KR102423086B1 - 새로운 cd47 단일클론 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 인간에서 면역원성이 낮고, 적혈구 세포의 고갈 또는 적혈구 응집을 거의 또는 전혀 유발하지 않는, 새로운 CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편 뿐만 아니라 CD47에 의해 매개되는 질환을 치료하거나 또는 탐식 작용 또는 혈소판 응집을 저해하기 위해 사용될 수 있는 상기한 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

Description

새로운 CD47 단일클론 항체 및 그 용도{NOVEL CD47 MONOCLONAL ANTIBODIES AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2016년 10월 20일자 국제 출원 번호 PCT/CN2016/102720, 2017년 3월 13일자 국제 출원 번호 PCT/CN2017/076462 및 2017년 4월 27일자 국제 출원 번호 PCT/CN2017/000329에 대하여 우선권을 주장하며, 이들 문헌의 내용들 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
CD47 (Cluster of Differentiation 47)은 1980년대에 인간 난소암에서 종양 항원으로서 최초로 동정되었다. 그 이후로, CD47은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 다발성 골수종 (MM), 방광암 및 기타 고형암을 비롯한, 복수의 인간 종양 타입들에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. CD47의 수준이 높으면, 암 세포가 강력한 탐식 촉진 신호인 칼레티쿨린 (calreticulin)을 높은 수준으로 가짐에도 불구하고 탐식 작용을 회피할 수 있다.
CD47은, 인테그린-관련 단백질 (IAP), 난소암 항원 OA3, Rh-관련 항원 및 MER6로도 알려져 있으며, 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하며, 막을 여러 번 관통하는 막관통 수용체 (multi-spanning transmembrane receptor)이다. 이의 발현과 활성은 다수의 질환 및 장애들과 연관되어 있다. 이는 1개의 Ig-유사 도메인과 5개의 막 스패닝 영역들을 가진 광범위하게 발현되는 막관통형 당단백질로서, SIRPα에 대한 세포성 리간드로서 기능하며, 신호-조절성-단백질 알파 (SIRPα)의 NH2-말단 V-유사 도메인을 통해 결합이 매개된다. SIRPα는 대식세포, 과립구, 골수성 수지상 세포 (DC), 비만 세포 및 이들의 전구체, 예를 들어 조혈 줄기 세포를 비롯한, 골수 세포 상에서 주로 발현된다.
대식세포는 탐식 작용을 통해 혈류로부터 병원체와 손상 또는 노화된 세포를 청소한다. 세포-표면 CD47은 대식세포 상의 이의 수용체, 즉 SIRPα와 상호작용하여, 정상적인 건강한 세포의 탐식을 방지한다. SIRPα는 대식세포에 의한 숙주 세포의 탐식을 저해하는데, 숙주 타겟 세포 상에 발현된 CD47이 대식세포 상의 SIRPα에 결합하면 탐식 작용을 억제하게 조절하는 SHP-1에 의해 매개되는 저해 신호가 발생된다.
CD47은, 정상 세포의 탐식 작용을 저해하는 역할과 더불어, 이동기 (migratory phase) 직전과 이동기 중에 조혈 줄기 세포 (HSC) 및 선조세포 상에서 일시적으로 상향-조절되며, 이들 세포 상의 CD47의 수준이 이들의 생체내 생착 가능성을 결정한다는 증거가 있다.
또한, CD47은 골수성 백혈병 등의 다양한 암들에서 구성적으로 상향 조절된다. 골수성 백혈병 세포주 상에 CD47의 과다 발현은 탐식 작용을 회피할 수 있게 함으로써 이의 병원성을 증가시킨다. CD47의 상향-조절은 염증-매개 동원 과정 중에 정상적인 HSC에 대한 보호를 제공하기 위한 중요한 기전인데, 백혈구 선조세포가 대식세포의 사멸을 회피하기 위해 이러한 능력을 동원하는 것으로 보인다.
특정 CD47 항체는 탐식 작용을 회복시켜 죽상동맥경화증을 방지하는 것으로 입증된 바 있다. 예를 들어, Kojima et al., Nature, Vol. 36, 86-90 (Aug. 4, 2016)을 참조한다. 본 발명은, 인간에서 면역원성이 낮고, 적혈구 세포의 고갈을 거의 또는 전혀 유발하지 않는, 새로운 CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 제공한다. 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 이러한 항체는 "anti-CD47 항체"와 상호 호환적으로 지칭될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 인간 CD47에 결합하는 단리된 단일클론 항체 및 이의 면역학적 활성 단편을 제공한다. 간략하게는, 이들 CD47-결합성의 단리된 단일클론 항체 및 이의 면역학적 활성 단편은 본원에서 이하 "CD47 항체"로서 지칭된다. 본 발명의 CD47 항체는 CD47의 발현, 활성 및/또는 신호전달, 또는 CD47과 SIRPα 간의 상호작용을 조절, 예를 들어, 차단, 저해, 저하, 길항, 중화 또는 간섭할 수 있다. 더욱 유의하게는, 본 발명의 CD47 항체는 일반적으로 인간 적혈구 세포의 고갈 또는 적혈구 응집반응을 유의한 수준으로 유발하지 않으며, 놀랍게도 다수 사례들에서 인간 적혈구 세포의 어떠한 고갈이나 또는 적혈구 응집반응을 전혀 유발하지 않는다. 또한, 본 발명의 CD47 항체는 강력한 항-종양 활성을 발휘하였다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CD47 항체는 각각 (a) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 및 서열번호 77로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 (예, 95% 이상) 동일한, 가변적인 중쇄 (VH) 서열; 및 (b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 및 서열번호 78로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 (예, 95% 이상) 동일한, 가변적인 경쇄 (VL) 서열을 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명의 CD47 항체는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2 (즉, 1A1), 서열번호 3 및 서열번호 4 (즉, 1F8), 서열번호 5 및 서열번호 6 (즉, 2A11), 서열번호 7 및 서열번호 8 (즉, 2C2), 서열번호 9 및 서열번호 10 (즉, 2D7), 서열번호 11 및 서열번호 12 (즉, 2G4), 서열번호 13 및 서열번호 14 (즉, 2G11), 서열번호 15 및 서열번호 16 (즉, 6F4), 서열번호 17 및 서열번호 18 (즉, 5H1), 서열번호 19 및 서열번호 20 (즉, 5F6), 서열번호 21 및 서열번호 22 (즉, 1F3), 서열번호 23 및 서열번호 24 (즉, 2A4), 서열번호 25 및 서열번호 26 (즉, 2B12), 서열번호 27 및 서열번호 28 (즉, 13A11), 서열번호 29 및 서열번호 30 (즉, 15E1), 서열번호 31 및 서열번호 32 (즉, 13H3), 서열번호 33 및 서열번호 34 (즉, 14A8), 서열번호 35 및 서열번호 36 (즉, 16H3), 서열번호 37 및 서열번호 38 (즉, 1A1), 서열번호 39 및 서열번호 40 (즉, 1A1-A), 서열번호 41 및 서열번호 42 (즉, 1A1-Q), 서열번호 43 및 서열번호 44 (즉, 1A2), 서열번호 45 및 서열번호 46 (즉, 1A8), 서열번호 47 및 서열번호 48 (즉, 1B1), 서열번호 49 및 서열번호 50 (즉, 1B2), 서열번호 51 및 서열번호 52 (즉, 1H3), 서열번호 53 및 서열번호 54 (즉, 1H3-Q), 서열번호 55 및 서열번호 56 (즉, 1H3-A), 서열번호 57 및 서열번호 58 (즉, 2A2), 서열번호 59 및 서열번호 60 (즉, 2A3), 서열번호 61 및 서열번호 62 (즉, 2A6), 서열번호 63 및 서열번호 64 (즉, 2A10), 서열번호 65 및 서열번호 66 (즉, 2B1), 서열번호 67 및 서열번호 68 (즉, 2C6), 서열번호 69 및 서열번호 70 (즉, 2E7), 서열번호 71 및 서열번호 72 (즉, 2E9), 서열번호 73 및 서열번호 74 (즉, 2F1), 서열번호 75 및 서열번호 76 (즉, 2F3), 및 서열번호 77 및 서열번호 78 (즉, 34C5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 한쌍의 VH 및 VL 아미노산 서열과 90% 이상 (예, 적어도 95%, 95%, 96, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%) 동일한, VH/VL 쌍의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본 발명의 CD47 항체는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2 (즉, 1A1), 서열번호 3 및 서열번호 4 (즉, 1F8), 서열번호 5 및 서열번호 6 (즉, 2A11), 서열번호 7 및 서열번호 8 (즉, 2C2), 서열번호 9 및 서열번호 10 (즉, 2D7), 서열번호 11 및 서열번호 12 (즉, 2G4), 서열번호 13 및 서열번호 14 (즉, 2G11), 서열번호 15 및 서열번호 16 (즉, 6F4), 서열번호 17 및 서열번호 18 (즉, 5H1), 서열번호 19 및 서열번호 20 (즉, 5F6), 서열번호 21 및 서열번호 22 (즉, 1F3), 서열번호 23 및 서열번호 24 (즉, 2A4), 서열번호 25 및 서열번호 26 (즉, 2B12), 서열번호 27 및 서열번호 28 (즉, 13A11), 서열번호 29 및 서열번호 30 (즉, 15E1), 서열번호 31 및 서열번호 32 (즉, 13H3), 서열번호 33 및 서열번호 34 (즉, 14A8), 서열번호 35 및 서열번호 36 (즉, 16H3), 서열번호 37 및 서열번호 38 (즉, 1A1), 서열번호 39 및 서열번호 40 (즉, 1A1-A), 서열번호 41 및 서열번호 42 (즉, 1A1-Q), 서열번호 43 및 서열번호 44 (즉, 1A2), 서열번호 45 및 서열번호 46 (즉, 1A8), 서열번호 47 및 서열번호 48 (즉, 1B1), 서열번호 49 및 서열번호 50 (즉, 1B2), 서열번호 51 및 서열번호 52 (즉, 1H3), 서열번호 53 및 서열번호 54 (즉, 1H3-Q), 서열번호 55 및 서열번호 56 (즉, 1H3-A), 서열번호 57 및 서열번호 58 (즉, 2A2), 서열번호 59 및 서열번호 60 (즉, 2A3), 서열번호 61 및 서열번호 62 (즉, 2A6), 서열번호 63 및 서열번호 64 (즉, 2A10), 서열번호 65 및 서열번호 66 (즉, 2B1), 서열번호 67 및 서열번호 68 (즉, 2C6), 서열번호 69 및 서열번호 70 (즉, 2E7), 서열번호 71 및 서열번호 72 (즉, 2E9), 서열번호 73 및 서열번호 74 (즉, 2F1), 서열번호 75 및 서열번호 76 (즉, 2F3), 및 서열번호 77 및 서열번호 78 (즉, 34C5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 한쌍의 VH 및 VL 체인 서열을 포함한다.
본 발명의 CD47 항체는 키메라 또는 인간화된 형태일 수 있다. 이들 항체는 SIRPα와의 상호작용으로부터 인간 CD47을 방지하거나 또는 현저하게 저하시키거나, 또는 CD47-발현 세포의 대식세포-매개 탐식 작용을 촉진할 수 있다.
본 발명의 CD47 항체는 적혈구 세포의 유의한 또는 인지가능한 수준의 적혈구 응집반응 또는 고갈을 유발하지 않으며, 다수의 사례들에서 적혈구 세포의 적혈구 응집반응 또는 고갈을 전혀 유발하지 않는다.
다른 측면에서, 본 발명은 단리된 2중 특이성 단일클론 항체를 제공한다. 이러한 단리된 2중 특이적인 단일클론 항체들은 각각 제1 영역 및 제2 영역을 포함하며, 제1 영역은 인간 CD47에 결합하는 전술한 바와 같은 제1 단일클론 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 포함하며, 제2 영역은 인간 CD47에 결합하지 않는 제2 단일클론 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 2중 특이성 단일클론 항체에서 제2 영역은 암 세포에 결합한다.
일부 다른 구현예에서, 상기한 2중 특이성 단일클론 항체는 인간 CD47과 인간 SIRPα 간의 상호작용을 저해한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CD47 항체들 중 하나 또는 본 발명의 단리된 2중 특이성 단일클론 항체, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 각각 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제"는 일반적으로 안전하고, 무독성이며, 생물학적으로도 부적절하지 않은, 약학적 조성물 또는 제형을 제조하는데 유용한, 담체 또는 부형제를 지칭한다. 사용되는 담체 또는 부형제는 전형적으로 인간 개체 또는 기타 포유류에 투여하기에 적합한 것이다. 조성물 제조시, 활성 성분은 일반적으로 담체 또는 부형제와 혼합되거나, 이에 의해 희석되거나 또는 이에 의해 봉입된다. 담체 또는 부형제가 희석제로서 사용되는 경우, 이는 고체, 반-고체 또는 액체 물질이며, 이는 항체의 활성 성분에 대한 비히클, 담체 또는 매질로서 작용한다.
또한, 치료가 필요한 인간 개체에서 질환을 치료하는 방법은 본 발명의 범위에 포함되며, 이 방법은 본 발명의 CD47 항체, 본 발명의 2중 특이성 단일틀론 항체 또는 본 발명의 약학적 조성물을 치료학적인 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 질환은 암, 섬유성 질환 또는 탐식 작용의 저해와 관련된 임의 질환이다. 일부 경우에, 암은 난소암, 대장암, 유방암, 폐암, 두경부암, 방광암, 결장직장 암, 췌장암, 비-호지킨 림프종, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모상세포 백혈병 (HCL), T-세포 전림프성 백혈병 (T-PLL), 거대 과립 림프성 백혈병, 성체 T-세포 백혈병, 다발성 골수종, 흑색종, 평활근종, 평활근육종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 단핵 백혈병, B-세포 유래 백혈병, T-세포 유래 백혈병, B-세포 유래 림프종, T-세포 유래 림프종, 자궁내막암, 신장암, 흑색종, 전립선암, 갑상선암, 자궁경부암, 위암, 간암 및 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며; 섬유성 질환은 심근경색, 협심증, 골관절염, 폐 섬유증, 천식, 낭포성 섬유증, 기관지염 및 천식으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 고형 종양의 예로는, 예를 들어, 자궁내막암, 갑상선암, 자궁경부암, 위암, 유방 종양, 난소 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 전립선 종양, 흑색종 종양, 결장직장 종양, 폐 종양, 두경부 종양, 방광 종양, 식도 종양, 간 종양 및 신장 종양, 및 신경모세포성 CNS 종양 등이 있다. 탐식 작용의 저해와 관련있는 질환은 심혈관 질환 (예, 죽상동맥경화증, 뇌졸증, 고혈압 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근증, 심장 부정맥, 선천성 심장 질환, 심장 판막 질환, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질환 또는 정맥 혈전증)일 수 있다.
본원에서, 용어 "유효량"은, 개체에 투여되었을 때, 본원에 기술된 바와 같이, CD47 의존적인 신호전달과 관련있는 질환의 치료, 예후 예측 또는 진단을 달성하는데 충분한 또는 필요한 CD47 항체의 양을 의미한다. 본원에 제공된 항체의, 단독 또는 조합 사용시, 치료학적인 유효량은, 항체의 상대적인 활성 (예, CD47을 발현하는 암 세포의 대식세포 매개성 탐식 작용을 촉진하는)에 따라, 그리고 치료 중인 개체와 질병 증상, 개체의 체중과 나이, 질병 증상의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이며, 이는 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 결정할 수 있다.
본원에서, 본 발명의 CD47 항체 앞에 오는 용어 "단리된"은, 항체에 다른 세포성 물질이 실질적으로 없다는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 단리된 항체에는 동일 종으로부터 유래된 다른 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, 단리된 항체는 다른 종으로부터 유래된 세포에 의해 발현되며, 다른 종으로부터 유래된 다른 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다. 단백질은, 당해 기술 분야에 잘 알려진 단백질 정제 기술을 이용한 단리에 의해, 천연적으로 조합된 물질들 (또는 항체를 생산하기 위해 사용된 세포 발현 시스템과 관련된 물질)이 실질적으로 없게 될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 단리된다.
본 발명의 범위에 또한 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열을 각각 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 제1 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 또는 서열번호 77이거나, 또는 이와 90% 이상 (예, 95% 이상) 동일한 아미노산 서열이고; 제2 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 또는 서열번호 78, 또는 이와 90% 이상 (예, 95% 이상) 동일한 아미노산 서열이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열의 조합을 포함하며, 이들 2개의 아미노산 서열의 조합은 서열번호 1 및 서열번호 2 (즉, 1A1), 서열번호 3 및 서열번호 4 (즉, 1F8), 서열번호 5 및 서열번호 6 (즉, 2A11), 서열번호 7 및 서열번호 8 (즉, 2C2), 서열번호 9 및 서열번호 10 (즉, 2D7), 서열번호 11 및 서열번호 12 (즉, 2G4), 서열번호 13 및 서열번호 14 (즉, 2G11), 서열번호 15 및 서열번호 16 (즉, 6F4), 서열번호 17 및 서열번호 18 (즉, 5H1), 서열번호 19 및 서열번호 20 (즉, 5F6), 서열번호 21 및 서열번호 22 (즉, 1F3), 서열번호 23 및 서열번호 24 (즉, 2A4), 서열번호 25 및 서열번호 26 (즉, 2B12), 서열번호 27 및 서열번호 28 (즉, 13A11), 서열번호 29 및 서열번호 30 (즉, 15E1), 서열번호 31 및 서열번호 32 (즉, 13H3), 서열번호 33 및 서열번호 34 (즉, 14A8), 서열번호 35 및 서열번호 36 (즉, 16H3), 서열번호 37 및 서열번호 38 (즉, 1A1), 서열번호 39 및 서열번호 40 (즉, 1A1-A), 서열번호 41 및 서열번호 42 (즉, 1A1-Q), 서열번호 43 및 서열번호 44 (즉, 1A2), 서열번호 45 및 서열번호 46 (즉, 1A8), 서열번호 47 및 서열번호 48 (즉, 1B1), 서열번호 49 및 서열번호 50 (즉, 1B2), 서열번호 51 및 서열번호 52 (즉, 1H3), 서열번호 53 및 서열번호 54 (즉, 1H3-Q), 서열번호 55 및 서열번호 56 (즉, 1H3-A), 서열번호 57 및 서열번호 58 (즉, 2A2), 서열번호 59 및 서열번호 60 (즉, 2A3), 서열번호 61 및 서열번호 62 (즉, 2A6), 서열번호 63 및 서열번호 64 (즉, 2A10), 서열번호 65 및 서열번호 66 (즉, 2B1), 서열번호 67 및 서열번호 68 (즉, 2C6), 서열번호 69 및 서열번호 70 (즉, 2E7), 서열번호 71 및 서열번호 72 (즉, 2E9), 서열번호 73 및 서열번호 74 (즉, 2F1), 서열번호 75 및 서열번호 76 (즉, 2F3), 서열번호 77 및 서열번호 78 (즉, 34C5), 또는 이들 제1 및 제2 아미노산 서열 각각과 적어도 90% (예, 적어도 95%) 이상 동일한 조합이다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열의 조합을 포함하며, 이들 아미노산 서열 2종의 조합은 서열번호 1 및 서열번호 2 (즉, 1A1), 서열번호 3 및 서열번호 4 (즉, 1F8), 서열번호 5 및 서열번호 6 (즉, 2A11), 서열번호 7 및 서열번호 8 (즉, 2C2), 서열번호 9 및 서열번호 10 (즉, 2D7), 서열번호 11 및 서열번호 12 (즉, 2G4), 서열번호 13 및 서열번호 14 (즉, 2G11), 서열번호 15 및 서열번호 16 (즉, 6F4), 서열번호 17 및 서열번호 18 (즉, 5H1), 서열번호 19 및 서열번호 20 (즉, 5F6), 서열번호 21 및 서열번호 22 (즉, 1F3), 서열번호 23 및 서열번호 24 (즉, 2A4), 서열번호 25 및 서열번호 26 (즉, 2B12), 서열번호 27 및 서열번호 28 (즉, 13A11), 서열번호 29 및 서열번호 30 (즉, 15E1), 서열번호 31 및 서열번호 32 (즉, 13H3), 서열번호 33 및 서열번호 34 (즉, 14A8), 서열번호 35 및 서열번호 36 (즉, 16H3), 서열번호 37 및 서열번호 38 (즉, 1A1), 서열번호 39 및 서열번호 40 (즉, 1A1-A), 서열번호 41 및 서열번호 42 (즉, 1A1-Q), 서열번호 43 및 서열번호 44 (즉, 1A2), 서열번호 45 및 서열번호 46 (즉, 1A8), 서열번호 47 및 서열번호 48 (즉, 1B1), 서열번호 49 및 서열번호 50 (즉, 1B2), 서열번호 51 및 서열번호 52 (즉, 1H3), 서열번호 53 및 서열번호 54 (즉, 1H3-Q), 서열번호 55 및 서열번호 56 (즉, 1H3-A), 서열번호 57 및 서열번호 58 (즉, 2A2), 서열번호 59 및 서열번호 60 (즉, 2A3), 서열번호 61 및 서열번호 62 (즉, 2A6), 서열번호 63 및 서열번호 64 (즉, 2A10), 서열번호 65 및 서열번호 66 (즉, 2B1), 서열번호 67 및 서열번호 68 (즉, 2C6), 서열번호 69 및 서열번호 70 (즉, 2E7), 서열번호 71 및 서열번호 72 (즉, 2E9), 서열번호 73 및 서열번호 74 (즉, 2F1), 서열번호 75 및 서열번호 76 (즉, 2F3), 또는 서열번호 77 및 서열번호 78 (즉, 34C5)이다.
일부 또 다른 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 제1 및 제2 아미노산 서열 외에도 부가적인 단백질을 더 포함할 수 있다. 부가적인 단백질은 항체 또는 사이토카인이다.
일부 또 다른 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 소분자 치료제 (예, 항암제 또는 항염증제) 또는 마커 (예, 바이오마커 또는 형광 마커)와 접합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 입체형태적으로(conformationally)으로 CD47의 TNMEAQ 루프 (잔기 26-31), T34, E35, L74 및 LTR 힌지 (잔기 101-103)를 함유한 재조합 단백질을 포함하는 CD47 유전자에 의해 코딩되는 면역우성 (immunodominant) 에피토프를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD47의 TNMEAQ 루프 (잔기 26-31), T34, E35, L74, 및 LTR 힌지 (잔기 101-103)를 포함하는 아미노산 서열을 가진 입체 (conformational) 에피토프에 특이적으로 결합하는 생물 분자를 제공하며, 이 항체는 CD47에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에서, 용어 "생물 분자"는 합성 항체 (단일클론 또는 2중 특이성), 펩타이드 및 생물모방 분자 (biomimetic molecule)를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "생물모방 분자"는 단백질 또는 뉴클레오티드와 같은 천연적인 거대 화합물과 비슷하거나 또는 유사한 구조 또는 특성을 가지도록 설계 또는 개발되며, 예를 들어 적어도 3,000, 적어도 5,000 또는 적어도 10,000의 분자량을 가지는, 분자를 지칭한다.
본원에 인용된 모든 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
도 1은 모노머 CD47-ECD에 대한 CD47 항체 결합의 용량-의존적인 반응을 도시한 것이다.
도 2a 및 도 2b는 다이머 CD47-ECD에 대한 CD47 항체 결합의 용량-의존적인 반응을 도시한 것이다.
도 3a, 도 3b 및 도 3c는 SIRPα에 대한 CD47의 결합을 차단하는 CD47 항체의 용량-의존적인 반응을 도시한 것이다.
도 4a 및 도 4b는 CD47+ Raji 세포에 대한 용량-의존적인 CD47 항체의 결합 반응을 도시한 것이고; 도 4c, 도 4d 및 도 4e는 Biocore 분석으로 측정시 CD47 항체의 결합 카이네틱스 및 데이타를 도시한 것이다.
도 5a 및 도 5b는 CD47 항체를 이용한 인간 MΦ에 의한 종양 세포에 대한 탐식 작용을 도시한 것이다.
도 6a-6c는 CD47 항체에 의해 촉발된 다양한 인간 혈액 암 세포주의 대식세포-매개 탐식 작용을 도시한 것이다.
도 7a 및 7b는 CD47 항체를 이용한 RBC 응집반응에서 적혈구 세포 (RBC)-보존 특성을 도시한 것이다.
도 8a, 8b, 8c 및 8d는 여러가지 고 농도에서 CD 항체에 의한 RBC 결합 활성 및 RBC 응집반응을 유도하는 활성을 도시한 것이다.
도 9a, 9b, 9c 및 9d는 CD47 항체의 RBC-결합 활성을 도시한 것이다.
도 10은 CD47 항체에 의해 유도되는 복수의 인간 혈액 샘플들에서의 적혈구 세포의 응집반응 결과를 도시한 것이다.
도 11은 CD61을 혈소판에 대한 표면 마커로서 염색한, CD47 항체 및 SIRPα-Ig 융합체의 인간 혈소판 결합 활성을 도시한 것이다.
도 12는 CD47 항체 및 SIRPα-Ig 융합체에 의해 유도된 시험관내 cyno 적혈구 세포의 응집반응 테스트 결과를 도시한 것이다.
도 13은 CD47 항체 및 대조군에 의한 탐식 작용 및 AML 세포 결합성에 대한 테스트 결과를 도시한 것이다.
도 14a 및 도 14b는 루시퍼라제-Raji 이종이식 마우스에서의 CD47 항체 및 대조군을 이용한 치료 효과를 도시한 것이다.
도 15는 종양-보유 마우스에서 CD47 항체 및 대조군에 의해 유도되는 대식세포의 분극화 (polarization)를 도시한 것이다.
도 16은 다양한 인간 암 타입들의 PDX 샘플을 이용한 CD47 발현 프로파일을 도시한 것이다.
도 17은 시노몰구스 원숭이에서 안전성 약학 실험 (혈액) 결과를 도시한 것이다.
도 18은 5F9/CD47 복합체 및 1F8/CD47 복합체의 에피토프 및 구조 차이에 따른, 항체 1F8과 5F9, 항체 1F8과 2A1 간의 CD47에 대한 결합 경쟁을 도시한 것이다.
도 19a, 19b, 19c, 19d, 19e, 19f, 19g 및 19h는 RBC 집단 (congregation), 헤모글로빈, 혈소판 및 림프구 각각에서의 CD47 항체 13H3의 효과를 도시한 것이다.
도 20은 재조합 CD47-ECD에 대한 34C5의 강력한 결합 친화성을 도시한 것이다.
도 21은 CD47-보유한 Raji 세포에 대한 34C5의 강력한 결합 친화성을 도시한 것이다.
도 22는 34C5가 SIRPα에 대한 CD47 결합을 효과적으로 차단할 수 있음을 도시한 것으로, EC50은 0.30 nM이다.
도 23은 항체 34C5가 인간 MΦ에 의한 종양 세포의 탐식 작용을 촉발함을 도시한 것이다.
도 24는 항체 34C5가 시험관내에서 RBC 응집 반응을 유발하지 않음을 도시한 것이다.
도 25는 항체 34C5가 농도 감소에 따라 RBC에 대한 결합성이 감소됨을 도시한 것이다.
도 26은 본 발명의 일부 CD47 항체의 아미노산 서열 및 이의 해당 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 27은 CD47 면역글로불린-유사 도메인 (Ig-V) 19-141의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
본 발명은 인간 CD47이 SIRPα와의 상호작용을 방지하거나 또는 CD47-발현 세포의 대식세포-매개 탐식 작용을 촉매할 수 있는, 새로운 단리된 단일클론 CD47 항체를 제공한다. 이들 CD47 항체는 적혈구 세포의 유의한 또는 인지가능한 수준의 적혈구 응집 또는 고갈을 유발하지 않으며, 다수 경우에 적혈구 세포의 응집 또는 고갈을 전혀 유발하지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 CD47 항체는 (a) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% (예, 적어도 95%) 동일한 가변성 중쇄 (VH) 서열; 및 (b) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 및 서열번호 78로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% (예, 적어도 95%) 동일한 가변성 중쇄 (VL) 서열을 포함할 것이다. 일부 추가적인 예에서, 본 발명의 CD47 항체는 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36, 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56, 서열번호 57 및 서열번호 58, 서열번호 59 및 서열번호 60, 서열번호 61 및 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64, 서열번호 65 및 서열번호 66, 서열번호 67 및 서열번호 68, 서열번호 69 및 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72, 서열번호 73 및 서열번호 74, 서열번호 75 및 서열번호 76, 및 서열번호 77 및 서열번호 78로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% (예, 적어도 95%) 동일한, 조합된 VH/VL 서열을 포함할 것이다.
본원에서, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체 (전장 단일클론 항체 포함), 다클론 항체, 다중 특이성 항체 (예, 2중 특이성 항체) 및 항체 단편을 포괄한다. "항체" (또는 "Ab") 및 "면역글로불린" (또는 "Ig")는 동일한 구조 특징을 가진 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 결합 특이성을 나타내지만, 면역글로불린은 항체 및 항원 특이성이 결핍된 그외 항체-유사 분자를 둘다 포함한다. 이들 유형의 폴리펩타이드는, 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 수준으로, 그리고 골수종에 의해 증가된 수준으로 제조된다.
본원에서, 용어 "에피토프"는 항체의 파라토프 (paratope)가 결합하는 항원 상의 임의의 항원 결정기를 의미한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 기 그룹들로 구성되며, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특징 뿐만 아니라 특이적인 하전 특징을 가진다.
본원에서, 용어 "천연 (native) 항체 및 면역글로불린"은 일반적으로 동일한 경쇄(L) 2개와 동일한 중쇄(H) 2개로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당 단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 이황화 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되며 ("VH/VL 쌍"으로도 지칭됨), 여러가지 면역글로불린 이소형의 중쇄들 간에 이황화 결합의 수는 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄에는 또한 체인내 이황화 결합이 일정하게 배치된다. 각 중쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인 (VH)을 가지며, 그 뒤로 수개의 불변 도메인이 배치된다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인 (VL)을, 다른 쪽 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 나란히 정렬되고, 경쇄 가변성 도메인은 중쇄의 가변성 도메인과 나란히 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄- 및 중쇄 가변성 도메인 간에 인터페이스를 형성하는 것으로 보인다. 예를 들어, Clothia et al., J. Mol . Biol ., 186:651 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:4592 (1985)를 참조한다.
본원에서, 용어 "가변성"은, 가변성 도메인의 특정 부위가 항체들에서 서열상 매우 다르고, 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합성 및 특이성에 관여한다는 것을 의미한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변성 도메인 전체에 균등하게 분포되는 것은 아니다. 경쇄 및 중쇄 가변성 도메인들에서 상보성-결정부 (CDR) 또는 과가변부로 지칭되는 3개의 영역에 집중되어 있다. 가변성 도메인의 보다 고도로 보존된 영역은 프래임워크 (FR)로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변성 도메인은 FR 영역 4개를 포함하여, 대체적으로 루프 연결을 형성하는 CDR 3개에 의해 연결된 베타-시트 구조를 취하며, 일부 경우에는, 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 체인내 CDR은 FR 영역과 매우 근접하게 유지되며, 다른 체인에서 유래된 CDR과 함께 항체의 항원-결합부 형성에 관여한다. 예를 들어, Kabat et al., Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)를 참조한다. 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접 참여하지는 않지만, 항체-의존적인 세포 독성으로 항체의 참여와 같은 다양한 작동자 기능을 발휘한다. 대상 가변부 서열은 CD47 항체에 대해 제시된 인간화된 가변부 서열을 포함한다. 예를 들어, 1A1은 서열번호 1 (중쇄) 및 서열번호 2 (경쇄)를 포함하고, 1F8은 서열번호 3 (중쇄) 및 서열번호 4 (경쇄)를 포함하며, 2A11은 서열번호 5 (중쇄) 및 서열번호 6 (경쇄)을 포함한다.
항체를 파파인으로 분해하면, 각각 단일한 항원-결합부를 가진 "Fab" 단편으로 지칭되는 2개의 동일한 항원 결합 단편과, 쉽게 결정화되는 결정화성이 이름에 반영된 "Fc" 단편이 제조된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원-조합부를 가진 F(ab')2 단편이 제조되며, 이것은 여전히 항원 가교력을 유지한다. "Fv"는 완전한 항원-인지 및 결합부를 포함하는 최소 항체 단편이다. 2쇄 Fv 단편에서, 이 영역은 하나의 중쇄 가변성 도메인과 하나의 경쇄 가변성 도메인이 강력한 비-공유적 조합을 통해 형성된 다이머를 구성된다. 단쇄 Fv 단편 (scFv)는 하나의 중쇄 가변성 도메인과 하나의 경쇄 가변성 도메인이 유연한 펩타이드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있어, 경쇄 및 중쇄는 2쇄 Fv 단편과 유사한 "다이머" 구조로 조합될 수 있다. 이러한 구조에서 각 가변성 도메인의 CDR 3개는 상호작용하여 VH-VL 다이머의 표면 상에 항원-결합부를 구성한다. 총괄하여, 6개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일한 가변성 도메인 (또는 항원에 특이적인 CDR 3개만 포함하는 Fv의 절반)도 완전한 결합 부위에 비해 친화성은 낮지만 항원을 인지 및 결합하는 능력을 가진다. 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다.
또한, Fab는 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지부에서 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하여 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 차이를 가진다. Fab'-SH는, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 가지고 있는, Fab'로 본원에서 지칭된다. F(ab')2 항체 단편은 본래 둘 사이에 힌지 시스테인을 가진 Fab' 단편 쌍으로서 제조된다. 항체 단편의 또 다른 화학적 커플링들도 공지되어 있다.
면역글로불린에는 주요 클래스 5종, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 여러 클래스에 해당되는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 여러가지 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형태들이 잘 알려져 있다.
본원에서, 용어 "항체 단편" 및 이의 문법상 변형 형태들 모두 무손상 항체의 가변부 또는 항원 결합 부위를 포함하는 무손상 항체의 일부로서 정의되며, 상기한 일부는 무손상 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인 (즉, 항체 이소형에 따라 즉 CH2, CH3 및 CH4)을 포함하지 않는다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 및 Fv 단편들; 다이아바디; 연속적인 아미노산 잔기들로 된 불연속 서열 (uninterrupted sequence)로 구성된 일차 구조를 가진 폴리펩타이드인 임의의 항체 단편 (본원에서 "단쇄 항체 단편" 또는 "단쇄 폴리펩타이드"로 지칭됨), 예를 들어, 비제한적으로, (1) 단쇄 Fv (scFv) 분자, (2) 조합된 중쇄 모이어티 없이, 경쇄 가변성 도메인 하나만 또는 경쇄 가변성 도메인의 CDR 3개를 포함하는 이의 단편만 포함하는 단쇄 폴리펩타이드, 및 (3) 조합된 경쇄 모이어티 없이, 중쇄 가변성 도메인 하나만 또는 중쇄 가변성 도메인의 CDR 3개를 포함하는 이의 단편만 포함하는 단쇄 폴리펩타이드; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이성 또는 다가 구조 등이 있다. 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체 단편의 경우, 중쇄(들)는 무손상의 비-Fc 영역에서 발견되는 임의의 불변 도메인 서열 (예, IgG 이소형에서 CH1)을 포함할 수 있거나, 및/또는 무손상 항체에서 발견되는 임의의 힌지부 서열을 포함할 수 있거나, 및/또는 중쇄(들)의 힌지부 서열 또는 불변 도메인 서열에 융합되거나 또는 위치된 루신 지퍼 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로 상충하게 언급되지 않은 한, 용어 "접합체"는 본원에서 하나 이상의 폴리머 분자)들에 하나 이상의 항체 단편(들)이 공유 결합함으로써 형성된 이종의 분자 (heterogeneous molecule)로서 정의되며, 이종의 분자는 혈액과 같은 생리 체액에서 수용성, 즉 가용성이며, 이종의 분자에는 임의의 구조화된 응집체 (structured aggregate)가 존재하지 않는다. 대상 접합체는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)이다. 상기한 정의에서, 용어 "구조화된 응집체"는 (1) 이종의 분자가 마이셀 또는 기타 에멀젼 구조로 존재하지 않고, 지질 이중층, 소낭 또는 리포좀에 고정되지 않도록, 구형 또는 구형 셀 구조를 가진 수용액 중의 임의의 분자 응집체; 및 (2) 수상과의 접촉시 이종의 분자가 용액으로 방출되지 않도록, 크로마토그래피 비드 매트릭스와 같은 고체 또는 불용성 형태의 임의의 분자 응집체를 지칭한다. 이에, 용어 "접합체"는 본원에 정의된 바와 같이 석출, 침전, 생물부식성 매트릭스 또는 고체의 수화시 이종 분자를 수용액으로 방출할 수 있는 기타 고체내 전술한 이종 분자를 포괄한다.
본원에서, 용어 "단일클론 항체" (mAb)는 실질적으로 동질한 (homogeneous) 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 즉 이들 집단을 구성하는 개개 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 천연적인 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 고 특이적이며, 단일한 항원부위에 대해 인가된다. 각 mAb는 항원 상의 단일한 결정기에 대해 인가된다. 단일클론 항체는, 이의 특이성 외에도, 다른 면역글로불린으로 오염되지 않은, 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있다는 점에서, 유익하다. 수식어 "단일클론"은 항체의 실질적으로 동질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 지칭하며, 항체를 어떤 특정한 방법으로 제조하여야 하는 것으로 해석되진 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 불멸화된 B 세포 또는 이의 하이브리도마에서 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DAN 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원의 단일클론 항체는, 종 또는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스 명과 무관하게, 불변 도메인을 가진 CD47 항체 (예, "인간화된" 항체), 또는 중쇄를 가진 경쇄, 또는 다른 종 유래의 쇄를 가진 한 종 유래의 하나의 쇄, 또는 이종의 단백질과의 융합체의 가변성 (과가변 포함) 도메인을 스플라이싱함으로써 제조되는 하이브리드 및 재조합 항체 뿐만 아니라 항체 단편 (예, Fab, F(ab')2 및 Fv)이 원하는 생물학적 활성을 발휘하는 한 이들을 포함한다.
본원에서 단일클론 항체는, 특히, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체내 해당 서열과 동일 또는 상동적이면서, 쇄(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체내 대응되는 서열과 동일 또는 상동적인, "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라, 원하는 생물학적 활성을 발휘하는 한에서는 항체의 단편을 포함한다.
본원에서, "단리된" 항체는 천연 환경의 구성 성분들로부터 동정 및 분리 및/또는 회수된 것을 의미한다. 천연 환경의 오염 물질들은 항체의 진단 또는 치료학적 용도를 방해할 물질이며, 이러는 것으로는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 (1) 라우리 방법에 의해 결정되는 바와 같이 항체의 75 중량 % 이상으로, 가장 바람직하게는 80%, 90% 또는 99 중량% 이상으로, 또는 (2) 코마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용한 환원 또는 비-환원 조건 하의 SDS-PAGE에 따르면 균질하게 정제될 것이다. 단리된 항체는, 항체의 천연적인 환경의 하나 이상의 구성 성분이 존재하기 때문에, 재조합 세포내에 인 시추로 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서, 용어 "에피토프 테깅된"은 "에피토프 테그"에 CD47 항체가 융합되는 것을 지칭한다. 에피토프 테그 폴리펩타이드는 항체가 제조될 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 가지지만, CD47 항체의 활성을 간섭하지 않을 정도로 충분히 짧다. 에피토프 테그는 바람직하게는 에피토프에 특이적인 항체가 실질적으로 다른 에피토프와 교차 반응하지 않도록 충분한 고유성을 가진다. 적합한 테그 폴리펩타이드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 일반적으로 약 8-50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 잔기 약 9-30개)를 가진다. 그 예로는 c-myc 테그 및 이의 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (예, Evan et al., Mol . Cell. Biol., 5(12):3610-3616 (1985)); 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D (gD) 테그 및 이의 항체 (예, Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)) 등이 있다.
본원에서, 용어 "표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 자체적으로 (예, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지)에 의해 검출가능하거나, 또는 효소 표지의 경우 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
본원에서, 용어 "고상"은 본 발명의 항체가 부착할 수 있는 비-수성 매트릭스를 지칭한다. 본원에 포함되는 고상의 예로는 유리 (예, 조절 기공 유리 (controlled pore glass)), 다당류 (예, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올 및 실리콘으로 일부 또는 전체적으로 형성된 것들이 있다. 특정 구현예에서, 문맥에 따라, 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며; 다른 예로, 정제 컬럼 (예, 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 또한, 이 용어는 개개 입자들로 된 불연속 고상을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 4,275,149를 참조한다.
또한, 본 발명은 이들 CD47 항체를 포함하는 약학적 조성물 및 이들 CD47 항체 또는 약학적 조성물로 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에서, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질병 (예, 암 또는 섬유성 질환)의 치료학적 처치 및 예방학적 또는 예방적 조처를 둘다 의미한다. 치료가 필요한 개체는 이미 질환을 앓고 있는 개체 뿐만 아니라 질환으로부터 예방되어야 하는 개체를 포함한다.
암의 예로는, 비-제한적으로, 난소암, 대장암, 유방암, 폐암, 두경부암, 방광암, 결장직장암, 췌장암, 비-호지킨 림프종, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 흑색종, 평활근종, 평활근육종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 단핵구성 백혈병, B-세포 유래 백혈병, T-세포 유래 백혈병, B-세포 유래 림프종, T-세포 유래 림프종 및 고형 종양 등이 있다. 섬유성 질환은 예를 들어 심근경색, 협심증, 골관절염, 폐 섬유증, 천식, 낭포성 섬유증, 기관지염 또는 천식 등이 있다.
본원에서, 용어 "개체"는 인간, 가축 및 농장 동물 및 동물원 동물, 스포츠 동물 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등의 포유류로 분류되는 모든 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
본 발명의 CD47 항체는 또한 CD47 질환의 치료 코스를 모니터링하기 위해 시험관내 및 생체내에서 사용될 수 있다. 즉, 예를 들어, CD47을 발현하는 세포, 특히 CD47을 발현하는 암 세포의 수적 증가 또는 감소를 측정함으로써, 질병 완화를 목적으로 하는 특정 치료 요법이 효과적인지를 측정할 수 있다.
본 발명의 CD47 항체는 액상에서 이용될 수 있거나 또는 고상 담체에 결합될 수 있는 면역분석에서 시험관내 사용될 수 있다. 아울러, 이러한 면역분석에서 CD47 항체는 다양한 방식으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체를 활용할 수 있는 면역분석의 타입의 예로는 유세포 측정, 예컨대 FACS, MACS, 면역조직화학법, 직접 또는 간접 형태의 경쟁적인 및 비-경쟁적인 면역분석이 있다. 본 발명의 CD47 항체를 이용한 항원의 검출은 생리 샘플에 대해 면역조직화학적 분석 등의 정방향, 역방향 또는 동시 모드로 운영되는 면역분석을 이용해 수행될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 과도한 실험없이도 다른 면역분석 형태를 인지하게 되거나 또는 쉽게 파악할 수 있다.
본 발명의 CD47 항체는 여러가지 다수 담체에 결합될 수 있으며, CD47 발현 세포의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 널리 공지된 담체의 예로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철석 등이 있다. 담체의 성질은 본 발명의 목적에 따라 용해성이거나 또는 불용성일 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 단일클론 항체를 결합하기에 적합한 기타 담체들을 알 것이며, 또는 과도한 실험없이도 그러한 담체를 파악할 수 있을 것이다.
당해 기술 분야의 당업자에게 여러가지 다수의 표지 물질과 표지 방법들이 공지되어 있으며, 이는 진단 방법에 이용하기 위해서 등의 치료학적 방법에서 추적자로서의 용도를 가진다. 진단 목적의 경우, 표지는 본 발명의 항체 또는 그 단편, 예를 들어, CDR 서열로 구성되거나 또는 이를 포함하는 단편에 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 표지의 타입의 예로는, 효소, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 콜로이드형 금속, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물 등이 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 본 발명의 단일클론 항체에 결합하기에 적합한 다른 표지 물질을 인지하거나 또는 통상적인 실험을 이용해 이를 확인할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체에 이들 표지의 결합은 당해 기술 분야의 당업자에게 통상적인 표준 기법을 이용해 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CD47 항체는 예를 들어 이미징화에 사용하기 위해 나노입자에 부착된다. 사용가능한 나노입자는 당해 기술 분야에 공지된 것으로서, 예를 들어, 비-제한적으로, 라만-실리카-골드-나노입자 (Raman-silica-gold-nanoparticle, R-Si-Au-NP) 등이 있다. R-Si-Au-NP는 골드 코어 상에 흡착된 좁은 흡수 스펙트럼 시그니처를 가진 라만 유기 분자로 구성된다. 라만 유기 분자는 바꿀 수 있기 때문에, 각 나노입자는 자신의 시그니처를 보유할 수 있으며, 따라서 멀티플렉싱에 의해 독립적으로 복수의 나노입자를 동시에 검출할 수 있다. 골드 나노코어 상에 라만 유기 분자를 고정하기 위해, 나노입자 전체가 실리카 셀 안에 캡슐화된다. R-Si-Au-NP의 선택적인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)화는 이의 생체이용성을 증가시키고, 타겟팅 모이어티를 부착하기 위한 기능적인 "핸들"을 제공해준다. 예를 들어, Thakor et al (2011), Sci . Transl . Med ., 3(79):79ra33; Jokerst et al. (2011) Small., 7(5):625-33; Gao et al. (2011) Biomaterials, 32(8):2141-8을 참조한다.
본 발명의 목적에서, CD47은 존재하는 경우 생물 유체 및 조직 상에서 생체내 또는 시험관내에서 본 발명의 CD47 항체에 의해 검출할 수 있다. CD47을 검출가능한 양으로 포함하는 임의 샘플이 사용될 수 있다. 샘플은 뇨, 타액, 뇌척수액, 혈액, 혈청 등의 액체, 또는 조직, 대변 등의 고체 또는 반-고체일 수 있거나, 또는 다른 예로 조직 진단에 통상적으로 사용되는 것과 같은 고체 조직일 수 있다.
민감성을 높이는 결과를 발생시킬 수 있는 또 다른 표지 기법은 항체에 저분자량의 합텐을 커플링함으로써 달성된다. 이들 합텐은 이후 2차 반응을 이용하여 특이적으로 검출할 수 있다. 예를 들어, 특이적인 anti-합텐 항체와 반응할 수 있는, 아비딘 또는 다이니트로페놀, 피리독살 또는 플루오레세인과 반응하는, 바이오틴 등의 합텐을 이용하는 것이 일반적이다.
편의상, 본 발명의 CD47항체는 키트로, 즉, 진단 분석을 수행하기 위한 설명서와 함께 기결정된 양의 시약으로 구성된 패킹된 조합물로서 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 그 효소에 필요한 기질 및 조인자 (예, 검출가능한 발색단 또는 형관단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 안정화제, 완충제 (예, 차단 완충제 또는 세포용해 완충제) 등과 같은 또 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 실질적으로 최적화하는 농도로 시약 용액 중에 제공되도록 다양하게 달라질 수 있다. 특히, 시약은 건조 산제, 통상적으로 동결건조된 형태로, 용해시 적절한 농도를 가진 시약 용액을 제공하게 될 부형제와 함께 제공될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 치료학적 제형은 원하는 순도를 가진 항체를 선택적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로, 저장용으로 제조된다 (예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 항체 조성물은 알맞은 약학 실무에 적합한 방식으로 제형화되고, 투여량이 결정되고, 투여될 것이다. 이 경우 고려 요소로는 치료 중인 구체적인 장애, 치료 중인 구체적인 포유류, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 요인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의료 실무자들에게 공지된 기타 인자 등이 있다. 항체가 투여되는 "치료학적인 유효량"은 이러한 고려사항에 따라 결정될 것이며, CD47 관련 질환을 방지하는데 필요한 최소량이다.
치료학적 용량은 적어도 당 약 0.01 ㎍/(체중)kg, 적어도 약 0.05 ㎍/(체중)kg; 적어도 약 0.1 ㎍/(체중)kg, 적어도 약 0.5 ㎍/(체중)kg, 적어도 약 1 ㎍/(체중)kg, 적어도 약 2.5 ㎍/(체중)kg, 적어도 약 5 ㎍/(체중)kg이며, 약 100 ㎍/(체중)kg을 넘진 않는다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이러한 가이드라인이, 예를 들어 항체 단편의 사용시 또는 항체 접합체의 사용시, 활성 물질의 분자량에 따라 조절됨을 이해할 것이다. 투여량은 또한 국소 투여, 예를 들어, 비강내, 흡입 등, 또는 전신 투여, 예를 들어, 복막내 (I.P.), 정맥내 (I.V.), 진피내 (I.D.), 근육내 (I.M.) 등에 따라 변경될 수 있다.
본 발명의 CD47 항체는 활성을 강화하거나 또는 치료학적 효과를 증가시키는 하나 이상의 물질과 함께 반드시 그런 것은 아니지만, 선택적으로 제형화된다. 이는 일반적으로 전술한 바와 동일한 투여량으로 투여 경로로 또는 상기 기술된 투여량의 약 1 - 99%로 사용된다.
허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여체에게 무독성이며, 이러한 것으로는 포스페이트, 사이트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌 등의 항산화제; 보존제 (예, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예로 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저 분자량의 (잔기 약 10개 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예로 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예로 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예로 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예로 EDTA; 당류, 예로 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염을 형성하는 반대-이온, 예로, 소듐; 금속 착물 (예, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예로 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등이 있다. 생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 무균성이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
또한, CD47 항체를 포함하는 활성 성분은, 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해, 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예로, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐내에, 콜로이드형 약물 전달 시스템 (예, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼내에 포획될 수 있다. 이러한 기법들은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기술되어 있다.
본 발명의 CD47 항체 또는 약학적 조성물은, 비경구, 피하, 복막내, 폐내 및 비강내 등의 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여를 포함한다. 아울러, anti-CD47 항체는 펄스 주입에 의해, 특히 항체의 용량을 줄이면서 적절하게 투여된다.
질병을 예방 또는 치료하기 위해, 항체의 적절한 투여량은 전술한 바와 같이 치료할 질환의 타입, 질환의 중증도 및 코스, 항체가 예방적 목적으로 투여되는지, 이전 치료, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응 및 주치의의 판단에 따라 결정될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료 기간 동안 환자에게 적절하게 투여된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 전술한 장애를 치료하기 위해 사용가능한 물질을 포함하는 제조 물품 (article of manufacture)을 제공한다. 제조 물품은 용기 및 표지를 포함한다. 적절한 용기로는, 예를 들어, 바틀, 바이얼, 시린지 및 시험관 등이 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱 등의 다양한 물질로 제조될 수 있다. 용기는 병태를 치료하는데 효과적인 조성물을 수용하며, 무균성 접근 포트 (sterile access port)를 구비할 수 있다 (예, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼를 구비한 정맥내 용액 백 또는 바이얼일 수 있음). 조성물내 활성 물질은 anti-CD47 항체이다. 용기 상의 또는 용기에 부착된 표지는, 조성물이 선택 증상을 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 제조 물품은 포스페이트-완충화된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충제를 수용하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 이는 그외 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용 설명서가 동봉된 패키지 인서트 등의, 상업적인 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.
하기 실시예들은 본 발명의 제조 및 이용법에 대한 완전한 개시와 설명을 당해 기술 분야의 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 본 발명으로 간주하는 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않거나 하기 실험들이 수행되는 전체 또는 유일한 실험임을 의미하고자 의도되는 것은 아니다. 사용된 숫자 (예, 함량, 온도 등)의 정확도를 확보하기 위한 시도들이 수행되었지만, 일부 실험 오차 및 편차도 고려되어야 한다. 달리 언급되지 않은 하, 부는 중량부이며, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 ℃이고, 압력은 대기압 또는 대략 대기압이다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 출원들은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 포함되는 것으로 언급된 바와 같이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 본 발명자에 의해 발견되거나 또는 제안된 특정 실시예와 관련하여 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 모드를 포함하는 것으로 설명되어 있다. 본 개시 내용에 비추어, 본 발명의 의도된 범위를 벗어나지 않으면서 예시된 특정 실시 예에서 다수의 변형 및 변경이 이루어질 수 있음을 당해 기술 분야의 당업자라면 인지할 것이다. 예를 들어, 동의코돈 (codon redundancy)으로 인해, 단백질 서열에 영향을 미치지 않으면서도 기본 DNA 서열이 달라질 수 있다. 또한, 생물학적 기능 동등성을 고려하여, 종류 또는 양 측면에서 생물학적 작용에 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조에 변화를 가할 수 있다. 이러한 수정들 모두 첨부된 청구항의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
파자 라이브러리 확립
CD47은 세포외 N-말단 IgV 도메인과 5개의 막관통 도메인 및 짧은 C-말단 세포내 테일을 가진, 50 kDa의 막 수용체이다. 인간 Fc 또는 바이오틴화된 인간 CD47-IgV 도메인 단백질 (ACROBiosystems)이 접합된 인간 CD47-IgV 도메인 단백질을 파지 라이브러리 패닝 (phage library panning)을 위한 항원으로서 사용하였다.
건강한 인간 개체 >50명의 비장 또는 골수로부터 증폭시킨 항체 유전자 단편들로 이루어진 파지미드 벡터를 사용해, 파지 라이브러리를 구축하였다. 항체 포멧은 단쇄 가변성 단편 (VH + 링커 +VL)이다. 라이브러리 크기는 1.1 x 1010이며, 서열 다양성 (sequence diversity)이 다음과 같이 분석되었다. 라이브러리로부터 취하여 추가로 서열분석한 클론 62개에서, 서열 16개는 절두 (truncation), 프래임쉬프트 또는 앰버 코돈을 가지고 있으며; 서열 46개는 HCDR3 서열들 모두 고유한 전장 scFv를 가지고 있다. 전장 scFv 46개 중에서, 서열 13개는 람다 경쇄를 가지고 있으며, 서열 22개는 카파 경쇄를 가진다.
파지 패닝 및 클론 선택
인간 CD47-IgV 도메인에 특이적으로 결합하는 파지 클론을 수득하기 위해, 2가지 방법의 파지 패닝법을 이용하였다.
1. 인간 CD47- IgV에 대한 파지 라이브러리 이뮤노튜브 패닝 (phage library immunotube panning)
본 방법에서, 전술한 바와 같이 개발된 파지 라이브러리를 먼저 카제인-코팅된 이뮤노튜브에서 2시간 동안 먼저 인큐베이션하였다. 1차 패닝에서는 인간 CD47-IgV-Fc 융합 단백질을 사용하였다. 결합되지 않은 파지는 PBST로 2회 세척하여 제거하였다. 결합된 파지는 신선하게 준비한 100 mM 트리에틸아민 용액으로 용리시키고, Tris-HCl 완충제를 첨가하여 중화하여 1차 아웃풋 파지 풀을 수득하였다. 이 1차 아웃풋 파지 풀을 증폭시키기 위해 E. Coli TG-1 세포에 감염시켜 회수 (rescue)한 다음 바이오틴화된 인간 Cd47-IgV를 항원으로 사용한 2차 패닝을 수행하였다. 결합된 파지는 동일한 프로세스로 용리시켜 2차 아웃풋 파지 풀을 수득하였고, 이를 회수하여 다시 인간 Cd47-IgV-Fc 융합 단백질을 항원으로 사용해 3차 패닝을 수행하였다. 결합된 파지는 3차 아웃풋 파지 풀을 수득하고, 이를 바이오틴화된 인간 CD47-IgV를 이용해 4차 패닝을 수행하였다.
2. 인간 CD47-IgV에 대한 파지 라이브러리 용액 패닝
2번째 방법으로, 파지 라이브러리를 먼저 카제인-차단된 100 ㎕ 스트렙타비딘-자기 비드 중에 인큐베이션하여 스트렙타비딘 비드 결합물을 고갈시켰다. 스트렙타비딘-자기 비드와 AG0084-huIgG1/k는 음성 고갈 (negative depletion)로 사용하였다. 고갈된 라이브러리를 회수한 다음, 바이오틴화된 인간 CD47-IgV를 항원으로서 사용해 2차 패닝을 수행한 다음 카제인-차단된 스트렙타비딘-자기 비드로 음성 고갈을 수행하였다. 결합되지 않은 파지는 PBST로 5-20회 세척하여 제거하였다. 결합된 파지는 신선하게 제조한 100 mM 트리에틸아민 용액으로 용출시키고, Tris-HCl 완충제를 첨가하여 중화한 다음 회수하고, 인간 CD47-IgV-Fc 융합 단백질을 이용해 3차 패닝을 수행한 후 AG0084-huIgG1/k로 고갈시켰다. 그 후, 결합된 파지는 3차 아웃풋 파지 풀로 수득하였고, 바이오틴화된 인간 CD47-IgV를 이용한 4차 패닝과 카제인-차단된 스트렙타비딘-자기 비드를 이용한 음성 고갈을 수행하였다.
상기한 과정 후, 인간 CD47-IgV 도메인에 특이적으로 결합하는 복수의 파지 클론들이 수득되었으며, 농화되었다. 이를 희석 및 접종하여 8시간 동안 37℃에서 배양하고, 밤새 항-카파 항체-코팅된 필터를 사용해 포획하였다. 바이오틴화된 인간 CD47-IgV (50 nM) 및 NeutrAvidin-AP 접합체 (1:1000 희석)를 필터에 적용하여, 결합된 양성 파지 클론을 검출하였다. 양성 파지 플라그를 취하여, 파지 용출 완충제 100 ㎕로 용출시켰다. 약 10-15 ㎕의 용출된 파지를 사용해 1 mL XL1 blue 세포에 감염시켜, 파지 싱글 포인트 ELISA (SPE)를 위해 고 역가 파지 (HT)를 준비하였다. 양성을 나타내는 하나의 클론을 필터에서 취하여, 인간 CD47-IgV-Fc 융합 단백질 및 바이오틴화된 인간 CD47-IgV 도메인 단백질과의 결합을 수행하였다. 이러한 양성 단일 클론에서 또한 VH 및 VH 유전자를 서열분석하였다. 고유한 VH 및 VL 유전자를 가진 양성 클론들 모두 발현 벡터 pFUSE2ss-CLIg-hk (경쇄, InvivoGen, Cat No. pfuse2ss-hclk) 및 pFUSEss-CHIg-hG1 (중쇄, InvivoGen, Cat No. pfusess-hchg1)에 클로닝하였다. 항체를 HEK293 세포에서 발현시켜, 단백질 A Plus 아가로스로 정제하였다.
CD-47 항체의 친화성 성숙
본 발명의 CD47 항체의 결합 친화성은 시험관내 친화성 성숙화에 의해, 예를 들어, 부위-특이적인 무작위 돌연변이에 의해 개선시킬 수 있으며, 이로써 본 발명의 범위에 또한 포함되는 돌연변이 서열이 제조된다.
예를 들어, 본 발명의 CD47 항체 1F8의 BiaCore 분석은, 결합 친화성 (KD)이 2.8 nM이고, 해리 속도가 1.04E-03 1/s인 것으로 확인되었으며, 이는 시험관내 친화성 성숙화에 의해 개선시킬 수 있었다. 1F8의 중쇄 및 경쇄의 CDR 서열에 대한 강도높은 분석을 통해 무작위 돌연변이될 수 있는 HCDR1 및 LCDR1 영역에서 수개의 잔기들을 동정하였다. 따라서, 랜덤 돌연변이 라이브러리를 구축하여, 특정 잔기에 도입함으로써 새로운 다양한 서열을 구축할 수 있다. CDR 돌연변이 라이브러리를 대상으로 평형 조건 하에 용액내 바이오틴화된 용해성 CD47 ECD를 이용해 패닝을 수행한다. 항원 농도를 감소시켜 패닝을 여러회 수행한 후, 농화된 아웃풋 결합을 결합성 ELISA 검사를 위해 선택한 다음 전장 IgG로 변환시켜 BiaCore 분석을 수행함으로써, 오프-율 (off-rate) 개선된 서열을 특이적으로 선별하였다. 이러한 스크리닝 과정을 통해, 본 발명의 항체 분자는 임상 용도에 전체적으로 최상의 특징을 가지도록 구축할 수 있다.
실시예 1. 파지 클론의 재조합 Cd47 - ECD 단백질 결합성에 대한 ELISA 스크리닝
재조합 인간 CD47-Fc 융합 단백질 (Acrobiosystems)을 포스페이트 완충화된 염수 (PBS) 중에 마이크로타이터 플레이트 상에 실온 (RT)에서 2시간 동안 2 ㎍/mL로 코팅하였다. 항원 코팅 후, 웰을 PBS/0.05% Tween (PBST) + 1% BSA로 1시간 동안 실온 (RT)에서 블록킹하였다. 웰을 PBST로 세척한 후, 단일 클론으로부터 정제된 파지를 웰에 넣고, RT에서 1시간 인큐베이션하였다. 결합성 파지 클론을 검출하기 위해, HRP 접합된 M13에 대한 이차 항체 (Jackson Immuno Research)를 첨가한 다음 형광성 기질 (Roche)을 첨가하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에는 플레이트의 웰을 PBST로 3회 헹구었다. TECAN Spectrafluor 플레이트 리더에서 형광을 측정하였다. 양성 파지 클론을 중쇄 및 경쇄 유전자 서열분석을 위해 선별하였다.
본 발명의 테스트한 CD47 항체들 모두 재조합 인간 CD47-Fc 융합 단백질에 대해 양호한 결합 활성을 나타내었다.
실시예 2. CD47의 SIRPα와의 상호작용을 차단하는 항체에 대한 ELISA 분석
재조합 인간 CD47/마우스 Fc 융합 단백질 또는 바이오틴화된 CD47 단백질 (Acrobiosystems)을 PBS 중에 1 ㎍/mL로 마이크로타이터 플레이트에 RT에서 2시간 동안 코팅하였다. 항원을 코팅한 다음, 웰을 PBS/0.05% Tween (PBST) + 1% BSA로 RT에서 1시간 동안 블록킹하였다. 웰을 PBST로 헹군 다음, PBS에 희석한 항체를 웰에 넣고 (5 ㎍/mL), RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합 항체를 검출하기 위해 인간 Fc에 대한 HRP 접합된 이차 항체 (Jackson Immuno Research)를 첨가한 다음 형광 기질 (Roche)을 첨가하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에는 플레이트의 웰을 PBST로 3번 헹구었다. TECAN Spectrafluor 플레이트 리더에서 형광을 측정하였다.
본 발명의 테스트한 CD47 항체 모두 재조합 인간 CD47-Fc 융합 단백질 및 바이오틴화된 CD47 단백질에 대해 양호한 결합 활성을 나타내었다.
실시예 3. CD47의 SIRPα와의 상호작용을 차단하는 항체에 대한 ELISA 분석
재조합 CD47-Fc 융합 단백질 (Acrobiosystems)를 PBS 중에 1 ㎍/mL로 마이크로타이터 플레이트 상에 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. RT에서 PBST 중의 1% BSA로 1시간 블록킹한 후, 1 ㎍/ml의 SIRPa-His 단백질을 CD47 항체 (10 ㎍/mL)의 존재 또는 부재 하에 첨가하여 RT에서 1시간 동안 두었다. 그런 후, 플레이트를 3번 헹구고, HRP-접합된 anti-His 이차 항체와 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 이를 세척한 후, TMB 용액을 각 웰에 첨가하여 30분간 둔 다음 2.0 M H2SO4으로 반응을 중지시켜 490 nm에서 OD를 측정하였다.
본 발명의 테스트한 CD47 항체들 모두 CD47 단백질- SIRPα 결합을 효과적으로 차단하였다.
실시예 4. 모노머 CD47-ECD에 대한 용량-의존적인 CD47 항체의 결합 반응
직접 결합 및 경쟁적인 스크리닝 후, 본 발명의 CD47 항체인 1F8을 2종의 기존 기준 항체와 비교하여, 본 테스트를 위해 선택하였다. 바이오틴화된 CD47 단백질 (Acrobiosystems)을 PBS 중에 1 ㎍/mL로 마이크로타이터 플레이트에 RT에서 2시간 동안 코팅하였다. 항원을 코팅한 다음, 웰을 PBS/0.05% Tween (PBST) + 1% BSA로 RT에서 1시간 동안 블록킹하였다. 웰을 PBST로 헹군 다음, 여러가지 농도로 CD47 항체를 웰에 넣고), RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합 항체를 검출하기 위해 인간 Fc에 대한 HRP 접합된 이차 항체 (Jackson Immuno Research)를 첨가한 다음 형광 기질 (Roche)을 첨가하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에는 플레이트의 웰을 PBST로 3번 헹구었다. TECAN Spectrafluor 플레이트 리더에서 형광을 측정하였다.
Stanford University, Inhibrx LLC, 및 Celgene Corp. (예, US Pat. No. 9,017,675 B2, US Pat. No. 9,382,320, US Pat. No. 9,221,908, US Pat. Application Pub. No. 2014/0140989 and WO 2016/109415)의 연구자들에 의해 개시된 바와 같이 Hu5F9 및 CC-90002의 서열에 따라 기준 항체 5F9 및 2A1를 제조하고, 동일한 실험에 이용하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 항체 3종 (1F8, 5F9 및 2A1) 모두 모노머 CD47-ECD와 유사한 결합 활성을 나타내었다.
실시예 5. CD47 항체의 다이머 CD47-ECD에 대한 용량-의존적인 결합 반응
실시예 4에 사용한 CD47 항체 3종 (즉, 1F8, 5F9 및 2A1)을 본 실험에서도 사용하였다.
CD47/마우스 Fc 융합 단백질 (Acrobiosystems)을 PBS 중에 1 ㎍/mL로 마이크로타이터 플레이트에 RT에서 2시간 동안 코팅하였다. 항원을 코팅한 다음, 웰을 PBS/0.05% Tween (PBST) + 1% BSA로 RT에서 1시간 동안 블록킹하였다. 웰을 PBST로 헹군 다음, 여러가지 농도로 anti-CD47 항체를 웰에 넣고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합 항체를 검출하기 위해 인간 Fc에 대한 HRP 접합된 이차 항체 (Jackson Immuno Research)를 첨가한 다음 형광 기질 (Roche)을 첨가하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에는 플레이트의 웰을 PBST로 3번 헹구었다. TECAN Spectrafluor 플레이트 리더에서 형광을 측정하였다.
마찬가지로, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 3종의 항체 1F8, 5F9 및 2A1 모두 다이머 CD47-ECD와 유사한 결합 활성을 나타내었다.
본 발명의 항체 2종, 즉, 1F8 및 13H3의 재조합 CD49-ECD에 대한 결합 친화성을 비교하기 위해 또 다른 결합 실험을 수행하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 이들 2종의 항체는 농도-의존적인 방식으로 유사한 결합 활성을 나타내었으며, EC50은 1F8의 경우 0.038 nM이고, 13H3의 경우 0.045 nM였다.
실시예 6. CD47의 SIRPα 결합을 차단하는 CD47 항체의 농도-의존적인 반응
본 실험에서는 CD47 항체 3종 (즉, 1F8, 5F9 및 2A1)을 사용하였다.
재조합 CD47-Fc 융합 단백질 (Acrobiosystems)을 PBS 중에 1 ㎍/mL로 마이크로타이터 플레이트에 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. RT에서 PBST 중의 1% BSA로 1시간 블록킹한 후, 1 ㎍/ml의 SIRPa-His 단백질을 여러가지 농도의 CD47 항체의 존재 또는 부재 하에 첨가하여 RT에서 1시간 동안 두었다. 그런 후, 플레이트를 3번 헹구고, HRP-접합된 anti-His 이차 항체와 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 이를 세척한 후, TMB 용액을 각 웰에 첨가하여 30분간 둔 다음 2 M H2SO4으로 반응을 중지시켜 490 nm에서 OD를 측정하였다.
또한, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 항체 3종들 모두 CD47의 SIRPα 결합을 차단하는데 비슷한 활성을 나타내었다.
본 발명의 CD47 항체 2종, 즉, 1F8 및 13H3가 CD47이 SIRPα에 결합하는 것을 차단하는 능력을 비교하기 위해 또 다른 실험을 수행하였다. 도 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이, 이들 2종의 항체는 농도-의존적인 방식으로 유사한 차단 활성을 나타내었으며, IC50은 1F8의 경우 0.78 nM이고, 13H3의 경우 0.20 nM였다.
실시예 7. CD47 + Raji 세포에 대한 농도-의존적인 CD47 항체 결합 반응
본 실험에는 CD47 항체 3종 (즉, 1F8, 5F9 및 2A1)을 사용하였다.
표면에 인간 CD47을 내인성으로 발현하는 Raji 세포를 여러가지 농도의 F8, 5F9 및 2A1 항체로 4℃에서 30분간 염색하였다. 그런 후, 세포를 PBS로 3번 헹군 다음 APC-표지된 항-인간 Fc 특이 항체 (Invitrogen)와 함께 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 결합은 FACSCanto (Becton-dickinson)으로 측정하였다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 나타낸 항체 3종 모두 동일한 농도-의존적인 패턴으로 CD47+ Raji 세포에 대해 비슷한 결합 활성을 나타내었다.
본 발명의 CD47 항체 2종, 즉, 1F8 및 13H3가 CD47-보유한 Raji 세포에 결합하는 결합력을 비교하기 위해 또 다른 실험을 수행하였다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 13H3가 1F8 보다 CD47-보유한 Raji 세포에 대한 보다 강한 결합 친화성을 나타내었으며, EC50은 1F8의 경우 2.95 nM이고, 13H3의 경우 1.06 nM이었다.
도 4c 및 도 4d는 Biocore 분석으로 측정하였을 때의 각각 1F8 및 13H3의 결합 카이네틱스를 도시하며, 도 4e는 데이타를 도시한다.
실시예 8. 인간 대식세포 (MΦ)에 의한 종양 세포의 탐식 작용 실험
본 실험에 CD47 항체 3종 (즉, 1F8, 5F9 및 2A1)을 사용하였다.
인간 혈액에서 PBMC를 분리하고, 단핵세포를 6일간 대식세포로 분화시켰다. 단핵세포 유래의 대식세포 (MDM)를 긁어내, 24웰 플레이트에 재접종한 다음 24시간 동안 부착되게 하였다. CD47을 내인성으로 발현하는 인간 종양 세포주 Raji를 타겟 세포로 선별하고, 10분간 1 uM CFSE로 표시한 다음 탐식세포 (phagocyte) 당 종양 세포 5:1의 비율로 MDM에 첨가하고, CD47 항체를 다양한 농도로 첨가하였다. 3시간 인큐베이션한 후, 비-탐식세포 타겟 세포는 PBS로 헹궈 제거하고, 남아있는 탐식세포를 긁어내 대식세포 마커 CD14 항체로 염색하여 유세포 측정으로 분석하였다. 탐식 작용을 CD14+ 세포에 대한 게이팅을 통해 측정하고, CFSE+ 세포에 대한 %로 평가하였다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 테스트한 항체 3종 (즉, 1F8, 5F9 및 2A1) 모두 인간 MΦ에 의한 종양 세포의 탐식 작용을 촉진하는데 비슷한 활성을 나타내었다. 도 6a, 6b 및 6c는 CD47 항체 3종에 의해 촉발되는 3종의 서로 다른 인간 혈액 암 세포주의 대식 세포-매개 탐식 작용을 보여준다.
본 발명의 CD47 항체 2종, 즉, 1F8 및 13H3가 인간 MΦ에 의한 종양 세포의 탐식 작용을 촉진하는 능력을 비교하기 위해 또 다른 실험을 수행하였다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, 13H3 및 1F8은 비슷한 능력을 발휘하였으며, 13H3가 일부 농도에서 약간 더 높은 탐식 작용을 나타내었다.
실시예 9. RBC 응집반응 분석에서 RBC-보존성
인간 RBC를 PBS에 10%로 희석하여, 둥근 바닥형의 96웰 플레이트에서 CD47 항체를 타이트레이션하면서 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 응집반응의 증거는 비-침전된 RBC의 존재로 확인하며, 이는 비-응집된 RBC의 점상 적색 도트 (punctuate red dot)와 비교해 혼탁하게 나타난다 (도 7a 및 8a). 도 7b 및 8b의 그래프는 응집반응 분석의 정량 결과를 도시한 것으로, 항체의 존재시 RBC 펠릿의 면적을 측정하고 IgG 대조군에 대해 정규화함으로써 정해지는 "응집 지수"로 표시된다.
도 7a, 7b, 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, CD47 항체 5F9은 0.1 ㎍/㎕ 이상의 농도에서 현저한 RBC 응집성을 나타낸 반면, CD47 항체 1F8 및 2A1은 최대 30 ㎍/㎕ (도 7a 및 7b) 또는 심지어 최대 150 ㎍/mL (도 8a 및 8b)의 테스트 농도에서 기본적으로 RBC 응집을 유발하지 않았다.
마찬가지로, 도 8c 및 8d는, 본 발명의 CD47 항체 (즉, 1F8 및 13H3)가 기본적으로 테스트한 농도 최대 150 ㎍/mL에서 RBC 응집을 유발하지 않은 반면, CD47 항체 5F9은 0.1 ㎍/㎕ 이상의 농도에서 RBC 응집을 현저하게 유발함을 보여준다.
실시예 10. RBC 결합 분석
인간 RBC에 대한 CD47 항체의 결합성을 유세포 측정에 의해 조사하였다. 인간 RBC를 CD47 항체 (10 ㎍/mL)와 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션한 다음 APC-접합된 이차 항체를 첨가하여 4℃에서 30분간 두었다.
도 9a 및 9b에 나타낸 바와 같이, 놀랍게도, 본 발명의 CD47 항체 1F8는 RBC에 결합하지 않았지만, 기준 CD47 항체 5F9 및 2A1은 테스트한 농도에서 결합하였다.
마찬가지로, 도 9c 및 9d는, 1F8이 테스트한 농도에서 RBC에 결합하지 않지만, 13H3는 테스트한 농도에서 RBC에 매우 낮은 수준으로 결합성을 나타냄을 보여준다.
실시예 11. RBC 응집 분석
CD47 항체 첨가에 따른 RBC 응집을 분석하기 위해 건강한 남성 6명 및 여성 6명으로부터 RBC를 채취하였다. 도 10a 및 10b는 적혈구 응집 분석의 타이트레이션 결과를 나타낸 것으로, 항체의 존재시 RBC 펠릿의 면적을 측정하고 IgG 대조군 또는 기준 항체에 대해 정규화함으로써 정해지는 "응집 지수"로 표시된다.
실시예 12. 혈소판 결합 분석
본 발명의 CD47 항체의 인간 혈소판 결합성을 유세포 측정에 의해 평가하였다. 인간 말초 전혈을 본 발명의 테스트 CD47 항체 (10 ㎍/mL) 또는 SIRPα-Ig 융합체와 함께 인큐베이션하고, 혈소판의 표면 마커로서 CD61을 염색하였다. CD47 항체 또는 SIRPα-Ig 융합체의 결합을 CD61 양성 집단 (혈소판) 상에 게이팅하여 측정하고, CD47 또는 SIRPα-Ig 융합체의 결합 %를 추가로 평가하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 테스트한 CD47 항체는 인간 혈소판에 인지가능한 수준으로 결합하진 않았지만, SIRPα 단백질에는 결합하였다.
실시예 13. Cyno RBC 응집 분석
암컷 및 수컷 cyno 원숭이로부터 수득한 RBC를 PBS에 10%로 희석하여, 둥근 바닥형의 96웰 플레이트에서 CD47 항체를 지정된 농도로 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 응집반응의 증거는 비-침전된 RBC의 존재로 확인하며, 이는 도 12a에 나타낸 바와 같이, 비-응집된 RBC의 점상 적색 도트와 비교해 혼탁하게 나타난다. 도 12b는 응집반응 분석의 타이트레이션 결과를 도시한 것으로, 항체의 존재시 RBC 펠릿의 면적을 측정하고 IgG 대조군에 대해 정규화함으로써 정해지는 "응집 지수"로 표시된다.
데이타는, 본 발명의 테스트한 CD47 항체가 cyno RBC 응집을 시험관내에서 인지가능한 수준으로 유도하지 않았음을 보여준다.
실시예 14. CD47 항체에 의한 일차 인간 AML세포에 대한 탐식 작용
AML 환자 (AML-PB003F)로부터 수득한 일차 PBMC를 10분간 1uM CFSE로 표지한 다음 MDM을 탐식세포 당 종양 세포 5:1 비율로 첨가하고, 지정된 CD47 항체를 여러가지 농도로 첨가하였다. 3시간 인큐베이션한 후, 식균되지 않은 타겟 세포를 PBS로 헹궈 제거하고, 남아있는 탐식세포는 긁어내 CD14 항체로 염색하여 유세포 측정으로 분석하였다. 탐식 작용은 CD14+ 세포 게이팅으로 측정하고, CFSE+ 세포에 대한 %로서 평가하였다. 탐식 작용을 전술한 바와 같이 측정하였다.
도 13a-13h에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 테스트한 CD47 항체들 모두 유의한 AML 결합력 (>75%) 및 탐식 작용성 (≥36%)을 나타내었으며, 이들 모두 동일 분석에 사용된 기준 CD47 항체 보다 훨씬 우수하였다.
실시예 15. 루시퍼라제 - Raji 이종이식 모델 ( CDX )을 이용한 1F8의 생체내 효능
NSG 마우스에 Raji Luc-EGFP를 꼬리 정맥 주사를 통해 백만개 세포/마우스의 농도로 생착시켰다. 생착 후 5일째에 생착율을 측정하기 위해 생체내 사진을 촬영하였다. CD47 항체 (즉, 1F8, 5F9 및 2A1)의 처리는 같은 날 10 mg/kg 용량에서부터 출발하였다. 마우스 모두 복막내 주사를 통해 2일 간격으로 주사하였다. 마우스는 하기 시간대에 IVIS Lumina III 이미징 시스템을 통해 생체내 이미지를 촬영하였다: 항체 처리 1일, 처리 2일, 처리 6일 및 처리 9일. 마우스에서의 종양 증식은 생체내 라이브 이미징 시스템을 통해 생발광 휘도 (bioluminescent radiance) 분석을 통해 측정하였다.
도 14a에서 볼 수 있는 바와 같이, 생발광 휘도 분석 결과, 마우스의 종양이 본 발명의 테스트 CD47 항체 (즉, 1F8) 처리 후 처음 3일 이내에 거의 증식하지 않았으며, 처리 후 6일부터 종양은 줄어들었다. 비교를 위해, 기준 CD47 항체를 처리한 마우스에서 종양은 동일한 치료 기간 동안 계속 증식하였다.
마찬가지로, 도 14b는 CD47 항체 13H3가 Raji 이종이식 모델에서 여러가지 테스트 농도에서 생체내 효과적이었음을 보여준다.
Raji-이종이식 실험 종료시, 설치류 안락사를 위해 이산화탄소를 사용해 마우스들을 모두 안락사시켰다. 마우스 그룹 4개에서 비장세포를 분리하여, M1 대식세포 (F4/80 양성 대식세포 중 CD80+ %) 및 M2 대식세포 (F4/80 양성 대식세포 중 CD206+ %)의 비율을 유세포 측정에 의해 분석하였다.
도 15a-15b에 나타낸 바와 같이, 테스트한 CD47 항체들 모두 (1F8 포함) 종양-보유한 마우스에서 대식세포의 분극화를 유도할 수 있었다.
실시예 16. 다양한 인간 암 타입들의 PDX 샘플을 이용한 CD47 발현 프로파일
PDX 샘플 54개 (인간 암 타입 7종)에서 면역-조직화학 염색을 통해 CD47의 발현을 분석하였다. 다양한 PDX 샘플에서 CD47 염색 수준을 기하학적 구조 및 염색 강도에 의해 점수를 매겼다. 도 16a, 16b 및 16c는 CD47 항체를 이용한 치료 후 여러가지 CD47 발현 수준을 도시한다.
실시예 17. 약물의 안전성 실험 (생체내 Cyno PK 실험)
나이브 cyno 원숭이에 비히클 (n=2), 1F8 (n=3, 15 mg/kg) 및 5F9 (n=3, 15 mg/kg)를 정맥내 주입하였다. 채혈 후 24시간 이내에, 주사 전 2번, 및 항체 투여 후 3, 6, 10, 14 및 21일째에 혈액 (CBC)을 분석하였다. 적혈구 수치 (RBC), 헤모글로빈 (HGB), 절대 망상적혈구 및 혈소판 카운트 등의 CBC 파라미터를 조사하였다. 그 결과는 도 17a-17d에 도시하며, 1F8 처리는 cyno 원숭이에서 혈액 파라미터에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
마찬가지로, 나이브 cyno 원숭이 (n=2)에게 CD47 항체 13H3를 20 mg/kg 용량으로 정맥내 주사하였다. 여러 시간대에 항응고제를 사용하지 않고 정맥 천자를 통해 시험관내에 혈액을 채혈하였다. CD47 항체 13H3의 혈청 수준을 코팅 시약으로서 CD47 단백질을 이용한 다음 HRP-접합된 항-인간 카파 이차 항체로 검출하는 ELISA에 의해 측정하였다. cyno 원숭이에서 약동한 파라미터를 Winolin에 의해 분석하였으며, 도 17e 및 하기 표에 나타낸다.
T 1/2 (h) C max (㎍/ml) AUC 0-t (day*㎍/ml) AUC inf (day*㎍/ml) CL (ml/hr/kg)
145.2±10.8 536.4± 63.9 10692.1± 1300.9 10712.5± 1298.4 1.880± 0.228
시노몰구스 원숭이에서 항체 13H3의 약물의 안전성 실험 (혈액) 나이브 cyno 원숭이에 항체 13H3 (20 mg/kg)를 1회 또는 반복 (매주) 정맥내 주입하였다. 적혈구 수치 (RBC), 헤모글로빈 (HGB), 혈소판 카운트 및 림프구 카운트 등의 혈액 (CBC) 파라미터들을 항체 투여 후 지정된 시기에 조사하였다.도 19a, 19b, 19c, 19d, 19e, 19f, 19g 및 19h는 RBC 응집, 헤모글로진, 혈소판 및 림프구에 대한 CD47 항체 13H3의 효과를 도시한다.
실시예 18. 항체 1F8의 구조
CD47 항체의 에피토프 결합성을 경쟁적인 ELISA에 의해 분석하였다. CD47 ECD 단백질 및 제1 anti-CD47 항체를 예비-인큐베이션한 다음, 스트렙타비딘-HRP 항체에 의해 검출되는 바이오틴화된 제2 anti-CD47 항체에 첨가하였다. 제1 anti-CD47 항체가 제2 항체와 CD47 ECD 결합에 대해 경쟁한다면, 이들 항체 2종은 동일한 또는 중첩되는 에피토프에 놓이게 된다. 그렇지 않다면, 중첩되지 않은 에피토프에 놓이게 된다. 도 18a 및 18b에 도시된 결과는, 본 발명의 CD47 항체 1F8이 기준 항체 5F9 및 2A1과 다른 에피토프를 가진다는 것을 보여준다.
도 18c는 문헌에 보고된 인간 CD47-ECD와의 복합체 (녹색)에서 기준 Ab 5F9 (상단)의 결정 구조를 도시한다 (예, J. Clin . Investigation, 126, 7: 2610-2620).
도 18d는 인간 CD47-ECD와의 복합체 (녹색) 형태의 1F8-Fab (상단) 결정 구조를 보여준다. CD47-1F8 Fab의 복합체 구조는 헤드에서 헤드까지 일직선 배향성을 취하지만, CD47-SIRPα 및 CD47-5F9 다이아바디의 복합체 구조는 헤드에서 헤드까지 경사진 배향성을 나타낸다. CD47 상의 1F8 에피토프는 잔기 L3, V25, T26, N27, M28, E29, A30, Q31, T34, E35, Y37, A53, L54, L74, K75, G76, T99, E100, L101, T102 및 R103를 포함하는 불연속적이고 광범위이며, 이중 L3, N27, E29, Q31, T34, E35, Y37, A53, T99, E100, L101, T102 및 R103이 SIRPα와의 상호작용에 참여하는데 있어 1F8의 길항 특성을 해명해준다. 또한, 복합체 구조는 1F8의 VH 도메인이 CD47에 대해 수소 결합 8개와 염 브릿지를 4개 형성하며, 1F8의 VL 도메인 역시 CD47에 수소 결합을 8개 형성하는 것으로 확인된다.
공개된 CD47-IgV/항체 또는 SIRPα 복합체 구조와 달리, 1F8 항체는 모두 유사한 헤드 투 헤드 배향성을 가진 결합임에도 불구하고 타겟의 대부분 다른 에피토프에 결합한다. CD47 상의 1F8 에피토프는 형태적으로 불연속적이며, CD47의 TNMEAQ 루프 (잔기 26-31), T34, E35, L74, 및 LTR 힌지 (잔기 101 -103)를 포함한다. 항체 잔기의 측쇄와 CD47 주쇄 산소 원자 사이에는 여러개의 수소 결합이 형성된다. 염 브릿지 역시 1F8의 R103과 CD47의 E35 사이에 형성된다. 또한, 적절한 배향성을 유지하는데 중요한 반데르 발스 결합도 수개 관찰된다. 항체 1F8의 VH 도메인은 주로 CD47의 T34, E35 및 LTR 힌지 (잔기 101-103)에 결합하는데 참여하며, VK 도메인은 TNMEAQ 루프 (잔기 26-31) 및 L74와 상호작용한다. 이러한 CD47 상의 에피토프들은 5F9 항체 및 SIRPα에서 서로 다르다. 구조 분석 결과, 1F8 항체의 2개의 긴 루프 (잔기 26-38 및 52-59)는 거의 수직 방향으로 CD47에 결합할 수 있도록 보조하여, 인접 세포 상의 CD47이 이 항체와 결합할 수 없는 방식으로 항체가 분리되게 할 수 있으며, 그래서 혈액 세포의 응집 반응 대부분이 방지되는 것으로, 시사된다.
도 18e는 5F9 및 1F8의 CD47과의 상호작용을 비교한 것이다.
1F8/CD47 복합체 구조에 기준 항체 5F9/CD47 복합체 구조를 중첩시킨 결과, CD47의 결합 방향이 이들 2가지 복합체들 간에 매우 다른 것으로 확인되었다. 이들 2종의 항체는 헤드 투 헤드 결합 배향성을 가지지만, CD47은 약 180° 수평으로 회전된다. 1F8/CD47 복합체의 구조는 경쇄 루프 잔기 61-64 근처에 CD47 N-말단 피로글루타메이트를 가지고 있는 반면, 5F9는 W52, N32 및 W101의 중쇄 루프 3개로 둘러싸인 CD47 N-말단을 가진다. 항체 1F8에서, 중쇄 잔기 Trp33 및 Arg103는 CD47의 Leu101 및 Glu35와 각각 반데르 발스 결합 및 염 브릿지를 형성한다. 동일 위치에서, 항체 5F9의 잔기 Tyr101은 반데르 발스 결합을 통해 CD47의 N-말단 쪽을 가르키고, Arg102는 CD47의 Glu104와 수소 결합을 형성한다. 항체 1F8의 루프 잔기 Asn31, Trp33 및 힌지 잔기 Arg53과 Asp56은 도메인-간의 수소 결합 망을 형성하고, Asn31과 Arg53은 CD47의 주쇄 Leu101 및 Thr34와 수소 결합을 형성한다. 동일한 인터페이스에서, 5F9은, 잔기 Tyr52가 CD47의 Leu3와 반 데르 발스 결합을 형성하는 것을 제외하고는, 상호작용을 형성하지 않는 것으로 보인다. 힌지 (잔기 52-56)가 1F8 (잔기 52-59)에 비해 잔기 3개가 짧다. 경쇄에서, Fab 1F8 및 5F9 둘다 루프 (1F8의 V29 -Y38 및 5F9의 V152-Y158)애서 CD47과 중요한 수개의 수소 결합 상호작용을 형성한다. 1F8의 경우, 잔기 Y97 및 Y98는 루프 (잔기 26-38)를 멀리 "밀어내고", 1F8과 CD47 간의 수소 결합 2개, 즉 1F8의 Arg34와 CD47의 주쇄 Leu74 간에, 그리고 1F8의 Arg36와 CD47의 주쇄 Thr26 간에 수소 결합이 형성된다. 그러나, 5F9의 잔기 Gly218과 Ser219 (이들은 1F8의 Tyr97 및 Tyr98에 해당됨)은 5F9의 루프 (잔기 149-158)가 CD47과 3개의 수소 결합을 형성하게 유도한다 (Asn157-Lys39, Tyr159-Glu104 및 Lys177-Thr99에서). 또한, 중쇄에서도 마찬가지로, 5F9의 루프 (잔기 149-158)가 1F8 (잔기 26-38)에 비해 잔기 약 3개가 짧다. 이렇듯 1F8에서 상대적으로 긴 루프가 CD47의 결합 배향성에 크게 기여하다.
실시예 19. CD47 항체 34C5
anti-인간 CD47 항체를 제조하기 위해, BALB/C, C57/BL6 또는 SJL 마우스 등의 6-8주령의 여러 품종의 마우스에 재조합 인간 CD47 세포외 도메인 단백질을 여러번 주입하여 면역화하였다. 면역화 후, anti-CD47 IgG 역가가 충분한 마우스에 동일한 항원으로 부스팅한 다음, 융합 (fusion)을 수행하였다. 하이브리도마 상층액에서 인간 CD47 ECD 단백질을 이용한 직접 결합성과 CD47에 대한 SIRPα 결합성 경쟁을 ELISA 스크리닝을 통해 테스트하였다. 일련의 스크리닝 분석을 통해, 인간화를 위해 34C5를 선별하였으며, 전술한 분석에 따라 추가적인 시험관내 특징 규명을 수행하였다.
도 20 및 도 21은 재조합 CD47-ECD (EC50 0.27 nM) 및 CD47-보유한 Raji 세포 (EC50 0.83 nM) 각각에 대한 34C5의 강력한 결합 친화성을 도시한 것이다.
도 22는 34C5가 CD47이 SIRPα에 결합하는 것을 효과적으로 차단할 수 있음을 나타낸 것으로서, 이때 EC50은 0.30 nM이다.
도 23은 인간 MΦ에 의한 종양 세포의 탐식 작용을 항체 34C5가 촉진함을 나타낸 것이다.
도 24는 항체 34C5가 시험관내 RBC 응집을 유발하지 않음을 보여주는 것이다.
도 25는 항체 34C5가 항체의 농도 감소에 따른 RBC 결합성의 감소를 나타낸 것이다.
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ggcaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 79 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 caggtacagc tgcagcagtc agggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctaagactc 60 tcctgtacag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagca attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggccgtat attactgtgc gagatatagt 300 attggtagac acacctttga ccactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcggcc 357 <210> 80 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 aaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggttt cactttcagt aacgcctgga tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggccgt attaaaagga aaactgatgg tgagacaaca 180 gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc agcatctcaa gagatgattc aaaaaacacc 240 ctgtatctgc aaatgaacag cttgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgcgctggc 300 agtaaccgag cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc tgcc 354 <210> 81 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 caggtacagc tgcagcagtc agggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggctatgcca tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attacttcta ctggtggtcg cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccacc tccagagaca attccaggaa cacgttgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggccgtat attactgtgc gagagagtca 300 aacttcaggg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc tgcc 354 <210> 82 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcatt gacgcctgga tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatagcg gtggtagcac atactacgca 180 gactccgtga agggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgag aggggctagg 300 ggccatcccg ggcaggacta ctgggggcag ggcaccctgg tcaccgtctc ggcc 354 <210> 83 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 caggtcaact taagggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcgggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120 ccaggggggg ggctggagtg ggtttcatac actagtcgtt ttggtagtga cacaaactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgtccagaa ctcactatat 240 ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggac acggctgttt attactgtgt gagagatgta 300 cataacaggg atgcctactg gggccagggc accctggtca ccgtctcggc c 351 <210> 84 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaacacagat 300 tactatgata gtagtagcca tacccccgct gactactggg gccagggcac cctggtcacc 360 gtctcggcc 369 <210> 85 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 caggtgcagc tgcaggagtc ggggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctatggca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag ggctggagtg ggtctcaact atcagtggca gtggtagtag cacaaactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctattt 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat atttctgtgc gaaaggccga 300 tattactatg atagtcttga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tctgcc 366 <210> 86 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 caggtacagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta ctggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgcat attactgtgc gaaagataaa 300 tggagcagct ggcccactta ctactttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcggcc 366 <210> 87 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 caggtgcagc tgcaggtgtc ggggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tggcctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcggct gttagtaata gtggtgttga gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ttgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaacgaact 300 agacaactgc taactccgcg ggagtttgac tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360 ttggcc 366 <210> 88 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 caggtcaact taagggagtc tgggggaggc ttgatacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttacc aattatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaagt gttagtagtg ctggtggtag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagacgagtc 300 aatcgggcct tcgatctctg gggccgtgga accctggtca ccgtctcggc c 351 <210> 89 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 caggtgcagc tgcaggagtc ggggggaggc ttggtacagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggtgtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180 gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300 gataagagct atggttacac atttgactac tggggccagg gcaccctggt caccgtctcg 360 gcc 363 <210> 90 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 caggtcaact taagggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cgggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctactgga tgcactgggt ccgccaagcc 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct atcagtggta gtggtgccgg cacatactac 180 ccagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gagagatcgg 300 tccttatctt ttggttttga tatttggggc caaggcaccc tggtctccgt ctctggc 357 <210> 91 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 caggtacagc tgcagcagtc agggggaggc ttggtccagc cgggggggtc actgagactc 60 tcctgtgcag cccctggatt cacctttagt agatattgga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gactggagtg ggtggccaac ataaagggag atggaagtca gacatactat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccatgaa aacagtgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccatat attactgtgc gaaaggggct 300 gcttatcaca ttaacagctg gctcgacccc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcg 360 gcc 363 <210> 92 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cggcattgcc agtaactttg tgcagtggta ccagcagcgc 120 ccgggcagtg tccccaccac tgtgatctat agggataacc aaagaccctc tggagtccct 180 gatcggttct ctggctccgt cgacagctcc tccaattctg cctccctcac catctctggg 240 ctgaagactg acgatgaggc tgactattat tgtcagtcct atgatgacca caatcattgg 300 gtgttcggcg gcgggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 93 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataggaa ctacctagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca ttaaccaggc atctacccgg 180 gcatccggcg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagagtt cactctcatc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggcg atttattact gtcagcaata ttatactcct 300 cccctcgctt tcggcggagg gaccaagctg gagatcaaa 339 <210> 94 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 gaaattgtgt tgacgcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg cacagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga aaccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgaattc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggta cagattttac actgcaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tactactgta tgcaagctct acaaattcct 300 cccactttcg gcggagggac caaagtggat atcaaa 336 <210> 95 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cgggaaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg caccattgcc agcaactttg tgcagtggta tcaacagcgc 120 ccgggcagtt cgcccacccc agtgatcttt gagaatgacc gaagaccctc tggggtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaattctg cctccctcac catttcgtca 240 ctgaacactg aggacaaggc tgactactac tgtcagtcct atgatagcag cactcatggg 300 tgggtgtttg gcggagggac ccagctcacc gtttta 336 <210> 96 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcggc ggtaattctg tatcctggta ccagcaactc 120 ccaggaacgg cccccaagct cctcatctat aggaatcatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgacgacg aggctgatta ttattgtgca acatgggatt tcagcctgag tggttttgtc 300 ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330 <210> 97 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 gaaactacac tcacgcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca ggacatcaga aatgatttag actggtttca acaaaaacca 120 ggcgaagccc ctaaacgcct gatctctgct gcatctaatt tgcagagtgg ggtcccctca 180 cgattcagcg gcggtggctc tggctccgaa ttcactctca caatccacag cctggagtct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacatta cccctccttg gacgttcggc 300 caagggacca agctggagat caaa 324 <210> 98 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca ggaaattagg accgcctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat tatgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gcggcagtag gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttcctgtcag cagtatgata cctcacctcc caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 99 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagcag caatgtgata 300 ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330 <210> 100 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 gaaactacac tcacgcagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 ctcacttgtc gggcgagtca ggatatcaca aggtggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 agattcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag ggttccagtg ttcctttcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 101 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 gatgttgtga tgactcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccaacagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc tatgtacact 300 tttggccagg ggaccaagct ggagatcaaa 330 <210> 102 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagtggctc caacatcgga agtaattctg ttcactggta ccagcaactc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat actaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcatt tcagcctccc tggctatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgttta ttactgtgca acgtgggatg acagactgag tggtccggtg 300 ttcgccgcag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 103 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggggtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattggc agcacctatg tgcagtggta ccaacagcgc 120 ccgggcagtc cccccaccac tgtgatctat aaggatgacc aaagaccctc tggggtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacggctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctggagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt ctgataccag caatctggtc 300 ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330 <210> 104 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 gaaactacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctgttt ctccggggga aagagttacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc ggtaattact tagcctggta ccagcagaga 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggggcattca ggagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcac cagactggag 240 cctgaagatt ttgcaactta ttactgccaa cactataata atttccccca cactttcggc 300 gcagggacca aagtggatat caaa 324 <210> 105 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Ala Arg Ile Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Gly Ala Trp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 106 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ile Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 107 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn 1 5 10 15 Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn 20 25 30 Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr 35 40 45 Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys 85 90 95 Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys 100 105 110 Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu 115 120 <210> 108 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 108 Arg Ala Trp Met Asn 1 5 <210> 109 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 109 Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 110 Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 111 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 111 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 112 Gln Ala Ser Thr Arg Ala Ser 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 113 Gln Gln Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala 1 5

Claims (33)

  1. (i) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 내의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3, 및
    (ii) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역 내의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3
    를 포함하는, 인간 CD47에 결합하는 항체로서,
    상기 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 은 카바트 넘버링 방법 (Kabat numbering scheme)에 따른 것인, 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 인간 IgG4 항체인, 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 적혈구 세포의 적혈구 응집 또는 고갈을 유의한 수준 (significant level)으로 유발하지는 않는, 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 인간 CD47과 SIRPα 간의 상호작용을 저해하는, 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 CD47-발현 세포의 대식세포-매개 탐식 작용(phagocytosis)을 촉진하는, 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    인간 개체에서 CD47을 과다 발현하는 암을 치료하는데 사용하기 위한 것인, 항체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 암이 난소암, 대장암, 유방암, 폐암, 두경부암, 방광암, 결장직장암, 췌장암, 비-호지킨 림프종, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모상세포 백혈병 (HCL), T-세포 전-림프성 백혈병 (T-PLL), 거대 과립 림프성 백혈병, 성체 T-세포 백혈병, 다발성 골수종, 흑색종, 평활근종, 평활근육종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 단핵구성 백혈병, B-세포 유래 백혈병, T-세포 유래 백혈병, B-세포 유래 림프종, T-세포 유래 림프종, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 자궁경부암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 암이 고형 종양인, 항체.
  9. 서열번호 108의 아미노산 서열을 가진 VH CDR1, 서열번호 109의 아미노산 서열을 가진 VH CDR2, 서열번호 110의 아미노산 서열을 가진 VH CDR3, 서열번호 111의 아미노산 서열을 가진 VL CDR1, 서열번호 112의 아미노산 서열을 가진 VL CDR2, 서열번호 113의 아미노산 서열을 가진 VL CDR3을 포함하는,
    인간 CD47에 결합하는 항체
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항체가 인간 IgG4 항체인, 항체.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 항체가 적혈구 세포의 적혈구 응집 또는 고갈을 유의한 수준 (significant level)으로 유발하지는 않는, 항체.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 항체가 인간 CD47과 SIRPα 간의 상호작용을 저해하는, 항체.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 항체가 CD47-발현 세포의 대식세포-매개 탐식 작용(phagocytosis)을 촉진하는, 항체.
  14. 제9항에 있어서,
    인간 개체에서 CD47을 과다 발현하는 암을 치료하는데 사용하기 위한 것인, 항체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 암이 난소암, 대장암, 유방암, 폐암, 두경부암, 방광암, 결장직장암, 췌장암, 비-호지킨 림프종, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모상세포 백혈병 (HCL), T-세포 전-림프성 백혈병 (T-PLL), 거대 과립 림프성 백혈병, 성체 T-세포 백혈병, 다발성 골수종, 흑색종, 평활근종, 평활근육종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 단핵구성 백혈병, B-세포 유래 백혈병, T-세포 유래 백혈병, B-세포 유래 림프종, T-세포 유래 림프종, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 자궁경부암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 암이 고형 종양인, 항체.
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