitrogen)에 현탁액 내 자라는 Freestyle HEK 293 세포 (Invitrogen)의 일시적 형질전환에 의해 수득되었다. 형질전환을 위해 293fectin® 시약 (Invitrogen)은 제조자의 지시에 따라 사용되었다. 형질전환 3일 이후, 상청액이 수확되었고 원심분리 (200g로 10분)에 의해 정화되었다. Fc-융합 단백질은 제조자의 지시에 따라 Protein G Sepharose 4 FF를 사용하여 정화되었다. 용리(Elutions)는 0.1M 글리신 pH 2.8에서 수행되었다. 용출액(Eluates)은 1M Tris-Hcl pH 9.0에서 중성화되고 PBS에 대항하여 밤새 투석되었다. 최종 분석은 변성 및 비 변성 조건 내 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 수행된 후에 쿠마씨 블루 염색 또는 니트로셀룰로스 이전(nitrocellulose transfer) 후 웨스턴 블롯 분석되었다(항-인간 IgG (Fc 특이적)-HRP 항체, Sigma를 사용하여).

재조합 UNC5A-Fcas는 또한 무 동물 구성 요소, 31°C 에서 8 % CO₂ 로 무혈청 배지, 화학적으로 정의된 현탁액 내 자라는 Freestyle CHO-S 세포 (Chine Hamster Ovary, Invitrogen)의 일시적 형질전환에 의해 수득되었다. 형질전환을 위해 FreeStyleTM MAX Reagent (Invitrogen)가 제조자의 지시에 따라 사용되었다. UNC5A-융합 단백질 (SEQ ID NO: 1)은 Freestyle CHO-S 세포 내 일시적 발현에 적어도 300 mg/L의 속도로 높은 효율성으로 분비될 수 있다. 상청액은 원심분리로 수확되고 멸균 여과(0.2 μm)되었다. 상청액 내 UNC5A-Fc의 농도는 BioRad Experion system을 사용하여 결정되었다. 그 후에 Fc-융합 단백질은 0.1M 글리신 HCl pH 3.0 내 용리를 제외하고 제조자의 지시에 따라 양이온 교환 크로마토그래피 이후 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (PALL Protein A Ceramic Hyper D)를 통해 정제되었다. 용출액은 1M Tris-HCl pH 9로 중성화되고 20 mM 시트레이트, 134 mM NaCl, pH 6.2에 대하여 밤새 투석되었다. 최종 분석은 정량, 크기 검증 및 오염물의 존재에 대한 Bio-Rad Experion system으로 수행되었다.

발현의 결과

플라스미드#	특징	서열	MW kDa	발현량 μg/mL (Freestyle HEK 293 상청액 3일)	발현량 μg/mL (Freestyle CHO-S 상청액 8일)
NP-V-01	UNC5A-Fc	SEQ ID NO. 1	48,17	3.5	300
NP-V-02	UNC5B-Fc	SEQ ID NO. 2	48,31	25	-
NP-V-03	UNC5C-Fc	SEQ ID NO. 3	48,55	5	-

하기 실험에서 CHO-S 세포 내 생산된 UNC5A-Fc가 사용되었다.

6. 동물 모델:

7주령 (20-22 g 체중) 암컷 무흉선 nu/nu 쥐는 Charles River 동물 시설로부터 수득되었다. 쥐들은 멸균된 필터-탑(filter-topped) 우리에 사육되었고 무병원체 동물 시설에서 유지되었다. A549 세포가 쥐의 오른쪽 측면에 PBS의 200μL로 10⁷ 세포의 s.c. 주사로 이식되었다. 종양이 발생할 때 (V≒100 mm³), 쥐들은 2주 동안 네트린-1 방해 약물 및/또는 세포독성 약물로 치료되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. 종양 부피는 공식 v = 0.5*(길이*너비²)로 계산되었다. 치료의 마지막에, 종양이 수확, 계량되고 7.5% 젤라틴 - 0.12M 수크로스에 내장되고(embedded) 20 μm 슬라이스로 절개되었다.

7. 통계 분석:

보고된 데이터는 삼배체(triplicate)에 각각 수행된, 적어도 세가지 독립적 기준의 평균 ± S.D.이다. 통계 분석은 달리 지시되지 않는 한 비모수 만-휘트니 U 테스트에 의해 수행되었다.

II. 결과 및 논의

1. 네트린-1 및 이의 수용체는 통상적인 화학 요법에 종양 세포에서 상위 조절됨.

우선 독소루비신에 반응하여 두 폐암 세포 라인 A549 및 H460 내 네트린-1의 수준을 정량적 RT-PCR을 통해 분석하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 네트린-1 mRNA 수준은 2 μM 독소루비신으로 치료에 양 세포 라인 모두에서 크게 증가(각각 430 및 300 배)하였다. mRNA의 증가는 네트린-1 단백질 발현의 강한 증가와 관련된다(도 2 및 면역 형광법(도시 생략)).

그 다음, 독소루비신에 반응하여 네트린-1 수용체 DCC 및 UNC5H -UNC5A, UNC5B, UNC5C 및 UNC5D의 수준을 분석하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, DCC, UNC5A, UNC5B 및 UNC5D의 수준은 독소루비신 치료된 A549 세포에서, 네트린-1 수준에 수반하여 증가하였다. 이러한 증가는 UNC5B 수용체에 대해 44배에 달했다. 네트린-1 및 이의 수용체의 상위 조절이 증가된 유전자 전사와 관련되는지 여부를 관찰하기 위해, A549 세포는 RNA 중합효소 억제자 액티노마이신 D의 존재 하에 독소루비신으로 치료되었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 액티노마이신 D는 독소루비신 매개 네트린-1 상위 조절을 완전히 방지하였고 따라서 통상적인 치료 약물이 증가된 유전자 전사를 통해 네트린-1 및 이의 수용체의 증가를 유발한다는 점을 뒷받침하였다.

네트린-1 및 이의 수용체 상위 조절이 독소루비신에 제한 또는 화학 요법제에 일반적 반응인지 여부를 조사하기 위해, 네트린-1 수준은 독소루비신, 5-플루오르우라실 (5FU), 파클리탁셀 (Taxol) 및 시스플라틴과 같은, 다양한 통상적 화학요법 약물에 반응하여 15 암세포 라인의 패널에서 정량적 RT-PCR을 통해 분석되었다. 네트린-1 수준의 분석은 각 세포 라인에 대한 각 약물의 결정된 IC₁₀, IC₃₀ 또는 IC₅₀에 상응하는 3 농도로 치료에 수행되었다 (도 28). 특정한 약물에 저항성을 갖는 것으로 나타나는 세포 라인에서 (도 28), 최대 효율 농도 (IC_MAX)에 상응하는 농도가 네트린-1 수준을 관찰하는데 사용되었다. 도 5-8에 도시된 바와 같이, 독소루비신 및 5FU 모두는 암 세포 라인의 각각 60% 및 36%로 네트린-1의 현저한 증가(즉, 대조군 대비 >2배 초과)를 유발하였다. 탁솔 및 시스플라틴으로 치료는 각 세포 라인의 오직 20% 및 21%에 네트린-1 상위 조절과 관련된다. 네트린-1 상위 조절이 적어도 하나의 유방, 폐, 췌장 및 난소 암의 세포 라인 뿐만 아니라 신경아세포종 및 교아종 세포 라인에서 보이는 것처럼, 화학 요법 약물 치료에 네트린-1 상위 조절은 종양 형태 특이적이지 않다. 네트린-1 상위 조절이 내성 및 민감성 세포 라인 모두에서 발견되고, 일부 내성 세포 라인은 네트린-1 상위 조절을 보이지 않는 것처럼 (도 5-8), 네트린-1 상위 조절 및 화학 내성 사이에 어떠한 상관관계도 발견할 수 없다.

또한 이들 세포독성 시약에 반응하는 네트린-1 의존성 수용체의 발현은 15 암 세포 라인에서 조사되었다 (도 5-8). 네트린-1 반응과 유사하게, 스크린된 세포 라인의 DCC, UNC5B 및 UNC5D 내 각각, 87%, 80% 및 67%의 상위 조절과 관련된 것처럼, 독소루비신은 가장 큰 효과를 갖는 것으로 보인다. DCC 발현이 각각의 시스플라틴, 5FU 및 탁솔에 반응하여 세포 라인의 36%, 43%, 및 53%로 강하게 증가되는 것처럼, 스크린된 암 세포 라인 내 종합적인 낮은 발현을 보인 DCC는 상위 조절의 가장 큰 스펙트럼을 보이는 네트린-1 수용체이다. 네트린-1 수용체 UNC5A 및 UNC5C의 수준은 스크린된 세포 라인의 대부분에서 세포독성 약물로 치료에 의해 크게 영향을 받지 않은 채 유지되었다 (도 23-24). 이와 함께, 이들 데이터는 네트린-1 및 이의 수용체 상위 조절은 통상적 약물 치료에 반응하여 종종 발생하는 것을 뒷받침한다.

최종적으로 카보플라틴/탁솔로 치료 전 후에 환자로부터 난소암 표본(specimens)에서 네트린-1 및 수용체 수준 을 분석하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 네트린-1 mRNA는 화학 요법 이후 상위 조절되었다. 게다가, DCC, UNC5B 및 UNC5D 수준은 또한 카보플라틴/탁솔 치료에 의해 영향을 받았다 (도 25-27).

2. 네트린-1 방해는 세포독성 약물 유도된 세포 사멸을 일으킴(potentiates).

네트린-1 및 이의 수용체 모두는 통상적 약물 치료에 상위 조절되는 사실은 네트린-1에 생존을 위한 의존성이 화학 치료된 암세포에서 증폭됨을 제안한다. 따라서 siRNA 전략에 의해 네트린-1의 사일런싱에 독소루비신 유도된 세포 사멸을 우선 분석하였다. 이후 A549 세포는 네트린-1 siRNA로 형질전환되었고 독소루비신의 증가하는 농도로 치료되었다. 네트린-1의 사일런싱은 세포 투과도 (도 10), 세포 생존 (도 11), DAPI 제외(exclusion) (도 12), 카스파제 활성화 (도 13) 또는 DNA 절편화 (도 14)의 감소의 측정을 통해 보여진 바와 같이 독소루비신 유도된 세포 사멸의 표지된 강화(potentiation)와 관련된다. 이러한 증가된 민감도가 비결합 네트린-1 의존성 수용체의 전-세포자멸 참여에 의한 것인지 여부를 결정하기 위해, 유사한 실험이 UNC5B의 사일런싱 셋팅에서 수행되었고, 주요 네트린-1 수용체는 A549 세포 내 독소루비신 치료에 발현되었다. 도 15에 도시된 바와 같이, UNC5B의 사일런싱은 네트린-1 사일런싱 및 독소루비신 치료에 의해 유도된 세포 사멸의 강화(potentiation)의 억제와 관련된다.

따라서 네트린-1 방해에 대한 더욱 치료적으로 관련된 방법을 사용하여 가능한 유사 강화 효과를 보았다. 각각 DCC 또는 UNC5A의 Fc-안정화된 엑토도메인인 두 후보, TRAP-netrin^DCC 및 TRAP-netrin^UNC5A는 인비트로에서 종양 세포를 발현하는 네트린-1의 사멸을 유발하고 이식된 쥐 모델에서 종양 성장 억제를 보였다(도시되지 않음). 도 16-17에 도시된 바와 같이, 이들 두 후보 약물은 A549 세포 내 독소루비신 유도된 세포 사멸을 강하게 강화하였다. 네트린-1 및 수용체가 또한 5FU 및 시스플라틴 치료 (도 5-8)에 상위 조절되는 것처럼, 5FU 및 시스플라틴과 TRAP-netrin^UNC5A의 유사한 조합을 수행하였다. 세포 사멸에 비슷한 강화 효과는 5FU 또는 시스플라틴 및 TRAP-netrin^UNC5A의 공동 치료에 관측되었다(도 18-19). 유사하게, 5FU 및 독소루비신이 네트린-1 및 이의 수용체를 상위 조절하는 것으로 보여진 췌장 암 세포 라인 MiaPacA에서, 5FU 또는 독소루비신 및 TRAP-netrin^UNC5A의 공동 치료는 세포 사멸을 강화시켰다 (도 20-21).

3. 네트린-1 방해는 전임상 암 동물 모델에 세포독성 약물 항암 효과를 강화시킴.

이후 상기에 보여진 인비트로 효과가 치료 관점에 인비트로에서 번역될 수 있는지 여부를 측정하였다. A549 세포는 nude 쥐에 이식되었고 뚜렷한 종양을 갖는 동물은 20mg/kg 단독으로 또는 독소루비신의 2 mg/kg과 조합으로 담체 또는 TRAP-netrin^UNC5A의 i.p. 주사를 통해 일주일에 두번 치료되었다. 이들 투여 계획(schemes) 및 투여량에 사용된 단일 제제 -TRAP-netrin^UNC5A 또는 독소루비신- 치료는 검출 가능하지만 약한 종양 성장 억제 효과와 관련된다 (도 22). 그러나, 독소루비신 및 TRAP-netrin^UNC5A의 공동 치료는 종양 성장의 강하고 장기적인 억제와 관련된다. 모두 종합해 보면, 이들 데이터는 통상적 화학 요법과 네트린-1 방해 기초한 치료의 조합은 시너지적인 항암 효과와 관련되는 것을 뒷받침한다.

4. 네트린-1 방해 및 세포독성 약물을 조합하는 것은 유망한 치료적 접근법(approach)임.

여기에, 세포독성 약물로 치료에 반응하는 네트린-1의 암 세포 라인 상위 조절 발현함을 보였다, 독소루비신, 시스플라틴, 5FU, 및 파클리탁셀 (탁솔)을 포함하는, 본 발명에 실험된 세포 독성 약물은 어쥬번트(adjuvant) 및 발전된 세팅(advanced setting) 모두로 비소형 세포 폐암, 유방, 직장 및 난소 암을 갖는 환자의 관리에 일반적으로 사용된다. 나아가 인간 샘플의 제한된 패널까지 사용하여, 카보플라틴/탁솔로 치료된 환자로부터 일차 난소 종양은, 치료 전 동일한 종양에 비해 네트린-1 수준이 증가함을 나타내는 것을 보였다. 세포 배양물 내 이러한 네트린-1 상위 조절은 사용된 약물 및 암 세포 타입 (도 1)에 의존하는 동역학(kinetics) 및 진폭(amplitude)에서 다르더라도, 이들 약물이 다른 세포 메커니즘에 영향을 주는 것으로 알려져 있는 사실은 네트린-1 상위 조절이 특정한 화학 요법 약물에 의해 영향을 받는 특이적 경로의 특이적 변형보다 일반적인 생존 스트레스 반응인 점을 뒷받침한다. 따라서 이러한 네트린-1 상위 조절이 이들 약물에 반응하여 암 세포에 의해 고용된 생존 메커니즘일 수 있는 것을 추측하는 것은 흥미롭다.

비록 이러한 네트린-1의 상위 조절에 대한 메커니즘은 결정되기 위해 남아 있으나, 이는 현저한 치료적 결과(consequences)를 가질 수 있다. 실제로 네트린-1 방해 약물은 현재 통상적 세포독성 제제와 이들 약물의 조합이 시너지적임을 증명할 수 있는; 전임상 개발 중에 있다. 네트린-1 발현이 유방, 난소, 췌장 및 비소형 세포 폐암 환자로부터 샘플에서 상위 조절되고 네트린-1 자가분비/주변분비 루프를 방해하는 것이 일부 모델에서 암 세포의 세포자멸을 유발함을 보였다. 게다가, 본 발명에 개시된 데이터는 환자의 더욱 큰 부분집합(subset)은 네트린-1 타게팅 제제 단독 또는 세포독성 제제와 조합으로부터 유익할 수 있음을 제안한다. 종양을 갖는 쥐에 인비보 관찰에 기초하여, 조합은 세포독성 제제 단독에 비해 독성을 증가시키는 것으로 보이지는 않았다. 본 발명에 개시된 전임상 데이터는 통상적 약물에 네트린-1 방해를 더하는 조합은 통상적 약물의 감소된 농도로 증가된 효과를 유도할 수 있음을 뒷받침한다. 함께 이들 데이터는 통상적인 화학 요법과 조합된 조기 임상 실험에서 치료에 기초한 네트린-1 방해 실험의 근거를 뒷받침한다.

5. 네트린-1을 과발현하고 DCC 및/또는 UNC5A 및/또는 B 및/또는 C 및/또는 D를 발현하는 암의 예시.

네트린-1 과발현 경우의 백분율은 네트린-1 및 이의 수용체의 발현이 정량된 암의 각각 타입에 주어졌다.

- 전이성 유방암(metastatic breast cancer)의 60% (Fitamant et al., PNAS 2008),

- 비소형 세포 폐암(non-small cell lung cancer)의 47% (Delloye-Bourgeois et al., JNCI 2009),

- 공격적 신경아세포(aggressive neuroblastoma)의 38% (Delloye-Bourgeois et al., J. Exp. Med. 2009),

- 췌장 선암세포(pancreatic adenocarcinoma)의 61% (Link et al., Annals of Chir. Onco. 2007; Dumartin et al., Gastro 2010),

- 원발성 흑색종(primary melanoma) (n=7), 흑색종 전이(melanoma metastasis) (n=6) 의 100% (Kaufmann et al., Cellular Oncology 2009),

- 난소암(ovarian cancers)의 76% (Panastasiou et al., Oncotarget 2011),

- 교아종(glioblastoma)의 65%,

- 급성 골수 백혈병(acute myeloid leukemia) 및 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)의 > 60%

- 공격적 B-세포 림프종(aggressive B-cell lymphoma)의 > 50 %,

- 육종(sarcoma)의 30%,

- 신장 선암(renal adenocarcinoma)의 40%,

- 두경부암(head and neck cancers)의 22%,

- 고환암(Testicular cancers) (태생성 암종(embryonal carcinoma)의 36%, 기형종(teratoma)의 50%, 난황낭종양(yolk sac tumors)의 100%)

- 신장암(kidney cancers)의 50%,

- 위암(stomach cancers)의 26%,

- 자궁암(uterus cancers)의 19%.

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Ile Val 130 135 140 Leu Pro Cys Arg Pro Pro Glu Gly Ile Pro Pro Ala Glu Val Glu Trp 145 150 155 160 Leu Arg Asn Glu Asp Leu Val Asp Pro Ser Leu Asp Pro Asn Val Tyr 165 170 175 Ile Thr Arg Glu His Ser Leu Val Val Arg Gln Ala Arg Leu Ala Asp 180 185 190 Thr Ala Asn Tyr Thr Cys Val Ala Lys Asn Ile Val Ala Arg Arg Arg 195 200 205 Ser Ala Ser Ala Ala Val Ile Val Tyr Gly Thr Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UNC5B-fusion protein UNC5B-TRAP <400> 2 Met Asp Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Leu Cys Tyr Phe Leu Gln Glu Pro Gln Asp Ala Tyr Ile Val Lys 20 25 30 Asn Lys Pro Val Glu Leu Arg Cys Arg Ala Phe Pro Ala Thr Gln Ile 35 40 45 Tyr Phe Lys Cys Asn Gly Glu Trp Val Ser Gln Asn Asp His Val Thr 50 55 60 Gln Glu Gly Leu Asp Glu Ala Thr Gly Leu Arg Val Arg Glu Val Gln 65 70 75 80 Ile Glu Val Ser Arg Gln Gln Val Glu Glu Leu Phe Gly Leu Glu Asp 85 90 95 Tyr Trp Cys Gln Cys Val Ala Trp Ser Ser Ala Gly Thr Thr Lys Ser 100 105 110 Arg Arg Ala Tyr Val Arg Ile Ala Tyr Leu Arg Lys Asn Phe Asp Gln 115 120 125 Glu Pro Leu Gly Lys Glu Val Pro Leu Asp His Glu Val Leu Leu Gln 130 135 140 Cys Arg Pro Pro Glu Gly Val Pro Val Ala Glu Val Glu Trp Leu Lys 145 150 155 160 Asn Glu Asp Val Ile Asp Pro Thr Gln Asp Thr Asn Phe Leu Leu Thr 165 170 175 Ile Asp His Asn Leu Ile Ile Arg Gln Ala Arg Leu Ser Asp Thr Ala 180 185 190 Asn Tyr Thr Cys Val Ala Lys Asn Ile Val Ala Lys Arg Arg Ser Thr 195 200 205 Thr Ala Thr Val Ile Val Tyr Gly Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 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cgccgtgatc 660 gtgtacggta cc 672 <210> 6 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UNC5B DNA sequence <400> 6 aagcttgccg ccaccatgga cttcggcctg cggctgatct tcctggtgct ggtgctgaag 60 ggcgtgctgt gctactttct gcaagaaccc caggacgcct acatcgtgaa gaacaagccc 120 gtggaactgc ggtgccgggc cttccctgcc acccaaatct acttcaagtg caacggcgag 180 tgggtgtccc agaacgacca cgtgacccag gaaggcctgg acgaggccac aggcctgaga 240 gtgcgcgagg tgcagatcga ggtgtcccgg cagcaggtgg aagaactgtt cggcctggaa 300 gattactggt gccagtgcgt ggcctggtct agcgccggca ccaccaagag cagacgggcc 360 tacgtgcgga tcgcctacct gcggaagaac ttcgaccagg aacccctggg caaagaggtg 420 cccctggacc acgaggtgct gctgcagtgc agacctcctg agggcgtgcc cgtggccgag 480 gtggaatggc tgaagaacga ggacgtgatc gaccctaccc aggataccaa cttcctgctg 540 accatcgacc acaacctgat catccggcag gcccggctga gcgacaccgc caattacacc 600 tgtgtggcca agaacatcgt ggccaagcgg cggagcacca ccgccaccgt gatcgtgtac 660 ggtacc 666 <210> 7 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UNC5C DNA sequence <400> 7 aagcttgccg ccaccatgga cttcggcctg cggctgatct tcctggtgct ggtgctgaag 60 ggcgtgctgt gcctgcccca cttcctgatc gagcccgaag aggcctacat cgtgaagaac 120 aagcccgtga acctgtactg caaggccagc cccgccaccc aaatctactt caagtgcaac 180 agcgagtggg tgcaccagaa agaccacatc gtggacgagc gggtggacga gacaagcggc 240 ctgatcgtgc gcgaggtgtc catcgagatc agccggcagc aggtggaaga actgttcggc 300 cccgaggact actggtgcca gtgcgtggcc tggtctagcg ccggcaccac caagagccgg 360 aaggcctacg tgcggatcgc ctacctgaga aagaccttcg agcaggaacc cctgggcaaa 420 gaggtgtccc tggaacaaga agtgctgctg cagtgcagac cccccgaggg aatccccgtg 480 gccgaggtgg aatggctgaa gaacgaggac atcatcgacc ccgtggaaga tcggaacttc 540 tacatcacca tcgaccacaa cctgatcatc aagcaggccc ggctgagcga caccgccaac 600 tacacctgtg tggccaagaa catcgtggcc aagcggaagt ccaccaccgc caccgtgatc 660 gtgtacggta cc 672 <210> 8 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UNC5D DNA sequence <400> 8 aagcttgccg ccaccatgga cttcggcctg cggctgatct tcctggtgct ggtgctgaag 60 ggcgtgctgt gcctgcccca cttcatcgaa gagcccgacg acgcctacat catcaagagc 120 aaccccatcg ccctgcgctg caaggcccgc cccgccatgc agattttctt caagtgcaac 180 ggcgagtggg tgcaccagaa cgagcacgtg agcgaggaga ccctggacga gagcagcggc 240 ctgaaggtgc gggaagtgtt catcaacgtg acacggcagc aggtggaaga cttccacggc 300 cccgaagact actggtgcca gtgcgtggcc tggtcccacc tgggcaccag caagagccgg 360 aaggccagcg tgcggatcgc ctacctgcgg aagaacttcg agcaggaccc ccagggccgg 420 gaggtgccca tcgagggcat gatcgtgctg cactgcagac cccctgaggg cgtgcccgcc 480 gccgaggtgg aatggctgaa gaacgaggag cccattgaca gcgagcagga cgagaatatt 540 gacacccgcg ccgaccacaa tctgattatt agacaggccc gcctgagcga cagcggcaac 600 tacacctgta tggccgccaa catcgtggcc aagcggcgct ctctgtctgc caccgtggtg 660 gtgtacggta cc 672 <210> 9 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 Fc coding sequence <400> 9 ggtaccgaca agacccacac ctgtccccca tgccctgccc ctgaactgct gggaggcccc 60 agcgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa 120 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 180 gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gtacaacagc 240 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 300 tacaagtgca aagtctccaa caaggccctg cctgccccca tcgagaaaac catcagcaag 360 gccaagggac agccccgcga gcctcaggtg tacacactgc cccccagccg ggaagagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtcaagggct tttaccccag cgatatcgcc 480 gtggaatggg agagcaacgg ccagcccgag aacaattaca agaccacccc ccctgtgctg 540 gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600 cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagtccctga gcctgagccc cggcaagtaa taatctaga 699 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA targeting netrin-1 <400> 10 aagcuggacg cagcaugaug c 21 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 11 aaaagtactg caagaaggac tatgc 25 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 12 ccctgcttat acacggagat g 21 <210> 13 <211> 580 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Pro Gly Leu Ser Met Phe Ala Gly Gln Ala Ala Gln Pro Asp Pro 1 5 10 15 Cys Ser Asp Glu Asn Gly His Pro Arg Arg Cys Ile Pro Asp Phe Val 20 25 30 Asn Ala Ala Phe Gly Lys Asp Val Arg Val Ser Ser Thr Cys Gly Arg 35 40 45 Pro Pro Ala Arg Tyr Cys Val Val Ser Glu Arg Gly Glu Glu Arg Leu 50 55 60 Arg Ser Cys His Leu Cys Asn Ala Ser Asp Pro Lys Lys Ala His Pro 65 70 75 80 Pro Ala Phe Leu Thr Asp Leu Asn Asn Pro His Asn Leu Thr Cys Trp 85 90 95 Gln Ser Glu Asn Tyr Leu Gln Phe Pro His Asn Val Thr Leu Thr Leu 100 105 110 Ser Leu Gly Lys Lys Phe Glu Val Thr Tyr Val Ser Leu Gln Phe Cys 115 120 125 Ser Pro Arg Pro Glu Ser Met Ala Ile Tyr Lys Ser Met Asp Tyr Gly 130 135 140 Arg Thr Trp Val Pro Phe Gln Phe Tyr Ser Thr Gln Cys Arg Lys Met 145 150 155 160 Tyr Asn Arg Pro His Arg Ala Pro Ile Thr Lys Gln Asn Glu Gln Glu 165 170 175 Ala Val Cys Thr Asp Ser His Thr Asp Met Arg Pro Leu Ser Gly Gly 180 185 190 Leu Ile Ala Phe Ser Thr Leu Asp Gly Arg Pro Ser Ala His Asp Phe 195 200 205 Asp Asn Ser Pro Val Leu Gln Asp Trp Val Thr Ala Thr Asp Ile Arg 210 215 220 Val Ala Phe Ser Arg Leu His Thr Phe Gly Asp Glu Asn Glu Asp Asp 225 230 235 240 Ser Glu Leu Ala Arg Asp Ser Tyr Phe Tyr Ala Val Ser Asp Leu Gln 245 250 255 Val Gly Gly Arg Cys Lys Cys Asn Gly His Ala Ala Arg Cys Val Arg 260 265 270 Asp Arg Thr Asp Ser Leu Val Cys Asp Cys Arg His Asn Thr Ala Gly 275 280 285 Pro Glu Cys Asp Arg Cys Lys Pro Phe His Tyr Asp Arg Pro Trp Gln 290 295 300 Arg Ala Thr Ala Arg Glu Ala Asn Glu Cys Val Ala Cys Asn Cys Asn 305 310 315 320 Leu His Ala Arg Arg Cys Arg Phe Asn Met Glu Leu Tyr Lys Leu Ser 325 330 335 Gly Arg Lys Ser Gly Gly Val Cys Leu Asn Cys Arg His Asn Thr Ala 340 345 350 Gly Arg His Cys His Tyr Cys Lys Glu Gly Tyr Tyr Arg Asp Met Gly 355 360 365 Lys Pro Ile Thr His Arg Lys Ala Cys Lys Ala Cys Asp Cys His Pro 370 375 380 Val Gly Ala Ala Gly Lys Thr Cys Asn Gln Thr Thr Gly Gln Cys Pro 385 390 395 400 Cys Lys Asp Gly Val Thr Gly Ile Thr Cys Asn Arg Cys Ala Lys Gly 405 410 415 Tyr 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ttcgcgggcc aggcggcgca gcccgatccc 120 tgctcggacg agaacggcca cccgcgccgc tgcatcccgg actttgtcaa tgcggccttc 180 ggcaaggacg tgcgcgtgtc cagcacctgc ggccggcccc cggcgcgcta ctgcgtggtg 240 agcgagcgcg gcgaggagcg gctgcgctcg tgccacctct gcaacgcgtc cgaccccaag 300 aaggcgcacc cgcccgcctt cctcaccgac ctcaacaacc cgcacaacct gacgtgctgg 360 cagtccgaga actacctgca gttcccgcac aacgtcacgc tcacactgtc cctcggcaag 420 aagttcgaag tgacctacgt gagcctgcag ttctgctcgc cgcggcccga gtccatggcc 480 atctacaagt ccatggacta cgggcgcacg tgggtgccct tccagttcta ctccacgcag 540 tgccgcaaga tgtacaaccg gccgcaccgc gcgcccatca ccaagcagaa cgagcaggag 600 gccgtgtgca ccgactcgca caccgacatg cgcccgctct cgggcggcct catcgccttc 660 agcacgctgg acgggcggcc ctcggcgcac gacttcgaca actcgcccgt gctgcaggac 720 tgggtcacgg ccacagacat ccgcgtggcc ttcagccgcc tgcacacgtt cggcgacgag 780 aacgaggacg actcggagct ggcgcgcgac tcgtacttct acgcggtgtc cgacctgcag 840 gtgggcggcc ggtgcaagtg caacggccac gcggcccgct gcgtgcgcga ccgcaccgac 900 agcctggtgt gcgactgcag gcacaacacg gccggcccgg agtgcgaccg ctgcaagccc 960 ttccactacg accggccctg gcagcgcgcc acagcccgcg aagccaacga gtgcgtggcc 1020 tgtaactgca acctgcatgc ccggcgctgc cgcttcaaca tggagctcta caagctttcg 1080 gggcgcaaga gcggaggtgt ctgcctcaac tgtcgccaca acaccgccgg ccgccactgc 1140 cattactgca aggagggcta ctaccgcgac atgggcaagc ccatcaccca ccggaaggcc 1200 tgcaaagcct gtgattgcca ccctgtgggt gctgctggca aaacctgcaa ccaaaccacc 1260 ggccagtgtc cctgcaagga cggcgtgacg ggtatcacct gcaaccgctg cgccaaaggc 1320 taccagcaga gccgctctcc catcgccccc tgcataaaga tccctgtagc gccgccgacg 1380 actgcagcca gcagcgtgga ggagcctgaa gactgcgatt cctactgcaa ggcctccaag 1440 gggaagctga agattaacat gaaaaagtac tgcaagaagg actatgccgt ccagatccac 1500 atcctgaagg cggacaaggc gggggactgg tggaagttca cggtgaacat catctccgtg 1560 tataagcagg gcacgagccg catccgccgc ggtgaccaga gcctgtggat ccgctcgcgg 1620 gacatcgcct gcaagtgtcc caaaatcaag cccctcaaga agtacctgct gctgggcaac 1680 gcggaggact ctccggacca gagcggcatc gtggccgata aaagcagcct ggtgatccag 1740 tggcgggaca cgtgggcgcg gcggctgcgc aagttccagc agcgtgagaa gaagggcaag 1800 tgcaagaagg cctag 1815

Claims (13)

1. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클(vehicle) 내에, 암 세포 내 네트린-1의 발현 또는 과발현을 유도할 수 있는 화학 요법 약물, 및 네트린-1 방해 약물을 포함하며,
   상기 네트린-1 방해 약물은 네트린-1에 결합하는 항체, 또는 네트린-1 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질(Fc-fusion protein)이며,
   상기 네트린-1 방해 약물은 네트린-1과 그 수용체 사이의 상호 작용을 억제하고 네트린-1 수용체 유도된 세포 자멸을 촉진하는 것이고,
   상기 화학 요법 약물은 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil, 5FU), 또는 시스플라틴(Cisplatin)인 것인,
   상기 화학 요법 약물의 처리 결과로써 네트린-1을 발현 또는 과발현하는 암을 치료하기 위한 약학 조성물,
   여기서 상기 암은 전이성 유방암(metastatic breast cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 공격적 신경아세포종(aggressive neuroblastoma), 췌장 선암(pancreatic adenocarcinoma), 1차 흑색종(primary melanoma) (n=7), 흑색종 전이(melanoma metastasis) (n=6), 난소암(ovarian cancers), 교아종(glioblastoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 공격적 B-세포 림프종(aggressive B-cell lymphoma), 육종(sarcoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 두경부암(head and neck cancers), 고환암(testicular cancers), 신장암(kidney cancers), 위암(stomach cancers), 및 자궁암(uterus cancers)으로부터 선택되는 것임.
2. 제1항에 있어서, 상기 네트린-1 방해 약물은 네트린-1 수용체 DCC, UNC5A, UNC5B, UNC5C 또는 UNC5D의 세포외 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질인 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 네트린-1 방해 약물은 네트린-1 수용체의 세포외 도메인 및 항체 Fc 영역을 포함하는 Fc-융합 단백질인 약학 조성물.
4. 암 세포 내 네트린-1의 발현 또는 과발현을 유도할 수 있는 화학 요법 약물을 포함하며,
   상기 화학 요법 약물은 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil, 5FU), 또는 시스플라틴(Cisplatin)이고,
   네트린-1 방해 약물과 조합하여 환자에 사용되거나, 또는
   이러한 네트린-1 방해 약물로 처리된 환자에게 사용되며,
   상기 네트린-1 방해 약물은 네트린-1에 결합하는 항체, 또는 네트린-1 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질(Fc-fusion protein)이며, 상기 네트린-1 방해 약물은 네트린-1과 그 수용체 사이의 상호 작용을 억제하고 네트린-1 수용체 유도된 세포 자멸을 촉진하는,
   상기 화학 요법 약물의 처리 결과로써 네트린-1을 발현 또는 과발현하는 암을 치료하기 위한,
   항암 약제로서 용도를 위한 약학 조성물,
   여기서 상기 암은 전이성 유방암(metastatic breast cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 공격적 신경아세포종(aggressive neuroblastoma), 췌장 선암(pancreatic adenocarcinoma), 1차 흑색종(primary melanoma) (n=7), 흑색종 전이(melanoma metastasis) (n=6), 난소암(ovarian cancers), 교아종(glioblastoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 공격적 B-세포 림프종(aggressive B-cell lymphoma), 육종(sarcoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 두경부암(head and neck cancers), 고환암(testicular cancers), 신장암(kidney cancers), 위암(stomach cancers), 및 자궁암(uterus cancers)으로부터 선택되는 것임.
5. 네트린-1 방해 약물을 포함하며,
   상기 네트린-1 방해 약물은 네트린-1에 결합하는 항체, 또는 네트린-1 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질(Fc-fusion protein)이고,
   상기 네트린-1 방해 약물은 네트린-1과 그 수용체 사이의 상호 작용을 억제하고 네트린-1 수용체 유도된 세포 자멸을 촉진하며,
   암 세포 내 네트린-1의 발현 또는 과발현을 유도할 수 있는 화학 요법 약물과 조합하여 환자에 사용되거나, 또는
   이러한 화학 요법 약물로 처리된 환자에게 사용되며,
   상기 화학 요법 약물은 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil, 5FU), 또는 시스플라틴(Cisplatin)인 것인,
   상기 화학 요법 약물의 처리 결과로써 네트린-1을 발현 또는 과발현하는 암을 치료하기 위한,
   항암 약제로서 용도를 위한 약학 조성물,
   여기서 상기 암은 전이성 유방암(metastatic breast cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 공격적 신경아세포종(aggressive neuroblastoma), 췌장 선암(pancreatic adenocarcinoma), 1차 흑색종(primary melanoma) (n=7), 흑색종 전이(melanoma metastasis) (n=6), 난소암(ovarian cancers), 교아종(glioblastoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 공격적 B-세포 림프종(aggressive B-cell lymphoma), 육종(sarcoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 두경부암(head and neck cancers), 고환암(testicular cancers), 신장암(kidney cancers), 위암(stomach cancers), 및 자궁암(uterus cancers)으로부터 선택되는 것임.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학 요법 약물 및 상기 네트린-1 방해 약물을 환자에게 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여하기 위해 포함하는 약학 조성물.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학 요법 약물은 암 세포 내에서 네트린-1 수용체의 상위-조절(up-regulation)을 유도할 수 있는 약학 조성물.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학 요법 약물은 암 세포 내에서 DCC의 상위-조절을 유도할 수 있는 약학 조성물.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학 요법 약물은 암 세포 내에서 UNC5A, UNC5B, UNC5C 또는 UNC5D의 상위-조절을 유도할 수 있는 약학 조성물.
10. 네트린-1 방해 약물은 네트린-1에 결합하는 항체, 또는 네트린-1 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질(Fc-fusion protein)이며, 상기 네트린-1 방해 약물은 네트린-1과 그 수용체 사이의 상호 작용을 억제하고 네트린-1 수용체 유도된 세포 자멸을 촉진하며,
    화학 요법 약물은 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil, 5FU), 또는 시스플라틴(Cisplatin)이고,
    네트린-1을 발현 또는 과발현하는 암을 갖는 환자에게 동시에, 별도로 또는 순차적 투여를 위한 것이며,
    상기 암은 화학 요법 약물의 처리 결과로써 네트린-1을 발현 또는 과발현하는 것을 특징으로 하는,
    상기 화학 요법 약물의 처리 결과로써 네트린-1을 발현 또는 과발현하는 암을 치료하기 위한, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 내, 암 세포 내에서 네트린-1의 발현 또는 과발현을 유도할 수 있는 화학 요법 약물, 및 네트린-1 방해 약물의 조합,
    여기서 상기 암은 전이성 유방암(metastatic breast cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 공격적 신경아세포종(aggressive neuroblastoma), 췌장 선암(pancreatic adenocarcinoma), 1차 흑색종(primary melanoma) (n=7), 흑색종 전이(melanoma metastasis) (n=6), 난소암(ovarian cancers), 교아종(glioblastoma), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 공격적 B-세포 림프종(aggressive B-cell lymphoma), 육종(sarcoma), 신장 선암(renal adenocarcinoma), 두경부암(head and neck cancers), 고환암(testicular cancers), 신장암(kidney cancers), 위암(stomach cancers), 및 자궁암(uterus cancers)으로부터 선택되는 것임.
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