KR102319264B1 - Plk1의 선택적 분해를 유도하는 벤즈이미다졸 티오펜 유도체 화합물 - Google Patents

Plk1의 선택적 분해를 유도하는 벤즈이미다졸 티오펜 유도체 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PLK1의 선택적 분해를 유도하는 신규 화합물에 관한 것으로, 구체적으로 PLK1 결합 모이어티와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 화학적 링커로 연결된 이기능성 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 상기 화합물, 이의 제조방법, 및 이의 용도 등을 제공한다. 본 발명에 따른 화합물들은 PLK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PLK1의 선택적 분해를 유도하는 벤즈이미다졸 티오펜 유도체 화합물{Benzimidazole thiophene derivative compounds inducing selective degradation of PLK1}
본 발명은 PLK1의 선택적 분해 유도 화합물, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
PLK1(Polo-like kinase 1)은 세린/트레오닌 인산화효소로서 세포 성장 및 분열 중에 G2/M기의 전환에 관여하는 것으로 알려져 있다. PLK1은 S phase부터 G2/M기까지 펄스 형태로 발현되고 활성화되었다가, 유사분열이 종료되면서 빠르게 분해된다.
PLK1은 대장암, 폐암, 방광암, 흑색종 등 다양한 암종에서 과발현 되는 양상을 띄며, PLK1이 과발현된 암세포는 여러 종류의 항암제에 대해 저항성을 나타내는 경향을 보인다. 이와 같이 다양한 암종에서 PLK1 의존성이 밝혀짐에 따라, 볼라설팁(volasertib; BI6727로도 알려짐) 등 PLK1 억제제 화합물들의 개발이 시도된 바 있다.
그러나, 기존 PLK1 억제제들은 임상적으로 안전성이 확보된 농도에서 PLK1 활성을 충분히 억제하지 못하여, 암세포의 세포 주기를 일시적으로 지연시키더라도 결국 일부 암세포에서 세포 주기가 재개시되어, 충분한 임상적 효과를 거두지 못한 문제가 있다(문헌[Gheghiani et al. CULM Reports, 2017] 등). 실제로 베링거잉겔하임, GSK(GlaxoSmithKline) 등 다수 제약사들이 저분자화합물 기반의 PLK1 억제제 개발을 시도하였으나 대부분 임상시험 단계에서 실패하거나 중단되어 현재까지 상용화된 PLK1 억제제는 전무한 상태이다. 이는 암세포의 PLK1 활성을 억제하여 항암효과를 도출하고자 하는 신약개발 의도에 있어서, 저분자화합물 억제제와 같이 PLK1의 활성부위에 결합하여 효소 활성을 억제하는 방식의 약리 기전이 충분히 효과적이지 않음을 보여준다.
최근 들어, 표적 단백질의 체내 단백질 분해(proteolysis)를 유도할 수 있는 저분자 화합물 기반 플랫폼 기술로서 PROTAC(Proteolysis targeting chimera)이 제시된 바 있다. PROTAC이란 질환 관련 표적 단백질에 결합하는 리간드 분자와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 화학적 링커로 연결된 이기능성 화합물이다. 이론적으로 PROTAC 화합물은 질환 관련 표적 단백질을 E3 유비퀴틴 라이게이즈 근처에 위치시킴으로써, 표적 단백질의 분해를 유도할 수 있다.
본 발명의 목적은 PLK1의 선택적 분해 유도 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PLK1의 선택적 분해 유도 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PLK1의 선택적 분해 유도 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
PLK1 선택적 분해 유도 화합물
본 발명은 PLK1의 선택적 분해를 유도하는 신규 화합물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 PLK1 결합 모이어티와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 화학적 링커로 연결된 이기능성 화합물을 제공한다.
본 발명의 일 실시양태는 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염이다:
[화학식 I]
Figure 112021036227883-pat00001
상기 화학식 I에서,
ULM은 하기 화학식 A 또는 화학식 B로 표시되는 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티이고,
[화학식 A]
Figure 112021036227883-pat00002
{상기 화학식 A에서, X1은 -CH2- 또는 -CO-임}
[화학식 B]
Figure 112021036227883-pat00003
{상기 화학식 B에서,
Figure 112021036227883-pat00004
는 5원 헤테로아릴 고리이고, Y1은 수소 또는 C1-3알킬임}
PTM은 하기 화학식 II로 표시되는 PLK1 결합 모이어티이고,
[화학식 II]
Figure 112021036227883-pat00005
Linker는 ULM과 PTM을 화학적으로 연결하는 기이다.
화학식 A 및 B에서,
Figure 112021036227883-pat00006
는 ULM을 링커에 연결하는 공유 결합을 나타낸다.
화학식 II에서,
Figure 112021036227883-pat00007
는 PTM을 링커에 연결하는 공유 결합을 나타낸다.
(1) E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티
본 발명의 일 실시양태에 따르면 ULM은 화학식 A로 표시되는 CRBN E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티이다.
본 발명에서 CRBN은 세레블론(Cereblon) E3 유비퀴틴 라이게이즈를 의미한다. CRBN은 DDB1, Cul4A 및 ROC1와 함께 E3 유비퀴틴 라이게이즈 복합체를 구성하며, 여기서 CRBN은 상기 복합체의 기질 인식 서브유닛이다. CRBN E3 유비퀴틴 라이게이즈에 결합할 수 있는 화합물은 당업계에 일부 공지되어 있다. 예컨대, 탈리도마이드(thalidomide)가 CRBN E3 유비퀴틴 라이게이즈에 결합한다는 사실이 알려진 이후(문헌[Ito et al. 2010]), 레날리도마이드 및 포말리도마이드를 포함한 다수의 이미드계 소분자 화합물(immunomodulatory imide drug; IMiD)이 CRBN 결합능을 가진다는 점이 보고되었다 (문헌[Chamberlain and Brian. 2019], 문헌[Akuffo et al. 2018]), 문헌[Burslem et al. 2018] 등).
본 발명의 일 실시양태에 따르면 ULM은 화학식 B로 표시되는 VHL E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티이다.
본 발명에서 VHL은 폰 히펠-린다우 종양 억제자(von Hippel-Lindau tumor suppressor)를 의미한다. VHL은 Elongin B, Elongin C, CUL2 및 Rbx1와 함께 VCB E3 유비퀴틴 라이게이즈 복합체를 구성하며, 여기서 VHL은 상기 복합체의 기질 인식 서브유닛이다. VHL E3 유비퀴틴 라이게이즈에 결합할 수 있는 화합물은 당업계에 일부 공지되어 있다. 예컨대, Ala-Leu-Ala-(Hy)Pro-Tyr-Ile-Pro 헵타펩티드(문헌[Schneekloth et al. 2004]), Leu-Ala-(Hy)Pro-Tyr-Ile 펜타펩티드(문헌[Rodriguez-Gonzalez et al. 2008])와 같은 펩타이드가 알려진 이후, 이를 개량한 저분자 VHL E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 화합물이 보고된 바 있다(문헌[Buckley et al. J. Am. Chem. Soc. 2012], 문헌[Buckley et al. Ang. Chem. Int. Ed. 2012], 문헌[Galdeano et al. 2014], 문헌[Soares et al. 2017] 등).
(2) 표적 단백질 리간드(PTM)
본 발명의 화학식 I로 표시되는 화합물에서, 표적 단백질 리간드 기능을 수행하는 모이어티인 PTM은 상술한 화학식 II로 표시되는 PLK1 결합 모이어티이다.
본 발명의 화학식 I 화합물의 일부 모이어티를 구성하는 화학식 II는 단독적으로 벤즈이미다졸 티오펜 유도 화합물로, PLK1의 활성 부위에 결합할 수 있다(국제공개특허 WO2004/014899 및 WO2007/030361 등)
본 발명의 화학식 I의 일 실시양태에서, ULM은 화학식 A로 표시되고, 화학식 II는 하기와 같이 표시된다.
Figure 112021036227883-pat00008
본 발명의 화학식 I의 일 실시양태에서, ULM은 화학식 B로 표시되고, 화학식 II는 하기와 같이 표시된다.
Figure 112021036227883-pat00009
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 화학식 I 화합물은 화합물 1 및 화합물 2로 구성된 군에서 선택된다.
(3) 링커(Linker)
본 발명의 일 실시양태에 따르면, Linker는 하기 화학식 L로 표시된다.
[화학식 L]
Figure 112021036227883-pat00010
상기 화학식 L에서,
Figure 112021036227883-pat00011
및
Figure 112021036227883-pat00012
는 결합이고,
LULM는 이에 연결된
Figure 112021036227883-pat00013
를 통해 ULM 모이어티와 결합하고,
LPTM은 이에 연결된
Figure 112021036227883-pat00014
를 통해 PTM 모이어티와 결합하고,
LULM 및 LPTM은 단일결합, -CH2-, -NH-, -O-, -CO-, -CONH- 또는 -NHCO-이고,
LINT는 -CH2-, -CH2CH2-, -CHCH-, -CC-, -CH2CH2O-, -OCH2CH2-, -CH2CH2S-, -SCH2CH2-, -COO-, -CONH-, -NHCO- 및
Figure 112021036227883-pat00015
로 구성된 군에서 선택되고{여기서,
Figure 112021036227883-pat00016
은 3원 내지 10원 사이클로알킬, 4원 내지 10원 헤테로사이클로알킬, 6원 내지 10원 아릴 또는 5원 내지 10원 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택된 고리임},
p는 1 내지 10의 정수이다.
일 실시양태에서, Linker는 화합물 1 내지 2에 포함된 Linker이다.
본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 화학식 I로 표시되는 화합물은 하기 화합물 1 내지 2로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 화합물, 이의 입체 입성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염이다.
본 발명에서 약학적으로 허용가능한 염이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 I로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 유기산 또는 무기산 부가염을 의미한다. 예컨대, 약학적으로 허용가능한 염은 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 또는 질산 등일 수 있고, 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산 또는 요오드화수소산일 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.
PLK1 선택적 분해 유도 화합물의 제조방법
본 발명에서, 상술한 화학식 I로 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염은 유기화학 기술 분야에 공지된 합성 방법 또는 통상의 기술자에게 자명한 변형 및 유도체화 기법에 의해 하기 반응식 1 내지 3과 같은 반응에 의해 제조될 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112021036227883-pat00017
[반응식 2]
Figure 112021036227883-pat00018
[반응식 3]
Figure 112021036227883-pat00019
상기 반응식 1 내지 3에서, PTM, Linker 및 ULM은 위에서 정의된 기이거나, 그의 적합한 유도체이고, RG1, RG2, RG2a, RG2b, RG3, RG3a, RG3b 및 RG4는 유기 합성 분야에서 공유 결합 형성을 통해 화학식 I로 표시되는 PROTAC 화합물 중간체를 함께 연결할 수 있는 적합한 반응기를 포함하는 모이어티이다. 상기 공유 결합 형성은 특정한 반응기에 따라 아미드 형성, 에스테르 형성, 카바메이트 형성, 우레아 형성, 에테르 형성, 아민 형성 및 다양한 탄소간 단일결합, 이중결합 형성, 클릭 케미스트리(Click chemistry) 등의 합성 반응을 거쳐 형성될 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
상기 반응식에서 각 단계의 변형은 1개 또는 다중 합성 단계를 포함할 수 있다. 생성물의 분리 및 정제는 유기화학 분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 과정에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에서, 반응식 1의 일례로 실시예 1의 제조방법이 제시되었고, 반응식 3의 일례로 실시예 2의 제조방법이 제시되었다.
상기 반응식에서, PTM로 제시된 반응물 및 ULM으로 제시된 반응물은 유기화학 분야에 공지된 문헌 및 본 발명의 실시예 기재 등을 참고로 하여 통상의 기술자가 용이하게 합성할 수 있다.
본 발명은 화학식 I의 반응 중간체에 해당하는 중간체에 해당하는 PTM-Linker-RG3 또는 PTM-Linker 1-RG2b 형태의 화합물을 포함한다.
PLK1 선택적 분해 유도 화합물의 용도
본 발명의 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 PLK1 분해 유도용 조성물이다. 화학식 I는 위에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 PLK1 분해 유도 PROTAC 화합물은 작용 기전의 관점에서 타겟 단백질인 PLK1를 원천 분해할 수 있으므로, PLK1의 단순 활성을 억제하는 종래 PLK1 저분자 억제제와 비교하여서도 우수한 PLK1 억제 효과를 달성한다.
따라서, 본 발명의 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물은 PLK1의 선택적 분해를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 PLK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다. 화학식 I는 위에서 정의된 바와 같다.
본 발명에서 PLK1 관련 질환은 PLK1의 분해 유도 또는 활성 억제로부터 치료, 경감, 지연, 저해 또는 예방될 수 있는 임의의 질환 또는 병태를 의미한다. 일 실시양태에서, PLK1 관련 질환은 암(악성 종양), 양성 종양, 신경질환, 또는 그 외 지나친 세포 분열로 인해 일어나는 유전적 또는 비유전적 질환일 수 있다.
상기　암은 PLK1의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든 암을 포함하며, 고형암　또는 혈액암일 수 있다. 예컨대, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기　암은 원발성　암뿐 아니라 전이성　암도 포함한다.
상기 양성 종양은 PLK1의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든 양성 종양, 예컨대 암 이전 단계의 양성 종양을 포함하며, 고형 종양 또는 혈액 종양일 수 있다. 예컨대, 상기 종양은 배럿 식도, 대장 선종 및 용종, 유방 섬유선종 및 낭종, 단세포 감마글로불린병증 (MGUS), 단클론 림프구증가증 등으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 신경질환은 PLK1의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든　신경질환을 포함하며, 구체적으로 중추 신경계 질환, 퇴행성　신경질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성경화증, 헌팅톤병, 노인성 치매, 간질, 루게릭, 뇌졸증, 및 뇌 또는 척수 손상에 이은 신경손상과 축삭 변성 관련 장애 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 화학식 I 로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 외에 동일 또는 유사한 약효를 나타내는 유효성분을 1 종 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 인간을 포함하는 포유류에 투여하여 PLK1 단백질을 분해하는 방법이다.
본 발명의 또다른 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 체외에서 샘플에 투여하여 PLK1 단백질을 분해하는 방법이다. 상기 샘플은 세포, 세포 배양물, 사람을 포함한 포유동물의 체액 또는 조직일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물은 PLK1의 분해를 유도하는 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 화합물은 PLK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 하기 표에 표시된 화합물 1 및 2에 대한 합성 방법을 제공한다.
[표 1]
Figure 112021036227883-pat00020
본 발명의 화합물을 아래 방법에 따라 정제하고 구조를 분석하였다.
분석 기기
LCMS : Shimadzu LCMS-2020
NMR : BRUKER AVANCE III/400MHz
HPLC : Shimadzu LC-20AB 와 Shimadzu LC-20AD, Agilent 1100 LC, Agilent 1200 LC, Agilent 1290 LC
LCMS 분석 방법
LCMS 데이타는 전자 분사 이온화(electron spray ionization) 장치가 장착된 Shimadzu LCMS-2020으로 기록하였다. 물 내 0.0375 % TFA (용매 A)와 아세토니트릴 내 0.01875 % TFA (용매 B)를 이동상으로 사용하였다. 컬럼은 Kinetex EVO C18 (2.1*30)mm, 5um 을 사용하였다.
HPLC 분석 방법
HPLC는 Shimadzu LC-20AB 또는 Shimadzu LC-20AD 또는 Agilent 1100 LC 또는 Agilent 1200 LC 또는 Agilent 1290 LC 를 사용하였고, 물 내 0.0375 % TFA (용매 A)와 아세토니트릴 내 0.01875 % TFA (용매 B) 또는 물 내 0.025% NH3·H2O (용매 A)와 아세토니트릴(용매 B)을 이동상으로 사용하였다. 컬럼은 XBridge C18 (2.1*50)mm, 5um 또는 Kinetex C18 LC 컬럼 (4.6*50)mm, 5um 또는 Eclipse plus C18 (4.6*150)mm, 3.5um 또는 Waters XBridge® C18 (4.6*150)mm, 3.5μm을 사용하였다.
NMR 분석 방법
1H NMR 스펙트럼을 Bruker AVANCE III/400MHz Probe (BBO)로 기록하였다.
실시예 1. 3-(1-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)-5-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)티오펜-2-카복사미드(화합물 1)의 합성
Figure 112021036227883-pat00021
Figure 112021036227883-pat00022
단계 1: 메틸 4-히드록시-2-(트리플루오로메틸)벤조에이트 (2)의 합성
톨루엔 (75 mL)과 MeOH (37 mL) 내 4-히드록시-2-(트리플루오로메틸)벤조산 (7.5 g, 36.39 mmol)의 용액에 TMSCHN2 (2 M, 36.4 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트=2:1)로 출발 물질이 소모되고 신규 스폿이 검출된 것을 확인하였다. 감압 하에서 혼합물을 농축하여 황색 고체의 표제 화합물 (8 g, crude)을 수득하였다.
단계 2: 3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일 4-메틸벤젠설포네이트 (3)의 합성
DCM (50 mL) 내 벤질 (2-(2-(2-히드록시에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (6.9 g, 24.35 mmol), TEA (7.39 g, 73.06 mmol, 10.17 mL)의 용액에 TosCl (9.29 g, 48.71 mmol)을 25 ℃에서 첨가하였다. 용액을 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (45 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~65% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 75 mL/min)로 정제하여 무색 오일의 표제 화합물 (9.1 g, 20.59 mmol, 84.55%yield, 99% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=438.0.
단계 3: 메틸 4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시) -2-(트리플루오로메틸)벤조에이트 (4)의 합성
ACN (180 mL) 내 3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일 4-메틸벤젠설포네이트 (8.9 g, 20.34 mmol)와 메틸 4-히드록시-2-(트리플루오로메틸)벤조에이트 (4.93 g, 22.38 mmol)의 용액에 K2CO3 (5.62 g, 40.69 mmol)과 KI (168.84 mg, 1.02 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 80 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과된 케이크를 EtOAc (100 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (20 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~30% Ethyl acetate/Petroleum Ether gradient @ 60 mL/min)로 정제하여 황색 오일의 표제 화합물 (7.4 g, 14.94 mmol, 73.44% yield, 98% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=486.2.
단계 4: 벤질 (2-(2-(2-(4-아세틸-3-(트리플루오로메틸)페녹시)에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (5)의 합성
톨루엔 (49 mL) 내 MeMgBr (3 M, 35.50 mL)의 용액에 TEA (7.74 g, 76.52 mmol, 10.65 mL)를 0 ℃에서 첨가하고, 톨루엔 (49 mL) 내 메틸 4-((3-옥소-1-페닐-2, 7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로메틸)벤조에이트 (7.1 g, 14.63 mmol,)의 용액을 첨가하였다. 최종 혼합물을 25 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 0 ℃에서 NH4Cl (10 mL)을 첨가하여 켄칭한 다음 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 H2O (10 mL)로 세척하고 Na2SO4로 밤새 건조하고 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 10~60% Ethyl acetate/Petroleum Ether gradient @ 100 mL/min)로 정제하여 황색 오일의 표제 화합물 (5.4 g, 10.93 mmol, 74.72% yield, 95% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=470.2
단계 5: 벤질 (2-(2-(2-(4-(1-히드록시에틸)-3-(트리플루오로메틸)페녹시)에톡시) 에톡시)에틸)카바메이트 (6)의 제조
MeOH (40 mL) 내 벤질 (2-(2-(2-(4-아세틸-3-(트리플루오로메틸)페녹시)에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (1.8 g, 3.83 mmol)의 용액에 NaBH4 (450 mg, 11,90 mmol)를 천천히 첨가하고 혼합물을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 NH4Cl (30 mL)을 첨가하여 켄칭한 다음 감압 하에 농축하였다. 혼합물을 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 NaHCO3 (10 mL x 2)와 H2O (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 20~80% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 50 mL/min)로 정제하여 황색 오일의 표제 화합물 (1.77 g, 3.75 mmol, 97.91% yield, 100% purity)을 수득하였다.
MS(M+Na)+=494.2
단계 6: 메틸 5-니트로-3-(1-(4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (8)의 합성
DCM (40 mL) 내 벤질 (2-(2-(2-(4-(1-히드록시에틸)-3-(트리플루오로메틸)페녹시)에톡시)에톡시) 에틸)카바메이트 (1.77 g, 3.75 mmol), 메틸 3-히드록시-5-니트로티오펜-2-카복실레이트 (915 mg, 4.50 mmol) 및 PPh3 (1.48 g, 5.63 mmol)의 용액에 DTBAD (1.30 g, 5.63 mmol)를 25 ℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (20 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 10~100% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 50 mL/min)로 정제하였다. 조 생성물을 MTBE (10 mL)로 고체화하고 여과하였다. 여과된 케이크를 수집하고 감압 하에 건조하여 황색의 표제 화합물 (2.06 g, 3.14 mmol, 83.57% yield)을 수득하였다.
단계 7: 메틸 5-아미노-3-(1-(4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (9)의 합성
EtOH (20 mL)와 H2O (20 mL) 내 메틸 5-니트로-3-(1-(4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (2.06 g, 3.14 mmol)의 용액에 NH4Cl (1.01 g, 18.82 mmol)과 Fe (1.05 g, 18.82 mmol)를 첨가하고 최종 혼합물을 80 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 80 ℃에서 여과하고 필터된 케이크를 MeOH (50 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축하여 MeOH를 제거하고 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 H2O (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (20 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 20~60% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 50 mL/min)로 정제하여 황색의 표제 화합물 (0.9 g, 1.44 mmol, 45.78% yield)을 수득하였다.
MS(M+H)+=627.4
단계 8: 1-(3-브로모-4-니트로벤질)-4-메틸피페라진 (10)의 합성
DCE (30 mL) 내 1-메틸피페라진 (866.88 mg, 8.65 mmol, 960 μL)와 3-브로모-4-니트로벤즈알데하이드 (1 g, 4.35 mmol)의 용액에 AcOH (10.50 mg, 174.85 μmol, 10 μL)를 0 ℃에서 첨가하고 혼합물을 0 ℃에서 30 분 동안 교반하였다. 그 다음 NaBH(OAc)3 (2.77 g, 13.05 mmol)를 첨가하고 최종 혼합물을 25 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 H2O (20 mL)와 시트르산 용액 (50 mL)으로 희석한 다음, EtOAc (10 mL x 2)로 세척하고, 유기층을 제거하였다. 수성층의 pH를 9로 조정하고 EtOAc (10 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 Na2SO4로 건조하고 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축하여 황색 오일의 표제 화합물 (1.2 g, 3.74 mmol, 86.10% yield, 98% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=314.1
단계 9: 메틸 5-((5-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-2-니트로페닐)아미노)-3-(1-(4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (11)의 합성
톨루엔 (15 mL) 내 1-(3-브로모-4-니트로벤질)-4-메틸피페라진 (355.14 mg, 1.13 mmol)과 메틸 5-아미노-3-(1-(4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로-메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (850.00 mg, 1.36 mmol)의 용액에 Cs2CO3 (1.10 g, 3.39 mmol), Pd2(dba)3 (20.70 mg, 22.61 μmol) 및 Xantphos (28.78 mg, 49.74 μmol)를 첨가하고 최종 혼합물을 80 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. TLC (에틸 아세테이트: 메탄올=5:1)로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과된 케이크를 EtOAc (50 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축하였다. 그 다음 조 생성물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 H2O (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (5 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 50~100% Ethyl acetate/Petroleum ether to 0~20% M에탄올/Ethyl acetate gradient @ 50 mL/min)로 정제하여 황색 오일의 표제 화합물 (510 mg, 593.09 μmol, 52.47% yield)을 수득하였다.
MS(M+H)+=860.4
단계 10: 메틸 5-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-3-(1-(4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (12)의 합성
MeOH (8 mL) 내 메틸 5-((5-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-2-니트로페닐)아미노) -3-(1-(4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (410 mg, 476.80 μmol)의 용액에 트리메톡시메탄 (1.27 g, 11.97 mmol, 1.31 mL), 포름산 (200.09 mg, 4.35 mmol, 164.00 μL) 및 Zn (156 mg, 2.39 mmol)을 첨가하였다. 70 ℃에서 6 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 여과하고, 필터된 케이크를 뜨거운 MeOH (50 mL, 50 ℃)로 세척하고, 여과물을 감압 하에 농축하였다. 조 생성물을 H2O (10 mL)로 희석하고 NaHCO3 용액으로 pH를 8로 조정하였다. 그 다음 혼합물을 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 H2O (10 mL x 2)로 세적하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 하에서 농축하여 황색 오일의 표제 화합물 (330 mg, crude)을 수득하였다.
MS(M+H)+=840.5
단계 11: 5-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-3-(1-(4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실산 (13)의 합성
THF (3 mL) 내 메틸 5-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일) -3-(1-(4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (250.00 mg, 297.65 μmol)의 용액에 H2O (1.5 mL) 내 LiOH•H2O (14.39 mg, 342.89 μmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 40 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. 혼합물에 LiOH•H2O (17.98 mg, 428.61 μmol)를 추가로 첨가하고 혼합물을 40 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 소모되고 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 감압 하에 농축하여 황색 오일의 표제 화합물 (250 mg, crude)을 수득하였다.
MS(M+H)+=826.6
단계 12: 벤질 (2-(2-(2-(4-(1-((2-카바모일-5-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸) -1H-벤조[d]이미다졸-1-일)티오펜-3-일)옥시)에틸)-3-(트리플루오로메틸)페녹시)에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (14)의 제조
DMF (4 mL) 내 5-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-3-(1-(4-((3-옥소-1-페닐-2,7,10-트리옥사-4-아자도데칸-12-일)옥시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실산 (250 mg, 300.54 μmol)과 NH4Cl (80.38 mg, 1.50 mmol)의 용액에 DIPEA (118.72 mg, 918.58 μmol, 160 μL) 및 HATU (171.41 mg, 450.82 μmol)를 첨가하고 최종 혼합물을 25 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 남아있음을 확인하였다. 추가로 NH4Cl (80.38 mg, 1.50 mmol) 및 HATU (171.41 mg, 450.82 μmol)를 첨가하고 최종 혼합물을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물 (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축하여 황색 오일의 표제 화합물 (170 mg, crude)을 수득하였다.
MS(M+H)+=825.6
단계 13: 3-(1-(4-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에톡시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)-5-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)티오펜-2-카복사미드 (15)의 합성
ACN (0.75 mL) 내 벤질 (2-(2-(2-(4-(1-((2-카바모일-5-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)티오펜-3-일)옥시)에틸)-3-(트리플루오로메틸)페녹시)에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (150 mg, 181.84 μmol)의 용액에 TMSI (220.50 mg, 1.10 mmol, 150 μL)를 첨가하고 혼합물을 20 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 소모되고 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 H2O (20 mL, 0 ℃)로 켄칭하고 EtOAc (10 mL x 3)로 세척하고, 유기층을 제거하였다. 수성상에 Na2CO3 용액을 첨가하여 pH를 7~8로 조정한 다음, 혼합물을 동결건조하였다. 조 생성물을 prep-HPLC (column: Unisil 3-100 C18 μLtra 150*50 mm*3 um; mobile phase: [water (0.225%FA) -ACN]; B%: 5% - 35%, 10 min)로 정제하여 황색 고체의 표제 화합물 (60 mg, 70.22 umol, 38.62% yield, 97% purity, FA salt)을 수득하였다.
MS(M+H)+=691.4
단계 14: 3-(1-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일) 아미노)에톡시)에톡시)에톡시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)-5-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)티오펜-2-카복사미드(화합물 1)의 합성
DMSO (1.2 mL) 내 3-(1-(4-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에톡시)-2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)-5-(6-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)티오펜-2-카복사미드 (60 mg, 72.39 μmol, FA salt)와 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-플루오로이소인돌린-1,3-디온 (24 mg, 86.89 μmol)의 용액에 TEA (43.95 mg, 434.34 μmol, 60.45 μL)를 첨가하고 혼합물을 80 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과물을 prep-HPLC (column: Phenomenex Gemini-NX C18 75*30 mm*3um;mobile phase: [water (10mM NH4HCO3) -ACN]; B%: 30% - 60%, 8 min)로 정제하였다. 용리액을 동결건조하여 황색 고체의 최종 표제 화합물 (10.2 mg, 9.80 μmol, 13.54% yield, 91% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=947.7
1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ = 8.06 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.51 - 7.44 (m, 1H), 7.33 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.30 - 7.27 (m, 1H), 7.24 - 7.17 (m, 2H), 7.11 (br s, 1H), 7.0 - 6.94 (m, 2H), 6.85 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 6.48 - 6.43 (m, 1H), 6.29 (br s, 1H), 5.88 - 5.82 (m, 1H), 4.91 - 4.86 (m, 1H), 4.14 - 4.09 (m, 2H), 3.78 - 3.74 (m, 2H), 3.66 - 3.57 (m, 6H), 3.56 - 3.52 (m, 2H), 3.42 - 3.37 (m, 2H), 2.74 - 2.61 (m, 4H), 2.45 - 2.30 (m, 8H), 2.06 - 2.00 (m, 2H), 1.78 - 1.71 (m, 4H).
실시예 2. (2S,4R)-1-((S)-2-(tert-부틸)-14-(4-((1-(5-카바모일-4-((R)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-6-일)메틸)피페라진-1-일)-4-옥소-6,9,12-트리옥사-3-아카테트라데카노일)-4-히드록시-N-(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드(화합물 2)의 합성
Figure 112021036227883-pat00023
단계 1: (R)-메틸 5-니트로-3-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (3)의 합성
DCM (20 mL) 내 메틸 3-히드록시-5-니트로티오펜-2-카복실레이트 (1.23 g, 6.05 mmol), (S)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에탄올 (1 g, 5.26 mmol, 80.00 μL)의 용액에 PPh3 (2.07 g, 7.89 mmol), DTBAD (1.82 g, 7.89 mmol)를 25 ℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. TLC (Petroleum ether : Ethyl acetate=3:1; Rf=0.75)로 (S)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에탄올이 완전히 소모되고 신규 스폿이 형성되었음을 확인하였다. 혼합물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~5% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 30 mL/min)로 정제하여 황색 오일의 표제 화합물 (1.8 g, 4.51 mmol, 85.73% yield, 94% purity)을 수득하였다.
단계 2: (R)-메틸 5-아미노-3-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜- 2-카복실레이트 (4)의 합성
EtOH (15 mL)와 H2O (15 mL) 내 (R)-메틸 5-니트로-3-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (1.8 g, 4.80 mmol )의 용액에 Fe (1.61 g, 28.78 mmol ) 및 NH4Cl (1.54 g, 28.78 mmol )을 25 ℃에서 첨가하고, 혼합물을 80 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. TLC (Petroleum ether : Ethyl acetate=3:1; Rf=0.4)로 출발 물질이 완전히 소모되고 신규 스폿이 형성되었음을 확인하였다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 여과물을 농축하여 유기 용매를 제거하였다. 용액을 물 (50 mL)로 희석하고 에틸 아세테이트 (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물 (20 mL x 3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~30% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 75 mL/min)로 정제하여 갈색 오일의 표제 화합물 (1.4 g, 3.81 mmol, 79.46% yield, 94% purity)을 수득하고 다음 단계에 직접 사용하였다.
MS(M+H) +=345.8
단계 3: (R)-tert-부틸 4-(3-((5-(메톡시카보닐)-4-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-일)아미노)-4-니트로벤질)피페라진-1-카복실레이트 (6)의 합성
t-BuOH (10 mL) 내 (R)-메틸 5-아미노-3-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실레이트 (530 mg, 1.53 mmol), tert-부틸 4-(3-브로모-4-니트로벤질)피페라진-1-카복실레이트 (675.73 mg, 1.69 mmol) 및 K2CO3 (636.33 mg, 4.60 mmol)의 용액에 Pd2(dba)3 (28.11 mg, 30.69 μmol) 및 XPhos (32.19 mg, 67.53 μmol)를 25 ℃, N2 조건 하에서 첨가하고 최종 혼합물을 60 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 37 %의 피크가 tert-부틸 4-(3-브로모-4-니트로벤질)피페라진-1-카복실레이트임을 확인하였다. 추가로 Pd2(dba)3 (28.11 mg, 30.69 μmol ) 및 XPhos (32.19 mg, 67.53 μmol )를 25℃, N2 조건 하에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 70 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (50 mL)로 희석하고 셀라이트 패드를 통해 여과하고 여과물을 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (10 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 5~50% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 60 mL/min)에 이어 prep-HPLC (column: Waters Xbridge C18 150*50 mm* 10um; mobile phase: [water (10 mM NH4HCO3) - ACN]; B%: 65% - 95%, min)로 정제하였다. 용리액을 동결건조하여 갈색 고체의 표제 화합물 (400 mg, 601.78 μmol, 39.21% yield)을 수득하였다. 조 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
MS(M+H) +=665.1
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ=9.71 (s, 1H), 8.16 (br d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.68 - 7.56 (m, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.20 - 7.16 (m, 1H), 6.93 (br d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.43 (s, 1H), 5.74 (q, J = 5.9 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.44 (br s, 6H), 2.38 (br s, 2H), 2.36 (s, 2H), 1.73 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.47 (s, 9H).
단계 4: (R)-tert-부틸 4-((1-(5-(메톡시카보닐)-4-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-6-일)메틸)피페라진-1-카복실레이트 (7)의 합성
MeOH (20 mL) 내 (R)-tert-부틸 4-(3-((5-(메톡시카보닐)-4-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-일)아미노)-4-니트로벤질)피페라진-1-카복실레이트 (0.4 g, 601.78 μmol) 용액에 트리메톡시메탄 (1.60 g, 15.04 mmol, 1.65 mL), 포름산 (249.28 mg, 5.42 mmol, 204.32 μL) 및 Zn (196.75 mg, 3.01 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모된 것과 원하는 분자량으로 하나의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 여과하고 여과된 케이크를 MeOH (50 mL, 50 ℃)로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 H2O (15 mL)로 희석하고 NaHCO3 용액으로 pH를 8로 조정하였다. 그 다음 혼합물을 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 H2O (10 mL x 2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~50% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 50 mL/min)로 정제하여 황색 오일의 표제 화합물 (300 mg, 456.02 μmol, 75.78% yield, 98% purity)을 수득하고, 다음 단계에 직접 사용하였다.
MS(M+H) +=645.2
단계 5: (R)-5-(6-((4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-3-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실산 (8)의 합성
THF (5 mL) 내 (R)-tert-부틸 4-((1-(5-(메톡시카보닐)-4-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-6-일)메틸)피페라진-1-카복실레이트 (300 mg, 465.33 μmol) 용액에 H2O (5 mL) 내 LiOH (33.43 mg, 1.40 mmol) 용액을 25 ℃에서 적가하였다. 혼합물을 40 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모되었다는 것과 원하는 분자량의 하나의 주 피크를 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하여 갈색 고체의 표제 화합물 (296 mg, crude)을 수득하고, 다음 단계에 직접 사용하였다.
MS (M+H) +=631.0
단계 6: (R)-tert-부틸 4-((1-(5-카바모일-4-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-6-일)메틸)피페라진-1-카복실레이트 (9)의 합성
DMF (3 mL) 내 (R)-5-(6-((4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-3-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복실산 (296 mg, 464.96 μmol), NH4Cl (124.36 mg, 2.32 mmol)의 용액에 HATU (353.59 mg, 929.93 μmol) 및 DIPEA (180.28 mg, 1.39 mmol, 242.96 μL)를 30 ℃에서 첨가하였다. 혼합물을 30 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모되었다는 것과 원하는 분자량의 하나의 주 피크를 확인하였다. 혼합 용액을 감압 하에 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (4 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~100% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 60 mL/min; Eluent of 0~50% Methanol / Ethyl acetate @ 60 mL/min)로 정제하여 갈색 고체의 표제 화합물 (400 mg, crude)을 수득하고 다음 단계에 직접 사용하였다.
MS (M+H) +=630.0
단계 7: (R)-5-(6-(피페라진-1-일메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-3-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복사미드 (10)의 합성
DCM (5 mL) 내 (R)-tert-부틸 4-((1-(5-카바모일-4-(1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-6-일)메틸)피페라진-1-카복실레이트 (400 mg, 635.23 μmol) in DCM (5 mL) 용액에 TFA (1.54 g, 13.51 mmol, 1 mL)를 첨가하고 최종 혼합물을 30 ℃에서 0.5 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모된 것과 원하는 분자량의 하나의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 하에서 10 ℃에서 농축하였다. 잔여물을 탈염수 (40 mL)로 용해하고 동결건조하여 갈색 고체의 표제 화합물 (0.5 g, crude, TFA salt)을 수득하였으며, 다음 단계에 직접 사용하였다.
MS(M+H) +=530.0
단계 8: (2S,4R)-1-((S)-2-(tert-부틸)-14-(4-((1-(5-카바모일-4-((R)-1-(2-(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-6-일)메틸)피페라진-1-일)-4-옥소-6,9,12-트리옥사-3-아자테트라데칸-1-오일)-4-히드록시-N-(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (화합물 2)의 합성
디옥산 (10 mL) 내 (R)-5-(6-(피페라진-1-일메틸)-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-3-(1-(2 -(트리플루오로메틸)페닐)에톡시)티오펜-2-카복사미드 (400 mg, 621.50 μmol, TFA salt) 및 (S)-13-((2S,4R)-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-카보닐)-14,14-디메틸-11-옥소-3,6,9-트리옥사-12-아자펜타데실 4-메틸벤젠설포네이트 (481.63 mg, 621.50 μmol)의 용액에 DIPEA (240.97 mg, 1.86 mmol, 324.76 μL) 및 NaI (18.63 mg, 124.30 μmol, 0.2 eq)를 25 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 100 ℃에서 12 시간 동안 가열하였다. LCMS로 반응물이 완전히 소모된 것과 원하는 분자량의 하나의 주 피크를 확인하였다. 혼합물을 감압 하에 농축하였다. 조 생성물을 prep-HPLC (column: Waters Xbridge C18 150*50 mm* 10um; mobile phase: [water (10 mM NH4HCO3) - ACN]; B%: 33% - 63%, 11 min)로 정제하고 용리액을 동결건조하여 백색 고체의 표제 화합물 (48.9 mg, 41.46 μmol, 6.67% yield, 96% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=1132.2
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 8.97 - 8.96 (m, 1H), 8.59 (br t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.94 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.85 (br s, 1H), 7.82 - 7.74 (m, 2H), 7.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.61 - 7.52 (m, 1H), 7.45 - 7.35 (m, 5H), 7.33 (s, 1H), 7.28 (dd, J = 1.2, 8.3 Hz, 1H), 7.22 - 7.11 (m, 1H), 7.06 (s, 1H), 5.96 - 5.92 (m, 1H), 5.15 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.46 - 4.41 (m, 1H), 4.40 - 4.34 (m, 1H), 4.29 - 4.19 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 3.73 - 3.39 (m, 16H), 2.44 (br s, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.42 - 2.22 (m, 8H), 2.11 - 2.00 (m, 1H), 1.95-1.85 (m, 1H), 1.75 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.93 - 0.91 (m, 9H).
<실험예>
1. HeLa 세포주의 배양
HeLa 세포주를 한국세포주은행에서 구입하였다. 배양 세포의 계대(Passage)를 P115 내지 P125로 유지하였다.
세포 계수를 위해, Thermo사의 세포 계수기(cULM counter)(Catalog # AMQAX1000) 및 0.4% 트립판 블루(Trypan blue) 용액을 사용하였다.
세포 배양을 위해, DMEM(Gibco, Cat. No. 1195-65; Lot. No. 2085318), FBS(Gibco, Cat. No. 16000-044; Lot. No. 2097593), 페니실린/스트렙토마이신(PS)(Gibco, Cat. No. 15140-122; Lot. No. 2058855), 100　㎟　세포배양 디쉬(SPL, Cat. No. 20100), 150　㎟　세포배양 디쉬(SPL, Cat. No. 20150), 12 웰 배양 플레이트(SPL, Cat. No. 30012), PBS pH7.4(Gibco, Cat. No. 10010-023; Lot. No. 2085080), TrypLETM　Express(Gibco, Cat. No. 12605-010; Lot. No. 2070638), 카운팅 챔버(Hematocytometer)(Hirschmann, Cat. No. 8100204), 및 0.4% 트립판 블루 용액(DYNEBIO, Cat. No. CBT3710; Lot. No. 20190723)를 사용하였다.
2. 본 발명의 화합물 처리
12 웰 플레이트(SPL사)의 각 웰마다 2Х105개의 세포를 시딩하였고, 배양 배지 부피를 총 2mL로 하여 세포를 배양하였다.
실시예 화합물은 DMSO에 완전 용해시켜 실험에 사용하였고, 티미딘(thymidine)은 DW에 완전 용해시켜 실험에 사용하였다. 티미딘 블록을 위해, 티미딘(Sigma-Aldrich Cat. No. T9250-5G) 2mM 처리 후 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
방출(release) 및 화학적 처리를 위해, 배지를 석션한 후 1× PBS로 3 회 세척하였다. 완전 배지(complete media)를 넣고 CO2 인큐베이터에서 4 시간 인큐베이션하였다. 각각의 화합물을 100nM 농도에 따라 처리한 후 다시 6 시간 인큐베이션하였다.
3. 웨스턴 블롯팅
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 위해, 1X RIPA 용해 버퍼(Rockland, Cat. No. MB-030-0050; Lot no. 39751), 100X 프로테아제 억제제 칵테일(Quartett, Cat. No. PPI1015; Lot no. PCO50038424), Pierce™ BCA protein assay kit(ThermoScientific, Cat. No. 23225; Lot no. UC276876), 알부민 standard(ThermoScientific, Cat. No. 23209; Lot no. UB269561), 4-15 % Mini-PROTEAN TGX stain-free gel(Bio-rad, Cat. No. 4568085; Lot no. L007041B), 10X Tris/Glycine/SDS buffer(Bio-rad, Cat. No. 1610732; Lot no. 10000044375B); 10X TBS(Bio-rad, Cat. No. 1706435; Lot no. 1000045140B), 10% Tween 20 용액(Cat. No. 1610781; Lot no. L004152B), Color protein standard broad range(NEB, Cat. No. P7719S; Lot no. 10040349), 4X　Laemmli　sample buffer(Bio-rad, Cat. No. 1610747; Lot no. L004133B), β-머캡토에탄올(Sigma-Aldrich, Cat. No. M3148; Lot no. 60-24-2), SuperBlock™ T20 (TBS) blocking buffer(ThermoScientific, Cat. No. 37536; Lot no. UC282578), 1M 소듐 아자이드 용액(Sigma-Aldrich, Cat. No. 08591-1mL-F; Lot no. BCBV4989), α-Rabbit pAb to Ms IgG(abcam, Cat. No. ab97046; Lot no. GR3252115-1), α-Goat pAb to Rb IgG(CST, Cat. No. 7074S; Lot no. 28), α-GAPDH(abcam, Cat. No. ab8245; Lot no. GR3275542-2), αPlk1(CST, Cat. No. 208G4), α-BRD4(CST, Cat. No. 13440S), ECL™ Prime western blotting reagents(GE Healthcare, Cat. No. RPN2232; Lot no. 17001655), Ponceau S 용액(Sigma-Aldrich, Cat. No. P7170; Lot no. SLBV4112), Difco™ Skim milk(BD, Cat. No. 232100; Lot no. 8346795), iBlot®　2 NC Regular stacks(Invitrogen, Cat. No. IB23001; Lot no. 2NR110619-02)을 사용하였다.
세포 수확을 위해, 트립신을 사용하여 세포를 플레이트에서 분리한 뒤 배지 및 PBS로 세척하였다. 구체적으로, 배지를 석션한 뒤 1mL PBS로 세척하고, PBS를 석션하였다. 0.5 mL TrypLE™ Express를 37　℃,　7 min 처리하여 세포를 분리시킨 다음, 0.5 mL 완전 배지를 첨가하여 1 mL의 세포 배양액을 수집하였다. 그 다음, 1 mL의 세포 수집액을 8,000 rpm에서 120 초 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 0.2 mL의 PBS로 세척한 후, PBS를 제거하였다.
세포 용해(lysis)를 위해, 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하고 세포 파쇄물(debris)을 제거하여 세포 용해물(lysate)을 얻었다. 구체적으로, 세포에 프로테아제 억제제가 함유된 70 μL의 1X RIPA 버퍼를 처리하고 얼음 위에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 4 ℃ 15,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 세포 용해물을 얻었다.
그 다음, BCA 어세이를 이용하여 표준 커브를 구하고 이를 대입하여 용해물 내 단백질 질량을 정량하였다. 혼합물에는 20 μL의 표준 또는 샘플 용액, 200 μL의 BCA 또는 브래드포드 용액을 사용하여 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였고, 562 nm 흡광도에서 측정하였다. 샘플은 각 웰당 15μg이 되도록 4X 샘플 버퍼를 넣어 준비하였다.
4-15 % Mini-PROTEAN TGX stain-free gel (15　wULM)에 120 V로 100 분의 러닝 타임을 설정하여 SDS-PAGE를 수행하였다. iBlot®　2 NC　Mini stacks에 Dry blotting system의 P0 mode를 사용하여 트랜스퍼하였다. Ponceau S 용액을 사용하여 염색한 뒤, 블로킹 버퍼(Thermo)로 1 시간 동안 블로킹하였다. 0.05% Tween20를 포함한 1X TBS로 세척한 후, 1차 항체로서 1X TBS-T 내 항-Plk1(CST) 항체(1:500), 항 BRD4 (CULM signaling) 항체 (1:1000) 또는 항-GAPDH(abcam) 항체(1:10,000)와 함께 4 ℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween20를 포함한 1X TBS로 10 분 동안 3회 세척한 후, 2차 항체로서 1X TBS-T 내 항-마우스 항체(abcam)(1:10,000) 또는 항-래빗 항체(CST)(1:5,000)와 함께 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 다음, 0.05% Tween 20을 포함한 1X TBS로 10 분 동안 3회 세척한 후, ECL 워킹 용액(1:1)으로 검출하였다.
결과 분석을 위해, 이미지 애널라이저(GE)를 사용하여 최종 블롯 데이터를 얻었다. 각 샘플별 GAPDH 대비 PLK1의 비를 ImageQuant TL (ver.8.2.0) 프로그램을 이용하여 계산하였다. 계산된 각각의 값을 Graphpad Prism 9 프로그램의 각 셀에 입력하고 그래프를 자동으로 계산하여, 단백질 분해능에 해당하는 Dmax 값을 확인하였다.
4. 본 발명 화합물의 PLK1 분해능 확인
상술한 실험 결과, 본 발명의 모든 실시예 화합물들은 40~60%의 PLK1 단백질 분해능을 보이는 것으로 확인되었다.
이상으로 본 발명을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 하기 화합물 1 또는 화합물 2로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112021093523841-pat00031
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