CN1984929A - 减少感染性细菌中生物膜形成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供预防或抑制细菌群体形成生物膜的方法，所述方法包括给予该群体抗细菌分泌的内酯或内酯衍生信号分子的抗体。所以本发明也提供治疗生物膜形成中细菌性感染的方法，其中所述生物膜的形成被防止或抑制。

Description

减少感染性细菌中生物膜形成的方法
技术领域
本发明涉及用于控制和治疗患者中细菌感染的方法。本发明提供了治疗应用，所述应用在优选的实施方案中以对酰基高丝氨酸内酯信号分子有亲和性和特异性的免疫球蛋白或免疫球蛋白样受体分子为基础，其中所述信号分子参与细菌细胞间的通讯过程。通过结合这种信号分子，该受体可用于调制参与细菌(如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和/或其他病原菌)环境感应分子的胞外浓度，以便减少或抑制生物膜的形成和毒性，以及生物膜细菌对抗菌剂的相关抗性。
背景技术
目前，在医院中接受治疗的患者中死亡率和发病率的主要原因之一是医源性感染。对这种感染的易感性可以起因于患者最初的不良健康状况、免疫抑制治疗方案或者是引起严重皮肤损害的损伤，诸如烧伤。引起最高比例的病例的细菌是铜绿假单胞菌。它是人类机会病原体的典型。在组织防御受到一定损伤时，几乎任何组织都会受到该细菌感染，但是该细菌几乎从不感染未受损的组织。尽管占有相对小数量的物种，它对人类健康仍造成严重威胁，此后用其作为感染性细菌的代表性例子，但是并不以任何方式限制本发明的范围或程度。
铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)是引起尿路感染、呼吸系统感染、皮炎、软组织感染、菌血症和多种全身性感染的机会病原体，特别是在严重烧伤的受害者中和免疫受抑的癌症和AIDS患者中更是如此。铜绿假单胞菌引起的呼吸道感染几乎仅发生在具有受损的下呼吸道或全身性防御机制的个体中。原发性肺炎在具有慢性肺病和充血性心力衰竭的患者中发生。菌血症肺炎通常在接受化疗的中性粒细胞减少的癌症患者中发生。粘液样铜绿假单胞菌菌株在囊性纤维化病患者下呼吸道的建群是常见的，并且即使不是不能治疗，也是难于治疗的。该细菌主要在免疫受损患者中引起菌血症。诱病条件包括血液病学恶性肿瘤、与AIDS相关的免疫缺陷、中性粒细胞减少症、糖尿病和严重烧伤。大多数假单胞菌属(Pseudomonas)菌血症是在医院和护理院获得的，它占所有医源性革兰氏阴性菌血症的约25％。
由于该细菌外膜LPS提供的渗透性屏障，所以该细菌以其对许多抗生素具有天然抗性而出名，因此是特别危险和可怕的病原体。并且，它倾向于以生物膜形式在表面建群，这使得细胞不会受到治疗浓度的抗生素(Shih和Huang，2002)和宿主吞噬细胞(Wozniak等人，2003)的损害。生物膜被认为在保护细菌免受宿主抵抗中起关键作用。研究发现，从伤口分离出的铜绿假单胞菌能在感染的几个小时内产生胞外多糖荚膜，其特性可能非常有助于成功建群(Harrisson-Baestra等人，2003)。因为其天然栖息地是土壤，与芽胞杆菌、放线菌和霉菌共同生活，所以它已经发展了对这些菌株的各种天然抗生素的抗性。而且，假单胞菌属物种可以维持抗生素抗性质粒，抗性因子(R因子)和抗性转移因子(RTF)，并且能够通过细菌的转导和接合过程转移这些基因。只有少数抗生素对假单胞菌有效，包括氟喹诺酮，庆大霉素和亚胺培南，并且即使这些抗生素也不是对所有株系有效。据报道，在患有急性铜绿假单胞菌感染的患者中庆大霉素和羧苄青霉素的联合是有效的。在囊性纤维化患者中最明显地示例了用抗生素治疗假单胞菌感染的无效性，实际上所有囊性纤维化患者最终都会受具有强烈抗性以致无法治疗的菌株感染。因为抗生素抗性，临床分离物的易感性检测就成为必须。
通常可以从土壤和水及植物和动物表面分离铜绿假单胞菌。在世界上，无论在什么地方，都发现了该细菌的栖息地，所以它确实是“世界性”细菌。有时它作为人类正常菌群的部分存在，但在医院外边在健康个体中建群的盛行程度相对地低(根据解剖地点估计范围在0-24％)。在医院中，已知它定居在食物、水槽、水龙头、拖把、呼吸器及手术器械上。尽管铜绿假单胞菌的建群通常发生在感染以前，但是由于其在环境中普遍存在，此病原体传播的确切来源和模式常常不清楚。在临床基础上怀疑受到感染的重症监护患者中，多达50％的患者没有可确定的感染来源。目前在重症监护室(ICU)中，全世界范围内由于铜绿假单胞菌引起的死亡病例每天有1400例，这使得该细菌成为头号杀手。
铜绿假单胞菌主要是医院病原体。根据CDC，在美国医院中，铜绿假单胞菌感染的总体发生率平均约是0.4％(出院患者中的4‰)，并且该细菌是第四种最常分离的医院病原体，占所有医院获得性感染的10.1％。在全球范围内，该病原体造成16％医院肺炎病例，12％获得性尿路感染，8％手术创伤感染和10％血流感染。免疫受损患者诸如中性粒细胞减少的癌症和骨髓移植患者易受机会铜绿假单胞菌感染，据报道引起30％的死亡。此外，它也与38％呼吸器相关肺炎和AIDS患者中的50％死亡有关。在烧伤病例中，最近由于改进的治疗和饮食变化，铜绿假单胞菌感染已经下降。然而，死亡率仍保持很高，占由于烧伤患者二次感染所致的所有死亡的60％。
铜绿假单胞菌多样性的一个原因是它产生多种多样的毒性决定因子(virulence determinant)，包括弹性蛋白酶、LasA蛋白酶、碱性蛋白酶、鼠李糖脂、类型IV菌毛介导的颤动、绿脓菌荧光素(Williams等人，1996，Stintzi等人，1998，Glessner等人，1999)，绿脓菌素(Brint&Ohman，1995，Reimmann等人，1997)和细胞毒性凝集素PA-I和PA-II(Winzer等人，2000)。现在已知这些毒力决定因子中许多通过群体感应(quorumsensing)，以依赖于细胞密度的方式在遗传水平上受到调节。铜绿假单胞菌具有两种良好表征的群体感应系统，即las和rhl(vsm)系统，这两个系统分别由LuxRI同系物LasRI(Gambello&Iglewski，1991)和RhlRI(VsmRI)(Latifi等人，1995)组成。LasI指导3-氧代-C12-HSL的合成(Passador等人，1993，Pearson等人，1994)，而RhlI指导C4-HSL的合成(Winson等人，1995)。据认为las和rhl系统存在等级，其中las系统对RhlR发挥转录控制作用(Williams等人，1996，Pesci等人，1997)。转录激活物LasR与3-氧代-C12-HSL联合起作用以调节基因表达，其中所述基因编码毒力决定因子弹性蛋白酶、LasA蛋白酶、碱性蛋白酶和外毒素A(Gambello&Iglewski，1991，Toder等人，1991，Gambello等人，1993，Pearson等人，1994)及lasI。弹性蛋白酶能切割胶原蛋白、IgG和IgA抗体、补体，并且有利于细菌粘附到肺粘膜上。与碱性蛋白酶联合导致γ干扰素(INF)和肿瘤坏死因子(TNF)的失活。LasI指导3-氧代-C12-HSL的合成，3-氧代-C12-HSL与LasR一起结合lasI启动子，产生正反馈系统。RhlR转录激活物与其关联AHL(C4-HSL)一起调节rhlAB(鼠李糖脂)、lasB、aprA、RpoS、氰化物，绿脓菌素和凝集素PA-I和PA-II的表达(Ochsner等人，1994，Brint&Ohman，1995，Latifi等人，1995，Pearson等人，1995，Winson等人，1995，Latifi等人，1996，Winzer等人，2000)。由于这些以等级形式存在，其中通过LasR/3-氧代-C12-HSL调节rhlR(Latifi等人，1996，Pesci等人，1997)，故需要这两个系统用于所有上述毒力决定因子的调节。
铜绿假单胞菌诱导的最严重的临床状况之一是囊肿性纤维化(CF)患者的破坏性慢性肺部感染(destructive chronic lung infection)。几乎所有患者的肺部在三岁时就受到感染了(Burns等人，2001)。CF患者的免疫系统不能清除细菌，这导致扩散性组织损伤和呼吸道阻断相关的慢性疾病的发作，这最终导致大部分患者死亡。除了诱导其他群体感应调节毒力因子，长久以来铜绿假单胞菌肺部感染的产生和持续与生物膜表型的发展有关(Singh等人，2000)。群体感应信号易于在受感染小鼠的CF肺部中检测到(Wu等人，2000)。在其他效应之中，在良好表征的铜绿假单胞菌AHL信号分子肺部的产生可以通过调制抗体应答的同种型比率和细胞因子水平来直接影响宿主的免疫应答(Wu等人，2004)。而且，铜绿假单胞菌在生物膜内的生长导致非常高的细胞密度，数量达1×1010个细胞/ml，细胞间增加的物理性接近为提高的细胞与细胞之间通过群体感应的通信和相关毒性因子的产生提供了完美环境。
正在积极地寻求大量不同的方法来开发用于治疗或预防铜绿假单胞菌感染的治疗法。一些方法针对很广的范围，而其他方法针对特定类型的假单胞菌感染。遵循传统途径的方法包括诸如美国专利6,309,651中所述的疫苗开发，及一种有希望的新抗生素药物(SLIT)可以一般性地有效抗革兰氏阴性细菌，但是其主要设计用于抗铜绿假单胞菌，并且通过气雾剂吸入法施用。研究中的另一个发现是以次优生长抑制浓度给药的红霉素抗生素可以同时抑制铜绿假单胞菌血液凝集素、溶血素、蛋白酶和酰基高丝氨酸内酯的产生，并且可用于持续性铜绿假单胞菌感染的治疗。此外，正在检测含有两亲性肽的乳膏制剂是否可作为预防烧伤感染或其他严重皮肤创伤感染的可能方法。美国专利6,309,651也教导了抗铜绿假单胞菌PcrV毒力蛋白的抗体可以提供抗感染保护。
对于将高丝氨酸内酯水平的调节做为控制致病性的手段，也有些兴趣。已经证明一些藻类以及陆生植物产生酰基-高丝氨酸内酯的竞争性抑制剂，诸如，呋喃酮类化合物(Manefield，1999)。这些化合物从AHL信号分子的受体蛋白中置换AHL信号分子，并且可以在AHL生物测定试验中作为激动剂或拮抗剂(Tepletski等人，2000)。用于降低AHL浓度的其他方法包括催化AHL降解的自诱导物(auto-inducer)失活酶(AiiA’s)的研究开发，和通过抗体隐蔽AHL(WO 2004/014423)。与天然AHL竞争结合与细菌上的受体结合的AHL模拟物的研究上兴趣也有提高，但AHL模拟物不引发群体感应调节应答，如生物膜的形成和毒力(Suga和Smith，2003)。
存在与当前正在开发的治疗方法相关的大量潜在的问题和限制。仍然没有证明疫苗是否将是有效的治疗方法。正如由具有高血清效价的抗假单胞菌抗体的持续感染患者所揭示的，铜绿假单胞菌在生物膜生长过程中可以产生能有效地保护细菌免受宿主抗体调理作用的大量粘液样荚膜。这也为细菌提供了抵抗抗生素和其他抗微生物化学药品的保护。已证明当正在生长为生物膜时，铜绿假单胞菌的临床分离物抵抗浓度升高的抗生素，并且，群体感应缺陷突变体产生发育不良的，或者可忽略的多醣，并被更低浓度的抗生素杀死(Shih和Huang，2002)。自诱导物模拟物的应用受限于有效地与AHL竞争受体结合位点所需的浓度和产生副作用的可能性。已知假单胞菌和其他细菌释放的AHL对人体生理学具有多种直接影响。这些影响包括如WO 01/26650中所述的抑制组胺释放。WO 01/74801描述了AHL也能抑制淋巴细胞增殖和下调单核细胞和巨噬细胞的TNF-α分泌，由此充当一般的免疫抑制剂。因此，涉及竞争性AHL模拟物应用的治疗存在可能引起患者免疫系统下调的危险。而一般不希望这种危险存在，特别在免疫受损患者中更是如此。而鉴于该细菌(和其他细菌)具有形成对特定抗生素抗性的显著能力，并且由于生物膜表型提供的抗微生物化学药品的普遍适应力，抗生素的应用至多可以看作短期策略。
铜绿假单胞菌的发病机理显然是多因素的，与该细菌相关的广谱疾病和大量毒性因子突出了这一点。组织入侵和传播及生物膜形成所需的许多细胞外毒性因子受细胞间信号系统的控制，该细胞间信号系统涉及基于高丝氨酸内酯信号分子，和特异性转录激活物蛋白。这些调节系统允许铜绿假单胞菌以协调的依赖于细胞密度的方式适应于毒性形式并克服宿主的防御机制。
需要研发调节致病性中所涉及的HSL和其他细菌细胞信号分子浓度的有效手段，该手段所采用的调节方法没有不利的副作用，并且在可预测的将来也不可能被病原菌逃避。能够预防生物膜在细菌，尤其是铜绿假单胞菌中形成，由此不直接攻击细菌细胞，且因此不会导致抗性菌株的组合物或者化合物，对于疾病状况如CF的治疗及和伤口感染的预防有相当大的好处。本发明提供了这种组合物。
发明概述
本发明提供了通过调节细菌胞外信号分子的胞外浓度来减少病原菌数量的方法。通过去除(结合或者降解)内酯衍生的细胞信号分子，能够抑制生物膜的形成和生物膜样生长，从而提高病原体对抗微生物药物和宿主防御机制的敏感性。尽管其他杀菌处理方法直接作用细胞，导致死亡，本发明靶向胞外信号分子以减少生物膜形成。这样，出现对治疗有抗性的菌株是不太可能的。
本发明的第一方面提供了一种预防或抑制由细菌群体形成生物膜的方法，所述方法包括给予该群体抗细菌分泌的内酯或内酯衍生细胞信号分子的抗体。
该内酯细胞信号分子可以是高丝氨酸分子或肽硫代内酯(peptidethiolactone)分子。高丝氨酸内酯分子可以具有选自以下的通式：
式I
式II
Figure A20058002317300173
式III
其中n是0-12。
通式I的高丝氨酸内酯分子可以是N-丁酰-L-高丝氨酸内酯(BHL)，其中n＝0；N-十二烷酰-L-高丝氨酸内酯(dDHL)，其中n＝8或者正十四烷酰-L-高丝氨酸内酯(tDHL)，其中n＝10。
通式II的高丝氨酸内酯分子可以是N-(-3-氧代己酰)-L-高丝氨酸内酯(OHHL)，其中n＝2或者N-(-3-氧代十二烷酰)-L-高丝氨酸内酯(OdDHL)，其中n＝8。
通式III的高丝氨酸内酯分子可以是N-(-3-羟基丁酰)-L-高丝氨酸内酯(HBHL)，其中n＝0。
肽硫代内酯可以具有如下通式(IV)：
其中X是任意氨基酸，且n是1-10。
合适地，该肽硫代内酯可以是
Figure A20058002317300182
或
或
或
内酯衍生信号分子也可以是呋喃硼酸二酯。呋喃硼酸二酯可以是自动诱导物-2(Auto Inducer-2，AI-2)，
内酯衍生的信号分子也可以是Pro-AI-2或C1-C10饱和或其不饱和的羧酸衍生物
Figure A20058002317300192
发现越来越多的细菌种类在细胞间通讯中使用各种小信号分子。革兰氏阴性细菌主要使用N-酰基高丝氨酸内酯。后者是一组化合物，它们有共同的高丝氨酸内酯环结构，但侧链的长度和结构不同。该组中分成3类，即，酰基-高丝氨酸内酯、3-氧代-高丝氨酸内酯和3-羟基-高丝氨酸内酯。单一物种可以产生和应答一类以上的高丝氨酸内酯成员。铜绿假单胞菌使用几种，并特别使用N-丁酰-高丝氨酸内酯(BHL)、3-氧代-十二酰-高丝氨酸内酯(OdDHL)和N-己酰-高丝氨酸内酯(HHL)。
这些细胞使用这些分子作为确定局部细胞密度的手段，这样在低细胞密度的情况下，信号分子浓度相应地低。在高细胞密度的情况下，局部信号分子浓度高。当该浓度达到阈值水平时，其诱导毒性所涉及的基因的转录和宿主中病状的发作。许多病原菌，包括铜绿假单胞菌能够生长为生物膜。在这种情况下，细胞被包围在胞外多糖基质中。这即提供了抵抗抗微生物药剂的物理屏障又提供了对吞噬作用的抗性，但这导致高局部细胞密度，致使群体感应诱导的机会菌向致病表型的转化。
许多游动细菌具有趋化性系统，据此细胞不仅能够探测多种周围化合物的存在，而且监测它们的浓度梯度并随之调整游动方式。这样，细菌趋向如营养物等刺激物运动，并远离代表不利状况的刺激物。现在已知一些细菌，包括铜绿假单胞菌，对细胞信号分子如AHL表现正向趋化应答(参见实施例，图4)。这种行为在病状产生和发展中非常显著，因为细菌将趋向彼此靠近并向更高浓度的信号分子运动。这将导向局部细胞浓度升高及保护性生物膜更早建立、胞外信号分子浓度的局部水平升高、以及伴随的转化到致病表型的时间缩短。所以本发明的抗体可以用于阻断细菌向其自己的和其他物种的信号分子的趋化应答。
在所调查的每一种生物体中发现细菌信号分子。它看起来是一个普遍的系统，可以应用于每种物种。主要差异在于所有革兰氏阴性(革兰氏-ve)细菌使用基于高丝氨酸内酯的分子，革兰氏阳性(革兰氏+ve)细菌使用(修饰的)小肽。本领域以前的工作集中在用能被识别但没有作用(即无致病转化(Suga和Smith，2003))的分子模拟信号分子，或集中在阻断各种受体系统。这些方法的缺点主要是对模拟或阻断会可以产生抗性，而“真正的”信号分子仍旧存在并将竞争结合。而且，信号分子模拟必须首先进入细菌以接触并结合细胞的受体。此外，一些细菌信号分子如酰基高丝氨酸内酯本身是毒性因子，并可以直接引起宿主(即患者)的免疫抑制。本发明提供了在胞外环境中使用靶向真正的信号分子而不是细胞本身的抗体的方法。该方法相对于本领域之前所有的努力有一个关键的重要优点，即细菌将不会意识到它们正在受到攻击，它们仅会检测到它们是单独存在的。不会有任何抗性选择压力。本发明方法的进一步优点在于其提供了抑制生物膜形成的方法，并同样地提高了现存抗微生物药剂如抗生素的效果，对抗生素来说，出现抗性正成为一个严重的全球性关注问题。
在本发明的方法中，抗体可以是多克隆抗体。备选地，抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是单链抗体(scAb)或抗体片段。抗体片段可以是单链抗体(scAb)或单结构域片段。抗体可以是人抗体或抗体可以是人源化抗体构建体。
在本发明的某些优选实施方案中，抗体可以是单链抗体(scAb)，如G3H5、G3B12、G3G2和/或G3H3，保藏号分别为NCIMB-41167、NCIMB-41168、NCIMB-41169、NCIMB-41170。抗体G3B12也称为Hap2，抗体G3G2也称为Hap5。
如上讨论，本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将抗原注射到适宜的动物宿主(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、绵羊、鸡、山羊或猴子)中刺激宿主中多克隆抗体的产生而形成。如果必要，佐剂可以与抗原一起给药。然后，可以利用抗体与抗原的结合或如下所述方法纯化抗体。单克隆抗体可以从杂交瘤产生。通过融合骨髓瘤细胞和产生期望抗体的B淋巴细胞形成无限增殖细胞系，可以产生杂交瘤。这是熟知的Kohler&Milstein技术(Nature 256 52-55(1975))。
现在，本领域已经很好地开发了制备结合特定蛋白质的单克隆和多克隆抗体的技术。在标准免疫学教科书中，例如在Roitt等人，Immunology第二版(1989)，Churchill Livingstone，London中有相关讨论。
除了完整抗体，本发明还包括能结合抗原的抗体衍生物。因此，本发明包括抗体片段和合成构建体。Dougall等人在Tibtech 12 372-379(1994年9月)中给出了抗体片段和合成构建体的例子。抗体片段包括，例如Fab，F(ab′)2和Fv片段(参见Roitt等[上引文])。可以修饰Fv片段以产生称为单链Fv(scFv)分子的合成构建体。这包括共价连接VH和VL区域的肽接头，该肽接头有助于该分子的稳定性。因此，本发明也延及单链抗体或scAb。
其他合成构建体包括CDR肽。这些是包含抗原结合决定簇的合成肽。也可以使用肽模拟物。这些分子通常是构象限定的有机环，该有机环模拟CDR环结构，并且包含可与抗原相互作用的侧链。合成构建体也包括嵌合分子。因此，例如，人源化(或灵长类化)抗体或其衍生物也在本发明范围内。人源化抗体的例子是具有人类构架区，但是啮齿类动物高变区的抗体。合成构建体也包括包含共价连接的部分的分子，该部分除了抗原结合特性外，还提供给该分子一些期望的特性。例如，该部分可以是标记物(例如，可检测的标记，诸如荧光或放射性标记)或者是药物学上的活性剂。
为了产生抗细菌信号分子的抗体，优选将靶分子，或适合的衍生物缀合到两种不同的载体分子(蛋白质)上，但也可以使用一种缀合分子。一般地，细菌信号分子太小而不能刺激体内免疫应答或者直接用做抗原来源用于从抗体库筛选高亲和力的抗体。在优选的实施方案中，利用特异性结合对(sbp)的第一成员的集合(文库)，例如在丝状噬菌体表面展示的抗体文库，进行细胞信号分子(此后称为“抗原”)特异性抗体的筛选。允许从受体文库筛选特异性受体的任何其他系统也可以应用于本发明的方法。在另一个实施方案中，可以从用抗原缀合物免疫的动物产生的一组抗体分泌杂交瘤细胞系选择信号分子特异性克隆。为了一般示例的目的，将使用噬菌体颗粒上展示的抗体结合位点文库为例子。
将包含与适宜载体分子缀合的抗原的缀合物(此后称为“缀合物1”)固定到适合的固相支持体，诸如“免疫试管(immunotube)”或微量滴定板上，并且用非特异性封闭剂诸如干奶粉封闭未包被的表面，其中所述载体分子可以是蛋白质、肽或任何天然或合成的化合物或物质。适合的缀合物分子可以包括，但不限于蛋白质诸如牛血清白蛋白(BSA)，匙孔戚血蓝蛋白(KLH)，牛甲状腺球蛋白(TG)，卵白蛋白(Ova)，或者非蛋白质诸如生物素。选择缀合物分子时仅有的限制是它可以以一定的方式固定，并且就免疫而言其足够大以致可以激发免疫应答。
将特异性结合对(sbp)的第一成员的文库(“文库”)应用于固定的缀合物，并且温育足够的时间使得识别缀合物1的sbp成员可以发生结合。通过严格洗涤移除不识别缀合物的噬菌体。例如用三乙胺或其他适合的试剂将保持结合的噬菌体洗脱到缓冲液中以恢复中性pH。然后，用回收的噬菌体颗粒感染适合的宿主生物体，例如大肠杆菌(E.coli)细菌，并且培养它们以扩增每个选定成员的数量，并且由此产生第二“富集”文库。然后，利用富集文库重复该方法以筛选识别缀合第二载体蛋白质的抗原(缀合物2)的噬菌体抗体(“噬菌体”)。
根据需要进行另外的循环，改变筛选方法以有利于选择识别游离抗原的sbp成员。对于每个随后的循环，首先利用缀合物1，并交替使用缀合物2(如果可获得的话)，如前所述筛选抗抗原缀合物的噬菌体。通过与游离抗原溶液或者缀合了小的可溶性标记部分(例如生物素)的抗原溶液温育足够长时间，使对结合形式的抗原具有较高亲和力的sbp成员从固定化的缀合物上解离下来，从而洗脱结合的噬菌体。用游离抗原洗脱的噬菌体感染大肠杆菌细胞以进行扩增和再次筛选，同时弃掉与固定化抗原保持结合的噬菌体。做为可替代的方案，但不是太优选的方案，可以例如，利用低pH洗脱结合缀合物的所有抗体。
从每轮筛选选择具有期望结合特征的各单个(单克隆)噬菌体克隆。可以根据需要，通过本领域普通技术人员熟悉的各种方法进行这种筛选，所述方法包括技术诸如SPR(表面等离子体共振)和ELISA(酶联免疫吸附测定法)。筛选标准将包括在缀合衍生物存在的情况下，优先结合游离可溶形式抗原的能力。
在本发明优选的实施方案中，从幼稚(naive)人抗体噬菌体展示文库(McCafferty等人，1990；和WO 92/01047中所述)产生抗体。因此，可以将抗体给予患者，而不会引起免疫应答。在另一实施方案中，从用AHL的一个或多个缀合物和合适的载体分子预免疫的动物中构建库。另一个备选方案是从上面描述的免疫动物产生杂交瘤细胞系。在后两种情况下，优选地，采取措施，例如通过产生宿主动物-人嵌合抗体，或者通过将CDR嫁接到适宜的抗体构架支架上进行“人源化”，以减少所得抗体的免疫原性。可用的其他方法将包括抗体内潜在T细胞表位的鉴定，和例如通过定点诱变随后将这些表位移除(去免疫)。在另一个实施方案中，抗体可以被改造以包含来自不同类人免疫球蛋白(IgG，IgA等)的恒定区，并且在动物细胞中做为完整抗体分子产生。尤其在治疗使用这些抗体时，这些方法是期望的。在设想鼻内/气溶胶应用中，例如在治疗囊肿性纤维化患者的铜绿假单胞菌感染的情况下，优选使用分泌型IgA同种型抗体。
对于本发明，抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是人类的或人源化的。可以使用抗体片段或衍生物，诸如Fab，F(ab′)下标2(也写做F(ab′)2)，Fv或scFv，也可以使用单链抗体(scAb)诸如Huston等人(Int.Rev.Immunol.10：195-217，1993)所述的那些，结构域抗体(dAbs)，例如单结构域抗体，或抗体样单结构域抗原结合受体。除了抗体外，可以设计抗体片段和免疫球蛋白样分子、肽模拟物(peptidomimetics)或非肽模拟物，以模拟抗体的结合活性并抑制或防止细菌形成生物膜。
制备合适的抗体后，可以通过几种常用的技术之一(例如，在Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane编著.Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988)中所述)分离或纯化它。一般地，适合的技术包括肽或蛋白质亲和柱子，HPLC或RP-HPLC，蛋白质A或蛋白质G柱子上的纯化或这些技术的联合。根据标准方法，可以制备重组抗体，并且利用一般可用的方法包括ELISA、斑点印迹测定法等可以检测其特异性。
细菌可以是革兰氏阴性细菌菌种或革兰氏阳性细菌菌种。细菌可以选自：伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布鲁氏菌属物种(Brucella sp.)、弯曲杆菌属物种(Campylobacter sp.)、二氧化碳嗜纤维菌属物种(Capnocytophaga sp.)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、杜氏嗜血菌(Haemophilusducreyi)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、金氏金氏菌(Kingella kingae)、肺炎性军团杆菌(Legionellapneumophila)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、柠檬酸细菌属物种(Citrobacter sp.)、肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、变形菌物种(Proteus sp.)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、志贺氏菌属物种(Shigella sp.)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)  、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、韦荣氏球菌属物种(Veillonella sp.)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)、普氏菌属物种(Prevotella sp.)、梭杆菌属物种(Fusobacterium sp.)、减小螺菌(Spirillumminus)、气单胞菌属物种(Aeromonas sp.)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)、黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、Xanthomonasmaltophila、嗜麦芽黄杆菌(Stenotrophomonas maltophila)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、梭菌属物种(Clostridium spp.)和链球菌属物种(Stretococcus spp.)。
本发明这一方面的方法也可以包括抗生素的施用。抗生素可以是β-内酰胺抗生素，如青霉素或青霉素衍生物、卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、氟喹诺酮、庆大霉素、亚胺硫霉素、和/或羧苄青霉素、或其组合。
根据本发明第二个方面，提供了一种用于防止或抑制在受试体中细菌群体形成生物膜的方法，所述方法包括本发明第一方面方法相关的以上定义抗体的施用。
该方法也可以包括抗生素的施用。抗生素可以与抗体同时施用，或可以在所述抗体的所述施用之前或之后施用。本发明这一方面的方法同样适用于人药或兽药。
依据本发明这一方面的实施方案也延及本发明第一方面方法相关的以上定义抗体在制备用于防止或抑制细菌群体形成生物膜的药物中的应用。
根据本发明的第三个方面，提供了以防止或抑制细菌群体形成生物膜的药盒，其包含本发明第一方面方法相关的以上定义抗体和用于单独、随后或同时施用的抗生素。合适地，该药盒将包含用于本发明方法的说明书。
根据本发明的第四个方面，提供了本文定义的抗细菌分泌的内酯或内酯衍生的细胞信号分子的抗体，用于预防或抑制由细菌群体形成生物膜。
根据本发明的方法和用途可以涉及本文所述抗体的配制，以及任选其他作为药学组合物的药学活性物质(如抗生素)的配制。通过药学领域已知的任何方法，例如在无菌条件下混合活性成分与一种或多种载体、稀释剂或者赋形剂可制备这种组合物。
抗体用做为无菌药物组合物的一部分，该组合物通常包括可药用载体。该药物组合物可以是任何适合的形式(这取决于将它给予患者的期望方式)。
药物组合物可适于通过任何适合途径给药，例如通过口服(包括口腔或舌下服用)、直肠、鼻、局部(包括口腔，舌下服用或经皮)途径、阴道或胃肠外途径(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)。可以通过制药领域已知的任何方法，例如通过在无菌条件下混合活性组分和一种或多种载体或赋形剂制备这种组合物。
适合口服给药的药物组合物可以采取的形式有离散单元诸如胶囊或片；粉末或颗粒；溶液、糖浆或混悬剂(在水或非水液体中；或者作为可食用的泡沫或搅拌物(whips)；或者作为乳剂)。
用于片剂或硬明胶胶囊的适合赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐。与软明胶胶囊一起使用的适合赋形剂包括例如植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。为了制备溶液和糖浆，可以使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。为了制备混悬剂，可以使用油(例如植物油)以提供水包油或油包水混悬剂。
适合经皮施用的药物组合物可以为离散贴剂，意在与与体表皮紧密地长期接触。例如，可以一般地如Pharmaceutical Research，3(6)，第318页(1986)中所述，通过离子电渗疗法从贴剂递送活性组分。
适合局部施用的药物组合物可以制备成软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油。对于眼睛或其他外部组织，例如嘴和皮肤的感染，该组合物优选以局部用软膏剂或乳膏形式施用。当制备成软膏剂时，活性组分可以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。做为可替代的方案，活性组分可以用水包油型乳膏剂基质或油包水型基质配制成乳膏剂。适于眼睛局部施用的药物组合物包括滴眼剂，其中活性组分溶解或悬浮在适合载体中，特别是水性溶剂中。适于口中局部施用的药物组合物包括糖锭、锭剂、漱口剂。
适于直肠施用的药物组合物可以为栓剂或灌肠剂。
适合经鼻施用、其中载体是固态的药物组合物包括粒度在例如20-500微米之间的粗粉末，该组合物采用鼻子吸气的方式施用，即通过鼻腔从紧靠鼻子的粉末容器快速吸入。其中载体是液态、以鼻喷雾剂或者滴鼻剂施用的合适组合物包括活性成分的水溶液或者油溶液。
适合吸入施用的药物组合物包括可通过多种类型的定量加压气雾剂(aerosol)、喷雾器或者吹入器的方式产生的细尘粒或者雾。
适合阴道施用的药物组合物可以是阴道栓剂、卫生栓、乳膏剂、凝胶剂、糊剂或者喷雾制剂。
适合肠胃外施用的药物组合物包括水性和非水性的无菌注射溶液，该溶液可以含有使制剂与预期受体的血液基本等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂；和水性和非水性无菌混悬剂，该混悬剂可以包括悬浮剂和增稠剂。可以用于注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干的)条件下贮藏，只需在临使用前添加例如注射用水之类的无菌液体载体。可以从无菌粉末、颗粒和片剂制备即用配制的注射溶液和混悬剂。
药物组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、增味剂、盐(本发明物质本身即可以以药物学可接受盐的形式提供)、缓冲液、包衣剂或抗氧化剂。除了本发明的物质外，它们也可以含有其他治疗活性剂。
可以施用本发明抗体(或等同物)以治疗细菌感染，或者用做高危感染者的预防性措施。在已经存在感染的情况下，可以单独或者联合抗菌抗体或抗生素或其他抗微生物疗法施用抗体。抗AHL抗体联合其他疗法可以允许使用较短疗程或较低剂量进行治疗，由此降低出现抗性的风险并且提高患者的顺应性。
根据待治疗的疾病或失调，待治疗个体的年龄和状况等，可以在宽范围内改变药物组合物的剂量，并且医师将最终确定适合的使用剂量。这种组合物可以制成人药或兽药。除了本发明上下文明确地表示外，本申请应该解释为等同地应用于人类及动物。治疗可以是预防疾病或视存在的情况而定。治疗也可以用于加强现存治疗的效果。
该组合物可以以单位剂量形式提供，通常地在密封容器中提供并且可以做为药盒的一部分提供。这种成套药盒通常(尽管不是必需的)包括使用说明书。它可以包括多个所述单位剂量形式。
本发明的方法可用于细菌引起的短期或长期、急性或慢性疾病症/疾病。在优选的实施方案中，本发明的方法和用途可以针对病原铜绿假单胞菌引起的感染，尤其涉及患有囊肿性纤维化的患者。另外，本发明的方法尤其针对细菌细胞信号分子，而不是主要针对细菌细胞本身，所以不会给细菌群体造成选择性压力以形成对所述治疗的抗性。
可以向感染的患者施用抗体以便通过减少生物膜形成来调制和降低细菌感染。这包括由囊肿性纤维化患者以气雾剂形式吸入抗体或给伤口局部施用以提高平均寿命。
还在另一个实施方案中，可以向个体或患者施用细胞信号分子与免疫原性蛋白质的缀合物以刺激抗内酯信号分子的免疫反应，引起中和抗体产生。
在另一个实施方案中，另一个方法可以应用于从患者血液中移除细菌细胞间信号分子，以减少感染性微生物中生物膜的形成，来降低毒力并导致细菌对杀菌剂和宿主防御机制具有提高的敏感性。用其他天然受体(如抗体或其片段)或基于结合所述内酯信号分子的天然分子的分子可以达到该目的。做为可替代的方案，可以应用非天然受体诸如分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)。已经证明这类受体能特异性地结合小分子量生物分子诸如药物(Hart等人，2000)和类固醇(Whitcombe等人，1995；Ramstrom等人，1996；Rachkov等人，2000)。
在另一个实施方案中，受体可以具有催化或酶促活性，能将内酯信号分子转化为靶生物体不再识别的形式。
根据本发明的第五方面，提供了本文定义的用于抑制或防止细菌对细胞信号分子的趋化应答的抗体。该用途延及抑制或防止细菌对细胞信号分子的趋化应答，该方法包括施用组合物的步骤，所述组合物包含抗本文定义的细菌群体的抗体。
本发明的第二个和随后方面的优选特征是对第一方面的修正。
本发明的其他目的、特征和优点，包括但不限于在动物宿主中的相关应用，在本领域技术人员阅读本发明说明书和权利要求书后，将是显而易见的。
本领域普通技术人员将明了，本文公开的组合物和方法可以应于大范围的生物体中以抑制生物膜形成，并调节或治疗由感染引起的状况。本发明的组合物和方法参考铜绿假单胞菌进行描述，但是将本文的目的应用到其他物种是本领域普通技术人员之能力所及的范围。
现在，通过参考下面详细的非限制性实施例和附图，将进一步描述本发明。
附图说明
图1显示与没有抗体(□)或无细菌细胞(○)存在的对照相比，不同浓度抗-AHL单链抗体片段(scAb)Hap-2(●)对铜绿假单胞菌PA14的生物膜生长发展的影响。
图2显示在6小时时，与只有细菌(■)和只有PBS(□)的对照相比，Hap-2 scAb(●)、四环素()、Hap-2+四环素(○)对生物膜形成的影响。
图3显示与没有抗体(□)、只有抗体 和没有细菌(□)的对照相比，Hap-2(■)抑制生物膜的时间过程。
图4显示游动铜绿假单胞菌向不同浓度群体感应信号分子己酰高丝氨酸内酯(HHL)的运动。
实施例1：抗-AHL抗体的产生
针对酰基-高丝氨酸内酯dDHL(十二烷酰高丝氨酸内酯)的缀合物筛选幼稚然人抗体噬菌体展示文库。简单来说，使用公知的化学方法将酰基链末端含有一个羧基的dDHL的衍生物与载体蛋白质牛血清白蛋白(BSA)和牛甲状腺球蛋白(TG)缀合。针对每个缀合物交替筛选(淘选)抗体文库三轮，将与缀合物结合的那些噬菌体分离、扩增，然后用于后一轮筛选。在第一轮筛选后回收和扩增所有结合的噬菌体。在第二轮和第三轮筛选后。通过周游离的可溶性天然dDHL的溶液温育，从固定的缀合物上洗脱结合的噬菌体。来自第三轮的单克隆噬菌体抗体被首先筛选与两个AHL缀合物的结合作用，以及与单独的载体蛋白质的结合作用。进一步通过竞争性结合ELISA筛选那些仅仅与缀合的抗原结合的克隆结合游离dDHL的能力。分离到命名为Hap 2的克隆，在存在游离dDHL和游离BHL(N-丁基-高丝氨酸内酯)的情况下，其与dDHL缀合物的结合受到抑制。
测定生物膜产生
根据Conway等人，2002年描述的方法，通过评价生长细胞附着于聚丙烯96孔微量滴定板表面的能力测量由铜绿假单胞菌形成的生物膜。铜绿假单胞菌株PA14接种到5ml LB培养液中并在37℃下培养过夜。第二天，将该细菌以1％接种到含有100μl/孔LB培养液的96孔组织培养板中，并在37℃的加湿环境中培养过夜。使用基本培养基(LB)防止生物膜形成。
将平板以2,500转/分钟离心10分钟，吸去上清，小心不要干扰沉淀的细胞。然后将细胞用100μl/孔的脑/心肉浸汁原位重悬浮。在37℃下培养2小时。除去培养液，并用200μl/孔去离子H2O洗涤这些孔以去除任何残留的浮游生物细胞，要小心以避免干扰任何已经形成的生物膜。加入125μl/孔1％的结晶紫溶液并随后在室温下培养15分钟来为附着细胞(生物膜)染色。然后用去离子H2O全面洗涤平板以去除过量染料。用200μl/孔95％乙醇将测量生物膜生长程度的结晶紫染色剂复原。125μl乙醇/结晶紫的吸光度在590nm处测量。
生物膜的抑制
按照以上描述进行生物膜测验。当沉淀的细菌在脑/心肉浸汁重悬浮时，进一步的加入物由100μl/孔PBS中的Hap2单链抗体片段(scAb)或PBS单独制成。
i)生物膜抑制的滴定
在平行孔中建立Hap-2抗-AHL scAb稀释系列，以测定抗体浓度对由铜绿假单胞菌PA14形成生物膜的影响。如上所述继续培养2小时，并由固定在各种scAb浓度上的结晶紫染料的量测定Hap2的加入对生物膜形成的影响。进行对照实验，其中或者由PBS代替scAb，或者也将细菌省略以评价多少染料被动吸附在平板上。结果清楚地证明Hap2的加入引起浓度依赖的生物膜抑制(图1)。70nM scAb的浓度足以减少大约80％的生物膜。
ii)抗体和四环素的影响
已知抗生素四环素抑制生物膜在假单胞菌属物种中形成。基本上如上述进行生物膜测验，但是在生物膜抑制出现的情况下将用于培育的孵育时间延长到6小时。除了scAb的稀释系列，也用四环素的稀释系列处理平行孔。另一组孔用scAb及四环素共同培养。结果显示，当在延长的时间内scAb和四环素都对减少生物膜形成有效时，二者组合提供了在低浓度下的累加效果(图2)。
iii)生物膜抑制的时间过程
经过4小时的时间进行测验，并在几个时间点取得样品读数来评价scAb得加入随时间对生物膜形成的影响。浓度为70nM的抗-AHL scabHap-2与包含不存在scAb，及scAb和PBS单独对结晶紫吸附影响的培养物的对照比较(图3)。结果显示当生长在丰富培养液中时，细菌细胞非常迅速地附着到表面上，并Hap-2随时间逐渐减少快速形成的生物膜。
实施例2：在群体感应和趋化性之间建立联系
进行测验以测定是否铜绿假单胞菌不仅能通过改变其表型来对AHL细胞信号分子的出现作出响应，而且能通过AHL分子导向探测和向源头运动积极地找出同伴细菌。
用中心穿孔器(core-borer)在LB琼脂平板的边缘处，在平板上切四个彼此成90°、放射状的孔。将100微升HHL(己酰高丝氨酸内酯)以各种浓度用于三个孔中的每个。将PBS加入第四个孔中作为对照。将20微升培养过夜的铜绿假单胞菌PA141的1％接种物点在平板中心，与各个孔等距，并将平板在37℃下培养过夜。
除了将细菌用于平板上的中心斑点外，在离中心不同距离处发现了大量菌群。它们来自以固着方式居留和生长之前转移穿过琼脂表面的游动细胞。将平板划分为四个相等的象限，以便每个孔与每个毗邻象限等距。将位于每个象限的菌群计数。结果显示铜绿假单胞菌显示了对HHL的存在趋化应答，游向HHL的细胞数量与孔中所用的浓度成比例，并因此与浓度梯度的强度成比例(图4)。
引用的参考文献
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Claims (45)

1、一种预防或抑制细菌群体形成生物膜的方法，所述方法包括给予所述群体抗细菌分泌的内酯或内酯衍生信号分子的抗体。
2、根据权利要求1所述的方法，其中所述内酯信号分子是高丝氨酸内酯分子或肽硫代内酯分子。
3、根据权利要求2所述的方法，其中所述高丝氨酸内酯分子具有选自以下的通式：
Figure A2005800231730002C1
式I
式II
式III
其中n＝0-12。
4、根据权利要求3所述的方法，其中所述通式I的高丝氨酸内酯分子是N-丁酰-L-高丝氨酸内酯(BHL)，其中n＝0；N-十二烷酰-L-高丝氨酸内酯(dDHL)，其中n＝8和正十四烷酰-L-高丝氨酸内酯(tDHL)，其中n＝10。
5、根据权利要求3所述的方法，其中所述通式II的高丝氨酸内酯分子是N-(-3-氧代己酰)-L-高丝氨酸内酯(OHHL)，其中n＝2和N-(-3-氧代十二烷酰)-L-高丝氨酸内酯(OdDHL)，其中n＝8。
6、根据权利要求3所述的方法，其中所述通式III的高丝氨酸内酯分子是N-(-3-羟基丁酰)-L-高丝氨酸内酯(HBHL)，其中n＝0。
7、根据权利要求2所述的方法，其中所述肽硫代内酯分子具有如下通式：
Figure A2005800231730003C1
其中X是任何氨基酸，并n是1-10。
8、根据权利要求7所述的方法，其中所述肽硫代内酯分子是：
Figure A2005800231730003C2
或
或
或
9、根据权利要求1所述的方法，其中所述内酯衍生信号分子是呋喃硼酸二酯。
10、根据权利要求9所述的方法，其中所述呋喃硼酸二酯是自动诱导物-2(AI-2)，
11、根据权利要求1所述的方法，其中所述内酯衍生的信号分子是Pro-AI-2或其C1-C10饱和或不饱和的羧酸衍生物
12、根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
13、根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
14、根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述抗体是单链抗体(scAb)。
15、根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗体片段。
16、根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体片段是单链抗体(scAb)。
17、根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体片段是单结构域片段。
18、根据权利要求16所述的方法，其中所述单链抗体(scAb)是保藏号分别为NCIMB-41167、NCIMB-41168、NCIMB-41169、NCIMB-41170的G3H5、G3B12、G3G2和/或G3H3。
19、根据权利要求1到18中任一项所述的方法，其中所述细菌选自：伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布鲁氏菌属物种(Brucella sp.)、弯曲杆菌属物种(Campylobacter sp.)、二氧化碳嗜纤维菌属物种(Capnocytophaga sp.)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、杜氏嗜血菌(Haemophilusducreyi)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、金氏金氏菌(Kingella kingae)、肺炎性军团杆菌(Legionellapneumophila)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、柠檬酸细菌属物种(Citrobacter sp.)、肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、变形菌物种(Proteus sp.)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、志贺氏菌属物种(Shigella sp.)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、韦荣氏球菌属物种(Veillonella sp.)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)、普氏菌属物种(Prevotella sp.)、梭杆菌属物种(Fusobacterium sp.)、减小螺菌(Spirillumminus)、气单胞菌属物种(Aeromonas sp.)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)、黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、Xanthomonasmaltophila、嗜麦芽黄杆菌(Stenotrophomonas maltophila)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、梭菌属物种(Clostridium spp.)和链球菌属物种(Stretococcus spp.)。
20、根据权利要求1到19中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括抗生素的施用。
21、用于防止或抑制细菌群体在受试体内形成生物膜的方法，所述方法包括施用权利要求1到18中任一项定义的抗体。
22、根据权利要求21所述的方法，其中所述方法进一步包括抗生素的施用
23、一种防止或抑制细菌群体形成生物膜的成套药盒，其包含权利要求1到18中任一项定义的抗体以及单独、随后或同时施用的抗生素。
24、权利要求1到18中任一项定义的抗体在制备用于防止或抑制细菌群体形成生物膜的药物中的用途。
25、抗细菌分泌的内酯或内酯衍生信号分子的抗体在防止或抑制细菌群体形成生物膜中的用途。
26、根据权利要求25所述的抗体的用途，其中所述内酯信号分子是高丝氨酸内酯分子或肽硫代内酯分子。
27、根据权利要求26所述的抗体的用途，其中所述高丝氨酸内酯分子具有选自以下的通式：
Figure A2005800231730006C1
式I
Figure A2005800231730006C2
式II
式III
其中n＝0-12。
28、根据权利要求27所述的抗体的用途，其中所述通式I的高丝氨酸内酯分子是N-丁酰-L-高丝氨酸内酯(BHL)，其中n＝0；N-十二烷酰-L-高丝氨酸内酯(dDHL)，其中n＝8和正十四烷酰-L-高丝氨酸内酯(tDHL)，其中n＝10。
29、根据权利要求27所述的抗体的用途，其中所述通式II的高丝氨酸内酯分子是N-(-3-氧代己酰)-L-高丝氨酸内酯(OHHL)，其中n＝2和N-(-3-氧代十二烷酰)-L-高丝氨酸内酯(OdDHL)，其中n＝8。
30、根据权利要求27所述抗体的用途，其中所述通式III的高丝氨酸内酯分子是N-(-3-羟基丁酰)-L-高丝氨酸内酯(HBHL)，其中n＝0。
31、根据权利要求26所述的抗体的用途，其中所述肽硫代内酯分子具有如下通式(IV)：
其中X是任何氨基酸并n是1到10。
32、根据权利要求31所述的抗体的用途，其中所述肽硫代内酯分子为：
或
Figure A2005800231730007C3
或
或
33、根据权利要求26所述的抗体的用途，其中所述内酯衍生的信号分子是呋喃硼酸二酯。
34、根据权利要求33所述的抗体的用途，其中所述呋喃硼酸二酯是自动诱导物-2(AI-2)，
35、根据权利要求26所述的抗体的用途，其中所述内酯衍生信号分子是Pro-AI-2或其C1-C10饱和或不饱和的羧酸衍生物
Figure A2005800231730008C3
36、根据权利要求26-35中任一项所述的抗体的用途，其中所述抗体是多克隆抗体。
37、根据权利要求26-35中任一项所述的抗体的用途，其中所述抗体但单克隆抗体。
38、根据权利要求26-35中任一项所述的抗体的用途，其中所述抗体是单链抗体(scAb)
39、根据权利要求26-35中任一项所述的抗体的用途，其中所述抗体是抗体片段。
40、根据权利要求39所述的抗体的用途，其中所述抗体片段是单链抗体(scAb)。
41、根据权利要求39所述的抗体的用途，其中所述抗体片段是单结构域片段。
42、根据权利要求40所述的抗体的用途，其中所述单链抗体(scAb)是保藏号分别为NCIMB-41167、NCIMB-41168、NCIMB-41169、NCIMB-41170的G3H5、G3B12、G3G2和/或G3H3。
43、根据权利要求25到42中任一项所述的方法，其中所述细菌选自组：伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布鲁氏菌属物种(Brucella sp.)、弯曲杆菌属物种(Campylobacter sp.)、二氧化碳嗜纤维菌属物种(Capnocytophaga sp.)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、杜氏嗜血菌(Haemophilusducreyi)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、金氏金氏菌(Kingella kingae)、肺炎性军团杆菌(Legionellapneumophila)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、柠檬酸细菌属物种(Citrobacter sp.)、肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、变形菌物种(Proteus sp.)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、志贺氏菌属物种(Shigella sp.)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、韦荣氏球菌属物种(Veillonella sp.)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)、普氏菌属物种(Prevotella sp.)、梭杆菌属物种(Fusobacterium sp.)、减小螺菌(Spirillumminus)、气单胞菌属物种(Aeromonas sp.)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)、黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、Xanthomonasmaltophila、嗜麦芽黄杆菌(Stenotrophomonas maltophila)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、梭菌属物种(Clostridium spp.)和链球菌属物种(Stretococcus spp.)。
44、抗细菌分泌的内酯或内酯衍生信号分子的抗体在抑制或阻止细菌对细胞信号分子的趋化应答中的用途。
45、一种抑制或阻止细菌对细胞信号分子的趋化应答的方法，所述方法包括给予所述细菌群体组合物的步骤，所述组合物包含抗细菌分泌的内酯或内酯衍生信号分子的抗体。
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