KR102313752B1 - Plk1의 선택적 분해를 유도하는 피라졸로퀴나졸린 유도체 화합물 - Google Patents

Plk1의 선택적 분해를 유도하는 피라졸로퀴나졸린 유도체 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PLK1의 선택적 분해를 유도하는 신규 화합물에 관한 것으로, 구체적으로 PLK1 결합 모이어티와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 화학적 링커로 연결된 이기능성 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 상기 화합물, 이의 제조방법, 및 이의 용도 등을 제공한다. 본 발명에 따른 화합물들은 PLK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PLK1의 선택적 분해를 유도하는 피라졸로퀴나졸린 유도체 화합물{Pyrazolo quinazoline derivative compounds inducing selective degradation of PLK1}
본 발명은 PLK1의 선택적 분해 유도 화합물, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
PLK1(Polo-like kinase 1)은 세린/트레오닌 인산화효소로서 세포 성장 및 분열 중에 G2/M기의 전환에 관여하는 것으로 알려져 있다. PLK1은 S phase부터 G2/M기까지 펄스 형태로 발현되고 활성화되었다가, 유사분열이 종료되면서 빠르게 분해된다.
PLK1은 대장암, 폐암, 방광암, 흑색종 등 다양한 암종에서 과발현 되는 양상을 띄며, PLK1이 과발현된 암세포는 여러 종류의 항암제에 대해 저항성을 나타내는 경향을 보인다. 이와 같이 다양한 암종에서 PLK1 의존성이 밝혀짐에 따라, 볼라설팁(volasertib; BI6727로도 알려짐) 등 PLK1 억제제 화합물들의 개발이 시도된 바 있다.
그러나, 기존 PLK1 억제제들은 임상적으로 안전성이 확보된 농도에서 PLK1 활성을 충분히 억제하지 못하여, 암세포의 세포 주기를 일시적으로 지연시키더라도 결국 일부 암세포에서 세포 주기가 재개시되어, 충분한 임상적 효과를 거두지 못한 문제가 있다(문헌[Gheghiani et al. CULM Reports, 2017] 등). 실제로 베링거잉겔하임, GSK(GlaxoSmithKline) 등 다수 제약사들이 저분자화합물 기반의 PLK1 억제제 개발을 시도하였으나 대부분 임상시험 단계에서 실패하거나 중단되어 현재까지 상용화된 PLK1 억제제는 전무한 상태이다. 이는 암세포의 PLK1 활성을 억제하여 항암효과를 도출하고자 하는 신약개발 의도에 있어서, 저분자화합물 억제제와 같이 PLK1의 활성부위에 결합하여 효소 활성을 억제하는 방식의 약리 기전이 충분히 효과적이지 않음을 보여준다.
최근 들어, 표적 단백질의 체내 단백질 분해(proteolysis)를 유도할 수 있는 저분자 화합물 기반 플랫폼 기술로서 PROTAC(Proteolysis targeting chimera)이 제시된 바 있다. PROTAC이란 질환 관련 표적 단백질에 결합하는 리간드 분자와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 화학적 링커로 연결된 이기능성 화합물이다. 이론적으로 PROTAC 화합물은 질환 관련 표적 단백질을 E3 유비퀴틴 라이게이즈 근처에 위치시킴으로써, 표적 단백질의 분해를 유도할 수 있다.
PLK1을 타겟 단백질로 하는 PROTAC 화합물의 경우, 중국 공개특허 제106543185 A호는 볼라설팁 유도체 화합물과 E3 유비퀴틴 라이게이즈 CRBN에 대한 결합 모이어티를 화학적 링커로 연결한 이기능성 화합물을 일부 개시한다. 그러나, 상기 선행문헌에는 오직 일부 제한된 형태의 PROTAC 화합물의 합성예가 기재되어 있는데, 일반적으로 표적 단백질 모이어티, E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티 등의 선택에 따라 PROTAC의 타겟 분해 활성 및 선택성은 현저히 달라질 수 있다(문헌[Burslem and Crews, 2017] 등).
또한, 위 문헌에 기재된 PROTAC 화합물은 PLK1 및 BRD4를 동시에 분해하는 것에 발명의 특징이 있는 화합물이며 PLK1 이외의 다른 PLK 패밀리 단백질 및 BRD4 등 다양한 단백질 분해 역시 유도하므로 약물 개발 시 오프 타겟 영향(off-target effect)으로 인한 부작용 발생의 문제가 있다. 특히 BRD4의 활성을 강하게 억제하면 약리 효과와 함께 혈액독성 및 위장관 독성 같은 온 타겟 부작용(on target toxicity)이 필연적으로 동반된다는 사실이 이미 알려져 있음을 감안하면, 위 문헌에 기재된 PROTAC 화합물이 BRD4를 효과적으로 분해하면 할수록 임상적 부작용이 커질 것으로 예상된다(문헌[Bolden et al. CULM Reports, 2014] 등)
더욱이 위 문헌의 발명자에 의해 공개된 문헌[Mu et al. BBRC, 2019]에 따르면, 상기 PLK1 및 BRD4를 동시에 분해하는 PROTAC 화합물은 세포 수준에서 BRD4 분해능력이 PLK1 분해능력보다 월등히 강하고 세포 주기가 거의 G1 phase에 멈추는 등 기존 PLK1 억제제가 약리효과를 내는 방식과 전혀 상관없이 사실상 BRD4 억제제로서만 작용하는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 효과적으로 PLK1의 분해를 유도하면서도 PLK1에 대한 선택적 분해 활성을 갖춰 부작용을 최소화한 PLK1의 선택적 분해 유도 화합물에 대한 미충족된 수요가 존재한다.
본 발명의 목적은 PLK1의 선택적 분해 유도 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PLK1의 선택적 분해 유도 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PLK1의 선택적 분해 유도 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
PLK1 선택적 분해 유도 화합물
본 발명은 PLK1의 선택적 분해를 유도하는 신규 화합물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 PLK1 결합 모이어티와 E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티가 화학적 링커로 연결된 이기능성 화합물을 제공한다.
본 발명의 일 실시양태는 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염이다:
[화학식 I]
Figure 112021036227546-pat00001
상기 화학식 I에서,
ULM은 CRBN 또는 VHL E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티이고,
PTM은 하기 화학식 II로 표시되는 PLK1 결합 모이어티이고,
[화학식 II]
Figure 112021036227546-pat00002
{상기 화학식 II에서,
R1은 수소, C1-4알킬 또는 -(C1-3알킬)-OH이고,
R2는 -OC1-4알킬 또는 -OCF3이고,
R3은 N 또는 CH이고,
R4는 NH, N(C1-3알킬), CH2 또는 CH(C1-3알킬)임}
Linker는 ULM과 PTM을 화학적으로 연결하는 기이다.
(1) E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티
본 발명의 일 실시양태에 따르면 ULM은 CRBN E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티이다.
본 발명에서 CRBN은 세레블론(Cereblon) E3 유비퀴틴 라이게이즈를 의미한다. CRBN은 DDB1, Cul4A 및 ROC1와 함께 E3 유비퀴틴 라이게이즈 복합체를 구성하며, 여기서 CRBN은 상기 복합체의 기질 인식 서브유닛이다. CRBN E3 유비퀴틴 라이게이즈에 결합할 수 있는 화합물은 당업계에 일부 공지되어 있다. 예컨대, 탈리도마이드(thalidomide)가 CRBN E3 유비퀴틴 라이게이즈에 결합한다는 사실이 알려진 이후(문헌[Ito et al. 2010]), 레날리도마이드 및 포말리도마이드를 포함한 다수의 이미드계 소분자 화합물(immunomodulatory imide drug; IMiD)이 CRBN 결합능을 가진다는 점이 보고되었다 (문헌[Chamberlain and Brian. 2019], 문헌[Akuffo et al. 2018]), 문헌[Burslem et al. 2018] 등).
일 실시양태에서, 본 발명의 CRBN E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티는 하기 화학식 A로 표시되는 화합물이다(여기서, PTM 또는 ULM 내에 표시된
Figure 112021036227546-pat00003
는 Linker와 공유결합으로 연결됨을 나타냄).
[화학식 A]
Figure 112021036227546-pat00004
상기 화학식 A에서,
X1은 -CH2-, -CH(C1-4알킬)-, -CO- 또는 -N=N-이고;
X2은 수소 또는 C1-3알킬이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면 ULM은 VHL E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티이다.
본 발명에서 VHL은 폰 히펠-린다우 종양 억제자(von Hippel-Lindau tumor suppressor)를 의미한다. VHL은 Elongin B, Elongin C, CUL2 및 Rbx1와 함께 VCB E3 유비퀴틴 라이게이즈 복합체를 구성하며, 여기서 VHL은 상기 복합체의 기질 인식 서브유닛이다. VHL E3 유비퀴틴 라이게이즈에 결합할 수 있는 화합물은 당업계에 일부 공지되어 있다. 예컨대, Ala-Leu-Ala-(Hy)Pro-Tyr-Ile-Pro 헵타펩티드(문헌[Schneekloth et al. 2004]), Leu-Ala-(Hy)Pro-Tyr-Ile 펜타펩티드(문헌[Rodriguez-Gonzalez et al. 2008])와 같은 펩타이드가 알려진 이후, 이를 개량한 저분자 VHL E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 화합물이 보고된 바 있다(문헌[Buckley et al. J. Am. Chem. Soc. 2012], 문헌[Buckley et al. Ang. Chem. Int. Ed. 2012], 문헌[Galdeano et al. 2014], 문헌[Soares et al. 2017] 등).
일 실시양태에서, VHL E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티는 하기 화학식 B로 표시되는 화합물이다.
[화학식 B]
Figure 112021036227546-pat00005
상기 화학식 B에서,
Figure 112021036227546-pat00006
는 5원 헤테로아릴 고리이고,
Y1은 수소 또는 C1-3알킬이다.
일 실시양태에서, 화학식 B는 하기 화합물 중에서 선택된다.
Figure 112021036227546-pat00007
Figure 112021036227546-pat00008
Figure 112021036227546-pat00009
Figure 112021036227546-pat00010
(2) 표적 단백질 리간드(PTM)
본 발명의 화학식 I로 표시되는 화합물에서, 표적 단백질 리간드 기능을 수행하는 모이어티인 PTM은 상술한 화학식 II로 표시되는 PLK1 결합 모이어티이다.
본 발명의 화학식 I 화합물의 일부 모이어티를 구성하는 화학식 II는 단독적으로 피라졸로퀴나졸린 계열의 화합물로, PLK1의 활성 부위에 결합할 수 있다(문헌[Valsasina, Barbara, et al. Molecular cancer therapeutics 11.4 (2012): 1006-1016. 및 국제특허공개 WO2008/074788호 등].
본 발명에서, 화학식 II는 하기 화학식 III-1 또는 화학식 III-2으로 표시된다.
[화학식 III-1]
Figure 112021036227546-pat00011
[화학식 III-2]
Figure 112021036227546-pat00012
상기 화학식 III-1 및 III-2에서, R1, R2, R3 및 R4는 화학식 II에서 정의된 것과 같다.
일 실시양태에서, R1은 CH3이다.
일 실시양태에서, R2는 -OCH3 또는 -OCF3이다.
일 실시양태에서, R3는 N이다.
일 실시양태에서, R4은 NH 또는 N(C1-2알킬)이다.
일 실시양태에서, 화학식 III-1은
Figure 112021036227546-pat00013
이고, 화학식 III-2는
Figure 112021036227546-pat00014
이다.
(3) 링커(Linker)
본 발명의 일 실시양태에 따르면, Linker는 하기 화학식 L로 표시된다.
[화학식 L]
Figure 112021036227546-pat00015
상기 화학식 L에서,
Figure 112021036227546-pat00016
및
Figure 112021036227546-pat00017
는 결합이고,
LULM는 이에 연결된
Figure 112021036227546-pat00018
를 통해 ULM 모이어티와 결합하고,
LPTM은 이에 연결된
Figure 112021036227546-pat00019
를 통해 PTM 모이어티와 결합하고,
LULM 및 LPTM은 단일결합, -CH2-, -NH-, -O-, -CO-, -OCO-, -CONH- 또는 -NHCO-이고,
LINT는 -CH2-, -CH2CH2-, -CHCH-, -CC-, -CH2CH2O-, -OCH2CH2-, -CH2CH2S-, -SCH2CH2-, -COO-, -CONH-, -NHCO- 및
Figure 112021036227546-pat00020
로 구성된 군에서 선택되고{여기서,
Figure 112021036227546-pat00021
은 3원 내지 10원 사이클로알킬, 4원 내지 10원 헤테로사이클로알킬, 6원 내지 10원 아릴 또는 5원 내지 10원 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택된 고리임},
p는 1 내지 10의 정수이다.
일 실시양태에서, Linker는 화합물 2 내지 12에 포함된 Linker이다.
본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 화학식 I로 표시되는 화합물은 하기 화합물 2 내지 12로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 화합물, 이의 입체 입성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염이다.
본 발명에서 약학적으로 허용가능한 염이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 I로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 유기산 또는 무기산 부가염을 의미한다. 예컨대, 약학적으로 허용가능한 염은 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 또는 질산 등일 수 있고, 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산 또는 요오드화수소산일 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.
PLK1 선택적 분해 유도 화합물의 제조방법
본 발명에서, 상술한 화학식 I로 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염은 유기화학 기술 분야에 공지된 합성 방법 또는 통상의 기술자에게 자명한 변형 및 유도체화 기법에 의해 하기 반응식 1 내지 3과 같은 반응에 의해 제조될 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112021036227546-pat00022
[반응식 2]
Figure 112021036227546-pat00023
[반응식 3]
Figure 112021036227546-pat00024
상기 반응식 1 내지 3에서, PTM, Linker 및 ULM은 상기 정의된 기 또는 그의 반응 유도체이고, RG1, RG2, RG2a, RG2b, RG3, RG3a, RG3b 및 RG4는 유기 합성 분야에서 공유 결합 형성을 통해 화학식 I로 표시되는 PROTAC 화합물 중간체를 함께 연결할 수 있는 적합한 반응기를 포함하는 모이어티이다. 상기 공유 결합 형성은 특정한 반응기에 따라 아미드 형성, 에스테르 형성, 카바메이트 형성, 우레아 형성, 에테르 형성, 아민 형성 및 다양한 탄소간 단일결합, 이중결합 형성, 클릭 케미스트리(Click chemistry) 등의 합성 반응을 거쳐 형성될 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
상기 반응식에서 각 단계의 변형은 1개 또는 다중 합성 단계를 포함할 수 있다. 생성물의 분리 및 정제는 유기화학 분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 과정에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 화합물은 예컨대 1개 또는 다중 합성 단계의 반응식 2를 통해 제조될 수 있다.
일례로, ULM이 화학식 A일 경우 본 발명의 화합물은 하기 반응식을 통해 제조될 수 있다.
Figure 112021036227546-pat00025
또다른 일례로, ULM이 화학식 B일 경우 본 발명의 화합물은 하기 반응식을 통해 제조될 수 있다.
Figure 112021036227546-pat00026
상기 반응식에서, RG1 및 RG2는 LPTM 또는 그의 반응 전구체이고, RG3 및 RG4는 LULM 또는 그의 반응 전구체이며, 목적 화합물의 구조 및 링커 위치에 따라 RG1, RG2, RG3 및 RG4를 적절히 선택할 수 있다.
예컨대,
Figure 112021036227546-pat00027
가
Figure 112021036227546-pat00028
인 경우, RG1은 실시예 2-4, 8-12에서와 같이 -COOH일 수 있고,
Figure 112021036227546-pat00029
인 경우, RG1은 실시예 5-7에서와 같이 수소일 수 있다.
상기 반응식에서, PTM로 제시된 반응물 및 ULM으로 제시된 반응물은 유기화학 분야에 공지된 문헌 및 본 발명의 실시예 기재 등을 참고로 하여 통상의 기술자가 용이하게 합성할 수 있다.
본 발명은 화학식 I의 반응 중간체에 해당하는
Figure 112021036227546-pat00030
또는
Figure 112021036227546-pat00031
형태의 화합물을 포함한다.
PLK1 선택적 분해 유도 화합물의 용도
본 발명의 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 PLK1 분해 유도용 조성물이다. 화학식 I는 위에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명의 화합물은 PLK1의 분해를 효과적으로 유도한다는 점을 확인하였다(도 1). 구체적으로, 본 발명의 화합물들(화합물 2-12)는 PLK1에 대한 분해 활성이 선행기술문헌인 중국 공개특허 제106543185 A호에 개시된 화합물 대비 현저히 우수할 뿐만 아니라, PLK1 이외의 타겟 단백질인 BRD4에 대한 분해능을 갖지 않아, 상기 선행기술문헌에 개시된 화합물에서 나타나는 오프타겟(off-target) 분해로 인한 부작용 역시 최소화한 장점이 있다.
본 발명의 PLK1 분해 유도 PROTAC 화합물은 작용 기전의 관점에서 타겟 단백질인 PLK1를 원천 분해할 수 있으므로, PLK1의 단순 활성을 억제하는 종래 PLK1 저분자 억제제와 비교하여서도 우수한 PLK1 억제 효과를 달성한다.
따라서, 본 발명의 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물은 PLK1의 선택적 분해를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 PLK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다. 화학식 I는 위에서 정의된 바와 같다.
본 발명에서 PLK1 관련 질환은 PLK1의 분해 유도 또는 활성 억제로부터 치료, 경감, 지연, 저해 또는 예방될 수 있는 임의의 질환 또는 병태를 의미한다. 일 실시양태에서, PLK1 관련 질환은 암(악성 종양), 양성 종양, 신경질환, 또는 그 외 지나친 세포 분열로 인해 일어나는 유전적 또는 비유전적 질환일 수 있다.
상기　암은 PLK1의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든 암을 포함하며, 고형암　또는 혈액암일 수 있다. 예컨대, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기　암은 원발성　암뿐 아니라 전이성　암도 포함한다.
상기 양성 종양은 PLK1의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든 양성 종양, 예컨대 암 이전 단계의 양성 종양을 포함하며, 고형 종양 또는 혈액 종양일 수 있다. 예컨대, 상기 종양은 배럿 식도, 대장 선종 및 용종, 유방 섬유선종 및 낭종, 단세포 감마글로불린병증 (MGUS), 단클론 림프구증가증 등으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 신경질환은 PLK1의 활성 억제로 인해 예방 또는 치료 효능을 나타낼 수 있는 모든　신경질환을 포함하며, 구체적으로 중추 신경계 질환, 퇴행성　신경질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성경화증, 헌팅톤병, 노인성 치매, 간질, 루게릭, 뇌졸증, 및 뇌 또는 척수 손상에 이은 신경손상과 축삭 변성 관련 장애 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 화학식 I 로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 외에 동일 또는 유사한 약효를 나타내는 유효성분을 1 종 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 인간을 포함하는 포유류에 투여하여 PLK1 단백질을 분해하는 방법이다.
본 발명의 또다른 일 실시양태는 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 체외에서 샘플에 투여하여 PLK1 단백질을 분해하는 방법이다. 상기 샘플은 세포, 세포 배양물, 사람을 포함한 포유동물의 체액 또는 조직일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물은 PLK1의 분해를 유도하는 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 화합물은 PLK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 이기능성 화합물의 PLK1의 분해능을 측정한 웨스턴블롯팅 결과를 나타낸다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 하기 표에 표시된 화합물 1 내지 12에 대한 합성 방법을 제공한다.
[표 1]
Figure 112021036227546-pat00032
Figure 112021036227546-pat00033
Figure 112021036227546-pat00034
본 발명의 화합물을 아래 방법에 따라 정제하고 구조를 분석하였다.
분석 기기
LCMS : Shimadzu LCMS-2020
NMR : BRUKER AVANCE III/400MHz
HPLC : Shimadzu LC-20AB 와 Shimadzu LC-20AD, Agilent 1100 LC, Agilent 1200 LC, Agilent 1290 LC
SFC : SHIMADZU LC-30ADsf
LCMS 분석 방법
LCMS 데이타는 전자 분사 이온화(electron spray ionization) 장치가 장착된 Shimadzu LCMS-2020으로 기록하였다. 물 내 0.0375 % TFA (용매 A)와 아세토니트릴 내 0.01875 % TFA (용매 B)를 이동상으로 사용하였다. 컬럼은 Kinetex EVO C18 (2.1*30)mm, 5um 을 사용하였다.
HPLC 분석 방법
HPLC는 Shimadzu LC-20AB 또는 Shimadzu LC-20AD 또는 Agilent 1100 LC 또는 Agilent 1200 LC 또는 Agilent 1290 LC 를 사용하였고, 물 내 0.0375 % TFA (용매 A)와 아세토니트릴 내 0.01875 % TFA (용매 B) 또는 물 내 0.025% NH3·H2O (용매 A)와 아세토니트릴(용매 B)을 이동상으로 사용하였다. 컬럼은 XBridge C18 (2.1*50)mm, 5um 또는 Kinetex C18 LC 컬럼 (4.6*50)mm, 5um 또는 Eclipse plus C18 (4.6*150)mm, 3.5um 또는 Waters XBridge® C18 (4.6*150)mm, 3.5μm을 사용하였다.
NMR 분석 방법
1H NMR 스펙트럼을 Bruker AVANCE III/400MHz Probe (BBO)로 기록하였다.
SFC 분석 방법
SFC는 SHIMADZU LC-30ADsf를 사용하였고, CO2 (용매 A)와 메탄올 내 0.05% DEA (용매 B) 또는 메탄올:아세토니트릴(1:1) 내 0.05% DEA (용매 B)를 이동상으로 사용하였다. 컬럼은 Chiralcel OD-3 50Х4.6mm, 3um 또는 Chiralcel OJ-3 50Х4.6mm, 3um 또는 Chiralpak AD-3 50Х4.6mm, 3um 또는 Chiralpak AS-3 50Х4.6mm, 3um을 사용하였다.
실시예 1. 8-((2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)-3-((2-(2-(2-(페닐아미노)에톡시)에톡시)에틸)카바모일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 1)의 합성
단계 1: 벤질 (2-(2-(2-히드록시에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (26)의 합성
Figure 112021036227546-pat00035
DCM (50 mL) 내 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에탄올 (5 g, 33.51 mmol)의 용액에 벤질 카보노클로리데이트 (5.72 g, 33.51 mmol, 4.76 mL) 및 DIPEA (8.66 g, 67.03 mmol, 11.68 mL)를 첨가하였다. 그 다음, 혼합물을 25 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS으로 원하는 질량이 검출되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 무색 오일의 벤질 (2-(2-(2-히드록시에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (9 g, crude)을 수득하여 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
단계 2: 2-[2-[2-(벤질옥시카보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸 4-메틸벤젠설포네이트 (27)의 합성
Figure 112021036227546-pat00036
DCM (100 mL) 내 벤질 (2-(2-(2-히드록시에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (9 g, 31.77 mmol)의 용액에 4-메틸벤젠설포닐 클로라이드 (12.11 g, 63.53 mmol) 및 피리딘 (5.10 g, 64.49 mmol, 5.20 mL)를 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 25 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS으로 원하는 질량이 검출되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL×2)로 세척하였다. 유기층을 소금물(500 mL×2)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하였다. 여과물을 감압 하에서 농축하였다. 잔여물을 속성 실리카 겔 크로마토그래피(flash silica gel chromatography)로 정제하였다(80 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~100% PE/EtOAc at 80 mL/min). 무색 오일의 표제 화합물(8.74 g, 14.39 mmol, 45.30% yield, 72% purity)을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 438.1
단계 3: 벤질 (2-(2-(2-(페닐아미노)에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (28)의 합성
Figure 112021036227546-pat00037
톨루엔(20 mL) 내 2-[2-[2-(벤질옥시카보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸 4-메틸벤젠설포네이트 (2 g, 3.29 mmol)의 혼합물에 TEA (666.11 mg, 6.58 mmol, 916.25 uL) 및 아닐린(425.72 mg, 4.57 mmol, 417.37 uL)을 25 ℃에서 적가하고, 생성된 혼합물을 120 ℃에서 5 시간 동안 교반하였다. LCMS에 출발물질이 주로 보였고, 혼합물에 아닐린(306.52 mg, 3.29 mmol, 300.51 uL)을 추가로 첨가하고 생성된 혼합물을 120 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS으로 원하는 물질의 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하였다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 8/1 to 2/1)로 정제하여 황색 오일의 표제 화합물(1.1 g, 3.07 mmol, 93.24% yield)을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 359.3
단계 4: N -(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아닐린 (29)의 합성
Figure 112021036227546-pat00038
EtOAc (10 mL) 내 벤질 (2-(2-(2-(페닐아미노)에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (900.00 mg, 2.51 mmol)의 용액에 Pd/C (50 mg, 10% purity)를 첨가하고, 혼합물을 25 ℃에서 16 시간 동안 H2 (15 psi) 하에서 교반하였다. LCMS으로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 혼합물을 여과하고, 여과물을 진공 하에서 농축하여 황색 오일의 표제 화합물(530 mg, 2.36 mmol, 94.10% yield)을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 225.1
단계 5: 에틸 ( Z )-6-((디메틸아미노)메틸렌)-1-메틸-7-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-1 H -인다졸-3-카복실레이트 (31)의 합성
Figure 112021036227546-pat00039
DMF (40 mL) 내 에틸 1-메틸-7-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-1H-인다졸-3-카복실레이트 (8 g, 36.00 mmol) 및 1,1-디tert-부톡시-N,N-디메틸-메탄아민 (33.92 g, 166.83 mmol, 40.00 mL)의 혼합물을 60 ℃에서 15 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하였다. 잔여물을 (석유 에테르 : 에틸 아세테이트=5:1, 100 mL)로 고체화하고 여과하였다. 여과 케이크를 수집하여 황백색의 표제 화합물(8.5 g, 30.65 mmol, 85.15% yield)을 수득하였다.
단계 6: 에틸 8-아미노-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복실레이트 (32)의 합성
Figure 112021036227546-pat00040
EtOH (170 mL) 내 에틸 (Z)-6-((디메틸아미노)메틸렌)-1-메틸-7-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-1H-인다졸-3-카복실레이트 (8.5 g, 30.65 mmol) 및 구아니딘; 히드로클로라이드 (3.51 g, 36.78 mmol, 2.95 mL) 혼합물에 NaOEt (2.71 g, 39.85 mmol)을 첨가하고 생성된 혼합물을 80 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 혼합물을 여과하였다. 여과 케이크를 물(50 mL) 및 EtOH (50 mL)로 세척하고, 건조하여 황백색의 표제 화합물(5.6 g, 20.49 mmol, 66.85% yield)을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 274.1
1H NMR (400MHz, DMSO-d 6 ) ┙ = 8.17 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 4.31 (s, 3H), 4.29 - 4.24 (m, 2H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.73 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.29 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
단계 7: 메틸 3-브로모-2-히드록시-5-아이오도벤조에이트 (34)의 합성
Figure 112021036227546-pat00041
MeOH (800 mL) 내 메틸 2-히드록시-5-아이오도벤조에이트 (55 g, 197.81 mmol)의 용액에 MeOH (40 mL) 내 Br2 (47.42 g, 296.72 mmol, 15.30 mL) 용액을 0 ℃에서 적가하고, 혼합물을 25 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. HPLC로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 Na2S2O3 (sat. aq. 500 mL)로 켄칭하고 여과하였다. 여과된 케이크를 수집하여 백색 고체의 표제 화합물(74 g, crude)을 수득하였다.
단계 8: 메틸 3-브로모-5-아이오도-2-메톡시벤조에이트 (35)의 합성
Figure 112021036227546-pat00042
DMF (800 mL) 내 메틸 3-브로모-2-히드록시-5-아이오도벤조에이트 (73 g, 204.52 mmol) 용액에 K2CO3 (84.80 g, 613.55 mmol) 및 CH3I (34.83 g, 245.42 mmol, 15.28 mL)를 0 ℃에서 N2 하에서 30분 기간 동안 적가하고 생성된 혼합물을 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. TLC로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 25 ℃에서 물(1600 mL)을 첨가하여 켄칭하였다. 수성층을 EtOAc (500 mL×3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물(800 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 진공 하에서 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피(석유 에테르 : 에틸 아세테이트 = 1:10)로 정제하여 백색 고체의 표제 화합물(50 g, 134.78 mmol, 65.90% yield)을 수득하였다.
단계 9: 메틸 3-브로모-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)벤조에이트 (36)의 합성
Figure 112021036227546-pat00043
디옥산(200 mL) 내 메틸 3-브로모-5-아이오도-2-메톡시벤조에이트 (19 g, 51.22 mmol), 1-메틸피페라진 (5.13 g, 51.22 mmol, 5.68 mL), Pd(OAc)2 (1.15 g, 5.12 mmol), BINAP (3.19 g, 5.12 mmol) 및 Cs2CO3 (33.38 g, 102.44 mmol) 혼합물을 75 ℃에서 20 시간 동안 N2 대기 하에서 교반하였다. LCMS으로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각하고, EtOAc (600 mL) 및 물(800 mL)을 첨가하고 층들을 분리하였다. 수성층을 EtOAc (500 mL×2)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 소금물(400 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하고, 진공 하에서 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트 : 메탄올 = 10:1)로 정제하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 물(300 mL)로 희석하고 HCl(1 M)으로 pH2로 조정한 다음, EtOAc (250 mL×2)로 세척하였다. 수성층을 NaHCO3(sat.aq)로 pH9로 조정하고 EtOAc (200 mL×3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하였다. 여과물을 진공 하에서 농축하여 황색 액체의 표제 화합물(13.15 g, 38.31 mmol, 74.81% yield)을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 343.2
단계 10: tert -부틸 3-브로모-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)벤조에이트 (37)의 합성
Figure 112021036227546-pat00044
3개 배치 병행(three batches in parallel):
THF (50 mL) 내 t-BuOH (12.96 g, 174.82 mmol, 16.72 mL) 용액에 -65 ℃에서 n-BuLi (2.5 M, 58.27 mL)를 첨가하고 생성된 혼합물을 -65 ℃에서 0.5 시간 동안 교반하고, THF (5 mL) 내 메틸 3-브로모-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)벤조에이트 (5 g, 14.57 mmol) 용액을 첨가하고 생성된 혼합물을 25 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. LCMS으로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 혼합물에 물(500 mL)을 붓고 EtOAc (500 mL×3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물(500 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼(석유 에테르 : 에틸 아세테이트 = 1:1)으로 정제하여 황색 오일의 표제 화합물(10 g, 25.18 mmol, 57.60% yield, 97% purity)을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 385.1
단계 11: 에틸 8-((3-( tert -부톡시카보닐)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복실레이트 (38)의 합성
Figure 112021036227546-pat00045
디옥산(40 mL) 내 tert-부틸 3-브로모-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)벤조에이트 (1.5 g, 3.89 mmol) 및 에틸 8-아미노-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복실레이트 (750 mg, 2.74 mmol) 혼합물에 Cs2CO3 (2.68 g, 8.23 mmol), [2-(2-아미노페닐)페닐]-메틸설포닐옥시-팔라듐;디시클로헥실-[3,6-디메톡시-2-(2,4,6-트리이소프로필페닐)페닐]포스판 (248.77 mg, 274.43 umol)을 첨가하고 생성된 혼합물을 90 ℃에서 12 시간 동안 N2 하에서 교반하였다. LCMS로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 혼합물에 NH4Cl (aq.sat, 100 mL)을 붓고 EtOAc (100 mL×3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼(에틸 아세테이트 : 메탄올 = 1:0 - 10:1)으로 정제하여 황색 고체의 표제 화합물(1.5 g, 2.41 mmol, 87.99% yield, 93% purity)을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 578.4
단계 12: 8-((3-( tert -부톡시카보닐)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복실산 (39)의 합성
Figure 112021036227546-pat00046
THF (20 mL) 및 MeOH (20 mL) 내 에틸 8-((3-(tert-부톡시카보닐)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복실레이트 (2 g, 3.46 mmol)의 용액에 H2O (40 mL) 내 NaOH (166.17 mg, 4.15 mmol)의 용액을 첨가하고 생성된 혼합물을 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 혼합물을 HCl (1 M)로 약 pH7로 조정하고 농축하여 황색 고체의 표제 화합물(1.9 g, 3.46 mmol, 99.85% yield)을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 550.2
단계 13: tert -부틸 3-((3-카바모일-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-8-일)아미노)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)벤조에이트 (40)의 합성
Figure 112021036227546-pat00047
DMF (40 mL) 내 8-((3-(tert-부톡시카보닐)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복실산 (1.9 g, 3.46 mmol)의 혼합물에 EDCI (1.72 g, 8.99 mmol) 및 HOBt (1.17 g, 8.64 mmol) 를 첨가하고 생성된 혼합물을 25 ℃에서 10 분 동안 교반하고, DIPEA (1.56 g, 12.10 mmol, 2.11 mL) 및 NH4Cl (1.11 g, 20.74 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 혼합물을 여과하고, 여과물에 물(20 mL)을 붓고 EtOAc (20 mL×3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물(50 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하였다. 여과물을 농축하여 황색 오일의 표제화합물(1.5 g, 2.73 mmol, 79.09% yield) 을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 549.2
단계 14: 3-((3-카바모일-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-8-일)아미노)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)벤조산 (41)의 합성
Figure 112021036227546-pat00048
디옥산(15 mL) 내 tert-부틸 3-((3-카바모일-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-8-일)아미노)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)벤조에이트 (1.6 g, 2.92 mmol) 의 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 15 mL)을 첨가하고 생성된 혼합물을 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 현탁액을 여과하고 여과된 케이크를 수집하여 황색 고체의 표제 화합물(1.7 g, crude, HCl salt)을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 493.2
단계 15: 8-((2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)-3-((2-(2-(2-(페닐아미노)에톡시)에톡시)에틸)카바모일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 1)의 합성
Figure 112021036227546-pat00049
DMF (5 mL) 내 3-((3-카바모일-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-8-일)아미노)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)벤조산 (190 mg, 359.17 umol, HCl salt), HATU (273.14 mg, 718.35 umol)의 용액에 DIPEA (139.26 mg, 1.08 mmol, 187.68 uL)를 첨가하고 생성된 혼합물을 25 ℃에서 30 분 동안 교반하고, N-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아닐린 (88.62 mg, 395.09 umol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 25 ℃에서 0.5 시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 혼합물에 물(20 mL)을 붓고 EtOAc (20 mL×3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물(50 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (column: Phenomenex luna C18 150*40mm* 15um; mobile phase: [water (0.225% FA) - ACN]; B%: 11% - 41%, 10 min)을 통해 26.9 mg의 원하는 생성물 및 110 mg의 조 생성물로 분리하였다. 조 생성물은 다시 prep-TLC (에틸 아세테이트 : 메탄올=10:1)로 분리한 뒤, H2O/CH3CN=10/1 (2 mL)에 용해시키고, 용액을 HCOOH로 pH5로 조정한 다음, 동결건조하여 25 mg의 원하는 생성물을 수득하였다. 최종 표제 화합물(51.9 mg, 64.11 umol, 17.85% yield, 92% purity, FA salt)을 회색 고체로 수득하였다.
MS (M + H)+ = 699.2
실시예 2. 8-((3-((2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)카바모일)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드(화합물 2)의 합성
Figure 112021036227546-pat00050
DMF (5 mL) 내 3-((3-카바모일-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-8-일)아미노)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)벤조산 (250 mg, 472.60 umol, HCl salt)의 용액에 HATU (359.39 mg, 945.20 umol) 및 DIPEA (183.24 mg, 1.42 mmol, 246.95 uL)를 첨가하고 혼합물을 25 ℃에서 10 분 동안 교반하고, 4-((2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아미노)-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린-1,3-디온 (270.87 mg, 614.38 umol, HCl salt)를 첨가하고 생성된 혼합물을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응이 완결되었음을 확인하였다. 혼합물에 물(20 mL)을 붓고 EtOAc (20 mL×3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물(50 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (column: Waters Xbridge C18 150*50mm* 10um; mobile phase: [water(10mM NH4HCO3) - ACN]; B%: 17% - 47%, 11.5 min)에 이어 prep-HPLC (column: Phenomenex Gemini-NX C18 75*30mm*3um; mobile phase: [water (0.1% TFA) - ACN]; B%: 25% - 35%, 7 min)로 정제하여 황색 고체의 표제 화합물(39.7 mg, 38.38 umol, 8.12% yield, 96% purity, TFA salt)을 수득하였다.
MS (M + H)+ = 879.4
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) ┙ 11.08 (s, 1H), 9.68 (br s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.30 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.58 - 7.48 (m, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.10 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.03 - 6.92 (m, 2H), 6.59 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.03 (dd, J = 5.4, 12.8 Hz, 1H), 4.20 (s, 3H), 3.74 (d, J = 12.6 Hz, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.64 - 3.53 (m, 10H), 3.51 - 3.45 (m, 5H), 3.15 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 3.01 - 2.94 (m, 2H), 2.92 - 2.76 (m, 8H), 2.59 - 2.50 (m, 1H), 2.06 - 1.94 (m, 1H).
실시예 3. 8-((3-((2-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)카바모일)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드(화합물 3)의 합성
상술한 실시예와 유사한 방법으로 황색 고체의 표제 화합물(274 mg, 245.73 umol, 32.50% yield, 93% purity, TFA salt)을 합성하였다.
MS (M + H)+ = 923.4
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) ┙ 9.03 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.56 - 7.44 (m, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.08 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.00 (s, 1H), 4.91 (dd, J = 11.8, 5.7 Hz, 1H), 3.99 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.72 - 3.65 (m, 8H), 3.65 - 3.58 (m, 11H), 3.47 - 3.33 (m, 4H), 3.19 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.06 - 2.95 (m, 2H), 2.95 - 2.83 (m, 6H), 2.79 - 2.70 (m, 2H), 2.16 - 2.07 (m, 1H).
실시예 4. 8-((3-((14-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)카바모일)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 4)의 합성
상술한 실시예와 유사한 방법으로 황색 고체의 표제 화합물(104 mg, 96.79 umol, 25.60% yield, 90% purity) 을 합성하였다.
MS(M+H)+=967.0
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.09 (s, 1H), 9.71 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.32 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.70 - 7.63 (m, 1H), 7.56 (dd, J = 8.6, 7.0 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.11 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.08 - 6.97 (m, 2H), 6.58 (s, 1H), 5.05 (dd, J = 12.9, 5.4 Hz, 1H), 4.21 (s, 3H), 3.74 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.59 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.56 - 3.49 (m, 12H), 3.49 - 3.47 (m, 4H), 3.46 - 3.41 (m, 4H), 3.23 - 3.10 (m, 2H), 3.01 - 2.90 (m, 4H), 2.90 - 2.85 (m, 4H), 2.84 - 2.78 (m, 2H), 2.64 - 2.51 (m, 2H), 2.07 - 1.96 (m, 1H).
실시예 5. 8-((5-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메톡시)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 5)의 합성
Figure 112021036227546-pat00051
단계 1: (Z)-에틸 6-((디메틸아미노)메틸렌)-1-메틸-7-옥소-4,5,6,7-테트라히드로 -1H-인다졸-3-카복실레이트 (3)의 합성
1,1-디-tert-부톡시-N,N-디메틸메탄아민 (3.39 g, 16.68 mmol, 4.00 mL) 내 에틸 1-메틸-7-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-1H-인다졸-3-카복실레이트 (2 g, 9.00 mmol)의 혼합물을 60 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모되었음과 원하는 분자량에서 89%의 피크가 검출되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 농축하여 녹색 고체의 표제 화합물 (2.5 g, crude)을 수득하였다.
단계 2: 에틸 8-아미노-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복실레이트(4)의 합성
EtOH (21 mL) 내 (Z)-에틸 6-((디메틸아미노)메틸렌)-1-메틸-7-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-1H-인다졸-3-카복실레이트 (2.1 g, 7.57 mmol)와 구아니딘 (2.17 g, 22.72 mmol, HCl)의 용액에 NaOEt (1.55 g, 22.72 mmol)를 첨가하고 혼합물을 80 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 남아 있음을 확인하고 혼합물을 85 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 18%의 출발 물질이 남아 있음과 61%의 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 반응물을 감압 하에서 농축하였다. 조 생성물을 MeOH (10 mL), EtOAc (10 mL) 및 MTBE (10 mL)로 희석한 다음, 여과하였다. 여과된 케이크를 EtOAc (20 mL)로 세척하고, 수집 및 진공 하에서 건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (2 g, 6.81 mmol, 89.88% yield, 93% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=274.1.
단계 3: tert-부틸 4-(3-브로모-4-(트리플루오로메톡시)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (5)의 합성
디옥산 (200 mL) 내 2-브로모-4-아이오도-1-(트리플루오로메톡시)벤젠 (5 g, 13.63 mmol)과 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (2.75 g, 12.35 mmol)의 용액에 Cs2CO3 (13.32 g, 40.88 mmol), BINAP (254.57 mg, 408.83 μmol) 및 Pd(OAc)2 (61.19 mg, 272.55 μmol)를 첨가하고 혼합물을 60 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. TLC (Petroleum ether : Ethyl acetate=5:1)로 신규 스폿이 형성되었음을 확인하였다. 혼합물을 EtOAc (50 mL)로 희석하고 여과하였다. 여과된 케이크를 EtOAc (100 mL)로 세척하였다. 여과물을 감압 하에서 농축하였다. 잔여물을 신속 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 0~20% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 50 mL/min)로 정제하여 황색 고체의 표제 화합물 (0.6 g, 1.31 mmol, 9.63% yield, 93% purity)을 수득하였다.
단계 4: 에틸 8-((5-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메톡시)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복실레이트(6)의 합성
디옥산 (4 mL) 내 에틸 8-아미노-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복실레이트 (130.00 mg, 475.69 μmol)와 tert-부틸 4-(3-브로모-4-(트리플루오로메톡시)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (200 mg, 470.32 μmol)의 용액에 Cs2CO3 (459.72 mg, 1.41 mmol) 및 BrettPhosPdG3 (42.63 mg, 47.03 μmol)를 첨가하고 혼합물을 100 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 EtOAc (10 mL)로 희석하고 여과하였다. 여과된 케이크를 EtOAc (20 mL)로 세척하고, 여과물을 감압 하에서 농축하였다. 잔여물을 신속 실리카 겔 크로마토그래피 (5 g SepaFlash® Silica Flash Column, Eluent of 10~40% Ethyl acetate/Petroleum ether gradient @ 50 mL/min)로 정제하여 황색 고체의 표제 화합물 (140 mg, 219.88 μmol, 46.75% yield, 97% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=618.3.
단계 5: 8-((5-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메톡시)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복실산 (7)의 합성
THF (0.7 mL) 및 MeOH (0.7 mL) 내 에틸 8-((5-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메톡시)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복실레이트 (140 mg, 226.68 μmol)의 용액에 NaOH (3 M, 150 μL)를 첨가하고 혼합물을 30 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 반응물을 감압 하에서 농축하여 황색 고체의 표제 화합물 (150 mg, crude)을 수득하였다.
MS(M+H)+=590.3.
단계 6: tert-부틸 4-(3-((3-카바모일-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h] 퀴나졸린-8-일)아미노)-4-(트리플루오로메톡시)페닐)피페라진-1-카복실레이트(8)의 합성
DMF (3 mL) 내 8-((5-(4-(tert-부톡시카보닐)피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메톡시)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복실산 (150 mg, 245.28 μmol)과 NH4Cl (65.60 mg, 1.23 mmol)의 용액에 EDCI (70.53 mg, 367.92 μmol), HOBt (49.71 mg, 367.92 μmol) 및 DIPEA (158.50 mg, 1.23 mmol, 213.62 μL)를 첨가하고 혼합물을 20 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 남아 있음과 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 30 ℃에서 14 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 소모되었음과 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 소금물 (10 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하였다. 여과물을 감압 하에서 농축하여 황색 고체의 표제 화합물 (130 mg, 220.87 μmol, 90.05% yield)을 수득하였다.
MS(M+H)+=589.2.
단계 7: 1-메틸-8-((5-(피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메톡시)페닐)아미노)-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복사미드 (9)의 합성
디옥산 (2 mL) 내 tert-부틸 4-(3-((3-카바모일-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로 [4,3-h]퀴나졸린-8-일)아미노)-4-(트리플루오로메톡시)페닐)피페라진-1-카복실레이트 (130 mg, 220.87 μmol)의 용액에 HCl/디옥산 (4 M, 2 mL)을 첨가하고 혼합물을 20 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 워크업 후 LCMS로 원하는 분자량이 검출되었음을 확인하였다. 혼합물을 감압 하에서 농축하여 황색 고체의 표제 화합물 (130 mg, crude, 2HCl)을 수득하였다.
MS(M+H)+=489.1.
단계 8: 8-((5-(4-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸)피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메톡시)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 5)의 합성
디옥산 (2 mL) 내 2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에틸 4-메틸벤젠설포네이트 (132 mg, 235.89 μmol)와 1-메틸-8-((5-(피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메톡시)페닐)아미노)-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복사미드 (110 mg, 195.94 μmol, 2HCl)의 용액에 K2CO3 (135.41 mg, 979.72 μmol) 및 NaI (14.68 mg, 97.97 μmol)를 첨가하고 혼합물을 80 ℃에서 28 시간 동안 교반하였다. LCMS로 원하는 분자량이 검출된 것을 확인하였다. 혼합물을 H2O (10 mL)로 희석하고 EtOAc (10 mL x 3)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 H2O (10 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하였다. 여과물을 감압 하에서 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (column: Unisil 3-100 C18 Ultra 150*50mm*3 um; mobile phase: [water (0.225% FA) - ACN]; B%: 20% - 50%, 10 min)로 정제하고 용리액을 동결건조하여 황색 고체의 표제 화합물 (26 mg, 27.36 μmol, 13.96% yield, 97% purity, FA salt)을 수득하였다.
MS(M+H)+=876.5.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 9.19 - 9.11 (m, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.03 - 8.00 (m, 1H), 7.56 - 7.44 (m, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.17 - 7.13 (m, 1H), 7.11 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.85 - 6.79 (m, 1H), 6.58 - 6.52 (m, 2H), 5.42 - 5.37 (m, 1H), 4.94 - 4.88 (m, 1H), 4.33 (s, 3H), 3.78 - 3.72 (m, 4H), 3.70 - 3.66 (m, 4H), 3.50 - 3.44 (m, 2H), 3.32 - 3.25 (m, 4H), 3.16 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.92 - 2.67 (m, 11H), 2.16 - 2.09 (m, 1H).
실시예 6. 8-((5-(4-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메톡시)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 6)의 합성
Figure 112021036227546-pat00052
상기 반응식에 따라 상술한 실시예와 유사한 방법으로 황색 고체의 표제 화합물 (21.7 mg, 21.23 μmol, 11.92% yield, 90% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=920.7.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 8.29 (s, 1H), 7.62 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.51 - 7.46 (m, 1H), 7.20 - 7.16 (m, 1H), 7.01 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 6.74 - 6.69 (m, 1H), 5.05 - 4.99 (m, 1H), 4.24 (s, 3H), 3.71 - 3.68 (m, 2H), 3.68 - 3.64 (m, 8H), 3.62 - 3.59 (m, 2H), 3.47 - 3.43 (m, 2H), 3.23 - 3.17 (m, 4H), 3.09 - 3.03 (m, 2H), 2.89 - 2.84 (m, 2H), 2.83 - 2.77 (m, 1H), 2.75 - 2.62 (m, 8H), 2.11 - 2.02 (m, 1H)
실시예 7. 8-((5-(4-(14-((2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)아미노)-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)피페라진-1-일)-2-(트리플루오로메톡시)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 7)의 합성
Figure 112021036227546-pat00053
상기 반응식에 따라 상술한 실시예와 유사한 방법으로 백색 고체의 표제 화합물 (8 mg, 8.05 μmol, 6.46% yield, 97% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=964.4.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 8.29 (s, 1H), 7.63 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.52 - 7.47 (m, 1H), 7.21 - 7.17 (m, 1H), 7.02 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.75 - 6.71 (m, 1H), 5.05 - 5.00 (m, 1H), 4.25 (s, 3H), 3.69 - 3.58 (m, 16H), 3.46 - 3.42 (m, 2H), 3.23 - 3.20 (m, 4H), 3.09 - 3.03 (m, 2H), 2.88 - 2.84 (m, 2H), 2.84 - 2.78 (m, 1H), 2.75 - 2.64 (m, 8H), 2.12 - 2.03 (m, 1H).
실시예 8. 8-((3-((2-(2-((( S )-1-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-일)-3,3-디메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에톡시)에틸)카바모일)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드(화합물 8)의 합성
단계 1: tert -부틸 (2-(2-(((S)-1-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-일)-3,3-디메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에톡시)에틸)카바메이트 (43a)의 합성
Figure 112021036227546-pat00054
DMF (10 mL) 내 2-[2-(tert-부톡시카보닐아미노)에톡시]아세트산 (516.37 mg, 2.36 mmol)의 용액에 DIPEA (553.48 mg, 4.28 mmol, 745.92 uL) 및 HATU (895.57 mg, 2.36 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 15 ℃에서 20 분 동안 교반하고, DIPEA (553.48 mg, 4.28 mmol, 745.92 uL)가 포함된 DMF (10 mL) 내 (2S,4R)-1-((S)-2-아미노-3,3-디메틸부타노일)-4-히드록시-N-(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (1 g, 2.14 mmol, HCl salt) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 15 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모되었음과 88%의 원하는 질량이 검출되었음을 확인하였다. TLC (SiO2, 디클로로메탄:메탄올 = 10:1)로 출발 물질이 완전히 소모되었음과 한 개의 신규 스폿이 검출되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (60 mL)로 희석하고 EtOAc (60 mL×3)로 추출하였다. 유기층을 소금물(60 mL×3)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 디클로로메탄 /메탄올 = 0/1 to 10/1)로 정제하였다. 황색 오일의 표제 화합물(816 mg, 1.19 mmol, 55.49% yield, 92% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=632.2
단계 2: tert -부틸 (2-(2-(2-(((S)-1-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-일)-3,3-디메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에톡시)에톡시)에틸)카바메이트 (43b)의 합성
단계 1과 유사한 방법으로 황색 고체의 표제 화합물(850 mg, 1.14 mmol, 62.88% yield, 91% purity)을 합성하였다.
MS (M + H)+ = 676.3
단계 3: tert -부틸 (( S )-13-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-카보닐)-14,14-디메틸-11-옥소-3,6,9-트리옥사-12-아자펜타데실)카바메이트 (43c)의 합성
단계 1 과 유사한 방법으로 황색 고체의 표제 화합물(1.3 g, 1.48 mmol, 86.83% yield, 82% purity)을 합성하였다.
MS (M + H)+ = 720.3
단계 4: tert -부틸 (( S )-16-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-카보닐)-17,17-디메틸-14-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-15-아자옥타데실)카바메이트 (43d)의 합성
단계 1 과 유사한 방법으로 갈색 오일의 표제 화합물(0.45 g, 0.59 mmol, 36.14% yield)을 합성하였다.
MS (M + H)+ = 764.2
단계 5: (9 H -플루오렌-9-일)메틸 (( S )-19-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-카보닐)-20,20-디메틸-17-옥소-3,6,9,12,15-펜타옥사-18-아자헤니코실)카바메이트 (43e)의 합성
DMF (5 mL) 내 2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]아세트산 (1 g, 1.93 mmol)의 용액에 DIPEA (553.48 mg, 4.28 mmol, 745.92 uL) 및 HATU (895.57 mg, 2.36 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 15 ℃에서 20 분 동안 교반하고, DIPEA (553.48 mg, 4.28 mmol, 745.92 uL)가 포함된 DMF (5 mL) 내 (2S,4R)-1-((S)-2-아미노-3,3-디메틸부타노일)-4-히드록시-N-(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (1 g, 2.14 mmol, HCl salt) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 15 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모되었음과 원하는 질량이 검출되었음을 확인하였다. TLC (SiO2, 디클로로메탄 : 메탄올 = 20:1)로 출발 물질이 완전히 소모되었음과 세 개의 신규 스폿이 검출되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 H2O (20 mL)로 희석하고 EtOAc (20 mL×3)로 추출하였다. 유기층을 소금물(20 mL×3)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하였다. 잔여물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 디클로로메탄 : 메탄올 = 1/0 to 10/1)로 정제하여 적색 오일의 표제 화합물(552 mg, 593.48 umol, 27.72% yield)을 수득하였다.
MS(M+H)+=930.4
단계 6: (2 S ,4 R )-1-(( S )-2-(2-(2-아미노에톡시)아세트아미도)-3,3-디메틸부타노일)-4-히드록시- N -(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (44a)의 합성
Figure 112021036227546-pat00055
디옥산(4 mL) 내 tert-부틸 (2-(2-(((S)-1-((2S,4R)-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-일)-3,3-디메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에톡시)에틸)카바메이트 (816 mg, 1.29 mmol)의 혼합물에 HCl/디옥산(4 M, 16 mL)을 25 ℃ 에서 한 번에 첨가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모되었음과 95%의 원하는 질량이 검출되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하였다. 황색 고체의 표제 화합물(734 mg, crude, HCl salt)을 수득하여 다음 단계에 사용하였다.
MS(M+H)+=532.3
단계 7: (2 S ,4 R )-1-(( S )-2-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)아세트아미도)-3,3-디메틸부타노일)-4-히드록시- N -(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (44b)의 합성
단계 6과 유사한 방법으로 황색 오일의 표제 화합물(330 mg, 539.06 umol, 42.86% yield, 100% purity, HCl salt)을 합성하였다.
MS (M + H)+ = 576.3
단계 8: (2 S ,4 R )-1-(( S )-14-아미노-2-( tert -부틸)-4-옥소-6,9,12-트리옥사-3-아카테트라데카노일)-4-히드록시- N -(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (44c)의 합성
단계 6과 유사한 방법으로 황색 오일의 표제 화합물(660 mg, 975.57 umol, 54.02% yield, 97% purity, HCl salt)을 합성하였다.
MS (M + H)+ = 620.3
단계 9: (2 S ,4 R )-1-(( S )-17-아미노-2-( tert -부틸)-4-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자헵타데카노일)-4-히드록시- N -(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (44d)의 합성
단계 6과 유사한 방법으로 황색 오일의 표제 화합물(0.4 g, 0.57 mmol, 96.97% yield, HCl)을 합성였다. 조 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
MS (M + H)+ = 664.2
단계 10: (2 S ,4 R )-1-(( S )-20-아미노-2-( tert -부틸)-4-옥소-6,9,12,15,18-펜타옥사-3-아자이코사노일)-4-히드록시- N -(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (44e)의 합성
THF (5 mL) 내 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-19-((2S,4R)-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-카보닐)-20,20-디메틸-17-옥소-3,6,9,12,15-펜타옥사-18-아자헤니코실)카바메이트 (550 mg, 591.33 umol)의 용액에 THF (1 mL) 내 DBU (180.05 mg, 1.18 mmol, 178.26 uL)의 용액을 0 ℃에서 적가하였다. 혼합물을 15℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모되었음과 원하는 질량이 검출되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하였다. 이 잔여물에 HCl (1 M)을 첨가하고 EtOAc(10 mL×4)로 세척하고, EtOAc 층을 제거하였다. 수성상에 NaHCO3 (sat.aq)을 첨가하여 pH를 8로 조정하고 prep-HPLC (column: Waters Xbridge C18 150*50mm* 10um; mobile phase: [water (0.05% 암모니아 히드록시드 v/v) - ACN]; B%: 15% - 45%, 11.5min)로 정제하였다. 황색 오일의 표제 화합물(438 mg, 581.63 umol, 98.36% yield, 94% purity)을 수득하였다.
MS(M+H)+=708.4
단계 11: 8-((3-((2-(2-((( S )-1-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-일)-3,3-디메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에톡시)에틸)카바모일)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 8)의 합성
Figure 112021036227546-pat00056
DCM (4 mL) 내 3-((3-카바모일-1-메틸-4,5-디히드로-1H-피라졸로[4,3-h]퀴나졸린-8-일)아미노)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)벤조산 (204.84 mg, 387.24 umol, HCl salt)의 용액에 DIPEA (91.00 mg, 704.07 umol, 122.64 uL) 및 HATU (147.24 mg, 387.24 umol)를 첨가하였다. 혼합물을 15 ℃에서 20 분 동안 교반하고, DIPEA (91.00 mg, 704.07 umol, 122.64 uL)가 포함된 DCM (4 mL) 내 (2S,4R)-1-((S)-2-(2-(2-아미노에톡시)아세트아미도)-3,3-디메틸부타노일)-4-히드록시-N-(4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)피롤리딘-2-카복사미드 (200 mg, 352.03 umol, HCl salt) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 15 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 출발 물질이 완전히 소모되고, 61%의 원하는 질량이 검출되었음을 확인하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축하였다. 잔여물을 prep-HPLC (column: Phenomenex luna C18 150*40mm* 15um; mobile phase: [water (0.1%TFA) - ACN]; B%: 12% - 42%, 11 min)로 정제하였다. 백색 고체의 표제 화합물(118.8 mg, 103.93 umol, 29.52% yield, 98% purity, TFA salt)을 수득하고, 이를 SFC(retention time: 1.544, SFC analysis method: "Column: Chiralcel OJ-3 50 ×4.6mm I.D., 3um Mobile phase: Phase A for CO2, 및 Phase B for MeOH (0.05% DEA); Gradient elution: MeOH (0.05% DEA) in CO2 from 5% to 40%; Flow rate: 3mL/min; Detector: PDA; Column Temp: 35C; Back Pressure: 100Bar ")로 확인하였다.
MS(M+H)+=1006.7
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 9.75 (br s, 1H), 8.96 (s, 1H), 8.61 - 8.51 (m, 2H), 8.38 (s, 2H), 7.74 - 7.68 (m, 1H), 7.49 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.42 - 7.38 (m, 4H), 7.30 (br s, 1H), 7.00 - 6.95 (m, 1H), 4.56 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.46 - 4.39 (m, 2H), 4.38 - 4.33 (m, 2H), 4.25 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 4.21 (s, 3H), 4.02 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 3.76 - 3.72 (m, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.68 - 3.58 (m, 5H), 3.54 (br s, 2H), 3.19 - 3.12 (m, , 2H), 3.01 - 2.92 (m, 4H), 2.88 (br s, 3H), 2.84 - 2.79 (m, 2H), 2.44 d, J = 3.0 Hz, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.09 - 2.02 (m, 1H), 1.90 - 1.80 (m, 1H), 0.93 (s, 9H).
실시예 9. 8-((3-((2-(2-(2-((( S )-1-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-일)-3,3-디메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-2-옥소에톡시)에톡시)에틸)카바모일)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 9)의 합성
실시예 8과 유사한 방법으로 황색 고체의 표제 화합물(119.1 mg, 107.73 umol, 32.98% yield, 95% purity)을 합성하였다.
SFC (Retention time = 2.065 min, SFC analysis method: Column: Chiralcel OD-3 50×4.6mm I.D., 3um Mobile phase: Phase A for CO2, 및 Phase B for MeOH (0.05% DEA); Gradient elution: 40% MeOH (0.05% DEA) in CO2 Flow rate: 3mL/min; Detector: PDA column Temp: 35 ℃; Back Pressure: 100 Bar).
MS (M + H)+ = 1050.9
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) ┙ 8.66 (s, 1H), 8.45 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.02 - 7.97 (m, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.58 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.35 - 7.27 (m, 4H), 7.04 - 6.99 (m, 1H), 6.92 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 6.76 (s, 1H), 5.42 (s, 1H), 4.66 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.57 - 4.48 (m, 2H), 4.31 (s, 4H), 4.20 (dd, J = 15.1, 5.1 Hz, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.84 - 3.58 (m, 12H), 3.47 - 3.29 (m, 5H), 3.22 - 3.07 (m, 2H), 2.99 - 2.90 (m, 2H), 2.86 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 2.61 (s, 3H), 2.50 (s, 3H), 2.38 - 2.30 (m, 1H), 2.08 - 2.00 (m, 1H), 0.94 (s, 9H).
실시예 10. 8-((3-((( S )-13-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-카보닐)-14,14-디메틸-11-옥소-3,6,9-트리옥사-12-아자펜타데실)카바모일)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 10)의 합성
실시예 8과 유사한 방법으로 황색 고체의 표제 화합물(160 mg, 138.90 umol, 30.38% yield, 95% purity)을 합성하였다.
SFC (Retention time = 1.770 min, SFC analysis method: Column: Chiralcel OJ-3 50×4.6mm I.D., 3um Mobile phase: Phase A for CO2, 및 Phase B for MeOH (0.05% DEA); Gradient elution: MeOH (0.05% DEA) in CO2 from 5% to 40% Flow rate: 3mL/min; Detector: PDA. Column Temp: 35C; Back Pressure: 100Bar).
MS (M + H)+ = 1094.2
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) ┙ 8.66 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.12 - 8.03 (m, 2H), 7.62 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.35 (s, 4H), 7.19 - 7.16 (m, 1H), 6.77 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 4.65 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.61 - 4.50 (m, 3H), 4.38 - 4.32 (m, 1H), 4.30 (s, 3H), 4.03 - 3.92 (m, 2H), 3.90 - 3.83 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.70 - 3.63 (m, 8H), 3.63 - 3.56 (m, 7H), 3.40 - 3.34 (m, 4H), 3.14 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.94 - 2.81 (m, 6H), 2.56 (s, 3H), 2.50 (s, 3H), 2.48 - 2.40 (m, 1H), 2.16 - 2.09 (m, 1H), 0.95 (s, 9H).
실시예 11. 8-((3-((( S )-16-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-카보닐)-17,17-디메틸-14-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-15-아자옥타데실)카바모일)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 11)의 합성
실시예 8과 유사한 방법으로 백색 고체의 표제 화합물(83 mg, 72.18 umol, 12.21% yield, 99% purity)을 합성하였고, SFC(retention time = 2.160, analysis method: "Column: Chiralpak AD-3 50×4.6mm I.D., 3um; Mobile phase: Phase A for CO2, 및 Phase B for MeOH+ACN (0.05% DEA); Gradient elution: 50% MeOH +CAN (0.05% DEA) in CO2; Flow rate: 3mL/min; Detector: PDA; Column Temp: 35C;Back Pressure: 100Bar ")로 확인하였다.
M(M+H)+=1138.5
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 8.68 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.11 - 8.05 (m, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.43 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.39 - 7.33 (m, 4H), 7.26 - 7.22 (m, 2H), 6.78 (br s, 1H), 5.42 (br s, 1H), 4.73 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.61 - 4.49 (m, 3H), 4.37 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 4.33 (s, 3H), 4.09 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 4.04 - 3.91 (m, 2H), 3.80 - 3.79 (m, 3H), 3.68 (d, J = 2.0 Hz, 5H), 3.65 - 3.59 (m, 13H), 3.30 - 3.22 (m, 4H), 3.19 - 3.14 (m, 2H), 2.88 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.63 (br s, 4H), 2.56 (dd, J = 4.8, 8.2 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 2.14 (dd, J = 8.2, 13.4 Hz, 1H), 0.95 (s, 9H).
실시예 12. 8-((3-((( S )-19-((2 S ,4 R )-4-히드록시-2-((4-(4-메틸티아졸-5-일)벤질)카바모일)피롤리딘-1-카보닐)-20,20-디메틸-17-옥소-3,6,9,12,15-펜타옥사-18-아자헤니코실)카바모일)-2-메톡시-5-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아미노)-1-메틸-4,5-디히드로-1 H -피라졸로[4,3- h ]퀴나졸린-3-카복사미드 (화합물 12)의 합성
실시예 8과 유사한 방법으로 백색 고체의 표제 화합물(147.2 mg, 115.78 umol, 27.84% yield, 93% purity)을 합성하였고, SFC (retention time: 2.230, SFC analysis method: "Column: Chiralpak AS-3 50×4.6mm I.D., 3um; Mobile phase: Phase A for CO2, 및 Phase B for MeOH (0.05% DEA); Gradient elution: MeOH (0.05% DEA) in CO2 from 5% to 40%; Flow rate: 3mL/min; Detector: PDA; Column Temp: 35C;Back Pressure: 100Bar ")로 확인하였다.
MS(M+H)+=1182.8
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 8.67 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.11 - 8.05 (m, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.42 (br s, 1H), 7.38 - 7.33 (m, 4H), 7.27 - 7.22 (m, 2H), 6.79 (br s, 1H), 5.50 (br s, 1H), 4.73 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.60 - 4.50 (m, 3H), 4.38 - 4.34 (m, 1H), 4.33 (s, 3H), 4.10 - 4.04 (m, 1H), 4.01 - 3.90 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.68 (s, 4H), 3.66 - 3.59 (m, 18H), 3.27 - 3.22 (m, 4H), 3.18 - 3.13 (m, 2H), 2.90 - 2.85 (m, 2H), 2.64 - 2.55 (m, 4H), 2.55 - 2.48 (m, 4H), 2.37 (s, 3H), 2.14 (dd, J = 8.0, 13.5 Hz, 1H), 0.95 (s, 9H).
비교예 1. CN 106543185 A에 기재된 예시 화합물
Figure 112021036227546-pat00057
비교예 2. CN 106543185 A에 기재된 예시 화합물
Figure 112021036227546-pat00058
<실험예>
1. HeLa 세포주의 배양
HeLa 세포주를 한국세포주은행에서 구입하였다. 배양 세포의 계대(Passage)를 P115 내지 P125로 유지하였다.
세포 계수를 위해, Thermo사의 세포 계수기(cULM counter)(Catalog # AMQAX1000) 및 0.4% 트립판 블루(Trypan blue) 용액을 사용하였다.
세포 배양을 위해, DMEM(Gibco, Cat. No. 1195-65; Lot. No. 2085318), FBS(Gibco, Cat. No. 16000-044; Lot. No. 2097593), 페니실린/스트렙토마이신(PS)(Gibco, Cat. No. 15140-122; Lot. No. 2058855), 100　㎟　세포배양 디쉬(SPL, Cat. No. 20100), 150　㎟　세포배양 디쉬(SPL, Cat. No. 20150), 12 웰 배양 플레이트(SPL, Cat. No. 30012), PBS pH7.4(Gibco, Cat. No. 10010-023; Lot. No. 2085080), TrypLETM　Express(Gibco, Cat. No. 12605-010; Lot. No. 2070638), 카운팅 챔버(Hematocytometer)(Hirschmann, Cat. No. 8100204), 및 0.4% 트립판 블루 용액(DYNEBIO, Cat. No. CBT3710; Lot. No. 20190723)를 사용하였다.
2. 본 발명의 화합물 처리
12 웰 플레이트(SPL사)의 각 웰마다 2Х105개의 세포를 시딩하였고, 배양 배지 부피를 총 2mL로 하여 세포를 배양하였다.
실시예 화합물은 DMSO에 완전 용해시켜 실험에 사용하였고, 티미딘(thymidine)은 DW에 완전 용해시켜 실험에 사용하였다. 티미딘 블록을 위해, 티미딘(Sigma-Aldrich Cat. No. T9250-5G) 2mM 처리 후 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
방출(release) 및 화학적 처리를 위해, 배지를 석션한 후 1× PBS로 3 회 세척하였다. 완전 배지(complete media)를 넣고 CO2 인큐베이터에서 4 시간 인큐베이션하였다. 각각의 화합물을 100nM 농도에 따라 처리한 후 다시 6 시간 인큐베이션하였다.
3. 웨스턴 블롯팅
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 위해, 1X RIPA 용해 버퍼(Rockland, Cat. No. MB-030-0050; Lot no. 39751), 100X 프로테아제 억제제 칵테일(Quartett, Cat. No. PPI1015; Lot no. PCO50038424), Pierce™ BCA protein assay kit(ThermoScientific, Cat. No. 23225; Lot no. UC276876), 알부민 standard(ThermoScientific, Cat. No. 23209; Lot no. UB269561), 4-15 % Mini-PROTEAN TGX stain-free gel(Bio-rad, Cat. No. 4568085; Lot no. L007041B), 10X Tris/Glycine/SDS buffer(Bio-rad, Cat. No. 1610732; Lot no. 10000044375B); 10X TBS(Bio-rad, Cat. No. 1706435; Lot no. 1000045140B), 10% Tween 20 용액(Cat. No. 1610781; Lot no. L004152B), Color protein standard broad range(NEB, Cat. No. P7719S; Lot no. 10040349), 4X　Laemmli　sample buffer(Bio-rad, Cat. No. 1610747; Lot no. L004133B), β-머캡토에탄올(Sigma-Aldrich, Cat. No. M3148; Lot no. 60-24-2), SuperBlock™ T20 (TBS) blocking buffer(ThermoScientific, Cat. No. 37536; Lot no. UC282578), 1M 소듐 아자이드 용액(Sigma-Aldrich, Cat. No. 08591-1mL-F; Lot no. BCBV4989), α-Rabbit pAb to Ms IgG(abcam, Cat. No. ab97046; Lot no. GR3252115-1), α-Goat pAb to Rb IgG(CST, Cat. No. 7074S; Lot no. 28), α-GAPDH(abcam, Cat. No. ab8245; Lot no. GR3275542-2), αPlk1(CST, Cat. No. 208G4), α-BRD4(CST, Cat. No. 13440S), ECL™ Prime western blotting reagents(GE Healthcare, Cat. No. RPN2232; Lot no. 17001655), Ponceau S 용액(Sigma-Aldrich, Cat. No. P7170; Lot no. SLBV4112), Difco™ Skim milk(BD, Cat. No. 232100; Lot no. 8346795), iBlot®　2 NC Regular stacks(Invitrogen, Cat. No. IB23001; Lot no. 2NR110619-02)을 사용하였다.
세포 수확을 위해, 트립신을 사용하여 세포를 플레이트에서 분리한 뒤 배지 및 PBS로 세척하였다. 구체적으로, 배지를 석션한 뒤 1mL PBS로 세척하고, PBS를 석션하였다. 0.5 mL TrypLE™ Express를 37　℃,　7 min 처리하여 세포를 분리시킨 다음, 0.5 mL 완전 배지를 첨가하여 1 mL의 세포 배양액을 수집하였다. 그 다음, 1 mL의 세포 수집액을 8,000 rpm에서 120 초 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 0.2 mL의 PBS로 세척한 후, PBS를 제거하였다.
세포 용해(lysis)를 위해, 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하고 세포 파쇄물(debris)을 제거하여 세포 용해물(lysate)을 얻었다. 구체적으로, 세포에 프로테아제 억제제가 함유된 70 μL의 1X RIPA 버퍼를 처리하고 얼음 위에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 4 ℃ 15,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 세포 용해물을 얻었다.
그 다음, BCA 어세이를 이용하여 표준 커브를 구하고 이를 대입하여 용해물 내 단백질 질량을 정량하였다. 혼합물에는 20 μL의 표준 또는 샘플 용액, 200 μL의 BCA 또는 브래드포드 용액을 사용하여 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였고, 562 nm 흡광도에서 측정하였다. 샘플은 각 웰당 15μg이 되도록 4X 샘플 버퍼를 넣어 준비하였다.
4-15 % Mini-PROTEAN TGX stain-free gel (15　wULM)에 120 V로 100 분의 러닝 타임을 설정하여 SDS-PAGE를 수행하였다. iBlot®　2 NC　Mini stacks에 Dry blotting system의 P0 mode를 사용하여 트랜스퍼하였다. Ponceau S 용액을 사용하여 염색한 뒤, 블로킹 버퍼(Thermo)로 1 시간 동안 블로킹하였다. 0.05% Tween20를 포함한 1X TBS로 세척한 후, 1차 항체로서 1X TBS-T 내 항-Plk1(CST) 항체(1:500), 항 BRD4 (CULM signaling) 항체 (1:1000) 또는 항-GAPDH(abcam) 항체(1:10,000)와 함께 4 ℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween20를 포함한 1X TBS로 10 분 동안 3회 세척한 후, 2차 항체로서 1X TBS-T 내 항-마우스 항체(abcam)(1:10,000) 또는 항-래빗 항체(CST)(1:5,000)와 함께 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그 다음, 0.05% Tween 20을 포함한 1X TBS로 10 분 동안 3회 세척한 후, ECL 워킹 용액(1:1)으로 검출하였다.
결과 분석을 위해, 이미지 애널라이저(GE)를 사용하여 최종 블롯 데이터를 얻었다. 각 샘플별 GAPDH 대비 PLK1의 비를 ImageQuant TL (ver.8.2.0) 프로그램을 이용하여 계산하였다. 계산된 각각의 값을 Graphpad Prism 9 프로그램의 각 셀에 입력하고 그래프를 자동으로 계산하여, 단백질 분해능에 해당하는 Dmax 값을 확인하였다.
4. 본 발명 화합물의 PLK1 분해능 확인
상술한 실험 결과, 본 발명의 실시예 화합물들에서 40% 이상의 PLK1 단백질 분해 활성(Dmax)를 확인하였고, 특히 화합물 2, 3, 7, 9의 Dmax는 60% 이상으로 우수한 PLK1 분해능을 나타냄을 확인하였다. 또한, 본 발명의 화합물은 중국 공개특허 제106543185 A호에 기재된 비교 화합물 1, 2와 비교하여, 그리고 아닐린기를 링커로 연결한 실시예 1 화합물과 비교하여 PLK1 분해능이 현저히 우수함을 확인하였다(도 1).
이상으로 본 발명을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 I]
    Figure 112021093534001-pat00059

    상기 화학식 I에서,
    ULM은 CRBN 또는 VHL E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티이고,
    CRBN E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티는 하기 하기 화학식 A로 표시되고:
    [화학식 A]
    Figure 112021093534001-pat00074

    {상기 화학식 A에서,
    X1은 -CH2-, -CH(C1-4알킬)-, -CO- 또는 -N=N-이고;
    X2은 수소 또는 C1-3알킬임}
    VHL E3 유비퀴틴 라이게이즈 결합 모이어티는 하기 하기 화학식 B로 표시되고:
    [화학식 B]
    Figure 112021093534001-pat00075

    {상기 화학식 B에서,
    Figure 112021093534001-pat00076
    는 5원 헤테로아릴 고리이고,
    Y1은 수소 또는 C1-3알킬임}
    PTM은 하기 화학식 II로 표시되는 PLK1 결합 모이어티이고,
    [화학식 II]
    Figure 112021093534001-pat00060

    {상기 화학식 II에서,
    R1은 수소, C1-4알킬 또는 -(C1-3알킬)-OH이고,
    R2는 -OC1-4알킬 또는 -OCF3이고,
    R3은 N 또는 CH이고,
    R4는 NH, N(C1-3알킬), CH2 또는 CH(C1-3알킬)임}
    상기 PTM 또는 ULM 내에 표시된
    Figure 112021093534001-pat00077
    는 Linker와 공유결합으로 연결됨을 나타내고,
    Linker는 ULM과 PTM을 화학적으로 연결하는 기이고,
    하기 화학식 L로 표시됨:
    [화학식 L]
    Figure 112021093534001-pat00078

    [상기 화학식 L에서,
    Figure 112021093534001-pat00079
    및
    Figure 112021093534001-pat00080
    는 결합이고,
    LULM는 이에 연결된
    Figure 112021093534001-pat00081
    를 통해 ULM 모이어티와 결합하고,
    LPTM은 이에 연결된
    Figure 112021093534001-pat00082
    를 통해 PTM 모이어티와 결합하고,
    LULM 및 LPTM은 각각 독립적으로 단일결합, -CH2-, -NH-, -O-, -CO-, -OCO-, -CONH- 또는 -NHCO-이고,
    LINT는 -CH2-, -CH2CH2-, -CHCH-, -CC-, -CH2CH2O-, -OCH2CH2-, -CH2CH2S-, -SCH2CH2-, -COO-, -CONH-, -NHCO- 및
    Figure 112021093534001-pat00083
    로 구성된 군에서 선택되고{여기서,
    Figure 112021093534001-pat00084
    은 3원 내지 10원 사이클로알킬, 4원 내지 10원 헤테로사이클로알킬, 6원 내지 10원 아릴 또는 5원 내지 10원 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택된 고리임},
    p는 1 내지 10의 정수임]
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 화학식 II는 하기 화학식 III-1 또는 화학식 III-2로 표시되는 화합물
    [화학식 III-1]
    Figure 112021036227546-pat00064

    [화학식 III-2]
    Figure 112021036227546-pat00065

    상기 화학식 III-1 및 III-2에서, R1, R2, R3 및 R4는 청구항 1에서 정의된 것과 같다.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 하기 표에 표시된 화합물 2 내지 12로 구성된 군에서 선택된 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112021093534001-pat00085

    Figure 112021093534001-pat00086

    Figure 112021093534001-pat00087
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, PLK1 단백질의 선택적 분해를 유도하는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
  9. 삭제
  10. 삭제
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