CN110461343A - 用于保护或治疗细菌感染患者的具有杀菌或抑菌特性的细胞外基质组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种利用由非上皮组织和上皮组织获得的消化的或非消化的细胞外基质材料，从而减轻和治疗人和动物的细菌感染的制剂和方法。

Description

用于保护或治疗细菌感染患者的具有杀菌或抑菌特性的细胞 外基质组合物

技术领域

本文中描述的发明涉及用于治疗人和动物的细菌感染的组合物、其制备方法和使用方法。

相关申请

本申请要求于2017年3月31日提交的美国临时申请No.62/479,888的优先权和权益，出于所有的意图和目的，其全部内容以引用方式并入本文。

背景技术

细菌感染常常会对患者的烧伤、慢性创面以及组织和器官的其他细菌感染(如肺炎)的愈合过程造成危害。然而，通常使用的预防性抗生素(如外用磺胺嘧啶银)会伴随烧伤创面感染率增加、治疗失败以及住院时间延长。理想地，有利的是在体内使用具有细菌生长抑制活性的组合物，以治疗具有局部细菌感染和全身细菌感染的烧伤创面。在这种情况中，优选通过使用这种组合物进行治疗，能够减少或消除对额外的抗生素应用的需求。下面描述了用于实现上述有益效果的组合物和方法。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种革兰氏阳性球菌，其常见于人的鼻子、呼吸道和皮肤，并且为创伤或手术后感染的常见原因之一。由于目前可获得的抗生素的广泛使用以及细菌演化，近年来出现了耐抗生素的革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniaestrains)。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是对β内酰胺类抗生素具有耐药性的任何金黄色葡萄球菌菌株，其中β内酰胺类抗生素包括青霉素类(甲氧西林、双氯西林、苯唑西林等)和头孢菌素。不能对抗这些抗生素的菌株被分类为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌或MSSA。关于MRSA对于人类健康的总体影响的最为显著的发展是其作为社区获得性感染的威胁越来越大。在过去的二十年间，MRSA由院内感染(65％的MRSA病例发生于医院环境，并且会使患者感染)发展为主要是社区获得性疾病，其使原本健康的个体受到感染并且常常会产生致命的结果。人们需要一种用于预防和治疗人和动物的此类感染的改进方法。

绿脓杆菌(PA)是一种革兰氏阴性的杆状菌，其会使人和动物患有多种传染性疾病。人们开始认识到绿脓杆菌是一种临床意义上新出现的条件致病菌，其常常会造成院内感染。对于免疫受损个体，绿脓杆菌感染是会危及生命的疾病，并且绿脓杆菌的定殖在囊性纤维化患者中是严重问题。一些流行病学研究表明，由于绿脓杆菌在暴露于抗菌剂之后会产生新的耐药性，因此在绿脓杆菌的临床分离中，抗生素抗药性在不断增加。

克雷伯氏菌(Klebsiella，KP)也是常见的革兰氏阴性致病菌，其会导致社区获得性细菌肺炎和8％的所有医院获得性感染。感染了肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的肺部感染常常是坏死性感染。观察到在酒精中毒患者中，社区获得性肺炎克雷伯氏菌的死亡率在50％至接近100％的范围内。据CDC报告称，包括克雷伯氏菌属在内的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)是紧急威胁的细菌，而MRSA和PA均被划分为严重威胁。

本文中描述的发明包括解决了这些问题的组合物和方法，并且可应用于有必要对细菌污染或感染采用替代疗法的情况。

在将支架材料、尤其是源自上皮组织的天然细胞外基质的支架材料施用于患者时，引发融合反应(integration response)。细胞外基质(ECM)由结构性大分子和功能性大分子的复杂混合物构成，其在生长、发育和创伤修复中具有重要作用。来源于ECM的支架材料包括但不限于非上皮来源ECM、小肠粘膜下层(SIS)、膀胱粘膜下层(UBS)、肝脏细胞外基质(L-ECM)和膀胱基质(UBM)。

美国专利No.6,576,265(出于所有目的，该专利的全部内容以引用方式并入本文中)中描述了膀胱基质为生物衍生支架细胞外基质材料，其由具有在(例如但不限于)膀胱的上皮基底膜和上皮组织的其他层中存在的结构特征和生物特征的天然分子的复杂混合物构成。UBM在多种身体系统内被用作有效支架，以促进部位适当的组织形成(site-appropriate tissue formation)，这被称为结构性重构(constructive remodeling)。由于UBM支架能够完全被身体吸收，因而UBM支架可作为组织支架。由于支架的组成和降解动力学，对于UBM的宿主反应以适应性免疫反应为特征，在重构位点普遍存在辅助性T细胞和M2型巨噬细胞。已表明UBM的降解会释放肽片段，其能够促进结构性重构。

发明内容

令人惊讶的是，在本文所描述的研究中，经鉴定，源自猪膀胱的示例性ECM、尤其是膀胱基质(UBM)对于MSSA的实验室菌株表现出体外和体内细菌活性，并且对于多种MRSA、PA和KP临床分离株表现出明显的抗生物膜活性。使用小鼠模型以研究例如UBM等ECM在预防、减少和/或消除人和动物的细菌感染中的潜在应用价值。由革兰氏阳性菌(GPB)MSSA和MRSA以及革兰氏阴性菌(PA)引发的小鼠的呼吸道感染导致肺部细菌负荷显著提高，其伴随着中性粒细胞募集增多以及促炎细胞因子和趋化因子增多。然而，当通过气管滴注外源性施用UBM消化物时，显著降低了接种小鼠的细菌负荷并且减少了细菌细胞因子/趋化因子分泌，从而保护接种小鼠免于发生严重肺部感染。此外，长时间保持于室温的水重构的预配制消化UBM以及UBM的未消化微粒形式能够同样实现UBM针对GPB和由GNB引发的感染的保护功能，从而提供易获得的成品资源，以使细菌感染最小化并对其进行治疗。

总而言之，下述研究结果支持了UBM作为已知疗法的替代或辅助疗法的用途，以用于在未消除哺乳动物的体内由GPB和GNB诱导所引发的感染的情况下，减轻该感染，所述感染包括但不限于人和动物的肺炎、创伤、烧伤、皮肤的持续性感染、粉碎性骨折、膀胱炎、蜂窝织炎、局部和全身细菌感染以及院内感染。

在一个方面，本文所描述的发明涉及治疗患者的例如(但不限于)呼吸道感染等细菌感染的方法，该方法包括通过适当的途径(例如但不限于气道)施用有效剂量的非交联微粉化粉末，该非交联微粉化粉末由失活的天然细胞外基质材料获得，其优选在室温下进行处理。该失活的天然细胞外基质选自由非上皮组织、UBM、SIS和UBS组成的组。

在本发明的一个实施方案中，微粉化粉末经过非酶法处理，并且可在室温下长时间储存，例如(但不限于)长达四周、两个月、六个月、一年、两年、五年，并仍然维持其治疗动物和人细菌感染的效用。

由上述微粉化粉末治疗的细菌感染可由革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌引发，所述革兰氏阳性菌为例如(但不限于)由金黄色葡萄球菌相关细菌组成的细菌，所述革兰氏阴性菌为例如(但不限于)选自由绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌杆菌以及相关细菌组成的组中的细菌。

呼吸道感染可位于气道，包括肺部，并且施用途径包括经由吸入途径、经由喷雾或呼吸器、鼻内滴注或通过气管内途径。或者，施用途径包括用微粉化ECM颗粒的缓冲溶液灌洗患者的气道。

在另一方面，本发明涉及一种组合物，包含：

重构材料的缓冲溶液，该缓冲溶液包含由包括上皮基底膜的失活细胞外基质材料获得的酶消化的或非酶消化的微粉化粉末，所述重构材料包含细胞外基质的一种或多种天然成分。缓冲液可选自任何生理缓冲液，例如(但不限于)缓冲盐水。

在另一方面，本发明涉及通过向患者施用治疗有效剂量的上皮组织的微粉化失活细胞外基质，从而减少细菌感染患者的细菌生物膜的形成，其中该微粉化失活细胞外基质具有针对一种或多种细菌的杀菌活性。所述一种或多种细菌可选自(但不限于)由MSSA-金黄色葡萄球菌、MSRA-金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和绿脓杆菌组成的组。所述治疗可预防、减轻或消除细菌感染。

在又一方面，本发明涉及通过提供重构材料，并通过一定的途径施用治疗有效剂量的所述重构材料，从而保护哺乳动物免受细菌引发的感染的方法，其中所述重构材料包括由上皮组织或非上皮组织的失活细胞外基质材料获得的微粉化粉末的缓冲溶液，该重构材料包含细胞外基质的一种或多种天然成分，其中所述途径选自由气管滴注、鼻内吸入、喷雾、经口吸入、局部施用、灌洗以及它们的组合组成的组。

附图说明

这些附图主要侧重于展示本发明的原理。

图1A至图1H图示了与PBS提取的UBM上清液相比，胃蛋白酶消化的UBM针对MSSA的高抗菌活性。

图1A图示了PBS提取的UBM上清液对MSSA生长的抑制。

图1B图示了在PBS提取的UBM上清液存在下MRSA的生长。

图1C图示了在PBS提取的UBM上清液存在下绿脓杆菌(PAOl)的生长。

图1D图示了在PBS提取的UBM上清液存在下肺炎克雷伯氏菌的生长。

图1E图示了酶消化的UBM对MSSA生长的抑制。

图1F图示了在酶消化的UBM存在下MRSA的生长。

图1G图示了在酶消化的UBM存在下绿脓杆菌(PAOl)的生长。

图1H图示了在酶消化的UBM存在下肺炎克雷伯氏菌的生长。光学密度的测量反应了培养基中的细菌生长。结果由三次独立实验获得。

图2A至图2D图示了将消化的UBM(10mg/kg，气管内(i.t.))滴注至野生型FVB/NJ小鼠肺部未引发肺毒性。

图2A示出了在经PBS治疗的小鼠肺部和经UBM治疗的小鼠肺部中的总炎性细胞计数和分类细胞计数。

图2B示出了在经PBS治疗的小鼠肺部和经UBM治疗的小鼠肺部中BAL中的总蛋白。

图2C示出了在经PBS治疗的小鼠肺部和经UBM治疗的小鼠肺部中与炎症相关的基因的表达。

图2D示出了在经PBS治疗的小鼠肺部和经UBM治疗的小鼠肺部中与上皮细胞相关的基因的表达。图2A至图2D中示出的结果表明，UMB并不会引发肺毒性。这些结果为来自两次独立实验的平均值±SEM；各组中的小鼠数n＝5。

图3A至图3D图示了经UBM治疗的小鼠受到保护，免于产生MSSA诱导的呼吸道感染。

图3A图示了与经UBM治疗的感染MSSA的小鼠相比，在经PBS治疗的感染MSSA的小鼠中，肺部、BAL和总肺部负荷(BAL+肺匀浆)中的CFU。

图3B图示了与经UBM治疗的感染MSSA的小鼠相比，经PBS治疗的感染MSSA的小鼠中的分类细胞计数。

图3C图示了与经UBM治疗的感染MSSA的小鼠相比，经PBS治疗的感染MSSA的小鼠中与炎症相关的基因的表达。

图3D图示了与经UBM治疗的感染MSSA的小鼠相比，经PBS治疗的感染MSSA的小鼠中与上皮细胞相关的基因的表达。这些结果为来自三次独立实验的平均值±SEM；各治疗组中的小鼠数n＝4-6。对于经UBM治疗的小鼠与经PBS治疗的小鼠之间的比较，^*p<0.05，^**p<0.01。

图4A至图4D图示了UBM治疗保护了小鼠免于产生MRSA诱导的呼吸道感染。

图4A图示了在每只小鼠中鼻内(i.n.)滴入2×10⁶CFU MRSA(USA300)的年龄一致的野生型FVB/NJ小鼠中，UBM治疗使得BAL、肺部和总肺部负荷(BAL+肺匀浆)中的CFU显著降低；对感染MRSA的小鼠进行PBS治疗与进行UBM治疗的比较。

图4B图示了与经UBM治疗的感染MSSA的小鼠相比，经PBS治疗的感染MRSA的小鼠中的分类细胞计数。

图4C图示了与经UBM治疗的感染MSSA的小鼠相比，经PBS治疗的感染MRSA的小鼠中与炎症相关的基因的表达。

图4D图示了与经UBM治疗的感染MSSA的小鼠相比，经PBS治疗的感染MRSA的小鼠中与上皮细胞相关的基因的表达。这些结果为来自三次独立实验的平均值±SEM；各治疗组中的小鼠数n＝4-6。对于经UBM治疗的小鼠与经PBS治疗的小鼠之间的比较，^*p<0.05，^**p<0.01。

图5A至图5D图示了UBM显著抑制了GPB(MSSA和MRSA)和GNB(PA和KP)细菌的生物膜形成。

图5A示出了在用不同浓度的UBM治疗之后，MSSA的生物膜形成。

图5B示出了在用不同浓度的UBM治疗之后，MRSA的生物膜形成。

图5C示出了在用不同浓度的UBM治疗之后，PA的生物膜形成。

图5D示出了在用不同浓度的UBM治疗之后，KP的生物膜形成。这些结果为来自三次独立实验的平均值±SEM。对于治疗组与对照组之间的比较，^***p<0.005，^****p<0.001。

图6A至图6D图示了UBM治疗保护了小鼠免于产生绿脓杆菌诱导的呼吸道感染。

图6A图示了在经UBM治疗的小鼠和经PBS治疗的小鼠中，在感染绿脓杆菌15小时后，BAL、肺部和总肺部负荷(BAL+肺匀浆)中的CFU。

图6B图示了在经UBM治疗的小鼠和经PBS治疗的小鼠中，在感染绿脓杆菌15小时后的分类细胞计数。

图6C图示了在经UBM治疗的小鼠和经PBS治疗的小鼠中，在感染绿脓杆菌15小时后与炎症相关的基因的表达。

图6D图示了在经UBM治疗的小鼠和经PBS治疗的小鼠中，在感染绿脓杆菌15小时后与上皮细胞相关的基因的表达。图6A至图6D中示出的结果显示，在感染后的第15小时，经UBM治疗的小鼠和经PBS治疗的小鼠之间不存在统计学差异。这些结果为来自三次独立实验的平均值±SEM；各治疗组的小鼠数n＝5。对于经UBM治疗的小鼠与经PBS治疗的小鼠之间的比较，^*p<0.005，^**p<0.01。

图7A至图7B图示了预配制UBM(PF-UBM)显示出与新鲜消化的UBM(FD-UBM)相当的生物活性。

图7A示出了UBM对抗MSSA(ATCC#49775)和MRSA(USA300)的体外抗生物膜活性。

图7B示出了在MRSA感染后的第15小时，小鼠的BAL、肺部、总肺部负荷(BAL+肺匀浆)和脾脏中由细菌CFU表示的体内抗菌活性。图7A至图7B中示出的结果显示，在预配制UBM(PF-UBM)和新鲜消化的UBM(FD-UBM)的对抗MRSA感染的保护方面，不存在统计学差异。在小鼠中，PF-UBM和FD-UBM均显示出对抗MRSA引发的细菌感染的显著保护作用。这些结果为来自三次独立实验的平均值±SEM；各组中的小鼠数n＝5。在进行单因素方差分析(ANOVA)之后，当P值显著(P<0.05)时，利用Dunnett多重比较检验进行事后比较。对于组间比较，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.005并且^****p<0.001。

图8A至图8C图示了外源性施用的预配制UBM显著减轻了由呼吸道MRSA感染诱导的炎症反应。

图8A比较了经FD-UBM治疗的小鼠肺部、经PD-UBM治疗的小鼠肺部和经PBS治疗的小鼠肺部，示出了感染MRSA的小鼠中细胞因子和趋化因子的基因表达。

图8B比较了经FD-UBM治疗的小鼠肺部、经PD-UBM治疗的小鼠肺部和经PBS治疗的小鼠肺部，示出了感染MRSA的小鼠中小鼠BAL中的细胞因子和趋化因子的蛋白分泌。

图8C示出了来自感染MRSA的经FD-UBM治疗的小鼠肺部、经PD-UBM治疗的小鼠肺部和经PBS治疗的小鼠肺部的肺部切片的显微照片中的中性粒细胞浸润和肺损伤。这些结果为来自三次独立实验的平均值±SEM；各组的小鼠数n＝5。对于各组间的比较，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.005，并且^****p<0.001。

图9A至图9B图示了预配制UBM和未消化UBM(U-UBM)保护了宿主免于发生急性严重呼吸道MRSA感染。

图9A比较了利用PBS、U-UBM和PF-UBM进行的治疗，示出了在感染MRSA的小鼠中，小鼠BAL、肺部和总肺部负荷(BAL+肺匀浆)中的细菌CFU。

图9B比较了利用PBS、U-UBM和PF-UBM进行的治疗，示出了在感染MRSA的小鼠中，包括Cxcll、Cxcl2、Cxcl3、IL-17、Tnf-α和Nf-κb的炎性细胞因子和趋化因子的表达。这些结果为来自三次独立实验的平均值±SEM；各组的小鼠数n＝5。使用单因素方差分析(ANOVA)比较经药物治疗的感染小鼠和经PBS治疗的感染动物，当P值显著(P<0.05)时，利用Dunnett多重比较检验进行事后比较。对于组间比较，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.005并且^****p<0.001。

具体实施方式

本文中描述的发明涉及例如UBM等ECM在治疗人和动物的细菌感染中的用途，所述感染例如为小鼠肺炎感染模型。通过使用下述方案，研究了UBM保护宿主免受MSSA、MRSA、肺炎克雷伯氏菌和绿脓杆菌引发的感染的体外和体内抗菌活性。下文中所详细描述的结果表明，UBM对于MSSA和MRSA的实验室菌株表现出杀菌活性，并且对于多种临床MRSA分离株和绿脓杆菌表现出明显的抗生物膜活性。

通过使用小鼠细菌感染模型，小鼠中MSSA、MRSA、绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌诱导的呼吸道感染导致了明显升高的肺部细菌负荷，其伴随着中性粒细胞募集增多以及促炎细胞因子和趋化因子增多。通过以气管内滴注的方式外源性施用UBM消化物，显著降低了细菌负荷并减轻了细菌细胞因子/趋化因子分泌，从而保护了接种小鼠免于发生严重的肺炎。此外，保持于室温的预消化的冻干UBM的水重构物以及UBM的未消化颗粒形式能够同样实现UBM针对GPB和GNB引发的肺炎的保护功能，从而为治疗人和动物的细菌感染提供易于获得的成品资源。使用呼吸道感染的小鼠模型的研究结果表明，UBM是针对人和动物的细菌感染的提供保护的常规疗法的可行替代疗法或补充疗法，所述细菌感染例如为MSSA、MRSA、绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌呼吸道细菌感染。

示例性材料和方法

UBM消化物制备

由标记为未消化UBM(U-UBM)的非灭菌形式的微粉化UBM粉末(ACell,Inc.，Columbia，MD)制备测试用样品，以用于下述体内试验。

简而言之，以如下方式制作专有(proprietary)UBM粉末从上市体重猪中分离出膀胱，以机械方式去除浆膜、肌肉外层、粘膜下层和肌层粘膜。通过用去离子水洗涤，使粘膜层的粘膜腔内尿路上皮细胞与基底膜分离。剩余组织由上皮基底膜和粘膜层的下层固有层构成，将其称为UBM。接下来通过在0.1％的过氧乙酸和4％的乙醇中以150rpm搅拌2小时，从而使剩余组织脱细胞化。然后用IX PBS和无菌水将组织充分漂洗。在UBM的制作中未使用交联剂、洗涤剂、肽酶或蛋白酶。接下来，将组织冻干，并使用Wiley Mill(Thomas Scientific，NJ)以#60目筛网将其研磨为粉末颗粒形式。然后使用Tapping Sieve Shaker(Gilson，OH)将UBM粉末筛分通过150微米筛网，持续4小时。或者，将冻干UBM切至小块以装入Cryomill样品室，并使用Cryomill仪器(Retsch，德国哈恩)进行交替的冷却、振动和静置步骤，从而对其进行加工2.5小时。

在另一实施方案中，如此前在D.O.Freytes、J.Martin、S.S.Velankar、A.S.Lee、S.F.Badylak的Preparation and rheological characterization of a gel form ofthe porcine urinary bladder matrix(猪膀胱基质的凝胶形式的制作和流变学表征)(Biomaterials，29(11)(2008)，1630-7，其全文以引用方式并入本文)中所描述的，还将微粉化UBM粉末酶消化以形成消化的UBM原液。简而言之，将0.01HCl溶液和120mg的猪胃蛋白酶(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)混合直至溶解。将1.2g的非灭菌UBM颗粒加入胃蛋白酶溶液中，以获得所需的原液浓度，并在室温下搅拌直至完全溶解，持续约48小时，其中非灭菌UBM颗粒根据T.W.Gilbert、D.B.Stolz、F.Biancaniello、A.Simmons-Byrd、S.F.Badylak的Production and characterization ofECM powder:implications for tissue engineering applications(ECM粉末的制作和表征：对组织工程应用的启示)(Biomaterials，26(12)(2005)，1431-5，其全文以引用方式并入本文)制得。然后使用冰浴将消化的UBM溶液冷却至5℃。在搅拌的同时，添加12ml的10X磷酸盐缓冲盐水(PBS)、5mL的0.02M NaOH和3mL去离子水，以中和UBM消化物。然后检测pH值以确保完成中和。对于预配制UBM(PF-UBM)，将所得的中和后的消化物分装在离心管中并冷冻过夜。然后移除离心管中的中和后的PF-UBM消化物并将其冻干，然后封装样品并使用电子束照射将其灭菌。在室温下储存样品直至实验需要。对于新鲜消化的UBM(FD-UBM)组和PF-UBM组(预配制的冻干且灭菌的消化物)，最后按照如下所述方式制备具有所需最终浓度的试验用样品以用于各项实验。

小鼠和动物的管理

由Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)购得野生型FVB/NJ小鼠，并以12小时的光暗周期保持于无特定病原体的环境中。所有操作均使用8-9周龄的小鼠，其保持于经美国实验动物评估和认可管理委员会(AAALAC)认证的动物设施中的通风微隔离笼内。涉及动物的方案和研究根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的指导方针，并由匹兹堡大学动物管理与使用委员会批准。

细菌

所有实验使用了革兰氏阳性菌(GPB)金黄色葡萄球菌菌株(MSSA ATCC#49775和MRSA US A300)以及革兰氏阴性菌GNB绿脓杆菌(PA01，ATCC BAA-47)和肺炎克雷伯氏菌(KP，B3)。已知这些革兰氏阳性菌株和革兰氏阴性菌株会影响人类的健康。由单菌落获得的细菌于-80℃下分装储存在15％的甘油/胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中。对于各项实验，在振动的条件下将一份细菌在经高压灭菌的TSB中于37℃生长16小时。然后将一份过夜生长的细菌由1ml稀释至5ml新鲜TSB中，并在振动的条件下于37℃进一步培养2小时。将细菌清洗两次，并再悬浮于10ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。

肺毒性

通过气管内(i.t.)施用至小鼠肺部，从而检验UBM的体内肺毒性。用具有每毫升不同UBM浓度的50μ1PBS气管内灌洗FVB/NJ小鼠，其中UBM的范围为1mg/kg至10mg/kg。按照Y.P.Di的Assessment of pathological and physiological changes in mouse lungthrough bronchoalveolar lavage(通过支气管肺泡灌洗带来的小鼠肺部的生理和病理变化的评价)(Methods Mol.Biol.1105(2014)33-42，其全部内容以引用方式并入本文)对肺部组织进行灌洗，在UBM施用后第24小时摘取肺部组织，并且通过支气管肺泡灌洗(BAL)中的总蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞总数和分类细胞计数，以及通过使用实时PCR分析的基因表达，从而进行毒性分析。

小鼠的体内细菌暴露

通过使小鼠吸入异氟烷从而麻醉小鼠，并通过对每只小鼠鼻内(i.n.)滴入～2×10⁶CFU(常规感染)或～2×10⁷CFU(严重感染)的50μ1 PBS溶液，以治疗ATCC#49774、USA300或PA01。对照小鼠用50μ1 PBS进行鼻内接种。在细菌接种一小时后，向小鼠的气管内滴入10mg/kg量的50μl UBM，并向对照小鼠的气管内滴入50μl PBS。然后在UBM施用14小时后死小鼠，以研究对细菌感染的急性宿主反应以及后续治疗。

CFU试验

通过在TSB琼脂板上进行连续稀释和定量培养，从而确定CFU数目。将左肺叶在1ml的盐水中均质化，并置于冰上。将肺组织匀浆或支气管肺泡灌洗液(BALF)的100μl稀释液与900μl盐水混合。制备四个连续10倍稀释液，并涂布在TSB琼脂板上，并在37℃培养18小时，每个稀释液一式三份涂布。然后对菌落进行计数，并且以log₁₀为单位表示存活细菌。

BALF和细胞分类计数

在治疗细菌感染15小时后(施用UBM 14小时后)，用2.5％的三溴乙醇(Avertin)将小鼠(5只小鼠/组)麻醉。进行气管插管，使用1ml盐水进行两次肺灌洗，并收集BALF样品。用4μ1吖啶橙(MP Biomedical，Santa Ana,CA)将16μ1的试样染色，并使用Vision CellAnalyzer细胞计数器(Nexcelom，Lawrence,MA)进行细胞计数。将另一份试样置于显微镜载玻片(Shanon Cytospin；Thermo Fisher，宾夕法尼亚州Pittsburgh市)上，用Diff-Quick进行染色；通过显微镜确定细胞分类。对每个载玻片上的总计400个细胞进行计数至少两次，以进行炎性细胞分类计数。

实时PCR分析

使用Trizol试剂(Life Technologies，Carlsbad,CA)从WT和Spluncl KO小鼠的右肺组织的两个上肺叶中分离出总mRNA。使用ABI7900HT(Applied Biosystems，加利福尼亚州Foster City市)和引物Muc5ac、Muc5b、CCSP、Foxj l、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl5、NF-κΒ、IL-6、IL-10、IL-la、Ccl20进行定量PCR(qPCR)。进行验证测试，以确定目标基因的等效PCR效率(equivalent PCR efficiencies)。使用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒(LifeTechnologies)将测试肺RNA和校准肺RNA逆转录，并以如下方式进行PCR扩增：50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环；95℃15秒；60℃1分钟。使用三次重复数据来计算目标转录物和标准化转录物的平均周期阈值(β-葡糖醛酸糖苷酶[GUS-B]；Assays on Demand；AppliedBiosystems)。使用ΔΔ周期阈值(Ct)方法计算相对mRNA丰度。

细胞因子测定

使用小鼠Cytokine Multiplex Panel Milliplex测定(Millipore，Billerica,MA)对BAL中的细胞因子水平进行定量。使用Luminex测定系统，基于制造商的说明并按照此前在Y.Zhang、R.Birru、Y.P.Di的Analysis of clinical and biological samples usingmicrosphere-based multiplexing Luminex system(Methods Mol Biol 1105(2014)43-57)中所描述的方法分析IL-Ιβ、IL-6、IL-10、IL-12(p70)、IL-17、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、KC、IP-10、VEGF和ΜΙΡ-Ια的表达。使用标准重构蛋白溶液以产生各分析蛋白的标准曲线。由标准曲线计算各细胞因子的绝对细胞因子浓度。

肺组织病理学

在感染15小时后摘取肺组织，打开胸腔，在10cm H₂O时用4％的多聚甲醛原位灌注固定10分钟。将右肺叶包埋于石蜡中，并制作5μm切片。用苏木精和伊红将切片染色，并进行组织学评估以检验由细菌感染引发的病理学严重程度。通过双盲方式，使用组织病理学炎症评分系统在光学显微镜下评价染色的肺部切片。

生物膜测定

如Y.Liu、M E.Di、H.W.Chu、X.Liu、L.Wang、S.Wenzel、Y.P.Di的Increasedsusceptibility to pulmonary Pseudomonas infection in Spluncl knockout mice(JImmunol 191(8)(2013)4259-68)和G.A.O'Toole,R.Kolter的Flagellar and twitchingmotility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development(Molecular microbiology 30(2)(1998)295-304)(其全部内容以引用方式并入本文)中所述，使用由O'Toole和Kolter研发的微量滴定板测定的稍作修改的版本。

简而言之，将细菌的过夜浮游菌培养物接种至聚苯乙烯处理的96孔培养微量滴定板(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)中的100μL DMEM内，有或没有UBM或抗生素对照。包括仅填充生长培养基的孔作为阴性对照。在37℃下孵育3小时后，通过用0.5％(w/v)的结晶紫水溶液将结合细胞(bound cells)染色15分钟从而测定表面附着的生物膜的形成。在用蒸馏水漂洗后，使用95％乙醇使结合染料从染色的细胞中释放出来，并确定590nm处的光密度。

数据分析

数据表示为平均值±SEM。通过使用ANOVA，并随后通过Dunnett多重比较检验(单向ANOVA)进行小鼠组间统计比较。认为p值＜0.05是统计学上显著的。

结果

体外研究

UBM表现出体外抗菌活性

为了确定UBM是否包含可能表现出对细菌的生长抑制作用的成分，我们将微粉化UBM粉末以4mg/ml的浓度悬浮于盐水中(ACell,Inc.)，以测试其抗菌活性。对一组包括GPB(MMSA和MRSA)和GNB(绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌)在内的多种常见呼吸道细菌感染进行检测，这是因为这些细菌是常常与呼吸道感染有关的最普遍的细菌菌株。

对UBM进行了两种不同的制备方法。第一种制备方法是简单地将粉末形式的UBM悬浮于PBS中，将未溶解物质离心沉降，并收集UBM的溶解部分(UBM上清液)，认为抗菌剂如抗菌肽(AMP)会在上清液中维持抑制细菌生长的活性。

第二种方法是如上所述使用胃蛋白酶将UBM酶消化，以从基质物质(经过消化的UBM)中提取所有潜在的抗菌分子，例如肽。使用所有对数生长期的测试细菌，以确定未消化UBM材料和经过消化的UBM材料在直接杀灭细菌中的抗菌活性。

参见图1A至图1C，UBM上清液未表现出任何针对GPB(MSSA和MRSA)(图1A、图1B)或GNB(PA和KP)(图1C、图1D)的明显抗菌活性。经过消化的UBM具有针对MSSA的体外杀菌活性(图1E)，但是针对其他GPB(MRSA；图1F)或GNB(PA和KP；图1G、图1H)则不具有体外杀菌活性。看起来在蛋白酶消化后从基质中释放出了一些抗菌分子，而不是仅靠有助于基于UBM的杀菌活性的PBS溶解性成分，这是因为与UBM的溶解性成分相比，经过消化的UBM表现出增强的抗菌活性(图1)。因此，在下述研究中，将已消化形式的UBM用于两个体内实验组中。在另一实验组中，将微粉化的未消化UBM粉末以灌洗的方式用于小鼠肺炎模型的体内，预期该材料将在滴注至肺部时降解。

体内研究-对UBM的组织耐受性

UBM在肺部的耐受性良好，并且未表现出肺毒性

以下研究证实，UBM对肺部无毒性，并且不会造成肺损伤。

将50μl不同浓度(0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml)的经过消化的FD-UBM气管内(i.t.)滴注至八至九周龄的FVB/NJ小鼠肺部，使得施用剂量为0.25mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg或5mg/kg。当比较UBM滴注小鼠组和仅接受空白对照的小鼠对照组的多项毒性指标(包括BAL中的总细胞数和LDH、肺上皮细胞的基因表达和Nf-κb)时，确认没有显著的变化。还评价了更高浓度的经过消化的UBM(4mg/ml)，其在小鼠肺部(200μg/小鼠肺部)中的最终剂量为10mg/kg。

参见图2，即使在更高的UBM浓度(10mg/kg)下，在空白治疗组和FD-UBM治疗组之间，小鼠的几乎所有测量值均相当。如图2A所示，在FD-UBM治疗组中观察到中性粒细胞的增加量最小，其占小鼠肺部白细胞总数的约3％至4％，但无统计学意义。类似地，图2B中显示，在PBS对照组和经FD-UBM治疗的小鼠组之间，肺部中的总蛋白(作为肺损伤的指标)未显示出差异。参见图2C，在向小鼠肺部施用UBM(10mg/kg，总计200μg/小鼠)之后，与上皮细胞相关的基因的表达未显示出任何明显变化，其中所述与上皮细胞相关的基因包括Ccsp(Club细胞)、Foxj 1(纤毛细胞)、Muc5ac(Goblet细胞)和Muc5b(粘液细胞)，并且如图2D所示，TLR-2、TLR-4、Tnf-α和Nf-κb中的与炎症相关的基因也未显示出任何明显变化。这些数据表明，将UBM以最高浓度(10mg/kg)施用至小鼠肺部不会破坏肺上皮细胞完整性或引发炎性反应。

体内UBM抗菌性研究

在呼吸道感染小鼠模型中，UBM表现出针对MSSA的体内抗菌活性

为了测试外源性施用UBM是否能够保护宿主免于发生金黄色葡萄球菌引发的感染，使用了小鼠肺炎模型来确定基于UBM的体内抗菌活性。向年龄一致的FVB/N小鼠气管内(i.t.)滴注剂量为～2x 10⁶CFU/肺的MSSA(ATCC#49775)。在细菌感染1小时之后，以10mg/kg递送(i.t.)50μl的FD-UBM，以检测UBM对呼吸道细菌感染的治疗效果。在细菌感染后的第15小时，如图3A中所示，经过FD-UBM治疗的小鼠的BAL和肺部中的细菌数量均显著降低。因此，与初始肺部细菌负荷相比，在细菌感染后1小时用UBM进行治疗的小鼠组中的总肺部细菌负荷显著降低了超过六倍。未预期到的是，图3B中显示，细菌负荷的差异并未影响白血球总数，因为经PBS治疗的小鼠组和经FD-UBM治疗的小鼠组的BAL中的总炎性细胞计数以及巨噬细胞和中性粒细胞的分类细胞计数没有显示出统计学上的差异。如图3C中所示，在抗炎性细胞因子IL-10和促炎细胞因子IL-6、Nf-κb和Tnf-α的表达上也没有显示出显著差异，并且如图3D所示，在与气道上皮细胞相关的基因中未观察到明显变化。

UBM有效保护小鼠免于发生MRSA诱导的呼吸道感染

通过在小鼠肺炎模型中使用MRSA(US A300)，进行与上述使用MSSA的实验类似的一组小鼠金黄色葡萄球菌感染实验。参见图4A，与上述使用MSSA的研究相比，FD-UBM治疗的感染MRSA的小鼠在BAL和肺部中的细菌数显著增加。然而，大部分细菌(MRSA)比MSSA更为紧密地结合至肺部并保留在肺部中(～10⁵CFU/肺,占总肺部细菌CFU的～84％)，而未被冲洗至BAL中(～1.8x 10⁴CFU/肺)。

有利的是，外源性施用的UBM表现为能够有效对抗体内的MRSA，因为该治疗在小鼠中表现出针对由MRSA诱导的呼吸道感染的抗菌活性。与仅用PBS对照治疗的小鼠相比，在经过FD-UBM治疗的小鼠中，总肺部MRSA细菌负荷减少了超过80％。来自暴露于MRSA且经FD-UBM治疗的小鼠的BAL中的白细胞总数略微小于PBS对照组，但是未产生统计学差异(图4B)。如图4C和图4D所示，与暴露于MRSA且未经UBM治疗的小鼠相比，暴露于MRSA且经UBM治疗的小鼠的与炎症相关的基因和与上皮细胞相关的基因的表达趋向于显示出更低的表达，但未产生统计学差异。

UBM生物活性防止体内细菌吸附

MSSA和MRSA所共有的UBM介导的抗菌机制对于体外MRSA并未表现出直接的杀菌活性(图1)，但是仍表现出针对MRSA的优异的体内抗菌活性(图4)。由于接种的细菌必须附着至上皮细胞，以避免被小鼠肺炎模型中的粘液纤毛清除推出肺部，因此UBM施用至小鼠肺部显然防止了细菌吸附至小鼠肺上皮细胞。

通过使用生物膜形成测定，从而在不同浓度下研究在FD-UBM(如下所述)存在下的MSSA和MRSA的细菌吸附。

如上所述，通过结晶紫染色(OD620)测定非生物表面上的生物膜的生物量，从而确定FD-UBM对MSSA、MRSA、PA和KP的抗生物膜效果。浓度高于0.0625mg/ml的FD-UBM有效降低了MSSA(如图5A所示)和MRSA(如图5B所示)培养板的细菌吸附，由此防止了引发生物膜形成。

为了确定FD-UBM介导的抗生物膜活性是否为广谱的、或者仅局限于GPB，在上述生物膜形成测定中测试了FD-UBM针对相关呼吸道GNB致病菌的抗生物膜活性，其中相关呼吸道GNB致病菌包括绿脓杆菌(PA)和肺炎克雷伯氏菌(KP)。我们得到的结果显示，FD-UBM针对GNB也具有优异的抗生物膜活性(图5C和图5D)。

UBM还保护小鼠免于发生由绿脓杆菌诱导的呼吸道感染

为了进一步评价UBM介导的抗生物膜活性是否也能够保护宿主免于发生GNB细菌感染，使用绿脓杆菌(PAO1)以类似方式进行了小鼠呼吸道感染实验。向年龄一致的野生型FVB/NJ小鼠气管内滴注1x 10⁷CFU/小鼠的绿脓杆菌(PAO1)。外源性施用的预配制UBM(PF-UBM)也能够有效对抗由GNB绿脓杆菌诱导的呼吸道感染(图6A至图6D)。图5中证实了，这些数据表明PF-UBM介导的抗生物膜活性能够有助于宿主对抗体内细菌感染的常见保护机制。

预配制UBM在重构后维持了抗菌活性

由于已知完整的UBM在体外不会降解，因此在体外研究(图1和图5)中使用了新鲜消化的UBM(FD-UBM)，并且为了便于比较，将FD-UBM用于体内中。然而，在临床环境中使用新鲜消化的UBM是不实际的。由于在肺部感染中需要对创伤的迅速响应，因此，能够保持新鲜消化的UBM的肺部保护特性的成品形式的预配制冻干灭菌UBM(PF-UBM)优于新鲜消化的UBM。

对于这些研究，利用上述抗生物膜测量方法，分别测试了三批冻干PF-UBM的体外和体内抗菌活性，并与FD-UBM(在实验室中制备并随即使用)进行比较。PF-UBM溶液(其可储存数年时间)表现出与FD-UBM非常类似的对于绿脓杆菌和MRSA的体外抑制作用(图7A)。在小鼠肺炎感染模型中，冻干PF-UBM还表现出与PF-UBM类似的体内抗菌活性，以保护宿主对抗绿脓杆菌和MRSA(图7B)。

为了进一步评价PF-UBM和FD-UBM治疗对于与炎性反应相关的细胞因子和趋化因子的基因和蛋白质表达的作用，如图8A所示，使用实时qPCR和Luminex以分别分析小鼠肺部样品和BAL样品。用约2xl0⁶CFU的MRSA(i.t.)使小鼠感染，并在接种MRSA后1小时用10mg/kg的PF-UBM或FD-UBM(i.t.)治疗小鼠。如图3和图4所示，由于一些基因在经PBS治疗的小鼠组和经UBM治疗的小鼠组之间并未显示出差异，因此选择了其他基因和蛋白质进行评价。参见图8A，未预期到的是，对于Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl10和Ccl20，在经FD-UBM治疗的小鼠中检测到比经PBS治疗的对照小鼠更低的基因表达，而对于Tnf-α、IL-lα和IL-6则并非如此。此外，除了IL-6以外，PF-UBM显示出对于Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl10、Ccl20、Tnf-α和IL-lα的所有检测到的基因表达的显著抑制作用(图8A)。与经PBS治疗的对照小鼠相比，在经PF-UBM治疗的小鼠和经FD-UBM治疗的小鼠中，Cxcl1和IL-6在BAL中的分泌的蛋白量显著更低(图8B)。关于BAL中Cxcl10、IL-12、Tnf-α和RANTES的分泌，并不存在显著差异，而IL-17和MIP-1α在UBM治疗后显示出低表达趋势(图8B)。

如图8C所示，在对MRSA(USA 300)感染的小鼠经过UBM治疗后的病理分析中，也反映出了炎性细胞因子和趋化因子的低表达。经PF-UBM治疗的小鼠和经FD-UBM治疗的小鼠也表现出针对MRSA的更强的细菌清除作用(图8C)。这些结果表明，在保护宿主免受MRSA诱导的呼吸道感染方面，PF-UBM和FD-UBM是相当且有效的。

预配制的未消化UBM表现出针对由高剂量细菌诱导的呼吸道感染的保护作用

为了测试UBM在治疗患者由GPB和GNB诱导的急性严重呼吸道感染中的效用，以比此前在小鼠肺炎模型中使用的CFU更高的细菌负荷(10×)接种MRSA和绿脓杆菌。向FVB/N小鼠鼻内滴注绿脓杆菌上的MRSA(USA300)，剂量为～2x 10⁷CFU/肺。在细菌感染后1小时以10mg/kg递送(i.t.)悬浮于盐水中的PF-UBM和未消化的完整形式的颗粒状UBM(U-UBM)。参见图9，与经PBS治疗的小鼠组相比，PF-UBM和U-UBM治疗均使总肺部细菌负荷显著降低。

结论

本文所描述的一系列体外和体内实验中的结果表明，与生理缓冲PBS提取的UBM的上清液相比，消化形式的UBM在对抗MSSA方面显示出更好的体外抗菌活性，其中所述一系列体外和体内实验是为了评价将UBM作为示例性ECM而用于治疗应用中以对抗患者因GPB和GNB诱导的细菌感染时的潜在抗菌益处。尽管经过消化的UBM没有表现出针对MRSA或绿脓杆菌的体外直接杀菌活性，但是在小鼠呼吸道肺炎模型中，气管滴注PF-UBM和U-UBM有效保护了感染MSSA的小鼠、感染MRSA的小鼠和感染绿脓杆菌的小鼠。由于金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌是与感染有关的常见致病菌，因此UBM针对这些感染的抗菌活性不仅使UBM常常用于治疗多种创伤，包括许多组织(包括但不限于皮肤和肺部)中的创伤性急性损伤和烧伤，而且还能够潜在用作非局部治疗应用，例如吸入或全身治疗应用。

对于未消化UBM、新鲜消化的UBM和经过消化的预配制UBM，它们保护宿主免于发生细菌引发肺炎的体内抗菌活性将总肺部细菌负荷平均降低约5至6倍(保护率～80％至85％)。所证实的体内结果示出了UBM在降低生物负荷中的益处，因为其他研究中所使用的其他炎症相关基因敲除小鼠(如IL-17敲除)仅能够将肺部中的MRSA细菌负荷降低约2至3倍。此外，即使当如图9中所示，向小鼠肺部进行严重接种(severe inoculation)(比普通MRSA的CFU高10倍)以诱导严重呼吸道MRSA感染时，预配制PF-UBM也能够有效减轻MRSA感染。经PBS治疗的小鼠中的升高的肺部细菌负荷为经PF-UBM治疗的小鼠的肺部细菌负荷的250倍，并且为经U-UBM治疗的小鼠的肺部细菌负荷的87倍。这些结果表明，UBM在哺乳动物的细菌感染环境中具有体内治疗作用。不受理论限制，认为UBM仅允许有限数量的细菌吸附至上皮细胞，而UBM防止MRSA寄居于小鼠肺部。

UBM表现出强的体内抗菌活性的一种可能的机制是：UBM在体内酶降解后具有强抗生物膜形成活性。细菌趋向于聚集在一起并彼此间附着于表面以形成生物膜，并且随后发生表型和基因表达改变。据推测，超过80％的人类传染性疾病与细菌生物膜形成直接相关，但是目前大部分的细菌研究是对自由游动的浮游细菌，而非对与生物膜相关的细菌进行的。在细菌定植的发病机制中，与生物膜相关的细菌比浮游形式更为危险。UBM对于生物膜形成的一种可能的模式是由于UBM的生物物理性质，其可减慢细菌在肺部的寄居和/或在上皮细胞上形成保护层，从而使得上皮细胞表面上的生物膜形成减少。UBM的成分可与细菌吸附至肺部上皮细胞的能力发生作用或使这一能力无效。

本文所述结果示出了外源性施用的UBM在体内提供了针对细菌感染的有效保护。在经UBM治疗的小鼠中观察到的增强的细菌清除作用的产生原因可能是：UBM与其他抗菌肽(如防御素)和/或抗菌蛋白(如溶菌酶)之间相互作用，从而增强其抗菌活性。

细胞因子在免疫和炎症过程的调控中也起到重要作用。通常，在识别微生物产物后，上皮细胞中的TLR介导的信号转导致TNF-α和IL-1β的产生，其为调节随后的中性粒细胞募集的两种早期反应性细胞因子。炎症介质的有序且均衡的产生对于针对细菌感染的有效的局部和全身宿主防御是非常重要的。

在本文披露的研究中，在由普通剂量引发的细菌感染之后，在经PBS治疗的小鼠和经UBM治疗的小鼠之间，大部分的炎性细胞因子如IL-6、IL-10和TNF-α未发生显著变化(图3、图4和图5)。然而，与经PBS治疗的小鼠组相比，经UBM治疗的小鼠组中的一些细胞因子和趋化因子显著减少(图8和图9)。

相比于已知的细菌感染治疗方法，该研究中确认的UBM的重要且未预期到的优点之一是：即使在室温下长时间储存之后，预配制(预消化的冻干且灭菌的)PF-UBM仍维持其针对MSSA和MRSA引发的感染的抗菌活性。该研究中所使用的PF-UBM经过灭菌并且在室温条件下储存长达6个月，然后用于体外和体内实验中。具有长期稳定性的PF-UBM可作为成品在室温下储存数年的时间，从而进一步增强了其作为治疗微生物感染的易获得抗菌剂的效用。

这些研究中确定的另一优点是：未消化U-UBM也表现出针对MRSA诱导的呼吸道感染的优异抗菌活性。同样不受限于理论，可能的机制是：宿主气道中分泌的蛋白酶将U-UBM消化，从而产生了原位消化并使未消化UBM分解，从而保护宿主免受细菌感染，这与观察到的经过消化的PF-UBM和FD-UBM的抗菌作用类似。上述来源于ECM的组合物(例如但不限于UBM)的制备在不存在蛋白质交联剂的条件下进行配制，这对于组合物在细菌感染(包括但不限于呼吸道感染)的治疗中的应用是有利的。交联蛋白的原位分解可能会超过宿主蛋白酶和肽酶的能力。

综上，本文中披露的方法包括但不限于利用气道内的体内途径实现UBM针对细菌性致病菌的广谱抗菌活性的用途。此外，UBM可用作(例如)金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌(其为本文中所研究的示例性细菌感染)以及创伤、烧伤、皮肤的持续感染、粉碎性骨折、膀胱炎、蜂窝组织炎、院内感染、以及气道和其他组织感染中的其他细菌感染的治疗手段，或用于改善这些细菌感染的耐药性。作为非限制性实例，UBM可用作囊性纤维化患者的早期细菌定植的治疗。UBM介导的抗菌分子是有效对抗免疫正常患者和免疫受损患者的细菌感染(如气道的细菌感染)的替代方法。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种治疗患者的呼吸道感染的方法，包括：

通过气道向所述患者施用有效剂量的未经消化的、非交联的微粉化粉末，该非交联的微粉化粉末由失活的天然细胞外基质材料获得，所述失活的天然细胞外基质(ECM)选自由非上皮组织、膀胱基质(UBM)、小肠粘膜下层(SIS)和膀胱粘膜下层(UBS)组成的组。

2.权利要求1所述的方法，其中所述微粉化粉末是非酶法处理的。

3.权利要求1所述的方法，其中所述微粉化粉末在室温下储存至少2个月。

4.权利要求1所述的方法，其中所述微粉化粉末在室温下储存至少6个月。

5.权利要求1所述的方法，其中所述感染选自由金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌组成的细菌组。

6.权利要求1所述的方法，其中所述感染至少位于肺部。

7.权利要求1所述的方法，其中所述气道为气管。

8.权利要求1所述的方法，其中所述施用途径为气管内或鼻内。

9.权利要求1所述的方法，其中所述施用途径为通过吸入施用。

10.权利要求1所述的方法，其中所述施用为通过喷雾施用。

11.权利要求1所述的方法，其中所述细胞外基质材料包括膀胱基质(UBM)。

12.权利要求1所述的方法，其中所述细胞外基质材料包括UBS。

13.权利要求1所述的方法，其中所述治疗包括用微粉化颗粒的缓冲溶液灌洗所述患者的气道。

14.一种组合物，包含：

重构材料的缓冲溶液，该缓冲溶液包含由包括上皮基底膜的失活细胞外基质材料获得的未经消化的、非交联微粉化粉末，所述重构材料还包含所述细胞外基质的一种或多种天然成分。

15.权利要求14所述的组合物，其中所述一种或多种天然成分选自由衍生自ECM的非上皮组织、膀胱基质(UBM)、小肠粘膜下层(SIS)和膀胱粘膜下层(UBS)组成的组。

16.一种减少细菌感染患者的细菌生物膜形成的方法，包括：

向所述患者施用上皮基底膜的未经消化的、非交联微粉化失活细胞外基质，该微粉化失活细胞外基质具有针对选自由MSSA-金黄色葡萄球菌、MSRA-金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和绿脓杆菌组成的组中的一种或多种细菌的杀菌活性。

17.权利要求16所述的方法，其中所述失活的天然细胞外基质(ECM)选自由非上皮组织、UBM、SIS和UBS组成的组。

18.一种保护哺乳动物免受细菌引发的感染的方法，包括：

提供重构材料，所述重构材料包括由上皮基底膜的失活细胞外基质材料获得的未经消化的、非交联微粉化粉末的缓冲溶液，所述重构材料包含所述细胞外基质的一种或多种天然成分；以及

通过选自由气管内滴注、鼻内滴注-吸入、喷雾、局部施用以及它们的组合组成的组中的途径施用治疗有效剂量的所述材料。

19.权利要求18所述的方法，其中所述失活的天然细胞外基质(ECM)选自由上皮组织、UBM、SIS和UBS组成的组。

Claims (19)

1.一种治疗患者的呼吸道感染的方法，包括：

通过气道向所述患者施用有效剂量的非交联的微粉化粉末，该非交联的微粉化粉末由失活的天然细胞外基质材料获得，并且在室温下进行处理，所述失活的天然细胞外基质(ECM)选自由非上皮组织、UBM、SIS和UBS组成的组。

2.权利要求1所述的方法，其中所述微粉化粉末是非酶法处理的。

3.权利要求1所述的方法，其中所述微粉化粉末在室温下储存至少2个月。

4.权利要求1所述的方法，其中所述微粉化粉末在室温下储存至少6个月。

5.权利要求1所述的方法，其中所述感染选自由金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯氏菌组成的细菌组。

6.权利要求1所述的方法，其中所述感染至少位于肺部。

7.权利要求1所述的方法，其中所述气道为气管。

8.权利要求1所述的方法，其中所述施用途径为气管内或鼻内。

9.权利要求1所述的方法，其中所述施用途径为通过吸入施用。

10.权利要求1所述的方法，其中所述施用为通过喷雾施用。

11.权利要求1所述的方法，其中所述细胞外基质材料包括膀胱基质(UBM)。

12.权利要求1所述的方法，其中所述细胞外基质材料包括UBS。

13.权利要求1所述的方法，其中所述治疗包括用微粉化颗粒的缓冲溶液灌洗所述患者的气道。

14.一种组合物，包含：

重构材料的缓冲溶液，该缓冲溶液包含由包括上皮基底膜的失活细胞外基质材料获得的消化的微粉化粉末，所述重构材料包含所述细胞外基质的一种或多种天然成分。

15.权利要求14所述的组合物，其中所述微粉化粉末是非交联的。

16.一种减少细菌感染患者的细菌生物膜形成的方法，包括：

向所述患者施用上皮组织的微粉化失活细胞外基质，该微粉化失活细胞外基质具有针对选自由MSSA-金黄色葡萄球菌、MSRA-金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和绿脓杆菌组成的组中的一种或多种细菌的杀菌活性。

17.权利要求16所述的方法，其中所述微粉化粉末是非交联的。

18.一种保护哺乳动物免受细菌引发的感染的方法，包括：

提供重构材料，所述重构材料包括由上皮组织的失活细胞外基质材料获得的微粉化粉末的缓冲溶液，所述重构材料包含所述细胞外基质的一种或多种天然成分；以及

通过选自由气管内滴注、鼻内滴注-吸入、喷雾、局部施用以及它们的组合组成的组中的途径施用治疗有效剂量的所述材料。

19.权利要求18所述的方法，其中所述微粉化粉末是非交联的。