KR102267339B1

KR102267339B1 - 삼광벼 유래 키다리병 저항성 선발 마커

Info

Publication number: KR102267339B1
Application number: KR1020190085266A
Authority: KR
Inventors: 지현소; 김경환; 최인찬; 백정호; 천경성; 김송림; 강도유; 오준; 오효자
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-07-15
Filing date: 2019-07-15
Publication date: 2021-06-22
Also published as: KR20210008984A

Abstract

본 발명의 삼광벼 유래 DNA 마커를 포함하는 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 삼광벼 유래 DNA 마커를 포함하는 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 이용하여 효율적으로 키다리병 저항성 및 감수성 개체를 구분할 수 있으며, 본 발명의 마커를 이용하여 키다리병 저항성을 개선한 벼 육종에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 키다리병에 대한 피해 절감 및 농약 사용량을 감소시킬 수 있다.

Description

삼광벼 유래 키다리병 저항성 선발 마커{DNA markers for selection of rice plants having resistance to rice bakanae disease derived from Samgwangbyeo}

본 발명은 삼광벼 유래 DNA 마커를 포함하는 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물 및 이를 이용한 키다리병 저항성 벼 품종 선별방법에 관한 것이다.

벼 키다리병은 곰팡이 병원균인 푸사리움균(Fusarium fujikuroi)에 의해 발생하는 대표적인 종자전염성 병으로, 개화기에 곰팡이 포자가 벼꽃에 감염되어 종자전염을 한다. 감염종자에서 발아한 식물체는 도장하고 이앙 후 고사하며, 묘가 비정상적으로 신장하는 병징 때문에 Bakanae disease라 불리고 있다. 일본에서 1898년 처음 보고되었으며, 우리나라에서는 1960년대 일부 농가에 심하게 발생하여 문제가 되었고, 발병필지율이 2007년 42%, 2009년 51%, 2011년 11.4%으로 감소하였으나, 2013년 31%, 2015년 23.9%, 2017년 14.6%, 2018년 15.2%로 증가하는 경향을 보였다. 이러한 키다리병 발병의 증가는 벼 종자 내부의 심한 감염과 약제에 대한 저항성 균의 출현 및 기온 상승으로 인한 고온성 종자 전염병의 증가에 기인한다.

벼 키다리병의 예방으로 위해 적당한 온도의 온수탕을 만들어 파종종자를 일정시간동안 침지시킴으로써 병원균 포자나 유해 미생물을 살균·예방하는 방법인 온탕침법(溫湯浸法)을 수행하거나, 헥사코나졸(hexaconazole), 테부코나졸(tebuconazole)과 같은 종자소독제들이 이용하고 있으나, 상기 온탕침법은 대량의 종자를 균일한 온도로 처리하기가 어렵다는 한계점이 있고, 상기 종자소독제의 사용과 같은 화학적 처리는 약제 저항성 균의 출현이 우려되는 문제점이 있다.

벼 키다리병의 예방 또는 방제를 위한 농약살포에 막대한 농약과 노동력이 소모되고 있고, 이에 따라 생산비 절감과 친환경 농산물의 생산에 큰 걸림돌이 되고 있다. 따라서 키다리병의 근본적의 해결을 위해서는 키다리병 저항성 품종의 발굴이 필요하다.

새로운 품종을 개발하여 생산하기 위해서는 일반적으로 8~12년 이상의 장기간이 소요되며, 계통 전개 및 선발을 위한 넓은 재배면적이 필요하다. 우리나라에서 재배되고 있는 벼 품종들은 대부분 벼 키다리병에 약하여 저항성 품종에 대한 개발 요구가 매우 높다. 따라서, 벼 유전자원 및 교배집단 대상 저항성 자원 및 계통의 선발 등에 소요되는 시간과 비용 절감을 위해 정밀하면서도 객관성이 있는 검정결과를 얻을 수 있는 가장 효율적인 검정방법인 분자표지 방법이 매우 필요한 실정이다. 분자표지 방법은 분자 육종시스템에서 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등의 목적으로 널리 이용되고 있다. 분자 표지를 이용한 벼 육종은 환경변이에 영향을 받지 않고 어린 시기에 형질을 탐색할 수 있기 때문에 대량의 자원을 정확하고 빠르게 분석할 수 있는 장점이 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 키다리병 저항성 벼 품종을 구별하는데 효율적으로 이용될 수 있는 DNA 마커를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 키다리병 저항성 품종인 삼광벼에에서 키다리병 저항성 품종을 선발할 수 있는 Indel(insertion/deletion) 마커를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1322345호

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 서열번호1 및 서열번호2로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 과제는 상기 조성물을 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 과제는 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여, 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 하나의 양태로 서열번호1 및 서열번호2로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "키다리병(bakanae disease)"은 푸사리움균(Fusarium fujikuroi)에 의해 발생하는 대표적인 종자전염성병으로, 벼의 묘종 또는 본답 이식 직후부터 잎이 옅은 노란색이 되면서 도장(徒長)하여 풀의 길이가 건전주의 2배 가까이 되는 병징을 보인다. 종자전염의 병해로, 벼의 개화기 도장 후 고사한 포기 위에 형성된 병원균의 분생포자가 비산해 감염되어 이병종자가 된다. 또한 파종 전 최아(催芽)하기 위해 물에 침지할 때 이병종자가 섞여 있으면 새로운 감염이 일어난다. 병원균이 침범하고 있으면 발아하지 않거나 발아하더라도 곧 고사한다. 고사하지 않은 것은 전술한 바와 같이 도장하여 전형적인 증상을 나타내지만 말기에는 고사한다.

본 발명에서 “병 저항성”은 식물체가 병원성 곰팡이, 세균, 바이러스 등에 대한 방어를 나타내며, 구체적으로 증상의 완화로 병변의 감소, 생장 저해의 감소, 병 감염속도의 저하, 병 진행속도의 저하 등의 효과를 나타내는 것을 말한다. 본 발명에서 병 저항성은 벼 키다리병에 대한 저항성을 의미할 수 있다.

본 발명에서 “벼(Oryza stiva)”는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀로, 동인도 원산의 식용작물로 논이나 밭에 심는다. 높이는 1m 정도이고 잎은 가늘고 길며 성숙하면 줄기 끝에 이삭이 나와 7월 말에서 8월 경 꽃이 핀 후 열매를 맺는다.

본 발명의 "프라이머"는 자유 3' 말단에 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 짧은 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 18개 이상, 바람직하게는 20 내지 200개, 보다 바람직하게는 20 내지 100개, 보다 더 바람직하게는 20 내지 30개의 연속된 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.

본 발명에서 프라이머는 올리고뉴클레오티드로 이루어 질 수 있으며, 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

또한, 상기 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예:금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예컨대, 호스래디쉬 옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예컨대,³²P), 형광성 분자, 화학그룹 (예컨대, 바이오틴) 등이 있다.

본 발명의 다른 양태로 상기 조성물을 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별키트를 제공한다.

본 발명의 선별키트는, 상기 조성물 이외에 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 구체적으로 완충용액, DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 보조인자(Mg²⁺), dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및dTTP) 및 물(dH₂O)를 포함할 수 있다. 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등이 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태로 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여, 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별방법을 제공한다.

본 발명에서 "벼 시료"는 키다리병에 감염될 수 있는 벼의 조직을 말하며, 종자, 뿌리, 잎, 줄기 또는 화기(꽃), 이삭을 포함하는 식물체의 조직에서 유래한 모든 기관 및 세포, 캘러스, 식물 조직의 선발, 배양 및 식물체의 재분화를 위해 형질전환된 조직을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “DNA의 분리”는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 표적서열을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다.

이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적서열을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 "표적서열"은 저항성 품종에서 특이적으로 검출되는 Indel 마커일 수 있다. 바람직하게, 상기 표적 서열은 서열번호1 및 2으로 표시되는 프라이머 쌍에 의해 증폭되어 검출될 수 있다.

본 발명에서 “Indel(Insertion/deletion) 마커”는 DNA의 염기배열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 상기 Indel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다. 따라서 그 증폭 결과는 표준유전체와 비교하여 밴드크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion)의 두 종류 타입을 나타낼 수 있다. 본 발명에서 "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 "유전자좌"는 분자 마커의 유전자 지도상의 위치를 의미한다.

본 발명에서 검출하는 단계는 증폭산물에서 Indel 마커인 qFfR9IND를 검출하는 것으로, DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또한, 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 삼광벼 유래 DNA 마커인 qFfR9IND Indel 마커를 이용하여 국내 벼 22종(삼광, 조운, 하이아미, 팔달, 화영, 운광, 화성, 다마금, 중생은방주, 진흥, 새누리, 기호, 주남, 동진, 호품, 안미, 설향찰, 칠보, 오대, 금오, 낙동, 영안)의 유전자형을 분석한 결과, 키다리병 저항성을 가지는 삼광벼와 같은 크기의 밴드를 나타내는 벼 품종 2종(조운, 하이아미)를 확인하였다. 조운벼와 하이아미는 고사율이 각각 42.9%, 48.3%로 중간 정도의 키다리병 저항성을 보였으며, 삼광벼와 밴드 크기가 상이하게 나타난 19종(팔달, 화영, 운광, 화성, 다마금, 중생은방주, 진흥, 새누리, 기호, 주남, 동진, 호품, 안미, 설향찰, 칠보, 오대, 금오, 낙동, 영안)은 키다리병에 대해 고사율이 64.3% 내지 100%로 나타나 감수성임을 확인하였다.

따라서, qFfR9IND 마커는 키다리병 저항성 품종을 선별할 수 있다.

본 발명에 따른 삼광벼 유래 DNA 마커를 포함하는 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 이용하여 효율적으로 키다리병 저항성 및 감수성 개체를 구분할 수 있으며, 본 발명의 DNA 마커는 MAS(Marker Assisted Selection)를 통한 키다리병 저항성을 개선한 벼 육종에 유용하게 사용될 수 있다. 이에, 벼 키다리병 저항성 품종 개발 촉진으로 인해 키다리병에 대한 피해 절감 및 농약 사용량 또한 절감할 수 있다

도 1은 주남벼/삼광벼 교배 후대 F2 집단의 유전지도이다.
도 2는 주남벼/삼광벼 F3 집단을 키다리병 반응 검정을 위해 기내 배양하는 사진이다.
도 3은 주남벼/삼광벼 교배 후대 F3 집단의 키다리병에 대한 저항성을 분석한 결과로, 키다리병균 접종 후 4주차의 고사 정도를 나타낸 사진이다. (a) 모본 품종에서 키다리병 저항성을 분석한 결과이며, (b) F3 집단에서 분석한 결과로 표현형을 저항성(R), 중도저항성(MR), 감수성(S)로 분리하였다. 저항성(R)은 고사율 40% 이하, 중도저항성(MR)은 고사율이 40% 초과 60% 미만, 감수성(S)은 고사율이 60% 이상인 경우로 분리하였다.
도 4는 주남벼 및 삼광벼 교배 후대 F3 집단의 키다리병 고사율 분포 히스토그램이다.
도 5는 벼 표준유전체에서 qFfR9의 위치구간에 위치한 유전자 위치를 나타낸 것이다.
도 6은 Os09g0298700 유전자에서의 InDel 부위를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 키다리병 저항성 품종 선발 마커인 qFfR9IND 마커를 이용하여, 국내 자포니카 벼 품종들의 유전자형을 분석한 전기영동 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예1> 키다리병 저항성 검정

키다리병균 감염에 따른 품종간 고사 정도를 검정하기 위해 기내 배양한 키다리병균을 접종한 후 4주차에 각각의 품종에 대한 고사 정도를 조사하였다. 조사 방법은 잎의 3/4이상이 건조(dry), 시듦(wilt), 마름병(blight)이 진행된 것을 대상으로 고사율을 %로 조사하였다.

표 1은 국내에서 육성된 벼 우량 품종들 가운데 22 품종(삼광, 조운, 하이아미, 팔달, 화영, 운광, 화성, 다마금, 중생은방주, 진흥, 새누리, 기호, 주남, 동진, 호품, 안미, 설향찰, 칠보, 오대, 금오, 낙동, 영안)에 대해서 키다리병 반응 기내 유묘 검정을 실시한 결과이다. 표 1을 참고하면, 삼광은 25%의 고사율을 보여 저항성 품종임을 확인하였으며, 조운, 하이아미는 각 42.9% 48.3%의 고사율로 중도저항성을 가짐을 확인하였다. 나머지 19종의 품종(팔달, 화영, 운광, 화성, 다마금, 중생은방주, 진흥, 새누리, 기호, 주남, 동진, 호품, 안미, 설향찰, 칠보, 오대, 금오, 낙동, 영안)은 64.3 내지 100%의 고사율을 나타냈으며, 이중 주남, 동진, 호품, 안미, 설향찰, 칠보, 오대, 금오, 낙동, 영안은 100%의 고사율을 나타냈다. 즉, 삼광벼의 키다리병 저항성이 가장 높음을 확인하였다.

표 1은 벼 품종들의 키다리병균 접종 후 4주차의 고사율(%)을 측정한 결과이다.

품종	고사율(%)	품종	고사율(%)
삼광	25.0	기호	96.6
조운	42.9	주남	100
하이아미	48.3	동진	100
팔달	64.3	호품	100
화영	65.5	안미	100
운광	71.4	설향찰	100
화성	71.4	칠보	100
다마금	81.5	오대	100
중생은방주	84.6	금오	100
진흥	93.3	낙동	100
새누리	96.0	영안	100

<실시예2> 키다리병 저항성 유전자 맴핑(mapping) 및 키다리병 저항성 품종 선발마커의 개발

상기 실시예1에서 벼 키다리병 저항성 정도에 대한 검정결과, 삼광벼가 키다리병에 대한 저항성이 우수한 품종임을 확인하였다.

이에 키다리병 저항성 유전자 위치를 밝히기 위해 벼 키다리병 저항성 품종인 삼광벼와 감수성 품종인 주남벼를 교배하여 후대 F2 집단(188 개체)을 육성하고, 상기 육성한 삼광벼 및 주남벼에 대한 유전체 재해석(resequencing)을 통해 두 품종간의 변이 영역을 탐색하였으며, 이를 토대로 키다리병 저항성 관련 QTL 맵핑하였다.

<실시예2-1> 변이영역의 탐색 및 키다리병 저항성 관련 유전자 양적형질 유전자좌좌(QTLs, quantitative trait loci)의 결정을 위한 유전 지도 작성

CLC Assembly Cell 프로그램(ver.3.2.2, http://www.clcbio.com)을 사용하여 삼광벼와 주남벼의 NGS 염기서열들(reads)의 표준유전체서열에 대한 mapping과 SNP 탐색을 수행하였다. 이 과정에서 clc_mapper 명령어를 사용하여 read mapping을 수행하였는데, 이 때 옵션 값을 similar ity 95%, matched length fraction 1.0, repeat ignore로 설정하여 각 read의 전체 영역이 match되면서 염기서열 유사도가 95% 이상인 서열만을 선별하고 반복서열들은 제외되도록 하였다. clc_find_variations 명령어를 사용하여 각 품종들의 니폰바레(Nipponbare) 대비 DNA 다형성 목록을 추출하였다. 이후의 분석은 자체로 작성한 Python 프로그램을 사용하였는데, 먼저 시퀸싱 오류(sequencing error)에 의한 미스매치(mismatch)를 배제하기 위해 mapping depth가 10 이상인 DNA 다형성만을 추출하였다.

삼광벼-니폰바레(Nipponbare) 비교에 의한 단일염기서열변이(SNP) 파일과 주남벼-니폰바레(Nipponbare) 비교에 의한 단일염기서열변이(SNP) 파일을 비교 분석하여 삼광벼와 주남벼간 단일염기서열변이(SNP) 목록을 추출하였다.

벼 표준 유전체서열은 RAP-DB(The Rice Annotation Project Database, http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)에 있는 니폰바레(Nipponbare) IRGSP-1.0 sequence(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/download/irgsp1.html)를 이용하였다.

분석결과, 140,318 개의 단일염기서열변이(SNP)와 11,598 개의 삽입/결실(InDel)을 포함한 151,916 개의 DNA 다형성을 발굴하였다(표 2, 표 3).

표 2는 주남벼와 삼광벼의 유전체 시퀀싱 데이터 양이다.

표 3은 주남벼와 삼광벼간 DNA 다형성(polymorphisms) 염색체별 분포를 분석한 결과이다.

염색체	SNP	InDel	합(Sum)
Chr1	8,371	897	9,268
Chr2	10,129	964	11,093
Chr3	7,615	600	8,215
Chr4	6,441	570	7,011
Chr5	2,479	293	2,772
Chr6	5,032	417	5,449
Chr7	15,620	1,532	17,152
Chr8	1,732	292	2,024
Chr9	6,527	475	7,002
Chr10	12,843	1,190	14,033
Chr11	51,628	3,282	54,910
Chr12	11,901	1,086	12,987
Total	140,318	11,598	151,916

188개체로 구성된 주남벼 및 삼광벼 교배 F2 집단을 대상으로 175 개의 KASP 마커와 8 개의 CAPS 마커와 1개의 dCAPS 마커를 포함하여 총 184개의 마커로 구성된 유전지도를 작성하였다(도 1, 표 4, 표 5).

표 4는 상기 175 개의 KASP 마커의 프라이머 및 염기서열을 나타낸 것이고, 표 5는 상기 8 개의 CAPS 마커와 1개의 dCAPS 마커 프라이머 및 염기서열을 나타낸 것이다.

No.	마커명칭	Chr.	Position	snp	Primer_AlleleFAM	Primer_AlleleHEX	Primer_Common
1	KJ01_002	1	1360285	T/G	GAGCCTTGGCCGCAGCCA	GAGCCTTGGCCGCAGCCC	ACGGCGGCGTCGGGTCGTT
2	KJ01_009	1	2871043	C/T	TAATCTACTCAACCCCGATATCAATG	AATTTAATCTACTCAACCCCGATATCAATA	AGGCATTGGCACTTGGCAGAACAAA
3	KJ01_013	1	3523649	A/C	ATCTATTTTTTTCGTAATCCGTCCATTCAT	CTATTTTTTTCGTAATCCGTCCATTCAG	ACCATGATGCTCTTCTGAGACTATTGAT
4	KJ01_015	1	4209102	T/G	ATGAAAACACTGAGGATGCTCAGAATA	GAAAACACTGAGGATGCTCAGAATC	CCTTCTCAGTCTGAAGCCTAGAGAT
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126	KJ08_011	8	2940939	T/G	GGATTGAGTATTGAATATTGCATCCTAAAT	GAGTATTGAATATTGCATCCTAAAG	CCCAAACATTTGGAATTCAACTCCAAAGAA
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128	KJ08_017	8	4097511	C/T	TCACAAAATCCCCAAATACATCAAGC	CTTTCACAAAATCCCCAAATACATCAAGT	GGTTAGAGTGAATGGGATTTGGAGAAAAT
129	KJ09_002	9	434420	A/G	TATTGCGCAATATAACCAGGGCTAAT	GCGCAATATAACCAGGGCTAAC	TCGGCGCCACCCCCTGGAT
130	KJ09_015	9	4668812	C/T	TTCACTATGTTCTCCGTACCCG	GTTTCACTATGTTCTCCGTACCCA	ACAATGCTCGAGACGTTCACGCAA
131	KJ09_018	9	5343850	A/G	CACCCCAAAATCACAATAGTCTCAA	CACCCCAAAATCACAATAGTCTCAG	GGGACTAAAGATGATCATTAGTCCTAGTT
132	KJ09_022	9	6657081	A/G	AAAAAGAGAAAGGTTTAAAATTCAACAAATTCA	AAAAAGAGAAAGGTTTAAAATTCAACAAATTCG	CATATTTGCTTTACATACTATACCTGCGTT
133	KJ09_024	9	7356016	A/C	AAGTGAGCAAATCTGGCGTAGTGA	GTGAGCAAATCTGGCGTAGTGC	TGAGAAGTAATTGCACACTTGCGTTGTTT
134	KJ09_025	9	7555220	A/G	AAGCTTCACTTAATTGATTAATTTCCTTAACT	GCTTCACTTAATTGATTAATTTCCTTAACC	CGCCAACCGTTTGATTCTTGATGGAT
135	KJ09_077	9	21004828	A/C	AAGTTTTGGTGGCGGAAGCGCA	GTTTTGGTGGCGGAAGCGCC	GGCCTGAAGGTTGATGAAGAAGGAT
136	KJ09_079	9	21598192	A/G	GTCTCGTGAATTAGTCCAAAATTATAGATA	CTCGTGAATTAGTCCAAAATTATAGATG	CTCTATCACATCGGATGTTTGAACACTAA
137	KJ09_081	9	22166657	A/G	GACACTTGTAACTTGTTGCACATGTATA	ACACTTGTAACTTGTTGCACATGTATG	GGCGCTGAATAAACTCATTCACATGTAAA
138	KJ09_083	9	22403093	C/T	CTATTGCTATTTCCAAGACCG	GGCTCTATTGCTATTTCCAAGACCA	TCTGAGAATGCTCGACAGAAACAAAGTTT
139	KJ10_003	10	973578	C/T	GAAAATCGGCTAAAAGGCTGAAGG	GGAAAATCGGCTAAAAGGCTGAAGA	GTAATTTTGCTGCCAGGGATAAGGATTTT
140	KJ10_009	10	2760140	A/G	GATTCGGTCCTCCCTTCCTTCT	CGGTCCTCCCTTCCTTCC	CATAAATTTAGGAAAGTAATACGGTGCCAA
141	KJ10_011	10	3187409	A/G	GCAAGACTTTAAGTGATCGTGTATAGTT	CAAGACTTTAAGTGATCGTGTATAGTC	AACAAGCTCTCACCCAAGTGGGAA
142	KJ10_013	10	3771667	C/T	AAGAGCACCTCGAAATATCC	GGCTAAGAGCACCTCGAAATATCT	GAACGAGCCAGAGACCGACGAT
143	KJ10_015	10	9513814	C/T	GGCTCCAAGGAAGCTAGATCTG	GGCTCCAAGGAAGCTAGATCTA	GACCTCTTTCCCCTAAGTCTCTTCAT
144	KJ10_019	10	15128495	A/C	GTAACTTCTCCAGTCGTTATAGAATACAT	AACTTCTCCAGTCGTTATAGAATACAG	CATGTTAGAGGGTAAAAACTTAATCGGCAT
145	KJ10_024	10	16700924	A/C	AGGTTATAGCCCGTTTGTCGTGA	GGTTATAGCCCGTTTGTCGTGC	TCCTTTCTCTTCGGTTGCCATATTCTTT
146	KJ10_033	10	18461290	A/G	GCCCCAAGTGTAGCTGCAGCT	CCCCAAGTGTAGCTGCAGCC	CGAAGGACTACTCGCCGGGATA
147	KJ10_035	10	19473918	C/T	CATCAGTTAATTAGCTAGCTCTAAACC	GCATCAGTTAATTAGCTAGCTCTAAACT	CCATGGCGTGCAGCGTGTTCAT
148	KJ10_039	10	20358666	A/C	AGAGCTCGGCTGCTCGAGA	AGAGCTCGGCTGCTCGAGC	GCCTGCCTCCATTCTTTTACTTCGAA
149	KJ11_001	11	273657	C/T	TATCTCACACGCAAACATTTAATACTC	CTTATCTCACACGCAAACATTTAATACTT	CATGCATGGAGCATTAAATGTGGATGAAA
150	KJ11_004	11	1080991	A/G	AATCTGTATGGTCGTTCCAGTAGGA	CTGTATGGTCGTTCCAGTAGGG	CCCCTCGACTCCTCTTGGTCTT
151	KJ11_017	11	5928004	A/C	AATTTATTGCTCGAAATATGCATTCATCTTAT	TATTGCTCGAAATATGCATTCATCTTAG	GTCGCTAACTAATTGCTTGAAGTTATGTAT
152	KJ11_019	11	6377155	A/C	GTCCCATTCATCCACAGTCCAT	GTCCCATTCATCCACAGTCCAG	CTCTGTTCGTTTGGAATATGGCAGCAT
153	KJ11_024	11	7461078	A/G	GGATGCCACGTCAGCAAACCAA	GATGCCACGTCAGCAAACCAG	TTCGGTCCCATGGCAGTATGGATAT
154	KJ11_028	11	8225301	A/T	GAACTCTTTTATTTATTTAATTCGTGTGGACA	GAACTCTTTTATTTATTTAATTCGTGTGGACT	AACTAAGATTTGGCAAATGGACTACAACAA
155	KJ11_031	11	9734345	A/G	ACCCTAGGATTCACCGAGGCTT	CCCTAGGATTCACCGAGGCTC	CACGAGTGTATATGAACAATGATGTGTCAA
156	KJ11_033	11	10335474	A/C	GAAATTAATGATGTACTTGTTCCGTTTTCATT	AATTAATGATGTACTTGTTCCGTTTTCATG	CAAGGGACGTTATAATCACATGACCAAAA
157	KJ11_043	11	12295393	A/G	TGCAATATATAGAGTTCTGTTGCTACAA	GCAATATATAGAGTTCTGTTGCTACAG	CGGTGACAATATAACACCACTATTTGCAA
158	KJ11_049	11	13793186	C/T	TTGTCTTCACGGTTGGCTTACTAC	TTGTCTTCACGGTTGGCTTACTAT	GTTGCAGCTGATGATAATGATGAGATCTT
159	KJ11_059	11	15869882	A/G	ATTTTCCTCCGCTTCCCTCTTTTATTT	TCCTCCGCTTCCCTCTTTTATTC	GAGTGGGAGGCGGAGGGGAA
160	KJ11_064	11	17886991	A/C	AAAGGGTTCTAAATCGGGAGTAAAGAT	AGGGTTCTAAATCGGGAGTAAAGAG	CTCTGCAAGAACGCGTGGAGAAATT
161	KJ12_014	12	5486498	A/T	CGGTTGACTGCAAAATCTTTCT	GCTCGGTTGACTGCAAAATCTTTCA	TCGTCTTCTCTGCCAAAGCGATCAA
162	KJ12_018	12	7100606	C/T	GGTGCATAGCTTCTCAGTCACG	CGGTGCATAGCTTCTCAGTCACA	CTGTAAGATGCAACCGTCGATCTGAA
163	KJ12_023	12	9489380	C/T	GAGAAATACATATTTTCGCTTTTGACAAAG	AAAGAGAAATACATATTTTCGCTTTTGACAAAA	TTCTCACCATGTATAATCTTCCTGCCTA
164	KJ12_029	12	11965502	C/T	CGTGTCCCAACTAAAGAAGTGCC	ACGTGTCCCAACTAAAGAAGTGCT	TCAGCCTGTTCTTCGGGTACTCTTA
165	KJ12_033	12	12937191	A/T	TGTCAAACGTATATTCAAAAGTCAATGGT	GTCAAACGTATATTCAAAAGTCAATGGA	TGATACTACCTCCATTTTTCAAAAGATGAT
166	KJ12_041	12	15328542	A/G	TACAGATTTCATCCGCAAGCGCAT	CAGATTTCATCCGCAAGCGCAC	CTCTCGGGGTGAAATATTACAATGGTATA
167	KJ12_043	12	15839951	C/T	GGAAGCTAAAAATCACTAGCCAACC	AGGAAGCTAAAAATCACTAGCCAACT	AGGTGGAATGTGTATGAGGCCCAT
168	KJ12_045	12	16493747	C/G	CGCTACCTCTACTTCCCCTAC	CGCTACCTCTACTTCCCCTAG	CCTCGAACCACCTCCTCGCTTT
169	KJ12_051	12	19885739	T/G	CATGTCTGCACCCTTCCCTTA	CATGTCTGCACCCTTCCCTTC	TCCACCTCGGTCACCGGAGAA
170	KJ12_056	12	21903642	A/G	CCGAAGCCCTTCCAGGCTCTA	CGAAGCCCTTCCAGGCTCTG	TCCAGGGATCCTAGAGAATCGGAT
171	KJ12_058	12	22479641	C/T	TTTTAACTTCTAAACTCTCCTATAAAATAGC	GTTTTTAACTTCTAAACTCTCCTATAAAATAGT	CAGAAGATTGAAACATGGAGATCTTGTCAA
172	KJ12_061	12	25291346	C/T	GTTGCTGGCCAGATTGTATGGC	ATGTTGCTGGCCAGATTGTATGGT	AACTTGTTACATTTTTCGATGGCGAAAGTA
173	KJ12_063	12	25549618	C/T	CGTTGTTGACTTGTTTCCTCTCTAG	AACGTTGTTGACTTGTTTCCTCTCTAA	CATGGCATGCATGTTTGCTAGCGAA
174	KJ12_068	12	26987977	T/G	TTATCAATGAAATGAGACAGAACTTCTT	TATCAATGAAATGAGACAGAACTTCTG	CCTCCAGCCTAACAGCCAGAGTT
175	KJ12_070	12	27474449	T/G	ACTGCTAGCTAAGCTACGGCT	ACTGCTAGCTAAGCTACGGCG	CTGCCATGGAATGGAAGGAGAAGAT

No.	마커명칭	physical location		primer sequence		제한 효소	마커 타입
No.	마커명칭	Chromosome number	distance from the top (Mbp)	forward	reverse	제한 효소	마커 타입
1	9FC1	9	6,760,046	ACAACGAGAGGGATGGTGT	GGGTTCAACAAAGATCCAGA	PshBI	CAPS
2	9FC5	9	6,835,396	CACATGGTGAAAAGACATGG	TAGTGTGCAAAGCAGGACAA	PvuII	CAPS
3	9FC7	9	6,904,230	GGATGTTTTCTTTCTGATGACC	TAAGCCGTCATGTGGCACTA	XbaI	CAPS
4	9FC9	9	6,966,618	GCTTAACGCCGAGAGCTAGT	TCTAACAAAGTGGCATCACG	EcoRV	CAPS
5	9FC10	9	7,149,210	GTCCATTCCACCCTTACGTT	TTGATTGGGGGTTGAAGATA	EcoRV	CAPS
6	9FC13	9	7,182,057	TGCCATCATGAGTTGAAATG	AAAGGTCACCAGTGTGGAAA	PvuII	CAPS
7	9FC14	9	7,239,467	GGGGTAAAATGTGTTTGTGC	CTTGGGCTTTGTTTGTGAAC	PshBI	CAPS
8	9FC30	9	7,511,494	TGGAAGAAGAAAAGTAGGGAGA	ATAACGAAGCAGTCCCCAAA	HindIII	CAPS
9	JS9M6	9	14,581,727	AGAATGTAAGTCATTCTAGCAGATC	TGGTTAGCCTCATCGTAGAC	BglII	dCAPS

<실시예 2-2> 삼광벼 및 주남벼 교배 후대 집단의 키다리병 저항성 검정 결과 및 이를 기반으로 한 키다리병 저항성 관련 QTL 맵핑

키다리병 저항성 관련 QTL mapping을 위해, 주남벼 및 삼광벼 교배 후대 F3 집단 계통들의 벼 키다리병 기내검정을 실시하였다(도 2, 도 3, 도 4), 도 1의 유전지도와 상기 F3 집단의 키다리병 반응데이터를 이용하여 벼 키다리병 저항성 QTL mapping을 수행하였다. 그 결과 9번 염색체의 30.17 cM 부위에서 벼 키다리병 저항성 주동 QTL을 발굴하였다. 이 QTL을 qFfR9으로 명명하였으며, LOD값은 60.3이었고, 상가적 효과(additive effect)는 35.15이었고 우성효과(dominance effect) -1.27이었다(표 6).

<실시예 2-3> 키다리병 저항성 품종 선별마커 개발

상기 실시예2-2에서 탐색된 qFfR9의 위치구간은 95% 유의수준에서 29.9-31.2 cM이었는데 이는 물리적거리로 7.24-7.56 Mbp 구간에 해당하였다. 벼 표준유전체염기서열 데이터베이스에서 이 구간에는 15개의 유전자가 위치하는 것으로 나타났다(도 5).

이 유전자들 가운데 Os09g0298700 유전자가 병 저항성과 관련된 것으로 보고된 RNA Recognition Motif 도메인을 가진 단백질을 코딩하고 있었다.

삼광벼의 유전체 염기서열 데이터를 가지고 CLC Assembly Cell 프로그램의 clc_assembler 명령어를 사용하여 de novo assembly를 수행하였다. 그 결과 생산된 contig 염기서열들을 CLC Genomics Workbench 프로그램(ver. 6.01,http://www.clcbio.com)을 이용하여 BLAST 데이터베이스로 만들고, Os09g0298700 유전자 염기서열로 BLAST를 수행하여 이들 유전자를 포함하는 삼광벼 contig를 추출하였다. 이렇게 추출한 삼광벼 contig 염기서열과 자포니카 벼 표준유전체 염기서열인 니폰바레 염기서열을 비교하여 삽입/결실(InDel) 부위를 찾아내었다.

구체적으로 삼광벼의 유전체 염기서열에서 Os09g0298700 유전자 영역을 조사한 결과 76bp 크기의 InDel이 발견되었다(도 6). 이를 토대로 상기 InDel 부위를 증폭하기 위해 표 7과 같은 염기서열을 가지는 PCR 프라이머를 제작하여 qFfR9IND의 InDel 마커를 개발하였다.

마커명 (Marker name)	정방향 프라이머 (Forward primer)	역방향 프라이머 (Reverse primer)
qFf9IND	GAGTCTGAAACTGCTGGTGGG 서열번호1	AGACAAGACAACGGAGGTGG 서열번호2

상기 InDel 마커를 키다리병 저항성 벼 품종 선발 마커로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고자, 국내 벼 22 품종의 벼에서 게놈 DNA를 추출하고, 추출된 유전자를 InDel 마커를 이용하여 PCR을 수행하였다.

이 때 PCR 조건은 94℃에서 3분간 가열한 다음, 94℃에서 40초, 63℃에서 40초, 72℃에서 100초 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회(cycle) 반복한 후, 이를 72℃에서 5분간 더 가열하는 조건으로 진행하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 PCR 산물은 전기영동하여 밴드를 확인하였다.

국내 벼 22 품종(삼광, 조운, 하이아미, 팔달, 화영, 운광, 화성, 다마금, 중생은방주, 진흥, 새누리, 기호, 주남, 동진, 호품, 안미, 설향찰, 칠보, 오대, 금오, 낙동, 영안)의 유전자형을 분석한 결과, 벼 키다병 저항성이 우수한 삼광벼와 같은 크기의 밴드를 보인 품종은 조운, 하이아미로 나타났다.

표 1에서 조운벼와 하이아미는 고사율이 각각 42.9%, 48.3%로 중간 정도의 저항성을 보였다. qFfR9IND 마커는 키다리병 저항성 품종을 구분해 낼 수 있었다.

따라서 상기 결과를 통해, 삼광벼와 주남벼간 InDel(Insertion/Deletion) 부위로부터 신규 발굴한 InDel 마커를 키다리병 저항성 벼 품종 선발마커로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> DNA markers for selection of rice plants having resistance to rice bakanae disease derived from Samgwangbyeo <130> DP20190152 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qFf9IND forward primer <400> 1 gagtctgaaa ctgctggtgg g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qFf9IND reverse primer <400> 2 agacaagaca acggaggtgg 20

Claims

서열번호1 및 서열번호2로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별키트.
제 2항에서 상기 키트는 증폭을 위한 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 선별키트.
벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여, 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는,
키다리병 저항성 벼 품종 선별방법.
제 4항에서 상기 시료는 벼의 종자, 뿌리, 잎, 줄기, 꽃 또는 이삭 조직으로부터 유래된 것인, 키다리병 저항성 벼 품종 선별 방법.