KR20210041571A - 역형성 림프종 키나아제 억제제와 조합하여 egf/egfr 경로를 억제하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

역형성 림프종 키나아제 억제제와 조합하여 egf/egfr 경로를 억제하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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인3바이오 리미티드
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Abstract

비조절된 인간 표피 성장 인자 수용체(HER1/인간 EGFR)에 의해 유도된 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 역형성 림프종 키나아제 억제제(ALK 억제제) 및 항 EGF-EGFR 결합(mAb)에 의해 활성화된 경로의 억제를 위한 유연한 능동 요법을 투여하는 단계를 포함한다. 항-EGF 항체는 능동 면역화에 의해 생성되거나 항-EGF인 항체의 투여에 의해 수동적으로 제공될 수 있다. 방법은 10∼250mg 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되는 ALK 억제제를 포함하고, mAb는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 또는 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회 반복되는 치료 유효량을 달성하는 투여 요법에 따라 능동적 또는 수동적으로 동시 투여된다.

Description

역형성 림프종 키나아제 억제제와 조합하여 EGF/EGFR 경로를 억제하기 위한 방법 및 조성물
(관련 출원에 대한 상호 참조)
본 출원은 2018년 8월 7일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/715,351호, 2018년 9월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/727,056호, 2018년 10월 22일에 출원 된 미국 가특허 출원 제62/748,772호, 2018년 11월 13일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/760,529호, 및 2019년 3월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/822,290호에 대한 우선권 및 이익을 주장하고, 그 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 여기에 포함된다.
본 발명의 실시형태는 특히, 역형성 림프종 키나아제 억제제(ALK 억제제) 치료법에 반응하지 않거나 내성이 생긴 사람에게 있어서 암과 같은 질병 상태를 치료 및 예방하는 방법에 관한 것이다.
비소세포 폐암(NSCLC)은 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이고, 치료 및 진단의 최근 발전에도 불구하고 5년 생존율은 ∼16%에 그치고 있다. 이 열악한 결과는 대체로 진단시에는 진행된 질병 단계, 질병의 강력한 특성 및 전이의 정도에 따른 것이다. 현저한 발전이 악성 암세포를 야기하는 게놈 기형을 밝혀내었지만, 현재 이용가능한 화학요법은 여전히 만족스럽지 않고, 대다수의 암 진단 환자에 대한 예후가 여전히 문제로 남아 있다.
대부분의 화학요법 제제는 악성 표현형의 발달과 관련이 있다고 생각되는 특정 분자 표적에 작용한다. 그러나, 신호전달의 복잡한 네트워크가 세포 증식을 조절하고 대부분의 악성 암이 이러한 경로의 다양한 유전적 기형에 의해 촉진된다. 표준 세포 독성 화학요법에 의한 폐암의 치료가 효력을 위해 최적화되어 있지만, NSCLC 치료법에 대한 보다 최근의 접근법은 NSCLC를 그들의 특유의 종양유전자 드라이버에 기초한 분자 서브세트로 분류하는 것에 기반한다. NSCLC의 이러한 분자 드라이버는 치료학적으로 특정 종양유전자에 대한 표적화된 제제에 의해 공격받을 수 있다.
암에 대한 대부분의 종래의 화학요법 약물은 그들의 활성에 있어서 비선택적이다. 그들의 정확한 작용 메카니즘은 다양하고 복잡하지만, 일반적으로 대부분의 정상 조직에서보다 악성 종양에서 더욱 일반적인 유사 분열을 겪고있는 세포를 손상시킴으로써 작용한다. 표적화된 제제는 암의 종양발생 및 유지에 필요하고 필수적인 단백질, 특히 악성 종양의 제어되지 않는 성장, 혈관 신생, 침윤성 및 전이 특성을 유도하는 효소의 활성을 조절함으로써 그 효력을 선택하도록 설계된다. 개선된 차등 활성은 일반적으로 암 환자에 대해 문제가 되는 부작용을 줄여주고, 특히 오심, 구토, 및 골수와 위장관의 세포사를 감소시키고, 종양 세포에 대한 효과를 증가시킨다.
암의 치료에 있어서 치료적 개입을 위한 유망한 표적 세트에는 HER-키나아제 축의 요소를 포함한다. 이들은, 예를 들면 전립선, 폐 및 유방의 견고한 상피 종양에서 빈번히 상향조절되는 경우가 많고, 아교 모세포종 종양에서도 상향조절된다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 HER-키나아제 축의 요소이고, 여러 상이한 암 치료법의 개발을 위한 선택의 표적이 되어 왔다. 티로신 잔기의 가역적 인산화가 EGFR 경로의 활성화에 요구되므로, EGFR 티로신 키나아제 억제제(EGFR-TKI)가 이러한 치료법 중 하나이다. 다시 말하면, EGFR-TKI는 종양 세포 성장 및 분열을 유도하는 세포 신호전달을 유발 및/또는 유지시키는 역할을 하는 세포 표면 수용체를 차단한다. 구체적으로, 이들 억제제는 EGFR 키나아제 도메인을 간섭하는 것으로 생각된다.
얼마 전, 비소세포 폐암(NSCLC) 환자의 서브세트에서 역형성 림프종 키나아제(ALK) 수용체 티로신 키나아제의 게놈 재배열이 확인되었다. 머지않아, 소분자 ATP-경쟁적 ALK 억제제인 크리조티닙이 ALK-양성 NSCLC 환자에 있어서 화학요법보다 더욱 효과적인 것으로 입증되었다. 크리조티닙과 다른 2개의 ATP-경쟁적 ALK 억제제인 세리티닙 및 알렉티닙은 이러한 환자에게 있어서 1차 치료법으로 사용하도록 승인되었으며, ALK 재배열은 현재 면역조직화학 및 인시투 잡종화에 의해 진단된다. 이들 3개의 ALK 억제제의 임상적 성공은 훨씬 더 큰 효능과 선택성을 가진 차세대 ALK 억제제의 개발로 이어졌다. 그러나, 불행히도 환자는 ALK 억제제에 대한 내성이 필연적으로 생겨 일반적으로 뇌전이의 형태로 나타나는 종양 재발로 이어진다.
역형성 림프종 키나아제(ALK) 재배열은 비소세포 폐암의 뚜렷한 분자 아형을 규정한다. 최근, 진행된 ALK-양성 NSCLC에 대한 치료 환경은 점점 더 강력하고 선택적인 ALK 억제제의 개발에 의해 변화하고 있다. 크리조티닙은 임상 개발에 들어간 최초의 ALK 억제제이다. 무작위 3상 시험에서, 크리조티닙은 세포독성 화학요법에 비해 객관적 반응률(ORR)과 무진행 생존율(PFS)에서 상당한 개선이 보였으며, 진행된 ALK-양성 NSCLC에 대한 표준 치료로서 크리조티닙이 확립되었다.
대부분의 환자는 크리조티닙에 반응하지만, 환자는 일반적으로 1∼2년 이내에 치료를 다시 받게 된다. 진행 후 생검 표본의 분석은 크리조티닙 내성의 분자 메커니즘에 대한 더 큰 이해를 촉진하는 매우 가치있는 것으로 입증된다. 일반적으로, 이러한 메커니즘은 표적 유전자 변경(예를 들면, ALK-내성 돌연변이, ALK 유전자 증폭) 또는 내성의 표적외 메커니즘(예를 들면, EGFR, KIT, IGF-1R, SRC, MEK/ERK 등과 같은 우회 신호전달의 상향조절) 중 어느 하나를 포함하는 것으로 분류되고 있다. 일반적으로, 표적내 저항 메커니즘은 크리조티닙으로 진행 중인 환자의 약 1/3에서 발견되었다.
최근, 여러 2세대 ALK 억제제가 ALK-양성 NSCLC에서 인상적인 활성을 보여주었다. 이들 제제 중 2개인 세리티닙과 알렉티닙은, 크리조티닙 불응성 ALK-재배열 NSCLC의 치료에 대해 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았다. 세번째 제제인 브리가티닙은 FDA로부터 획기적인 치료법을 지정받아 최근 승인되었다. 전임상 모델에서, 2세대 ALK 억제제는 여러 크리조티닙-내성 ALK 돌연변이를 극복한다. 또한, 1-2상 연구에서, 이들 제제는 크리조티닙-내성 환자에서 높은 ORR(48-71%)이 입증되었다. 중요한 것은, 2세대 ALK 억제제가 ALK-내성 돌연변이 나 융합 유전자 증폭이 없는 환자에서도 활성화되는 점으로, 많은 암이 ALK의 부적절한 억제로 인해 크리조티닙에 내성을 갖게 된다는 것을 시사한다. 그러나 2세대 ALK 억제제의 효력에도 불구하고 환자는 변함없이 재발한다.
여러 새로운 접근법은 상이한 ALK 억제제의 지식 기반 대체 및 연속적인 사용뿐만 아니라, ALK와 대체 신호전달을 표적으로 하는 복합 치료법을 포함하여, ALK-양성 NSCLC에서 발생하는 다양한 내성 메커니즘을 극복하는 것을 목표로 하고 있지만, 내성을 해결하기 위한 새로운 접근법이 필요하다.
본 발명의 목적은 EGF-EGFR에 의해 활성화된 경로의 억제를 위해 능동 EGF 경로 면역(EGF PTI)과 역형성 림프종 키나아제 억제제(ALK 억제제)를 병용하기 위한 유연한 능동 요법을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 ALK 돌연변이 및 ROS1 재배열에 의해 유도된 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 방법에 있어서, ALK 억제제는 약 10∼250㎎ 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, EGF PTI는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회로 반복되는 치료 유효량을 달성하는 투약 요법에 따라 동시 투여된다.
본 발명의 다른 목적은 ALK 돌연변이 및 ROS1 재배열에 의해 유도된 비소세포 폐암(NSCLC)을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 환자는 EGFR의 돌연변이된 형태를 발현하는 종양을 가지고, EGF를 표적으로 하는 능동 면역화를 병용하기 위한 유연한 능동 요법을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 방법에 있어서, ALK 억제제는 약 10∼250㎎ 범위의 평균 일일 투여량 및 능동 면역화에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, EGF PTI는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회로 반복되는 치료 유효량에 따라 동시 투여되며, 상기 방법은 ALK 억제제 치료에 대해 내성이 생기는 것을 방지한다.
본 발명의 또 다른 목적은 항 EGF 표적화된 항체의 유효량을 포함하는 제 1 구획, 및 ALK 억제제의 유효량을 포함하는 제 2 구획을 포함하는 제약 키트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 EGF에 대한 면역 반응을 생성하는 백신의 유효량을 포함하는 제 1 구획, 및 ALK 억제제의 유효량을 포함하는 제 2 구획을 포함하는 제약 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EGFR에 대한 면역 반응을 생성하는 백신의 유효량을 포함하는 제 1 구획, 및 ALK 억제제의 유효량을 포함하는 제 2 구획을 포함하는 제약 키트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 EGF에 대한 면역 반응을 생성하는 백신과 동시 투여에 의해 ALK 돌연변이 및 ROS1 재배열에 의해 유도된 암을 앓고 있는 환자의 치료 방법에 사용하기 위한 ALK 억제제에 관한 것이며, 여기에서 ALK 억제제는 약 10∼250㎎ 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, EGF에 대한 면역 반응을 생성하는 백신은 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회로 반복되는 치료 유효량에 따라 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 동시 투여된다.
본 발명의 다른 목적은 EGF에 대한 면역 반응을 생성하는 백신의 유효량을 포함하는 제 1 구획, 및 약 10∼250㎎ 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여될 ALK 억제제의 유효량을 포함하는 제 2 구획을 포함하는, ALK 돌연변이 및 ROS1 재배열에 의해 유도된 암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 제약 키트를 제조하기 위한 ALK 억제제의 용도에 관한 것이며, 상기 백신은 ALK 억제제 요법을 개시하기 전에 1주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회로 반복되는 치료 유효량을 평균 주간 투여량 범위의 연속 요법에 따라 치료를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
본 개시는 본 개시의 실시형태의 비제한적인 예에 의해 언급된 복수의 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 상세히 기재되고, 동일한 참조 번호는 도면의 여러 관점에 걸쳐서 유사한 부분을 나타내며, 여기에서:
본 개시는 이하의 도면과 함께 상세한 설명을 참조하여 보다 완전히 이해될 것이다.
도 1은 환자에서 발견되는 ALK 재배열의 약 75%를 차지하는 NSCLC 세포주를 예시한다. H3122는 EML4-ALK v1 융합을 전달하고 H2228은 EML4-ALK v3 융합을 전달한다.
도 2a-b는 H3122 세포주에서 EGF의 유무에서 브리가티닙 및 알렉티닙의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 3은 72시간 배양 후 H3122 세포주에서 EGF의 유무에서 크리조티닙의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 4는 H3122 세포주에서 72시간 동안 배양된 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다. C-Ab는 대조군 항체이다.
도 5는 H3122 세포에서 72시간 배양 후 BVN22E 항체 및 알렉티닙 조합의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 6은 H3122 세포에서 72시간 배양 후 BVN22E 항체 및 크리조티닙의 조합의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 7a-b는 H3122 및 H2228 세포에서 브리가티닙 및 알렉티닙과 조합한 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 8은 H3122 세포에서 BVN22E 항체와 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 9는 H3122 세포에서 BVN22E 항체와 24시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 10은 H3122 세포에서 크리조티닙과 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 11은 H2228 세포주에서 EGF의 유무에서 브리가티닙 및 알렉티닙의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 12는 72시간 배양 후 H2228 세포주에서 EGF의 유무에서 크리조티닙의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 13은 H2228 세포주에서 72시간 동안 배양된 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다. C-Ab는 대조군 항체이다.
도 14는 H2228 세포에서 72시간 배양 후 BVN22E 항체 및 알렉티닙 조합의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 15는 H2228 세포에서 72시간 배양 후 BVN22E 항체 및 크리조티닙 조합의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 16a-b는 H2228 세포에서 브리가티닙 및 알렉티닙과 조합한 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 17은 H2228 세포에서 BVN22E 항체와 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 18은 H2228 세포에서 BVN22E 항체와 24시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 19는 H2228 세포에서 크리조티닙과 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 20은 H2228 세포에서 브리가티닙과 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 21은 H2228 세포에서 BVN22E 항체 및 브리가티닙과 조합한 2시간 배양에 대한 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 22는 H3122 세포에서 브리가티닙과 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 23은 H3122 세포에서 고농도의 브리가티닙과 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 24는 H3122 세포에서 BVN22E 항체 및 브리가티닙과 조합한 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 ERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 25는 내성 콜로니의 출현(상단 패널) 및 세포 사멸 지연(하단 패널)으로 나타내어지는, 상이한 성장 조건 하에서 BVN22E 항체의 유무에서 H2228 세포에서 크리조티닙 및 알렉티닙에 대한 내성 개시까지의 시간을 보여준다.
도 26은 BVN22E 항체의 유무에서 H3122 세포에서 크리조티닙 0.1μM에 대한 내성의 출현을 보여준다.
도 27은 BVN22E 항체의 유무에서 H3122 세포에서 크리조티닙 0.2μM에 대한 내성의 출현을 보여준다.
도 28은 본 개시에 사용된 BRAF 돌연변이 세포주를 예시한다. HT29주는 결장 선암 유래이며, V600E BRAF 돌연변이를 포함한다.
도 29는 HT29 세포 생존력에 대한 EGF의 효과를 보여준다.
도 30은 HT29 세포에서 EGF의 유무에서 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 31은 HT29 세포주에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 32는 HT29 세포에서 트라메티닙과 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 33은 HT29 세포에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체와 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 34는 유세포 분석으로 개별 세포의 세포 주기 및 아포토시스 상태를 결정하기 위한 프로피디움 요오드화물 염색의 사용을 보여주는 도식을 예시한다. 이 방법은 KRAS 돌연변이(A549 및 DLD1) 및 ALK 전위(H2228 및 H3122) 세포주에 적용된다.
도 35는 DLD1 세포에서 세포 주기의 S 및 G2M 단계에 있는 세포의 상대수에 대한 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 효과를 보여준다.
도 36은 A549 세포에서 세포 주기의 S 및 G2M 단계에 있는 세포의 상대수에 대한 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 효과를 보여준다.
도 37은 H2228 세포에서 세포 주기의 S 및 G2M 단계에 있는 세포의 상대수에 대한 브리가티닙과 조합한 BVN22E 항체의 효과를 보여준다.
도 38은 H3122 세포에서 세포 주기의 S 및 G2M 단계에 있는 세포의 상대수에 대한 브리가티닙과 조합한 BVN22E 항체의 효과를 보여준다.
도 39는 본 개시에 사용된 세포주의 KRAS 돌연변이를 예시한다. A549 세포는 G12S KRAS 돌연변이를 포함하고, H23 세포는 G12C KRAS 돌연변이를 포함하고, DLD1 세포는 G13D KRAS 돌연변이를 포함하고, LS174T 세포는 G12C KRAS 돌연변이를 포함한다.
도 40은 DLD1 세포에서 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 41은 DLD1 세포에서 72시간 배양 후 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 42는 DLD1 세포에서 BVN22E 항체의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 43은 DLD1 세포에서 BVN22E 항체의 24시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 44는 DLD1 세포에서 EGF의 유무에서 트라메티닙의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 45는 DLD1 세포에서 트라메티닙의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 46은 DLD1 세포에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 47은 DLD1 세포에서 EGF의 유무에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 48은 DLD1 세포에서 트라메티닙에 대한 내성의 개시에 대한 BVN22E 항체의 효과를 보여준다.
도 49는 A549 세포주에서 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 50은 A549 세포에서 BVN22E 항체와 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 51은 A549 세포에서 BVN22E 항체와 24시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 52는 A549 세포주에서 EGF의 유무에서 트라메티닙의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 53은 A549 세포에서 트라메티닙의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 54는 A549 세포에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 55는 A549 세포에서 EGF의 유무에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 56은 H23 세포에서 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 57은 H23 세포에서 BVN22E 항체의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 58은 H23 세포에서 BVN22E 항체의 24시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 59는 H23 세포에서 EGF의 유무에서 트라메티닙의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 60은 H23 세포에서 트라메티닙의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 61은 H23 세포에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 62는 H23 세포에서 EGF의 유무에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 63은 LS174T 세포주에서 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 64는 LS174T 세포에서 BVN22E 항체의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 65는 LS174T 세포에서 BVN22E 항체의 24시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 66은 LS174T 세포주에서 EGF의 유무에서 트라메티닙의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다.
도 67은 LS174T 세포에서 트라메티닙의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 68은 LS174T 세포에서 EGF의 유무에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과를 보여준다.
도 69는 LS174T 세포 생존력에 대한 트라메티닙 단독 및 BVN22E 항체와 조합한 효과를 보여준다.
도 70은 EGF의 존재 하에 SW900 세포에서 pEGFR(TYR 1068)에 대한 인간 환자 항-EGF 혈청의 효과를 보여준다.
도 71은 EGF의 존재 하에 SW900 세포에서 pEGFR(TYR 1068), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 2명의 인간 환자 항-EGF 혈청의 효과를 보여준다.
도 72는 EGF의 존재 하에 SW900 세포에서 pEGFR(TYR 1068), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 3명의 인간 환자 항-EGF 혈청의 효과를 보여준다.
도 73a-b는 도 69-71에 나타낸 환자 항-EGF 혈청으로부터 웨스턴 블롯의 정량화 요약을 보여준다.
도 74a-d는 도 69-71에 나타낸 SW900 세포에서 환자 항-EGF 혈청으로부터 웨스턴 블롯의 정량화를 보여준다.
2007년, 비소세포 폐암(NSLC) 환자에서 EML4-ALK(극피 미세소관 관련 단백질 4) 융합 종양유전자가 처음으로 확인되었다. 상기 융합은 EML4 유전자 프로모터의 N 말단과 역형성 림프종 키나아제(ALK) 유전자의 키나아제 도메인을 나란히 놓은 2번 염색체의 단완에 반전된 결과이다. EML4-ALK 융합 형성 후에, EML4 융합 파트너는 ALK의 리간드 독립 활성화 및 구성적 키나아제 활성을 매개하여, NSLC의 3∼7%를 담당하는 암세포의 증식과 생존을 유도한다.
ALK 억제제는 EML4-ALK 전위와 같은 종양 성장을 유도하는 (ALK)의 변이를 표적으로 한다. 크리조티닙은 2011년 8월 FDA 승인을 받은 최초의 ALK 억제제이며, 현재 전이성 ALK-양성 NSCLC 환자를 위한 진료 기준이 되고 있다. 불행히도, 비소세포 폐암(NSCLC)이 초기에 크리조티닙에 반응한 대부분의 환자는 치료를 시작한 지 1년 이내에 내성이 생겨 질병 진행으로 퇴행한다. NSCLC 세포가 추가 ALK 돌연변이를 획득하기 때문에 크리조티닙 내성이 나타나는 것으로 보인다. FDA 승인을 받은 차세대 ALK 억제제인 세리티닙(Zykadia) 및 알렉티닙(Alecensa)은 크리조티닙에 대한 내성을 유발하는 임상적으로 관찰된 ALK 돌연변이의 대부분을 억제할 수 있으며, 이 2개의 치료제는 현재 크리조티닙으로 치료 후 진행되었거나 애초에 크리조티닙에 반응하지 않은 전이성 ALK-양성 NSCLC 환자 치료용으로 승인되었다.
세리티닙, 알렉티닙, 브리가티닙 및 롤라티닙은 모두 ALK-양성 NSCLC에 대해 FDA로부터 승인을 받은 차세대 억제제이다. ALK 억제제는 세리티닙(LDK378), 알렉티닙(RO5424802/CH5424802), 브리가티닙(AP26113), ASP3026, 벨리자티닙(TSR-011), 롤라티닙(PF-06463922), 엔트렉티닙(RXDX-101), 엔사르티닙(X-396), 및 CEP-37440을 포함한다.
크리조티닙은 세포 기반 분석에서 각각 IC50이 11nM 및 24nM인 c-Met 및 ALK의 강력한 억제제이다. 세리티닙(LDK378)은 0.2nM의 IC50을 가진 강력하고 특이적인 ALK 억제제이다. 알렉티닙(CH5424802; RO5424802; AF802)는 1.9nM의 IC50을 가진 강력하고 선택적인 경구용으로 이용가능한 ALK 억제제이다. 브리가티닙은 0.6nM의 IC50을 가진 매우 강력하고 선택적인 ALK 억제제이다. ASP3026은 3.5nM의 IC50을 가진 ALK(역형성 림프종 키나아제)에 대한 신규하고 선택적인 억제제이다. 벨리자티닙은 야생형 재조합 ALK 키나아제에 대해 0.7nM의 IC50을 가진, ALK 및 TRKA, TRKB 및 TRKC의 경구용으로 이중의 강력한 억제제이다. 롤라티닙(PF-06463922)은 ROSI, 야생형 ALK 및 ALK-L1196M에 대해 각각 0.02nM, 0.07nM 및 0.7nM의 Kis를 가진, 강력한 이중 ALK/ROS1 억제제이다. 엔트렉티닙은 강력하고 경구용으로 이용가능한 Trk, ROS1 및 ALK 억제제이며; 각각 1, 3, 5, 12 및 7nM의 IC50값을 가진 TrkA, TrkB, TrkC, ROS1 및 ALK를 억제한다. 엔사르티닙(X-396)은 각각 <0.4nM 및 0.74nM의 IC50을 가진 강력한 이중의 ALK/MET 억제제이다. CEP-37440은 2.3nM(FAK) 및 120nM(75% 인간 혈장에서 ALK 세포 IC50)의 IC50을 가진 신규한 강력하고 선택적인 이중의 FAK/ALK 억제제이다. IC50값: 2.3nM(FAK); 120nM(75% 인간 혈장에서 ALK 세포 IC50)(WO 2013134353, A1 20130912).
크리조티닙
2개의 후속 무작위 3상 연구는 크리조티닙을 표준 화학요법과 비교해서 크리조티닙에 대한 완전한 승인을 받았으며, 최근까지 ALK-양성 NSLC의 1차 치료를 위한 "골드 스탠더드"로 자리 매김되어 왔다. 2상 연구 데이터와 일치하여, 크리조티닙은 화학요법과 비교해서 인상적인 결과를 나타내었으며, orr(65% 대 20%) 및 pfs[위험비(hr): 0.49; 7.7개월 대 3개월]의 개선을 보여줬다. 그 후에, 크리조티닙은 ALK-양성 치료 경험이 없는 환자에서 백금-페메트렉시드 화학요법과 비교했다. 다시 한번, 화학요법과 비교하여, 크리조티닙은 orr(74% 대 45%), mpfs(시간: 0.45, 10.9개월 대 7개월), 및 중요한 삶의 질의 개선과 관련이 있었다. 전체 생존율에는 차이가 없었다.(Rothenstein et al. Current Oncology, 2018)
세리티닙
세리티닙은 크리조티닙-내성 ALK-양성 NSLC를 치료하는데 이점을 보인 최초의 차세대 억제제이다. 크리조티닙과 비교하여, 세리티닙은 알크를 억제하는 효능이 20배 높으며, 크리조티닙-내성이 발생한 환자의 생검 세포주 연구에서는 세리티닙이 일부 발견된 내성 돌연변이의 강력한 억제제임을 나타낸다.
알렉티닙
알렉티닙은 크리조티닙-내성 ALK 돌연변이에 대한 활성을 갖는 또 다른 고도로 선택적인 ALK 억제제이다. 알렉티닙의 독특한 특징 중 하나는 크리조티닙을 복용하는 환자의 CNS 내성 메카니즘과 관련이 있는 P-당단백질을 위한 기질이 아니라는 것이다. 알렉티닙은 현재 진행된 ALK-양성 NSCLC 환자를 위한 신규한 표준 1차 치료제로 확립되었다. 1차 알렉티닙에 대한 대부분의 반응은 항구성이 있지만, 본질적으로 모든 환자는 내성이 생겨 임상적 재발로 이어진다. 2개의 다른 2세대 ALK 억제제인 세리티닙과 브리가티닙은 크리조티닙 천연 및/또는 크리조티닙-내성 환경에서만 테스트된다.
3세대 ALK/ROS1 억제제인 롤라티닙은 1상 및 2상 테스트를 완료했으며, ALK TKI-천연, 크리조티닙-내성 또는 하나 이상의 2세대 ALK TKI에 내성이 있는 환자를 포함하여 수많은 환경에서 테스트된다. 롤라티닙은 알렉티닙과 같은 2세대 ALK 억제제에 실패한 환자를 포함하여 이러한 모든 환경에서 항종양 활성을 입증한다. 롤라티닙은 CNS 침투성이 높으며, 알렉티닙과 같은 뇌 침투성 TKI에 실패한 환자에서도 강력한 두개 내 활동을 보여준다. 1/2상 연구에서 확인된 효력과 안전성을 바탕으로, 롤라티닙은 지난해 FDA 획기적인 요법 지정을 받았고, 이번에는 1개 이상의 ALK 억제제로 치료받은 ALK-양성 환자에 대한 승인이 가속화될 것으로 예상된다. 따라서, 2세대 ALK 억제제에 이은 크리조티닙을 사용한 순차 요법의 패러다임은 이제 롤라티닙에 이은 알렉티닙의 신규한 패러다임으로 대체되고 있다.
본원에 기재된 기술의 실시형태는, 생리학적 농도에서 항 EGF 항체가 EGFR, Akt 및 ERK1/2의 인산화에 대한 억제 효과가 이들 시그널링 분자에 미치는 ALK 억제제의 효과만큼 중요하다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 항 EGF 항체와 ALK 억제제의 병용 치료가 pEGFR, pAkt, pERK1/2 및 pSTAT-3 억제에 대한 추가 효과를 나타낸다는 것을 추가로 발견했다. 일부 실시형태에 있어서, 이러한 항체 또는 그 항원 결합 단편은 NSLC를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 항 EGF 항체는 EGF에 대한 면역 반응을 생성하는 백신의 투여에 의해 생체내(in vivo) 능동적으로 생성될 수 있다는 것이 본 개시의 범위 내에서 고려되고 있다. 수동 모노클로날 항 EFG 항체가 투여될 수 있다는 것이 본 개시의 범위 내에서 추가로 고려되고 있다.
ALK-양성(역형성 림프종 키나아제 양성, 또는 ALK+) 폐암은 25명의 비소세포 폐암 환자 중 1명(NSCLC-가장 흔한 유형의 폐암)에서 발생한다. 한 번도 흡연하지 않은 통상의 55세 이하의 젊은 환자는 ALK+로 진단될 가능성이 가장 높다.
역형성 림프종 키나아제 억제제(ALK 억제제)는 ALK 신호전달을 방해(또는 억제)함으로써 작동한다. 하나의 키나아제(키)에서 다른 키나아제(록)로 신호를 전달하려면 두 키나아제가 일시적으로 서로 맞아야 한다. 키나아제 억제제는 일시적으로 하나의 키나아제를 차단하여, 다른 키나아제가 첫번째 키나아제를 받을 수 없도록 한다. 따라서, 키나아제가 특정 유전자의 발현을 조절하는 것을 막기 위해, 신호가 충분히 자주(아마도 90% 이상) 전달되는 것을 차단하려면 특정 농도의 키나아제 억제제에 도달해야 한다.
ALK 기반 종양을 퇴치하기 위해 개발되고 있는 대부분의 약물은 ALK의 신호전달을 방해(또는 억제)하도록 설계된다(ALK가 신호를 전달하는 것을 중지하거나 경로에 있는 다른 키나아제가 신호를 전달하는 것을 중지). 예를 들면, 하나의 ALK 억제제는 ALK의 하류에 있는 AKT 키나아제를 억제하도록 설계된다. 따라서, 다른 유형의 종양과 함께 ALK 기반 종양에 대해 효과적인지 확인하기 위해 테스트되고 있다.
다른 키나아제 억제제와 마찬가지로, 내성이 문제다. 차세대 ALK 억제제에 대한 내성 메커니즘에 대한 데이터는 제한적이며; 거의 모든 데이터는 크리조티닙 치료 이후 이들 제제를 받은 환자에 대한 것이다. 다른 TKI와 마찬가지로, 표적 변경, 대체 신호전달의 활성화 및 종양의 표현형 변화는 차세대 ALK 억제제에 내성이 있는 종양에서 관찰되었다. ALK에 의한 표적 변경은 크리조티닙으로 치료받은 환자의 종양에서보다 차세대 ALK 억제제 이후 종양에서 훨씬 더 흔히 관찰되는 것으로 나타났다. 관찰된 가장 흔한 돌연변이는 ALK의 용매 노출 영역에서 돌연변이인 G1202R로, 대부분의 ALK 억제제에 입체 장애를 야기한다. 첫번째 ALK 억제제로서 차세대 ALK 억제제로 치료받은 환자의 종양에서 동일한 저항 메커니즘 또는 동일한 비율이 관찰되는지의 여부는 불분명하다.
ALK-양성 NSCLC는 결국 1세대 ALK 억제제 크리조티닙에 대한 내성이 1∼2년 내에 발생하는 암으로서 가변 PFS를 보여준다. EGFR과 마찬가지로, ALK의 TK 도메인, 가장 흔히 L1196M 내에 내성 돌연변이가 있다. 이 돌연변이는 결합 부위에서 입체 장애를 일으켜, 크리조티닙에 대한 반응의 효능을 감소시킨다. 그러나, EGFR-TKI 내성과는 달리, 다수의 키나아제 도메인 돌연변이(G1269A, G1202R, S1206Y, F1174C/L, D1203N)뿐만 아니라, ALK-TKI 내성 환경에서 확인될 수 있는 결합 부위에서 떨어진 돌연변이(1151에 트레오닌 삽입, C1156Y, L1152R)가 있다. 시험관내(in vitro) 연구에 따르면, 상이한 내성 돌연변이는 구조적으로 상이한 TKI에 대해 상이한 수준의 내성을 부여하는 것으로 나타났으며, 이는 내성이 생길 때 반복 암 샘플, 및 FISH 분석보다 더 자세한 시퀀싱 방법을 통해 2차 내성 돌연변이를 확인할 필요가 있음을 강조한다[69, 70]. 또한, FISH 테스트에 의해 융합 생성물의 증폭만을 보여주는 ALK-TKI 내성의 다른 사례도 있으며, 일부는 확인된 내성 돌연변이 중 하나를 보여주고 다른 것은 증폭만 보여주는 경우도 있다.
크리조티닙은 ALK 재배열을 포함하는 진행된 NSCLC의 치료에서 1차 요법으로 사용되는 경구용 MET/ALK 억제제이다. 또한, ALK에 대한 효능과 선택성이 증가된 신규한 2세대 ALK 억제제가 임상 시험에서 평가 중이다. 크리조티닙과 마찬가지로, 이들 제제는 크리조티닙과 구조적으로 구별되지만 ALK 티로신 키나아제의 ATP-경쟁적 억제제이다. 세리티닙은 크리조티닙에 대한 후천성 내성을 가진 개인을 포함하여 ALK-양성 폐암 환자에서 활성을 보인 2세대 억제제이다. 세리티닙은 이전에 크리조티닙으로 치료받은 진행된 ALK 재배열 NSCLC 환자에게 사용하기 위해 FDA 승인을 받았다. 그러나, ALK 억제제에 대한 반응은 수명이 짧으며, 일반적으로 1년 이내에 내성이 발생한다.
ALK 유발된 NSCLC의 치료에 크리조티닙을 도입한 이후, EML4-ALK의 유전자 증폭 또는 2차 돌연변이가 크리조티닙에 대한 획득된 내성을 가진 종양의 약 1/3에서 확인된다. 2차 돌연변이는 시험관내 크리조티닙에 대한 내성을 유발하는 것으로 나타났지만, 모든 것이 구조적으로 구별되는 2세대 ALK 억제제에 내성을 부여하는 것은 아니다. 또한, EGFR, KIT 및 IGF-1R의 활성화는 크리조티닙에 대한 내성이 있는 종양 서브세트에서 별도로 확인되었다. EML4-ALK의 2차 돌연변이는 후천적 세리티닙 내성이 있는 종양의 서브세트에서 확인되었지만, 2세대 ALK 억제제에 대한 내성은 최근에 클리닉에서 이들 제제의 도입으로 덜 특성화된다.
EGFR의 돌연변이는 면역 체크포인트 억제제에 대한 손상된 반응과 연관성이 있고, EGFR 돌연변이 NSCLC에 대한 신규한 면역치료 접근법의 개발이 특히 중요하다. 표피 성장 인자(EGF)에 대한 면역은 비선택된 NSCLC 환자를 포함한 3상 시험에서 효력을 보였지만, 백신접종(항-EGF VacAbs)의해 생성된 항-EGF 항체의 효과 또는 EGFR 돌연변이가 있는 종양 세포에서 그 활성에 관련된 메커니즘에 대해서는 거의 알려지지 않았다.
EGF에 대한 백신접종은 프로그램된 사망 1차단과는 달리 T 세포를 활성시킴으로써 종양 유도된 면역억제를 역전시키려는 의도가 아닌 신규한 전략을 구성한다. 대신에, B 세포를 자극하여 순환하는 EGF를 격리시키는 중화 항체를 생성함으로써, EGFR에 대한 결합을 방지하는 것을 목표로 한다. EGF-경로 표적된 면역이라고 하는 EGF에 대한 백신접종은 내성이 우수하고 심각한 부작용을 일으키는 사례가 거의 없으며, 비선택된 진행된 NSCLC 환자(11, 12, 21)를 등록하는 2건의 시험에서 유망한 결과를 보여주었다. 그러나, EGFR의 리간드 결합 및 인산화를 차단하는 능력 이외에 항-EGF 항체의 효과와 관련된 분자 및 세포 메커니즘에 대해서는 거의 알려져 있지 않고, 또는 EGFR 돌연변이 또는 기타 유전적 변형이 있는 종양에서 그들의 상이한 활성에 대해서는 거의 알려져 있지 않다(22).
본 개시는 토끼에서 자란 항-EGF VacAb가 EGFR-mut NSCLC 세포주, 특히 치료되지 않은 환자로부터 유래된 세포주에서 세포 증식, 세포 주기 및 신호전달에 대한 EGF의 효과를 억제했음을 보여준다. 실험에 사용된 EGF의 농도(10ng/mL)는 인간 연구에서 보고된 농도와 비슷했으며, 메디안은 약 1ng/mL이고 개인간 상당한 변동성을 보여준다(11, 23). 놀랍게도, 항-EGF VacAbs는 PC9 세포뿐만 아니라 PC9-GR4 세포에서도 외인성 EGF가 없을 때에 pErk1/2의 수준을 지속적으로 감소시키는 것으로 발견되었고, 성장 요인은 상당한 효과를 나타내지 않았다. 이 관찰에 대한 가능한 설명 중 하나는 사용된 세포주에서 수용체/리간드 피드백 루프가 존재한다는 것이다. 항 EGF 백신으로 면역화된 환자로부터의 혈청도 EGF에 의한 pErk1/2의 활성화를 효과적으로 차단하는 것으로 나타났다. 면역화되지 않은 환자의 대조군 혈청은 Erk1/2에 거의 효과를 미치지 않았지만 Akt는 강력하게 활성화되어, 건강한 개인의 혈액에는 EGFR-mut 세포에서 pAkt를 특이적으로 트리거하는 성장 인자가 포함되어 있음을 나타낸다. 대조적으로, 분석된 4명의 면역화된 환자의 혈청은 Akt 인산화 유도에 덜 능동적이다. Erk1/2 인산화를 차단하고 Akt를 활성화하는 정도는 낮지만, 백신접종된 개인으로부터의 혈청의 효능에서 상당한 차이가 관찰된다. 3상 시험만 완료된 신규한 치료 방법이기 때문에, EGF에 대한 백신접종된 환자의 샘플의 이용가능성은 제한적이며, 이를 임상 결과와 연관시킬 수 없었다.
이전에는 EGFR TKI에 대한 민감성 및 내성 모두가 있는 여러 EGFR-mut NSCLC 세포에서 제피티닙, 엘로티닙, 아파티닙 및 오시머티닙과 같은 TKI의 항증식 효과를 현저하게 감소시키는 것이 발견되었다. 이러한 발견은 EGF가 존재하는 경우에 EGFR TKI로 처리된 세포에서 pErk1/2의 수준이 상당히 높았던 웨스턴 블롯의 실험 결과와 관련이 있다.
높은 EGF 수준을 가진 EGFR-mut 환자는 EGFR TKI에 대해 더 나쁜 결과를 가질 수 있다. 성장 인자 알파와 엠피레귤린을 형질전환하는 두 EGFR 리간드의 증가 된 혈청 수준은 비선택된 NSCLC 환자에서 EGFR TKI에 대해 더 나쁜 반응과 연관성이 있는 것으로 보고된다. EGF와 관련하여, 현재까지 발표된 유일한 연구에서 엘로티닙으로 치료받은 11명의 EGFR-mut 및 21명의 EGFR-wt NSCLC 환자에 대해, 혈청에서의 EGF는 더 짧은 무진행 생존율과 연관성이 있다. 제피티닙, 엘로티닙, 아파티닙 및 오시머티닙과 항-EGF VacAbs의 조합은 테스트된 EGFR-mut 세포주에서 EGFR TKI 단독보다 강력한 항증식 효과를 보였으며, 이는 pErk1/2의 일관된 감소와 연관성이 있는 것으로 나타났다.(도 78, 라인 TKI+EGF를 TKI+Ab+EGF와 비교). 조합은 또한 EGF의 항아포토시스 및 G2/M의 자극 효과를 차단하는데 우수하다.
항-EGFR 모노클로날 세툭시맙은 또한 EGFR-mut 세포주 모델에서 테스트된다. 항-EGF VacAbs와 유사하게, 세툭시맙은 시험관내 리간드 결합을 차단하고 PC9 및 H1975 세포에서 리간드 유도된 EGFR, Erk1/2 및 Akt 인산화를 방지하는 것으로 나타났다. 그러나, H3255 또는 DFCILU-011.29와 같은 다른 EGFR-mut주에서 EGFR 다운스트림 시그널링에 상대적으로 적은 효과를 나타낸다. 수용체 하향조절과 관련하여, 두 항체 사이에는 상당한 차이가 있는 것으로 보인다. 세툭시맙은 PC9, H1975 또는 H3255와 같은 EGFR-mut 세포에서 1∼2시간 배양한 후 총 EGFR 수준을 현저히 감소시키는 것으로 나타났지만, 항-EGF VacAbs는 24시간 배양한 후 수용체의 임의의 상당한 하향조절도 유도하지 않았다. 마지막으로, 세툭시맙이 EGFR-wt, 두경부 암세포주 및 피하 종양에서 아포토시스 및 종양 퇴행의 유도를 증폭시킨다고 보고되었지만, PC9 이종 이식에서 제피티닙의 효과를 향상시키는데 실패했다.
대조적으로, 이전에 항-EGF VacAbs가 PC9 및 테스트된 나머지 EGFR-mut 세포주에서 EGFR TKI의 항증식 활성을 강화하는 것이 발견되었다. 이 강화 효과는 PC9-GR4 세포를 제외하고는 모든 사례에서 통계적 유의성에 도달했다. 항-EGF VacAb가 수용체 대신에 리간드를 표적으로 하고 EGFR 하향조절을 유도하지 않는다는 사실은 세툭시맙과 항-EGF 항체의 효과 사이에서 발견된 차이에 대한 가능한 설명을 제공할 수 있다.
또한, 이전에 항-EGF VacAbs의 첨가는 PC9 세포주에서 제피티닙 및 아파티닙에 내성이 있는 클론의 출현을 상당히 지연시키는 것으로 발견되었다. 항-EGF VacAbs의 추가는 상기 TKI-유도된 STAT3 활성화를 지속적으로 억제한다. 대조적으로, pSTAT3은 세툭시맙으로 진행하는 두경부 인간 종양에서 상승하는 것으로 보였으며, 이는 STAT3 활성화가 이 약물에 대한 내성에 관련되어 있음을 시사한다.
요약하면, 항-EGF VacAbs는 EGF의 효과를 억제하고, EGFR 돌연변이된 NSCLC 세포주에서 EGFR TKI의 항종양 활성을 상당히 향상시켰다. 그들은 또한 STAT3 활성화를 차단하고, AXL 발현을 감소시키고, 내성의 획득을 지연시켰다. 따라서, ALK 억제제는 항-EGF VacAbs의 이점을 누릴 수도 있다.
ALK는 세포외 자극에 대한 반응으로 세포 증식, 생존 및 분화의 기본 메커니즘을 제어하는 신경계의 발달과 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 인간 암에서 가장 일반적인 게놈 ALK 이상은 염색체 재배열로 융합 유전자를 생성한다. ALK 융합은 키나아제 촉매 도메인을 유지하는 염색체 2로부터 유래된 ALK의 3'절반 및 프로모터를 제공하는 상이한 유전자의 5'부분의 융합에서 발생한다. 다수의 상이한 5'파트너가 확인되고 있다. 야생형 ALK는 일반적으로 리간드가 그 세포외 도메인에 결합하여 활성화되어, 키나아제 도메인의 이량체화 및 자가인산화를 초래한다. 구조적 연구에 따르면, 다수의 5'파트너와의 융합은 비소세포 폐암(NSCLC)에서 NPM1-ALK 및 EML4-ALK에 의해 입증된 바와 같이, 이러한 요구사항을 우회하고 ALK의 발암 가능성을 증가시키는데 도움이 된다. 증가된 복제수 및 키나아제 활성화를 초래하는 활성화 포인트 돌연변이의 존재는 또한 ALK의 발암 활성과 관련이 있다. 이러한 유전적 변화는 폐암, 신경모세포종 횡문근육종, 신세포암, 염증성 근섬유아세포종(IMT) 및 염증유방암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다발성 악성 종양에서 발견된다.
편의상, 본원의 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 특정 용어는 여기에 정리된다. 달리 명시되지 않거나 문맥에서 암시하지 않는 한, 다음 용어 및 어구는 이하에 제공된 의미를 포함한다. 명백하게 달리 명시되거나 문맥에서 명백하지 않은 한, 이하의 용어 및 어구는 용어 또는 어구가 관련된 기술분야에서 획득한 의미를 배제하지 않는다. 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 한정되기 때문에, 정의는 특정 실시형태를 설명하는 것을 돕기 위해 제공되고 청구된 발명을 한정하기 위한 것은 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
통상, 본원에 있어서, 용어 "감소하다", "저감된다", "저감된", "저감", "감소" 및 "억제되다"는 모두 기준에 비하여 통계적으로 유의한 양의 감소를 의미하는 것으로 사용된다. 그러나, 의심의 여지를 회피하기 위해, 통상 "감소하다", "감소" 또는 "저감된다" 또는 "억제되다"는 기준 레벨과 비교하여 적어도 10% 정도의 감소를 의미하고, 예를 들면, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 예를 들면, 기준 레벨과 비교하여 제공된 개체 또는 매개 변수가 전혀 없거나 또는 제공된 치료가 없는 경우에 비하여 10∼99% 감소한 경우까지를 포함한다.
통상, 본원에 사용되는 용어 "증가된", "증가된다" 또는 "강화한다" 또는 "활성화한다"는 모두 정적으로의 유의량에 의한 증가를 의미하기 위해 사용되며; 의심의 여지를 회피하기 위해, "증가된", "증가된다" 또는 "강화한다" 또는 "활성화한다"라는 용어는 기준 레벨과 비교하여 적어도 10% 증가, 예를 들면, 적어도 약 20% 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100% 증가 또는 10∼100% 간의 임의의 증가를 포함하거나 또는 기준 레벨과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 또는 2배∼10배 이상의 임의의 증가를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단리된" 또는 "부분적으로 정제된"은 핵산 또는 폴리펩티드인 경우에 있어서, 그 천연원에서 발견되는 것과 동일한 핵산 또는 폴리펩티드와 함께 존재하거나 및/또는 분비된 폴리펩티드의 경우에 있어서 분비되거나 세포에 의해 발현되는 경우에 핵산 또는 폴리펩티드와 존재할 수 있는 적어도 하나의 다른 성분(예를 들면, 핵산 또는 폴리펩티드)으로부터 분리된 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다. 화학적으로 합성된 핵산 또는 폴리펩티드 또는 시험관내 전사/번역을 이용하여 합성된 핵산 또는 폴리펩티드는 "단리된"것으로 간주된다. "정제된" 또는 "실질적으로 정제된"이란 용어는 피험체의 핵산 또는 폴리펩티드를 적어도 95중량%, 예를 들면, 적어도 96중량%, 적어도 97중량%, 적어도 98중량%, 적어도 99중량% 이상 단리된 핵산 또는 폴리펩티드를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인접한 잔기의 알파-아미노 및 카르복시기 사이의 펩티드 결합에 의해 다른 아미노산 잔기에 연결된 일련의 아미노산 잔기를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로로 사용된다. 본원에서 동일한 의미로 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 사이즈 또는 기능에 관계없이 수식된 아미노산(예를 들면, 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체를 포함하는 단백질 아미노산의 폴리머를 의미한다. "단백질" 및 "폴리펩티드"는 비교적 큰 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우가 많고, 용어 "펩티드"는 작은 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우가 많지만, 기술 분야에서 이들 용어의 사용은 중복된다. 본원에 있어서, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인코딩된 유전자 생성물 및 그 단편을 언급하는 경우에 동일한 의미로 사용된다.
따라서, 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 생성물, 천연 발생 단백질, 호모로그, 오르토로그, 파라로그, 단편 및 그들의 다른 등가물, 변이체, 단편 및 유사체를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 리피드 등의 표적을 인식하고 특이적으로 결합하는 임의의 면역글로불린 분자를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 항체가 소망의 생물학적 활성을 나타내는 한, 원형의 폴리클로날 항체, 원형의 모노클로날 항체, 항체 단편(Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편 등), 단일쇄 Fv(scFv) 돌연변이, 적어도 2개의 원형의 항체로 생성된 비특이적 항체 등의 다중 특이적 항체, 항체부를 포함하는 융합 단백질 및 항원 인식 부위를 포함하는 그 밖의 다른 수식된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 각각 언급되는 그들의 중쇄 정상 도메인의 식별에 기초한 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 임의의 5개의 주요 부류, 또는 이들의 하위 부류(아이소타입)(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 여러 종류의 면역글로불린은 다양하고 공지인 서브 유닛 구조 및 3차원 구성을 갖는다. 항체는 예를 들면, 세포 독성, 독소, 방사성 동위 원소 등과 같은 다른 분자와 콘쥬게이팅되거나 또는 네이킹될 수 있다. 항체는 이들을 생체내 능동적으로 생성함으로써 부여될 수 있고, 또는 모노클로날 항체의 수동 투여에 의해 부여될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 의미하고, DNA와 RNA를 포함한다. 상기 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 수식된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제 또는 합성 반응에 의해 폴리머로 조합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 그들의 유사체 등의 수식된 뉴클레오티드를 포함해도 된다.
"항체"(Ab) 및 "면역글로불린"(Ig)은 동일한 구조적 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면에, 면역글로불린은 일반적으로 항원 특이성이 결핍된 다른 항체 유사 분자 및 항체를 모두 포함한다. 예를 들면, 후자 종류의 폴리펩티드는 림프계에 의해 낮은 레벨로, 또한 골수종에 의해 증가된 레벨로 생성된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 넓은 의미에서 동일하게 사용될 수 있고, 모노클로날 항체(예를 들면, 전장 또는 원형의 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가, 다가 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 소망의 생물학적 활성을 나타내는 이중 특이성 항체)를 포함하고, 또한 임의의 항체 단편(이하에 상세히 기재된다)를 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화 및/또는 친화성 성숙될 수 있다.
중쇄의 정상 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 항체(면역글로불린)가 다른 부류에 할당될 수 있다. 5개의 주요 면역글로불린인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 부류가 있고, 이들 중 몇개는 하위 부류(아이소타입), 예를 들면 IgG-1, IgG-2, IgA-1, IgA-2 등으로 더 구분될 수 있다. 다른 부류의 면역글로불린에 상응하는 상기 중쇄 정상 도메인은 α, δ, ε, γ 및 μ라 각각 불린다. 다른 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구조는 공지되어 있고, 예를 들면, 일반적으로 Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed.(2000)에 기재되어 있다. 항체는 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 상기 항체의 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 형성되는, 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
본원에 있어서, 용어 "전장 항체", "원형 항체" 및 "전체 항체"는 동일한 의미로 사용되고, 실질적으로 원형 형태의 항체를 의미하는 것이고, 이하에 기재된 항체 단편을 의미하는 것은 아니다. 특히, 상기 용어는 상기 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 지닌 항체를 의미한다.
"항체 단편"은 원형 항체의 일부만을 포함하고, 상기 부분은 원형 항체에 존재할 때 그 부분과 통상적으로 관련된 기능 중 적어도 하나, 바람직하게는 대부분 또는 전부를 유지하는 것이 바람직하다. 하나의 실시형태에 있어서, 항체 단편은 원형 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원을 결합하는 능력을 유지한다. 다른 실시형태에 있어서, 예를 들면 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 상보 결합 등의 원형 항체에 존재하는 경우의 Fc 영역과 일반적으로 연관되는 생물학적 기능 중 적어도 하나를 유지한다. 하나의 실시형태에 있어서, 항체 단편은 원형 항체와 실질적으로 동일한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들면, 이와 같은 항체 단편은 상기 단편에 대한 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열과 연결된 항원 결합 암(arm) 상에 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 개체군로부터 얻어진 항체를 의미하고, 즉 개체군을 포함하는 각각의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원에 대해 유도된다. 또한, 통상적으로 상이한 결정체(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다.
본원에 있어서, 구체적으로 모노클로날 항체는 소망의 생물학적 활성(U.S. Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984))을 나타내는 한, 상기와 같은 항체의 단편 뿐만 아니라, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특이적 종에서 유래된 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동하거나 또는 특이적 항체 또는 하위 부류에 속하지만, 쇄의 잔부는 다른 종에서 유래된 항체에서 유래된 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동하거나, 또는 다른 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 "키메라" 항체를 포함한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하고 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 아미노산 서열을 갖는 것이다. 구체적으로, 상기 인간 항체의 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다.
본원에에 제공되는 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 축약형으로 이해된다. 예를 들면, 1∼50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 구성되는 군의 임의의 숫자, 숫자 조합 또는 하위 범위뿐만 아니라, 예를 들면 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 및 1.9와 같은 상술한 정수 사이의 모든 중간 십진수값을 포함하는 것으로 이해된다. 하위 범위와 관련하여, 범위의 양쪽 끝점에서 확장되는 "내포된 하위 범위"가 구체적으로 고려된다. 예를 들면, 1∼50의 예시적인 범위의 내포된 하위 범위는 한 방향으로 1∼10, 1∼20, 1∼30 및 1∼40, 또는 다른 방향으로 50∼40, 50∼30, 50∼20 및 50∼10을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "피험체"는 세균 감염을 일으킬 수 있는 임의의 유기체를 의미한다. 이러한 유기체는 인간, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 쥐, 래트, 기니피그, 원숭이, 조류, 파충류 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 "종양"은 악성 또는 양성의 모든 전암성 및 암성 세포와 조직을 포함하는 모든 종양 세포 성장 및 증식을 의미한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 언급되는 바와 같이 상호배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유 동물에 있어서의 생리학적 조건을 의미하거나 설명한다. 암의 예로는 상피암, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐샘암종, 폐편평암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 아교 모세포종, 자궁 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 헤파토마, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액선암, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 각종 두경부암이 포함된다.
본원에 사용된 "치료"는 치료되는 개인 또는 세포의 자연 경과를 변경하려는 임상적 개입을 의미하며, 예방 또는 임상병리학 과정 중에 행해질 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 염증 및/또는 조직/기관 손상의 예방 또는 감소, 질병 진행률의 완화, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 질병 또는 장애의 발현을 지연시키는데 사용된다.
"BVN22E 핵산 분자"는 BVN22E 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예시적인 BVN22E 핵산 분자는 이하에서 재현된다(서열번호 1):
Figure pct00001
"BVN22E 폴리펩티드"는 이하의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 유사성(이하의 아미노산 변경 제외: T2S, E3D, N4S, D5E, E11D, A12G, V38I, F44Y, R48K, D51E 및 A52L)을 갖는 폴리펩티드 또는 그 단편을 의미한다(SEQ ID NO : 2):
Figure pct00002
"약제 부형제"는 약학 업계에서 일반적으로 사용되는 것을 의미하며, 특히 "Handbook of excipients"(Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, Paul J. Weller-4th Edition, 2003)의 전체 내용을 포함한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료학적 유효량"은 환자에게 소망의 반응성을 도출해내기 위해 환자의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 물질/분자의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적으로 유리한 효과가 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 큰 것이 치료학적 유효량이다. "예방적 유효량"은 소망의 예방적 결과를 얻는데 필요한 투여량 및 필요한 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 질병의 초기 단계 또는 초기 단계 이전에 피험체에게 예방 용량이 사용되기 때문에, 상기 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적어도 되는 것이 일반적이지만 필수는 아니다.
"화학 요법제"는 암 치료에 유용한 화합물이다. 화학 요법제의 예로는 티오 테파 및 CYTOXAN® 시클로포스파미드 등의 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판 등의 알킬술포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온(carboquone), 메트레데파(meturedepa) 및 우레데파(uredepa) 등의 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키친; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN®), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴레틴 및 9-아미노캄프토테신을 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그들의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사코딕틴; 스폰기스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스터린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드 등의 질소 머스타드; 카무스틴, 클로로조톡신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴 등의 니트로스우레아; 에네디인 항생 물질(예를 들면, 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신 감마 I1 및 칼리케아마이신 오메가 I1(예를 들면, Agnew, Chem Intl, Ed. Engl., 33:183-186(1994) 참조)) 등의 항생 물질; 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 에스페라미신; 또한 니오카지노스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(ADRLIMYCIN®. 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 인젝션(DOXIL®) 및 데옥시독소루비신을 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신 C 등의 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트, 겜시타빈 (GEMZAR®), 테가푸르(UFTORAL®), 카페시타빈(XELODA®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실(5-FU) 등의 항-대사산물; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트 등의 폴산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌 등의 푸린 유사체; 아시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘 등의 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤 등의 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄 등의 항-아드레날; 폴린산 등의 폴산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄신 및 안사미토신 등의 마이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK® 다당류 착체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신(ELDSINE®, FILDESIN®); 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드('Ara-C'); 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀(TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민 가공 나노입자 제형(ABRASANETM), 및 도테탁셀(TAXOTERE®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴 등의 백금 유사체; 빈블라스틴(VELBAN®); 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴(ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 레우코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴(DFMO); 레틴산 등의 레티노이드; 이들의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 병용 요법의 약자인 CHOP 및 옥살리플라틴(ELOXATIN™)과 5-FU 및 로이코보빈이 병용되는 치료 요법의 약자인 FOLFOX 등의 2개 이상의 상술의 것의 조합이 포함된다.
"환자 반응"은 (1) 둔화 및 완전한 저지를 포함한 질병 진행의 어느 정도까지의 억제; (2) 질병 에피소드 및/또는 증상의 수의 감소; (3) 병변 크기의 감소; (4) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 질병 세포 침윤의 억제(즉, 감소, 둔화 또는 완전 정지); (5) 질병 확산의 억제(즉, 감소, 둔화 또는 완전 정지); (6) 병변의 퇴행 또는 절제를 초래할 수 있는 세포 증식, 침습 또는 전이의 감소; (7) 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 완화; (8) 치료 후 무병(disease-free) 기간의 증가; 및/또는 (9) 치료 후 주어진 시점에서 사망률 감소를 포함한 환자에게 이점을 나타내는 임의의 엔드포인트를 사용하여 평가할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"조직 또는 세포 샘플"은 피험체 또는 환자의 조직으로부터 얻어진 유사 세포의 집합을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 프레쉬한 냉동 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물으로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분; 뇌척수액, 양수, 복막액 또는 간질액 등의 체액; 피험체의 임신 기간 또는 발달 기간 중의 임의의 기간으로부터의 세포일 수 있다. 또한, 상기 조직 샘플은 1차 세포 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다. 경우에 따라서, 상기 조직 또는 세포 샘플은 질병 조직/기관으로부터 얻어진다. 상기 조직 샘플은 방부제, 항응고제, 완충액, 고정제, 영양제, 항생제 등과 같은 본질적으로 조직과 선천적으로 혼화되지 않는 화합물을 함유해도 된다.
ALK 억제제
ALK 유전자 변경에 대한 치료적 의미는 주로 ALK 억제제에 대한 종양 반응을 예측하는 ALK 유전자 융합과 관련이 있다. 크리조티닙, 세리티닙 및 최근 알렉티닙은 종양이 ALK 융합에 양성인 전이성 NSCLC 환자의 치료를 위해 FDA 승인을 받았다. 초기 1상 연구에서는 크리조티닙이 ALK 융합 양성 전이성 NSCLC 환자에서 일관된 반응을 보인다. 크리조티닙의 FDA 승인으로 이어진 2개의 3상 연구에서는 크리조티닙이 이전에 치료되지 않은 진행된 ALK 재배열 NSCLC 환자에서 표준 1차 페메트렉시드+시스플라틴 화학요법보다 우수하다는 것을 추가로 확인된다.
크리조티닙은 ALK-융합 양성인 NSCLC 환자에서 우수한 활성을 보였지만, 질병 진행으로 이어지는 내성의 발달로 인해 평균 PFS가 13개월인 지속적인 반응은 여전히 드물다. 내성 메카니즘은 여전히 밝혀지지 않았지만, ALK 키나아제 도메인(F1174L, F1174C, L1196M, I1171T, G1202R, S1206Y, G1269S 및 G1269A) 또는 ALK 유전자 증폭에서 획득된 2차 돌연변이가 내성과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 내성은 또한 표피 성장 인자 경로, 인슐린 유사 성장 인자 경로, RAS/SRC 시그널링, 및 AKT/mTOR 시그널링 등을 포함한 크리조티닙의 유효성을 방해하는 대체 ALK 독립 생존 경로의 활성화에 의해 매개될 수 있다.
ALK 억제제 브리가티닙 및 롤라티닙은 여러 알려진 내성 돌연변이를 억제하고, 롤라티닙은 G1202R 돌연변이에 대해 효과적인 억제를 나타낸다. 이러한 결과는 치료에 대한 반응을 최적화하기 위해 내성 메커니즘을 이해하고 적절한 티로신 키나아제 억제제(TKI)를 선택해야 할 수 있음을 시사한다.
ALK를 직접 표적으로 하는 것 이외에도, 간접 표적을 허용하는 약리학적 전략이 있다. 특히, 폐암에서 열충격 단백질, 즉 HSP90을 표적으로 하여 간접적으로 ALK를 억제하는데 성공했다. ALK를 포함한 다양한 단백질을 안정화시키는 샤페론 단백질인 HSP90의 억제는 폐암 모델의 2차 내성 돌연변이를 포함한 크리조티닙-내성 ALK 융합(EML4-ALK 및 NPM1-ALK)에서 일부 임상전 효력을 보인다.
ALK 재배열된 종양은 현재 이용가능한 ALK 억제제로 효과적으로 표적화할 수 있는 특정 종양 서브세트를 나타낸다. 이런 이유로, 이러한 분자 이상이 있는 것으로 알려진 종양의 ALK 변형에 대한 테스트는 이제 진단의 의무적인 부분이다. FISH, 종양 조직의 차세대 시퀀싱(NGS), 및 순환하는 종양 세포의 시퀀싱은 ALK 변형으로 종양을 검출하는 대안적이고 종종 보완적인 방법을 제공한다. TKI 치료 중에 거의 불가피한 내성의 출현은 재발시 종양의 재생검을 통해 새로운 ALK 억제제 및 기타 신규한 치료 전략으로 표적화될 수 있는 내성 메커니즘을 식별해야 한다.
크리조티닙은 아미노피리딘 구조를 가지며, 표적 키나아제의 ATP 결합 포켓 내에서 경쟁적으로 결합함으로써 단백질 키나아제 억제제로서 기능한다. 비소세포 성 폐암 환자의 약 4%는 EML4('극피 미세소관 관련 단백질형 4')와 ALK('역형성 림프종 키나아제') 사이에 융합 유전자를 생성하는 염색체 재배열을 가지고 있으며, 이는 발암에 기여하고 악성 표현형을 유도하는 것으로 보이는 구성적 키나아제 활성을 야기한다. 융합 단백질의 키나아제 활성은 크리조티닙에 의해 억제된다. 이 유전자 융합 환자는 일반적으로 표피 성장 인자 수용체 유전자(EGFR) 또는 K-Ras 유전자에 돌연변이가 없는 젊은 비흡연자이다. ALK 돌연변이는 매우 어린 아이에게서 거의 독점적으로 발생하는 드문 형태의 말초 신경계 암인 신경모세포종 사례의 약 15%에서 악성 표현형을 유도하는데 중요한 것으로 생각된다. 크리조티닙은 여러 다른 조직학적 형태의 악성 신생물의 종양 발생에 관여하는 c-Met/간세포 성장 인자 수용체(HGFR) 티로신 키나아제를 억제한다.
알렉티닙은 진행된 비소세포 폐암의 선택된 형태의 치료에 사용되는 티로신 키나아제 수용체 억제제 및 항종양제이다. 알렉티닙은 치료 중에 혈청 아미노기전달효소 수준의 중간 비율의 일시적 상승 및 임상적으로 명백한 급성 간 손상의 드문 사례와 관련이 있다.
알렉티닙은 항종양 활성을 갖는 수용체 티로신 키나아제 역형성 림프종 키나아제(ALK)의 경구로 이용가능한 억제제이다. 투여시, 알렉티닙은 ALK 키나아제, ALK 융합 단백질뿐만 아니라, 소분자 키나아제 억제제에 대한 획득된 내성 메커니즘 중 하나로 알려진 게이트키퍼 돌연변이 ALKL1196M에 결합하여 이를 억제한다. 억제는 ALK 매개된 시그널링의 교란으로 이어지고, 결국 ALK 과발현 종양 세포에서 종양 세포 성장을 억제한다. ALK는 인슐린 수용체 수퍼계열에 속하며, 신경계 발달에 중요한 역할을 한다. ALK 조절장애 및 유전자 재배열은 일련의 종양과 관련이 있다.
알렉티닙은 6,6-디메틸-5,6-디히드로-11H-벤조[b]카르바졸-11-온인 유기 헤테로테트라시클릭 화합물로, 각각 3, 8 및 9 위치에서 시아노, 4-(모르폴린-4-일)피페리딘-1-일 및 에틸 치환기를 추가로 운반한다. 역형성 림프종 키나아제 양성, 전이성 비소세포 폐암 환자의 치료에 (염산염으로서) 사용된다. EC 2.7.10.1(수용체 단백질-티로신 키나아제) 억제제 및 항종양제 역할을 한다. 이는 유기 헤테로테트라시클릭 화합물, 모르폴린의 구성, 피페리딘의 구성, 니트릴 및 방향족 케톤이다. 이는 알렉티닙(1+)의 공액 염기이다.
브리가티닙은 광범위한 ALK 돌연변이 및 ROS1 재배열을 표적으로 하는 차세대 ALK 억제제이다. 현재는 또한 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 인코딩하는 유전자에 돌연변이가 있는 세포주에서 활성을 갖는 유일한 ALK 억제제이다. 크리조티닙에 불응성 질환이 있는 222명의 환자가 참여한 AP26113(ALTA)의 폐암 시험에 있어서의 ALK에서, 하루에 1회 180mg의 권장 투여량으로 투여된 브리가티닙(110명의 환자 중 90mg에서 7일간 유도한 기간 포함)은 높은 전신 및 CNS 반응률과 16.7개월의 메디안 무진행 생존율과 관련이 있다. 동일한 요법이 1∼2상 시험에서 크리조티닙을 투여받은 환자 중에 유사한 무진행 생존(16.3개월)과 관련이 있다. 무진행 생존율의 메디안은 이러한 환자 중에서 다른 차세대 ALK 억제제(알렉티닙, 세리티닙, 엔사르티닙 및 롤라티닙 포함)와 관련된 것보다 높다.
신호변환자-전사활성자 3(STAT3)은 많은 인간 암에서 활성화되고, 세포 주기 진행, 항아포토시스, 세포 생존 및 혈관신생에 관여하는 여러 유전자의 전사를 조절하는 발암성 전사 인자이다.
STAT3은 EGFR, JAK2, 및 EGF, 백혈병 억제 인자(LIF) 및 기타 사이토카인에 의해 활성화될 수 있는 다른 티로신 키나아제에 의해 활성화될 수 있다. 따라서, STAT3은 많은 신호전달의 수렴 포인트이며, 종양 발생 및 종양 전이에 중요한 역할을 한다. STAT3은 다양한 형태의 돌연변이 EGFR에 의해 활성화되고, 섬유아세포 및 인간 폐암 세포에서 이러한 돌연변이의 발암 효과에 기여할 수 있다고 생각된다.
리간드 결합 또는 돌연변이에 의한 활성화 이후, EGFR은 전사 및 후번역 메커니즘을 통해 세포의 생물학을 변경하는 일련의 신호전달 경로를 개시한다. 이러한 변화를 매개하는 신호전달에는 Ras-Raf-미토겐-활성화 단백질(MAP) 키나아제(MAPK), 포스파틸딜이노시톨 3-키나아제-AKT, 및 신호변환자-전사활성자(STAT) 3 및 STAT5 신호전달 경로가 포함된다. 전사 인자의 STAT 계열는 보존된 티로신 잔기에 대한 인산화에 의해 활성화되고, 이량체화, 핵 전좌 및 DNA 결합으로 이어진다. STAT1, STAT3 및 STAT5는 또한 COOH 말단의 세린 잔기에서 인산화되고; 이 인산화는 이량체화, 핵 전좌 및 DNA 결합에 없어서는 안될 것으로 생각되지만 일부 유전자의 최대 전사 활성을 위해 필요하다.
여러 비소세포 폐암 세포주에는 구성적으로 활성인 STAT3가 포함되어 있다. 최근에 STAT3은 유전적으로 규정된 시스템에서 이러한 EGFR 돌연변이 중 여러 개에 의해 활성화되는 것으로 나타낸다. 돌연변이 EGFR의 하류에서 신호전달가 발암 특성을 매개하는데 필요한 신호전달은 알려져 있지 않지만, 광범위한 인간 악성 종양에서 STAT3의 역할을 고려할 때에 다양한 세포 유형에서 EGF에 의해 활성화된다는 사실은 STAT3이 체세포 돌연변이 EGFR의 발암 효과에 필요한 것으로 생각된다. STAT3은 돌연변이 EGFR을 발현하는 섬유아세포뿐만 아니라, 자연적으로 발생하는 EGFR 돌연변이가 있는 두 개의 NSCLC주에서도 활성화되며, 이 활성화는 이러한 세포의 형질전환 및 생존에 필요하다고 보고되어 있다.
STAT3의 활성화는 종종 리간드-수용체 상호작용을 포함한다. STAT3은 인터페론, EGF, G-CSF, 및 인터루킨(IL-6) 계열 사이토카인을 포함한 다양한 사이토카인에 의해 활성화될 수 있다. 사이토카인이 동족 수용체에 결합하면, JAK 인산화, STAT3 이량체화, 핵 전좌, DNA 결합 및 유전자 활성화로 이어진다(12, 13). 또한, STAT3 인산화는 Src 계열 키나아제와 같은 세포질 티로신 키나아제에 의해 유도될 수도 있다(14). 상승된 EGFR 활성과 STAT3 활성화는 NSCLC, 유방암, 두경부 암종을 포함한 많은 1차 종양 표본 및 종양 유래된 세포주에서 양성 연관성이 있는 것으로 보고되어 있다.
증가된 STAT3 활성은 돌연변이 EGFR을 발현하는 폐 선암 및 세포주에서 관찰된다. 특정 이론에 얽매이지 않고, STAT3은 돌연변이 EGFR에 의해 요구되고 하류 표현형 효과에 필요하다고 생각된다. 섬유아세포에서 STAT3 기능을 억제하면 돌연변이 EGFR에 의한 형질전환이 중단된다. 불행히도, TKI 및 ALK 억제제와 같은 표적 요법은 NSCLC 세포주에서 STAT3 활성을 완전히 제거할 수 없다.
이전 연구에서는 돌연변이 EGFR이 IL-6 상향조절을 통해 gp130/JAK/STAT3 경로의 활성화를 유도한다고 주장한다. IL-6 및 IL-6 수용체 성분 gp80 및 gp130의 종양 발현은 NSCLC 표본에서 발견되었다(20). IL-6 및 IL-8과 같은 전염증 사이토카인의 증가된 수준은 또한 NSCLC 종양발생 및 예후와 관련이 있는 것으로 관찰된다. 이는 IL-6 및 그 하류 경로가 EGFR 돌연변이를 지닌 NSCLC 환자의 표적이 될 가능성이 있음을 나타낸다. 그러나, NSCLC에서 발암성 EGFR 돌연변이에 의한 IL-6 유도에 대한 메커니즘은 불분명지만; NF-kB 및 STAT3 시그널링은 폐암에서 IL-6 자가분비를 조절하는 역할을 하는 것으로 생각된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 항 EGF 항체는 EGF-EGFR 결합(mAb)에 의해 활성화된 경로의 억제를 위해 본 발명에 따른 역형성 림프종 키나아제 억제제(ALK 억제제) 및 항-EGF 항체를 병용하기 위한 유연한 능동 요법을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, ELM4-ALK 융합 유전자를 발현하는 비조절된 인간 표피 성장 인자 수용체에 의해 유발된 암을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용되며, 여기에서 ALK 억제제는 약 10∼250㎎ 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 본 발명에 따른 EGF TPI는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회로 반복되는 치료 유효량을 달성하는 투약 요법에 따라 동시 투여된다.
본 발명의 추가 양태에 따르면, 항 EGF 항체는 ALK 억제제와 EGF에 대한 면역 반응을 생성하는 백신을 병용하기 위한 유연한 능동 요법을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, ELM4-ALK 융합 유전자를 발현하는 비조절된 인간 표피 성장 인자 수용체에 의해 유도된 암을 앓고 있는 환자의 백신접종에 의해 생성되며, 여기에서 ALK 억제제는 약 10∼250㎎ 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 본 발명에 따른 백신은 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회로 반복되는 치료 유효량을 달성하는 투여 요법에 따라 동시 투여된다.
본 발명의 방법은 NSLC의 치료에 한정되지 않는다. 대신에, 본 발명의 방법에 의해 증명된 생체 분자 경로 및 ALK 억제제 내성이 다른 질병 상태의 치료에 적용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이며; ALK 억제제를 사용한 치료의 임의의 질병 상태는 치료 중인 환자에게 유리한 결과를 야기할 수 있다. "유리한 결과"는 질병 상태의 중증도 감소, 질병 상태가 악화되는 것을 방지, 질병 상태를 치유하고 환자의 수명 또는 기대 수명을 연장하는 것을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 질병 상태는 EGFR 또는 본 발명의 방법으로 임상적으로 효과를 미칠 수 있는 임의의 다른 키나아제와 관련되거나 이에 의해 조절될 수 있다.
보다 구체적으로, 이하의 실시예에 제시된 본 발명자의 실험 연구는 이들 종양에 대한 분자 연구에서 일일 투여 요법으로 ALK 억제제의 임상 활성을 입증하여 EGFR 시그널링 캐스케이드의 효과적인 억제를 입증한다. 실시예는 분자 연구가 다른 모델 시스템에서 관찰된 바와 같이 이러한 ALK 억제제의 거동을 적절히 반영한다는 것을 확인한다. 본 개시는 또한 놀랍게도, 이러한 항체를 생성하는 백신의 투여에 의해 수동적으로 투여되거나 능동적으로 생성되는 항-EGF 항체와 병용된 ALK 억제제가 기존의 ALK 억제제 요법에 대한 내성을 입증한 종양에서도 분자 모델에서 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 입증한다.
하나의 예시적인 실시형태에 있어서, 임상전 연구에 사용된 항-EGF 항체는 PCT 출원 WO2019/016597 A2에 기재된 바와 같이 BVN22E 백신으로 면역화함으로써 능동적으로 생산된다: Synthetic Proteins and Therapeutic Uses Thereof. EGF 또는 EGFR에 대한 면역 반응을 생성하는 다른 백신 제형이 사용될 수 있다는 것이 본 개시의 범위 내에서 고려된다. 또한, 다른 성장 인자 또는 그 수용체에 대한 면역 반응을 생성하는 백신이 사용될 수 있다는 것이 본 개시의 범위 내에 있다. 특히, WO2019/016597 A2에 기재된 바와 같은 면역원성 단백질 BVN22E는 그 내용이 참조에 의해 전체적으로 포함되어 본 개시에 따른 항-EGF 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
BVN22E는 분자량이 약 120kDt이고, EGF 도메인은 β-루프를 나타내거나 제한하는 영역, 예를 들면 합성 단백질 서열의 약 시스테인 6∼약 시스테인 42에 의해 규정된 영역, 또는 약 시스테인 6∼약 시스테인 31에 의해 규정된 영역, 또는 시스테인 22∼약 시스테인 33에 의해 규정된 영역, 또는 시스테인 22∼시스테인 31에 의해 규정된 영역, 또는 약 시스테인 14∼약 시스테인 62에 의해 규정된 영역을 포함한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 시스테인 6과 시스테인 42 사이의 상이한 영역 또는 하위 영역은 합성 단백질/분자에 통합될 때에 유리한 효과를 가질 수 있다고 생각된다. 이하의 영역은 유리한 효과를 가질 수 있다: 시스테인 6과 시스테인 14 사이의 영역, 시스테인 6과 시스테인 20 사이의 영역, 시스테인 6과 시스테인 31 사이의 영역, 시스테인 6과 시스테인 33 사이의 영역, 및 시스테인 6과 시스테인 42 사이의 영역. 또한, 역순차적 서열이 유리할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들면, 이하의 영역은 유리한 효과를 가질 수 있다: 시스테인 42와 시스테인 33 사이의 영역, 시스테인 42와 시스테인 31 사이의 영역, 시스테인 42와 시스테인 20 사이의 영역, 시스테인 42와 시스테인 14 사이의 영역, 및 시스테인 42와 시스테인 6 사이의 영역. 시스테인 6과 시스테인 42 사이의 영역 내의 특정 간격이 본 개시의 합성 단백질/분자에 혼입될 때에 유리한 효과를 제공할 수 있음이 본 발명의 범위 내에서 더욱 고려된다(예를 들면, 시스테인 6과 시스테인 14 사이의 영역, 시스테인 14와 시스테인 20 사이의 영역, 시스테인 20과 시스테인 31 사이의 영역, 및 시스테인 33과 시스테인 42 사이의 영역).
BVN22E 및 그 성장 인자 에피토프의 발현은 이들의 천연 형태가 실질적으로 유지되고 상기 에피토프에 대한 강력한 숙주 면역 반응을 유도하는 방식으로 숙주 면역계의 구성요소에 제시되는 방식으로 폴딩된다. 합성 단백질/분자의 에피토프를 지원하는 도메인을 모델링하는데 적합한 천연 단백질 모델의 예는 콜레라 독소 B 서브유닛, 대장균(E. coli) 열 불안정한 LT 및 LT-II 장독소 B 서브유닛, 베라톡신, 백일해 독소, 캄필로박터(C. jejuni) 장독소, 시가 독소, 리스테리아 독소, 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 수막구균성(N.Meningitidisl) 외막 단백질, 박테리오파지 피막 단백질, 아데노바이러스 및 기타 바이러스 피막 단백질을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 또한, 단백질의 비자기 성분은 작을 수 있다. 최소한으로, 비자기 서열(들)은 약 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 포함하고, 적어도 하나의 인간 T-세포 에피토프를 전체적으로 또는 부분적으로 포함해야 한다. 콜레라 독소 B 서브유닛은 전체 단백질에 면역원성을 부여하고 숙주 면역계에 성장 인자, 수용체, 종양 항원 또는 그 에피토프를 적절하게 제시할 수 있는 요건을 충족시키는데 사용될 수 있다.
BVN22E는 유방암, 폐암, 방광암, 난소암, 외음부암, 결장암, 폐암, 뇌암, 대장암, 장암, 두경부암 및 식도암과 같은 만성 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 상이한 종양 항원이 발현될 수 있고 상기 질환에서 다중 세포 수용체 및 성장 인자가 과잉 발현될 수 있기 때문에, 본원에서 기재된 단백질은 하나 이상의 상이한 종양 항원, 하나 이상의 상이한 수용체, 또는 질환과 관련된 하나 이상의 다수의 세포 경로의 성장 인자를 함유할 수 있다. 이러한 단백질을 다가라고 한다.
BVN22E는 하나 이상의 표피 성장 인자(EGF) 중화 도메인(예를 들면, TSP 도메인)을 발현하는 균질한 합성 단백질/분자로 구성된 합성 단백질이다. 단백질은 합성 단백질/분자의 형태일 수 있으며, 만성 질환 예를 들면 유방암, 폐암, 방광암, 난소암, 외음부암, 결장암, 폐암, 뇌암, 대장암, 두경부암 및 식도암을 치료하는데 유용할 수 있다. BVN22E는 합성 EGF 서열 및 CT-B 서열을 발현하거나 포함하는 합성 단백질/분자이다. BVN22E는 EGF와 80% 미만의 유사한 서열을 포함하는 합성 단백질 서열의 성장 인자 성분을 포함한다. 예를 들면, 성장 인자 성분은 합성 단백질 서열의 성장 인자 부분의 면역원성을 증가시킬 수 있는 11개의 아미노산 치환을 갖는 EGF 서열을 포함할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, β-루프를 '제시'하거나 제한하는 EGF 영역(예를 들면, Cys6∼Cys31에 의해 규정된 영역)은 합성 단백질에 포함하는 것이 중요하며, 아미노산 변형에 대한 표적이 될 수 있다고 생각된다.
BVN22E는 하나 이상의 링커 또는 스페이서를 포함한다. 상기 기재된 하나 이상의 실시형태는 합성 분자의 sEGF 부분이 GGSGGTSGGGGGSG 링커에 의해 CT-B 부분으로부터 분리되도록 CT-B에 융합된 sEGF를 포함한다. 이러한 얻어진 재조합 또는 키메라 단백질은 본질적으로 CT-B에 직접 융합된 sEGF를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 키메라 단백질의 EGF 및 CT-B 성분은 3∼14개의 아미노산에 의해 효과적으로 분리되며, 이는 2개의 도메인 사이에 유연한 스페이서 또는 링커를 형성한다. 링커는 길이가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 아미노산 일 수 있는 것으로 고려된다. 성장 인자가 더 큰 크기(예를 들면, 인간 성장 인자)를 갖는 일부 경우에, 더 긴 링커 서열을 사용하는 것이 유용할 수 있다. 이하의 예시적인 링커가 또한 사용될 수 있으며, 이하를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: SSG, SSGGG, SGG, GSSG, GGSGG, GGGGS, SSGGGSGG, SSGGGGSGGG, TSGGGSG, TSGGGGSGG, SSGGGSGGSSG, GGSGGTSGGGSG, SGGTSGGGGSGG, GGSGGTSGGGGSGG, SSGGGGSGGGSSG, SSGGGSGGSSGGG 및 SSGGGGSGGGSSGGG. 당업자는 유용한 링커 서열로도 작용할 수 있는 주로 'G' 및 'S'의 다른 많은 서열/조합이 있음을 이해할 것이다.
BVN22E는 상당한 임상적 이점을 제공한다고 생각된다. 예를 들면, BVN22E는 정확하게 접히고 기능하는 안정적인 폴리펩티드를 생산하면서, 상업적 규모와 순도로 박테리아 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, BVN22E는 필요한 담체의 양이 종래기술의 방법보다 상당히 적기 때문에 백신접종을 위해 훨씬 더 낮은 수준의 단백질을 요구하는 유리한 특성을 가지고 있다(예를 들면, Davila 외, 미국 특허 번호 5,984,018). 이와 관련하여, BVN22E는 훨씬 적은 양의 백신으로 환자에게 더 많은 성장 인자를 전달할 수 있다.
이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 세포 증식을 담당하는 세포 신호전달을 자극하는데 필요한 STAT3 대사 경로의 이러한 억제는 BVN22E에 의해 도움이 되는 것으로 생각된다. 또한, 본 발명의 병용 투여 요법에 의한 STAT3의 추가 억제는이 세포 시그널링을 억제 또는 하향조절하는데 효과적이라고 생각된다. 또한, STAT3도 억제되기 때문에, 종래의 ALK 억제제 요법에 내성이 있는 환자도 본 발명의 병용 투약 요법에 의해 유리한 항종양 효과를 얻을 수 있다. 본 개시의 병용 요법은 통상적인 ALK 억제제 요법이 실패한 질환 상태의 장애와 관련될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 세포 및 분자 수준에서 통상적인 방법과 상이하게 작동함으로써 ALK 억제제 요법에 대한 내성 또는 무반응을 극복할 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, ALK 억제제와 항-EGF 항체의 병용 투여량은 통상적인 ALK 억제제 요법에 내성이 있는 개체에서 암, 특히 폐암, 유방암 및 전립선암을 치료하는데 효과적일 수 있다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 다른 형태의 암은 위암, 대장암 및 난소암뿐만 아니라, 교모세포종 종양을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 형태의 암 각각은 상당한 EGFR 발현을 나타내고, 본 발명의 방법에 따른 치료에 적합한 표적이 된다.
본 발명의 방법에 따라 사용하는데 적합한 ALK 억제제는 크리조티닙, 세리티닙, 알렉티닙, 브리가티닙 및 롤라티닙, 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 또는 등가물을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않고; 모두는 "ALK 억제제"라는 용어에 포함된다.
암에 대한 주어진 치료의 효력은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 예를 들면 종양의 징후 또는 증상 중 어느 하나 또는 전부가 유리한 방식으로 변경되거나 다른 임상적으로 허용되는 증상이 나아지거나, 또는 예를 들면 본원에 기재된 제제로 치료한 후 심지어 적어도 10%까지 개선되는 경우, 본원에서 사용되는 용어로서 "효과적인 치료"로 간주된다. 또한, 입원 또는 의료 개입의 필요성(즉, 질병의 진행이 중단됨)에 의해 평가된 대로 개인이 악화되지 않는 경우에도 효력이 측정될 수도 있다. 이들 지표를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고/또는 본원에 기재되어 있다.
질병의 치료를 위한 유효량은 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여될 때, 그 용어는 본원에 규정된 바와 같이 그 질병에 대해 효과적인 치료를 야기하는데 충분한 양을 의미한다. 제제의 효력은 예를 들면 암의 물리적 지표(예를 들면, 종양 크기, 종양 질량, 종양 밀도, 혈관 신생, 종양 성장 속도 등)를 평가함으로써 결정될 수 있다. 또한, 약제의 효력은 본원에 기재된 항체 또는 그 항원 결합 부분을 포함하는 제제, 또는 본원에 기재된 항체 또는 그 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산으로 치료되는 피험체에 있어서, 순환하는 MIC 펩티드 또는 그 단편의 감소에 의해 측정될 수 있다.
본 개시의 실시형태의 설명은 포괄적이거나 본 개시를 개시된 정확한 형태로 한정하려는 것은 아니다. 본 개시의 특정 실시형태 및 실시예가 예시적인 목적으로 본원에 설명되었지만, 관련된 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 본 개시의 범위 내에서 다양한 동등한 수정이 가능하다. 본원에 제공된 개시의 교시는 적절하게 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에서 설명된 다양한 실시형태는 조합되어 또 다른 실시형태를 제공할 수 있다. 필요에 따라서, 본 개시의 양태는 상기 문헌의 구성, 기능 및 개념, 및 응용을 사용하도록 수정되어 본 개시의 또 다른 실시형태를 제공할 수 있다. 이들 및 다른 변경은 상세한 설명에 비추어 본 개시에서 행해질 수 있다.
상술한 실시형태 중 임의의 특정 요소는 다른 실시형태의 요소와 조합되거나 대체될 수 있다. 또한, 본 개시의 특정 실시형태와 관련된 이점이 이들 실시형태의 맥락에서 설명되었지만, 다른 실시형태도 이러한 이점을 나타낼 수 있고, 모든 실시형태가 반드시 본 개시의 범위 내에 포함되는 이러한 이점을 반드시 나타낼 필요는 없다.
실시예
본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 설명되지만, 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 비소세포 폐암 세포주에서 ALK 억제제 및 항-EGF 항체의 조합 효과
ALK TKI로 치료받은 환자는 EGFR TKI로 치료받은 EGFR 돌연변이 환자에 비해 더 긴 무진행 생존 기간을 달성했다. 클리닉에서는 환자의 20∼30%가 빠르게 내성을 갖게 되었다. 그러나, 이러한 환자가 내성이 생기거나 반응이 없는지의 여부는 알려져 있지 않았다. 또한, 이러한 환자에서 EGF가 순환하는 효과가 무엇인지도 명확하지 않았다. 본 개시는 TKI 내성에 대한 EGF의 효과를 다루고 있으며, NSCLC 환자의 주요 ALK 재배열을 포함한 2개의 세포주를 사용했다.
이하의 ALK TKI(크리조티닙, 알렉티닙 및 브리가티닙)와 조합한 BVN22E 항체의 효과는 NSCLC 환자의 주요 ALK 재배열을 포함한 2개의 세포주에서 테스트되었다. ALK "재배열"은 다수의 상이한 돌연변이를 의미한다. 이러한 주는 도 1에 도시되어 있으며: EML4-ALK 융합 변이체 v1을 포함하는 H3122 폐 선암종 및 EML4-ALK 융합 변이체 v3을 포함하는 H2228 폐 선암종은 ALK 재배열 환자의 약 30∼40%를 나타낸다.
모든 연구와 얻어진 실시예는 토끼에서 준비된 항-BVN22E 항체로 수행된 다음 정제되었다. 2단계 정제 과정은 면역화된 토끼로부터 수집된 초기 혈청을 약 10배 희석시켰다. 모든 실험은 1∼10 희석이 원래 역가의 1∼100 희석에 상응하는 추가 희석으로 수행되었다.
브리가티닙과 알렉티닙이 H3122 세포 증식에 미치는 효과는 단독, 및 EGF의 존재 하에서 측정되었다. 결과는 도 2a-b를 참조하여, 브리가티닙 및 알렉티닙 단독은 각각 EGF의 존재 하에서의 브리가티닙 및 알렉티닙보다 H3122 세포 증식에 대해 더 큰 억제 효과를 가짐을 보여준다. 유사하게, 크리조티닙은 EGF의 존재 하에서 크리조티닙보다 H3122 세포 증식에 대해 더 큰 억제 효과를 가졌다(도 3 참조). EGF의 존재 하에서 H3122 세포에서 BVN22E 항체의 효과는 도 4에 도시된 바와 같이 72시간 세포 증식 분석에서 평가되었다. 데이터는 BVN22E 항체가 대조군 항체에 비해 H3122 세포 생존력의 감소를 유발했음을 입증했다.
다음으로, BVN22E 항체와 조합한 ALK 억제제의 효과를 측정했다. H3122 세포 72시간 세포 증식에 대한 단일 치료, 또는 BVN22E 항체와의 조합으로서 알렉티닙의 효과는 도 5에 도시되어 있다. H3122 세포 72시간 세포 증식에 대한 단일 치료, 또는 BVN22E 항체와의 조합으로서 크리조티닙의 효과는 도 6에 도시되어 있다. 두 TKI 억제제 모두에 대해, 억제제 단독에 대한 것보다 BVN22E 항체와 억제제의 조합으로 세포 생존력이 현저하게 감소한 것으로 나타났지만, BVN22E 항체와 조합한 알렉티닙의 효과가 크리조티닙에 대한 것보다 더 강했다. H31122 및 H2228 세포 생존력에 대한 단일 치료, 또는 BVN22E 항체와의 조합으로서 브리가티닙 및 알렉티닙의 효과는 도 7에 도시되어 있다.
H3122 세포에서 BVN22E 항체의 효과는 도 8에 도시된 바와 같이 1/25, 1/50 및 1/250의 농도로 BVN22E 항체를 2시간 배양한 후 웨스턴 블롯에 의해 평가되었다. EGFR, AKT, STAT 3 및 ERK1/2의 존재가 특정 모노클로날 항체로 밝혀졌다. 인산화된 형태의 분자에 대한 항체도 사용되었다. C는 대조군, 처리되지 않은 세포주 샘플을 나타낸다. 두 번째 레인은 EGF를 받는 동일한 대조군 세포, 대조군 항체 및 항 BVN22E 항체의 다른 모든 레인 희석이다. 이들 데이터는 pEGFR의 상당한 억제가 발생한 반면에, pAkt, pStat3 및 pErk½ 수준은 변하지 않았음을 보여준다. H3122 세포에서 BVN22E 항체의 효과는 도 9에 도시된 바와 같이 1/25, 1/50 및 1/250의 농도로 BVN22E 항체를 24시간 배양한 후 웨스턴 블롯에 의해 평가되었다. 이들 데이터는 pEGFR의 상당한 억제가 BVN22E 항체와 함께 배양한 후 24시간 유지되었음을 입증한다. H3122 세포에서 크리조티닙의 효과는 도 10에 도시된 바와 같이 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5 및 5의 농도로 크리조티닙을 2시간 배양한 후 웨스턴 블롯에 의해 평가되었다. 이들 데이터는 pStat3의 상당한 억제뿐만 아니라 pAkt의 억제가 크리조티닙과 함께 배양한 후 2시간 관찰되었음을 입증한다.
H2228 세포 증식에 대한 브리가티닙 및 알렉티닙의 효과는 단독 및 EGF의 존재 하에서 측정되었다. 결과는 브리가티닙 및 알렉티닙 단독이 각각 EGF의 존재 하에서 브리가티닙 및 알렉티닙보다 H3122 세포 증식에 대해 더 큰 억제 효과를 가짐을 보여준다(도 11 참조). 도 12는 단독 및 EGF의 존재 하에서 H3122 72시간 세포 증식에 대한 크리조티닙의 효과를 보여준다. 결과는 크리조티닙 단독이 EGF의 존재 하에서 크리조티닙보다 H3122 세포 증식에 더 큰 억제 효과를 가지고 있음을 보여준다. 도 13은 H2228 세포에서 EGF의 존재 하에서 BVN22E 항체의 세포 생존력에 대한 효과를 보여준다. 더 높은 농도의 BVN22E 항체에서, 세포 생존력의 상당한 감소가 관찰되었다.
다음으로, BVN22E 항체와 조합한 ALK 억제제의 효과를 측정했다. 단일 치료, 또는 BVN22E 항체와 조합한 H2228 세포 72시간 세포 증식에 대한 알렉티닙의 효과를 평가했다. 알렉티닙은 세포 생존력에 최소한의 효과를 미쳤지만, 더 높은 농도의 알렉티닙 및 BVN22E 항체의 조합은 세포 생존력의 상당한 감소를 유도했다(도 15 참조). 크리조티닙의 경우, BVN22E 항체와 조합한 낮은 농도의 크리조티닙도 세포 생존력의 상당한 감소를 유도했다(도 15 참조). BVN22E 항체와 조합한 ALK 티로신 키나아제 억제제 브리가티닙 및 알렉티닙은 H2228 세포에서 세포 증식의 현저한 억제를 유도했다(도 16a 참조).
H2228 세포에서 BVN22E 항체의 효과는 도 17에 도시된 바와 같이 1/25, 1/50 및 1/250의 농도로 BVN22E 항체의 2시간 배양한 후 웨스턴 블롯에 의해 평가되었다. 이들 데이터는 pERK1/2의 일부 억제와 함께 pEGFR의 상당한 억제가 발생했음을 입증하는 반면에, pAkt 및 pStat3 수준은 변하지 않았다.
H2228 세포에서 BVN22E 항체의 효과는 도 18에 도시된 바와 같이 1/25, 1/50 및 1/250의 농도로 BVN22E 항체의 24시간 배양한 후 웨스턴 블롯에 의해 평가되었다. 이들 데이터는 pEGFR의 상당한 억제가 BVN22E 항체와 함께 배양한 후 24시간 유지되었음을 입증한다.
H2228 세포에서 크리조티닙의 효과는 도 19에 도시된 바와 같이 00.025, 0.05, 0.1, 0.5, 1 및 2.5μM의 농도로 크리조티닙의 2시간 배양 후 웨스턴 블롯에 의해 평가되었다. 이들 데이터는 pStat3의 상당한 억제가 크리조티닙과 함께 배양한 2시간 후에 관찰되었음을 입증한다. 유사하게, 브리가티닙은 pSTAT3를 상당히 억제하고, 브리가티닙의 고농도(1 및 2.5μM)는 pEGFR 및 pAKT의 증가를 유도했다(도 20 참조). 특히, 브리가티닙과 조합한 BVN22E 항체는 H2228 세포에서 pEGFR 및 pERK의 활성화를 억제했다(도 21 참조).
브리가티닙은 pSTAT3를 상당히 억제하였고, H3122 세포에서 pERK1/2의 약간의 억제가 관찰되었다(도 22 참조). 더 높은 농도의 브리가티닙은 또한 pSTAT3를 상당히 억제하고, H3122 세포에서 pERK1/2를 약간 억제했다. 대조적으로, 브리가티닙과 조합한 BVN22E 항체는 H2228 세포에서 pEGFR 및 pERK의 활성화를 완전히 억제했다(도 24 참조).
환자는 ALK TKI의 단일 치료에 내성이 있는 것으로 알려져 있다. 다음으로, 크리조티닙 또는 알렉티닙과 BVN22E 항체의 조합이 H2228 세포에서 ALK TKI에 대한 내성 발병을 지연시킬 수 있는지의 여부를 조사했다. 이들 연구에서, TKI 억제제와 BVN22E 항체의 조합은 세포 배양 배지를 교체할 때마다 일주일에 1∼2회 세포에 첨가되었다. 내성 콜로니를 포함하는 웰의 백분율을 결정하기 위해 현미경으로 이미지화한 96웰 마이크로 플레이트에서 연구를 수행했다.
BVN22E 항체는 ALK TKI에 대한 내성의 시험관내 발병을 지연시켰다. 크리조티닙(도 25a), 및 더 큰 규모의 알렉티닙(도 25b)을 사용한 실험(도 25B)은 병용 치료가 더 오랜 기간 동안 증식 억제 상태를 유지하여 내성의 발병을 지연시키는 것으로 나타났다. 알렉티닙 단독에 대해, 모든 웰은 10주 후에 활성 복제를 보인 반면에, 조합은 더 긴 기간 동안 복제를 지연시켰다. 특히, BVN22E 항체의 최고 농도를 알렉티닙과 조합하여 사용했을 때, 25주까지 100% 내성에 도달하지 못했다. 도 25c(크리조티닙) 및 도 25d(알렉티닙)는 동일한 실험을 나타내지만, 양성 웰의 백분율 대신에 종양 세포가 없는 웰의 백분율을 보여주며; 이는 임상 시험에서 Kaplan Meyer 곡선과 유사한 방식으로 본 개시의 결과를 나타내고, y축 절편은 환자 생존이 0인 지점에 상응했다. 유사하게, H3122 세포에서 BVN22E 항체는 H3122 세포에서 0.1μM 및 0.2μM의 크리조티닙에 대한 내성의 출현을 지연시켰다(도 26 및 27 참조).
특히, 3일 증식 분석에서 ALK TKI 및 BVN22E 항체의 조합은 세포 증식의 시험관내 억제 및 EGF 신호전달의 조절의 측면에서, ALK TKI 단독에 비해 상당한 개선을 입증했다. 조합은 ALK TKI의 효과를 강화하고, ALK TKI의 부정적인 효과를 중화시켰으며, 평가된 모든 시그널링 분자의 억제를 확대했다. 이러한 EGF 시그널링의 더 강하고 광범위한 억제는 ALK TKI 단독에 비해 ALK TKI 및 BVN22E 항체의 존재 하에서 H228 세포에 의한 ALK TKI 내성의 발병이 최대 2배까지 지연시킴으로써 뒷받침되었다.
실시예 2: BRAF 및 KRAS 돌연변이 세포주에서 항-EGF 항체 및 트라메티닙의 조합 평가
대장암(CRC)은 가장 널리 알려진 종양 암 중 하나 일뿐만 아니라, 특히 치료하기 어려운 것으로 알려져 있다. KRAS 돌연변이가 없는 CRC 환자는 클리닉에서 세툭시맙 및 엘로티닙과 같은 EGF를 표적으로 하는 요법으로 치료할 수 있다. 그러나, KRAS 돌연변이, BRAF 돌연변이 또는 PIK3CA 돌연변이를 보유한 대규모 집단의 CRC 환자가 있다. 현재 이러한 환자를 위한 효과적인 치료법은 없다. 화학요법 및 혈관신생 표적화가 일반적으로 사용되고 있지만 상당한 단점이 있다.
KRAS, BRAF 또는 PIK3CA 돌연변이가 있는 CRC 환자의 치료 필요성을 해결하기 위해, MEK 억제제인 트라메티닙과 조합한 EGF 항체를 상술한 돌연변이를 가진 세포주에서 시험관내 테스트했다. 모든 실험은 BVN22E에 대한 항체와 함께 수행되었다.
또한, 대장 선암 세포주이지만 BRAF V66E 돌연변이를 갖는 HT29의 세포 생존력을 조사했다(도 28 참조). HT29 세포 생존력은 도 29에 도시된 바와 같이 EGF로 향상될 수 있다. 단독 및 조합으로 BVN22E 항체 및 트라메티닙의 세포 생존력에 대한 효과는 도 30 및 31에 도시된 바와 같이 HT29 세포에서 평가되었다. 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체는 트라메티닙 단독에 비해 세포 증식의 상당히 더 큰 억제를 나타냈다.
BVN22E 항체 및 트라메티닙이 HT29 세포 시그널링에 미치는 효과를 이해하기 위해서, HT29 세포에서 2시간 배양한 후 웨스턴 블롯을 수행했다. BVN22E 항체는 1/10 희석으로 사용되었다. 웨스턴 블롯의 결과(도 32 및 33)는 트라메티닙 및 BVN22E 항체의 조합이 EGF에 의해 유도된 pEGFR 및 pERK1/2의 억제를 강화했음을 보여준다. 이러한 결과는 HT29 세포에서 BVN22E 항체 및 트라메티닙의 상당한 조합 효과의 세포 증식 분석에서 관찰된 뚜렷한 효과를 확인했다.
프로피디움 요오드화물 염색을 사용하여 유세포 분석으로 개별 세포의 세포 주기 및 아포토시스 상태를 결정했다(도 34 참조). 이 방법은 KRAS 돌연변이(A549 및 DLD1) 및 ALK 전위(H2228 및 H3122) 세포주에 적용되었다.
DLD1 세포에서, EGF 단독은 EGF를 갖는 BVN22E 항체 또는 트라메티닙과 조합한 EGF를 갖는 BVN22E 항체보다 상당히 더 높은 백분율의 S 및 G2/M 상태 세포를 유도했다(도 35 참조). A549 세포에서 트라메티닙과 조합한 EGF로 BVN22E 항체를 가진 세포 주기 상태에서는 매우 작은 차이가 관찰되었다(도 36 참조). 대조적으로, H228 세포에서, BVN22E 항체 단독 또는 트라메티닙 단독 중 하나에 비해 트라메티닙과 조합한 EGF와 BVN22E 항체를 가진 S 및 G2/M 세포에서 상당한 감소가 있었다(도 37 참조). H3122 세포에서는 세포 주기 상태에서 매우 작은 차이가 관찰되었다(도 38 참조). 이러한 데이터는 TKI 억제제와 조합한 BVN22E 항체가 EGF에 의해 조절되는 세포 주기 진행을 잠재적으로 억제한다는 것을 나타낸다.
KRAS 돌연변이를 가진 4개의 세포주는 도 39에 도시되어 있다. A549는 G12S 돌연변이가 있는 폐 선암종이다. H23은 G12C 돌연변이가 있는 폐 선암종이다. DLD1은 G13D 돌연변이가 있는 결장 선암종이다. LS174T는 G12C 돌연변이가 있는 결장 선암종이다.
BVN22E 항체 단독의 효과는 DLD1 세포주에서 다음 평가되었다. 더 높은 농도의 BVN22E 항체는 대조군 항체에 비해 DLD1 세포 생존력을 상당히 억제했다(도 40 참조). 유사하게, BVN22E 항체와 조합한 트라메티닙은 DLD1 세포에서 트라메티닙 단독보다 훨씬 더 큰 세포 생존력의 억제를 유도했다(도 41 참조).
BVN22E 항체의 효과는 웨스턴 블롯을 통해 DLD1 세포에서 조사되었다(도 42 및 43 참조). BVN22E 항체 단독은 DLD1 세포주에서 한정된 효과를 가졌다. 예상대로 테스트된 모든 희석에서, EGFR 인산화는 강력하게 억제되었다. AKT의 인산화는 약간만 억제되었 뿐, ERK1/2의 활성화에는 영향을 미치지 않았다.
테스트된 모든 농도의 트라메티닙에 대해, 트라메티닙 단독에 비해 EGF의 존재 하에서 세포 생존력이 향상되었다. 더 높은 세포 생존력은 종양 세포 복제를 나타내며, 트라메티닙 과정은 억제하기 위한 것이므로 트라메티닙의 효력은 EGF의 존재 하에서 더 낮았다(도 44 참조).
DLD1 세포주에서 트라메티닙 처리의 효과는 또한 웨스턴 블롯 분석에서 평가되었고, 그 결과는 도 45에 나타냈다. pEGFR에도, pAKT에도 아무런 영향을 미치지 않았다. pStat3 및 pERK1/2의 억제는 환자에게 사용된 트라메티닙의 생리학적 농도를 초과하는 농도에서만 관찰되었다.
다음으로, 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 조합은 도 46에 도시된 바와 같이 DLD1 세포주에서 조사되었다. BVN22E 항체와 조합한 트라메티닙을 사용한 세포 생존율은 트라메티닙 단독 또는 대조군 항체와 조합한 것보다 현저히 낮았다. 이러한 결과는 BVN22E 항체로 EGF를 억제하는 것이 트라메티닙의 효과를 상당히 강화시켰음을 입증했다.
BVN22E 항체와 조합한 트라메티닙의 강화된 효과의 이면에 있는 메커니즘을 이해하기 위해서, 도 47에 도시된 바와 같이 DLD1 세포주에서 웨스턴 블롯 실험을 수행했다. 트라메티닙을 사용한 단독 처리는 pERK1/2의 억제를 제외하고, 분석된 시그널링 분자에 효과를 미치지 않았다. BVN22E 항체 단독으로 EGFR의 인산화를 억제했다. 특히, BVN22E 항체와 트라메티닙의 조합은 개별적으로 처리한 것보다 시그널링 억제에 더 큰 효과를 미쳤다. 조합에서, 트라메티닙을 사용한 BVN22E 항체는 pERK1/2 및 pEGFR 이외에도 pSTAT3 및 pAKT를 억제했다. 또한, 트라메티닙에 대한 내성의 발병은 트라메티닙 단독에 비해 트라메티닙의 존재 하에서 BVN22E 항체의 조합에서 지연되었다(도 48 참조).
결론적으로, BVN22E 항체의 첨가는 DLD1 KRAS 돌연변이 세포주에서 트라메티닙의 항증식 효과를 향상시켰다. 세포 생존력에 대한 트라메티닙 단독 효과는 EGF의 존재에 의해 상당히 억제되었다. 트라메티닙의 단독 처리는 pERK1/2 억제를 제외하고, 분석된 시그널링 분자에 효과를 미치지 않았다. BVN22E 항체만으로 EGFR의 인산화를 억제했다. 특히, BVN22E 항체와 트라메티닙의 조합은 DLD1 세포에서 개별적으로 처리한 것보다 시그널링 억제에 더 큰 효과를 미쳤다. BVN22E 항체와 트라메티닙의 조합은 pERK1/2 및 pEGFR 이외에도 pSTAT3 및 pAKT를 억제했다.
더 높은 농도의 BVN22E 항체는 도 49에 도시된 바와 같이 A549 세포주의 세포 생존력을 억제했다. A549 세포에서 BVN22E 항체와 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과는 도 50에 도시되어 있다. pERK1/2의 약간의 억제가 관찰되었으며, EGF에 의한 pEGFR 활성화의 완전한 억제가 관찰되었다. A549 세포에서 BVN22E 항체와 24시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과는 도 51에 도시되어 있으며; 24시간에서, 이 세포주에서 세포 시그널링에 대한 효과가 감소했다. A549 세포주에서 EGF의 유무에 있어서 트라메티닙의 세포 생존력에 대한 효과는 도 52에 도시되어 있으며, EGF는 세포 생존력을 상당히 향상시켰다. A549 세포에서 트라메티닙 단독 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과는 도 53에 도시되어 있으며; 이 초기 시점에서 pERK1/2의 완전한 억제가 관찰되었다. 도 54는 A549 세포에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체에 대한 세포 생존력에서 현저히 감소했지만, 감소는 본 개시에 나타낸 다른 세포 유형에 비해 더 낮았음을 보여준다.
EGF의 유무에 있어서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과는 2시간 배양 후 A549 세포에서 관찰되었다. EGF의 존재 하에서 pEGFR 및 pERK1/2 시그널링에 대한 가장 강력한 효과는 BVN22E 항체 단독 또는 트라메티닙과의 조합에서 관찰되었다(도 55 참조).
BVN22E 항체는 또한 H23 세포에서 세포 생존력을 상당히 억제했다(도 56 참조). H23 세포에서 BVN22E 항체의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)에 대한 효과는 2시간 배양 후에 관찰되었다(도 57 참조). BVN22E 항체는 H23 세포에서 EGF에 대한 반응으로 관찰된 pEGFR 및 pERK1/2의 증가를 완전히 제거했다. pEGFR 및 pERK1/2의 이러한 억제는 도 58에 도시된 바와 같이 24시간 유지되었다.
세포 생존력의 트라메티닙 억제는 H23 세포에서 EGF의 존재 하에 의해 상당히 억제되었다(도 59 참조). H23 세포에서 트라메티닙에 대한 반응으로 pEGFR(TYR 1068), pSTAT3(TYR 705), pAKT(SER 473) 및 pERK1/2(THR 202/TYR 204)의 효과는 2시간 배양 후에 관찰되었다. pERK1/2는 더 높은 농도의 트라메티닙에서 상당히 억제되었다(도 60 참조). 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체는 트라메티닙 단독에 비해 H23 세포의 세포 생존력을 상당히 억제했다(도 61 참조). H23 세포에서 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체의 2시간 배양에 대한 반응으로 pEGFR의 상당한 억제가 관찰되었다.
BVN22E 항체는 대조군 항체에 비해 LS174T 세포 생존력을 상당히 억제했다(도 63 참조). BVN22E 항체는 또한 LS174T 세포에서 pEGFR 및 pAKT 시그널링 모두를 억제했다(도 64 및 65 참조). 트라메티닙 단독은 LS174T 세포 증식을 억제했으며, 이 효과는 EGF가 존재할 때에 감소했다(도 66 참조). LS174T 세포주에서 트라메티닙의 효과는 2시간 배양 웨스턴 블롯 분석에서 평가되었다(도 67 참조). 트라메티닙은 1∼10nM의 생리학적 범위 내에서 테스트된 분자의 인산화에 효과를 미치지 않았다. 임상적으로 관련이 없는 더 높은 농도에서, pERK1/2에 대한 효과가 관찰되었다. 그러나, 항-BVN22E와 조합한 트라메티닙은 pAKT, pEGFR 및 pERK1/2를 억제하는 동시에, pSTAT3도 억제했다(도 68 참조). 따라서, BVN22E 항체는 시그널링 억제에 대한 트라메티닙의 효과를 확장시켰다.
LS174T 세포 생존력에 대한 BVN22E 항체와 트라메티닙의 조합을 조사했다. 도 69에서 볼 수 있듯이, 트라메티닙과 조합한 BVN22E 항체는 트라메티닙의 1∼10nM 범위, 즉 환자의 트라메티닙의 생리학적 수준에서 트라메티닙 단독에 비해 세포 생존력에 대한 효과를 상당히 증가시켰다. 그러나, DLD1 세포에서 BVN22E 항체와 트라메티닙의 조합의 효과에 비해, LS174T 세포에서 조합의 효과는 덜 두드러졌다.
LS174T KRAS 돌연변이 세포주에서, BVN22E 항체는 트라메티닙의 항증식 효과를 강화했다. 세포 생존력에 대한 트라메티닙의 억제 효과는 EGF의 존재에 의해 현저하게 감소되었다. BVN22E 항체만으로 pEGFR과 pAKT를 모두 억제했다. 그러나, 항-BVN22E와 조합한 트라메티닙은 pAKT, pEGFR 및 pERK1/2를 억제하는 동시에, pSTAT3도 억제했다. 따라서, 두 KRAS 돌연변이 세포주에서 BVN22E 항체는 세포 증식을 억제하는 트라메티닙의 효과를 강화하고, 시그널링 억제에 대한 트라메티닙의 효과를 확장시켰다.
실시예 3: SW900 세포에서 EGF 암 백신으로 면역화된 환자의 혈청 평가
SW900 야생형 세포에서 pEGFR에 대한 인간 환자(22180004) 항-EGF 혈청의 효과는 EGF의 존재 하에서 관찰되었다. 2a=백신접종 전 환자, 3d=백신접종 후 환자. pEGFR 활성화의 완전한 억제는 항-EGF 혈청의 존재 하에서 관찰되었고, pERK1/2의 일부 감소도 관찰되었다(도 70 참조). SW900 야생형 세포에서 pEGFR에 대한 2명의 추가 환자로부터의 인간 환자 항-EGF 혈청의 효과는 EGF의 존재 하에서 관찰되었다(도 71 참조). pEGFR 및 pERK1/2 활성화의 현저한 억제는 환자 27030004에서 관찰된 반면에, 환자 29080005에서는 둘 모두에 대해 적은 억제가 관찰되었다. 3명의 추가 환자로부터의 항-EGF 혈청의 결과는 도 72에 도시되어 있다. 2명의 환자(29040007 및 33080020)에 대해, pEGFR 및 pERK1/2 시그널링의 상당한 억제가 관찰되었다. 환자 31070004에 대해, 최소한의 변화가 관찰되었다. 도 70∼72의 결과는 도 73 및 74에 요약되어 있다.
(참조)
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Claims (9)

  1. ELM4-ALK 융합 유전자를 발현하는 비소세포 폐암(NSCLC)을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서,
    여기에서, 환자는 EGFR의 돌연변이된 형태를 발현하는 종양을 가지고, 역형성 림프종 키나아제 억제제(ALK 억제제)와 EGF를 표적으로 하는 능동 면역화를 병용하기 위한 유연한 능동 요법을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이 방법에 있어서, ALK 억제제는 치료학적으로 유효한 일일 투여량으로 투여되고, 능동 면역화는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회 반복되는 치료 유효량에 따라 동시 투여되는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    ALK 억제제는 크리조티닙, 세리티닙, 알렉티닙, 브리가티닙 및 롤라티닙, 또는 그 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, EGFR 치료의 돌연변이된 형태를 발현하는 종양을 가진 환자에게, 약 10∼250mg 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, EGF를 표적으로 하는 능동 면역화는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회 반복되는 치료 유효량에 따라 동시 투여되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    암은 그 전이성 형태를 포함하는 ELM4-ALK 융합 유전자를 발현하는 NSCLC이고, ALK 억제제는 크리조티닙, 세리티닙, 알렉티닙, 브리가티닙 및 롤라티닙, 또는 그 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, EGFR 돌연변이 및 ALK 억제제 치료에 대한 획득된 내성을 가진 환자에게, 약 10∼250mg 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, EGF를 표적으로 하는 능동 면역화는 일주일에 2회 또는 1회, 또는 2주에 1회 반복되는 치료 유효량에 따라 동시 투여되고,
    여기에서, 상기 방법은 ALK 억제제 치료에 대한 내성을 극복하는 결과를 야기하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    암은 그 전이성 형태를 포함하는 ELM4-ALK 융합 유전자를 발현하는 NSCLC이고, ALK 억제제는 크리조티닙, 세리티닙, 알렉티닙, 브리가티닙 및 롤라티닙, 또는 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, ALK 억제제 치료에 대한 획득된 내성을 가진 환자에게, 약 10∼250mg 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, EGF를 표적으로 하는 능동 면역화는 일주일에 2회 또는 1회, 또는 2주에 1회 반복되는 치료 유효량에 따라 동시 투여되는 방법.
  5. ELM4-ALK 융합 유전자를 발현하는 비소세포 폐암(NSCLC)을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서, ALK 억제제와 모노클로날 항-EGFR 항체의 수동 투여를 병용하기 위한 유연한 능동 요법을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기에서, ALK 억제제는 치료학적으로 유효한 일일 투여량으로 연속 요법에 따라 투여되고, 능동 면역화는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 또는 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회 반복되는 치료 유효량에 따라 동시 투여되는 방법.
  6. ELM4-ALK 융합 유전자를 발현하는 비조절된 인간 표피 성장 인자 수용체(HER/Human EGFR)에 의해 유발된 비소세포 폐암(NSCLC)을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서,
    여기에서, 환자는 EGFR의 돌연변이된 형태를 발현하는 종양을 가지고, ALK 억제제와 모노클로날 항-EGFR 항체의 수동 투여를 병용하기 위한 유연한 능동 요법을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기에서, ALK 억제제는 약 10∼250mg 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 능동 면역화는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 또는 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회 반복되는 치료 유효량에 따라 동시 투여되고, 상기 방법은 ALK 억제제 치료에 대한 내성 획득을 방지하는 결과를 야기하는 방법.
  7. 비조절된 인간 표피 성장 인자 수용체(HER/인간 EGFR)에 의해 유발된 비소세포 폐암(NSCLC)을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서,
    여기에서, 환자는 돌연변이된 ELM4-ALK 융합 유전자를 발현하는 종양을 가지고, ALK 억제제와 모노클로날 항-EGFR 항체의 수동 투여를 병용하기 위한 유연한 능동 요법을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이 방법에 있어서, ALK 억제제는 약 10∼250mg 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 능동 면역화는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 또는 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회 반복되는 치료 유효량에 따라 동시 투여되고, ALK 억제제 및 모노클로날 항-EGFR 항체의 투여는 그 후에 투여되는 방법.
  8. ELM4-ALK 융합 유전자를 발현하는 비조절된 인간 표피 성장 인자 수용체(HER1/인간 EGFR) NSCLC에 의해 유발된 비소세포 폐암(NSCLC)을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서,
    여기에서, 환자는 EGFR의 돌연변이된 형태를 발현하는 종양을 가지고, ALK 억제제와 EGF를 표적으로 하는 능동 면역화를 병용하기 위한 유연한 능동 요법을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 능동 면역화는 약 10∼250mg 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법으로 ALK 억제제를 투여하기 전에 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 또는 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회 반복되는 치료 유효량에 따라 투여되고, 상기 방법은 ALK 억제제 치료에 대한 내성 획득을 방지하는 결과를 야기하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    면역원성 단백질은 STAT3 활성화를 감소시키기 위해 치료량으로 투여되는 방법.
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