CN112996534A - 结合间变性淋巴瘤激酶抑制剂进行egf/egfr通路抑制的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

一种对患有由失调人表皮生长因子受体(HER1/人EGFR)驱动的癌症的患者进行治疗的方法，其包括向需要此类治疗的患者施用灵活主动的方案，以将间变性淋巴瘤激酶抑制剂(ALK抑制剂)与抗EGF抗体(mAb)相结合，其用于抑制由EGF‑EGFR结合激活的通路。抗EGF抗体可通过主动免疫接种产生，或通过施用抗EGF抗体被动提供。所述方法包括根据基于10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案施用ALK抑制剂，并根据给药方案，主动或被动地共同施用mAb，实现每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量。

Description

结合间变性淋巴瘤激酶抑制剂进行EGF/EGFR通路抑制的方法 和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月7日提交的第62/715,351号美国临时专利申请、2018年9月5日提交的第62/727,056号美国临时专利申请、2018年10月22日提交的第62/748,772号美国临时专利申请、2018年11月13日提交的第62/760,529号美国临时专利申请和2019年3月22日提交的第62/822,290号美国临时专利申请的权益，其中，所述美国临时专利申请的内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明的一些实施方案针对的是病症(如癌症)的治疗和预防方法，尤其是已经产生耐药性或对间变性淋巴瘤激酶抑制剂(ALK抑制剂)治疗无反应的个体。

背景技术

非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是造成全球癌症相关死亡的主要原因，尽管最近在治疗和诊断方面取得了一定进展，但是五年存活率仍保持在16％左右。预后不良主要由疾病晚期、疾病的顽固性和诊断时的转移程度导致。虽然在阐明导致恶性肿瘤细胞的基因异常方面取得了重大进展，但是目前可用的化学疗法仍然不能满足要求，大多数确诊患有癌症的患者的预后情况依然令人担忧。

大多数化学治疗剂作用于特异性分子靶标，并且研究人员认为该特异性分子靶标参与了恶性表型的发展。但是，由信号通路组成的复杂网络对细胞增殖进行调控，并且这些通路中的多种基因异常促进了大多数恶性肿瘤的形成。虽然采用标准细胞毒性化学疗法治疗肺癌的疗效得到了优化，但最新NSCLC治疗方法的依据是根据各自独特的致癌基因驱动物将NSCLC分为不同的分子亚群。在治疗上，NSCLC的分子驱动物会受到直接针对特异性致癌基因的靶向性试剂的攻击。

以前的大多数癌症化疗药物的活性是非选择性的。虽然其确切作用机制多变又复杂，但是它们一般通过对进行分裂的细胞发生损害来产生作用，与大多数正常组织相比，这种现象通常在恶性肿瘤中较为常见。靶向性试剂旨在通过调节肿瘤发生和癌症维持所必需和对此至关重要的蛋白质活性来达到其选择性作用，尤其是驱动恶性肿瘤不受控生长、血管生成、侵袭性和转移特征的酶。差别活性增高通常会降低令癌症患者感到不安的副作用，特别是降低恶心、呕吐以及骨髓和胃肠道内细胞死亡，提高对肿瘤细胞的有效性。

一批在癌症治疗中用于治疗干涉的有前景的靶标包括HER-激酶轴的成员。它们经常在实体上皮肿瘤(如前列腺、肺和乳腺肿瘤)中发生上调，在胶质母细胞瘤中也上调。表皮生长因子受体(EGFR)是HER-激酶轴的一个成员，并已成为开发若干不同癌症疗法的选择目标。由于EGFR通路活化需要酪氨酸残基的可逆性磷酸化，因此这些疗法中包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)。换言之，EGFR-TKI阻滞细胞表面受体是造成引起肿瘤细胞生长和分化的触发和/或维持细胞信号通路的原因。特别是，研究人员相信这些抑制剂会干扰EGFR激酶结构域。

不久前，研究人员在一部分非小细胞肺癌(NSCLC)患者的间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)受体酪氨酸激酶中发现了基因重排。不久后的研究证明，与化疗相比，克唑替尼(一种小分子ATP竞争性ALK抑制剂)对ALK阳性NSCLC患者的疗效更好。克唑替尼和另外两种ATP竞争性ALK抑制剂(色瑞替尼和阿来替尼)经批准用于这些患者的一线治疗，其中，目前利用免疫组织化学技术和原位杂交技术对ALK重排进行诊断。这三种ALK抑制剂在临床上取得的成功，使下一代ALK抑制剂得以发展，并获得更强的效力和选择性。然而，不幸的是，患者不可避免地对ALK抑制剂产生耐药性，其导致肿瘤复发，通常表现为脑转移。

间变性淋巴瘤激酶(ALK)重排定义了非小细胞肺癌的独特分子亚型。最近，随着ALK抑制剂的药力和选择性不断发展，ALK阳性的晚期NSCLC患者的治疗前景发生了转变。克唑替尼是首个进入临床开发的ALK抑制剂。在随机III期检测中，与细胞毒性化疗相比，克唑替尼在客观反应率(objective response rate，ORR)和无进展生存(progression-freesurvival，PFS)方面有显著改善，确立了克唑替尼作为ALK阳性的晚期NSCLC患者标准治疗方法的地位。

大多数患者对克唑替尼有反应，但最终都会在治疗后复发，一般一到两年内复发。经证明，对进展后活检标本的分析极有价值，其有助于更好地理解克唑替尼耐药性的分子机制。一般情况下，这类机制已分为涉及在靶基因改变(如ALK耐药性突变、ALK基因扩增)或脱靶耐药性机制(如旁路信号通路上调)，如EGFR、KIT、IGF-1R、SRC、MEK/ERK等。通常情况下，约三分之一接受克唑替尼治疗的患者中发现了在靶耐药机制。

最近，几种第二代ALK抑制剂在ALK阳性NSCLC中表现出了显著的活性。其中两种抑制剂，即色瑞替尼和阿来替尼，已经获得美国食品药品监督管理局(FDA)的批准，用于治疗克唑替尼难治性ALK重排的NSCLC。第三种抑制剂，即布加替尼，获得了FDA的突破性疗法认定，并于最近获得批准。在临床前研究模型中，第二代ALK抑制剂克服了耐克唑替尼的几种ALK突变。此外，在I-II期研究中，这些药物在耐克唑替尼的患者中显示出高ORR(48-71％)。重要的是，第二代ALK抑制剂在没有ALK耐药性突变或融合基因扩增的患者中也很活跃，这表明许多癌症由于对ALK的抑制不足而对克唑替尼产生了耐药性。然而，尽管第二代ALK抑制剂具有疗效，但患者几乎总是复发。

虽然几种新方法都旨在克服ALK阳性NSCLC中产生的各种耐药机制，包括不同ALK抑制剂基于知识的交替和连续使用，以及针对ALK+替代信号通路的联合疗法，但是仍然需要采取新方法解决耐药性问题。

发明内容

本发明的一个目的是一种对患有由ALK突变和ROS1重排驱动的癌症的患者进行治疗的方法，包括对需要此类治疗的患者施用灵活主动的方案，以将间变性淋巴瘤激酶抑制剂(ALK抑制剂)与活性EGF通路免疫接种(EGF PTI)相结合，以用于抑制由EGF-EGFR激活的通路，其中在该方法中，根据基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案施用ALK抑制剂，并根据给药方案共同施用EGF-PTI，实现每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量。

本发明的另一目的是一种对患有由ALK突变和ROS1重排驱动的非小细胞肺癌(NSCLC)的患者进行治疗的方法，其中患者患有表达EGFR突变形式的肿瘤，其包括向需要此类治疗的患者施用灵活主动的方案，以将ALK抑制剂与靶向EGF的主动免疫接种相结合，其中在该方法中，根据基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案和主动免疫接种施用ALK抑制剂，并根据每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量共同施用EGF-PTI，其中所述方法导致防止获得对ALK抑制剂治疗的耐药性。

本发明的另一目的是一种药物试剂盒，包含：第一隔室，其包含有效量的抗EGF靶向抗体；以及第二隔室，其包含有效量的ALK抑制剂。

本发明的另一目的是一种药物试剂盒，包含：第一隔室，其包含有效量的产生对EGF免疫应答的疫苗；以及第二隔室，其包含有效量的ALK抑制剂。

本发明的另一目的是一种药物试剂盒，包含：第一隔室，其包含有效量的产生对EGFR免疫应答的疫苗；以及第二隔室，其包含有效量的ALK抑制剂。

本发明的另一目的是一种ALK抑制剂，其用于通过与产生对EGF的免疫应答的疫苗共同施用来对患有由ALK突变和ROS1重排驱动的癌症患者进行治疗的方法，其中根据基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案施用ALK抑制剂，并根据每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量对需要这种治疗的患者共同施用产生对EGF的免疫应答的疫苗。

本发明的另一目的是ALK抑制剂在制备用于对患有由ALK突变和ROS1重排驱动的癌症的患者进行治疗的药物试剂盒中的用途，药物试剂盒包含：第一隔室，其包含有效量的产生对EGF的免疫应答的疫苗；以及第二隔室，其包含有效量的ALK抑制剂，该ALK抑制剂根据基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案施用，在开始ALK抑制剂治疗之前，根据剂量方案，即从平均每周剂量到每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量，对需要此类治疗的患者施用疫苗。

附图说明

通过本发明实施例的非限制性实施例，并参考所述多个附图，在以下具体实施方式中，对本发明做进一步说明，其中，类似的参考数字表示贯穿在几个附图视图中的类似部分，其中：

通过参考具体说明，并结合以下附图，可以对本发明有更全面的理解，其中：

图1示出了NSCLC细胞系，约占患者ALK重排的75％。H3122携带EML4-ALK v1融合，H2228携带EML4-ALK v3融合；

图2A-B显示了在H3122细胞系中存在和不存在EGF的情况下，布加替尼和阿来替尼对细胞生存力的作用；

图3显示了孵育72小时后，在H3122细胞系中存在和不存在EGF的情况下，克唑替尼对细胞生存力的作用；

图4显示了在H3122细胞系中孵育72小时后，BVN22E抗体对细胞生存力的作用。C-Ab为对照抗体；

图5显示了在H3122细胞中孵育72小时后，BVN22E抗体和阿来替尼联合使用对细胞生存力的作用；

图6显示了在H3122细胞中孵育72小时后，BVN22E抗体和克唑替尼联合使用对细胞生存力的作用；

图7A-B显示了在H3122和H2228细胞中，BVN22E抗体与Brigantinib和阿来替尼联合使用对细胞生存力的作用；

图8显示了在H3122细胞中，响应于与BVN22E抗体孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图9显示了在H3122细胞中，响应于与BVN22E抗体孵育24小时，对pEGFR(TYR1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图10显示了在H3122细胞中，响应于与克唑替尼孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR204)的作用；

图11显示了在H2228细胞系中存在和不存在EGF的情况下，布加替尼和阿来替尼对细胞生存力的作用；

图12显示了在H2228细胞系中存在和不存在EGF的情况下，孵育72小时后，克唑替尼对细胞生存力的作用；

图13显示了在H2228细胞系中孵育72小时后，BVN22E抗体对细胞生存力的作用。C-Ab为对照抗体；

图14显示了在H2228细胞中孵育72小时后，BVN22E抗体和阿来替尼联合使用对细胞生存力的作用；

图15显示了在H2228细胞中孵育72小时后，BVN22E抗体和克唑替尼联合使用对细胞生存力的作用；

图16A-B显示了在H2228细胞中，与Brigantinib和阿来替尼联合使用的BVN22E抗体对细胞生存力的作用；

图17显示了在H2228细胞中，响应于与BVN22E抗体孵育2小时，对pEGFR(TYR1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图18显示了在H2228细胞中，响应于与BVN22E抗体孵育24小时，对pEGFR(TYR1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图19显示了在H2228细胞中，响应于与克唑替尼孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图20显示了在H2228细胞中，响应于与布加替尼孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图21显示了在H2228细胞中，响应于与BVN22E抗体和布加替尼的联合使用孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图22显示了在H3122细胞中，响应于与布加替尼孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图23显示了在H3122细胞中，响应于与高浓度布加替尼孵育2小时，对pEGFR(TYR1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图24显示了在H3122细胞中，响应于与BVN22E抗体和布加替尼的联合使用孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和ERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图25显示了不同生长条件下，存在和不存在BVN22E抗体的情况下，H2228细胞中，对克唑替尼和阿来替尼产生耐药性的时间，表现为出现耐药性集落(上栏)和细胞死亡的延缓(下栏)；

图26显示了存在和不存在BVN22E抗体的情况下，H3122细胞中出现对克唑替尼0.1μM的耐药性；

图27显示了存在和不存在BVN22E抗体的情况下，H3122细胞中出现对克唑替尼0.2μM的耐药性；

图28示出了本发明中使用的BRAF突变细胞系。HT29株是源自于结肠腺癌的细胞系，并且包含V600E BRAF突变；

图29显示了EGF对HT29细胞生存力的作用；

图30显示了存在和不存在EGF的情况下，在HT29细胞中，BVN22E抗体对细胞生存力的作用；

图31显示了HT29细胞系中，与曲美替尼联合使用的BVN22E抗体对细胞生存力的作用；

图32显示了在HT29细胞中，响应于与曲美替尼孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图33显示了在HT29细胞中，响应于与BVN22E抗体和曲美替尼的联合使用孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图34示出了示意图，表明使用荧光染料染色、采用流式细胞术，能够确定单个细胞的细胞周期和细胞凋亡状态。该方法曾应用于KRAS突变体(A549和DLD1)和ALK转位(H2228和H3122)细胞系；

图35显示了BVN22E抗体与曲美替尼联合使用对DLD1细胞中的细胞循环的S和G2M阶段中细胞相对数量的作用；

图36显示了BVN22E抗体与曲美替尼联合使用对A549细胞中的细胞循环的S和G2M阶段中细胞相对数量的作用；

图37显示了BVN22E抗体与布加替尼联合使用对H2228细胞中的细胞循环的S和G2M阶段中细胞相对数量的作用；

图38显示了BVN22E抗体与布加替尼联合使用对H3122细胞中的细胞循环的S和G2M阶段中细胞相对数量的作用；

图39示出了本发明中使用的细胞系的KRAS突变。A549细胞含有G12S KRAS突变，H23细胞含有G12C KRAS突变，DLD1细胞含有G13D KRAS突变，LS174T细胞含有G12C KRAS突变；

图40显示了DLD1细胞中BVN22E抗体对细胞生存力的作用。

图41显示了在DLD1细胞中孵育72小时后，BVN22E抗体与曲美替尼联合使用对细胞生存力的作用；

图42显示了响应于BVN22E抗体在DLD1细胞中孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图43显示了响应于BVN22E抗体在DLD1细胞中孵育24小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图44显示了在DLD1细胞中，存在和不存在EGF的情况下，曲美替尼细胞对生存力的作用。

图45显示了响应于曲美替尼在DLD1细胞中孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图46显示了DLD1细胞中，BVN22E抗体与曲美替尼联合使用对细胞生存力的作用；

图47显示了在DLD1细胞中存在和不存在EGF的情况下，响应于BVN22E抗体与曲美替尼联合使用孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图48显示了DLD1细胞中BVN22E抗体对产生曲美替尼抗药性的作用；

图49显示了在A549细胞系中，BVN22E抗体对细胞生存力的作用；

图50显示了在A549细胞中，响应于与BVN22E抗体孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图51显示了在A549细胞中，响应于与BVN22E抗体孵育24小时，对pEGFR(TYR1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图52显示了在A549细胞系中，存在和不存在EGF的情况下，曲美替尼细胞对生存力的作用；

图53显示了在A549细胞中，响应于曲美替尼孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图54显示了在A549细胞中，与曲美替尼联合使用的BVN22E抗体对细胞生存力的作用；

图55显示了响应于与曲美替尼联合使用的BVN22E抗体孵育2小时，以及在A549细胞中存在和不存在EGF的情况下，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图56显示了H23细胞中，BVN22E抗体对细胞生存力的作用；

图57显示了在H23细胞中，响应于BVN22E抗体孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图58显示了在H23细胞中，响应于BVN22E抗体孵育24小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图59显示了在H23细胞中存在和不存在EGF的情况下，曲美替尼对细胞生存力的作用；

图60显示了在H23细胞中，响应于曲美替尼孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图61显示了在H23细胞中，与曲美替尼联合使用的BVN22E抗体对细胞生存力的作用；

图62显示了响应于与曲美替尼联合使用的BVN22E抗体孵育2小时，以及在H23细胞中存在和不存在EGF的情况下，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图63显示了在LS174T细胞系中，BVN22E抗体对细胞生存力的作用；

图64显示了在LS174T细胞中，响应于BVN22E抗体孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图65显示了在LS174T细胞中，响应于BVN22E抗体孵育24小时，对pEGFR(TYR1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图66显示了在LS174T细胞系中，存在和不存在EGF的情况下，曲美替尼对细胞生存力的作用；

图67显示了在LS174T细胞中，响应于曲美替尼孵育2小时，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图68显示了响应于与曲美替尼联合使用的BVN22E抗体孵育2小时，以及在LS174T细胞中存在和不存在EGF的情况下，对pEGFR(TYR1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图69显示了单独使用曲美替尼以及将其与BVN22E抗体联合使用时对LS174T细胞生存力的作用；

图70显示了人患者抗EGF血清在EGF存在的情况下对SW900细胞中pEGFR(TYR1068)的作用；

图71显示了在SW900细胞中，存在EGF的情况下，两种人患者抗EGF血清对pEGFR(TYR 1068)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图72显示了在SW900细胞中，存在EGF的情况下，三种人患者抗EGF血清对pEGFR(TYR 1068)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用；

图73A-B显示了图69-71所示的来自患者抗EGF血清的蛋白印迹的定量化总结；以及

图74A-D显示了来自图69-71所示SW900细胞中患者抗EGF血清的蛋白印迹的定量化。

具体实施方式

2007年，在一例非小细胞肺癌(NSLC)患者中，首次发现了EML4-ALK(棘皮动物微管相关蛋白4)融合癌基因。在2号染色体短臂颠倒后，使EML4基因启动子的N末端与间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的激酶结构域并置，而形成融合基因。形成EML4-ALK融合基因之后，EML4融合伴侣介导ALK的配体非依赖性活化和组成性激酶活性，使癌细胞的增殖和存活占NSLC的3％-7％。

ALK抑制剂针对导致肿瘤生长的(ALK)变异，如EML4-ALK转位。克唑替尼是2011年8月经FDA批准的首个ALK抑制剂，目前作为转移性ALK阳性NSCLC患者护理的标准药物。不幸的是，最初对克唑替尼有反应的大多数非小细胞肺癌(NSCLC)患者在开始治疗后一年内就出现了耐药性，并且病情退回到恶化。由于NSCLC细胞获得额外的ALK突变，因此似乎出现克唑替尼耐药性。即将获得FDA批准的下一代ALK抑制剂，即色瑞替尼(Zykadia)和阿来替尼(Alecensa)，可以抑制大多数临床上观察到的ALK突变，从而驱动对克唑替尼的耐药性；这两种疗法目前已获批用于治疗转移性ALK阳性NSCLC的患者，NSCLC或者在接受克唑替尼治疗后有所进展，或者起初经克唑替尼治疗后未见好转。

色瑞替尼、阿来替尼、布加替尼和劳拉替尼均为下一代抑制剂，其已经由FDA批准用于ALK阳性NSCLC。ALK抑制剂包括色瑞替尼(LDK378)、阿来替尼(RO5424802/CH5424802)、布加替尼(AP26113)、ASP3026、贝扎替尼(TSR-011)、劳拉替尼(PF-06463922)、恩曲替尼(RXDX-101)、恩沙替尼(X-396)和CEP-37440。

克唑替尼是一种高效c-Met和ALK抑制剂，在细胞检测中IC50分别为11nM和24nM。色瑞替尼(LDK378)是一种高效特异性ALK抑制剂，IC50为0.2nM。阿来替尼(CH5424802；RO5424802；AF802)是一种高效选择性口服ALK抑制剂，IC50为1.9nM。布加替尼是一种高度高效选择性ALK抑制剂，IC50为0.6nM。ASP3026是一种新型选择性ALK(间变性淋巴瘤激酶)抑制剂，IC50为3.5nM。贝扎替尼是一种高效口服ALK和TRKA、TRKB和TRKC双重抑制剂，对野生型重组的ALK激酶，IC50为0.7nM。劳拉替尼(PF-06463922)是一种高效ALK/ROS1双重抑制剂，对ROS1、野生型ALK和ALK-L1196M，Kis分别为0.02nM、0.07nM和0.7nM。恩曲替尼是一种高效口服Trk、ROS1和ALK抑制剂；能够抑制TrkA、TrkB、TrkC、ROS1和ALK，IC50值分别为1、3、5、12和7nM。恩沙替尼(X-396)是一种高效ALK/MET双重抑制剂，IC50分别为＜0.4nM和0.74nM。CEP-37440是一种新型的高效选择性FAK/ALK双重抑制剂，IC50为2.3nM(FAK)和120nM(ALK细胞在75％人血浆中的IC50)。IC50值：2.3nM(FAK)；120nM(ALK细胞在75％人血浆中的IC50)(WO 2013134353，A1 20130912)。

克唑替尼

随后的两项随机III期研究比较了克唑替尼与标准化学疗法，使克唑替尼完全获批，直到最近，还将克唑替尼定位为一线治疗ALK阳性NSLC的“金标准”。与II期研究数据一致，与化学疗法相比，克唑替尼的研究结果令人印象深刻，研究表明，orr(65％与20％)和pfs【危险比(hr)：0.49；7.7个月与3个月】均有所改善。然后，在未接受过ALK阳性治疗的患者中，将克唑替尼与铂类-培美曲塞化疗治疗进行比较。再次，与化学疗法相比，克唑替尼与orr(74％与45％)、mpfs(hr：0.45；10.9个月与7个月)以及重要的一点即生活质量的改善有关。整体存活率方面未见差异(Rothenstein等人《Current Oncology》期刊，2018年)。

色瑞替尼

色瑞替尼为首个下一代抑制剂，在治疗耐克唑替尼的ALK阳性NSLC方面显示出了良好效果。与克唑替尼相比，色瑞替尼对alk的抑制效力是克唑替尼的20倍，对已产生克唑替尼耐药性的患者的活检细胞系研究表明，对已发现的一些耐药性突变，色瑞替尼是一种高效抑制剂。

阿来替尼

阿来替尼是另一种高度选择性ALK抑制剂，对耐克唑替尼的ALK突变具有活性。阿来替尼的一项独特特征是，它不是P-糖蛋白的底物，P-糖蛋白被认为是服用克唑替尼的患者CNS耐药性的机制。阿来替尼现已确立为晚期ALK阳性NSCLC患者的一线治疗新标准。虽然对一线阿来替尼的大多数反应都很持久，但基本上所有患者都会产生耐药性，从而导致临床复发。另外两种二代ALK抑制剂——色瑞替尼和布加替尼——仅在未接受过克唑替尼治疗和/或耐克唑替尼设置下进行了检测。

第三代ALK/ROS1抑制剂劳拉替尼已完成I期和II期检测，并已在大量设置下进行了检测，包括未接受过ALK TKI治疗的患者、耐克唑替尼的患者或耐一种或多种二代ALK-TKI的患者。检测证明，劳拉替尼在所有设置下均具有抗肿瘤活性，包括经二代ALK抑制剂(如阿来替尼)治疗失败的患者。劳拉替尼具有高CNS渗透性，即使在经脑穿透性TKI(如阿来替尼)治疗失败的患者中，劳拉替尼也显示出了高效的颅内活性。基于I/II期研究的功效和安全性，劳拉替尼去年获得了FDA突破性治疗药资格，预计今年将获得加速批准，用于之前使用一种或多种ALK抑制剂治疗的ALK阳性患者。因此，克唑替尼以及跟随其后的二代ALK抑制剂的序贯疗法的范例正在被一种新的范例所取代，即阿来替尼以及跟随其后的劳拉替尼。

本申请中所述技术的实施例至少部分地基于这样的发现，即生理浓度的抗EGF抗体对EGFR的磷酸化具有抑制作用，Akt和ERK1/2的作用至少与ALK抑制剂对这些信号分子的作用同等重要。研究进一步发现，抗EGF抗体和ALK抑制剂的联合治疗显示出对pEGFR、pAkt、pERK1/2和pSTAT-3抑制的额外作用。在一些实施例中，在NSLC治疗方法中，可以采用此类抗体或其抗原结合片段。在本发明的范围内，预期可通过施用产生对EGF免疫应答的疫苗，使体内主动产生抗EGF抗体。在本发明的范围内，进一步设想，可以施用被动单克隆抗EFG抗体。

25例非小细胞肺癌患者(NSCLC——最常见的肺癌类型)中，有1例为ALK阳性(间变性淋巴瘤激酶阳性，或ALK+)肺癌。未吸过烟的年轻患者——通常为55岁及以下——最有可能诊断为ALK+。

间变性淋巴瘤激酶抑制剂(ALK抑制剂)通过干扰(或抑制)ALK信号通路起到抑制作用。为了使信号从一个激酶(钥匙)传递到另一个激酶(锁)，这两个激酶需要暂时结合在一起。激酶抑制剂通过暂时阻断一个激酶起到抑制作用，使另一个激酶无法接收第一个激酶。因此，必须达到一定浓度的激酶抑制剂，以便阻止信号足够频繁地传递(可能超过90％)，以便阻止激酶对某些基因的表达进行调节。

目前正在研制的大多数抗ALK肿瘤药物都旨在干扰(或抑制)ALK的信号通路(通过阻止ALK传递信号，也可通过阻止通路中的另一个激酶传递信号)。例如，一种ALK抑制剂旨在抑制ALK下游的AKT激酶。因此，正在对这种抑制剂进行检测，以判断其是否能够有效抑制ALK肿瘤及其他类型的肿瘤。

和其他激酶抑制剂一样，耐药性也是一个问题。然而，关于下一代ALK抑制剂耐药机制的数据很有限；几乎所有数据都是关于接受克唑替尼治疗后服用这些药物的患者。与其他TKI一样，在耐下一代ALK抑制剂的肿瘤中，观察到了靶位改变、替代信号通路活化和肿瘤表型改变。研究表明，与在接受克唑替尼治疗的患者的肿瘤中相比，ALK靶位改变更常见于下一代ALK抑制剂之后的肿瘤。观察到的最常见突变是G1202R，即一种ALK溶剂暴露区的突变，导致大多数ALK抑制剂的空间位阻效应。目前尚不清楚的是，在将下一代ALK抑制剂作为一代ALK抑制剂治疗的患者的肿瘤中，是否会观察到相同的耐药机制或相同的比例。

由于癌症最终会在1-2年内对一代ALK抑制剂克唑替尼产生耐药性，因此ALK阳性NSCLC显示出了可变的PFS。与EGFR类似，ALK的TK结构域也存在耐药性突变，最常见的是L1196M。这种突变会导致结合位点处的空间位阻，降低对克唑替尼的反应药力。然而，与EGFR-TKI耐药性不同的是，在ALK-TKI耐药性的情况下，存在多个激酶结构域突变(G1269A、G1202R、S1206Y、F1174C/L、D1203N)以及远离结合位点的突变(在1151、C1156Y、L1152R插入苏氨酸)。体外研究表明，不同的耐药性突变对具有结构差异的TKI产生不同程度的耐药性，其中凸显的需求是，在获得性耐药时通过重复癌症样本和更详细的测序方法而非FISH分析，对继发性耐药突变进行识别[69，70]。此外，通过FISH法检测，其他ALK-TKI耐药性病例仅显示了融合产物的扩增，其中一些病例显示了其中一个已识别的耐药性突变，其他病例仅显示了扩增。

克唑替尼是一种口服MET/ALK抑制剂，用作治疗具有ALK重排的晚期NSCLC的一线疗法。此外，临床试验正在对ALK具有更高的效力和选择性的较新的第二代ALK抑制剂进行评估。与克唑替尼类似，尽管这些药物在结构上不同于酪氨酸激酶，但它们却是ALK酪氨酸激酶的ATP竞争性抑制剂。色瑞替尼属于第二代抑制剂，在ALK阳性肺癌患者中显示出活性，包括对克唑替尼具有获得性耐药性的个体。经FDA批准，色瑞替尼可用于先前接受克唑替尼治疗的晚期ALK重排NSCLC患者。然而，对ALK抑制剂的反应较短暂，通常一年内出现耐药性。

自从ALK驱动的NSCLC治疗采用克唑替尼以来，在对克唑替尼产生获得性耐药性的约三分之一的肿瘤中，发现了EML4-ALK基因扩增或继发突变。体外研究表明，继发突变可驱动对克唑替尼的耐药性，但并非所有突变都能导致对结构上不同的第二代ALK抑制剂的耐药性。此外，在一组具有克唑替尼耐药性的肿瘤中，对EGFR、KIT和IGF-1R的活化进行了单独识别。虽然在具有获得性色瑞替尼耐药性的一部分肿瘤中发现了EML4-ALK的继发突变，但由于最近临床上采用了这些药物，因此对第二代ALK抑制剂的耐药性不太明显。

EGFR突变与对免疫检查点抑制剂的反应受损相关，开发EGFR突变体NSCLC的新型免疫治疗方法尤为重要。在包括未经选择的NSCLC患者在内的III期试验中，表皮生长因子(EGF)免疫接种显示出了疗效，但研究人员对疫苗接种产生的抗EGF抗体(抗EGF VacAb)的作用所涉及的机制，或其在EGFR突变的肿瘤细胞中的活性还不甚了解。

EGF疫苗接种构成了一种新的策略，与程序性死亡1阻断相反，其目的并非通过活化T细胞来逆转肿瘤诱导的免疫抑制。相反，它的目的是刺激B细胞产生中和抗体，分离循环中的EGF，从而阻止其与EGFR结合。EGF疫苗接种，又称为EGF-通路目标免疫，其耐受性良好，严重不良反应病例少，在两个纳入未经选择的晚期NSCLC患者的试验中取得了不错的效果(11、12和21)。然而，抗EGF抗体除了具有阻断配体结合和EGFR磷酸化的能力外，很少有人了解其作用所涉及的分子和细胞机制，或者它在具有EGFR突变或其他基因改变的肿瘤中的差别活性(22)。

本发明表明，在兔子体内培养的抗EGF VacAb抑制了EGF对EGFR突变型NSCLC细胞系，尤其是来自未经治疗患者的细胞系中的细胞增殖、细胞周期和信号转导通路的作用。实验中使用的EGF浓度(10ng/mL)与人体研究中报告的浓度接近，中位数约为1ng/mL，并显示出显著的个体间变异(11，23)。值得注意的是，研究人员还发现，在缺乏外源性EGF的情况下，抗EGF VacAb不仅能持续降低PC9细胞的pErk1/2水平，而且还能降低PC9-GR4细胞的pErk1/2水平，其中生长因子并未表现出任何显著作用。对于这项观察结果，其中一种可能的解释是，所使用的细胞系中存在受体/配体反馈环路。采用抗EGF疫苗进行免疫接种的患者，其血清也能有效阻断EGF对pErk1/2的活化。未免疫接种患者的对照血清对Erk1/2影响不大，但对Akt有很强的活化作用，这表明健康人血液中含有生长因子，能够特异性触发EGFR突变型细胞中的pAkt。相比之下，经分析，四名已接受免疫接种患者的血清在诱导Akt磷酸化时的活性较低。在已接种疫苗的个体的血清阻断Erk1/2磷酸化以及在较小程度上激活Akt的效力方面，可以观察到显著差异。作为仅完成III期试验的新治疗性方法，从接种EGF疫苗的患者身上获得的样本很有限，并且不可能与临床结果相关联。

之前的研究已经发现，EGF显著降低了TKI(如吉非替尼、厄洛替尼、阿法提尼和奥西替尼)在几个EGFR突变型NSCLC细胞中的抗增殖效应，这些细胞对EGFR TKI既有敏感性，又有耐药性。这一发现与蛋白质印迹法实验的结果相关，在该实验中，经EGFR TKI治疗后，如果存在EGF，则细胞中的pErk1/2水平明显提高。

高EGF水平的EGFR突变型患者对EGFR-TKI的预后可能较差。据报道，在未经选择的NSCLC患者中，两种EGFR配体转化生长因子α和双调蛋白时的血清水平升高，与对EGFR-TKI的不良反应相关。关于EGF，在迄今为止发表的唯一一项研究中，对于使用厄洛替尼治疗的11例EGFR突变型和21例EGFR野生型NSCLC患者，血清中的EGF与较短的无进展生存期相关。研究发现，在接受检测的EGFR突变型细胞系中，吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和奥希替尼与抗EGF VacAb联合使用比单独使用EGFR TKI具有更强的抗增殖作用，这一发现与pErk1/2的持续下降相关(图78，比较流通槽TKI+EGF与TKI+Ab+EGF)。联合使用在阻断EGF的抗凋亡和G2/M刺激作用方面也有明显优势。

在EGFR突变型细胞系模型中，还对抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗进行了检测。与抗EGF VacAb类似，西妥昔单抗在体外阻断配体结合，证明其在PC9和H1975细胞中能够阻止配体诱导的EGFR、Erk1/2和Akt磷酸化。然而，在其他EGFR突变型细胞系，如H3255或DFCILU-011.29中，它对EGFR下游信号的影响相对较小。关于受体下调，两种抗体之间似乎存在显著差异。在EGFR突变型细胞(如PC9、H1975或H3255)中孵育1小时至2小时后，西妥昔单抗已使总EGFR水平显著降低，而抗EGF VacAb在孵育24小时后并未引起受体的明显下调。最后，虽然有报道称，西妥昔单抗在EGFR野生型、头颈部癌细胞系和皮下肿瘤中扩增了诱导细胞凋亡和肿瘤退缩，但它未能增强吉非替尼在PC9异种移植物中的作用。

与此相反，抗EGF VacAb增强了EGFR TKI在PC9和其余EGFR突变型细胞系中的抗增殖活性。这种增强效应在所有病例中均达到了统计显著性，唯一例外的是PC9-GR4细胞。抗EGF VacAb以配体而非受体为靶标，并且不会诱导EGFR下调，这一事实可能能够解释西妥昔单抗和抗EGF抗体在作用方面存在的差异。

之前还发现，抗EGF VacAb的加入大大延缓了PC9细胞系中吉非替尼和阿法替尼耐药克隆的出现。抗EGF VacAb的加入持续抑制了TKI诱导的STAT3活化。相反，研究表明，pSTAT3在进展到西妥昔单抗的头颈部人肿瘤中升高，这表明STAT3活化参与了对这种药物的耐药性。

总之，在EGFR突变NSCLC细胞系中，抗EGF VacAb抑制了EGF的作用，同时显著增强了EGFR-TKI的抗肿瘤活性。它们还阻断了STAT3活化，降低了AXL表达，延缓了耐药性获得。因此认为，ALK抑制剂也可从抗EGF VacAb中受益。

有人认为，ALK在神经系统的发育和功能中起到重要作用，其响应于细胞外刺激，控制细胞增殖、存活和分化的基本机制。人癌症中最普遍的ALK基因异常就是染色体重排，从而导致融合基因。ALK融合产生于ALK的3′半部分(来源于保留其激酶催化结构域的染色体2)与提供其启动子的不同基因的5′部分融合。已经识别了多个不同的5′伴侣。野生型ALK通常通过配体与其细胞外结构域的结合获得活化，从而导致激酶结构域的二聚化和自磷酸化。结构研究表明，与多个5′伴侣融合有助于跳过这一要求，提高ALK的致癌潜能，非小细胞肺癌(NSCLC)中的NPM1-ALK和EML4-ALK也证明了这一点。引起激酶活化的拷贝数增加和激活点突变的存在也与ALK的致癌活性有关。这些基因改变存在于多种恶性肿瘤中，包括但不限于肺癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾细胞癌、炎性肌纤维母细胞瘤(IMT)和炎性乳腺癌。

为方便起见，本申请收录了本申请及说明书中使用的某些术语、实施例及所附权利要求书。除非另有说明或上下文有暗示，以下术语和短语包括下文提供的含义。除非另有明确说明，或从上下文来看，以下术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域中已经获得的含义。由于本发明的范围仅受权利要求书限制，因此，提供定义的目的是帮助描述特定的实施例，而并非旨在限制要求保护的发明。除非另有定义，否则本申请中使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

“下降”、“降低”、“降低的”、“减少”、“下降”和“抑制”在本申请中一般都用于表示相对于参考值，按统计显著量下降。然而，为避免产生疑问，“降低”、“减少”或“下降”或“抑制”通常意味着与参考水平相比下降了至少10％，并且可以包括例如，下降至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％，最高可达到并包括，例如与参考水平相比，完全没有给定的实体或参数，或者与没有给定的治疗相比，下降10至99％。

在本申请中，“增加了”、“增加”或“增强”或“活化”一般均指统计显著量的增加；为避免产生疑问，“增加了”、“增加”或“增强”或“活化”是指与参考水平相比至少增加10％，例如，与参考水平相比，增加了至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％，或最高达到并包括增加100％、或10至100％之间的任何增加，或增加至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍，或者与参考水平相比，增加2倍至10倍或更大倍数。

在核酸或多肽的情况下，本申请中使用的术语“分离的”或“部分纯化的”是指从至少一种其它组分(例如，核酸或多肽)分离出来的核酸或多肽，其与在其天然来源中发现的核酸或多肽一起存在，和/或在用细胞表达或者在分泌多肽的情况下分泌时，与核酸或多肽共存。化学合成的核酸或多肽，或利用体外转录/翻译合成的核酸或多肽可视为“分离”核酸或多肽。“纯化的”或“实质上纯化的”是指分离的核酸或多肽，其至少占受试者核酸或多肽的95％(按重量计)，例如包括至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多。

本申请中使用的“蛋白质”和“多肽”在本申请中可互换使用，以指定通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键连接到另一系列氨基酸残基的一系列氨基酸残基。本申请中可互换使用的术语“蛋白质”和“多肽”是指蛋白质氨基酸的聚合物，包括修饰的氨基酸(如磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物，无论其大小或功能如何。“蛋白质”和“多肽”通常用于指代相对较大的多肽，而“肽”通常用于指代较小的多肽，但是这些术语在本领域中的用法存在重叠。当提及编码基因产物及其片段时，“蛋白质”和“多肽”在本申请中可互换使用。

因此，典型的多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同系物、直向同源物、旁系同源物、片段及其它等效物、变体、片段及前述类似物。

本申请中使用的“抗体”包括任何免疫球蛋白分子，其通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点，识别并特异性结合到靶标，如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质等。本申请中使用的该术语在最广泛的意义上使用，并且包括全多克隆抗体、全单克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab′、F(ab′).sub.2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体(例如由至少两个全抗体产生的双特异性抗体)抗体、包含抗体部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子(只要抗体表现出所需的生物活性)。基于抗体的重链恒定区(分别称为α、δ、ε、γ和μ)的同一性，抗体可以采用五大类免疫球蛋白中的任何一类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同种类的免疫球蛋白具有不同的众所周知的亚单元结构和三维结构。抗体可以是裸抗体，或与其他分子如细胞毒素类、毒素、放射性同位素等结合。抗体可通过在体内主动产生或被动施用单克隆抗体进行施用。

本申请中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰核苷酸或碱基和/或其类似物，或者是可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应并入到聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含修饰核苷酸，如甲基化核苷酸及其类似物。

“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特点的糖蛋白。虽然抗体具有对特异性抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白既包括抗体，又包括通常缺乏抗原特异性的其他抗体样分子。例如，后一种多肽由淋巴系统产生时含量较低，而由骨髓瘤产生时含量增加。

“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛的意义上可互换使用，并且包括单克隆抗体(例如全长单克隆抗体或全单克隆抗体)、多克隆抗体、单价、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们表现出所需的抗体活性)，还可包括某些抗体片段(本申请中有更详细的说明)。抗体可以是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体和/或亲和力成熟抗体。

根据其重链的恒定区的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可分配到不同的类别。有五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步划分成亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgA-1、IgA-2等。与不同种类的免疫球蛋白相对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类免疫球蛋白的亚单元结构和三维结构已为人所熟知，并在例如Abbas等人《细胞与分子免疫学》第4版(2000年)中予以一般性说明。抗体可以是较大融合分子的一部分，它通过抗体与一个或多个其他蛋白质或肽的共价或非共价物理缔合作用而形成。

在本申请中，“全长抗体”、“全抗体”和“完整抗体”可互换使用，指的是一种具有大体完整形态的抗体，而非下文定义的抗体片段。这些术语特指具有包含Fc区的重链的抗体。

“抗体片段”仅包含全抗体的一部分，其中当存在于全抗体中时，该部分优选保留通常与该部分相关的至少一个功能，优选大部分或全部功能。在一个实施例中，抗体片段包括全抗体的抗原结合位点，因此保留了抗原结合能力。在一个实施例中，抗体片段包括全抗体的抗原结合位点，从而保留了抗原结合能力。在另一实施例中，抗体片段(例如包括Fc区的抗体片段)在存在于全抗体中时，保留了通常与Fc区相关联的至少一种生物功能，如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施例中，抗体片段是一种单价抗体，其体内半衰期基本上类似于全抗体。例如，这种抗体片段可包括抗原结合臂上的抗体，该抗原结合臂连接到Fc序列，该Fc序列能够赋予片段体内稳定性。

本申请中使用的“单克隆抗体”一词是指从一组基本上同质的抗体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能自然发生的突变以外，包括该组抗体的单个抗体包括了基本相同的氨基酸序列。单克隆抗体是针对单一抗原的具有高度特异性的抗体。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对的是抗原上的单个决定簇。

本申请中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中，一部分重链和/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人《美国科学院院报》81：6851-6855(1984))。

“人抗体”是一种具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的和/或已使用如本申请所公开的用于制备人抗体的任何技术制备的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义特别排除了包括非人抗原结合残基的人源化抗体。

本申请中提供的范围可理解为范围内所有值的简称。例如，1到50这个范围可理解为包括任何数字、数字组合或来自由以下数字组成的组的子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，以及上述整数之间的所有中间十进制值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。就子范围而言，需特别考虑从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1到50的嵌套子范围可以在一个方向上包括1到10、1到20、1到30和1到40，或者在另一个方向上包括50到40、50到30、50到20和50到10。

本申请中使用的“受试者”一词是指能够出现细菌感染的任何生物体。这种生物体包括但不限于人、狗、猫、马、牛、羊、山羊、老鼠、大鼠、豚鼠、猴子、禽鸟、爬行动物等。

本申请中使用的“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性还是良性)，以及所有前癌性和癌细胞及组织。“癌症”、“癌”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”并非如本申请所提及的那样相互排斥。

“癌症”和“癌”指的是或描述了哺乳动物的生理状态，其典型特征是不受控制的细胞生长/增殖。癌症的示例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这种癌症的更具体示例包括鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞肿瘤及各类头颈癌。

本申请中使用的“治疗”是指试图改变接受治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预，可用于预防性投药或在临床病理过程中进行。理想的治疗效果包括预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防或降低炎症和/或组织/器官损害、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态、病情缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体用于延缓疾病或病症的发展。

“BVN22E核酸分子”是指对BVN22E多肽进行编码的多核苷酸。下面再现了示例性BVN22E核酸分子(序列ID号：1)：

“BVN22E多肽”是指一种对以下氨基酸序列(序列ID号：2)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸相同度(不包括以下氨基酸变化：T2S、E3D、N4S、D5E、E11D、A12G、V38I、F44Y、R48K、D51E和A52L)的多肽或其片段：

“药用辅料”是指制药技术中常用的辅料，尤其是“药用辅料手册”(RaymondC.Rowe，PaulJ.Sheskey和PaulJ.Weller，2003年第4版)中的辅料，其内容全文并入本文件。

本发明的物质/分子的“治疗有效量”可根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及该物质/分子在个体中引发预期反应的能力等因素而变化。治疗有效量也指物质/分子的任何毒性或有害影响被治疗有益作用所抵消的量。“预防有效量”是指按照所需剂量和时间达到预期预防结果的有效量。由于预防剂量用于患病前或疾病早期的受试者，预防有效量通常但不一定小于治疗有效量。

“化学治疗剂”是一种可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的示例包括烷化剂类，诸如噻替派(thiotepa)和

环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸盐酯类，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯基胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；乙酸衍生物(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，

)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱；白桦脂酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)(

)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)、

)、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、东莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；卡拉汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素(cryptophycins)(尤其是隐藻素1和隐藻素8)；多拉斯他丁(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗肿瘤抗生素(enediyneantibiotics)(例如，卡里奇霉素(calicheamicin)，特别是卡里奇霉素gamma1I和卡里奇霉素omegaI1(参见例如Agnew《Chem Intl。Ed。Engl。》期刊，33：183-186(1994年))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；espmeramicin；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatinchromophore)及相关色素蛋白烯二炔类抗菌发色团(chromoprotein enediyneantiobiotic chromophores))、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oXo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)(包括

吗啉乙磺酸-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉并-多柔比星(pyrrolino-doxorubicin)、盐酸多柔比星脂质体注射液(

)和去氧阿霉素(deoxydoxorubicin))，表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)，诸如丝裂霉素C(mitomycin C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非美素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)(

)、替加氟(tegafur)(

)、卡培他滨(capecitabine)(

)、埃博霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)、叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸蝶呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄性激素，诸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；胺苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elformithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登素类化合物，诸如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；

多糖复合物(JHS Natural Products，美国俄勒冈州尤金市)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；22，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(

)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(

)、白蛋白包覆紫杉醇脂质纳米粒制剂(ABRAXANE^TM)和紫杉萜(

)；瘤可宁(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春花碱(vinblastine)(

)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(

)；奥沙利铂(oxaliplatin)；亮氨酸(leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine)(

)；诺安托(novantrone)；伊达曲杀(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸类，诸如视黄酸；上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种物质的组合，诸如CHOP，即环磷胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写，以及FOLFOX，即奥沙利铂(ELOXATIN^TM)与5-FU和亚叶酸联合治疗方案的缩写。

可使用任何表明患者受益的终点，对“患者反应”进行评估，包括但不限于：(1)在某种程度上抑制疾病进展，包括减缓和完全停止；(2)减少疾病发作和/或症状出现的次数；(3)缩小病灶大小；(4)抑制(即减少、减缓或完全停止)疾病细胞浸润到邻近的外周器官和/或组织；(5)抑制(即减少、减缓或完全停止)疾病扩散；(6)降低细胞增殖、侵袭或转移(可能但不必导致病变消退或消融)；(7)在某种程度上减轻一个或多个与病症有关的症状；(8)治疗后，无病表现时间延长；和/或(9)治疗后，给定时间点的死亡率降低。

“组织或细胞样本”是指从受试者或患者的组织中得到的类似细胞的集合。组织或细胞样本的来源可以是新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样本或活检或抽出物的实体组织；血液或任何血液成分；体液，诸如脑脊液、羊水、腹膜液或间质液；受试者怀孕或发育过程中任何时期的细胞。组织样本也可以是原代或已培养细胞或细胞系。任选地，组织或细胞样本从疾病组织/器官获得。组织样本可包含自然界中不与组织自然混合的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。

ALK抑制剂

ALK基因改变的治疗意义主要与ALK基因融合有关，并能预测肿瘤对ALK抑制剂的反应。克唑替尼、色瑞替尼和最近的阿来替尼经FDA批准用于治疗ALK融合肿瘤阳性的转移性NSCLC患者。早期的1期研究表明，克唑替尼在ALK融合阳性转移性NSCLC患者中产生了持续的反应。两项3期研究(最终使克唑替尼通过FDA批准)进一步证实，在既往未经治疗的晚期ALK重排NSCLC患者中，克唑替尼优于标准一线培美曲塞+顺铂化疗。

由于耐药性的发展导致疾病进展，所以，尽管克唑替尼在ALK融合阳性的NSCLC患者中表现出较高的活性，但持久反应仍然不常见，中位PFS为13个月。虽然研究人员仍在对耐药机制进行阐明，但是已知ALK激酶结构域(F1174L、F1174C、L1196M、I1171T、G1202R、S1206Y、G1269S和G1269A)或ALK基因扩增的获得性继发突变与耐药性有关。耐药性也可以通过激活替代ALK非依赖性存活通路予以介导，该通路阻碍了克唑替尼的有效性，包括表皮生长因子通路、胰岛素样生长因子通路、RAS/SRC信号、AKT/mTOR信号等。

ALK抑制剂布加替尼和劳拉替尼对几种已知的耐药突变有抑制作用，劳拉替尼对G1202R突变显示出了有效的抑制作用。这些结果表明，需要了解耐药机制和选择合适的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，以优化治疗反应。

除了ALK直接靶向治疗以外，还存在允许间接靶向治疗的药理学策略。具体而言，通过肺癌热休克蛋白(即HSP90)靶向治疗，已经成功地间接抑制了HSP90。HSP90(一种伴侣蛋白质，可稳定大量蛋白质，包括ALK)抑制在耐克唑替尼的ALK融合(EML4-ALK和NPM1-ALK)方面显示出了一些临床前疗效，包括肺癌模型中的继发耐药性突变体。

ALK重排肿瘤代表了能够利用目前可用的ALK抑制剂进行有效靶向的一个特定的肿瘤子集。因此，在已知具有这种分子畸变的肿瘤中检测ALK改变，现已成为诊断的必需部分。FISH、肿瘤组织的下一代测序(NGS)和循环肿瘤细胞的测序为检测ALK改变的肿瘤提供了替代性且通常具有补充性的方式。在TKI治疗过程中，几乎不可避免地出现耐药性，需要在复发时对肿瘤进行重复活检，以识别较新的ALK抑制剂和其他新的治疗策略可能针对的耐药机制。

克唑替尼具有氨基吡啶结构，它通过靶激酶的ATP结合盒内的竞争性结合，发挥蛋白激酶抑制剂的作用。约4％的非小细胞肺癌患者的染色体重排产生了EML4(‘棘皮动物微管相关蛋白样4’)和ALK(‘间变性淋巴瘤激酶’)之间的融合基因，导致了组成性激酶活性，这种活性促成了癌变发生，并且似乎能够驱动恶性表型。融合蛋白的激酶活性受克唑替尼抑制。这种基因融合的患者通常是年轻的不吸烟者，他们的表皮生长因子受体基因(EGFR)或K-Ras基因都没有突变。在大约15％的神经母细胞瘤病例中，ALK突变被认为是驱动恶性表型的重要因素，神经母细胞瘤是一种罕见形式的周围神经系统癌症，几乎只在非常年幼的儿童身上出现。克唑替尼抑制了c-Met/肝细胞生长因子受体(HGFR)酪氨酸激酶，该激酶参与许多其他组织学形式的恶性肿瘤的发生。

阿来替尼是一种酪氨酸激酶受体抑制剂和抗肿瘤药物，用于选定形式的晚期非小细胞肺癌的治疗。阿来替尼与治疗期间血清转氨酶水平暂时性升高的中等比率相关，并与临床上明显的急性肝损伤的极少数实例相关。

阿来替尼是一种具有抗肿瘤活性的受体酪氨酸激酶间变性淋巴瘤激酶(ALK)的口服抑制剂。给药后，阿来替尼结合并抑制ALK激酶、ALK融合蛋白以及被称为获得性抗小分子激酶抑制剂机制之一的看门人突变ALKL1196M。抑制导致ALK介导的信号传导中断，并最终抑制ALK过度表达肿瘤细胞中的肿瘤细胞生长。ALK属于胰岛素受体超家族，在神经系统的发育中起到重要作用。ALK调节异常和基因重排与一系列肿瘤相关。

阿来替尼是一种有机异四环化合物，即分别位于位置3、8和9的6，6-二甲基-5，6-二氢-11H-苯并[b]咔唑-11-携带额外氰基、4-(吗啉-4-基)哌啶-1-基和乙基取代基。用于(作为盐酸盐)间变性淋巴瘤激酶阳性、转移性非小细胞肺癌患者的治疗。它具有EC2.7.10.1(受体蛋白酪氨酸激酶)抑制剂和抗肿瘤剂的作用。它是一种有机异四环化合物、吗啉类的成员、哌啶类的成员、一种腈和一种芳香酮。它是阿来替尼(1+)的共轭碱。

布加替尼是下一代ALK抑制剂，其针对的是范围广泛的ALK突变和ROS1重排。目前，它也是唯一一种具有细胞系活性的ALK抑制剂，该细胞系在对表皮生长因子受体(EGFR)进行编码的基因中发生突变。在ALK中，在涉及患有克唑替尼难治性疾病的222名患者的AP26113(ALTA)肺癌试验中，按照推荐的给药方案，即每天一次，一次180mg(110名患者有为期7天导入期，剂量为90mg)，施用布加替尼，布加替尼与高系统反应率和CNS反应率和中位无进展生存时间16.7个月相关。该方案还与1-2期试验中服用克唑替尼的患者的类似的无进展生存期(16.3个月)相关。在这类患者中，这些无进展生存的中位率高于与其他下一代ALK抑制剂(包括阿来替尼、色瑞替尼、恩沙替尼和劳拉替尼)相关的中位率。

信号转导及转录激活子3(STAT3)是一种致癌性转录因子，在许多人癌症中具有活性，并对参与细胞周期进程、抗凋亡、细胞存活和血管生成的若干基因的转录进行调节。

STAT3可由EGFR、JAK2和其他酪氨酸激酶激活，这些酪氨酸激酶的活化可由EGF、白血病抑制因子(LIF)和其他细胞因子介导。因此，STAT3是许多信号通路的收敛点，在肿瘤的发生和转移中起到重要作用。有人认为，STAT3可由各种形式的突变型EGFR激活，并可能有助于这些突变体对成纤维细胞和人肺癌细胞的致癌作用。

在通过配体结合或突变进行激活后，EGFR启动了一系列信号转导通路，通过转录和翻译后机制改变细胞生物学。对这些变化进行介导的信号通路包括Ras-Raf-丝裂原活化蛋白(MAP)激酶(MAPK)、磷酸肌醇3-激酶-AKT以及信号转导及转录激活子(STAT)3和STAT5信号转导通路。转录因子的STAT家族通过磷酸化在保守的酪氨酸残基上激活，导致二聚化、核转位和DNA结合。STAT1、STAT3和STAT5也在其COOH末端的丝氨酸残基上磷酸化；磷酸化对二聚化、核转位和DNA结合不那么依赖，但一些基因的最大转录活性需要磷酸化。

有些非小细胞肺癌细胞系包含了具有组成性活性的STAT3。最近的研究表明，在遗传限定的系统中，STAT3由这些EGFR突变体激活。目前尚不清楚致癌特性介导需要突变型EGFR下游的哪种信号转导通路，然而，鉴于STAT3在范围广泛的人恶性肿瘤中的作用，并且STAT3由各种细胞类型的EGF所激活，可以认为，STAT3是体细胞突变型EGFR的致癌作用的必要条件。据报道，STAT3在表达突变型EGFR的成纤维细胞中，以及在两个自然发生EGFR突变的NSCLC细胞系中活化，并且这种活化是这些细胞转化和存活所需的条件。

STAT3的活化通常涉及配体-受体的相互作用。STAT3可由多种细胞因子激活，包括干扰素、EGF、G-CSF和白细胞介素(IL-6)家族细胞因子。细胞因子与其同源受体结合，导致JAK磷酸化、STAT3二聚化、核转位、DNA结合和基因激活(12，13)。此外，STAT3磷酸化也可由细胞质酪氨酸激酶(如Src家族激酶)诱导(14)。据报道，在许多原发性肿瘤标本和肿瘤细胞系中，包括NSCLC、乳腺癌和头颈癌，EGFR活性升高与STAT3活化呈正相关。

在肺腺癌和表达突变型EGFR的细胞系中，观察到STAT3活性增高。在不受任何特定理论约束的情况下，可以认为突变型EGFR需要STAT3，而且STAT3是其下游表型效应所必需的。抑制成纤维细胞中的STAT3功能取消了由突变型EGFR进行的转化。不幸的是，靶向治疗(如TKI和ALK抑制剂)不能完全取消NSCLC细胞系中的STAT3活性。

以往的研究表明，突变型EGFR通过IL-6上调，诱导gp130/JAK/STAT3通路的活化。在NSCLC标本中发现了IL-6和IL-6受体成分gp80和gp130的肿瘤表达(20)。研究中还观察到，促炎症细胞因子(如IL-6和IL-8)水平的升高也与NSCLC的肿瘤发生和预后有关。表明IL-6及其下游通路可能成为包含EGFR突变的NSCLC患者的靶标。然而，关于NSCLC中致癌性EGFR突变诱导IL-6的机制尚不清楚；然而，有人认为，NF-kB和STAT3信号负责在肺癌中调节IL-6自分泌。

根据本发明的一个方面，抗EGF抗体用于对患有由表达ELM4-ALK融合基因的不受控人表皮生长因子受体驱动的癌症患者进行治疗，该受体通过对需要此类治疗的患者施用灵活主动的方案，联合使用根据本发明所述的间变性淋巴瘤激酶抑制剂(ALK抑制剂)和抗EGF抗体，以便抑制由EGF-EGFR结合(mAb)激活的通路，其中，根据基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案，施用ALK抑制剂，并根据给药方案，共同施用本发明的EGF-PTI，实现了每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量。

根据本发明的另一个方面，通过对表达ELM4-ALK融合基因的不受控人表皮生长因子受体驱动的癌症患者进行疫苗接种，产生抗EGF抗体，通过对需要此治疗的患者施用灵活主动的方案，联合使用ALK抑制剂和疫苗，产生对EGF的免疫反应，其中，根据基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案，施用ALK抑制剂，并根据给药方案，共同施用本发明的疫苗，实现了每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量。

本发明的方法不局限于NSLC的治疗。相反，容易理解的是，通过本发明的方法解决的生物分子通路和取消的ALK抑制剂耐药性可以在治疗其它疾病症状方面得到应用；采用ALK抑制剂进行治疗的任何疾病症状都将在接受治疗的患者身上产生有益结果。“有益结果”可能包括但不限于减轻疾病症状的严重程度、防止疾病症状恶化、治愈疾病症状、延长患者的寿命或预期寿命。这些疾病症状可能与EGFR或任何其他可能受本发明方法临床影响的激酶有关，或由EGFR或所述激酶调节。

更具体地，以下实施例中阐述的发明人实验研究证明了ALK抑制剂在日常给药方案中的临床活性，在对这些肿瘤的分子研究中，证明了EGFR信号级联反应得到了有效抑制。实施例证实了分子研究正确地反映了在其他模型系统中观察到的这些ALK抑制剂的行为。本发明还意外地证明了，ALK抑制剂与抗EGF抗体(被动给予，或通过给予产生此类抗体的疫苗而主动产生)联合使用，可以在分子模型中有效地抑制肿瘤生长——甚至在证明对传统ALK抑制剂疗法具有耐药性的肿瘤中。

在一个说明性实施例中，通过BVN22E疫苗免疫接种，主动地产生临床前研究中使用的抗EGF抗体，如标题为“合成蛋白质及其治疗用途”的PCT申请WO 2019/016597 A2所述。在本发明的范围内，可以摄像，使用对EGF或EGFR产生免疫应答的其他疫苗制剂。在本发明的范围内，也可使用对其他生长因子或其受体产生免疫应答的疫苗。特别地，WO 2019/016597 A2中所述的免疫原性蛋白质BVN22E(其内容通过引用全文并入本文件)可用于产生本发明的抗EGF抗体。

BVN22E的分子量约为120kDt，其EGF结构域包括呈现或限制β-环的区域，例如合成蛋白质序列由约半胱氨酸6至约半胱氨酸42定义的区域、由约半胱氨酸6至约半胱氨酸31定义的区域，或由约半胱氨酸22至约半胱氨酸33定义的区域，或由约半胱氨酸22至约半胱氨酸31定义的区域，或约半胱氨酸62至约半胱氨酸14定义的区域。在不受任何特定理论约束的情况下，可以设想，在并入合成蛋白质/分子时，半胱氨酸6和半胱氨酸42之间的不同区域或子区域可能具有有益效果。有人认为，以下区域可能具有有益效果：半胱氨酸6和半胱氨酸14之间的区域、半胱氨酸6和半胱氨酸20之间的区域、半胱氨酸6和半胱氨酸31之间的区域、半胱氨酸6和半胱氨酸33之间的区域以及半胱氨酸6和半胱氨酸42之间的区域。还可以设想的是，反向渐进序列也可能是有益的序列。例如，以下区域可能具有有益效果：半胱氨酸42和半胱氨酸33之间的区域、半胱氨酸42和半胱氨酸31之间的区域、半胱氨酸42和半胱氨酸20之间的区域、半胱氨酸42和半胱氨酸14之间的区域以及半胱氨酸42和半胱氨酸6之间的区域。在本发明范围内，可以进一步设想的是，在并入本发明的合成蛋白质/分子时，半胱氨酸6和半胱氨酸42之间的区域内的特定间隔可以提供有益效果(例如，半胱氨酸6和半胱氨酸14之间的区域、半胱氨酸14和半胱氨酸20之间的区域、半胱氨酸20和半胱氨酸31之间的区域以及半胱氨酸33和半胱氨酸42之间的区域)。

BVN22E及其生长因子表位的表达以允许基本保留其天然构象的方式进行折叠，并以引起对所述表位的强大宿主免疫应答的方式，呈现给宿主免疫系统的各个组成部分。用于模拟合成蛋白质/分子表位支持域的合适的天然蛋白质模型的示例，包括但不限于霍乱毒素B亚单位、大肠杆菌不耐热LT和LT-II肠毒素B亚单位、肠毒、百日咳毒素、空肠弯曲菌肠毒素、志贺毒素、李斯特菌毒素、破伤风类毒素、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白、噬菌体外壳蛋白、腺病毒及其它病毒外壳蛋白质。或者，蛋白质的非自身成分可以很小。非自身序列应至少包含长度约为9、10、11或更长的氨基酸，并全部或部分包括至少一个人T细胞表位。可采用霍乱毒素B亚单位，满足赋予整个蛋白质免疫原性并允许向宿主免疫系统适当呈现生长因子、受体、肿瘤抗原或其表位的要求。

BVN22E可用于治疗慢性疾病，例如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、肺癌、脑癌、大肠癌、肠癌、头颈癌和食道癌。在所述疾病中可以表达不同的肿瘤抗原和过度表达多个细胞受体和生长因子，因此，下文所述的蛋白质可以包含一个或多个不同的肿瘤抗原、与疾病相关的一个或多个细胞通路的一个或多个不同的受体或生长因子。这些蛋白质称为多价体。

BVN22E是一种由表达一个或多个表皮生长因子(EGF)中和域(例如TSP域)的同质合成蛋白质/分子组成的合成蛋白质。该蛋白质可以具有合成蛋白质/分子的形式，并可用于治疗慢性疾病，例如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、肺癌、脑癌、大肠癌、头颈癌和食道癌。BVN22E是一种表达或包含合成EGF序列和CT-B序列的合成蛋白质/分子。BVN22E包含合成蛋白质序列的生长因子成分，该合成蛋白质序列包括一个与EGF相同度不到80％的序列。例如，生长因子成分可包括具有11个氨基酸取代的EGF序列，可以增加合成蛋白质序列的生长因子部分的免疫原性。在不受理论约束的情况下，有人认为，“呈现”或限制β-环的EGF区域(例如，由Cys6到Cys31定义的区域)可能是包含在合成蛋白质中的重要区域，并适合作为氨基酸修饰的靶标。

BVN22E包括一个或多个连接器或间隔器。上述一个或多个实施例包括融合到CT-B的sEGF，使得合成分子的sEGF部分通过GGSGGTSGGGGGSG连接器与CT-B部分分离。这些由此产生的重组或嵌合蛋白质基本上包括直接与CT-B融合的sEGF。在其他实施例中，嵌合蛋白的EGF和CT-B成分由3到14个氨基酸进行有效分离，在两个结构域之间形成一个柔性间隔器或连接器。可以设想，连接器的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。在生长因子具有较大尺寸的某些情况下(例如人生长因子)，可能比较有用的做法是，使用较长的连接器序列。还可以使用以下示例性连接器，其包括但不限于以下：SSG，SSGGG，SGG，GSSG，GGSGG，GGGGS，SSGGGSGG，SSGGGGSGGG，TSGGGSG，TSGGGGSGG，SSGGGSGGSSG，GGSGGTSGGGSG，SGGTSGGGGSGG，GGSGGTSGGGGSGG，SSGGGGSGGGSSG，SSGGGSGGSSGGG，以及SSGGGGSGGGSSGGG。本领域技术人员将会理解的是，还有很多其他序列/组合(主要是“G”和“S”)也将作为有用的连接器序列。

研究人员认为，BVN22E具有显著的临床效益。例如，BVN22E可以在商业规模和纯度的细菌系统中进行表达，同时产生正确折叠且具有功能性的稳定多肽。此外，由于所必需的载体量显著低于现有技术方法(例如，美国专利号5,984,018，Davila等人)，BVN22E还具有接种需要的蛋白质水平低得多这一有利性质。在这方面，BVN22E能够以显著较低的疫苗量，向患者输送更多的生长因子。

虽然不希望受到任何理论的约束，但是研究人员相信，对STAT3代谢通路的这些抑制(刺激负责细胞增殖的细胞信号通路所需的)由BVN22E协助进行。研究人员还相信，借助本发明的联合给药方案，对STAT3进行额外抑制，可有效抑制或下调细胞信号。此外，由于STAT3也受到抑制，因此借助本发明的联合给药方案，即使对常规的ALK抑制剂治疗产生耐药性的患者，也可以获得有益的抗肿瘤效果。本发明的联合疗法可能与常规ALK抑制剂疗法未能取得成功的疾病症状的障碍有关。因此，通过在细胞和分子水平上以不同于常规方法的方式进行操作，本发明的方法可以克服对ALK抑制剂治疗的耐药性或无反应性。

在特定的实施例中，ALK抑制剂与抗EGF抗体的联合剂量可以有效地治疗对常规ALK抑制剂治疗具有耐药性的个体所患的癌症，特别是肺癌、乳腺癌和前列腺癌。可以用本发明的方法治疗的其他形式的癌症包括但不限于胃癌、大肠癌和卵巢癌以及胶质母细胞瘤。每种形式的癌症都表现出显著的EGFR表达，使其成为合适的靶标，以便按照本发明的方法进行治疗。

适用于按照本发明的方法使用的ALK抑制剂可以包括但不限于克唑替尼、色瑞替尼、阿来替尼、布加替尼和劳拉替尼，或其药学上可接受的盐，或其等效物；这些药物均纳入术语“ALK抑制剂”之范围。

给定癌症治疗的疗效可以由熟练的临床医生决定。然而，根据本申请中对“有效治疗”一词的使用，如果(例如肿瘤)任何一个或所有体征或症状以有益的方式改变，或者其他临床接受的症状得到改善，甚至减轻，例如在使用本申请中所述的药剂治疗后至少改善10％，则认为此次治疗为“有效治疗”。疗效也可以按照个体病情没有恶化(通过住院或需要医疗干预(即疾病进展停止)进行评估)加以测定。本领域技术人员知道和/或本申请说明了测定这些指标的方法。

根据本申请中对该疾病的定义，疾病治疗的有效量是指在对需要该有效量的哺乳动物施用时，足以有效治疗该疾病的量。通过评估物理指标，例如癌症的物理指标，例如肿瘤大小、肿瘤质量、肿瘤密度、血管生成、肿瘤生长率等，可以确定一种药剂的功效。另外，可以通过降低正在接受药剂(包括本申请中所述的抗体或其抗原结合部分，或本申请中所述的对抗体或其抗原结合部分进行编码的核酸)治疗的受试者的循环性MIC胜肽或其片段来测定药剂的功效。

对本发明实施例的说明并非旨在穷尽或将本发明限定在所公开的精确形式。虽然本发明的具体实施方式和实施例在本申请中出于说明目的进行了描述，但是相关领域的技术人员将会认识到，在本发明的范围内，可能存在各种等效的修改。适当时，本申请中提供的本发明的教导可应用于其它程序或方法。本申请中所述的各种实施例可以进行组合，以提供进一步的实施例。如有必要，可以修改本发明的各个方面，以利用上述参考文献和申请的组成、功能和概念，提供本发明的又一实施例。可以根据说明书，对本发明做出这些和其他变更。

上述实施例中任何一个实施例的特定要素可以加以组合或替换成其他实施例中的要素。此外，虽然在这些实施例的上下文中描述了与本发明的某些实施例相关的优点，但是其他实施例也可以展示这些优点，而且并非所有实施例都有必要展示这些优点才能属于本发明的范围。

实施例

本发明通过以下实施例进一步说明，而不应将其解释为对本发明加以限制。

实施例1：在非小细胞肺癌细胞系中联合使用ALK抑制剂和抗EGF抗体的作用。

与采用EGFR-TKI治疗的EGFR突变患者相比，采用ALK-TKI治疗的患者达到了更长的无进展生存期。在临床上，20-30％的患者会迅速产生耐药性，但是不知道这些患者是否会产生耐药性或从未出现反应。目前还不清楚循环EGF在这些患者中的作用。本发明提出了EGF对TKI耐药性的作用，采用了两种细胞系，其中包含NSCLC患者的主要ALK重排。

在两个含有NSCLC患者主要ALK重排的细胞系上，对BVN22E抗体与以下ALK-TKI——克唑替尼、阿来替尼和Brigantinib——的联合作用进行了检测。ALK“重排”是指一系列不同的突变。这些细胞系如图1所示：H3122肺腺癌，含有EML4-ALK融合变异体v1，H2228肺腺癌，含有EML4-ALK融合变异体v3，合计约占ALK重排患者的30-40％。

所有研究和由此得到的实施例均采用在兔子身上制备然后纯化的抗BVN22E抗体进行。经过两步纯化过程，从经免疫接种的兔身上采集的初始血清稀释了约10倍。所有实验均进行进一步稀释，其中1-10稀释对应于原始滴度的1-100稀释。

存在EGF的情况下，单独测定了布加替尼和阿来替尼对H3122细胞增殖的作用。结果(见图2A-B)表明，单独使用布加替尼和阿来替尼对H3122细胞增殖的抑制作用大于存在EGF的情况下使用布加替尼和阿来替尼对H3122细胞增殖的抑制作用。同样，存在EGF的情况下，克唑替尼对H3122细胞增殖的抑制作用大于克唑替尼对H3122细胞增殖的抑制作用，见图3。在72小时的细胞增殖试验中，对存在EGF情况下H3122细胞中BVN22E抗体的作用进行了评价，如图4所示。数据表明，与对照抗体相比，BVN22E抗体可使H3122细胞生存力下降。

接下来，测定了ALK抑制剂与BVN22E抗体联合使用的作用。阿来替尼单独治疗或与BVN22E抗体联合治疗对H3122细胞72小时增殖的作用如图5所示。克唑替尼单一治疗或与BVN22E抗体联合使用对H3122细胞72小时增殖的作用如表6所示。对于这两种TKI抑制剂，BVN22E抗体与抑制剂联合使用比单独使用任何一种抑制剂都能更加显著地降低细胞生存力，但是阿来替尼与BVN22E抗体联合使用的作用强于克唑替尼。布加替尼和阿来替尼单一治疗或与BVN22E抗体联合使用对H31122和H2228细胞生存力的作用如图7所示。

经浓度为1/25、1/50和1/250的BVN22E抗体孵育2小时后，采用免疫印迹法，对BVN22E抗体在H3122细胞中的作用进行评价，如图8所示。研究表明，特异性单克隆抗体存在EGFR、AKT、STAT 3和ERK1/2。还使用了磷酸化形式分子的抗体。C代表对照、未处理的细胞系样本。第二通道是接收EGF的同一对照细胞，所有其他通道均为对照抗体和抗BVN22E抗体的稀释度。这些数据表明，pEGFR受到显著抑制，而pAkt、pStat3和pErk1/2水平未发生改变。经浓度为1/25、1/50和1/250的BVN22E抗体孵育24小时后，采用免疫印迹法，对BVN22E抗体在H3122细胞中的作用进行评价，如图9所示。这些数据表明，在与BVN22E抗体孵育后24小时，pEGFR显著抑制得以保持。经浓度为0.1、0.25、0.5、1、2.5和5的克唑替尼孵育2小时后，采用免疫印迹法，对克唑替尼在H3122细胞中的作用进行评价，如图10所示。这些数据表明，在与克唑替尼孵育2小时后，观察到了pStat3显著抑制以及pAkt抑制。

存在EGF的情况下，单独测定了布加替尼和阿来替尼对H2228细胞增殖的作用。结果表明，存在EGF的情况下，单独使用布加替尼和阿来替尼对H3122细胞增殖的抑制作用大于布加替尼和阿来替尼，见图11。图12显示了存在EGF的情况下，单独使用克唑替尼对H312272小时细胞增殖的作用。结果表明，单独使用克唑替尼对H3122细胞增殖的抑制作用大于存在EGF的情况下的克唑替尼。图13显示了H2228细胞中存在EGF的情况下，BVN22E抗体对细胞生存力的作用。在BVN22E抗体浓度较高的情况下，观察到细胞生存力显著降低。

接下来，对ALK抑制剂与BVN22E抗体联合使用的作用进行了测定。对阿来替尼作为单一治疗或与BVN22E抗体联合使用对H2228细胞72小时细胞增殖的作用进行了评估。虽然阿来替尼对细胞生存力的影响最小，但较高浓度的阿来替尼和BVN22E抗体联合使用可使细胞生存力显著降低，见图15。对于克唑替尼，即使低浓度的克唑替尼与BVN22E抗体联合使用也会使细胞生存力显著降低，见图15。ALK酪氨酸激酶抑制剂布加替尼和阿来替尼与BVN22E抗体联合使用明显抑制了H2228细胞内的细胞增殖，见图16A。

经浓度为1/25、1/50和1/250的BVN22E抗体孵育2小时后，采用免疫印迹法，对BVN22E抗体在H2228细胞中的作用进行评价，如图17所示。这些数据表明，pEGFR受到显著抑制，pERK1/2受到一些抑制，而pAkt和pStat3水平未发生改变。

接下来，经浓度为1/25、1/50和1/250的BVN22E抗体孵育24小时后，采用免疫印迹法，对BVN22E抗体在H2228细胞中的作用进行评价，如图18所示。这些数据表明，在与BVN22E抗体孵育24小时后，pEGFR显著抑制得以保持。

接下来，经浓度为00.025、0.05、0.1、0.5、1和2.5μM的克唑替尼孵育2小时后，采用免疫印迹法，对克唑替尼在H2228细胞中的作用进行评价，如图19所示。这些数据表明，在与克唑替尼孵育后2小时观察到pStat3受到显著抑制。同样，布加替尼显著抑制了pSTAT3，并且高浓度的布加替尼(1和2.5μM)使pEGFR和pAKT增加，见图20。值得注意的是，BVN22E抗体与布加替尼联合使用，阻止了H2228细胞中pEGFR和pERK的活化，见图21。

布加替尼对pSTAT3有显著的抑制作用，在H3122细胞中观察到pERK1/2受到轻微抑制，见图22。较高浓度的布加替尼还对pSTAT3有明显的抑制作用，对H3122细胞中的pERK1/2有轻微的抑制作用。相反，BVN22E抗体与布加替尼联合使用，能够完全抑制H2228细胞中pEGFR和pERK的活化，见图24。

众所周知，患者会对ALK TKI的单一治疗产生耐药性。其次，研究人员研究了克唑替尼或阿来替尼与BVN22E抗体联合使用是否可能延缓H2228细胞中对ALK TKI产生耐药性。在这些研究中，每次更换细胞培养基(每周1-2次)时，会在细胞中加入TKI抑制剂和BVN22E抗体的组合。研究在96孔微孔板上进行，用显微镜成像，以确定含有耐药性集落的孔所占的百分比。

BVN22E抗体可延缓体外对ALK-TKI产生耐药性。使用克唑替尼进行实验(图25A)，在更大程度上使用阿来替尼进行实验(图25B)，结果表明，联合治疗使细胞增殖在较长时间内得到控制，表明耐药性的产生有所延缓。单独就阿来替尼而言，所有孔10周后均表现出主动复制，而联合用药延缓复制的时间更长。值得注意的是，当最高浓度的BVN22E抗体与阿来替尼联合使用时，直到25周才达到100％的耐药性。图25C(克唑替尼)和图25D(阿来替尼)呈现了相同的实验，但显示的是无肿瘤细胞孔所占的百分比，而非阳性孔所占的百分比；本发明的结果以类似于临床试验中Kaplan Meyer曲线的方式呈现，其中y轴截距对应于零患者存活期点。同样，在H3122细胞中，BVN22E抗体延缓了H3122细胞中对0.1μM和0.2μM克唑替尼耐药性的出现，见图26和27。

值得注意的是，在为期3天的增殖试验中，在体外抑制细胞增殖和调节EGF信号通路方面，ALK-TKI与BVN22E抗体联合使用比单独使用ALK-TKI有显著改善。联合用药增强了ALK-TKI的作用，中和了ALK-TKI的负面作用，扩宽了对所有信号分子的抑制。与单独使用ALK-TKI相比，在ALK-TKI和BVN22E抗体同时存在的情况下，H228细胞对ALK-TKI耐药性的产生显著延迟了2倍，由此支持对EGF信号传导更强、更广泛的抑制。

实施例2：在BRAF和KRAS突变细胞系中，对抗EGF抗体和曲美替尼联合使用的评估。

大肠癌(CRC)不仅是最常见的肿瘤性癌症之一，而且在治疗方面也具有特殊的挑战性。临床上，无KRAS突变的CRC患者可以接受EGF靶向治疗，如西妥昔单抗和厄洛替尼。然而，很大一部分CRC患者存在KRAS突变、BRAF突变或PIK3CA突变。目前没有针对这些患者的有效治疗方法。化疗和血管生成靶向治疗属于常用的治疗方法，但也存在明显的缺点。

为了开始解决KRAS、BRAF或PIK3CA突变的CRC患者的治疗需求，在具有上述突变的细胞系内，进行了EGF抗体与MEK抑制剂曲美替尼联合使用的体外检测。所有实验均与BVN22E抗体联合进行。

对HT29(同时也是一种大肠腺癌细胞系，但有BRAF V66E突变)的细胞生存力进行了研究(见图28)。如图29所示，利用EGF可以增强HT29细胞生存力。在HT29细胞中，对BVN22E抗体和曲美替尼单独使用和联合使用对细胞生存力的作用进行了评估，如图30和31所示。BVN22E抗体与曲美替尼联合使用对细胞增殖的抑制作用明显大于单独使用曲美替尼时对细胞增殖的抑制作用。

为了解BVN22E抗体和曲美替尼对HT29细胞信号传导的作用，在HT29细胞中孵育2小时后进行免疫印迹法。使用BVN22E抗体，稀释度1/10。免疫印迹法(图32和33)的结果表明，曲美替尼与BVN22E抗体联合使用增强了由EGF诱导的对pEGFR和pERK1/2的抑制作用。这些结果证实了在细胞增殖试验中观察到的BVN22E抗体与曲美替尼在HT29细胞中的显著联合效应的明显作用。

使用碘化丙啶染色法，通过流细胞计数法，确定单个细胞的细胞周期和凋亡状态，见图34。该方法曾用于KRAS突变体(A549和DLD1)和ALK转位(H2228和H3122)细胞系。

在DLD1细胞中，EGF单独诱导的S和G2/M状态细胞所占的百分比明显高于带有EGF的BVN22E抗体或带有EGF的BVN22E抗体与曲美替尼联合使用，见图35。在A549细胞中，BVN22E抗体与EGF与曲美替尼联合使用时，只观察到很少的细胞周期状态差异，见图36。相反，在H228细胞中，与单独使用BVN22E抗体或单独使用曲美替尼相比，带有EGF的BVN22E抗体与曲美替尼联合使用时，S和G2/M细胞显著减少，见图37。在H3122细胞中，只观察到很少的细胞周期状态差异，见图38。这些数据表明，BVN22E抗体与TKI抑制剂联合使用可能会抑制由EGF调控的细胞周期进程。

图39显示了四个KRAS突变的细胞系。A549是一种含有G12S突变的肺腺癌细胞系。H23是一种含有G12C突变的肺腺癌细胞系。DLD1是一种含有G13D突变的结肠腺癌细胞系。LS174T是一种大肠腺癌细胞系，也含有G12C突变。

接下来，在DLD1细胞系中，对单独使用BVN22E抗体的作用进行了评估。与对照抗体相比，更高浓度的BVN22E抗体显著抑制了DLD1细胞生存力，见图40。同样，在DLD1细胞中，曲美替尼与BVN22E抗体联合使用对细胞生存力的抑制明显大于单独使用曲美替尼对细胞生存力的抑制，见图41。

通过免疫印迹法，对DLD1细胞中BVN22E抗体的作用进行了研究，见图42和43。单独使用BVN22E抗体对DLD1细胞系的作用有限。正如预期的那样，在所检测的所有稀释度下，EGFR磷酸化受到强烈抑制。AKT的磷酸化仅仅略微受到抑制，未见对ERK1/2活化有任何影响。

对于所检测的所有浓度的曲美替尼，与单独使用曲美替尼相比，存在EGF的情况下，细胞生存力增强。较高的细胞生存力表明存在肿瘤细胞复制，曲美替尼旨在抑制这一过程，因此，存在EGF的情况下，曲美替尼的疗效较低，见图44。

在DLD1细胞系中，还采用免疫蛋白印迹法，对曲美替尼治疗的效果进行了评估，结果见图45。对pEGFR无影响，对pAKT无影响。观察到pStat3和pERK1/2抑制，但是其浓度仅超过患者用曲美替尼的生理浓度。

接下来，在DLD1细胞系中，对BVN22E抗体的组合与曲美替尼联合使用进行了研究，如图46所示。曲美替尼与BVN22E抗体联合使用的细胞生存力明显低于单独使用曲美替尼或与对照抗体联合使用时的细胞生存力。这些结果表明，用BVN22E抗体抑制EGF显著增强了曲美替尼的作用。

为了解曲美替尼与BVN22E抗体联合使用使作用增强背后的机制，在DLD1细胞系中进行了免疫印迹实验，如图47所示。除了抑制pERK1/2外，单独使用曲美替尼治疗对测定的信号分子没有影响。单独使用BVN22E抗体，抑制了EGFR的磷酸化。值得注意的是，BVN22E抗体与曲美替尼联合使用对抑制信号传导的作用比两种治疗都要大。除了pERK1/2和pEGFR，BVN22E抗体与曲美替尼联合使用还可以抑制pSTAT3和pAKT。此外，存在曲美替尼的情况下，相对于单独使用曲美替尼，联合使用BVN22E抗体时，曲美替尼耐药性的产生出现了延缓，见图48。

总之，BVN22E抗体的加入增强了DLD1-KRAS突变细胞系中曲美替尼的抗增殖作用。EGF的存在显著抑制了单独使用曲美替尼对细胞生存力的作用。除了抑制pERK1/2外，单独使用曲美替尼治疗对所测定的信号传导分子没有影响。单独使用BVN22E抗体可抑制EGFR的磷酸化。值得注意的是，在DLD1细胞中，BVN22E抗体与曲美替尼联合使用对抑制信号传导的作用比两种治疗都要大。除了pERK1/2和pEGFR，BVN22E抗体与曲美替尼联合使用还可以抑制pSTAT3和pAKT。

较高浓度的BVN22E抗体能够抑制A549细胞系的细胞生存力，如图49所示。在A549细胞中，作为对与BVN22E抗体孵育2小时的反应，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用如图50所示。观察到对pERK1/2有轻度抑制作用，并观察到EGF对pEGFR的活化有完全抑制作用。在A549细胞中，作为对与BVN22E抗体孵育24小时的反应，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用如图51所示；24小时后，在该细胞系中，对细胞信号传导的影响减弱。A549细胞系中存在和不存在EGF的情况下，曲美替尼对细胞活性的作用如图52所示，EGF显著增强了细胞生存力。在A549细胞中，作为对单独孵育曲美替尼2小时的反应，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用如图53所示；在这个最初时间点，观察到pERK1/2完全抑制。图54表明，在A549细胞中，虽然BVN22E抗体与曲美替尼联合使用时细胞生存力显著下降，但是与本发明中提出的其他细胞类型相比，下降的幅度较低。

孵育2小时后，观察A549细胞中存在和不存在EGF的情况下，作为对BVN22E抗体与曲美替尼联合使用的反应，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用。单独使用BVN22E抗体或与曲美替尼联合使用时，存在EGF的情况下，观察到对pEGFR和pERK1/2信号传导的最强作用，见图55。

BVN22E抗体也显著抑制了H23细胞的细胞生存力，见图56。孵育2小时后，在H23细胞中观察到，作为对BVN22E抗体孵育2小时的反应，对pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用，见图57。BVN22E抗体完全取消了H23细胞中观察到的作为对EGF的反应的pEGFR和pERK1/2增加。这种对pEGFR和pERK1/2的抑制保持了24小时，如图58所示。

H23细胞中EGF的存在显著抑制了曲美替尼对细胞生存力的抑制，见图59。孵育2小时后，观察H23细胞中，作为对曲美替尼的反应，pEGFR(TYR 1068)、pSTAT3(TYR 705)、pAKT(SER 473)和pERK1/2(THR 202/TYR 204)的作用。曲美替尼浓度较高时，pERK1/2受到显著抑制，见图60。与单独使用曲美替尼相比，BVN22E抗体与曲美替尼联合使用，显著抑制了H23细胞的细胞生存力，见图61。在H23细胞中，作为对BVN22E抗体与曲美替尼联合使用并孵育2小时的反应，观察到对pEGFR受到显著抑制。

与对照抗体相比，BVN22E抗体显著抑制了LS174T细胞生存力，见图63。BVN22E抗体也抑制了LS174T细胞中的pEGFR和pAKT信号传导，见图64和65。曲美替尼单独使用抑制了LS174T细胞增殖，当存在EGF时，这种作用受到减弱，见图66。在2小时孵育免疫印迹法中，对LS174T细胞系中的曲美替尼的作用进行了评估，见图67。在1-10nM的生理范围内，曲美替尼并未影响任何被测分子的磷酸化。在较高的浓度(与临床无关)下，观察到对pERK1/2的作用。然而，曲美替尼与抗BVN22E联合使用抑制了pAKT、pEGFR和pERK1/2，同时也抑制了pSTAT3，见图68。因此，BVN22E抗体拓宽了曲美替尼对信号传导抑制的作用。

对BVN22E抗体和曲美替尼联合使用对LS174T细胞生存力的作用。如图69所示。相对于单独使用曲美替尼，在1-10nM的曲美替尼范围内，即患者体内曲美替尼的生理水平，BVN22E抗体与曲美替尼联合使用，显著增加了对细胞生存力的作用。然而，与BVN22E抗体和曲美替尼在DLD1细胞中联合使用的作用相比，在LS174T细胞中联合使用的作用不那么明显。

在LS174T KRAS突变细胞系中，BVN22E抗体增强了曲美替尼的抗增殖作用。由于存在EGF，显著降低了曲美替尼对细胞生存力的抑制作用。BVN22E抗体单独使用可同时抑制pEGFR和pAKT。然而，曲美替尼与抗BVN22E联合使用能够抑制pAKT、pEGFR和pERK1/2，同时也抑制了pSTAT3。因此，在两种KRAS突变细胞系中，BVN22E抗体增强了曲美替尼抑制细胞增殖的作用，并拓宽了曲美替尼对信号传导抑制的作用。

实施例3：SW900细胞中接种EGF癌症疫苗的患者的血清评估。

存在EGF的情况下，对人患者(22180004)抗EGF血清对SW900野生型细胞中的pEGFR的作用进行了观察。2a＝疫苗接种前的患者，3d＝疫苗接种后的患者。存在抗EGF血清的情况下，观察到pEGFR活化的完全抑制，同时还观察到pERK1/2有一定程度的下降，见图70。存在EGF的情况下，观察到SW900野生型细胞中，另外两名患者的人患者抗EGF血清对pEGFR的作用，见图71。在患者27030004中，观察到pEGFR和pERK1/2活化受到显著抑制，而在患者29080005中观察到对pEGFR和pERK1/2的抑制作用较小。另外三名患者的抗EGF血清结果如图72所示。对于其中两名患者(29040007和3308020)，观察到pEGFR和pERK1/2信号传导受到显著抑制。对于患者31070004，观察到微小性变化。图70-72的结果在图73和74中进行了汇总。

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Claims (9)

1.一种对患有表达ELM4-ALK融合基因的非小细胞肺癌(NSCLC)的患者进行治疗的方法，其中：所述患者患有表达EGFR突变形式的肿瘤，其包括向需要此类治疗的患者施用灵活主动的方案，以将间变性淋巴瘤激酶抑制剂(ALK抑制剂)与靶向EGF的主动免疫接种相结合，其中在该方法中，按照治疗有效每日剂量施用所述ALK抑制剂，并根据每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量共同施用主动免疫接种。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、色瑞替尼、阿来替尼、布加替尼和劳拉替尼，或其药学上可接受的盐，并且根据基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案施用所述ALK抑制剂，并根据每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量，向患有表达EGFR的突变形式的肿瘤的患者共同施用靶向EGF的主动免疫接种治疗。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是表达ELM4-ALK融合基因的NSCLC，包括其转移形式，所述ALK抑制剂选自克唑替尼、色瑞替尼、阿来替尼、布加替尼和劳拉替尼，或其药学上可接受的盐，并且根据基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案施用所述ALK抑制剂，并根据每周重复两次或一次或每两周重复一次的治疗有效量，对患有含有EGFR突变的肿瘤并具有对ALK抑制剂治疗的获得性耐药性的患者共同施用靶向EGF的主动免疫接种，其中所述方法导致对ALK抑制剂治疗的耐药性的克服。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是表达ELM4-ALK融合基因的NSCLC，包括其转移形式，所述ALK抑制剂选自克唑替尼、色瑞替尼、阿来替尼、布加替尼和劳拉替尼，或其药学上可接受的盐，并且根据基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案施用所述ALK抑制剂，并根据每周重复两次或一次或每两周重复一次的治疗有效量，对具有对ALK抑制剂治疗的获得性耐药性的患者共同施用靶向EGF的主动免疫接种。

5.一种对患有表达ELM4-ALK融合基因的非小细胞肺癌(NSCLC)的患者进行治疗的方法，其包括向需要此类治疗的患者施用灵活主动的方案，以将ALK抑制剂与单克隆抗EGF抗体的被动施用相结合，其中根据连续方案以每日治疗有效的方式施用所述ALK抑制剂，并根据每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量共同施用被动免疫接种。

6.一种对患有由表达ELM4-ALK融合基因的失调人表皮生长因子受体(HER/人EGFR)驱动的非小细胞肺癌(NSCLC)的患者进行治疗的方法，其中：所述患者患有表达EGFR突变形式的肿瘤，其包括向需要此类治疗的患者施用灵活主动的方案，以将ALK抑制剂与单克隆抗EGFR抗体的被动施用相结合，其中根据基于10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案施用所述ALK抑制剂，并根据每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量共同施用被动免疫接种，其中所述方法导致阻止了对ALK抑制剂治疗耐药性的获得。

7.一种对患有由失调人表皮生长因子受体(HER/人EGFR)驱动的非小细胞肺癌(NSCLC)患者进行治疗的方法，其中，所述患者患有表达ELM4-ALK融合基因突变的肿瘤，其包括向需要此类治疗的患者施用灵活主动的方案，以将ALK抑制剂与单克隆抗EGFR抗体的被动施用相结合，其中在该方法中，根据基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案施用所述ALK抑制剂，并根据每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量共同施用被动免疫接种，其中此后施用ALK抑制剂和所述单克隆抗EGFR抗体。

8.一种对患有由表达ELM4-ALK融合基因的失调人表皮生长因子受体(HER1/人EGFR)NSCLC驱动的非小细胞肺癌(NSCLC)的患者进行治疗的方法，其中：所述患者患有表达EGFR突变形式的肿瘤，其包括向需要此类治疗的患者施用灵活主动的方案，以将ALK抑制剂与靶向EGF的主动免疫接种相结合，其中在按照基于约10至250mg之范围的平均每日剂量的连续方案施用ALK抑制剂之前，根据每周重复三次、两次或一次、每两周重复一次、每三周重复一次或至少每月重复一次的治疗有效量施用所述主动免疫接种，其中所述方法导致阻止了对ALK抑制剂治疗耐药性的获得。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，按治疗量施用免疫原性蛋白质，以降低STAT3活化。

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