KR102360209B1

KR102360209B1 - 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 항균조성물

Info

Publication number: KR102360209B1
Application number: KR1020200060895A
Authority: KR
Inventors: 민현진
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2022-02-09
Also published as: KR20210144094A

Abstract

본 발명은 운동선수의 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 항균조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유산소 운동 전후 운동선수에게서 각각 수집된 비강세척액을 황색포도상구균에 처리한 결과, 고강도 유산소 운동 후 운동선수에게서 수집된 비강세척액이 처리된 황색포도상구균에서 우수한 항균효과가 확인됨에 따라, 운동선수의 유산소 운동 후 수집된 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 조성물을 항균제로 제공하고자 한다.

Description

비강세척액을 유효성분으로 함유하는 항균조성물{Antibacterial composition comprising Nasal lavage fluids}

본 발명은 운동선수의 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 항균조성물에 관한 것이다.

항생제의 고전적인 의미는 미생물에 의해 생산되는 2차 대사 산물로서, 매우 낮은 농도에서 미생물을 죽이거나 성장을 저해하는 물질을 말한다. 항생제라는 용어는 1940년대 왁스만에 의해 처음 사용되기 시작한 것으로, 초기에는 주로 사용되던 합성물질 설폰아미드류와 페니실린 곰팡이에 의해 생산되는 페니실린이 사용되었으며, 그 후 항균활성을 나타내는 많은 물질들이 발견되고 합성되어 사용되고 있다.

현재까지 수많은 항생물질이 천연물로부터 분리되거나 유기합성됨으로써 많은 질병이나 감염증 치료가 가능해졌으나, 전 세계적으로 과도한 항생제 오남용으로 인해 기존 항생물질에 대한 내성균의 출현 및 내성률이 증가하고 있는 추세이며, 다양해지고 있는 감염경로는 내성균의 확산을 가속화시켜 심각한 사회문제로 대두되고 있다. 특히, 임상에서는 기존 항생제에 대한 내성균이 증가하면서 항생제 내성균의 마지막 무기인 반코마이신을 대체하기 위한 새로운 약제 개발의 필요성이 강조되고 있는 실정이다.

현재 국내에서 사용되는 많은 항생제의 경우 그에 따른 내성률 심각한 수준에 있으며 일부의 항생제의 경우 100% 근접해 있다. 황색포도상구균은 테트라사이클린에 96.2%의 높은 내성률을 보였고, 이어 에리스로마이신에 57.6%, 페니실린에 32.7%의 내성률을 각각 나타냈다. 장내구균은 축산동물의 종류에 관계없이 테트라사이클린에 높은 내성을 보였다. 또한 우리에게 먹거리로 제공될 식육산업에서 특히 돼지와 닭에서 분리한 황색포도상구균은 70% 이상이 두 가지 이상의 항생제에 내성을 나타냈다. 또 다른 보고에 의하면, 축산 환경 중 항생제 내성균 모니터링을 한 결과, 전국 소, 돼지, 닭 축산 농가를 중심으로 가축 분변, 주변 토양, 하천 따위에서 대장균 197 균주, 황색포도상구균 42 균주 등 세균을 분리했으며, 이들 세균의 항생제 내성을 조사한 결과 대장균은 69.4%, 황색포도상구균은 78.6%, 캄필로박터는 100%에서 하나 이상의 항생제에 내성을 지닌 것으로 나타났다. 두 가지 이상 항생제에 내성을 지닌 것도 대장균 19.2%, 황색포도상구균 11.6%로 나타났다. 가장 강력한 항생제인 반코마이신에 내성을 지닌 균주도 2개 검출됐다.

이에 따라, 기존의 항균물질과 달리 장기간 사용해도 부작용이 없고, 내성 또는 안정성에 문제가 없는 신규한 항균물질의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2009-0124397호 (2009.12.03. 공개)

본 발명은 종래의 항생제 사용에 따른 문제점을 해결하기 위해, 유산소 운동 후 운동선수에게서 수집된 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 조성물을 항균제로 제공하고자 한다.

본 발명은 운동선수의 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 항균조성물을 제공한다.

본 발명은 운동선수의 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 항균용 가축사료 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 운동선수의 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 살균제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 유산소 운동 전후 운동선수에게서 각각 수집된 비강세척액을 황색포도상구균에 처리한 결과, 고강도 유산소 운동 후 운동선수에게서 수집된 비강세척액이 처리된 황색포도상구균군에서 우수한 항균효과가 확인됨에 따라, 운동선수의 유산소 운동 후 수집된 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 조성물을 살균제로 제공하고자 한다.

도 1은 열충격 1 시간 후 초대 사람 코 상피세포를 수집하여 HSP27, HSP70 및 HSP90의 발현 수준을 확인한 결과로, 도 1A는 항체를 이용한 웨스턴블롯 분석 결과이며, 도 1B는 배양 상층액에서 발현수준을 확인한 ELISA 분석 결과이다 (*p<0.05, N=3).
도 2는 최대 유산소 전후 비운동선수 대조군(A-D) 및 경잭적 운동선수(E-H)로부터 수집된 비강세척액에서 HSP27, HSP70, IL-8 및 TNF-α의 수준을 비교분석한 결과이다 (*p<0.05, N=3).
도 3은 최대 유산소 운동 전후 시간 및 대상 그룹(배구선수 대 대조군)을 설명하기 위해, 선형 혼합-효과 모델을 이용하여 두 그룹간의 HSP27 (A) 및 HSP70 (B) 차이를 확인한 결과이다.
도 4는 최대 유산소 운동 전후 수집된 비강세척액의 생리 활성을 확인한 결과로, 도 4A는 최대 유산소 운동 전후 수집된 비강세척액의 박테리아 집단 수 감소효과를 확인한 결과이며, 도 4B(위)는 비강세척액에서 HSP27 및 HSP70의 침전을 확인한 결과이며, 도 4B(아래) 침전된 HSP27 및 HSP70를 제거한 비강세척액에서 박테리아 집단의 감소 수준을 확인한 결과로, (+)는 운동 수행 또는 각각의 항체 존재를 나타내며, (-)는 운동 미수행 또는 각각의 항체가 존재하지 않는 것을 나타낸다 (*p<0.05, N=3).

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

삭제

본 발명은 운동선수의 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 항균조성물을 제공할 수 있다.

상기 비강세척액은 유산소 운동 후 운동선수에게서 수집된 비강세척액인 것일 수 있다.

상기 유산소 운동은 최대 심박수의 70 내지 80% 수준의 강도로 20 내지 40분간 수행되는 것일 수 있다.

상기 유산소 운동 후 운동선수에게서 수집된 비강세척액은 유산소 운동 전 수집된 비강세척액과 비교하여 HSP27의 증가 및 HSP70 감소가 나타나는 것일 수 있다.

상기 조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 운동선수의 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 항균용 가축사료 첨가제를 제공할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 항균조성물은 운동선수의 비강세척액을 단독으로 또는 0.001 내지 99 중량%로 사용 목적에 따라 적절히 선택된 첨가제를 함유할 수 있다. 본 발명은 이들 첨가제의 선택 사용 및 함량에 대해 특별히 제한을 두지 않으며, 해당업계에 종사하는 전문가 수준에서 사용방법 및 제형에 따라 적절히 조절이 가능하다. 즉, 본 발명의 항균조성물에 첨가되는 첨가제는 통상의 항균제에 포함되는 물질의 예를 들면, 부형제 또는 희석제일 수 있고, 그 예로는 식염수, 완충용액, 덱스트로스, 이소파라핀, 물, 글리세롤, 에탄올이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 결코 아니다.

또한, 본 발명의 항균조성물의 제형은 사용방법 및 용도에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 예컨대 액제, 현탁제, 과립제, 방향수제, 산제, 시럽제, 에어로졸제, 엑스제, 연고제, 유도엑스제, 유제, 전제, 점안제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제일 수 있다.

또한, 본 발명의 항균제 조성물은 병원성 세균이나 독소를 생성시키는 곰팡이의 생성 및 성장을 억제하기 위한 용도로, 세정제, 약제, 식품첨가제, 방향제, 화장제, 도료로 사용 가능하다. 약제로 사용하는 경우 소독제, 치료제, 예방제 등으로 사용 가능하다. 식품 첨가제로 사용하는 경우, 항균 조성물은 식품의 종류 및 사용방법에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다. 방향제로 사용하는 경우, 휘발성 물질을 더욱 포함할 수 있다.

본 발명은 운동선수의 비강세척액을 유효성분으로 함유하는 살균제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 살균제 조성물은 필요한 경우, 담체, 계면활성제 또는 제형 기술분야에서 편리하게 사용되는 보조제와 함께 사용된다. 예를 들어, 이들은 공지 방식에 따라 비개질 형태로 가공되어, 예를 들어 활성 성분을 증량제[예: 용매, 고체 담체 및 적절한 경우 계면활성제]와 균일하게 혼합 및/또는 분쇄한 수화제, 분산성 액제, 유제, 과립수화제, 액상수화제, 오일상 현탁제 등의 제형으로 가공되어 식물체의 엽면 및 줄기에 살포함으로써 사용된다. 투여 회수 및 투여율은 병원균의 생물학적 특성 및 기후 환경에 따라 달라진다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 비강 세척액 (Nasal lavage fluids) 준비 및 수집

이 연구는 중앙 대학교 의과 대학 임상 시험 심사위원회 (132-009-276)의 승인을 받았으며, 참여한 모든 사람들은 사전 동의를 받았다.

주당 30분 미만으로 운동한 6명의 건강한 남성 지원자를 대조군(표 1)으로 하였다. 상기 대조군은 3개월 동안 부상, 흡연, 독감 또는 상부 호흡기 염증이 없는 사람을 대상으로 하였으며, 모든 실험기간 동안 알코올, 카페인 및 강렬한 신체 활동을 금지시켰다.

테스트 당일, 각각 최대 수준 이하(최대 심박수의 70 - 80%)로 유산소 운동 (20℃, 60% 습도, 30분간 러닝)을 수행하였으며, 운동 전후에 비강 세척액을 수집하였다.

또한, 최소 2시간씩 매일 운동하는 12명의 전문 남성 배구선수 지원자를 실험군(표 1)으로 하였으며, 각각 20℃ 및 60% 습도의 기후 조건에서 최대 HR (maximal heart rate)로부터 70-80%로 런닝머신을 30분간 수행하였으며, 각 그룹은 매일 동일한 시간에 운동 실험 및 비강세척액을 수집하였다.

Variables	Non-athletes Mean±SD	Volleyball players Mean±SD
Age, years	32.16±3.92	29.16±4.56
Height, cm	176±5.05	191±8.57
Body weight, kg	72.83±6.52	84.83±9.02
Body mass index, kg/m²	23.53±2.18	23.13±0.97

SD: standard deviation.

2. 세포 배양

사람 코 상피세포 (HNECs)를 PromoCell(Heidelberg, Germany)에서 구입하였으며, 37℃, 5% CO₂가습조건으로 기도 상피세포 성장배지에서 배양하였다.

제조사의 설명서에 따라, 계대배양을 수행하였다. 세포를 95℃에서 45분간 인큐베이션하고, 실험 목적에 따라 열충격 1시간 후 세포를 수확하였다.

3. 상층액 농축

HSP 발현 수준을 확인하기 위해 배양 상층액을 수집하였으며, 수집된 배양 상층액를 이전에 보고되어진 방법에 따라 농축하였다(Min HJ, Ko EA, Wu J, Kim ES, Kwon MK, Kwak MS, et al. J Immunol. 2013;190(4):1797-806.).

간략하게, 사람 코 상피세포 (HNECs)를 6-웰 플레이트에 동일한 개수로 접종하고 열충격을 유도하였다.

배양 상층액 전량을 수집하고 Centrifugal Filter Unit (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA)를 이용하여 농축시켰다. 농축된 시료에 샘플 버퍼를 ×5로 혼합하고 웨스턴블롯을 수행하였다.

4. 웨스턴블롯 (Western blot) 분석

농축된 배약 상층액 시료를 12% SDS-PAGE 겔에 분리시키고, 단백질을 니트로셀룰로스막에 옮겼다. HSP27, HSP70 및 HSP90 (Abcam, Cambridge, UK)에 대한 일차 항체 및 HRP 표시된 고트 항-마우스 Ig (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) 이차 항체와 반응시키고 ECL 시약 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 단백질을 검출하였다.

5. 비강 세척액 수집

종래의 방법으로 6명의 건강한 일반남성 및 12명의 남성 전문 배구선수로부터 비강 세척액을 수집하였다.

간략하게, 주사기를 이용하여 생리식염수 5 ml을 비강에 서서히 주입하였다. 피험자가 바로누운자세를 취함에 따라, 약간의 주입된 생리식염수가 후방 비강기도에서 빠져나갔고, 일부는 중비도 내로 들어가 비강내 처리전 흡입을 통하여 2.5 ml의 코 분비물을 남겼다.

비강액 수집은 앞서 보고된 방법으로 수행되었다 (Min HJ, Kim SJ, Kim TH, Chung HJ, Yoon JH, Kim CH. Laryngoscope. 2015;125(7):E225-30.).

수집 후 즉시 원심분리하여 점액을 제거하고 사용전까지 -70℃에서 저장하였다.

6. HSP27, HSP70, IL-8 및 TNF-α 검출

비강액에서 HSP27, HSP70 및 IL-8의 발현 수준을 상업적으로 이용가능한 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 정량하였다.

7. 박테리아 준비

원심분리를 통한 수집을 위해 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus, 1 × 10⁸ CFU/mL)를 현탁시켰다.

3회 세척 후 살균 식염수 (1 mL)로 재현탁하고 이어지는 실험을 위해 96-웰 플레이트에 10μL (1 × 10⁶ cells)씩 분주하였다.

8. 세척액으로부터 HSP27 및 HSP70의 준비 및 항균 활성 확인

안정된 상태에서 얻은 비강 세척액 (1 mL)으로 전문 배구선수의 기능적 변화를 확인하였다.

시료를 사전에 세척하기 위해, 단백질 G 세파로즈 비드(Sepharose beads, MilliporeSigma)와 인큐베이트하였다. 세척된 시료와 항-HSP27 및 항-HSP70 항체를 하룻밤동안 인큐베이트한 후 원심분리하여 상기 단백질을 제거하고, 상층액을 이용하여 항-박테리아 분석을 수행하였다.

S. aureus (1 × 10⁶ 세포)와 살균 식염수 (10 μL)를 포함하는 배양 웰에 남은 비강액을 100 μL 첨가하였다. 세포를 교반 배양기에서 37℃로 18시간 동안 인큐베이트하고 수집하였다. S. aureus가 포함되어 있는 수집된 액체를 연속적으로 희석하고 brain heart infusion agar 플레이트에서 8시간 배양하여 형성된 콜로니를 계수하였다 (pour plate method).

항-HSP27 및 항-HSP70 항체를 이용하여 HSP27 및 HSP70 단백질을 침전시키고 원심분리하여 제거하였으며, 웨스턴블롯을 수행하여 침전된 단백질을 나중에 확인하였다.

<실시예 1> 일반인의 운동 전후 비강세척액 내 HSP27 및 HSP70 수준 확인

초대 사람 코 상피세포 (HNECs)의 전체 세포 용해물과 배양 상층액에서 HSP의 발현 및 분비를 확인하였다.

전체 세포 용해물의 웨스턴블롯 분석을 수행한 결과, 도 1A와 같이 HSP27 및 HSP70은 매우 높게 발현된 반면 HSP90 발현은 무시될 수준으로 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 1B와 같이 농축된 배양 상층액의 ELISA 분석 결과에서도 HSP27 및 HSP70의 발현이 재확인되었다. 그러나 웨스턴 블롯과 동일하게 HSP90 발현은 확인되지 않았다.

상기 결과로부터 상기도 HSP 발현은 HSP27 및 HSP70에 한정된 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, 일반인(대조군)의 유산소 운동 전후 비강 세척액을 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과 도 2A 및 도 2B와 같이 HSP27는 운동 전 431.68 ± 436.94 pg/mL에서 운동 후 479.75 ± 360.02 pg/mL으로 나타났으며, HSP70은 운동 전 1701.61 ± 2216.63 pg/mL에서 운동 후 1370.82 ± 1874.20 pg/mL로 확인되었다.

상기 결과로부터 HSP27 및 HSP70 발현 수준은 유산소 운동 전과 운동 후 주요한 변화는 확인되지 않았다.

또한, 상기도 염증 신호과정에서 검출되는 IL-8 수준을 확인한 결과, 도 2C와 같이 운동 전 288.94 ± 161.37 pg/mL에서 운동 후 319.70 ± 338.49 pg/mL 수준으로 나타났으며, 앞서 확인된 실험결과와 유사한 것을 확인할 수 있었다.

또 다른 염증 매개체인 TNF-α는 도 2D와 같이 3명의 체액에서만 확인되었으며, 유의한 차이는 나타나지 않았다.

<실시예 2> 전문 배구 선수의 유산소 운동 전후 비강 세척액 내 HSP27 및 HSP70 수준 확인

전문 배구 선수의 유산소 운동 전후 비강 세척액에서 HSP27와 HSP70의 발현 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 2E와 같이 HSP27은 운동 전(158.37 ± 92.08 pg/mL)보다 운동 후(242.23 ± 197.57 pg/mL) 다소 증가하였지만, 전문 배구선수와 대조군 간에 운동 전후 HP27 수준에는 유의미한 차이가 확인되지 않았다.

반면, 도 2F를 참고하면, HSP70은 운동전 (368.50 ± 161.26 pg/mL)보다 운동 후 (282.24 ± 185.71 pg/mL) (p<0.05) 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있다.

IL-8 측정 결과, 도 2G와 같이 운동 전 (83.92 ± 67.58 pg/mL)과 운동 후 (130.14 ± 141.76 pg/mL) 수준이 유사한 것으로 확인되었으며, 또 다른 염증 매개체인 TNF-α은 도 2H와 같이 4명의 체액에서만 확인되었으며, 유의한 차이는 나타나지 않았다.

삭제

<실시예 4> 전문 배구선수의 유산소 운동 후 비강 세척액의 항균활성 증가 확인

항균활성 분석을 통하여 HSP27 및 HSP70의 기능적 역할을 확인하였다.

황색포도상구균 (Staphylococcus aureus, S. aureus)을 운동 후 수집된 비강 세척액과 인큐베이션한 결과, 도 4A와 같이 운동전 수집된 비강세척액과 비교하여 박테리아 수가 감소된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 운동 후 코 속 항균활성이 증가되는 것이 확인되었다.

추가적으로 HSP27 및 HSP70의 항균 가능성을 확인하기 위해, 세척액에서 상기 단백질(항원-항체 복합체)를 침전시켰다.

침전된 항체 결합된 HSP27 및 HSP70를 도 4B(아래)와 같이 웨스턴블롯으로 확인하였으며, HSP27 및 HSP70 제거 시, 도 4B(위)와 같이 운동 후 비강세척액에서 증가된 초기 항균활성은 확인되지 않았다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

유산소 운동 후 운동선수에게서 수집된 비강세척액을 유효성분으로 함유하며, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 나타내는 항균조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 유산소 운동은 최대 심박수의 70 내지 80% 수준의 강도로 30 분간 수행되는 것을 특징으로 하는 항균조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 유산소 운동 후 운동선수에게서 수집된 비강세척액은 유산소 운동 전 수집된 비강세척액과 비교하여 HSP27의 증가 및 HSP70 감소가 나타나는 것을 특징으로 하는 항균조성물.
삭제
유산소 운동 후 운동선수에게서 수집된 비강세척액을 유효성분으로 함유하며, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 나타내는 항균용 가축사료 첨가제.
유산소 운동 후 운동선수에게서 수집된 비강세척액을 유효성분으로 함유하며, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성을 나타내는 살균제 조성물.