KR20190127935A - 세균 감염 환자를 보호 및 치료하는데 유용한 살균성 또는 정균성 특성을 갖는 세포외기질 조성물 - Google Patents

세균 감염 환자를 보호 및 치료하는데 유용한 살균성 또는 정균성 특성을 갖는 세포외기질 조성물 Download PDF

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Abstract

비상피 및 상피 조직으로부터 유래된 소화 또는 비소화성 세포외기질 물질로 인간과 동물에서 세균 감염을 감소시키고 치료하기 위한 제형 및 방법이 설명된다.

Description

세균 감염 환자를 보호 및 치료하는데 유용한 살균성 또는 정균성 특성을 갖는 세포외기질 조성물
본원에 기재된 발명은 인간 및 동물에서 세균 감염을 치료하기 위한 조성물, 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.
(관련 출원)
본 출원은 2017년 3월 31일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/479,888호의 우선권 및 의익을 주장하고, 모든 의도 및 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
세균 감염은, 예를 들면 환자의 화상, 만성 상처, 및 조직과 장기의 다른 세균 감염, 예를 들면 폐렴의 치유 과정을 종종 손상시킨다. 그러나, 국소 설파디아진은과 같이 일반적으로 사용되는 예방 항생제는 화상 상처 감염률의 증가, 실패한 치료법, 및 입원 기간의 증가와 관련이 있다. 이상적으로, 세균 성장 억제 활성을 가진 인비보(in vivo) 조성물로 국소 및 전신 세균 감염을 가진 화상 상처를 치료하는 것이 유리할 것이다. 이 경우에, 이 조성물로의 처리는 바람직하게는 추가적인 항생제 적용의 필요성을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 상기 이점을 달성하기 위한 조성물 및 방법은 하기에 기재되어 있다.
황색포도상 구균(Staphylococcus aureus)은 그람양성 구균 세균이며, 코, 호흡기 및 인간의 피부에서 빈번하게 발견되고, 상해 또는 수술 후 감염의 흔한 원인 중 하나이다. 현재 사용 가능한 항생제의 광범위한 사용 및 세균 진화로 인해, 항생제 내성 그람양성 황색포도상 구균, 그람음성 녹농균 및 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae) 균주가 최근에 등장했다.
메티실린 내성 황색포도상 구균(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA)은 페니실린(메티실린, 디클록사실린, 옥실린 등) 및 세팔로스포린을 포함하는, 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 발전시킨 황색포도상 구균의 임의의 균주이다. 이들 항생제에 저항할 수 없는 균주는 메티실린 민감성 황색포도상 구균(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus) 또는 MSSA로 분류된다. MRSA가 인간 건강에 미치는 전반적인 영향에 관한 가장 중요한 발전은 지역사회 획득성 감염으로 인한 위협이 증가하고 있다는 점이다. 지난 20년 동안, MRSA는 병원 환경에서 발생하여 병에 걸린 환자에게 영향을 미치는 MRSA 사례의 65%를 차지하는 병원내 감염으로, 주로 지역사회 획득성 질병으로 인해 건강한 개인이 종종 치명적인 결과를 얻게 된다. 인간과 동물에서 이러한 감염을 예방하고 치료하기 위해 개선된 방법이 필요하다.
녹농균(Pseudomonas aeruginosa; PA)은 동물과 인간에서 다양한 감염성 질환을 유발하는 그람음성 막 대균(gram-negative rod-shaped bacteria)의 유형이다. 그것은 임상적으로 중요한 새로운 기회 감염성 병원체로 인식되고 있으며, 종종 병원내 감염을 야기한다. 녹농균 감염은 면역성 있는 개체에서 생명을 위협하는 질병이며, 그 식민지화는 낭포성 섬유증 환자에게 엄청난 문제가 되어 왔다. 여러 역학 연구에 따르면, 항균제에 노출된 후 새로운 내성이 생길 수 있기 때문에, 녹농균의 임상적 격리에서 항균제 내성이 증가하고 있음이 밝혀졌다.
클렙시엘라(Klebsiella; KP)는 또한 지역사회 획득성 세균성 폐렴 및 모든 병원 획득성 감염의 8%를 야기하는 흔한 그람음성 병원체이다. 폐렴간균에 의한 폐 감염은 종종 괴사이다. 지역사회 획득성 폐렴간균의 관찰된 사망률은 알코올성 환자의 50%에서 거의 100%에 이른다. 클렙시엘라종을 포함하는 카바페넴 내성 장내세균(Carbapenem-resistant enterobacteriaceae; CRE)은 CDC 보고서에 따르면 긴급 위협의 세균 중 하나이며, MRSA 및 PA 모두는 심각한 위협으로 분류된다.
본원에 기재된 발명은 이러한 문제를 해결하는 조성물 및 방법을 포함하고, 세균 오염 또는 감염이 대안적인 치료를 보증하는 경우에 적용 가능하다.
스캐폴드 물질, 특히 상피 조직의 자연 발생 세포외기질로부터 유래된 물질은 환자에게 적용될 때에 통합 반응을 이끌어 낸다. 세포외기질(extracellular matrix; ECM)은 성장, 발달 및 상처 회복 중에 중요한 구조적 및 기능적 거대 분자의 복합 혼합물로 구성된다. ECM으로부터 유래된 스캐폴드 물질은 비상피 유래된 ECM, 소장 점막하조직(SIS), 방광 점막하조직(UBS), 간(L-ECM) 및 방광 기질(Urinary bladder matrix; UBM)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
방광 기질은 미국특허 제6,576,265호에 기재된 생물학적 유래된 스캐폴드 세포외기질 물질로서, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로서 포함되며, 구조적 및 생물학적 특성을 모두 제공하는 천연 분자의 복합 혼합물로 구성되어 있고, 방광(이에 한정되지 않음)과 같은 상피 기저막 및 상피 조직의 다른 층에서 발견된다. UBM은 다양한 신체 시스템에서 건설적 리모델링이라고 하는 사이트 적합 조직 형성을 촉진하기 위해 효과적인 스캐폴드로 사용되었다. UBM 스캐폴드는 신체에 의해 완전히 재흡수되므로 조직에 대해 스캐폴드를 제공한다. 스캐폴드 및 분해 동역학의 조성으로 인해, UBM에 대한 숙주 반응은 리모델링 사이트에서 T 헬퍼 세포 및 M2 대식 세포의 유병률을 갖는 적응성 면역 반응에 의해 특징되고 있다. UBM의 분해는 건설적인 리모델링을 촉진할 수 있는 방출된 펩티드 프레그먼트를 야기하는 것으로 나타났다.
놀랍게도, 본원에 기재된 연구에서, 돼지 방광, 구체적으로 방광 기질(UBM)로부터 유래된 예시적인 ECM은 다수의 임상 MRSA, PA 및 KP 격리에 대해 주목할 만한 항생물막 활성 및 MSSA의 실험실 균주를 향해 인비트로 및 인비보 세균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 마우스 모델을 사용하여 인간과 동물에서 세균 감염을 예방, 감소 및/또는 제거하는데 UBM과 같은 ECM의 잠재적 유용성을 연구했다. 마우스에서 그람양성균(GPB) MSSA 및 MRSA, 및 그람음성균(PA) 유래된 호흡기 감염은 모두 호중구의 점증 증가, 및 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 상승을 동반하는 폐 세균 부하를 상당히 증가시킨다. 그러나, 기관내 주입을 통한 UBM 소화성의 외인성 투여는 세균 부하의 상당한 감소 및 세균 사이토카인/케모카인 분비의 약화에 의해 접종된 마우스를 심각한 폐 감염으로부터 보호했다. 또한, 물은 장기간의 시간 동안 실온에서 유지된 미리 제형화된 소화성 UBM뿐만 아니라, UBM의 비소화성 미립자 형태를 재구성하고, 마찬가지로 GPB 및 GNB 유래된 감염에 대해 UBM의 보호된 기능을 달성하여 세균 감염을 최소화하고 치료하기 위한 기성품 및 쉽게 접근할 수 있는 자원을 제공한다.
종합하면, 이하에 기재된 연구의 결과는 폐렴, 상처, 화상, 피부의 지속적인 감염, 분쇄된 골절, 방광염, 봉와직염, 국소 및 전신 세균 감염, 및 인간과 동물의 병원내 감염을 포함(이에 한정되지 않음)하는, 포유동물에서 GPB 및 GNB 유래된 감염을 제거하지 않으면, UBM을 감쇠에 대한 공지된 치료법의 대안 또는 보조제로서 사용하는 것을 지지한다.
일 양태에 있어서, 본원에 기재된 발명은 환자의 호흡기 감염(이에 한정되지 않음)과 같은 세균 감염의 치료 방법에 관한 것이며, 실활 고유 세포외기질 물질로부터 얻어지고 바람직하게는 실온에서 처리된, 비가교 미분화된 분말의 유효량을 기도(이에 한정되지 않음) 등의 적절한 경로를 통해 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 실활 고유 세포외기질은 비상피 조직, UBM, SIS 및 UBS로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 미분화된 분말은 비효소적으로 처리되며, 4주, 2개월, 6개월, 1년, 2년, 5년(이에 한정되지 않음) 등의 장기간의 시간 동안 실온에서 보관할 수 있고, 여전히 동물과 인간 세균 감염의 치료에 대한 효능을 유지한다.
상기 미분화된 분말에 의해 치료되는 세균 감염은 황색포도상 구균과 관련된 세균으로 구성된 세균(이에 한정되지 않음)과 같은 그람양성 세균, 녹농균 및 폐렴간균으로 이루어지는 군으로부터 선택된 세균(이에 한정되지 않음) 등의 그람음성 세균 및 관련 세균에 의해 야기될 수 있다.
호흡기 감염은 폐를 포함한 기도에 국한될 수 있고, 투여 경로는 흡입, 스프레이 또는 인공호흡기, 비강내 주입 또는 기관내 경로를 통한 경로를 포함한다. 또한, 투여 경로는 완충액에서 미분화된 ECM 입자로 환자의 기도를 세척하는 것을 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은:
상피 기저막을 포함하는 실활 세포외기질 물질로부터 얻어진 효소적으로 또는 비효소적으로 소화성 미분화된 분말을 포함하는 완충액에서 재구성된 물질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 재구성된 물질은 세포외기질의 하나 이상의 고유 성분을 포함한다. 완충제는 완충 생리식염수(이에 한정되지 않음)와 같은 임의의 생리학적 완충제로부터 선택될 수 있다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 치료적으로 유효량의 하나 이상의 세균에 대한 살균 활성을 포함하는 상피 조직의 미분화된 실활 세포외기질을 환자에게 투여함으로써 세균에 감염된 환자의 세균 생물막 형성을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 하나 이상의 세균은 MSSA, MSRA 황색포도상 구균, 폐렴간균 및 녹농균으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, 이에 한정되지 않는다. 처리는 세균 감염을 예방, 감소 또는 제거할 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상피 또는 비상피 조직의 실활 세포외기질 물질로부터 얻어진 완충액에 미분화된 분말을 포함하는 재구성된 물질을 제공함으로써 세균 유래 감염으로부터 포유동물을 보호하는 방법에 관한 것이며, 상기 재구성된 물질은 세포외기질의 하나 이상의 고유 성분을 포함하고, 및 유효량 물질을 기관내 주입, 비강내 흡입, 스프레이, 경구 흡입, 국소 적용, 세척 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 경로에 의해 치료적으로 투여하는 것을 포함하고, 이에 한정되지 않는다.
도면은 일반적으로 본 발명의 원리를 설명하는데 중점을 둔다.
도 1A~H는 PBS 추출된 UBM 상청액에 비해 MSSA에 대한 펩신 소화성 UBM이 증가된 항균 활성을 그래프로 도시한다.
도 1A는 PBS 추출된 UBM 상청액에 의한 MSSA 성장 억제를 그래프로 도시한다.
도 1B는 PBS 추출된 UBM 상청액의 존재 하에 MRSA의 성장을 그래프로 도시한다.
도 1C는 PBS 추출된 UBM 상청액의 존재 하에 녹농균(PAO1)의 성장을 그래프로 도시한다.
도 1D는 PBS 추출된 UBM 상청액의 존재 하에 폐렴간균의 성장을 그래프로 도시한다.
도 1E는 효소적으로 소화성 UBM에 의한 MSSA 성장 억제를 그래프로 도시한다.
도 1F는 효소적으로 소화성 UBM의 존재 하에 MRSA의 성장을 그래프로 도시한다.
도 1G는 효소적으로 소화성 UBM의 존재 하에 녹농균(PAO1)의 성장을 그래프로 도시한다.
도 1H는 효소적으로 소화성 UBM의 존재 하에 폐렴간균의 성장을 그래프로 도시한다. 광학 밀도의 측정은 배양 배지에서의 세균 성장을 나타낸다. 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터 얻어진다.
도 2A~D는 소화성 UBM(10㎎/㎏ 기관내(i.t.))을 야생형 FVB/NJ 마우스 폐로의 주입은 폐 독성을 야기하지 않음을 그래프로 도시한다.
도 2A는 PBS 및 UBM 처리된 마우스 폐에서의 총 염증 세포 및 백혈구 백분율 산정을 도시한다.
도 2B는 PBS 및 UBM 처리된 마우스 폐에서의 BAL의 총 단백질을 도시한다.
도 2C는 PBS 및 UBM 처리된 마우스 폐에서의 염증 관련 유전자의 발현을 도시한다.
도 2D는 PBS 및 UBM 처리된 마우스 폐에서의 상피 세포 관련 유전자의 발현을 도시한다. 결과는 UBM이 폐 독성을 야기하지 않음을 2A~D에 도시한다. 결과는 2 개의 독립적인 실험으로부터 평균±SEM이고; 각 그룹에 대해 n=5마우스이다.
도 3A~D는 UBM 처리된 마우스가 MSSA 유래된 호흡기 감염으로부터 보호되는 것을 그래프로 도시한다.
도 3A는 UBM 처리된 마우스에 비해 MSSA 감염 PBS 처리된 폐, BAL 및 총 폐 부하(BAL+폐 호모제네이트)의 CFU를 그래프로 도시한다.
도 3B는 UBM 처리된 마우스에 비해 MSSA 감염 PBS 처리된 마우스에서의 백혈구 백분율 산정을 그래프로 도시한다.
도 3C는 UBM 처리된 마우스에 비해 MSSA 감염 PBS 처리된 마우스에서의 염증 관련 유전자의 발현을 그래프로 도시한다.
도 3D는 UBM 처리된 마우스에 비해 MSSA 감염 PBS 처리된 마우스에서의 상피 세포 관련 유전자의 발현을 그래프로 도시한다. 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터 평균±SEM이고; 각 처리 그룹에 대해 n=4~6마우스이다. PBS 처리에 대한 UBM 처리의 비교를 위해 *p<0.05, **p<0.01이다.
도 4A~D는 MRSA 유래된 호흡기 감염으로부터 마우스를 보호하는 UBM 처리를 그래프로 도시한다.
도 4A는 마우스당 2×106CFU MRSA(USA300)로 접종된 연령-일치된 야생형 FVB/NJ 마우스에서의 BAL, 폐 및 총 폐 부하(BAL+폐 호모제네이트)의 상당히 감소된 CFU를 야기하는 UBM 처리를 그래프로 나타내고; UBM 처리된 마우스에 대한 MRSA 감염 PBS 처리된 마우스를 비교한다.
도 4B는 UBM 처리된 마우스에 비해 MRSA 감염 PBS 처리된 마우스에서의 백혈구 백분율 산정을 그래프로 도시한다.
도 4C는 UBM 처리된 마우스에 비해 MRSA 감염 PBS 처리된 마우스에서의 염증 관련 유전자의 발현을 그래프로 도시한다.
도 4D는 UBM 처리된 마우스에 비해 MRSA 감염 PBS 처리된 마우스에서의 상피 세포 관련 유전자의 발현을 그래프로 도시한다. 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터 평균±SEM이고; 각 처리 그룹에 대해 n=4~6마우스이다. PBS 처리에 대한 UBM 처리의 비교를 위해 *p<0.05, **p<0.01이다.
5A~D는 UBM이 GPB(MSSA 및 MRSA) 및 GNB(PA 및 KP) 세균의 생물막 형성을 상당히 억제한다는 것을 그래프로 도시한다.
도 5A는 상이한 농도의 UBM으로 처리한 후 MSSA의 생물막 형성을 도시한다.
도 5B는 상이한 농도의 UBM으로 처리한 후 MRSA의 생물막 형성을 도시한다.
도 5C는 상이한 농도의 UBM으로 처리한 후 PA의 생물막 형성을 도시한다.
도 5D는 상이한 농도의 UBM으로 처리한 후 KP의 생물막 형성을 도시한다. 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터 평균±SEM이다. 처리 그룹과 대조군 사이의 비교를 위해 ***p<0.005 및 ****p<0.001이다.
도 6A~D는 UBM 처리가 녹농균 유래된 호흡기 감염으로부터 마우스를 보호하는 것을 그래프로 도시한다.
도 6A는 UBM 대 PBS 처리된 마우스에서의 녹농균 감염 후 15시간에 BAL, 폐 및 총 폐 부하(BAL+폐 호모제네이트)의 CFU를 그래프로 도시한다.
도 6B는 UBM 처리된 마우스 대 PBS 처리된 마우스에서의 녹농균 감염 후 15시간에 백혈구 백분율 산정을 그래프로 도시한다.
도 6C는 UBM 처리된 마우스 대 PBS 처리된 마우스에서의 녹농균 감염 후 15시간에 염증 관련 유전자의 발현을 그래프로 나타낸다.
도 6D는 UBM 대 PBS 처리된 마우스에서의 녹농균 감염 후 15시간에 상피 세포 관련 유전자의 발현을 그래프로 도시한다. 도 6A~D에 도시되어 있는 결과에서는 감염 후 15시간에 UBM 처리 및 PBS 처리된 마우스 사이에서 통계적 차이를 나타내지 않는다. 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터 평균+SEM이고; 각 처리 그룹에 대해 n=5마리의 마우스이다. UBM 처리 대 PBS 처리의 비교를 위해 *p<0.005, 및 **p<0.01이다.
도 7A~B는 새로운 소화성 UBM(FD-UBM)과 유사한 생체 활성을 나타내는 미리 제형화된 UBM(PF-UBM)을 그래프로 도시한다.
도 7A는 MSSA(ATCC#49775) 및 MRSA(USA300)에 대한 UBM의 인비트로 항생물막 활성을 도시한다.
도 7B는 MRSA 감염 후 15시간에 마우스 BAL, 폐, 총 폐 부하(BAL+폐 호모제네이트) 및 비장에서의 세균 CFU에 의한 인비보 항균 활성을 도시한다. 7A~7B에 그래프로 도시되어 있는 결과에서는 MRSA 감염에 대한 그들의 보호에서 미리 제형화된 (PF-UBM) 및 새로운 소화성 (FD-UBM) UBM 사이에서 통계적 차이를 나타내지 않는다. PF-UBM 및 FD-UBM 모두는 마우스에서 MRSA 유래된 세균 감염에 대해 상당한 보호를 나타낸다. 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터 평균±SEM이고; 각 그룹에 대해 n=5마리의 마우스이다. 일원 분산 분석(ANOVA)에 따라, P값이 상당할 때에 Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하여 사후 비교를 행한다(P<0.05). 그룹 간의 비교를 위해 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005 및 ****p<0.001이다.
도 8A~C는 외인성으로 투여된 미리 제형화된 UBM이 호흡기 MRSA 감염에 의해 유래된 염증 반응을 상당히 약화시킨다는 것을 그래프로 도시한다.
도 8A는 FD-UBM, PD-UBM 및 PBS 처리된 마우스 폐를 비교하는 MRSA-감염된 마우스에서의 사이토카인 및 케모카인의 유전자 발현을 도시한다.
도 8B는 FD-UBM, PD-UBM 및 PBS 처리된 마우스 폐를 비교하는 MRSA-감염된 마우스에서 마우스 BAL의 사이토카인 및 케모카인의 단백질 분비를 도시한다.
도 8C는 MRSA-감염된 FD-UBM, PD-UBM 및 PBS 처리된 마우스 폐로부터 폐 섹션의 현미경 사진에서의 호중구 침윤 및 폐 손상을 도시한다. 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터 평균±SEM이고; 각 그룹에 대해 n=5마리의 마우스이다. 그룹 간의 비교를 위해 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005 및 ****p<0.001이다.
도 9A~B는 미리-제형화되고 비소화성 UBM(U-UBM)이 급성 중증 호흡기 MRSA 감염으로부터 숙주를 보호하는 것을 그래프로 도시한다.
도 9A는 PBS, U-UBM 및 PF-UBM으로의 처리를 비교하는 MRSA 감염된 마우스에서의 마우스 BAL, 폐 및 총 폐 부하(BAL+폐 호모제네이트)의 세균 CFU를 도시한다.
도 9B는 PBS, U-UBM 및 PF-UBM으로의 처리를 비교하는 MRSA 감염된 마우스에서의 Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, IL-17, Tnf-α 및 Nf-κb를 포함하는 염증성 사이토카인 및 케모카인의 발현을 도시한다. 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터 평균±SEM이다; 각 그룹에 대해 n=5마리의 마우스. 일원 분산 분석(ANOVA)을 이용하여 약물 처리된 감염된 마우스 및 PBS 처리된 감염된 동물을 비교하고, 사후 비교는 P-값이 상당할 때에 Dunnett의 다중 비교 시험을 이용하여 행한다(P<0.05). 그룹 간 비교를 위해 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005 및 ****p<0.001.
본원에 기재된 본 발명은 뮤린 폐렴 모델의 감염에 의해 예시된 바와 같이 인간과 동물에서 세균 감염의 치료를 위한 UBM과 같은 ECM의 용도에 관한 것이다. 이하에 기재된 프로토콜을 사용함으로써, MSSA-, MRSA-, 폐렴간균 및 녹농균 유래된 감염으로부터 숙주 보호를 위한 인비트로 및 인비보 UBM의 항균 활성을 조사했다. 이하에 보다 상세하게 기재되어 있는 결과에서는 UBM이 MSSA 및 MRSA의 실험실 세균 균주에 대한 살균 활성을 나타내고, 다수의 임상적 MRSA 분리주 및 녹농균에 대해 주목할 만한 항생물막 활성을 나타내는 것을 보여준다.
인간에서 세균 감염의 뮤린 모델을 사용하여, 마우스의 MSSA-, MRSA-, 녹농균 및 폐렴구균 유래된 호흡기 감염은 폐 세균 부하를 상당히 증가시키고, 호중구의 모집 증가와 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 증가를 수반한다. 기관내(i.t.) 주입을 통한 UBM 소화성의 외인성 투여는 세균 부하를 상당히 감소시키고 세균 사이토카인/케모카인 분비의 약화에 의해 접종된 마우스를 심각한 폐 폐렴으로부터 보호했다. 또한, UBM의 비소화성 미립자 형태뿐만 아니라, 실온에서 유지된 미리 소화되고 동결건조된 UBM의 수분 재구성은 GPB 및 GNB 유래된 폐렴에 대해 UBM의 보호된 기능을 유사하게 달성하여 인간과 동물의 세균 감염을 치료하기 위한 기성품 및 쉽게 접근 가능한 자원을 제공할 수 있다. 호흡기 감염의 뮤린 모델을 사용한 이들 연구 결과는 UBM이 인간과 동물의 세균 감염, 예를 들면 호흡기 MSSA, MRSA, 및 녹농균과 폐렴간균 세균 감염에 대한 보호를 위해 종래의 치료법에 대한 실행 가능한 대안 또는 보충제임을 나타낸다.
예시적인 재료 및 방법
UBM 소화성 제조
테스팅을 위한 아티클은 하기 기재된 바와 같이 인비보 테스팅을 위해 비소화성 UBM(U-UBM)으로 라벨링된 비멸균 형태의 미분화된 UBM 분말(ACell, Inc., Columbia, MD)로부터 제조된다.
간단히 말하면, 독점적인 ACell® UBM 분말(MicroMatrix®)은 시판 체중 돼지로부터 방광을 분리하고, 장막(tunica serosa), 근육층 외막(tunica muscularis externa), 점막하층(tunica submucosa) 및 근육층 점막(tunica muscularis mucosa)을 기계적으로 제거함으로써 제조되었다. 점막(tunica mucosa)의 관상 구조의 요로상피 세포를 탈이온수로 세척하여 기저막으로부터 해리시켰다. 나머지 조직은 상피 기저막, 및 UBM으로 지칭되는 점막의 인접한 점막고유층으로 구성되었다. 이어서, 나머지 조직을 150rpm에서 2시간 동안 4% 에탄올로 0.1% 과아세트산에서 교반함으로써 탈세포화했다. 이어서, 조직을 1X PBS 및 멸균수로 광범위하게 린싱했다. UBM의 제조에는 가교제, 세제, 펩티다아제 또는 프로테아제가 사용되지 않았다. 그 후에, 조직을 동결건조시킨 다음, #60 메쉬 스크린을 갖는 Wiley Mill(Thomas Scientific, NJ)을 사용하여 분말 입자 형태로 밀링했다. 이어서, UBM 분말을 Tapping Sieve Shaker(Gilson, OH)를 사용하여 150-미크론 스크린을 통해 4시간 동안 체로 쳤다. 또한, 동결건조된 UBM을 Cryomill 샘플 챔버에 맞게 작은 조각으로 절단하고 냉각, 셰이킹 및 휴식 단계를 교대로하여 Cryomill instrument(Retsch, Haan, Germany)를 사용하여 2시간 반 동안 처리했다.
대안적인 실시형태에 있어서, 미분화된 UBM 분말은 또한 효소적으로 소화되어 본원에 그 전체가 참조에 의해 포함되는, D.O. Freytes, J. Martin, S.S.Velankar, A.S. Lee, S.F. Badylak, Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix, Biomaterials 29(11)(2008) 1630-7에 기재된 바와 같이 스톡 UBM 소화성 용액을 생성했다. 간단히, 0.01 HCl 및 120㎎의 돼지 펩신(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)의 용액을 용해될 때까지 혼합했다. 본원에 그 전체가 참조에 의해 포함되는, T.W. Gilbert, D.B. Stolz, F. Biancaniello, A. Simmons-Byrd, S.F. Badylak, Production and characterization of ECM powder: implications for tissue engineering applications, Biomaterials 26(12)(2005) 1431-5에 따라 제조된 비멸균 UBM(MicroMatrix®) 미립자 1.2g을 펩신 용액에 첨가하여 원하는 저장 용액 농도를 달성하고 완전히 용해될 때까지 실온에서 약 48시간 동안 교반했다. 이어서, 소화성 UBM 용액을 얼음 배스를 사용하여 5℃로 냉각시켰다. 교반하면서, 12mL의 10X 포스페이트 완충 식염수(PBS), 5mL의 0.02M NaOH 및 3mL의 탈이온수를 첨가하여 UBM 소화성을 중화시켰다. 이어서, pH를 테스트하여 중화가 달성되었는지 확인했다. 미리 제형화된 UBM(PF-UBM)의 경우, 얻어진 중화된 소화성을 원심분리 튜브에서 앨리쿼트하고 하룻밤 동결시켰다. 중화된 PF-UBM 소화성 튜브를 제거한 다음 동결건조한 후, 샘플을 전자빔 조사를 사용하여 포장하고 멸균했다. 실험에 필요할 때까지 샘플을 실온에 보관했다. 새로운 소화성 UBM(FD-UBM) 및 PF-UBM 그룹(미리 제형화되고 동결건조 및 멸균 소화된) 모두에 대해, 궁극적으로 하기 기재된 바와 같이 개별 실험을 위해 원하는 최종 농도로 시험 아티클을 제조했다.
생쥐 및 축산
야생형 FVB/NJ 마우스를 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)로부터 구입하여 12시간 명/암 사이클에서 특정 병원체가 없는 상태로 유지했다. 모든 과정은 실험실 동물 관리를 위한 미국 협회(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care; AAALAC)에 보관된 환기 마이크로 분리기 케이지에 유지된 8-9주령의 마우스를 사용하여 수행되었다. 동물과 관련된 프로토콜 및 연구는 국립보건원(National Institutes of Health)의 지침에 따라 수행되었고, 피츠버그 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다.
세균
그람양성(GPB) 황색포도상 구균 균주(MSSA ATCC #49775 및 MRSA US A300), 및 그람음성 GNB 녹농균(PA01, ATCC BAA-47) 및 폐렴간균(KP, B3)을 모든 실험에 사용했다. 이들 세균의 그람양성 및 그람음성 균주는 인간 건강에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 단일 콜로니로부터 얻어진 세균들을 15% 글리세롤/트립신 대두(TSB)의 -80℃에서 앨리쿼트로 저장했다. 각각의 실험에 대해, 오트클레이즈된 TSB의 37℃에서 16시간 동안 앨리쿼트의 세균을 셰이킹하면서 성장시켰다. 하룻밤 성장한 세균의 앨리쿼트의 1mL를 5mL의 신선한 TSB로 희석시킨 다음, 37℃에서 2시간 더 셰이킹하면서 배양했다. 세균을 2회 세척하고 10mL 포스페이트-완충 식염수(PBS)에 재현탁시켰다.
폐 독성
UBM의 인비보 폐 독성은 마우스 폐로의 기관내(i.t.) 투여에 의해 검사되었다. FVB/NJ 마우스를 1㎎/㎏~10㎎/㎏ 범위의 mL당 상이한 농도의 UBM에서 50㎕ PBS로 기관내(i.t.) 세척했다. 본원에 그 전체가 참조에 의해 포함되는, Y.P.Di, Assessment of pathological and physiological changes in mouse lung through bronchoalveolar lavage, Methods Mol. Biol. 1105(2014) 33-42에 기재된 바와 같이 폐 조직은 세척되었고, UBM 투여 후 24시간에 채취하고, 실시간 PCR 분석을 이용한 유전자 발현뿐만 아니라, 기관지폐포 세척(bronchoalveolar lavage; BAL)의 총 단백질, 젖산 탈수소효소(LDH), 총 백혈구 및 백혈구 백분율 산정에 의한 독성에 대해 분석했다.
세균에 대한 마우스의 인비보 노출
마우스를 이소플루란의 흡입으로 마취시키고, 50㎕ PBS에서 마우스당 ~2×106CFU(통상 감염) 또는 ~2×107CFU(중증 감염)의 비강내(i.n.) 주입을 통해 ATCC #49774, USA300 또는 PA01로 처리했다. 대조군 마우스는 50㎕의 PBS를 비강내 접종했다. 세균 접종 1시간 후, 마우스에 50㎕의 UBM을 10㎎/㎏으로 기관내 주입하고 50㎕의 PBS로 마우스를 제어했다. 이어서, UBM 투여 14시간 후에 마우스를 희생시켜 세균 감염 및 후속 처리에 대한 급성 숙주 반응을 조사했다.
CFU 분석
CFU의 수는 TSB 한천 평판 상에 연속 희석 및 정량 배양에 의해 결정되었다. 좌측 폐엽을 1mL 식염수로 균질화하고 얼음 위에 놓았다. 100㎕의 폐 조직 호모제네이트 또는 기관지 폐포 세척액(BALF)의 희석액을 900㎕의 식염수와 혼합했다. 식염수 중 4회 연속 10배 희석물을 제조하여 TSB 한천 평판 상에 플레이팅하고, 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 각각의 희석액을 3회 플레이팅했다. 이어서, 콜로니를 계산하여 생존한 세균을 log10 단위로 발현시켰다.
BALF 및 백혈구 백분율 산정
세균 감염의 치료 후 15시간(UBM 투여 후 14시간)에, 마우스(5마리 마우스/그룹)를 2.5% 트리브로모에탄올(Avertin)로 마취시켰다. 기관에 캐뉼라를 삽입하고, 폐를 1mL 식염수를 사용하여 2회 용리시키고 BALF 샘플을 모았다. 16㎕ 앨리쿼트를 4㎕ 아크리딘 오렌지(MP Biomedical, Santa Ana, CA)로 염색하고, 세포를 Vision Cell Analyzer cell counter(Nexcelom, Lawrence, MA)로 계산했다. 추가 앨리쿼트를 유리 현미경 슬라이드(Shanon Cytospin; Thermo Fisher, Pittsburgh, PA)에 놓고, Diff-Quick으로 염색시키고; 현미경으로 백혈구 백분율 산정을 측정했다. 모든 슬라이드의 총 400개의 세포를 염증성 백혈구 백분율 산정에 대해 적어도 2회 계산했다.
실시간 PCR 분석
Trizol 시약(Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 WT 및 Spluncl KO 마우스의 우측 폐 조직의 상부 2개의 로브로부터 총 mRNA를 단리했다. 정량적 PCR(qPCR)은 ABI7900HT(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 Muc5ac, Muc5b, CCSP, Foxj1, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl5, NF-κB, IL-6, IL-10, IL-1a, Ccl20의 프라이머를 사용하여 수행되었다. 표적 유전자에 대한 동등한 PCR 효율을 확인하기 위해 검증 테스트를 수행했다. 테스트 및 캘리브레이터 폐 RNA는 고용량 cDNA 역전사 키트(Life Technologies)를 사용하여 역전사되고, PCR은 다음과 같이 증폭되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40사이클; 15초 동안 95℃; 1분 동안 60℃. 3개의 복제물을 사용하여 관심있는 전사물 및 정규화용 전사물의 평균 사이클 임계값을 계산했다(β-글루쿠로니다아제[GUS-B]; 주문형 평가; 응용 바이오시스템). 상대적인 mRNA 존재도는 ΔΔ 사이클 임계값(Ct) 방법을 사용하여 계산되었다.
사이토카인 분석
BAL의 사이토카인 레벨을 마우스 Cytokine Multiplex Panel Milliplex assay(Millipore, Billerica, MA)을 사용하여 정량했다. IL-β, IL-6, IL-10, IL-12(p70), IL-17, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, KC, IP-10, VEGF 및 MIP-Iα의 발현은 제조자의 지시에 기초하고 Y. Zhang, R. Birru, Y.P. Di, Analysis of clinical and biological samples using microsphere-based multiplexing Luminex system, Methods Mol Biol 1105(2014) 43-57에 앞서 기재된 바와 같이 Luminex 분석 시스템을 이용하여 분석했다. 표준 재조합 단백질 용액을 사용하여 각각의 분석된 단백질에 대한 표준 곡선을 생성했다. 각각의 사이토카인에 대한 표준 곡선으로부터 절대 사이토카인 농도를 계산했다.
폐 조직병리학
감염 후 15시간에 폐 조직을 채취하고, 흉강을 개방한 상태에서 10분 동안 10㎝ H20에서 4% 파라포름알데히드로 부풀려 인시투(in situ) 고정시켰다. 우측 로브를 파라핀에 매립하고 5㎛ 섹션을 제조했다. 섹션을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, 세균 감염 유래된 병리학적 심각성을 검사하기 위해 조직학적 평가를 수행했다. 염색된 폐 섹션을 조직병리학적 염증 스코어링 시스템을 이용하여 광학현미경 하에 이중 블라인드 방식으로 평가했다.
생물막 분석
O'Toole 및 Kolter에 의해 개발된 약간 변형된 버전의 마이크로타이터 플레이트 분석법은 Y. Liu, M E. Di, H.W. Chu, X. Liu, L. Wang, S. Wenzel, Y.P. Di, Increased susceptibility to pulmonary Pseudomonas infection in Spluncl knockout mice, J Immunol 191(8)(2013) 4259-68 및 G.A. O'Toole, R. Kolter, Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development, Molecular microbiology 30(2)(1998) 295-304에 기재된 바와 같이 사용했고, 모두는 본원에 그 전체가 참조로서 포함된다.
간단히, 세균의 하룻밤 플랑크톤 배양물을 UBM 또는 항생제 대조군과 함께 또는 없이, 96-웰 배양 처리된 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)에서 100㎕의 DMEM에 접종했다. 성장 배지만으로 채워진 웰을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 37℃에서 3시간 동안 배양한 후, 크리스탈 바이올렛의 0.5%(w/v) 수용액으로 15분 동안 결착된 세포를 염색함으로써 표면-부착성 생물막 형성을 측정했다. 증류수로 린싱한 후에, 95% 에탄올을 사용하여 염색된 세포로부터 결합된 염료를 방출시키고, 590㎚에서 광학 밀도를 측정했다.
데이터 분석
데이터는 평균±SEM으로 표현된다. 마우스 그룹 사이의 통계적 비교는 ANOVA를 이용하여 이루어진 후, Dunnett의 다중 비교 테스트(한 가지 방법으로 ANOVA)를 수행했다. p값<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
결과
인비트로 연구
UBM은 인비트로 항균 활성을 나타낸다.
UBM이 세균에 대한 성장 억제를 나타낼 수 있는 임의의 성분을 함유하는지를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 4㎎/mL(ACell, Inc.)의 농도로 식염수에 미분화된 UBM 분말을 현탁시켜 항균 활성을 테스트했다. 호흡기 감염과 관련이 있는 가장 일반적인 세균 균주이기 때문에, GPB(MMSA 및 MRSA)뿐만 아니라 GNB(녹농균 및 폐렴간균)를 포함한 다수의 일반적인 호흡기 세균 감염의 패널을 테스트했다.
UBM의 2가지 상이한 제조가 수행되었다. 첫번째는 PBS에서 UBM(MicroMatrix®, ACell, Inc.)의 분말 형태를 간단히 현탁시키고, 미용해된 물질을 원심분리하여, 항균 펩타이드(AMP)와 같은 항균제가 세균 성장을 억제하는 상청액에서의 활성을 유지한다는 개념으로 UBM(UBM 상청액)의 가용성 부분을 수집하는 것이다.
두번째 방법은 상기 기재된 바와 같이 UBM을 펩신으로 효소적으로 소화시켜 기질 물질(소화된 UBM)로부터 펩티드와 같은 모든 잠재적인 항균성 분자를 추출하는 것이다. 로그 단계에서 성장한 모든 테스트된 세균을 사용하여 세균을 직접 사멸시킬 때에 비소화성 또는 소화성 UBM 물질의 항균 활성을 측정했다.
도 1A~C를 참조하면, UBM 상청액은 GPB(MSSA 및 MRSA)(도 1A, 1B) 또는 GNB(PA 및 KP)(도 1C, 1D)에 대해 눈에 띄는 임의의 항균 활성을 나타내지 않았다. 소화성 UBM은 MSSA에 대해 인비드 살균 활성을 갖지만(도 1E), 다른 GPB(MRSA; 도 1F) 또는 GNB(PA 및 KP; 도 1G, 1H)에 대해서는 인비드 살균 활성을 갖지 않았다. 소화성 UBM이 UBM의 가용성 성분에 비해 향상된 항균 활성을 나타내기 때문에, UBM 기반 살균 활성을 돕는 PBS 가용성 성분 대신에 프로테아제 소화 후 기질로부터 일부 항균성 분자가 방출되는 것으로 보인다(도 1). 따라서, 소화성 형태의 UBM은 이하에 기재된 본 연구 내에서 2개의 인비보 실험 그룹에 사용되었다. 다른 실험 그룹에서, 인비보 미분화된 비소화성 UBM 분말은 폐로 주입시에 물질이 분해될 것이라는 예상에 따라, 뮤린 폐렴 모델에서 세척으로서 사용되었다.
UBM에 대한 인비보 연구-조직 내성
UBM은 폐에 잘 견디며 폐 독성을 나타내지 않는다.
이하의 연구는 UBM이 폐에 독성이 없고 폐 손상을 야기하지 않음을 입증한다.
8~9주령의 FVB/NJ 마우스를 상이한 농도(0.1, 0.5, 1 및 2㎎/mL)로 50㎕ 소화성 FD-UBM으로 마우스 폐에 기관내(i.t.) 주입하여 0.25, 1.25, 2.5 또는 5㎎/㎏의 투여량을 얻었다. 비히클 대조군만 받은 마우스의 대조군과 UBM 주입 마우스 그룹 사이에서 독성의 다수의 지표(BAL에서의 총 세포수 및 LDH, 폐 상피 세포의 유전자 발현 및 Nf-κb 포함)를 비교할 때에 상당한 변화는 확인되지 않았다. 마우스 폐(200㎍/마우스 폐)에서 10㎎/㎏의 얻어진 용량에 대해 더 높은 농도의 소화성 UBM(4㎎/mL)도 평가되었다.
도 2를 참조하면, 10㎎/㎏의 더 높은 UBM 농도에서도, 거의 모든 측정에서 비히클과 FD-UBM 처리된 그룹 사이의 마우스에서 비교할 수 있을 정도로 유지되었다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 호중구의 최소 증가는 FD-UBM 처리된 그룹에서 관찰되었고, 이는 마우스 폐에서 총 백혈구의 약 3~4%를 차지하지만 통계적으로 유의하지는 않았다. 유사하게, 도 2B에 도시된 폐의 총 단백질(폐 손상에 대한 지표로서)은 PBS 대조군과 FD-UBM 처리된 마우스 그룹 사이에서 차이를 나타내지 않았다. 도 2C를 참조하면, 마우스 폐에 UBM을 투여한 후에(총 200㎍/마우스에 대해 10㎎/㎏), Ccsp(클럽 세포에 대해), Foxj 1(섬모 세포에 대해), 및 Muc5ac(배상 세포에 대해), 및 Muc5b(점액 세포에 대해)를 포함한 상피 세포 관련 유전자의 발현은 눈에 띄는 임의의 변화를 나타내지 않았고, 도 2D에 도시된 바와 같이 TLR-2, TLR-4, Tnf-α 및 Nf-κb에서 염증 관련 유전자의 발현도 없었다. 이들 데이터는 최고 농도(10㎎/㎏)에서 마우스 폐로 UBM을 투여하면 폐 상피 세포 무결성을 방해하지 않거나 염증 반응을 유발하지 않았음을 시사한다.
인비보 UBM 향균성 연구
UBM은 호흡기 감염의 뮤린 모델에서 MSSA에 대한 인비보 항균 활성을 나타낸다.
UBM의 외인성 투여가 황색포도상 구균 유래된 감염으로부터 숙주를 보호할 수 있는지를 테스트하기 위해서, 뮤린 폐렴 모델을 사용하여 인비보 UBM 기반 항균 활성을 측정했다. 연령 일치 FVB/N 마우스에 ~2×106CFU/Lung의 용량으로 MSSA(ATCC #49775)를 기관내(i.t.) 주입했다. 10㎎/㎏의 FD-UBM 50㎕를 세균 감염 후 1시간에 전달하여(i.t.) 호흡기 세균 감염에 대한 UBM의 치료 효과를 테스트했다. 세균 감염 후 15시간에, 도 3A에 도시된 바와 같이, FD-UBM으로 처리된 마우스는 BAL 및 폐 모두에서 세균수가 상당히 감소된 것으로 나타났다. 따라서, 세균 감염 후 1시간에 UBM으로 처리된 마우스 그룹에서의 총 폐 세균 부하는 초기 폐 세균 부하에 비해 6배 이상 크게 감소되었다. 예상치 못하게, 도 3B에 도시된 바와 같이, PBS- 및 FD-UBM 처리된 마우스 그룹 모두는 BAL에서 총 염증성 세포수 및 대식 세포와 호중구의 백혈구 백분율 산정을 나타내지 않았기 때문에, 세균 부하의 차이는 총 백혈구의 수에 영향을 미치지 않았다. 또한, 도 3C에 도시된 항 염증성 사이토카인 IL-10 및 전염증성 사이토카인 IL-6, Nf-κb 및 Tnf-α의 발현에 상당한 차이는 없었고, 도 3D에 도시된 바와 같이 기도 상피 세포 관련 유전자에서 뚜렷한 변화는 관찰되지 않았다.
UBM은 MRSA 유래된 호흡기 감염으로부터 마우스를 효과적으로 보호한다.
MSSA를 사용하여 상술한 것과 유사한 뮤린 황색포도상 구균 감염 실험 세트를 뮤린 폐렴 모델에서 MRSA(US A300)를 사용하여 수행했다. 도 4A를 참조하면, FD-UBM MRSA-감염된 마우스는 상술한 MSSA를 사용한 연구에 비해 BAL 및 폐 모두에서 세균수를 상당히 증가시켰다. 그러나, 대부분의 세균(MRSA)은 MSSA보다 폐에 단단히 결합되어 BAL(~1.8×104CFU/폐)에서 린싱되기보다는 폐에 남아있었다(~105CFU/폐, 총 폐 세균 CFU의 ~84%).
유리하게도, 외인성 투여된 UBM은 인비보 MRSA에 대해 효과적인 것으로 보이는데, 이 처리는 MRSA 유래된 호흡기 감염에 대해 마우스에서의 항균 활성을 나타냈기 때문이다. PBS 대조군만으로 처리된 마우스와는 대조적으로, FD-UBM으로 처리된 마우스에서 총 폐 MRSA 세균 부하의 80% 이상 감소가 관찰되었다. MRSA 노출된 마우스로부터 FD-UBM 처리된 BAL의 총 백혈구는 PBS 대조군 그룹보다 약간 적었지만 통계적 유의성을 나타내지는 않았다(도 4B). 도 4C 및 4D에 도시 한 바와 같이, UBM 처리 MRSA 노출된 마우스의 염증 관련 및 상피 세포 관련 유전자 발현은 UBM 미처리 MRSA 노출된 마우스보다 낮은 발현을 나타내는 경향을 보였지만, 통계적 유의성을 나타내지는 않았다.
UBM 생체활성은 인비보 세균 부착을 방지한다.
MSSA 및 MRSA 모두에 공통적인 UBM 매개된 항균성 메카니즘은 인비트로 MRSA에 대해 직접적인 사멸 활성을 갖는 것으로 보이지 않지만(도 1), MRSA에 대해 우수한 인비보 항균 활성을 나타낸다(도 4). 접종된 세균은 뮤린 폐렴 모델에서 점막-섬모 제거율에 의해 폐 밖으로 밀려나지 않기 위해 상피에 부착되어야 하기 때문에, 마우스 폐로의 UBM 투여는 마우스 폐 상피에 대한 세균 부착을 명백히 방지한다.
FD-UBM의 존재 하에 MSSA 및 MRSA의 세균 부착(이하에 기재됨)은 생물막 형성 분석의 이용을 통해 다양한 농도로 조사되었다. MSSA, MRSA, PA 및 KP에 대한 FD-UBM의 항생물막 효과의 결정은 상기 기재된 바와 같이 크리스탈 바이올렛 염색(OD620)을 통해 비생물 표면 상의 생물막 바이오매스를 측정함으로써 수행되었다. 0.0625㎎/mL보다 높은 농도에서의 FD-UBM은 배양 플레이트에 대한 도 5A의 MSSA 및 도 5B의 MRSA의 세균 부착을 효과적으로 감소시켜, 생물막 형성의 개시를 방지했다.
FD-UBM 매개 항생물막 활성이 광범위한 스펙트럼인지 또는 GPB로만 한정되는지를 결정하기 위해서, FD-UBM의 항생물막 활성은 녹농균(PA) 및 폐렴간균(KP)을 포함한 관련 호흡기 GNB 병원체에 대해 상기 언급된 생물막 형성 분석으로 테스트되었다. 본 발명의 결과는 FD-UBM이 또한 GNB에 대해 우수한 항생물막 활성을 보유함을 나타냈다(도 5C 및 5D).
UBM은 녹농균 유래된 호흡기 감염으로부터 마우스를 보호한다.
또한, UBM 매개 항생물막 활성이 GNB 세균 감염으로부터 숙주를 보호할 수 있는지를 추가로 평가하기 위해서, 뮤린 호흡기 감염 실험을 녹농균(PAO1)를 사용하여 유사하게 수행했다. 연령-일치된 야생형 FVB/NJ 마우스는 마우스당 1×107CFU 녹농균(PAO1)을 기관내 접종했다. 또한, 외인적으로 투여된 미리 제형화된 UBM(PF-UBM)은 GNB 녹농균 유래된 호흡기 감염으로부터 마우스를 효과적으로 보호했다(도 6A~D). 이들 데이터는 도 5에서 입증된 PF-UBM 매개 항생물막 활성이 숙주가 인비보 세균 감염과 싸우기 위해 일반적인 보호 메커니즘에 기여할 가능성이 있음을 시사한다.
미리 제형화된 UBM은 재구성 후 항균 활성을 유지한다.
온전한 UBM은 인비트로 분해되지 않는 것으로 알려져 있고, 비교의 용이성을 위해 인비보 사용되므로, 새로운 소화성 UBM(FD-UBM)을 인비트로 연구에서 사용했다(도 1 및 5). 그러나, 새로운 소화성 UBM을 사용하는 것은 임상 환경에서 실용적이지 않다. 폐 감염의 부상에 신속하게 대응할 필요가 있기 때문에, 폐 보호를 위해 새로운 소화성 UBM의 특성을 유지하기 위한 기성품 형태의 미리 제형화된 동결건조 및 멸균 UBM(PF-UBM) 소화성이 새로운 소화성 USB보다 유리하다.
이들 연구를 위해서, 3개 배치의 동결건조된 PF-UBM을 인비트로 및 인비보 항균 활성에 대해 별도로 테스트하고, 상기 기재된 항생물막 측정 방법을 이용하여 FD-UBM(사용 직전에 실험실에서 제조)과 비교했다. 수년 동안 보관할 수 있는 PF-UBM 용액은 FD-UBM에 대한 녹농균 및 MRSA의 억제가 인비트로 매우 유사하게 나타났다(도 7A). 또한, 동결건조된 PF-UBM은 뮤린 폐렴 감염 모델에서 녹농균 및 MRSA로부터 숙주를 보호하는데 있어서 PF-UBM과 유사한 인비보 항균 활성을 입증했다(도 7B).
염증 반응 관련 사이토카인 및 케모카인의 유전자 및 단백질 발현에 대한 PF-UBM 및 FD-UBM 처리의 효과를 추가로 평가하기 위해서, 도 8A에 나타낸 바와 같이, 실시간 qPCR 및 Luminex를 이용하여 마우스 폐 및 BAL 샘플을 각각 분석했다. 마우스는 약 2×106CFU의 MRSA i.t.로 감염되었고, MRSA로 접종 1시간 후 10㎎/㎏의 PF-UBM 또는 FD-UBM i.t. 중 어느 하나로 처리되었다. 도 3 및 4에 검사된 바와 같이, 여러 유전자가 마우스의 PBS- 및 UBM 처리된 그룹 사이의 차이를 나타내지 않고, 추가 유전자 및 단백질이 평가를 위해 선택되었다. 예상치 못하게, 도 8A를 참조하면, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl1O 및 Ccl20과 관련하여 PBS 처리된 대조군 마우스보다 FD-UBM 처리된 마우스에서 현저히 낮은 유전자 발현이 검출되었지만, Tnf-α, IL-1α 및 IL-6은 그렇지 않았다. 또한, PF-UBM은 IL-6을 제외한 Cxcl1, Cxcl2, Cxcl3, Cxcl1O, Ccl20, Tnf-α 및 IL-1α의 모든 검사된 유전자 발현에 대해 상당한 억제를 나타냈다(도 8A). Cxcl1 및 IL-6의 BAL에서 분비된 단백질 양은 PBS 처리된 대조군 마우스보다 PF-UBM 및 FD-UBM 처리된 마우스 모두에서 상당히 더 낮았다(도 8B). BAL에서 Cxcl1O, IL-12, Tnf-α 및 RANTES의 분비와 관련하여 상당한 차이는 없었지만, IL-17 및 MIP-1α는 UBM 처리 후 낮은 발현의 경향을 나타냈다(도 8B).
염증성 사이토카인 및 케모카인의 감소된 발현은 도 8C에 예시된 UBM 처리 후 MRSA(USA 300) 감염된 마우스의 폐 병리학적 분석에 또한 반영되었다. 또한, PF-UBM 및 FD-UBM 처리된 마우스 모두는 MRSA에 대해 향상된 세균 제거율을 나타냈다(도 8C). 결과는 PF-UBM 및 FD-UBM 모두가 MRSA 유래된 호흡기 감염으로부터 숙주를 보호하는데 필적하고 효과적이라는 것을 나타낸다.
미리 제형화되고 비소화성 UBM은 다량의 세균 유래된 호흡기 감염에 대한 보호 효과를 나타낸다.
환자의 급성 중증 GPB 및 GNB 유래된 호흡기 감염의 치료에 있어서 UBM의 유용성을 시험하기 위해서, MRSA 및 녹농균은 뮤린 폐렴 모델에서 이전에 사용된 CFU보다 더 높은 세균 부하(10×)을 접종했다. 녹농균의 MRSA(US A300)를 ~2×107CFU/Lung의 용량으로 FVB/N 마우스 내로 i.n.을 통해 주입시켰다. 10㎎/㎏의 식염수에 현탁된 PF-UBM 및 비소화성 온전한 형태의 미립자 UBM(U-UBM)을 세균 감염 후 1시간에 전달했다(i.t.). 도 9를 참조하면, PF-UBM 및 U-UBM 처리는 PBS 처리된 마우스 그룹에 비해 총 폐 세균 부하를 상당히 감소시켰다.
결론
본원에 기재된 환자에게 GPB 및 GNB 유래된 세균 감염을 퇴치하기 위한 치료적 용도에서 예시적인 ECM으로서 UBM을 사용하는 잠재적 항균 효과를 평가하기 위해 행해진 일련의 인비트로 및 인비보 실험의 결과는 소화성 UBM의 형태가 인비트로 MSSA에 대한 생리적 완충제 PBS 추출된 UBM의 상청액보다 더 우수한 항균 활성을 나타낸다는 것이다. 소화성 UBM은 인비트로 MRSA 또는 녹농균에 대한 직접적인 살균 활성을 나타내지 않지만, PF-UBM 및 U-UBM의 기관내 주입은 뮤린 호흡기 폐렴 모델에서 MSSA-, MRSA- 및 녹농균 감염된 마우스 모두에 대해 효과적으로 보호되었다. 황색포도상 구균 및 녹농균은 감염과 관련된 일반적인 병원체이기 때문에, 이들 감염에 대한 UBM의 항균 활성은 UBM을 피부와 폐를 포함하는(이들에 한정되지 않음) 다수의 조직에서 외상성 급성 부상 및 화상을 포함한 다양한 상처를 치료하기 위해 자주 사용될뿐만 아니라, 비국소 치료적 용도 예를 들면, 흡입 또는 시스템적 치료적 용도로서 잠재적으로 사용될 수 있다.
세균 유래 폐렴으로부터 숙주의 보호에 있어서 비소화성 UBM, 새로운 소화성 UBM 및 미리 제형화된 소화성 UBM의 인비보 항균 활성은 총 폐 세균 부하에서 평균적으로 약 5~6배 감소했다(~80%~85% 보호). 다른 연구에 사용된 다른 염증 관련 유전자 녹아웃 마우스(IL-17 녹아웃 마우스 등)가 폐에서 MRSA 세균 부하를 약 2~3배 줄일 수 있었기 때문에, 입증된 인비보 결과는 바이오버든을 감소시키는 UBM의 이점을 설명했다. 또한, 미리 제형화된 PF-UBM은 도 9에 도시된 바와 같이 심각한 호흡기 MRSA 감염을 유래하기 위해 마우스 폐에 중증 접종(정상보다 10배 높은 MRSA의 CFU)을 투여할 때에도, MRSA 감염을 감소시키는데 효과적이었다. PBS 처리된 마우스에서 증가된 폐 세균 부하는 PF-UBM 처리된 마우스보다 250배 이상 높았고, U-UBM 처리된 마우스보다 87배 높았다. 이들 결과는 UBM이 포유동물의 세균 감염 환경에서 인비보 치료적임을 보여준다. 이론에 얽매이지 않고, UBM은 제한된 수의 세균만이 상피에 부착되는 것을 허용할 수 있는 반면에, UBM은 MRSA가 마우스 폐로 귀환하는 것을 방지한다.
UBM이 인비보 강력한 항균 활성을 나타낼 가능성이 있는 메커니즘 중 하나는 인비보 효소 분해 후 강력한 항생물막 형성 활성이다. 세균은 함께 그룹화되어 표면에서 서로 달라붙어 생물막을 형성하고, 그 후에 표현형 및 유전자 발현의 변화를 겪는 경향이 있다. 인간 전염병의 80% 이상이 세균성 생물막 형성과 직접 관련이 있는 것으로 추정되지만, 현재까지 대부분의 세균 연구는 생물막 관련 세균이 아닌 자유 유영성, 플랑크톤 세균에 대해 수행되었다. 생물막 관련 세균은 세균 군집의 병인에서 플랑크톤 형태보다 훨씬 더 중요하다. 생물막 형성에 있어서 UBM의 잠재적인 방식 중 하나는 UBM의 생물물리적 특성에 기인하고, 이는 폐로의 세균 귀환을 늦추거나 상피 상에 보호층을 형성하여, 상피 표면에서의 생물막 형성을 감소시킬 수 있다. UBM의 성분은 세균이 폐 상피 세포에 부착하는 능력을 상호작용하거나 중화시킬 수 있다.
본원에 기재된 결과는 인비보 외인적으로 투여되는 UBM이 세균 감염에 대한 효율적인 보호를 제공한다는 것을 설명한다. UBM 처리된 마우스에서 관찰된 강화 된 세균 제거율은 UBM과 다른 항균성 펩티드, 예를 들면 디펜신 및/또는 리소자임과 같은 항균성 단백질과의 상호작용으로 인해 그 항균 활성을 강화시킬 수 있다.
또한, 사이토카인은 면역학적 및 염증 과정의 규제 및 조절에 중요한 역할을한다. 일반적으로, 미생물 생성물의 인식에 따라, 상피 세포 내에서 TLR 매개된 신호전달을 호중구의 후속 모집을 규제하는 2개의 초기 반응 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β의 생성을 야기한다. 염증 매개체의 잘 규제되고 균형잡힌 생산은 세균 감염에 대한 효과적인 국소 및 전신 숙주 방어에 중요하다.
본원에 개시된 연구에서, IL-6, IL-10 및 TNF-α와 같은 대부분의 염증성 사이토카인은 일반적인 용량 유래된 세균 감염 후 PBS- 및 UBM 처리된 마우스 사이에서 눈에 띄게 변하지 않았다(도 3, 4 및 5). 그러나, 여러 사이토카인 및 케모카인은 PBS 처리된 마우스 그룹에 비해 UBM 처리된 마우스 그룹에서 상당히 감소했다(도 8 및 9).
세균 감염의 공지된 치료 방법에 비해 본 연구에서 확인된 UBM의 중요하고 예상치 못한 이점 중 하나는 미리 제형화된(미리 소화되고, 동결건조 및 멸균된) PF-UBM이 실온에서 장기간 보관된 후에도 MSSA 및 MRSA 유래된 감염에 대해 항균 활성을 유지한다는 것이다. 이 연구에 사용된 PF-UBM을 인비트로 및 인비보 실험 모두에 사용하기 전에 최대 6개월 동안 실온 조건에서 멸균 및 보관했다. 안정성이 연장된 PF-UBM은 상온에서 수년간 기성품으로 보관할 수 있어, 미생물 감염 치료에 사용할 수 있고 쉽게 접근할 수 있는 항균제로서의 유용성을 더욱 향상시킨다.
이들 연구에서 확인된 다른 장점은 비소화성 U-UBM이 또한 MRSA 유래된 호흡기 감염에 대해 우수한 항균 활성을 나타냈다는 것이다. 다시, 이론에 얽매이지 않고, 잠재적인 메커니즘은 U-UBM이 숙주 기도에서 분비된 프로테아제에 의해 소화되어, 소화성 PF-UBM 및 FD-UBM의 관찰된 향균 효과와 유사하게 세균 감염으로부터 숙주를 보호하기 위해 비소화성 UBM의 인시투 소화 및 분해를 야기한다는 것이다. 단백질 가교제 없이 제형화된 UBM과 같은 상기 기재된 ECM 유래된 조성물의 제조는 호흡기 감염을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 세균 감염의 치료에서 조성물의 사용에 유리할 수 있다. 가교된 단백질의 인시투 분해는 숙주 프로테아제 및 펩티다아제의 용량을 초과할 수 있다.
요약하면, 본원에 기재된 발명은 기도 내에 인비보 접근법을 사용하여 세균 병원체에 대한 UBM의 광범위한 항균 활성의 사용을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, UBM은 예를 들면 황색포도상 구균 및 녹농균에 대한 내성을 향상시키기거나 치료를 위해 사용될 수 있으며, 예시적인 세균 감염, 및 상처, 화상, 피부의 지속적인 감염, 분쇄 골절, 방광염, 봉와직염, 병원성 감염, 기도의 다른 세균 감염, 및 기타 조직 감염으로서 여기에서 연구된다. 비제한적인 예로서, UBM은 낭포성 섬유증 환자에게 초기 생명 세균 군집의 치료에 유용할 수 있다. UBM 매개된 항균 활성은 면역 능력이 있고 면역이 약화된 환자에게 기도의 세균 감염과 같은 세균 감염을 효율적으로 퇴치하기 위한 대안적 접근법이다.

Claims (19)

  1. 실활 고유 세포외기질 물질로부터 얻어진 유효량의 비소화성 비가교 미분화된 분말을 기도를 통해 환자에게 투여하는 단계로서, 상기 실활 고유 세포외기질(ECM)은 비상피 조직, 방광 기질(UBM), 소장 점막하조직(SIS), 및 방광 점막하조직(UBS)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는, 환자의 호흡기 감염의 치료 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 미분화된 분말은 비효소적으로 처리되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 미분화된 분말은 실온에서 적어도 2개월 동안 보관되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 미분화된 분말은 실온에서 적어도 6개월 동안 보관되는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 감염은 황색포도상 구균, 녹농균 및 폐렴간균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 감염은 적어도 폐에 국한되어 있는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 기도는 기관인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 투여 경로는 기관내 또는 비강내인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 투여 경로는 흡입을 통한 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 투여는 스프레이를 통한 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포외기질 물질은 방광 기질(UBM)를 포함하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포외기질 물질은 UBS를 포함하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 치료는 완충액에서 미분화된 입자로 환자의 기도를 세척하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 상피 기저막을 포함하는 실활 세포외기질 물질로부터 얻어진 비소화성 비가교 미분화된 분말을 포함하는 완충액에서 재구성된 물질을 포함하고, 상기 재구성된 물질은 세포외기질의 하나 이상의 고유 성분을 더 포함하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 고유 성분은 비상피 유래된 ECM, 방광 기질(UBM), 소장 점막하조직(SIS), 및 방광 점막하조직(UBS)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  16. 세균에 감염된 환자에게 세균 생물막 형성을 감소시키는 방법으로서:
    상기 환자에게 MSSA-, MSRA-황색포도상 구균, 폐렴간균 및 녹농균으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 세균에 대한 살균 활성을 포함하는 상피 기저막의 비소화성 비가교 미분화된 실활 세포외기질을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 실활 고유 세포외기질(ECM)은 비상피 조직, UBM, SIS, 및 UBS로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  18. 상피 기저막의 실활 세포외기질 물질로부터 얻어진 완충액에 비소화성 비가교 미분화된 분말을 포함하는 재구성된 물질을 제공하는 단계로서, 상기 재구성된 물질은 상기 세포외기질의 하나 이상의 고유 성분을 포함하는 단계; 및
    상기 물질을 기관내 주입, 비강내 주입-흡입, 스프레이, 국소 적용 및 그 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 경로에 의해 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 세균 유래 감염으로부터 포유동물을 보호하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 실활 고유 세포외기질(ECM)은 비상피 조직, UBM, SIS, 및 UBS로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
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