CN105861505A - 靶向沉默UNC5A的shRNA - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性靶向沉默UNC5A的shRNA。首先是根据人源的UNC5A的CDS区序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到PLL3.7载体上，连接转化，挑取阳性克隆鉴定。鉴定正确后，将提取的质粒送去进行测序，测序比对正确之后转染细胞并进行UNC5A沉默效率的检测。靶向沉默UNC5A的shRNA，序列为GCACCAGCAACATGACCTA。
Description
技术领域
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性靶向沉默UNC5A的shRNA。
背景技术
UNC5家族受体最初是在新杆状线虫被鉴定出来的，该家族有四个成员，在啮齿类动物中称为UNC5H1，2，3 和4；在哺乳动物中称为UNC5HA，B，C 和D。该家族属于I型跨膜受体，由三部分组成：胞外结构域，跨膜区以及胞内结构域，胞外由两个免疫球蛋白结构域、两个凝血酶敏感蛋白I型结构域组成；胞内由ZU 结构、一个DCC结合结构域和一个凋亡结构域组成。最初的研究表明，在神经系统中其能与DCC共同作用介导神经元的的导向。
最初关于UNC5A的研究多集中在神经系统，大量的文献表明，在神经系统中，DCC能够形成同源二聚体并Netrin-1相互作用介导神经元的吸引作用； DCC与UNC5A相互作用形成异源二聚体后Netrin-1相互作用能介导神经元的排斥作用。最近的研究表明，UNC5A除了能在神经导向中起重要的作用之外，在肿瘤中也发挥一定的作用，但是目前为止，UNC5A在肿瘤中的作用机制仍不是很清楚。一些报道表明，在非神经系统中UNC5A能作为P53的靶基因来介导细胞的凋亡；UNC5A在膀胱癌中表达下调，并与DNA的损伤有关；这就暗示在肿瘤中UNC5A表达下调，可能与促进肿瘤的发生发展相关，所以能够特异性的沉默UNC5A对于研究其在肿瘤中作用至关重要。
发明内容
本发明的目的是合成特定的靶向沉默UNC5A的shRNA，并在细胞水平上发现，在胶质瘤细胞中特异的沉默UNC5A能提高细胞的增殖能力，这就证明能特异性的沉默UNC5A，能为更加深入的研究UNC5A的功能以及UNC5A在选择、制备治疗肿瘤药物中的作用提供了有效的手段。
本发明中所需要构建的主要是UNC5A的沉默表达载体。核心沉默表达载体构建分为两个大的步骤，首先是根据人源的UNC5A的CDS区序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到PLL3.7载体上，连接转化，挑取阳性克隆鉴定。鉴定正确后，将提取的质粒送去进行测序，测序比对正确之后转染细胞并进行UNC5A沉默效率的检测。
本发明中设计合成了能够靶向人源UNC5A的19bp的靶向沉默UNC5A的shRNA，序列为 GCACCAGCAACATGACCTA。
能够特异性沉默UNC5A的表达载体的构建包括以下步骤：
第一步，序列设计
根据人源UNC5A基因序列特征设计特异性识别UNC5A的沉默序列。
第二步，对靶序列进行退火成双链以及对PLL3.7载体进行酶切
将核心载体PLL3.7进行双酶切后, 利用胶回收试剂盒回收线性化载体，为下一步的实验准备。
将合成的靶序列利用退火buffer溶解之后，利用PCR仪进行退火，95℃/4min，72℃/10min，之后降温到4℃。
第三步，将合成的靶序列以及核心载体进行连接
将上一步中的两个产物在T4连接酶的作用下进行连接，经转化、提取等步骤获得沉默载体。
第四步，沉默靶蛋白效率的检测
经转染细胞后提取蛋白，利用 western blot检测沉默效率。
附图说明
图1为UNC5AshRNA菌液PCR结果凝胶电泳图，框中为阳性结果；
图2为UNC5AshRNA双酶切结果凝胶电泳图，框中为阳性结果；
图3为检测UNC5A shRNA沉默效率图。
本发明中设计合成的19bp的目的片段，能够特异性的沉默UNC5A，同时也为构建UNC5A-shRNA提供关键的序列片段。UNC5A属于依赖性受体，该家族成员在神经发生以及肿瘤中都有很重要的作用。经研究表明，UNC5A在肿瘤的生长以及肿瘤的进程中发挥一定的作用，构建成功的载体，能够用来特异性的沉默UNC5A，降低UNC5A蛋白的表达，这就能为研究UNC5A在肿瘤中的作用提供一个好的手段，所以UNC5A沉默载体的应用能够为研究其在肿瘤中的功能以及相关机制，为选择、制备抗肿瘤药物提供理论基础。
具体实施方式
实施例一: 特异性沉默靶标蛋白UNC5A的表达载体构建
1、特异性沉默靶蛋白UNC5A的序列设计
（1）根据人源UNC5A基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计，设计的原则：19bp的特异性结合UNC5A的序列的GC含量为45%-55%，退火温度45℃-65℃，同时按照载体的要求，第一个碱基必须为G。将选取的片段进行BLAST人基因组比对，选择特异性识别人源UNC5A的序列。
（2）HpaⅠ- GN18-TT-loop- 81NC-XhoⅠ形式合成一段59bp序列，81NC为NG18的反向互补，5’端为HpaⅠ酶切位点，3’端为XhoⅠ酶切位点。设计合成的特异性识别UNC5A的序列片段为 GCACCAGCAACATGACCTA。
2、特异性沉默靶蛋白UNC5A的序列的合成与储存
（1）将合成的两段Oligo利用退火buffer溶解至50 µM，各取100µl混合。
（2）各取10µl上述储存液，放在PCR管中，混匀放入PCR仪中，95 ℃变性4min，72 ℃退火10min，之后可以放在4℃保存。
3、UNC5A沉默载体的构建
（1）取1µg PLL3.7载体，利用HpaⅠ和XhoⅠ进行双酶切，电泳，回收线性PLL3.7大片段。
（2）连接和转化。将线性PLL3.7浓度稀释至100ng/µl，将退火形成的DNA片段稀释成合适的浓度，进行连接反应（Promega公司的T4 DNA 连接酶）
16 ℃过夜连接，将连接产物转化Stb13感受态细胞，涂布在具有氨苄青霉素的LB平板上。
（3）阳性克隆鉴定。在转化平板上挑取单克隆摇菌，试剂盒提取质粒，通过PCR和双酶切鉴定阳性克隆【图1】【图2】。鉴定引物为pLL3.7 test-F：5’-GCACAGACTTGTGGGAGAAG-3’，pLL3.7 test-R:5’CCTGCTGGAATCTCGTGAA-3’。以U6启动子为测序引物，送北京金唯智进行测序。
实施例二:
沉默靶蛋白效率的检测
（1）将ScrabmbleshRNA和UNC5AshRNA共同转染进入胶质瘤细胞
（2）提取细胞总蛋白，利用Western blot免疫印迹检测沉默效率，结果显示，转入UNC5A沉默载体后，UNC5A表达量显著降低，GAPDH为内参【图3】。
序列表
<110>东北师范大学
<120>靶向沉默UNC5A的shRNA
<141> 2016-3-30
<160>19
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_RNA
<222> (1)...(19)
<223>
<400> 1
GCACCAGCAACATGACCTA 。
Claims (1)
1.靶向沉默UNC5A的shRNA，其特征是：序列为 GCACCAGCAACATGACCTA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610371017.7A CN105861505A (zh) | 2016-05-31 | 2016-05-31 | 靶向沉默UNC5A的shRNA |
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| CN201610371017.7A CN105861505A (zh) | 2016-05-31 | 2016-05-31 | 靶向沉默UNC5A的shRNA |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105861505A true CN105861505A (zh) | 2016-08-17 |
Family
ID=56642738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610371017.7A Pending CN105861505A (zh) | 2016-05-31 | 2016-05-31 | 靶向沉默UNC5A的shRNA |
Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN105861505A (zh) |
Citations (1)
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| CN104853756A (zh) * | 2012-09-12 | 2015-08-19 | 奈特里斯药物公司 | 利用netrin-1干扰药物和化疗药物的联合治疗 |
-
2016
- 2016-05-31 CN CN201610371017.7A patent/CN105861505A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104853756A (zh) * | 2012-09-12 | 2015-08-19 | 奈特里斯药物公司 | 利用netrin-1干扰药物和化疗药物的联合治疗 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
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| ZHU YUYAN 等: "DNA damage-inducible gene, UNC5A, functions as a tumor-suppressor in bladder cancer", 《TUMOR BIOL.》 * |
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