KR102306803B1 - 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 프라이머 세트 - Google Patents

제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 프라이머 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기 프라이머 세트는 제초제 내성 유전자인 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinothricin acetyltransferase; pat)나 bialaphos resistance (bar)를 특이적으로 검출하므로, 상기 pat/bar를 동시에 검출하는 프라이머 세트 또는 bar 유전자는 검출하지 못하면서, pat 유전자만을 검출하는 프라이머 세트를 이용하여 글루포시네이트에 대한 내성이 있는 식물을 판별할 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트를 이용하여 pat과 bar를 동시에 검출하거나 또는 pat만을 검출하여 제초제 내성 유전자 변형 식물을 구별할 수 있고 또한, 도입된 각각의 유전자의 종류를 구분할 수 있는 장점이 있다.

Description

제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 프라이머 세트{Primer set for discriminating genetically modified plants with herbicide tolerance}
본 발명은 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
2018년 기준으로, 우리나라 농촌진흥청에 등록된 제초제만 해도 778 종이 있을 정도로 많은 제초제가 시판 중이다. 제초제는 화학적 이름, 화학적 특성, 독성유무, 살포방식, 또는 작용기작 등에 따라 다양하게 분류할 수 있으며, 크게는 대상식물의 선택성 유무에 따라 선택적 제초제와 비선택적 제초제로 분류할 수 있다. 선택적 제초제는 잡초의 종류에 따라 선택적으로 작용하며, 비선택적 제초제는 모든 식물을 죽인다. 제초제는 직접적인 접촉 유무와 효과 부위에 따라 접촉성 제초제와 이행성(침투성) 제초제로 구분되기도 한다. 접촉성 제초제는 접촉부위를 죽이는 제초제이며 이행성 제초제는 식물체 내로 흡수되어 잎, 줄기, 뿌리까지 이행됨으로써 식물의 대사와 성장을 저해한다. 흡수 위치에 따라 경엽 제초제와 토양 제초제로 구분하기도 하는데, 경엽 제초제는 발아하여 이미 생육하고 있는 잡초의 지상부(잎과 줄기)를 죽이며, 토양 제초제는 토양에 살포하여 뿌리를 죽이거나 발아를 억제한다. 토양 제초제 중에는 발아억제 제초제가 포함된다. 최근 유기농 또는 유기농법이라는 용어가 등장하면서 유기제초제라는 용어도 같이 사용되는데, 식물 등에서 만들어지는 자연 생산물의 제초성분을 응용한 것으로 이전의 합성 제초제와 구분된다.
상기 제초제들을 사용하면서 재배 대상 작물의 생장에는 영향을 미치지 않을 필요가 있으며, 이를 위해서는 재배 대상 작물에 상기 제초제들에 대한 내성을 부여할 필요성이 대두되어 왔다. 이에 따라, 현재까지 제초제 저항성을 가지는 유전자 변형 작물이 개발되었으며, 500여종의 다양한 유전자 변형(GM) 작물 중에서 제초제 글루포시네이트(glufosinate) 내성 GM(genetically modified) 작물은 약 44%로 알려져 있다.
상기 글루포시네이트(glufosinate)의 주성분은 포스피노트리신(phosphinotricin)으로, 식물의 생장에 필수적인 역할을 하는 글루타민을 합성하는데 필요한 글루타민 합성효소를 저해하여, 식물체 내에 암모니아를 고농도로 축적함으로써 잡초와 작물을 구분하지 않고 모두 고사시킨다. 하지만 글루포시네이트(glufosinate)의 주성분인 포스피노트리신(phosphinotricin)에 대한 내성 단백질을 보유하게 되면, 상기 글루포시네이트에 대해 내성을 가지고 생존이 가능하게 된다.
이러한, 포스피노트리신(phosphinotricin)의 내성 단백질은 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinotricin acetyltransferase, PAT)로 포스피노트리신(phosphinotricin)을 아세틸화시켜 그 기능을 불활성화 시킴으로써 제초제에 내성을 가지게 된다.
따라서, 상기 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinotricin acetyltransferase, PAT)를 코딩하는 유전자를 유전자 변형 식물에 도입해 제초제 저항성을 가지는 식물을 제조해 왔다. 하지만 어떠한 식물이 포스피노트리신에 내성을 가지는 지를 일일이 확인하기가 곤란하다. 또한, 도입된 식물의 수도 수백 여 종으로 간편한 방법으로 포스피노트리신에 저항성을 가지는 유전자 변형 식물을 효과적으로 판별하는 방법의 개발이 필요하다.
대한민국공개특허 특1997-0021314
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 제1 프라이머 쌍 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머 쌍을 포함하는 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 조성물을 포함하는 제조제 내성 유전자 변형 식물 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 제초제 내성 유전자 변형 식물의 판별방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는 글루포시네이트 내성 유전자 변형 식물 검출을 위하여, 글루포시네이트에 내성을 가지는 유전자 pat, bar 중에서 어떠한 유전자가 도입되었는 지를 확인하고자 하였으며, 그 결과, 약 44%에 달하는 pat/bar 도입된 GM 계통에 공통적으로 사용하여 GMO(Genetically Modified Organism) 검출에 드는 비용과 시간을 절약할 수 있는 pat/bar를 선택적 또는 공통(동시)으로 검출이 가능한 프라이머 세트를 개발하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 제1 프라이머 쌍 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머 쌍을 포함하는 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 용어 "제초제"는 잡초를 제거하는 데 사용되는 화학약제로 적용범위에 따라 비선택성 제초제와 선택성 제초제가 있다. 상기 비선택적 제조체는 식물의 종류에 관계없이 살초 작용을 나타내는 것으로 일예로, 글루포시네이트(glufosinate)가 있다. 선택적 제초제는 식물의 종류에 따라서 살초 작용을 달리하는 것으로 2,4-D(2, 4-디클로로페녹시아세트산)이 활엽 식물에 대해 선택적인 살초 효과를 나타낸다.
본 발명의 용어 "제초제 내성 유전자 변형식물"은 제초제 내성을 가진 유전자를 도입하여 제조된 유전자 변형 식물을 의미한다. 용어 "유전자 변형 식물"은 일반적으로 생산량 증대 또는 유통·가공상의 편의를 위하여 유전공학기술을 이용, 기존의 육종방법으로는 나타날 수 없는 형질이나 유전자를 지니도록 개발된 식물을 말한다.
상기 유전자 변형 식물은 글루포시네이트의 주성분인 포스피노트리신(phosphinotricin)에 저항성이 있는 식물로서, 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinotricin acetyltransferase, PAT)를 코딩하는 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinothricin acetyltransferase; pat) 유전자나 bialaphos resistance (bar) 유전자가 도입되어 있다.
상기 제초제로 알려진 글루포시네이트(glufosinate)의 주성분은 포스피노트리신(phosphinotricin)으로, 식물의 생장에 필수적인 역할을 하는 글루타민을 합성하는데 필요한 글루타민 합성효소를 저해하여, 식물체 내에 암모니아를 고농도로 축적함으로써 잡초와 작물을 구분하지 않고 모두 고사시킨다. 하지만 제초제 글루포시네이트(glufosinate)에 내성을 가지는 내성 단백질인 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinotricin acetyltransferase, PAT)는 포스피노트리신(phosphinotricin)을 아세틸화시켜 그 기능을 불활성화 시킴으로써 제초제에 내성을 가질 수 있게 한다.
따라서, 상기 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinotricin acetyltransferase, PAT)를 코딩하는 유전자가 도입된 유전자 변형((GM, Genetically Modified) 식물은 포스피노트리신(phosphinotricin)을 아세틸화시켜 그 기능을 불활성화 시킴으로써 제초제에 내성을 가지게 된다.
상기 포스피노트리신 아세틸전달효소(Phosphinothricin acetyltransferase; PAT)를 코딩하는 유전자는 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinothricin acetyltransferase; pat)나 bialaphos resistance (bar) 유전자로 이러한 유전자가 도입된 식물은 포스피노트리신(phosphinotricin)이 아세틸화에 의해 불활성화 되므로 제초제에 의해 내성이 생기게 된다.
상기 PAT 단백질은 Streptomyces viridochromogenes 세균이 보유한 phosphinotricin acetyltransferase(pat) 유전자 또는 bialaphos resistance(bar) 유전자로부터 합성된다. 두 유전자는 DNA 염기서열에 있어 87%, 아미노산 서열에 있어 85%의 유사성을 나타내며, 구조 및 기능적으로 거의 유사한 활성을 나타낸다(Herouet 등, 2005; Wehrmann 등, 1996).
본 발명에서, 상기 제초제는 글루포시네이트(glufosinate)일 수 있으며, 상기 제초제 내성 유전자는 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinothricin acetyltransferase; pat)나 bialaphos resistance (bar) 유전자일 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머 세트(a pair of primers)"란 판별 대상 유전자를 PCR을 이용하여 증폭시키기 위한 염기서열들로, 하나의 검출(진단)대상 유전자에 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 세트를 이루어 반응하여 PCR 산물을 합성한다. 이때, 상기 정방향과 역방향 프라이머 세트가 결정되면 이로부터 합성되는 PCR 생성물의 크기를 예측할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 제1 프라이머 쌍 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머 쌍을 포함하며, 상기 제1 프라이머 쌍은 pat 유전자를 특이적으로 검출하며, 상기 제2 프라이머 쌍은 pat 유전자와 bar 유전자를 동시에 검출할 수 있다.
상기 제1 프라이머 쌍에 의해 검출되는 pat 유전자 서열은 서열번호 5로 222bp이다.
상기 제2 프라이머 쌍에 의해 검출되는 pat과 bar 유전자는 179bp로 각각 서열번호 6과 서열번호 7을 가진다.
따라서, 상기 프라이머 세트는 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinotricin acetyltransferase, PAT)을 코딩하는 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinothricin acetyltransferase; pat) 유전자의 핵산 단편 단독 또는 pat 유전자와 bar 유전자의 핵산 단편을 동시에 증폭시키는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 식물은 대두, 옥수수, 면, 카놀라 및 벼로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, pat 또는 bar 유전자가 도입된 식물은 제한없이 상기 프라이머 세트에 의해 검출할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 제1 프라이머 쌍 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머 쌍을 포함한다.
본 발명의 용어, "제1 프라이머 쌍", "제2 프라이머 쌍", "프라이머 세트", "제초제 내성 유전자 변형 식물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 용어, "조성물", "제초제 내성 유전자 변형 식물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 판별용 키트는 PCR 분석 또는 multiplex-PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 키트는, 상기 각 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 유전자에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 제초제 내성 유전자 변형 식물의 판별방법을 제공한다.
본 발명의 판별방법은 식물 시료에서 게놈(genomic) DNA를 분리하고 이를 주형으로 상기 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 프라이머 세트 를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 제초제 내성 유전자 변형 식물의 pat 유전자 또는 pat 유전자와 bar 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 구체적으로, 중합효소연쇄반응일 수 있으며, 멀티플렉스(multiplex) PCR을 통해 수행될 수 있으며, 또한, 형광 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR을 수행할 수 있다. 멀티플렉스 PCR을 수행하면 PCR 시간 및 반응을 단축할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 프라이머 세트를 이용한 증폭 단계로부터 증폭 산물 구체적으로, 제초제 내성 유전자 변형 식물의 pat 유전자 또는 pat 유전자와 bar 유전자의 표적 서열을 검출할 수 있다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명은 제초제 내성 유전자 변형 식물 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기 프라이머 세트는 제초제 내성 유전자인 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinothricin acetyltransferase; pat)나 bialaphos resistance (bar)를 특이적으로 검출하므로, 상기 pat/bar를 동시에 검출하는 프라이머 세트 또는 bar 유전자는 검출하지 못하면서, pat 유전자만을 검출하는 프라이머 세트를 이용하여 글루포시네이트에 대한 내성이 있는 식물을 판별할 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트를 이용하여 pat과 bar를 동시에 검출하거나 또는 pat만을 검출하여 제초제 내성 유전자 변형 식물을 구별할 수 있고 또한, 도입된 각각의 유전자의 종류를 구분할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 clustal omega를 사용하여 콩, 옥수수, 면화, 카놀라 및 벼를 포함한 몇 가지 작물의 pat/bar 유전자 서열에 기반한 다중 정렬을 나타낸다.
도 2는 pat 유전자 프로브용으로 설계된 프라이머의 특이성을 나타낸다. (a) 유전자 특이적 프라이머는 pat 유전자의 보존된 영역에서 설계되었다. (b) pat-F1/pat-R1, (c) pat-F1/pat-R2, (d) pat-F2/pat-R1 및 (e) pat-F2/pat-R2 프라이머 쌍을 테스트했다. PCR 산물을 2.5 % 아가로스 겔에서 전기 영동시켰다.
Lane 1: non-GM soybean, 2: DAS44406-4, 3: A5547-127, 4: PAC, 5: non-GM maize, 6: Bt-11, 7: TC1507, 8: Bt-176, 9: non-GM cotton, 10: 281-24-236X3006-210-23, 11: T304-40, 12: non-GM canola, 13: T45, 14: MS8, 15: non-GM rice, 16: BT.
도 3은 pat/bar 유전자용으로 설계된 프라이머의 특이성을 나타낸다. (a) 유전자 특이적 프라이머는 두 유전자의 보존된 영역에서 설계되었다. (b) pat/bar-F1/pat/bar-R1, (c) pat/bar-F1/pat/bar-R2, (d) pat/bar-F2/pat/bar-R1 및 (e) pat/bar-F2/pat/bar-R2 프라이머 쌍을 테스트했다. PCR 산물을 2.5 % 아가로스겔에서 전기 영동시켰다.
Lane 1: non-GM soybean, 2: DAS44406-4, 3: A5547-127, 4: PAC, 5: non-GM maize, 6: Bt-11, 7: TC1507, 8: Bt-176, 9: non-GM cotton, 10: 281-24-236X3006-210-23, 11: T304-40, 12: non-GM canola, 13: T45, 14: MS8, 15: non-GM rice, 16: BT.
도 4는 선택된 프라이머의 감도를 나타낸다. 0.1 내지 10 %의 상이한 GM 함량의 콩 (DAS44406-4), 면화 (281-24-236X 3006-210-23) 및 벼 (BT)을 PCR 반응에 사용하였다. (a) pat 유전자에 대한 pat-F1/pat-R1 프라이머 쌍, (b) pat/bar 유전자에 대한 pat/bar-F2/pat/bar-R1 프라이머 쌍을 테스트 하였다. PCR 산물을 2.5 % 아가로스겔에서 전기 영동시켰다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실시예 1> 제초제 내성 작물의 선발 및 내성 유전자( pat , bar )의 다중 배열
제초제 내성 유전자의 분자마커 개발을 위하여 기존의 여러 database (NCBI 등)와 참고문헌 정보 그리고 자체 개발된 GM 작물에서 분석한 pat 및 bar 유전자 단편의 염기서열을 다중 배열하였다. 특히, 다국적 회사에서 개발된 상업화 승인된 GM 작물 계통은 개발 회사와 작물 종을 고려하여 pat 또는 bar 유전자의 염기서열이 중복되지 않도록 선발하였다(표 1). 위와 같은 기준으로 대표성을 띄고 표준물질로 통용되는 11개의 GM 콩(Glycine max), 옥수수(Zea mays), 면화(Gossypium hirsutum), 카놀라(Brassica napus) 그리고 벼(Oryza sativa)를 대상으로 이들의 유전자 pat/bar 유전자의 염기서열을 다중 배열하였다(도 1).
Pat 및 bar 유전자 염기서열 분석에 이용된 작목, 계통 및 표준물질(CRM)
Crops Events Gene Developer CRM number
1 Soybean - Non Monsato 0906A
2 Soybean DAS44406-4 pat Dow AgroScience ERM-BF436b,
ERM-BF436E
3 Soybean A5547-127 pat Bayer CropScience 0707-C7
4 Soybean PAC bar - -
5 Maize - Non Monsato 0406A
6 Maize Bt-11 pat Syngenta ERM-BF412ek
7 Maize TC1507 pat Dupon ERM-BF418d
8 Maize Bt-176 bar Syngenta ERM-BF411f
9 Cotton - Non Monsato 0804A
10 Cotton 281-24-236 X 3006-210-23 pat Dow AgroScience ERM-BF422b,
ERM-BF422d
11 Cotton T304-40, bar Bayer CropScience ERM-BF429c
12 Canola - Non Monsato 0304-A2
13 Canola T45 pat Bayer CropScience 0208-A6
14 Canola Ms8 bar Bayer CropScience 0306-F7
15 Rice 낙동 Non - -
16 Rice BT bar 자체 개발 -
<실시예 2> 제초제 내성 pat 유전자 검출 마커 개발
제초제 내성 유전자 pat을 검출할 수 있는 마커를 개발하기 위하여 상기 도 1과 같이 다중배열된 염기서열 중에서 도 2(a)에 박스로 표시된 바와 같이 pat 유전자 검출을 위한 마커로 다양한 조합의 프라이머를 표 2와 같이 제작하였다(표 2).
도입유전자 pat 검출 마커 개발을 위한 PCR 마커 염기서열
Gene Primer name Sequence (5’- 3’)
pat pat-F1 5’-ATT GAT GAT CTA GAG AGG TTG CA-3’(서열번호 1)
pat-F2 5’-GTT GCT GAG GTT GAG GGT GT-3’
pat pat-R1 5’-CTT AAA ACC TTG CGC CTC CAT-3’(서열번호 2)
pat-R2 5’-ATC CAC CAT GCT TGT ATC CAG CT-3’
상기 프라이머를 이용하여 표 1에 나타낸 GM 작물 표준물질을 대상으로 PCR을 수행하고 증폭되는 PCR 산물을 2.5% agarose gel 전기영동으로 분석하였다(도 2).
PCR 분석 결과 다른 프라이머 조합과 달리, 프라이머 조합이 pat-F1과 pat-R1인 경우에 pat 유전자 특이적이고 선명한 검출(PCR band, 222bp)을 나타내어 pat-F1과 pat-R1 조합을 이용하여 pat 유전자 특이적(bar 유전자는 불검출 됨)이면서 여타의 작목에 공통적으로 사용할 수 있음을 증명하였다(도 2(b)).
<실시예 3> 제초제 내성 pat 및 bar 유전자 검출 마커 개발
제초제 내성 유전자 pat 및 bar 유전자를 동시에 검출할 수 있는 마커를 개발하기 위하여 상기 도 1과 같이 다중배열된 염기서열 중에서 도 5(a)에 박스로 표시된 바와 같이 PCR 마커를 제작하였다(표 3). 표 3의 마커를 이용하여 위 표 1에 나타낸 GM 작물 표준물질을 대상으로 PCR을 수행하고 증폭되는 PCR 산물을 2.5% agarose gel 전기영동으로 분석하였다.
PCR 분석 결과 다른 프라이머 조합과 달리, 프라이머 조합이 pat/bar-F2과 pat/bar-R1인 경우에 pat/bar 유전자 특이적이고 선명한 검출(PCR band, 179bp)를 나타내어 pat/bar-F2과 pat/bar-R1인 조합의 프라이머 쌍을 사용하는 경우, pat/bar 유전자 특이적이면서 여타의 GM 작물에 공통적으로 사용할 수 있음을 증명하였다(도 3(d)).
도입유전자 pat/bar 검출 마커 개발을 위한 PCR 마커 염기서열
Gene Primer name Sequence (5’- 3’)
pat/bar pat/bar-F1 5’-TAC GCB GGV CCY TGG AAG GC-3’
pat/bar-F2 5’-ATY GCY TAC GCK GGS CCC TGG AA-3’(서열번호 3)
pat/bar pat/bar-R1 5’-TTK GGM AGS CCK ATR ACA GCR ACC AC-3’(서열번호 4)
pat/bar-R2 5’-RTC ATG CCA KYY MCC RTG CTT G-3’
<실시예 4> 제초제 내성 pat 및 bar 유전자 검출 마커의 PCR 분석시의 검출 한계
본 발명에서 선택된 제초제 내성 유전자 특이적 프라이머가 0.9~5%의 GM 혼입 허용치를 검정하기에 충분한지 검증하고자, GM 콩(DAS 44406-4), 면화(281X3006) 그리고 벼(BT)의 혼입 비율을 0.1~10%로 조정하고 이들 시료의 유전자를 대상으로 PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 4(a)에 나타난 바와 같이, pat-F1/pat-R1 프라이머쌍을 이용한 pat 유전자 특이적 마커는 0.1% 수준의 콩과 벼의 혼입도를 검출할 수 있었다. 또한, 도 4(b)에 나타난 바와 같이, pat/bar-F2/pat/bar-R1 프라이머쌍을 이용한 선택된 제초제 내성 pat/bar 유전자 마커의 경우, 0.3%의 GM 면화, 0.1%의 GM 콩과 벼를 검출하였다.
즉, GM 작물 혼입도가 낮은 경우에도 본 발명의 pat-F1/pat-R1 프라이머쌍을 이용하여 pat 유전자가 도입된 유전자 변형 식물을 검출할 수 있었으며, 본 발명의 pat/bar-F2/pat/bar-R1 프라이머쌍을 이용하여 pat/bar 유전자가 도입된 유전자 변형 식물을 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.
따라서 본 발명에서 개발된 제초제 내성 유전자 특이적 유전자 변형 작물(GMO, Genetically Modified Organism)의 검출 방법이 향후 유전자 변형(GM) 작물의 실용화 및 식품안전 관리 방법에 충분히 적용될 수 있을 것이라 생각된다.
<110> Republic of Korea <120> Primer set for discriminating genetically modified plants with herbicide tolerance <130> DP20190304 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pat-F1 <400> 1 attgatgatc tagagaggtt gca 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pat-R1 <400> 2 cttaaaacct tgcgcctcca t 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pat/bar-F2 <400> 3 atygcytacg ckggsccctg gaa 23 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pat/bar-R1 <400> 4 ttkggmagsc ckatracagc raccac 26 <210> 5 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pat <400> 5 attgatgatc tagagaggtt gcaagataga tacccttggt tggttgctga ggttgagggt 60 gttgtggctg gtattgctta cgctgggccc tggaaggcta ggaacgctta cgattggaca 120 gttgagagta ctgtttacgt gtcacatagg catcaaaggt tgggcctagg atccacattg 180 tacacacatt tgcttaagtc tatggaggcg caaggtttta ag 222 <210> 6 <211> 179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pat <400> 6 attgcttacg ctgggccctg gaaggctagg aacgcttacg attggacagt tgagagtact 60 gtttacgtgt cacataggca tcaaaggttg ggcctaggat ccacattgta cacacatttg 120 cttaagtcta tggaggcgca aggttttaag tctgtggttg ctgttatagg ccttccaaa 179 <210> 7 <211> 179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bar <400> 7 atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc 60 gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg ggactgggct ccacgctcta cacccacctg 120 ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaa 179

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고, 서열번호 5로 표시되는 pat 유전자 검출용 제1 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고, 서열번호 6으로 표시되는 pat 유전자 및 서열번호 7로 표시되는 bar 유전자 동시 검출용 제2 프라이머 쌍;을 포함하는 글루포시네이트(glufosinate) 내성 유전자 변형 식물 판별용 프라이머 세트 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항의 조성물을 포함하는 글루포시네이트(glufosinate) 내성 유전자 변형 식물 판별용 키트.
  7. 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 글루포시네이트(glufosinate) 내성 유전자 변형 식물의 판별방법.
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