ES2702733T3 - Tratamiento combinado con fármaco interferente de netrina 1 y fármaco quimioterapéutico - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un fármaco quimioterapéutico que es capaz de inducir la expresión o sobreexpresión de netrina 1 en células cancerosas y un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo, en un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el fármaco interferente de netrina 1 es un anticuerpo de unión a netrina o un receptor de netrina 1, o un compuesto que comprende un dominio extracelular de un receptor de netrina 1 o un fragmento de dicho dominio extracelular, promoviendo dicho fármaco interferente de netrina 1 la apoptosis inducida por receptores de netrina 1, para uso en el tratamiento de un cáncer que expresa o sobreexpresa netrina 1 en que el cáncer expresa o sobreexpresa netrina 1 como resultado de un tratamiento con dicho fármaco quimioterapéutico.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento combinado con fármaco interferente de netrina 1 y fármaco quimioterapéutico

[0001] La presente invención se refiere a composiciones combinadas novedosas y a su uso en el tratamiento del cáncer.

[0002] Se ha propuesto recientemente que la netrina 1, una proteína soluble descubierta inicialmente como una señal de navegación axonal (1), desempeña un papel crucial en la progresión del cáncer al regular la apoptosis (2, 3). Es más, los receptores de netrina 1 DCC y UNC5H, es decir UNC5H1, UNC5H2, UNC5H3 y UNC5H4 también llamados UNC5A, UNC5B, UNC5C o UNC5D, pertenecen a la denominada familia de receptores de dependencia (4) (5) (6). Estos receptores de dependencia, debido a su capacidad de inducir la muerte celular cuando se desprenden de sus ligandos, crean estados celulares de dependencia de sus ligandos respectivos (7) y, en consecuencia, pueden comportarse como supresores tumorales debido a que eliminan células tumorales que se desarrollarían en entornos de indisponibilidad de ligando (2, 8). Desde esta perspectiva, los ratones portadores de un receptor DCC inactivados de su actividad proapoptótica desarrollaban cánceres colorrectales espontáneos y tenían más tendencia a progresión tumoral intestinal (9). De forma similar, la inactivación de UNC5H3/C en ratones en el tracto gastrointestinal está asociada a la progresión de tumor intestinal (10).

[0003] Por tanto, según el paradigma de receptor de dependencia, la progresión de tumores humanos agresivos debería requerir la inactivación de esta ruta de muerte. Hay al menos tres medios para conseguir esta ventaja de supervivencia: pérdida de la expresión de receptores de netrina 1, como se describe extensamente en cáncer colorrectal humano para DCC o/ y UNC5H (10-13); pérdida de la señalización de muerte posterior inducida por DCC o UNC5H; ganancia de expresión autocrina o paracrina del ligando. De forma interesante, se ha mostrado que la netrina 1 está regulada positivamente en una fracción considerable de cánceres de mama, pulmón, ovario y pancreático metastásicos, en cáncer colorrectal asociado inflamatorio y en neuroblastoma (14-19). Los estudios de prueba de concepto, in vitro y en modelos de ratones o pollo de cáncer, han mostrado que el silenciamiento de netrina 1 por ARNip de netrina 1 o la interferencia de interacciones de netrina 1-receptores están asociados a la muerte celular y a la inhibición del crecimiento tumoral y metástasis (14-18). Estos últimos estudios proponían que desestabilizar la unión de netrina 1 con sus receptores podría representar una estrategia anticancerosa eficaz en una gran fracción de cánceres en que se expresa netrina 1 de forma autocrina o paracrina. El desarrollo temprano de fármacos se ha centrado en agentes biológicos, productos biológicos, que imitan la interacción de receptores con netrina 1 (20).

[0004] Algunos otros trabajos se centraban en el papel de la netrina 1 y sus receptores en la angiogénesis, con la esperanza de que la regulación de la angiogénesis pudiera ayudar a inhibir la progresión tumoral. El documento US2006/0153840 divulga que la modulación de la actividad del receptor de netrina 1 puede activar o inhibir la angiogénesis y propone estrategias para disminuir o aumentar la angiogénesis. El documento divulga el uso de un receptor de netrina 1 o un fragmento del mismo como sustancia proangiogénica, y también de una proteína de fusión que comprende receptor de netrina 1 y un fragmento Fc de una inmunoglobulina como polipéptido proangiogénico. El documento enseña que el efecto antiangiogénico inducido por netrina 1 podía revertirse bloqueando la disponibilidad para netrina 1 de su receptor, tal como UNC5H2 (también llamado UNC5B), e inhibir o bloquear la actividad de receptor de netrina 1 puede inducir una fuerte angiogénesis. El documento WO2010/059821 divulga que UNC5B está regulado negativamente en la vasculatura adulta quiescente, pero se reexpresa durante la angiogénesis por brotes en tumores implantados, que la estimulación de neovasos que expresan UNC5B con un agonista (netrina 1) inhibe la angiogénesis por brotes y que la pérdida genética de la función de UNC5B puede reducir la inhibición de la angiogénesis mediada por netrina 1. El documento sugiere que la activación de UNC5B inhibe la angiogénesis por brotes y que UNC5B sería una diana antiangiogénica potencial. El documento propone entonces el uso de un anticuerpo anti-UNC5B, que inhibe una actividad de UNC5B o inhibe la unión de netrina 1 a su receptor, como agente antiangiogénico y como agente para tratar una enfermedad caracterizada por una angiogénesis anormal, tal como cáncer. El documento WO2006/054000 divulga el uso de un anticuerpo anti-netrina 1 como agente antiangiogénico y su uso en una composición para tratar el cáncer. Los dos últimos documentos proponen además combinar el anticuerpo anti-UNC5B o anti-netrina 1 con un fármaco quimioterapéutico existente. En ausencia de resultados experimentales consistentes en estas divulgaciones contradictorias, es difícil para el especialista en la materia alcanzar alguna enseñanza clara sobre la incidencia de anticuerpos anti-netrina 1 o anti-UNC5H2 sobre la angiogénesis, mucho menos sobre la actividad antitumoral potencial. También es difícil para el especialista en la materia establecer un vínculo biológico entre un fármaco quimioterapéutico que es conocido por afectar a células tumorales proliferantes pero no a células endoteliales quiescentes que forman los vasos y un tratamiento antiangiogénico basado en anticuerpos anti-netrina 1 o anti-UNC5H2. El documento WO2006/019904 se refiere también a inhibir el crecimiento o la supervivencia tumoral mediante inhibición de la angiogénesis. Pueden usarse antagonistas de netrina tales como anticuerpos anti-netrina, receptores de netrina solubles y anticuerpos contra un receptor de netrina. Se sugiere la combinación de quimioterapia y antiangiogénesis. El documento WO2012/025618 describe una proteína de fusión entre un Fc de inmunoglobulina y un fragmento de DCC, sin embargo no menciona ninguna combinación. El documento WO2009/141440 atañe a tratar un cáncer que sobreexpresa netrina 1 (neuroblastoma) y no divulga una terapia de combinación. Lu Dan et al. (European Journal of Cancer, 2011, páginas 2068-2076) se refiere a células cancerosas que aprovechan la desactivación del receptor UNC5C. El documento EP 2208738 atañe a la inhibición de la angiogénesis y se indica que puede hacerse una asociación con otros compuestos biológicamente activos. El documento WO2007/099133 divulga la expresión de netrina 1 por algunos cánceres.

[0005] La presente invención proporciona sin embargo un razonamiento biológico para combinar un tratamiento basado en la interferencia de netrina 1 y un fármaco quimioterapéutico que aumenta, como resultado de una respuesta de estrés por la célula tumoral, la dependencia de netrina 1 para la supervivencia de células tumorales.

[0006] Es más, la búsqueda de la fracción de pacientes de cáncer que serían elegibles para un tratamiento basado en la interferencia de netrina 1 durante la evaluación clínica temprana condujo a los presentes inventores a examinar el efecto de tratamientos quimioterapéuticos convencionales sobre la expresión de netrina 1 y receptores de netrina 1. Doxorrubicina, 5-fluorouracilo (5FU), paclitaxel (Taxol) y cisplatino son de hecho quimioterapias “clásicas” y se siguen usando ampliamente en la gestión de pacientes con tumores de mama, pulmón, colorrectal así como otros tipos de tumores sólidos, tanto en pacientes con tumores localizados como avanzados. Sin embargo, a pesar de su eficacia, el uso de agentes convencionales está limitado por la toxicidad y la emergencia de resistencia. Los presentes inventores muestran aquí que estos tratamientos quimioterapéuticos, aunque actúan sobre mecanismos celulares diferentes, desencadenan un aumento significativo de netrina 1 y sus receptores. Los presentes inventores muestran que este aumento está asociado a una inducción de muerte celular aumentada tras la interferencia de netrina 1 in vitro. Como consecuencia, los presentes inventores muestran que la combinación de doxorrubicina con un candidato a fármaco interferente de netrina 1 potencia el efecto inhibidor del crecimiento tumoral en un modelo animal.

[0007] Los datos preclínicos mostrados aquí apoyan la idea de que combinar fármacos convencionales más interferencia de netrina 1 puede conducir a una eficacia aumentada inesperada con concentración reducida de fármacos convencionales. En conjunto, estos datos apoyan el razonamiento de que la terapia basada en interferencia de netrina 1 en combinación con quimioterapias convencionales está asociada a un efecto anticanceroso sinérgico. Se considera que la terapia basada en interferencia de netrina 1 tiene dos efectos positivos, el primero es la inducción de apoptosis o muerte celular debido a la inhibición de la unión de netrina 1/receptor (la denominada promoción de la apoptosis inducida por receptores de netrina 1), el segundo es que el efecto potencialmente dañino de un aumento inducido por quimioterapia en la expresión de netrina 1 y/ o receptor se contrarrestaría por la inhibición de la unión de netrina 1/receptor y su efecto antiapoptótico.

[0008] En la presente invención, las composiciones y procedimientos son para el tratamiento de cánceres que expresan o sobreexpresan netrina 1, en los que esta expresión o sobreexpresión se induce por el tratamiento con fármaco quimioterapéutico solo. Se divulga en la presente memoria un procedimiento de tratamiento anticanceroso combinado que comprende la administración a un paciente necesitado de ello de un fármaco quimioterapéutico y de un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo. El fármaco quimioterapéutico y el fármaco interferente de netrina 1 están en cantidad eficaz.

[0009] Son objetos de la invención las composiciones para uso como se definen en las reivindicaciones.

[0010] Es por tanto un objeto de la invención una composición que comprende un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo para uso como medicamento anticanceroso para usar en combinación con un fármaco quimioterapéutico en un paciente. La invención se refiere también a una composición que comprende un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo para uso como medicamento anticanceroso en un paciente que se trata con un fármaco quimioterapéutico.

[0011] Es por tanto un objeto de la invención una composición que comprende un fármaco quimioterapéutico para uso como medicamento anticanceroso para usar en un paciente en combinación con un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo. La invención se refiere también a una composición que comprende un fármaco quimioterapéutico para uso como medicamento anticanceroso en un paciente que se trata con un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo.

[0012] En una realización, una composición o kit de piezas de la invención comprende un fármaco quimioterapéutico y un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo, para administración simultánea, separada o secuencial a un paciente.

[0013] Por tanto, es un objeto de la invención una composición o kit de piezas que comprende un fármaco quimioterapéutico y un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo, para administración simultánea, separada o secuencial a un paciente, para uso como medicamento anticanceroso o tratamiento anticanceroso.

[0014] Se divulga por tanto una composición que comprende un fármaco quimioterapéutico y un fármaco interferente de netrina 1 o un a vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo, en un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0015] Es otro objeto de la invención una composición que comprende un fármaco quimioterapéutico y un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo, en un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable, para uso como medicamento anticanceroso.

[0016] De acuerdo con un rasgo importante de la invención y como se explica adicionalmente a continuación, el fármaco quimioterapéutico es un fármaco que induce una sobreexpresión de netrina 1 en células cancerosas y el fármaco interferente de netrina 1 promueve la apoptosis o muerte celular inducida por receptores de netrina 1.

[0017] El paciente puede ser un mamífero, y más particularmente un ser humano.

[0018] Tratamiento terapéutico engloba profilaxis y terapia.

[0019] Se describirán ahora realizaciones más detalladas para estos objetos.

[0020] El fármaco quimioterapéutico es en particular un fármaco que induce una sobreexpresión de netrina 1 en células cancerosas. La determinación de que un fármaco induce una sobreexpresión de netrina 1 puede efectuarse fácilmente en cualquier célula cancerosa, tal como una línea celular o células de una biopsia. En una realización, se efectúa el ensayo en células del cáncer para tratar, por ejemplo de una biopsia. En otra realización, se efectúa el ensayo en una célula, tal como una línea celular, que es representativa del cáncer para tratar. En otra realización, se realiza el ensayo en una línea celular A549 o H460. El ensayo puede comprender comparar la expresión del gen de netrina 1 entre las células tratadas con el fármaco quimioterapéutico y las células no tratadas. La expresión puede medirse por PCR, especialmente RT-PCR cuantitativa, por ejemplo usando los cebadores divulgados y proporcionados en la presente memoria (SEQ ID NO: 11 y 12). La clasificación de un fármaco en la familia de aquellos que inducen esta sobreexpresión puede efectuarse simplemente de acuerdo con el procedimiento descrito en los siguientes Materiales y procedimientos en una línea celular A549 o H460, por referencia a la Figura 1.

[0021] El fármaco quimioterapéutico es especialmente un fármaco citotóxico.

[0022] En algunas realizaciones preferidas, el fármaco es doxorrubicina, 5-fluorouracilo (5FU), paclitaxel (p.ej., Taxol), o cisplatino.

[0023] En una realización, el fármaco es un antibiótico citotóxico. El antibiótico citotóxico puede ser actinomicina, una antraciclina, bleomicina, plicamicina o mitomicina. La antraciclina puede ser doxorrubicina, daunorrubicina, valrrubicina, idarrubicina o epirrubicina.

[0024] En una realización, el fármaco es un agente alquilante. El agente alquilante puede ser un derivado de platino, tal como cisplatino, carboplatino, oxalilplatino u otros agentes alquilantes tales como ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán o tiotepa. Otras clases incluyen epipodofilotoxinas, p. ej. etopósido, inhibidores de topoisomerasa (camptotecinas), p. ej. irinotecán, topotecán, agentes alquilantes del surco menor del ADN, p. ej. trabectedina (YONDELIS), metotrexato, pemetrexed o raltitrexed.

[0025] En una realización, el fármaco es un taxano u otro agente orientado a tubulina. El taxano puede ser paclitaxel o docetaxel o eribulina (recientemente aprobado para cáncer de mama).

[0026] En una realización, el fármaco es un agente antineoplásico tal como:

- agentes hormonoterapéuticos de mama: p. ej. tamoxifeno, letrozol, anastrozol, exemestano, faslodex;

- agentes hormonoterapéuticos de próstata: p. ej. agonistas de LHRH, bicalutamida, abiraterona;

- anticuerpos monoclonales: p. ej. cetuximab, panitumumab, bevacizumab;

- inhibidores de cinasa: p. ej. imatinib, nilotinib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, afatinib, sunitinib, sorafenib, pazopanib, crizotinib, axitinib.

[0027] La invención no implica o puede no implicar un cambio en el régimen de dosis del fármaco quimioterapéutico. Sin embargo, la sinergia que aparece con fármaco interferente de netrina 1 puede permitir usar un régimen de dosis menor en un paciente. El facultativo especialista es capaz de determinar el régimen de dosis óptimo en el contexto del tratamiento combinado proporcionado por la presente invención.

[0028] La invención atañe también a un tratamiento combinado de un paciente en el que la quimioterapia es ya una quimioterapia combinada, en el sentido de que se incorporan al menos dos fármacos quimioterapéuticos en el protocolo de tratamiento. Es decir, que las composiciones, kits de piezas y usos según los diferentes objetos de la invención combinan al menos un fármaco interferente de netrina 1 y al menos dos (p. ej. 2, 3, 4 o 5) fármacos quimioterapéuticos.

[0029] El fármaco interferente de netrina 1 es un fármaco que interfiere con la capacidad de la netrina 1 de interaccionar con un receptor de netrina 1, o que interfiere con la capacidad de la netrina 1 de inducir la dimerización o multimerización del receptor de netrina 1, o más generalmente que promueve la apoptosis inducida por receptores de netrina 1. El especialista en la materia puede consultar el documento WO2007/099133, que divulga la interferencia entre netrina 1 y sus receptores, una disminución o inhibición de la interacción o unión entre netrina 1 y los receptores o una disminución o inhibición de la capacidad de la netrina 1 de inducir la dimerización o multimerización del receptor de netrina 1, con lo que se promueve la apoptosis inducida por receptores de netrina 1.

[0030] En una realización, es un ARN interferente pequeño o ARNip que es un ARN bicatenario (ARNbc) (a saber que puede tener de 10 a 50 nucleótidos de longitud) y que reduce la expresión del gen que codifica netrina 1. Porciones de la primera hebra son complementarias del gen diana, es decir, tiene suficiente complementariedad para hibridar con el gen diana, por ejemplo hay al menos un 80 % de identidad con el gen diana o una porción del mismo. AP: número de acceso de secuencia de ARNm de netrina 1 humano: NM_004822. Secuencia de ARNip que puede usarse: SEQ ID NO: 10 AAGCUGGACGCAGCAUGAUGC (con sentido), correspondiente a la posición 94-114 de la secuencia NM_004822.

[0031] En una segunda realización, el fármaco interferente es uno que se une a netrina 1 y vuelve la netrina 1 incapaz de unirse a sus receptores debido a la unión del fármaco interferente o por inducir la dimerización/multimerización de receptores de netrina 1, especialmente DCC y/ o UNC5. En una realización, este fármaco es un anticuerpo que se une a netrina 1. Es preferiblemente un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une específicamente a netrina 1. En otra realización, este fármaco es un compuesto que comprende un dominio extracelular de un receptor de netrina 1 o un fragmento de dicho dominio extracelular. Por ejemplo, se dan la secuencia aminoacídica del dominio extracelular de un receptor de netrina 1 o un fragmento de dicho dominio extracelular en la secuencia UniProt ID [intervalo de posición del dominio extracelular]: UNC5A: Q6ZN44 [aa 26-306, o fragmento 34-240]; UNC5B: Q81ZJ1 [aa 27-377 o fragmento 29-244]; UNC5C: 095185 [aa 41-380 o fragmento 61­ 258]; UNC5D: Q6UXZ4 [aa 33-379]; DCC: P43146 [aa 26-1097]. Este fármaco es capaz de unirse a netrina 1. Los receptores de netrina 1 pueden ser DCC, UNC5A, UNC5B, UNC5C o UNC5D. El procedimiento de la invención puede hacer uso de dos o más compuestos que comprenden cada uno un dominio extracelular, o parte del mismo, de un receptor de netrina 1 diferente. Por ejemplo, el fármaco comprende dos compuestos que comprenden un dominio extracelular o parte del mismo de DCC y de un UNC5, p. ej. UNC5A.

[0032] En una tercera realización, el fármaco interferente es uno que se une a un receptor de netrina 1. Los receptores de netrina 1 pueden ser DCC, UNC5A, UNC5B, UNC5C o UNC5D. El procedimiento de la invención puede hacer uso de dos o más fármacos interferentes, uniéndose cada uno a un receptor de netrina 1 diferente. Por ejemplo, el fármaco comprende dos fármacos interferentes, uno de unión a DCC y el otro a un UNC5, p. ej. UNC5A. En una realización, este fármaco es un anticuerpo de unión a un receptor de netrina 1. Es preferiblemente un anticuerpo policlonal o monoclonal de unión específica a un receptor de netrina 1. En otra realización, este fármaco es un compuesto, especialmente un compuesto que comprende un resto peptídico, o una molécula pequeña, que es capaz de unirse a un receptor de netrina 1, siendo capaz esta unión de evitar la capacidad de netrina 1 de bloquear la inducción de apoptosis por un receptor de netrina 1, en particular de inducir la dimerización o multimerización del receptor.

[0033] "Anticuerpo” se usa en el sentido más amplio para designar cualquier anticuerpo que pueda unirse a netrina 1, en el que esta unión impida la unión entre netrina 1 y un receptor de netrina 1.

[0034] “Anticuerpo” incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos monocatenarios y fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos que exhiban la actividad biológica deseada. Los anticuerpos monoclonales pueden ser de murino, quiméricos o humanizados. El término “anticuerpo” hace referencia a cualquier anticuerpo completo o fragmento funcional de un anticuerpo (obtenido por ingeniería genética o no) que comprende, o consiste en, al menos un sitio de combinación antigénica que permite que dicho anticuerpo se una a al menos un determinante antigénico de un compuesto antigénico. A modo de ejemplo de fragmentos de anticuerpo, pueden mencionarse los fragmentos Fab, Fab', F(ab^')2 y los fragmentos variables monocatenarios (cadenas de scFv). Los anticuerpos usados en la presente invención son anticuerpos específicos de antígeno. Son preferiblemente anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales monoespecíficos, es decir, que reconocen específicamente solo un epítopo. La producción de anticuerpos monoclonales o de sueros policlonales monoespecíficos, o de anticuerpos obtenidos por cribado de colecciones genómicas, útiles en el contexto de la invención, es una técnica convencional.

[0035] Un anticuerpo policlonal anti-netrina 1 puede obtenerse, entre otros, por inmunización de un animal tal como un conejo, un ratón y similares con la ayuda de la secuencia aminoacídica seleccionada, recogiendo y agotando el antisuero obtenido, por ejemplo sobre un inmunoadsorbente que contiene el receptor según procedimientos en sí conocidos por un especialista en la materia.

[0036] La secuencia aminoacídica de netrina 1 (sin el péptido señal) es como se representa en la SEQ ID NO:13 y la netrina 1 puede usarse total o parcialmente para diseñar anticuerpos.

[0037] Generalmente, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse según el procedimiento convencional de fusión de linfocitos y cultivo de hibridoma descrito por Kohler y Milstein, (1975). Son también conocidos otros procedimientos para preparar anticuerpos monoclonales (Harlow et al., ed., 1988 "Antibodies: a laboratory manual"). Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse inmunizando un mamífero (por ejemplo un ratón, una rata, un conejo o incluso un ser humano y similares) y usando la técnica de fusión de linfocitos que conduce a hibridoma (Kohler y Milstein, 1975).

[0038] Existen técnicas alternativas a esta técnica habitual. Es posible, por ejemplo, producir anticuerpos monoclonales expresando un ácido nucleico clonado de un hibridoma. También es posible producir anticuerpos mediante la técnica de exposición en fago introduciendo ADNc de anticuerpos en vectores, que son típicamente fagos filamentosos que exhiben colecciones génicas V en la superficie del fago (por ejemplo, fUSE5 para E. coli, Scott, 1990). Se describen protocolos para construir estas colecciones de anticuerpos en Marks et al. (1991). Se usa el ADNc correspondiente a netrina 1 completa con secuencia señal (SEQ ID NO: 14) o a un fragmento adecuado de la misma para producir anticuerpos monoclonales según estos procedimientos.

[0039] En una realización preferida, el fármaco interferente comprende un dominio extracelular de un receptor de netrina 1 o un fragmento de dicho dominio extracelular. Los receptores de netrina 1 pueden ser DCC, UNC5A, UNC5B, UNC5C o UNC5D.

[0040] En una realización, el dominio extracelular o parte del mismo está unido a una parte de Fc de anticuerpo. En una realización preferida, la parte de Fc es el Fc o parte del mismo de una IgG humana. A saber, la IgG humana puede ser IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. En una realización preferida, la IgG es IgG1.

[0041] En una realización, la proteína de fusión es monocatenaria, lo que significa que la proteína está compuesta por un fragmento de DCC o UNC5 que comprende o está constituido respectivamente por el cuarto o quinto dominio de tipo fibronectina de DCC o los dos dominios de tipo Ig de UNC5 y por una secuencia peptídica o proteica que mejora los parámetros farmacéuticos del compuesto.

[0042] En otra realización preferida, la proteína de fusión es bicatenaria, lo que significa que la proteína de fusión está compuesta por dos cadenas que comprenden o están constituidas cada una respectivamente por el cuarto o quinto dominio de tipo fibronectina de DCC o los dos dominios de tipo Ig de UNC5 y una parte de Fc de anticuerpo, en la que ambas cadenas están ligadas conjuntamente, preferiblemente por uno o más, p. ej. dos enlaces disulfuro.

[0043] En una realización, el fármaco comprende el quinto dominio de fibronectina (Fn5 o 5Fbn) de DCC. Preferiblemente, el fármaco comprende una proteína de fusión de DCC que comprende este Fn5 fusionado con una parte de Fc de anticuerpo. En una realización preferida, la parte de Fc es el Fc o parte del mismo de una IgG humana. A saber, la IgG humana puede ser IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. En una realización preferida, la IgG es IgG1. El gen de DCC está disponible por ejemplo en la NCBI, con ID 1630 (actualizado a 14 de julio de 2012), y codifica la proteína de receptor DCC como Uniprot P43146, actualizado a 11 de julio de 2012. Se describe una proteína de fusión de DCC útil en la invención y que comprende Fn5 en el documento WO2012025618. En una realización, la proteína de fusión tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, 3 o 4 en el documento WO2012025618. En una realización, la proteína de fusión está codificada por la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 en el documento WO2012025618. Otros ejemplos de proteínas de fusión que comprenden Fn5 son la proteína de fusión de DCC-5-fibronectina con glutation-S-transferasa (DCC-5Fbn-GST) descrita en el documento WO2007099133, Fitamant et al.

(14) y Delloye-Bourgeois (16).

[0044] En una realización, el fármaco comprende los dos dominios de tipo Ig de un UNC5. Preferiblemente, el fármaco comprende la proteína de fusión de UNC5 que comprende los dos dominios de tipo Ig de un UNC5 fusionados con una parte de Fc de anticuerpo. A saber, la IgG humana puede ser IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. En una realización preferida, la IgG es IgG1. En una realización, el UNC5 es UNC5A. En otra realización, el UNC5 es UNC5B. En otra realización, el UNC5 es UNC5C. En aún otra realización, el UNC5 es UNC5D.

[0045] En una realización, la proteína UNC5A en la fusión de UNC5A comprende o consiste en los aminoácidos 20 a 217 de SEQ ID NO: 1. Esta proteína de fusión puede comprender además Fc de IgG1 que comprende o consiste en los aminoácidos 220 a 446 de SEQ ID NO: 1. Este Fc está fusionado con la proteína UNC5A, por ejemplo, a través de un ligador tal como GT. En una realización, la presente invención se refiere a una fusión de UNC5A de proteína UNC5A que comprende o consiste en la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 1: secuencia de péptido señal Kappa2: aa 1 a 19; dominios de tipo Ig de UNC5A: aa 20 a 217; ligador: aa 218-219; Fc de IgG1 humana: aa 220 a 446. En una realización, la proteína de fusión madura no comprende la secuencia del péptido señal Kappa2. En una realización preferida, la proteína de fusión es bicatenaria. La presente invención engloba también secuencias variante que tienen un porcentaje de identidad que es mayor o igual al 90 %, preferiblemente 96, 95, 94, 93, 92 o 91 %, en toda la longitud de la secuencia aminoacídica 20-217, o los aminoácidos 20-446 de SEQ ID NO: 1. Pueden aparecer sustituciones aminoacídicas, por ejemplo, en una o varias de las posiciones 9, 72, 74, 87, 144, 164, 170, 193 y/ o 210 en toda la longitud de la secuencia aminoacídica 20-217, o de la SEQ ID NO: 1.

[0046] En otra realización, la proteína UNC5B en la fusión de UNC5B comprende o consiste en los aminoácidos 20 a 215 de SEQ ID NO: 2. Esta proteína de fusión puede comprender además la Fc de IgG1 que comprende o consiste en los aminoácidos 218 a 444 de SEQ ID NO: 2. Este Fc está fusionado con la proteína UNC5A, por ejemplo a través de un ligador tal como GT. En una realización, la presente invención se refiere a una fusión de UNC5B de proteína UNC5B que comprende o consiste en la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2: secuencia de péptido señal Kappa2: aa 1 a 19; dominios de tipo Ig de UNC5B: aa 20 a 215; ligador: aa 216-217; Fc de IgG1 humana: aa 218 a 444. En una realización, la proteína de fusión madura no comprende la secuencia de péptido señal Kappa2. En una realización preferida, la proteína de fusión es bicatenaria. La presente invención engloba secuencias variantes que tienen un porcentaje de identidad que es mayor o igual al 90 %, preferiblemente 96, 95, 94, 93, 92 o 91 %, en toda la longitud de la secuencia aminoacídica 20-215, o los aminoácidos 20-444 de SEQ ID NO: 2. Pueden aparecer sustituciones aminoacídicas por ejemplo en una o varias de las posiciones 29, 74, 100, 109, 113, 146, 149, 155, 172, 184, 189, 201, 213 y/ o 214 en toda la longitud de la secuencia aminoacídica 20­ 215, o de la SEQ ID NO: 2.

[0047] En aún otra realización, la proteína UNC5C en la fusión de UNC5C comprende o consiste en los aminoácidos 20 a 217 de SEQ ID NO: 3. Esta proteína de fusión puede comprender además la Fc de IgG1 que comprende o consiste en los aminoácidos 220 a 446 de SEQ ID NO: 3. Este Fc está fusionado con la proteína UNC5A, por ejemplo a través de un ligador tal como GT. En una realización, la presente invención se refiere a una fusión de UNC5C de proteína UNC5C que comprende o consiste en la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 3: secuencia del péptido señal Kappa2: aa 1 a 19; dominios de tipo Ig de UNC5C: aa 20 a 217; ligador: aa 218-219; Fc de IgG humana: aa 220 a 446. En una realización, la proteína de fusión madura no comprende la secuencia de péptido señal Kappa2. En una realización preferida, la proteína de fusión es bicatenaria. La presente invención engloba secuencias variantes que tienen un porcentaje de identidad que es mayor o igual al 90 %, preferiblemente 96, 95, 94, 93, 92 o 91 %, en toda la longitud de la secuencia aminoacídica 20-217, o los aminoácidos 20-446 de SEQ ID NO: 3. Pueden aparecer sustituciones aminoacídicas por ejemplo en una o varias de las posiciones 33, 66, 109, 129, 136, 178, 189 y/ o 211 en toda la longitud de la secuencia aminoacídica 20-217, o de la SeQ ID NO:3.

[0048] En aún otra realización, la proteína UNC5D en la fusión de UNC5D comprende o consiste en los aminoácidos 20 a 217 de SEQ ID NO: 4. Esta proteína de fusión puede comprender además la Fc de IgG1 que comprende o consiste en los aminoácidos 220 a 446 de SEQ ID NO: 4. Este Fc está fusionado con la proteína UNC5A, por ejemplo a través de un ligador tal como GT. En una realización, la presente invención se refiere a una fusión de UNC5D de proteína UNC5D que comprende o consiste en la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 4: secuencia del péptido señal Kappa2: aa 1 a 19; dominios de tipo Ig de UNC5D: aa 20 a 217; ligador: aa 218-219; Fc de IgG humana: aa 220 a 446. En una realización, la proteína de fusión madura no comprende la secuencia de péptido señal Kappa2. En una realización preferida, la proteína de fusión es bicatenaria. La presente invención engloba secuencias variantes que tienen un porcentaje de identidad que es mayor o igual al 90 %, preferiblemente 96, 95, 94, 93, 92 o 91 %, en toda la longitud de la secuencia aminoacídica 20-217, o los aminoácidos 20-446 de SEQ ID NO: 4. Pueden aparecer sustituciones aminoacídicas por ejemplo en una o varias de las posiciones 38, 79, 80, 115, 131, 178, 186, 201 y/ o 212 en toda la longitud de la secuencia aminoacídica 20-217, o de la SEQ ID NO:4.

[0049] La presente invención proporciona las siguientes moléculas de ácido nucleico:

- SEQ ID NO: 5 que codifica una proteína UNC5A; nt (nucleótidos); nt 1-6 sitio de restricción Hindlll, nt 7-15 secuencia Kozak, nt 16-72 secuencia señal kappa2, nt 73-666 secuencia codificante de UNC5A, nt 667-672 sitio de restricción Xpnl;

- SEQ ID NO: 6 que codifica una proteína UNC5B; nt (nucleótidos); nt 1-6 sitio de restricción Hindlll, nt 7-15 secuencia Kozak, nt 16-72 secuencia señal kappa2, nt 73-660 secuencia codificante de UNC5B, nt 661-666 sitio de restricción Xpnl;

- SEQ ID NO: 7 que codifica una proteína UNC5C; nt (nucleótidos); nt 1-6 sitio de restricción Hindlll, nt 7-15 secuencia Kozak, nt 16-72 secuencia señal kappa2, nt 73-666 secuencia codificante de UNC5C, nt 667-672 sitio de restricción Xpnl;

- SEQ ID NO: 8, que codifica una proteína UNC5D; nt (nucleótidos); nt 1-6 sitio de restricción Hindlll, nt 7-15 secuencia Kozak, nt 16-72 secuencia señal kappa2, nt 73-666 secuencia codificante de UNC5C, nt 667-672 sitio de restricción Xpnl;

- SEQ ID NO: 9 que codifica una Fc de IgG humana (secuencia de ADN de bisagra CH2 CH3, nt 7-693), con sitio de restricción Kpnl en las posiciones 1-6 nt y sitio de restricción Xbal en la posición 694-699.

[0050] Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser moléculas de ADN o moléculas de ARN. Pueden ser también análogos de ácido nucleico, tales como tiofosfatos oligonucleotídicos, riboligonucleótidos sustituidos, moléculas de ANB (ácido nucleico bloqueado), moléculas de ANP (ácido nucleico peptídico), moléculas de ANG (ácido nucleico glicólico), moléculas de ANT (ácido nucleico treósico), polinucleótidos de morfolino o moléculas de ácido nucleico antagomir (conjugadas con colesterol) o cualquier modificación de las mismas conocida en la materia (véanse, p. ej., los documentos US 5.525.711, US 4.711.955, US 5.792.608 o EP 302.175 para ejemplos de modificaciones). Las moléculas de ácido nucleico en el contexto de la presente invención pueden ser residuos de ácido nucleico de origen natural o residuos de ácido nucleico producidos artificialmente. Son ejemplos de residuos de ácido nucleico adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T), uracilo (U), xantina (X) e hipoxantina (HX). En el contexto de la presente invención, pueden usarse timina (T) y uracilo (U) intercambiablemente dependiendo del tipo respectivo de molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, como será bien consciente un especialista en la materia, una timina (T) como parte de un ADN corresponde a un uracilo (U) como parte del ARNm correspondiente transcrito. La molécula de ácido nucleico de la presente invención puede ser monocatenaria o bicatenaria, lineal o circular, natural o sintética y, si no se indica otra cosa, sin ninguna limitación de tamaño. La molécula de ácido nucleico puede comprender también un promotor como se detalla adicionalmente a continuación en la presente memoria. El promotor puede ser homólogo o heterólogo. En una realización particular, la molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria está bajo el control de este promotor.

[0051] Generalmente, como se usa en la presente memoria, un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de una secuencia proporcionada en la presente memoria puede ser también un polinucleótido consistente en dicha secuencia de ácido nucleico.

[0052] La molécula de ácido nucleico de la presente invención puede clonarse en un vector. El especialista en la materia puede consultar el documento WO2007/099133, que describe vectores y procedimientos de preparación de vectores y su uso, que pueden usarse para llevar a cabo la presente invención. El término “vector” como se usa particularmente en la presente memoria hace referencia a plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores usados comúnmente en ingeniería genética. En una realización preferida, estos vectores son adecuados para la transformación de células, células eucarióticas como células fúngicas, células de microorganismos tales como levadura o células procarióticas. En una realización preferida particular, tales vectores son adecuados para la transformación estable de células bacterianas, por ejemplo para transcribir la molécula de ácido nucleico de la presente invención. Por ejemplo, el vector puede ser pUC18. En particular, el documento WO2007/099133 divulga vectores que expresan proteínas de fusión basadas en DCC, tales como los vectores identificados como 7800 y 7809 en el Ejemplo 1 del documento WO2007/099133. La presente invención proporciona por tanto un vector que codifica la proteína de fusión de SEQ ID NO: 2, 3 o 4 en el documento WO2012025618, o un vector de secuencia de ADN SEQ Id NO: 1 en el documento WO2012025618, para la proteína de fusión de DCC.

[0053] La presente invención proporciona también un vector tal como pUC18 que contiene una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica una proteína de fusión como se describe y proporciona en la presente memoria. En lo que atañe a UNC5, la presente invención se refiere por lo tanto a un vector tal como un pUC18 que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 20-217 y 220-446 de SEQ ID NO: 1 fusionados conjuntamente, o la secuencia SEQ ID NO:1; los aminoácidos 20-215 y 218-444 de SEQ ID NO: 2 fusionados conjuntamente, o la secuencia SEQ ID NO: 2; los aminoácidos 20-217 y 220-446 de SEQ ID NO: 3 fusionados conjuntamente, o la secuencia SEQ ID NO:3; o los aminoácidos 20-217 y 220-446 de SEQ ID NO: 4 fusionados conjuntamente, o la secuencia SEQ ID NO:4. Particularmente, la presente invención proporciona un vector tal como pUC18 que contiene una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica 73 666 de SEQ ID NO : 5, o 73-660 de SEQ ID NO : 6, o 73-666 de SEQ ID NO : 7 o 73-666 de SEQ ID NO : 8. Estos vectores comprenden también la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO : 9, particularmente los nucleótidos 7-693. Generalmente, el vector puede ser capaz de expresar dicha molécula de ácido nucleico en una célula hospedadora eucariótica.

[0054] El vector como se proporciona es un vector de expresión. Generalmente, los vectores de expresión se han descrito ampliamente en la bibliografía. El vector de expresión puede contener un gen marcador de selección y un origen de replicación que asegura la replicación en el hospedador. El vector de expresión puede comprender un promotor. Puede comprender además una señal de terminación de la transcripción. Entre el promotor y la señal de terminación hay preferiblemente al menos un sitio de restricción o un poliligador que posibilita la inserción de una secuencia de ácido nucleico/molécula que se desea expresar. En una realización, el vector es capaz de expresar la proteína in vivo, o sea el vector, una vez administrado a un paciente, es capaz de expresar la proteína in situ.

[0055] Ha de entenderse que, cuando el vector proporcionado en la presente memoria se genera aprovechando un vector de expresión conocido en la técnica anterior que comprende ya un promotor adecuado para emplear en el contexto de esta invención, por ejemplo la expresión de una proteína de fusión de UNC5 como se describe en la presente memoria, se inserta la molécula de ácido nucleico en ese vector de manera que el vector resultante comprenda preferiblemente solo un promotor adecuado para emplear en el contexto de esta invención. El promotor puede ser generalmente heterólogo u homólogo. El vector descrito en la presente memoria puede englobar también más de un promotor, cada promotor respectivo puede ser heterólogo u homólogo. El especialista sabe cómo puede ponerse en práctica tal inserción. Por ejemplo, el promotor puede escindirse del constructo de ácido nucleico o del vector de expresión antes del ligamiento.

[0056] Las proteínas según la invención se producen preferiblemente por medios recombinantes. Preferiblemente, la expresión de proteína es en una célula eucariótica con posterior aislamiento del polipéptido y habitualmente purificación a una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de proteína, se insertan ácidos nucleicos que codifican la proteína de los mismos en vectores de expresión por procedimientos estándares. Se efectúa la expresión en células hospedadoras eucarióticas estables apropiadas como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293 o células COS y se recupera la proteína de las células (sobrenadante o células después de lisis). Las células HEK293 parecían ser muy adecuadas para este fin y forman una realización particular.

[0057] En una realización, la molécula de ácido nucleico de la presente invención y/ o el vector en que se clona el polinucleótido descrito en la presente memoria pueden transducirse, transformarse o transfectarse o introducirse de otro modo en una célula hospedadora. Por ejemplo, la célula hospedadora es una célula eucariótica o una célula procariótica, preferiblemente una célula eucariótica. Como ejemplo no limitante, la célula hospedadora es una célula de mamífero. La célula hospedadora descrita en la presente memoria pretende ser particularmente útil para generar las proteínas de fusión de UNC5 descritas y proporcionadas en la presente invención.

[0058] Generalmente, la célula hospedadora descrita anteriormente en la presente memoria es una célula procariótica o eucariótica, preferiblemente una célula eucariótica que comprende una molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente invención o el vector descrito en la presente memoria o una célula derivada de tal célula y que contiene la molécula de ácido nucleico o el vector descritos en la presente memoria. En una realización preferida, la célula hospedadora comprende, es decir se modifica genéticamente con la molécula de ácido nucleico de la presente invención o el vector descrito en la presente memoria de tal modo que contenga, la molécula de ácido nucleico de la presente invención integrada en el genoma. Por ejemplo, tal célula hospedadora descrita en la presente memoria puede ser una célula humana, de levadura u hongo. En un aspecto particular, la célula hospedadora es capaz de transcribir la molécula de ácido nucleico de la presente invención. Está contenida una perspectiva general de ejemplos de diferentes sistemas de expresión correspondientes para usar para generar la célula hospedadora descrita en la presente memoria, por ejemplo, en Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, en Bitter (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544), en Sawers (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463) y en Griffiths (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440). La transformación o ingeniería genética de la célula hospedadora con la molécula de ácido nucleico de la presente invención o vector descrito en la presente memoria puede llevarse a cabo por procedimientos estándares, como se describe por ejemplo en Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CHS Press, Cold Spring Harbor, ⁿY ^e E. UU.; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990.

[0059] La célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico proporcionada en la presente memoria o un vector descrito en la presente memoria puede ser una célula HEK293 o una célula HEK293-Freestyle (línea celular de riñón embrionario humano 293, Invitrogen). La presente invención proporciona por tanto un procedimiento para producir las proteínas de fusión de DCC y UNC5 como se proporcionan y describen en la presente memoria. Este procedimiento comprende las etapas de expresar una molécula de ácido nucleico como se proporciona y describe en la presente memoria en una célula hospedadora adecuada, especialmente como se describe en la presente memoria, y recuperar la proteína de fusión de DCC o UNC5 de dicha célula o sobrenadante de cultivo celular.

[0060] La presente invención se refiere a composiciones que comprenden un fármaco interferente de netrina 1. Se refiere en particular a composiciones que comprenden una proteína de fusión de DCC y/ o UNC5 como se proporciona en la presente memoria o un vector de expresión in vivo que codifica una proteína de fusión de DCC y/ o UNC5. Se refiere también en particular a composiciones que comprenden un anticuerpo anti-netrina 1. Estas composiciones pueden comprender además un portador, excipiente y/ o diluyente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden usarse como coingrediente farmacéutico o producto farmacéutico y forman una composición farmacéutica o un medicamento para usar en combinación con el fármaco o tratamiento quimioterapéutico en el mismo paciente.

[0061] En una realización, tanto las proteínas de fusión de DCC y/ o UNC5 proporcionadas en la presente memoria o un vector de expresión in vivo que codifica una proteína de fusión de DCC y/ o UNC5 como el fármaco quimioterapéutico están dentro de la misma composición con un portador, excipiente y/ o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0062] En otra realización, se presentan en formas farmacéuticas separadas. Esto forma una composición o kit de piezas que comprende un fármaco quimioterapéutico y un fármaco interferente de netrina 1, para una administración simultánea, separada o secuencial a un paciente.

[0063] En una realización de las composiciones para uso, la administración es secuencial. En una realización preferida, el fármaco quimioterapéutico se administra primero, y el fármaco interferente de netrina 1 después. El intervalo entre ambas administraciones puede ser de al menos 5, 10, 15, 20 o 24 horas, preferiblemente entre 24 y 96 horas, más preferiblemente entre 24 y 72 horas, especialmente entre 24 y 48 horas, por ejemplo 24 horas. En una realización, el fármaco interferente de netrina 1 se administra simplemente el día después de la administración del fármaco quimioterapéutico.

[0064] Estas diferentes formas farmacéuticas pueden usarse en procedimientos de tratamiento en cantidades suficientes.

[0065] Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la materia. Incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones farmacéuticas que comprenden tales portadores pueden formularse mediante procedimientos convencionales bien conocidos.

[0066] Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse a un sujeto a una dosis adecuada, es decir para el fármaco interferente de netrina 1 al menos 1 mg/kg de peso corporal, p. ej. de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del sujeto en que se va a tratar el cáncer. El fármaco quimioterapéutico puede administrarse a la dosis habitual, o a una dosis reducida con respecto a la dosis habitual siempre que la combinación tenga una eficacia sinérgica. Por ejemplo, la dosis de fármaco quimioterapéutico se reduce un 10, 20, 30, 40, 50 % o más. La administración de la composición puede efectuarse o administrarse de diferentes modos, p. ej. por vía oral (p. ej., por píldora, comprimido, bucal, sublingual, por disgregación, cápsula, película fina, solución o suspensión líquida, polvo, cristales sólidos o líquido), rectal (p. ej., supositorio, enema), por inyección (p. ej. intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica), por inhalación (p. ej., intrabronquial), tópica, vaginal, epicutánea o intranasal). El régimen de dosificación se determinará por el médico a cargo y los factores clínicos. Como es bien conocido en las técnicas médicas, las dosificaciones para uno cualquiera de los pacientes dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño, área superficial corporal y edad del paciente, compuesto para administrar, sexo, momento y vía de administración, salud general y otros fármacos que se administren simultáneamente.

[0067] Las composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse local o sistémicamente. La administración será preferiblemente intravenosa o subcutánea. Las composiciones y composiciones farmacéuticas pueden administrarse también directamente al sitio diana, p. ej. por suministro biolístico a un sitio diana interno o externo o por catéter a un sitio en una arteria.

[0068] Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer o aceites no volátiles. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer) y similares. Pueden estar presentes también conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Además, también se prevén dosis por debajo o por encima de los intervalos ejemplares descritos anteriormente en la presente memoria, considerando especialmente los factores anteriormente mencionados.

[0069] Como ya se ha mencionado, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de un cáncer que sobreexpresa netrina 1.

[0070] Algunas realizaciones de cánceres incluyen cáncer de mama metastásico, carcinoma pulmonar no microcítico, neuroblastoma agresivo, adenocarcinoma pancreático, melanoma primario (n=7), metástasis de melanoma (n=6), cánceres de ovario, glioblastoma, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, linfoma de linfocitos B agresivo, sarcoma, adenocarcinoma renal, cánceres de cabeza y cuello, cánceres testiculares (p. ej., carcinoma embrionario, teratoma, tumores de saco vitelino), cánceres de riñón, cánceres de estómago y cánceres de útero. Se enumeran a continuación ejemplos de cánceres.

[0071] Los procedimientos de determinación de si una célula dada expresa los receptores de dependencia DCC y/ o UNC5 sobre la superficie y/ o muestra una regulación positiva significativa de la expresión del gen de netrina 1 son bien conocidos en la materia y comprenden, pero sin limitación, IHC (inmunohistoquímica) de FACS (clasificación celular activada por fluorescencia), PCR cuantitativa (p. ej., con ADNc cebado con hexámero) o como alternativa transferencia Western emparejada con técnicas de detección de proteína basadas en tinte cromogénico (tales como tinción con plata o azul de Coomassie) o procedimientos de detección basados en fluorescencia y luminiscencia para proteínas en soluciones y en geles, transferencias y micromatrices, tales como inmunotinción, así como inmunoprecipitación, ELISA, micromatrices y espectrometría de masas. En el contexto de la presente invención, se enumeran en la presente memoria ejemplos de cánceres para tratar, incluyendo versiones resistentes de cualquiera de los cánceres mencionados.

[0072] La invención se describirá ahora con más detalle, de modo no limitante, por referencia al dibujo, en que:

Figuras 1-4: La netrina 1 y sus receptores de dependencia están regulados positivamente tras el tratamiento con doxorrubicina.

Figura 1: Se trataron las líneas celulares de cáncer de pulmón A549 y H460 con doxorrubicina 2 pM durante 24 horas y se comparó la expresión del gen de netrina 1, normalizada a 3-fosfato de gliceraldehído deshidrogenasa (GAPDH) con células no tratadas, por PCR cuantitativa. El tratamiento con doxorrubicina inducía en ambas líneas celulares una fuerte inducción de la expresión del gen de netrina 1. Los resultados representan valores medios de cinco experimentos independientes. Se efectuaron pruebas de Mann-Whitney y se indica el valor de P. DoxoR, doxorrubicina; Act.D, Actinomicina D; NT, no tratado.

Figura 2: Se trataron células A549 con doxorrubicina 1 pM y 2 pM durante 48 horas y se evaluaron los niveles de proteína netrina 1 por transferencia Western. La proteína netrina 1, normalizada a p-actina, se acumulaba fuertemente después del tratamiento con doxorrubicina. Se confirmó la regulación positiva de netrina 1 por tinción de inmunofluorescencia después de tratamiento con doxorrubicina 2 pM durante 48 horas. Se contratiñeron los núcleos con tinción de Hoescht (en azul) (no mostrado).

Figura 3: Se midió la expresión génica de receptores de netrina 1 en células A549 después de tratamiento con doxorrubicina. La expresión génica de UNC5A, UNC5B y DCC estaba significativamente regulada positivamente por doxorrubicina, mientras que UNC5C y UNC5D mostraban variaciones no significativas. Se efectuaron pruebas de Mann-Whitney y se indica el valor de ^P . DoxoR, doxorrubicina; Act.D, actinomicina D; NT, no tratado.

Figura 4: La regulación positiva de netrina 1 inducida por doxorrubicina es directamente dependiente de la transcripción génica. Se trataron células A549 con doxorrubicina 2 pM y con el potente inhibidor de ARN polimerasas actinomicina D (100 pg/ml) durante 24 horas. La actinomicina D inhibía fuertemente la regulación positiva de netrina 1 después del tratamiento con doxorrubicina (Doxo.). Se efectuaron pruebas de Mann-Whitney y se indica el valor de ^P . DoxoR, doxorrubicina; Act.D, actinomicina D; NT, no tratado, Doxo., doxorrubicina actinomicina D.

Figuras 5-9: La expresión de netrina 1 y sus receptores aumenta en varias líneas celulares de cáncer y en tumores de ovario tras tratamiento con fármacos citotóxicos.

Figuras 5-8: Se midieron los niveles de expresión de netrina 1 (NTN1), DCC, UNC5B y UNC5D por RT-PCR cuantitativa. Se trataron líneas celulares de cáncer de mama (HBL100), cáncer de pulmón (A549, H322, H358), cáncer de colon (HCT116, HCT8), cáncer de páncreas (MiaPacA-2, Panc-1), neuroblastoma (SH-Sy5y, IMR32), glioblastoma (SF767, U87MG) y cáncer de ovario (PA-1, TOV-112^d , NIH-OVCAR3) con fármacos quimioterapéuticos clásicos (doxorrubicina, cisplatino, 5-fluorouracilo y Taxol) a diferentes concentraciones de fármacos dependientes de los valores de CI⁵⁰ calculados para cada línea celular y tratamiento de fármaco durante 24 horas. Se comparó la expresión de netrina 1 y sus receptores con células de control no tratadas y se puntuaron las variaciones como sigue: sin cambios o regulación negativa; , entre 2 y 4 veces frente al control de expresión génica; +, entre 4 y 100 veces frente al control; ++, más de 100 veces frente al control; n.d.: no determinado; n.e., no expresado. Se determinaron en las líneas celulares positivas las variaciones de expresión génica de más de 2 veces frente al control. Los recuadros grises representan líneas celulares de cáncer resistentes (es decir, más de un 50 % de supervivencia celular después de tratamiento con concentraciones máximas de fármaco).

Figura 9: Se sobreexpresa netrina 1 en pacientes de tumor de ovario después de tratamiento quimioterapéutico. Se analizó el nivel de netrina 1, normalizado a GAPDH, usado como gen constitutivo, en ARN extraído de biopsias de ovario de tumores de pacientes obtenidas antes y después de un ciclo quimioterapéutico de tratamiento de carboplatino/taxol. Se calculó el nivel mediano de netrina 1 para cada grupo.

Figuras 10-15: El silenciamiento de netrina 1 sensibiliza células A549 ante doxorrubicina e induce la muerte celular apoptótica a través del receptor UNC5B.

Figuras 10-12: El silenciamiento de netrina 1 sensibiliza células tumorales ante doxorrubicina. Se transfectaron células A549 con un ARNip reordenado (siCTRL, control negativo universal de ARNip n° 1, Sigma-Aldrich) o con un ARNip específico orientado a netrina 1 (siNet, secuencia SEQ ID NO: 10: AAGCUGGACGCAGCAUGAUGC). 24 horas después de la transfección, se trataron las células con concentraciones crecientes de doxorrubicina. Se evaluó la tasa de muerte celular (Figura 10), medida por el kit Toxilight como se describe en la sección de Materiales y procedimientos, y se evaluó la supervivencia celular (Figura 11) 48 horas después del tratamiento. Se normalizaron los resultados a células de control no tratadas. Aunque las células transfectadas con ARNip reordenado mostraron una resistencia general al tratamiento con doxorrubicina, el silenciamiento de netrina 1 inducía fuertemente la muerte celular y disminuía la supervivencia celular en presencia de doxorrubicina. La evaluación del porcentaje de muerte celular (Figura 12), medido por exclusión de 4',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) como se describe en la sección de Materiales y procedimientos, confirmó que el ARNip de netrina 1 sensibilizaba células A549 ante el tratamiento con doxorrubicina 0,5 mM y 2 mM. *, P< 0,05; **, P< 0,01. DoxoR, Doxorrubicina.

Figuras 13-14: El silenciamiento de netrina 1 desencadena la apoptosis en combinación con el tratamiento con doxorrubicina. Se transfectaron las células A549 como en (las Figuras 10-12) y se trataron con las concentraciones de doxorrubicina indicadas durante 24 horas. Se evaluaron la caspasa 3 activa (Figura 13), normalizada a células no tratadas, y la fragmentación de ADN (Figura 14) como se describe en la sección de Materiales y procedimientos. Aunque la doxorrubicina no conseguía inducir la apoptosis en células A549 transfectadas con un ARNip reordenado (siCTRL), las células con netrina 1 silenciada mostraron un fuerte aumento de la tasa apoptótica. *, P< 0,05; **, P< 0,01. DoxoR, doxorrubicina.

Figura 15: La combinación de silenciamiento de netrina 1 y tratamiento con doxorrubicina induce la muerte celular a través del receptor de netrina 1 UNC5B. Se transfectaron células A549 con ARNip reordenado (siCTRL), ARNip específico de netrina 1 (siNet), ARNip específico de UNC5B (siUnc5B) y con una combinación de ARNip orientado a netrina 1 y UNC5B. 24 horas después de la transfección, se trataron las células con las concentraciones de doxorrubicina indicadas durante 48 horas, se midió la tasa de muerte celular por Toxilight y se normalizó a células no tratadas de control. Aunque el silenciamiento de netrina 1 (siNet) sensibilizaba células A549 ante el tratamiento con doxorrubicina, en comparación con células transfectadas con siCTRL, el silenciamiento simultáneo de netrina 1 y UNC5B (siNet+siUnc5B) rescataba la inducción de muerte celular por siNet y tratamiento con doxorrubicina. *, P< 0,05; **, P< 0,01. DoxoR, doxorrubicina.

Figuras 16-21: La interferencia de la interacción de netrina 1 y sus receptores sensibiliza células tumorales ante fármacos citotóxicos.

Figuras 16-17: Se trataron células A549 durante 48 horas con las concentraciones de doxorrubicina indicadas en presencia o no de 2 pg/ml de TRAP-netrinDCC (Figura 16) y TRAP-netrinUnc5A (Figura 17). El cotratamiento con doxorrubicina y las dos proteínas de fusión recombinantes aumentaba la tasa de muerte celular, medida por Toxilight, en comparación con las células tratadas con doxorrubicina y PBS. Se normalizaron los resultados a células no tratadas. *, P< 0,05; **, P <0,01; ***, P< 0,001. DoxoR, doxorrubicina.

Figuras 18-19: Se trataron células A549 con PBS o 2 pg/ml de TRAP-netrinUnc5A, en presencia de las concentraciones indicadas de 5-fluorouracilo (5-FU, Figura 18) o cisplatino (Figura 19). 48 horas después del cotratamiento, se midió la supervivencia celular por MTS y se normalizó a células no tratadas. *, P< 0,05; **, P< 0,01; ***, p < 0,001. DoxoR, doxorrubicina.

Figuras 20-21: Se trataron células MiaPacA con PBS o 2 pg/ml de TRAP-netrinUnc5A, en presencia de las concentraciones indicadas de 5-FU (Figura 20) o doxorrubicina (Figure 21). 48 horas después del cotratamiento, se midió la supervivencia celular y se normalizó a células no tratadas. *, P< 0,05; **, P< 0,01; ***, P< 0,001. DoxoR, doxorrubicina.

Figura 22: La interferencia de netrina 1 potencia el efecto anticanceroso de la doxorrubicina en un modelo animal preclínico. Se injertaron células A549 en ratones desnudos atímicos hembra de 7 semanas de edad. Una vez los tumores alcanzaron un volumen de 100 mm3, se trataron los ratones por vía intraperitoneal con TRAP-netrinUNC5A (20 mg/kg), doxorrubicina (2 mg/kg) o con una combinación de ambos fármacos, dos veces por semana durante dos semanas. Como control, se inyectó a los ratones PBS. El histograma representa el crecimiento de volumen tumoral para cada grupo en función de los días después del xenoinjerto. Aunque el fármaco solo no era capaz de reducir el crecimiento tumoral, la combinación de TRAP-netrinUNC5A y tratamiento con doxorrubicina reducía significativamente el crecimiento tumoral.

Figuras 23-27: Expresión génica de los receptores de netrina 1 después del tratamiento con fármacos citotóxicos. Figuras 23-24: Se trataron las células cancerosas como se describe en la Fig. 5, y se evaluó la expresión génica de UNC5A y UNC5C después del tratamiento con fármaco. El sistema de puntuación es el mismo usado en la Fig. 5. Ambos receptores mostraron pocos cambios de los niveles de expresión después del tratamiento, en comparación con células no tratadas.

Figuras 25-27: Niveles de expresión de receptores de netrina 1 en biopsias de ovario de tumores de pacientes antes y después de tratamiento con carboplatino/Taxol. Se calcularon los valores medianos de cada grupo. La expresión génica de UNC5B (Figura 25), UNC5D (C=Figura 26) y DCC (Figura 27) mostraba una regulación positiva similar después del tratamiento quimioterapéutico. Se normalizaron los niveles de expresión a 3-fosfato de gliceraldehído deshidrogenasa (GAPDH), usado como gen constitutivo.

Figura 28: Sensibilidad celular ante fármacos citotóxicos. Se determinó la concentración inhibidora (CI) CI¹⁰, CI³⁰ y CI⁵⁰ en respuesta a cisplatino, 5-fluorouracilo (5FU), doxorrubicina y paclitaxel (Taxol) para las líneas celulares indicadas por ensayos de MTS. Se calcularon los valores de CI⁵⁰ por regresión lineal de gráficas recíprocas dobles. Para líneas celulares cancerosas resistentes (es decir más de un 50 % de supervivencia celular después de tratamiento con concentraciones máximas de fármaco CI^máx), representadas por recuadros grises, se calcularon CI^máx y fracciones.

Figura 29: Mapa del plásmido de expresión NP-X.

Listado de secuencias:

I. Materiales y procedimientos:

1. RT-PCR cuantitativa que permite valorar la expresión o sobreexpresión de netrina 1:

[0073] Se extrajo el ARN total usando el kit NucleoSpin® RNA II (Macherey Nagel, Düren, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se efectuaron las reacciones de RT-PCR con el kit iScript® cDNA Synthesis (Biorad). Se transcribió de forma inversa 1 pg de ARN total usando el siguiente programa: 25 °C durante 5 min, 42 °C durante 30 min y 85 °C durante 5 min. Para estudios de expresión, se amplificaron los transcritos diana en un aparato LightCycler® 2.0 (Roche Applied Science), usando el kit LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Applied Science). Se normalizó la expresión de genes diana a genes de 3-fosfato de gliceraldehído deshidrogenasa (GAPDH) y fosfoglicerasa cinasa (PGK), usados como genes constitutivos. Se calculó la cantidad de transcritos diana, normalizada al gen constitutivo, usando el procedimiento de C^t comparativo. Se efectuó un experimento de validación para demostrar que las eficacias de los genes diana y constitutivos eran aproximadamente iguales. Las secuencias de los cebadores son como sigue:

Cebador directo: aaaagtactgcaagaaggactatgc SEQ ID NO:11.

Cebador inverso: ccctgcttatacacggagatg SEQ ID NO:12.

2. Cuantificación de proteína netrina 1 en células cancerosas humanas:

[0074] Para análisis de inmunotransferencia, se lisaron células por sonicación en tampón RIPA modificado (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1 % de NP-40, 0,5 % de desoxicolato de sodio, 0,1 % de SDS, EDTA 1 mM, cóctel inhibidor de proteasas y DTT 5 mM) y se incubaron 1 h a 4 °C. Se sedimentó el residuo celular por centrifugación (10.000 g 15 min a 4 °C) y se cargaron extractos de proteína (200 pg por carril) en geles de poliacrilamida-SDS al 10 % y se transfirieron a láminas de PVDF (Millipore Corporation, Billerica, MA, EE. UU.). Se bloquearon los filtros con leche desnatada desecada al 10 % y BSA al 5 % en PBS/0,1 % de Tween 20 (PBS-T) durante una noche y se incubaron entonces durante 2 h con los anticuerpos policlonal de a-netrina 1 de conejo (dilución 1:500, clon H104, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.) y monoclonal de p-actina de ratón (Santa Cruz Biotechnologies). Después de tres lavados con PBS-T, se incubaron los filtros con el anticuerpo secundario conjugado con HRP apropiado (1:10000, Jackson ImmunoResearch, Suffolk, RU) durante 1 h. Se efectuó la detección usando el sistema West Dura Chemiluminescence (Pierce, Rockford, IL, EE. UU).

[0075] Para el estudio de inmunofluorescencia, se desprendieron las células, se centrifugaron en cubreobjetos con un Cytospiner (Shandon Cytospin 3, Thermo Scientific) y se fijaron durante 30 minutos con paraformaldehído al 4 % (v/v). Se permeabilizaron entonces las células durante 30 minutos en 0,2 % de Triton X-100/PBS y se bloquearon en PBS que contiene 2 % de BSA y 2 % de suero de asno normal. Se tiñó la netrina 1 endógena usando anticuerpo monoclonal de a-netrina 1 de rata (R&D systems) e IgG de asno anti-rata Alexa-488 (Molecular Probes). Se contratiñeron los núcleos usando tinción Hoescht (Sigma).

3. Ensayo de muerte celular y tratamiento de fármacos convencionales:

[0076] Se evaluó la muerte celular mediante diferentes procedimientos. Para los ensayos de muerte celular total, se hicieron crecer 5x103 células por pocillo en placa de 96 pocillos en medio pobre en suero y se trataron con doxorrubicina. 48 horas después, se evaluó la muerte celular usando el ensayo de toxicidad bioluminiscente ToxiLight (Lonza, Basilea, Suiza), según las instrucciones del fabricante. Como alternativa, se midió el porcentaje de muerte celular con naranja de acridina y tinción con DAPI, usando el sistema NucleoCounter NC-3000 (ChemoMetec A/S, Allenad, Dinamarca). Brevemente, se sembraron 5x104 células en placa de 12 pocillos y se trataron con doxorrubicina. 48 horas después del tratamiento, se recogieron las células flotantes y adherentes, se suspendieron en PBS y se mezclaron con dos tintes diferentes: naranja de acridina, que tiñe toda la población de células, y 4',6 -diamidino-2-fenilindol (DAPI), que tiñe las células no viables. Se determinó entonces la tasa de muerte celular, medida como células positivas de DAPI en la población celular total, por NucleoCounter NC-3000, siguiendo las notas de aplicación del fabricante. Se midió la supervivencia celular por el ensayo de MTS (ensayo CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation, Promega) en placas de 96 pocillos. Se efectuó el ensayo de MTS según los procedimientos del fabricante en 3x103 células crecidas en medio pobre en suero durante 16 horas y se trataron entonces durante 48 horas con las concentraciones de doxorrubicina indicadas en medio libre de suero. Se efectuó el ensayo de actividad caspasa 3 como se describe anteriormente (21) usando el kit de ensayo fluorimétrico Caspase 3/CPP32 (Gentaur Biovision, Bruselas, Bélgica), según las instrucciones del fabricante. Se calculó la actividad caspasa (actividad/min/microgramo de proteína) a partir de un ciclo cinético de 1 h leyendo en un espectrofluorímetro (405 nm/510 nm, Infinite F500, Tecan, Mannedorf, Suiza).

4. Fármacos candidatos:

[0077] TRAP-netrinDCC y TRAP-netrinUNC5A son respectivamente el quinto dominio de fibronectina del ectodominio de DCC y los dos dominios de inmunoglobulina (Ig1-Ig2) del ectodominio UNC5A, fusionados con la porción Fc de IgG1. Estas dos proteínas recombinantes se produjeron respectivamente en 293-Freestyle y CHO-Freestyle.

[0078] Se ha producido TRAP-netrinDCC según los ejemplos 1-4 del documento WO2012025618 usando el plásmido 7800. Puede producirse una proteína de fusión similar usando el vector 7809 también divulgado en estos ejemplos del documento WO2012025618.

[0079] Se ha producido TRAP-netrinUNC5A usando el procedimiento descrito en 5.

5. Producción de TRAP-netrinUNC5A (UNC5A-Fc), TRAP-netrinUNC5B (UNC5B-Fc) y TRAP-netrinUNC5C (UNC5CFc) Construcción de plásmido

[0080] Se usaron procedimientos estándares para manipular el ADN como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares según las instrucciones del fabricante. Se prepararon los segmentos génicos deseados por síntesis génica. Se clonaron los fragmentos génicos sintetizados en un vector de expresión especificado. Se confirmó la secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados por secuenciación de ADN.

[0081] Se representa el plásmido de expresión en la Figura 11 y se señala como PS-UNC5-Fc-NP-X (PS por péptido señal y X puede ser V-01 para UNC5A, V-02 para UNC5B y V-03 para UNC5C.

[0082] Este vector es un plásmido de expresión, p. ej. para la expresión transitoria de una proteína de fusión de Fc de Ig artificial en que los dominios de tipo Ig del receptor UNC5a , B o C humano están fusionados con la región bisagra de un anticuerpo de IgG1 humano (región constante Fc; bisagra-CH2-CH3) con la introducción de una secuencia ligadora artificial de 2 aminoácidos.

[0083] Se usó la síntesis génica química para preparar segmentos de ADN de 672 (SEQ ID NO: 5, 7) o 676 pb (SEQ ID NO: 6) flanqueados por una única endonucleasa de restricción Hindlll y Kpnl en el extremo 5' y 3', respectivamente. De forma similar, se preparó el segmento de ADN de 699 pb (SEQ ID NO: 9) flanqueado por una única endonucleasa de restricción Kpnl y Xbal en el extremo 5' y 3', respectivamente. Se obtuvo un segmento de ADN que codifica el marco abierto de lectura (ORF) de la proteína de fusión de UNC5 deseada (proteína de fusión de UNC5-Fc) (SEQ ID NO: 1, 2, 3) con el péptido señal Kappa 2 en la posición N-terminal por ligamiento de los dos segmentos de ADN citados anteriormente. Se introdujo el gen en un vector de expresión (NPV) del promotor inmediato de CMVIE y el potenciador hE1 y el sitio de polidenilación de hormona de crecimiento bovina (bGH).

[0084] La proteína de fusión de UNC5 (proteína de fusión UNC5-Fc) está compuesta por una secuencia señal de murino (aminoácidos 1 a 19 de las SEQ ID NO: 1, 2 o 3), los dos dominios de tipo inmunoglobulina del receptor UNC5 humano (UNC5A: aminoácidos 20 a 217 de SEQ iD NO: 1; corresponden a los aminoácidos 34 a 240 de UNC5A de la secuencia aminoacídica UniProt ID: Q6ZN44; UNC5B: aminoácidos 20 a 215 de SEQ ID NO: 2; corresponden a los aminoácidos 49 a 244 de UNC5B de la secuencia aminoacídica UniProt ID: Q8IZJ1; UNC5C: aminoácidos 20 a 217 de SEQ ID NO: 3; corresponden a los aminoácidos 61 a 258 de UNC5C de secuencia aminoacídica UniProt ID: 095185; ligador de dos aminoácidos (del sitio de clonación: aminoácidos 199 a 200 de SEQ ID NO: 3) y la región constante de Fc del anticuerpo de IgG1 humano (aminoácidos 220 a 446 de SEQ ID NO:

1 o 3; aminoácidos 218 a 444 de SEQ ID NO: 2). La proteína de fusión UNC5-Fc madura carece de péptido señal.

Transfección transitoria, expresión y purificación

[0085] Se obtuvieron proteínas recombinantes por transfección transitoria de células Freestyle HEK 293 (Invitrogen) que crecen en suspensión en medio de cultivo 293 Freestyle (Invitrogen) con 8 % de CO² a 37 °C. Para transfección, se usó el reactivo 293fectin® (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Tres días después de la transfección, se recolectaron los sobrenadantes y se clarificaron por centrifugación (10 min a 200 g). Se purificaron las proteínas de fusión de Fc usando proteína G-Sepharose 4 FF según las instrucciones del fabricante.

Se efectuaron las eluciones en glicina 0,1 M a pH 2,8. Se neutralizaron los eluidos en Tris-HCl 1 M pH 9,0 y se dializaron durante una noche frente a PBS. Se efectuó la analítica final usando electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes seguido de tinción con azul de Coomasie o análisis de transferencia Western después de transferencia a nitrocelulosa (usando un anticuerpo anti-IgG humano-HRP (específico de Fc), Sigma).

[0086] Se obtuvo también UNC5A-Fc recombinante por transfección transitoria de células Freestyle CHO-S (ovario de hámster chino, Invitrogen) que crecen en un medio libre de suero libre de componentes animales definido químicamente con 8 % de CO² a 31 °C. Para transfección, se usó el reactivo FreeStyleTM MAX (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La proteína de fusión UNC5A-Fc (SEQ ID NO: 1) podía secretarse con alta eficacia a una tasa de al menos 300 mg/l en expresión transitoria en células Freestyle CHO-S. Se recolectó el sobrenadante por centrifugación y se esterilizó por filtración (0,2 pm). Se determinó la concentración de UNC5A-Fc en el sobrenadante usando el sistema BioRad Experion. Se purificó posteriormente la proteína de fusión de Fc mediante cromatografía de intercambio catiónico seguida de cromatografía de afinidad con proteína A (PALL Protein A Ceramic Hyper D) según las instrucciones del fabricante, con excepción de elución en glicina-HCl 0,1 M pH 3,0. Se neutralizó el eluido con Tris-HCl 1 M pH 9 y se dializó durante una noche frente a citrato 20 mM, NaCl 134 mM, pH

6,2. Se efectuó la analítica final con el sistema Bio-Rad Experion para cuantificación, verificación de tamaño y presencia de contaminantes.

Tabla: Resultados de expresión

N.° de Característica Secuencia PM en Rendimiento de expresión en Rendimiento de expresión en plásmido kDa pg/ml (sobrenadante de pg/ml (sobrenadante de Freestyle HEK 293, día 3) Freestyle CHO-S 293, día 8)

NP-V-01 UNC5A-Fc SEQ ID 48,17 3,5 300

NO. 1

NP-V-02 UNC5B-Fc SEQ ID 48,31 25 -NO. 2

NP-V-03 UNC5C-Fc SEQ ID 48,55 5 -NO. 3

[0087] En el siguiente experimento, se ha usado UNC5A-Fc producido en células CHO-S.

6. Modelo animal:

[0088] Se obtuvieron ratones nu/nu atímicos hembra de siete semanas de edad (20-22 g de peso corporal) del animalario de Charles River. Se albergaron los ratones en jaulas rematadas con filtro esterilizadas y se mantuvieron en un animalario libre de patógenos. Se implantaron células A549 por inyección s.c. de 107 células en 200 pl de PBS en el flanco derecho de los ratones. Una vez se establecieron los tumores (V“ 100 mm3), se trataron los ratones con fármacos interferentes de netrina 1 y/ o fármacos citotóxicos durante dos semanas. Se midieron los tamaños tumorales con un calibre. Se calculó el volumen tumoral con la fórmula v=0,5x(longitudxanchura2). Al final del tratamiento, se recolectaron los tumores, se pesaron y se embebieron en gelatina al 7,5 %, sacarosa 0,12 M y se seccionaron en cortes de 20 pm.

7. Análisis estadístico:

[0089] Los datos reseñados son la media ± D.E. de al menos tres determinaciones independientes, efectuada cada una por triplicado. Se efectuó el análisis estadístico por la prueba de U de Mann-Whitney no paramétrica a menos que se indique otra cosa.

II. Resultados y discusión

1. Netrina 1 y sus receptores están regulados positivamente en células tumorales tras quimioterapias convencionales.

[0090] Se analizó en primer lugar por RT-PCR cuantitativa el nivel de netrina 1 en dos líneas de cáncer pulmonar A549 y H460 en respuesta a doxorrubicina. Como se muestra en la Fig.1, el nivel de ARNm de netrina 1 aumentaba masivamente en ambas líneas celulares (respectivamente en 430 y 300 veces) tras tratamiento con doxorrubicina 2 pM. Este aumento del ARNm estaba asociado a un robusto aumento de la expresión de proteína netrina 1 (Fig. 2 e inmunofluorescencia (no mostrada)).

[0091] A continuación, se analizó el nivel de los receptores de netrina 1 DCC y UNC5H, UNC5A, UNC5B, UNC5C y UNC5D en respuesta a doxorrubicina. Como se muestra en la Fig. 3, los niveles de DCC, UNC5A, UNC5B y UNC5D aumentan simultáneamente a los niveles de netrina 1 en las células A549 tratadas con doxorrubicina. Este aumento alcanzaba las 44 veces para el receptor UNC5B. Para monitorizar si esta regulación positiva de netrina 1 y sus receptores está relacionada con una transcripción génica aumentada, se trataron células A549 con doxorrubicina en presencia del inhibidor de ARN polimerasa actinomicina D. Como se muestra en la Fig. 4, la actinomicina D evita completamente la regulación positiva de netrina 1 mediada por doxorrubicina, apoyando por tanto la idea de que los fármacos terapéuticos convencionales desencadenan el aumento de netrina 1 y sus receptores mediante transcripción génica potenciada.

[0092] Para investigar si la regulación positiva de netrina 1 y sus receptores estaba limitada a doxorrubicina o era una respuesta general a agentes quimioterapéuticos, se analizaron los niveles de netrina 1 por RT-PCR cuantitativa en un panel de 15 líneas celulares cancerosas en respuesta a diversos fármacos quimioterapéuticos convencionales, tales como doxorrubicina, 5-fluoruracilo (5FU), paclitaxel (Taxol) y cisplatino. Se efectuó el análisis del nivel de netrina 1 tras tratamiento con 3 concentraciones correspondientes a las CI¹⁰, CI³⁰ o CI⁵⁰ determinadas de cada fármaco para cada línea celular (Fig. 28). En líneas celulares que parecían ser resistentes a fármacos específicos (Fig. 28), se usó una concentración correspondiente a la concentración eficaz máxima (CI^máx) para monitorizar el nivel de netrina 1. Como se muestra en las Fig. 5-8, doxorrubicina y 5FU desencadenan ambos un aumento significativo (es decir, > 2 veces frente al control) de netrina 1 en respectivamente un 60 % y 36 % de las líneas celulares cancerosas. El tratamiento con Taxol y cisplatino estaba asociado a la regulación positiva de netrina 1 en solo un 20 % y 21 % de las líneas celulares, respectivamente. La regulación positiva de netrina 1 tras tratamiento con fármacos quimioterapéuticos no es específica de tipo tumoral, ya que se observó regulación positiva de netrina 1 en al menos una línea celular de cánceres de mama, pulmón, pancreático y de ovario, y también en líneas celulares de neuroblastoma y glioblastoma. No pudo detectarse ninguna correlación entre la regulación positiva de netrina 1 y la quimiorresistencia, ya que se detectaba regulación positiva de netrina 1 tanto en líneas celulares resistentes como sensibles, y ya que algunas líneas celulares resistentes no mostraban regulación positiva de netrina 1 (Fig. 5-8).

[0093] Se investigó también la expresión de receptores de dependencia de netrina 1 en respuesta a estos agentes citotóxicos en las 15 líneas celulares cancerosas (Fig. 5-8). De forma similar a la repuesta de netrina 1, la doxorrubicina parecía tener el mayor efecto, ya que está asociada a la regulación positiva de DCC, UNC5B y UNC5D en, respectivamente, un 87 %, 80 % y 67 % de las líneas celulares cribadas. DCC, que expone una expresión global baja en las líneas celulares cancerosas cribadas, es el receptor de netrina 1 que muestra el más amplio espectro de regulación positiva, ya que la expresión de DCC aumentaba fuertemente en un 36 %, 43 % y 53 % de las líneas celulares en respuesta respectivamente a cisplatino, 5FU y Taxol. Los niveles de los receptores de netrina 1 UNC5A y UNC5C permanecieron en gran medida inalterados por el tratamiento con fármacos citotóxicos en la mayoría de las líneas celulares que se cribaron (Fig. 23-24). En conjunto, estos datos apoyan la idea de que aparece regulación positiva de netrina 1 y sus receptores frecuentemente en respuesta al tratamiento con fármacos convencionales.

[0094] Se analizó finalmente el nivel de netrina 1 y receptores en especímenes de cáncer de ovario de pacientes antes y después de tratamiento con carboplatino/Taxol. Como se muestra en la Fig. 9, el ARNm de netrina 1 estaba regulado positivamente después de quimioterapia. Además, el nivel de DCC, UNC5B y UNC5D estaba también afectado por el tratamiento con carboplatino/Taxol (Fig. 25-27).

2. La interferencia de netrina 1 potencia la muerte celular inducida por fármacos citotóxicos.

[0095] El hecho de que tanto la netrina 1 como sus receptores se regulen positivamente tras tratamiento con fármacos convencionales sugiere que la dependencia de la supervivencia de netrina 1 se amplifica en células cancerosas quimiotratadas. Se analizó por tanto primero la muerte celular inducida por doxorrubicina tras silenciamiento de netrina 1 por una estrategia de ARNip. Se transfectaron entonces células A549 con un ARNip de netrina 1 y se trataron con una concentración creciente de doxorrubicina. El silenciamiento de netrina 1 estaba asociado a una notable potenciación de la muerte celular inducida por doxorrubicina como se muestra por la medida de la pérdida de permeabilidad celular (Fig. 10), supervivencia celular (Fig. 11), exclusión de ^dA^p I (Fig. 12), activación de caspasa (Fig. 13) o fragmentación de ^a Dⁿ (Fig. 14). Para determinar si esta sensibilidad aumentada era debida a la participación proapoptótica de los receptores de dependencia de netrina 1 no unidos, se efectuó un experimento similar en entorno de silenciamiento de UNC5B, el receptor de netrina 1 principal expresado tras tratamiento con doxorrubicina en células A549. Como se muestra en la Fig.15, el silenciamiento de UNC5B está asociado a la inhibición de la potenciación de la muerte celular inducida por el silenciamiento de netrina 1 y el tratamiento con doxorrubicina.

[0096] Se revisó por tanto un posible efecto de potenciación similar usando un modo más terapéuticamente relevante para interferencia de netrina 1. Dos candidatos a fármaco, TRAP-netrinDCC y TRAP-netrinUNC5A, que son ectodominios estabilizados con Fc respectivamente de DCC o UNC5A, han mostrado desencadenar la muerte de células tumorales que expresan netrina 1 in vitro y la inhibición del crecimiento tumoral en modelos de ratón injertados (no mostrados). Como se muestra en las Fig. 16-17, estos dos fármacos candidatos potencian fuertemente la muerte celular inducida por doxorrubicina en células A549. Como netrina 1 y receptores estaban también regulados positivamente tras tratamiento con 5FU y cisplatino (Fig. 5-8), se efectuó una combinación similar de TRAP-netrinUNC A con 5FU y cisplatino. Se observó un efecto potenciador comparable sobre la muerte celular tras cotratamiento con 5FU o cisplatino y TRAP-netrinUNC5A (Fig. 18-19). De forma similar, en la línea celular de cáncer pancreático MiaPacA, donde 5FU y doxorrubicina han mostrado regular positivamente netrina 1 y sus receptores, el cotratamiento con 5FU o doxorrubicina y TRAP-netrinUNC5A potenciaba la muerte celular (Fig. 20-21).

3. La interferencia de netrina 1 potencia el efecto anticanceroso de fármacos citotóxicos en un modelo animal preclínico de cáncer.

[0097] Se valoró entonces si el efecto in vitro observado anteriormente podía traducirse in vivo en una perspectiva terapéutica. Se injertaron células A549 en ratones nude y se trataron animales con tumores palpables dos veces por semana por inyección i.p. de vehículo o TRAP-netrinUNC5A a 20 mg/kg solo o en combinación con 2 mg/kg de doxorrubicina. El tratamiento con agente único, TRAP-netrinUNC5A o doxorrubicina, usado tras estos esquemas de administración y dosis, estaba asociado a un efecto inhibidor del crecimiento tumoral detectable pero débil (Fig. 22). Sin embargo, el cotratamiento de doxorrubicina y TRAP-netrinUNC5A estaba asociado a una inhibición fuerte y prolongada del crecimiento tumoral. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la idea de que combinar el tratamiento basado en interferencia de netrina 1 con una quimioterapia convencional está asociado a un efecto anticanceroso sinérgico.

4. Combinar interferencia de netrina 1 y fármacos citotóxicos es un enfoque terapéutico prometedor.

[0098] Se muestra aquí que las líneas celulares cancerosas regulan positivamente la expresión de netrina 1 en respuesta al tratamiento con fármacos citotóxicos. Los fármacos citotóxicos ensayados aquí, que incluyen doxorrubicina, cisplatino, 5FU y paclitaxel (Taxol) se usan comúnmente en la gestión de pacientes con carcinoma pulmonar no microcítico, cánceres de mama, colorrectal y de ovario tanto en configuración complementaria como avanzada. Además, se ha mostrado, usando un panel de momento limitado de muestras humanas, que los tumores de ovario primarios de pacientes tratados con carboplatino/Taxol exponen un aumento del nivel de netrina 1 en comparación con los mismos tumores antes del tratamiento. Aunque en el cultivo celular esta regulación positiva de netrina 1 difiere en cinética y amplitud dependiendo del fármaco usado y del tipo de célula cancerosa (Fig. 1), el hecho de que estos fármacos son conocidos por afectar a diferentes mecanismos celulares apoya la idea de que la regulación positiva de netrina 1 es más una respuesta de estrés de supervivencia general que una alteración específica de una ruta específica afectada por un fármaco quimioterapéutico específico. Es entonces interesante especular que esta regulación positiva de netrina 1 puede ser un mecanismo de supervivencia empleado por células cancerosas en respuesta a estos fármacos.

[0099] Aunque los mecanismos para esta regulación positiva de netrina 1 continúan sin determinarse, puede tener consecuencias terapéuticas significativas. Es más, los fármacos interferentes de netrina 1 están actualmente en desarrollo preclínico; la combinación de estos compuestos con agentes citotóxicos convencionales puede probarse sinérgica. Se ha mostrado que la expresión de netrina 1 está regulada positivamente en muestras de pacientes de cáncer de mama, ovario, pancreático y pulmonar no microcítico y que interferir con el bucle autocrino/paracrino de netrina 1 desencadena la apoptosis de células cancerosas en varios modelos. Además, los datos presentados aquí sugieren que un subconjunto aún mayor de pacientes puede beneficiarse de los agentes orientados a netrina 1, solos o en combinación con fármacos citotóxicos. Basándose en la observación in vivo en ratones portadores de tumor, la combinación no parece aumentar la toxicidad en comparación con los agentes citotóxicos solos. Los datos preclínicos mostrados aquí apoyan la idea de que combinar fármacos convencionales más interferencia de netrina 1 puede conducir a una eficacia aumentada con concentración reducida de fármacos convencionales. En conjunto, estos datos apoyan el razonamiento de ensayar la terapia de interferencia de netrina 1 en ensayos clínicos tempranos en combinación con quimioterapias convencionales.

5. Ejemplos de cánceres que sobreexpresan netrina 1 y expresan DCC y/ o UNC5A y/ o B y/ o C y/ o D.

[00100] Se da el porcentaje de casos de sobreexpresión de netrina 1 para cada tipo de cánceres para el que se ha cuantificado la expresión de netrina 1 y sus receptores.

- 60 % de los cánceres de mama metastásicos (Fitamant et al., PNAS 2008),

- 47 % de los carcinomas pulmonares no microcíticos (Delloye-Bourgeois et al., JNCI 2009),

- 38 % de los neuroblastomas agresivos (Delloye-Bourgeois et al., J. Exp. Med. 2009),1 % de los adenocarcinomas pancreáticos (Link et al., Annals of Chir. Onco. 2007; Dumartin et al., Gastro 2010),

- 100 % de los melanomas primarios (n=7) y metástasis de melanoma (n=6) (Kaufmann et al., Cellular Oncology 2009),

- 76 % de los cánceres de ovario (Panastasiou et al., Oncotarget 2011),

- 65 % de los glioblastomas,

- > 60 % de las leucemias mieloides agudas y leucemias linfocíticas crónicas

- > 50 % de los linfomas de linfocitos B agresivos,

- 30 % de los sarcomas,

- 40 % de los adenocarcinomas renales,

- 22 % de los cánceres de cabeza y cuello,

cánceres testiculares (36 % de los carcinomas embrionario, 50 % de los teratomas y 100 % de los tumores de saco vitelino)

- 50 % de los cánceres de riñón,

- 26 % de los cánceres de estómago,

- 19 % de los cánceres de útero.

Referencias

1. Serafini, T. et al. 1994. Cell 78: 409-424.

2. Mazelin, L. et al. 2004. Nature 431: 80-84.

3. Mehlen, P. et al. 2011. Nat Rev Cancer 11: 188-197.

4. Mehlen, P. et al. 1998. Nature 395: 801-804.

5. Llambi, F. et al. 2001. Embo J 20: 2715-2722.

6. Tanikawa, C. et al. 2003. Nat Cell Biol 5: 216-223.

7. Bredesen, D.E. et al. 2005. Cell Death Differ 12: 1031-1043.

8. Mehlen, P. y A. Puisieux. 2006. Nat Rev Cancer 6: 449-458.

9. Castets, M. et al. 2012. Nature 482(7386): 534-7

10. Bernet, A. et al. 2007. Gastroenterology 133: 1840-1848.

11. Fearon, E.R., et al. 1990. Science 247: 49-56.

12. Thiebault, K. et al. 2003. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 4173-4178.

13. Shin, S.K., et al. 2007. Gastroenterology 133: 1849-1857.

14. Fitamant, J., et al. 2008. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 4850-4855.

15. Delloye-Bourgeois, C. et al. 2009. J Exp Med 206: 833-847.

16. Delloye-Bourgeois, C. et al. 2009. J Natl Cancer Inst 101: 237-247.

17. Paradisi, A., C. et al. 2009. Proc Natl Acad Sci U S A 106:17146-17151.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un fármaco quimioterapéutico que es capaz de inducir la expresión o sobreexpresión de netrina 1 en células cancerosas y un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo, en un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el fármaco interferente de netrina 1 es un anticuerpo de unión a netrina o un receptor de netrina 1. o un compuesto que comprende un dominio extracelular de un receptor de netrina 1 o un fragmento de dicho dominio extracelular, promoviendo dicho fármaco interferente de netrina 1 la apoptosis inducida por receptores de netrina 1, para uso en el tratamiento de un cáncer que expresa o sobreexpresa netrina 1 en que el cáncer expresa o sobreexpresa netrina 1 como resultado de un tratamiento con dicho fármaco quimioterapéutico.

2. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que el fármaco interferente de netrina 1 es un compuesto que comprende un dominio extracelular de un receptor de netrina 1 DCC, UNC5A, UNC5B, UNC5C o UNC5D o un fragmento de dicho dominio extracelular.

3. La composición para uso según la reivindicación 1 o 2, en la que el fármaco interferente de netrina 1 es una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular de un receptor de netrina 1 o fragmento del mismo y una parte de Fc de anticuerpo.

4. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el fármaco quimioterapéutico es doxorrubicina, 5-fluorouracilo (5FU), paclitaxel o cisplatino.

5. Una composición farmacéutica que comprende un fármaco quimioterapéutico que es capaz de inducir una expresión o sobreexpresión de netrina 1 en células cancerosas, para uso como medicamento anticanceroso para usar en un paciente en combinación con un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo, en la que el fármaco interferente de netrina 1 es un anticuerpo que se une a netrina 1 o a un receptor de netrina 1, o un compuesto que comprende un dominio extracelular de un receptor de netrina 1 o un fragmento de dicho dominio extracelular, promoviendo dicho fármaco interferente de netrina 1 la apoptosis inducida por receptores de netrina 1 o, en un paciente tratado con tal fármaco interferente de netrina 1 o un vector, para uso en el tratamiento de un cáncer que expresa o sobreexpresa netrina 1 en que el cáncer expresa o sobreexpresa netrina 1 como resultado de un tratamiento con dicho fármaco quimioterapéutico.

6. Una composición farmacéutica que comprende un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo, en la que el fármaco interferente de netrina 1 es un anticuerpo que se une a netrina 1 o a un receptor de netrina 1, o un compuesto que comprende un dominio extracelular de un receptor de netrina 1 o un fragmento de dicho dominio extracelular, promoviendo dicho fármaco interferente de netrina 1 la apoptosis inducida por receptores de netrina 1, para uso en un paciente en combinación con un fármaco quimioterapéutico que es capaz de inducir una expresión o sobreexpresión de netrina 1 en células cancerosas o, en un paciente tratado con tal fármaco quimioterapéutico, en el tratamiento de un cáncer que expresa o sobreexpresa netrina 1 en que el cáncer expresa o sobreexpresa netrina 1 como resultado de un tratamiento con dicho fármaco quimioterapéutico.

7. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un fármaco quimioterapéutico y un fármaco interferente de netrina 1 o un vector capaz de expresar un fármaco interferente de netrina 1 in vivo, para una administración simultánea, separada o secuencial a un paciente.

8. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el fármaco quimioterapéutico es capaz de inducir la regulación positiva de un receptor de netrina 1 en células cancerosas.

9. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el fármaco quimioterapéutico es capaz de inducir la regulación positiva de DCC en células cancerosas.

10. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el fármaco quimioterapéutico es capaz de inducir la regulación positiva de UNC5A, UNC5B, UNC5C o UNC5D en células cancerosas.

11. La composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el cáncer se selecciona de cáncer de mama metastásico, carcinoma pulmonar no microcítico, neuroblastoma agresivo, adenocarcinoma pancreático, melanoma primario (n=7), metástasis de melanoma (n=6), cánceres de ovario, glioblastoma, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, linfoma de linfocitos B agresivo, sarcoma, adenocarcinoma renal, cánceres de cabeza y cuello, cánceres testiculares, cánceres de riñón, cánceres de estómago y cánceres de útero.