KR102288953B1 - 다능성 줄기세포로부터 마이크로글리아를 얻는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은 다능성 줄기세포로부터 효율적으로 마이크로글리아를 제조하는 것이다. 이하의 공정을 포함하는 다능성 줄기세포로부터 마이크로글리아를 제조하는 방법: (a) 다능성 줄기세포를 7일간 이상 피더 세포와 공생 배양하고, 혈액전구세포를 얻는 공정, (b) 공정(a)에서 수득된 혈액 전구세포를 IL-3 및/또는 GM-CSF의 존재하에서 피더 세포와 공생 배양하고, 원시 단구를 얻는 공정, 및 (c) 공정(b)에서 수득된 원시 단구를 M-CSF의 존재하에서 아스트로사이트와 공생 배양 또는 아스트로사이트 상청액을 사용해서 배양하는 공정.

Description

다능성 줄기세포로부터 마이크로글리아를 얻는 방법
본 발명은 다능성 줄기세포로부터 마이크로글리아를 얻는 방법에 관한 것이다.
마이크로글리아란 뇌척수 중에 존재하는 신경교세포로, Hortega 세포라고도 불린다. 중배엽 유래이고, 뇌내로의 바이러스 등 이물의 침입 및 외상에 의해 활성화되고, 살균, 조직의 수복 이외에, 항종양 작용 등, 여러가지 생리기능을 담당하는 것이 알려져 있다. 또, 마이크로글리아는 아포토시스나 손상에 의한 사세포나 아밀로이드β 등의 노폐물을 탐식작용에 의해 제거한다.
질환과의 관계에서는 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 신경변성을 따르는 만성 신경변성질환이나, 뇌경색 등의 다양한 질환에 마이크로글리아가 관여하는 것, 아밀로이드β로 대표되는 뇌내에서 축적하는 노폐물에 의해 반응성이 변화되는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 1).
따라서 이것들의 마이크로글리아에 관련되는 질환의 치료약 개발과 평가를 위해서 마이크로글리아를 사용하는 것이 필요하다. 그래서, 마이크로글리아를 조제하기 위해서 다양한 방법이 시도되고 있다.
비특허문헌 2에는 마우스 ES 세포로부터 마이크로글리아를 얻는 방법이 기재되어 있다.
특허문헌 1에는 인간 iPS 세포로부터 마이크로글리아 전구세포를 얻는 방법이 기재되어 있지만, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 분화되어 수득되는 CD45에 대해서 면역 반응성을 가지는 세포(마이크로글리아 전구세포)는 겨우 2∼10%이다.
비특허문헌 3에도 기재되어 있는 바와 같이, 수많은 연구실에서 iPS 세포로부터 마이크로글리아로의 분화가 시도되고 있음에도 불구하고, 현시점에 있어서, 인간 iPS 세포로부터 마이크로글리아를 얻는 효율적인 방법은 알려져 있지 않다.
국제공개 제2010/125110호
J. Neuroinflammation, Vol. 1, pp. 14(2004) Nature Protocols, 5, 1481-1494(2010) Brain Research, Volume 1656, Pages 98-106(2017)
본 발명의 목적은 다능성 줄기세포로부터 효율적으로 마이크로글리아를 제조하는 것이다.
본 발명자는 예의 연구의 결과, 마이크로글리아가 태생초기에 난황낭 마크로파지로부터 발생하고, 중추신경계에 유주하는 것이 시사되고 있는(Nature ReviewImmunology, 2011, 11, 775-787) 것을 참고로, 효율적으로 마이크로글리아를 제조하는 것에 성공했다. 구체적으로는 인간 유래의 iPS 세포를 피더 세포 상에서 혈액 전구세포를 제작하고(공정(a)), 혈액 전구세포로부터 원시조혈에 의해 단구를 제작하고(공정(b)), 추가로 아스트로사이트와 공생 배양하는(공정(c)) 것에　의해서, 마이크로글리아를 제작했다. 공정(a)에서 수득된 세포를 모두 공정(b)에 적용시키면, 모든 세포(100%)가 원시 단구로서 수득되었다. 그 후에 공정(c)에 적용시키면, 원시 단구는 모두(100%) 마이크로글리아로 분화되었다. 즉, 비특허문헌 3에도 기재된 바와 같이, 마이크로글리아를 얻는 효율적인 방법은 알려져 있지 않은 현재의 상태에 있어서, 본 발명에 있어서, 마이크로글리아 및 마크로파지에 특유한 세포표면 마커(Iba1)를 발현하며, 또, 마크로파지에는 존재하지 않고, 마이크로글리아에 존재하는 형상인 돌기를 가지는 세포가 매우 효율적으로 수립되었다.
또, 본 발명자는 연구를 진행시키고, 제조 효율을 올리기 위해서는 공정(a)의 배양기간이 7일 이상(특히, 13일 이상)인 것, 공정(b)에 있어서 IL-3을 25ng/㎖ 이상 혹은 GM-CSF를 50ng/㎖ 이상 첨가하는 것, 공정(c)에 있어서 M-CSF를 25ng/㎖ 이상 첨가하는 것이 특히 바람직하다는 것, 또, 공정(b)의 배양기간은 크게 영향을 주지 않는 것을 발견했다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
(1) 이하의 공정을 포함하는 다능성 줄기세포로부터 마이크로글리아를 제조하는 방법:
(a) 다능성 줄기세포를 7일간 이상 피더 세포와 공생 배양하고, 혈액 전구세포를 얻는 공정,
(b) 공정(a)에서 수득된 혈액 전구세포를 IL-3 및/또는 GM-CSF의 존재하에서 피더 세포와 공생 배양하고, 원시 단구를 얻는 공정, 및
(c) 공정(b)에서 수득된 원시 단구를 M-CSF의 존재하에서 아스트로사이트와 공생 배양 또는 아스트로사이트 상청액을 사용해서 배양하는 공정.
(2) 상기 (1)에서, 공정(a)의 배양기간이 13일 이상인 방법.
(3) 상기 (1) 또는 (2)에서, 공정(c)에 있어서, IL-34의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에서, 공정(b)에 있어서, IL-3 및 GM-CSF의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에서, 피더 세포가 10T1/2 세포 또는 OP9세포인 방법.
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에서, 공정(a)에 있어서, VEGF의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인 방법.
(8) 상기 (7)에서, iPS 세포가 인간 또는 마우스 유래인 방법.
(9) 상기 (1) 내지 (8)에 기재된 방법으로 제조된 마이크로글리아를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이크로글리아가 관여하는 질환의 예방 혹은 치료제 또는 기억 혹은 학습능력 개선제의 스크리닝 방법.
(10) 상기 (9)에서, 마이크로글리아가 관여하는 질환이 척수의 외상, 뇌졸중에 의한 신경장애, 간질, 신경 장애성 동통, 혈관 폐색성의 안질환, 탈수초 질환, 정신질환, 뇌경색, 나수-하코라병 또는 신경변성질환인 스크리닝 방법.
(11) 상기 (10)에서, 신경변성질환이 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 근위축성 측색경화증인 스크리닝 방법.
본 발명의 방법에 의해, 다능성 줄기세포로부터 효율적으로 마이크로글리아를 제조할 수 있다. 수득되는 마이크로글리아는 마이크로글리아 자체의 연구, 마이크로글리아가 관련되는 질환의 연구 등, 여러 가지 기초 연구에 이용 가능하다. 또, 마이크로글리아를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이크로글리아가 관여하는 질환의 치료약 스크리닝 방법, 또는, 개개의 환자로부터 수립한 다능성 줄기세포로부터 제작한 마이크로글리아를 사용해서 개인에게 최적인 치료약을 선별하는, 소위 오더 메이드 치료약의 선택에 있어서 매우 유용하다. 추가로, 세포치료로의 이용도 기대된다.
도 1은 본 발명의 방법으로 분화유도 후의 세포의 Iba1 면역 염색상이다
도 2의 (a), (b) 모두 본 발명의 방법으로 분화유도 후의 세포의 확대상이다.
본 명세서에 있어서 사용되는 용어는 특별히 언급하는 경우를 제외하고, 당해 분야에서 통상 사용할 수 있는 의미로 사용할 수 있다. 또, 본 명세서에 있어서, 특별히 지시가 없는 한, 분자 생물학적 수법 및 면역학적 수법 등은 공지의 방법이 채용된다.
I. 다능성 줄기세포로부터 마이크로글리아로의 분화 유도 방법
본 발명의 다능성 줄기세포 마이크로글리아로의 분화 유도 방법은 이하의 공정을 포함하는 방법이다.
(a) 다능성 줄기세포를 7일간 이상 피더 세포와 공생 배양하고, 혈액 전구세포를 얻는 공정,
(b) 공정(a)에서 수득된 혈액 전구세포를 IL-3 및/또는 GM-CSF의 존재하에서 피더 세포와 공생 배양하고, 원시 단구를 얻는 공정, 및
(c) 공정(b)에서 수득된 원시 단구를 M-CSF의 존재하에서 아스트로사이트와 공생 배양 또는 아스트로사이트 상청액을 사용해서 배양하는 공정.
상세하게는 공정(a)에 있어서, 다능성 줄기세포를 혈액 전구세포로의 분화를 촉진시키는데 적합한 조건하에서 배양한다. 「혈액 전구세포로의 분화를 촉진시키는데 적합한 조건 하」란 다능성 줄기세포와 피더 세포를 공생 배양하는 것을 의미한다.
「다능성 줄기세포」란 배아 줄기세포(ES 세포)나 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포)로 대표되는 미분화ㆍ다능성을 유지하는 세포를 가리킨다. ES 세포는 체세포로부터 핵초기화되어 발생한 ES 세포일 수도 있다. 또 ES 세포 이외에서는 시원생식세포에 유래하는 Embryonic Germ Cell(EG 세포), 정소로부터 단리된 다능성 생식세포계열 줄기세포(mGS 세포), 골수로부터 단리되는 다능성 성체 전구세포(MAPC) 등을 들 수 있다. 본 발명에서 이들 다능성 줄기세포의 유래는 인간 유래이다. 본 발명에서 다능성 줄기세포는 바람직하게는 iPS 세포, 특히 바람직하게는 인간 iPS(hiPS) 세포이다.
다능성 줄기세포는 공지의 방법에 의해 작성 가능하다. 예를 들면, 이하에 구체적으로 기재되에 있다. 국제공개 제2007/069666호, 국제공개 제2010/068955호, 국제공개 제2011/030915호, 국제공개 제2013/094771호, 국제공개 제2014/014119호, 국제공개 제2014/065435호.
또, 인간 iPS 세포주는 예를 들면, TkDA3-4는 도쿄대학 스템 셀 뱅크로부터, 201B7은 교토대학 iPS 세포 연구소로부터 입수 가능하다.
인간 ES 세포주는 예를 들면 WA01(H1) 및 WA09(H9)는 WiCell Reserch Institute로부터, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은 교토대학 재생 의과학연구소로부터 입수 가능하다.
다능성 줄기세포로서 ES 세포 또는 iPS 세포를 사용하는 경우, 예를 들면, 배지로서는 최종농도 15%의 FBS를 첨가한 IMDM을 사용하고, 기타 무혈청의 경우에 있어서도 적당하게 증식인자 및 서플리먼트 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 또, VEGF를 첨가할 수도 있고, 저산소 환경하에서의 배양을 실시하는 경우에는, VEGF를 첨가하지 않아도, VEGF를 첨가했을 경우와 동등한 효과를 얻을 수 있다.
VEGF의 농도는 혈액 전구세포가 수득되는 농도라면 특별히 문제없지만, 5ng/㎖∼50ng/㎖일 수도 있고, 바람직하게는 20ng/㎖ 이상이다.
「저산소 조건」이란 세포를 배양할 때의 분위기 중의 산소농도가 대기 중의 그것보다도 유의하게 낮은 것을 의미한다. 구체적으로는, 통상의 세포배양에서 일반적으로 사용되는 5∼10% CO2/95∼90% 대기의 분위기 중의 산소농도보다도 낮은 산소농도의 조건을 들 수 있고, 예를 들면 분위기 중의 산소농도가 18% 이하의 조건이 해당한다. 바람직하게는, 분위기 중의 산소농도는 15% 이하(예, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하 등), 10% 이하(예, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하 등), 또는 5% 이하(예, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 등)이다. 또, 분위기 중의 산소농도는, 바람직하게는 0.1% 이상(예, 0.2% 이상, 0.3% 이상, 0.4% 이상 등), 0.5% 이상(예, 0.6% 이상, 0.7% 이상, 0.8% 이상, 0.95이상 등), 또는 1% 이상(예, 1.1% 이상, 1.2% 이상, 1.3% 이상, 1.4% 이상 등)이다.
세포의 환경에 있어서 저산소 상태를 창출하는 수법은 특별히 제한되지 않지만, 산소농도의 조절 가능한 CO2 인큐베이터 내에서 세포를 배양하는 방법이 가장 용이하고, 호적한 예로서 들 수 있다. 산소농도의 조절 가능한 CO2 인큐베이터는 여러 기기 메이커로부터 판매되고 있다(예를 들면, Thermo scientific사, , Ikemoto Scientific Technology Co., Ltd., Juji-field co. JP, WAKENYAKU CO., LTD., 등의 메이커제의 저산소 배양용 CO2 인큐베이터를 사용할 수 있다).
「피더 세포」란 다능성 줄기세포의 분화 유도에 기여하는 세포라면 어느 것이나 사용가능하고, 예를 들면, 마우스 배아 섬유아세포, 바람직하게는, 10T1/2 세포주, OP9 세포 등을 사용할 수 있다. 피더 세포를 사용할 때에는, 예를 들면, 방사선을 조사하는 등, 세포의 증식을 억제해 두는 것이 좋다.
배양하는 기간은 다능성 줄기세포가 「혈액 전구세포로의 분화」하는 것에 충분한 일수 한, 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 7일 이상, 10일 이상, 13일 이상의 기간 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되지 않는다. 당업자는 사용하는 조건에 따라서 적당하게 당해 배양기간을 조정할 수 있다.
기타의 배양조건으로서는 예를 들면, 5% CO2, 36∼38℃, 바람직하게는 37℃의 조건을 사용할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 상기 조건에서의 배양은 예를 들면 공지의 CO2 인큐베이터를 사용해서 실시할 수 있다.
「혈액 전구세포」이란 CD34 음성세포, CD34 양성세포, Lin 음성세포(CD 2음성세포, CD3 음성세포, CD4 음성세포, CD7 음성세포, CD8 음성세포, CD10 음성세포, CD14 음성세포, CD16 음성세포, CD19 음성세포, CD20 음성세포, CD24 음성세포, CD41 음성세포, CD45 음성세포, CD56 음성세포, CD66b 음성세포, 또는, CD235a 음성세포), CD38 음성세포, CD90 양성세포, CD49f 양성세포, VEGFR2 양성세포, CD31 양성세포, CD43 양성세포, CD34 양성, 또한, CD45 양성세포, Rhodamine 약양성세포, 혹은, Hoechst 음성/약양성 세포 중, 단독, 혹은 복수의 마커 조합으로 특징되는 조혈계의 세포이다.
공정(b)에 있어서, 공정(a)에서 수득된 혈액 전구세포를, 원시 단구로의 분화를 촉진시키는데 적합한 조건하에서 배양한다(원시조혈이 발생한다). 「원시 단구로의 분화를 촉진시키는데 적합한 조건 하」란 혈액 전구세포와 피더 세포를 공생 배양하는 것을 의미한다. 더욱 구체적으로, 예를 들면, IL-3 및/또는 GM-CSF의 존재하에서 혈액 전구세포와 피더 세포를 공생 배양한다.
IL-3 및 GM-CSF의 농도는 원시 단구가 수득되는 농도라면 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, IL-3은 1ng/㎖∼200ng/㎖, 20ng/㎖∼150ng/㎖, 25ng/㎖∼100ng/㎖이다. GM-CSF는 1ng/㎖∼200ng/㎖, 20ng/㎖∼150ng/㎖, 25ng/㎖∼100ng/㎖이다. 또, 효율적인 제조를 위해서는 IL-3은 25ng/㎖ 이상, GM-CSF는 50ng/㎖ 이상이 특히 바람직하다.
배양하는 기간은 「단구로의 분화」하는 것에 충분한 일수이며, 또, 원시조혈 가능한 일수인 한, 특별하게 한정되지 않는다. 당업자는 사용하는 조건에 따라 적당하게 당해 배양기간을 조정할 수 있다.
기타의 배양조건은 공정(a)(상기 [0047])과 동일하다.
「단구」란 CD1lb 양성세포, CD1 4양성세포, CD15 양성세포, CD4 양성세포, CD163 양성세포, CD9 양성세포, CD11c 양성세포, CDw12 양성세포, CD13 양성세포, CD17 양성세포, CD31 양성세포, CD32 양성세포, CD33 양성세포, CD35 양성세포, CD36 양성세포, CD38 양성세포, CD40 양성세포, CD43 양성세포, CD45RO 양성세포, CD45RA 양성세포, CD45RB 양성세포, CD49b 양성세포, CD49e 양성세포, CD49f 양성세포, CD63 양성세포, CD64 양성세포, CD65s 양성세포, CD68 양성세포, CD74 양성세포, CD84 양성세포, CD85 양성세포, CD86 양성세포, CD87 양성세포, CD89 양성세포, CD91 양성세포, CD92 양성세포, CD93 양성세포, CD98 양성세포, CD101 양성세포, CD102 양성세포, CD111 양성세포, CD112 양성세포, CD115 양성세포, CD116 양성세포, CD119 양성세포, CD12lb 양성세포, CD123 양성세포, CD127 양성세포, CD128b 양성세포, CD131 양성세포, CD142 양성세포, CD147 양성세포, CD156a 양성세포, CD155 양성세포, CD157 양성세포, CD162 양성세포, CD163 양성세포, CD164 양성세포, CD168 양성세포, CD170 양성세포, CD171 양성세포, CD172a 양성세포, CD172b 양성세포, CD180 양성세포, CD184 양성세포, CD191 양성세포, CD192 양성세포, CD195 양성세포, CDw198 양성세포, CD206 양성세포, CDw210 양성세포, CD213a1 양성세포, CD213a2 양성세포, CD226 양성세포, CD277 양성세포, CD281 양성세포, CD282 양성세포, CD284 양성세포, CD295 양성세포, CD300a 양성세포, CD300c 양성세포, CD300e 양성세포, CD302 양성세포, CD305 양성세포, CD312 양성세포, CD317 양성세포, CD322 양성세포, CD328 양성세포, CD329 양성세포 중, 단독, 혹은 복수의 마커 조합으로 특징되는 세포이다.
「원시조혈」이란 원래, 태생초기에 난황낭에 있어서 일과성으로 일어나는 조혈이다. 본 명세서에 있어서, 조혈단계가 「원시」인 것은 예를 들면, 실시예 1 (5)공정 2에 기재된 방법에 의해 확인할 수 있다.
공정(c)에 있어서, 공정(b)에서 수득된 원시 단구를, 마이크로글리아로의 분화를 촉진시키는데 적합한 조건하에서 배양한다. 「마이크로글리아로의 분화를 촉진시키는데 적합한 조건 하」란 원시 단구와 아스트로사이트를 공생 배양하는 것, 또는 원시 단구를 아스트로사이트 상청액을 사용해서 배양하는 것을 의미한다. 더욱 구체적으로, 예를 들면, M-CSF의 존재하에서 원시 단구와, 아스트로사이트를 공생 배양하는 또는 아스트로사이트 상청액을 사용해서 배양한다. 추가로, IL-34가 존재하고 있을 수도 있다.
IL-34 및/또는 M-CSF의 농도는 마이크로글리아가 수득되는 농도라면 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, IL-34는 1ng/㎖∼200ng/㎖, 20ng/㎖∼150ng/㎖, 25ng/㎖∼100ng/㎖이다. M-CSF는 1ng/㎖∼200ng/㎖, 20ng/㎖∼150ng/㎖, 25ng/㎖∼100ng/㎖이다. 또, M-CSF는 효율적인 마이크로글리아의 제조에 대한 영향이 크고, 25ng/㎖ 이상이 특히 바람직하다.
「아스트로사이트 상청액」이란 신경조직에서 채취한 아스트로사이트를 영양배지 중에서 배양하는 것에 의해 수득된다. 예를 들면, 국제공개 제2006/028049호에 기재된 방법을 참고로 조제할 수 있다.
배양하는 기간은 「마이크로글리아로의 분화」하기에 충분한 일수인 한 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 3일 이상, 5일 이상, 7일 이상, 8일 이상의 기간 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는 7일 이상이다. 당업자는 사용하는 조건에 따라 적당하게 당해 배양기간을 조정할 수 있다.
기타의 배양조건은 공정(a)(상기 [0047])과 동일하다.
수득된 세포가 「마이크로글리아」이라는 것은 공지의 지표를 사용해서 확인할 수 있다. 예를 들면, 「마이크로글리아」란 Iba1 양성세포, CD1lb 양성세포, P2Y12 양성세포, P2X7 양성세포, P2X4 양성세포, IL-1β 양성세포, CX3CR1 양성세포, CCR2 양성세포, CCR7 양성세포, CD80 양성세포, CD209 양성세포, CD23 양성세포, CD163 양성세포, TREM2 양성세포, CD45 양성세포, P2X2 양성세포, CCL21 양성세포, IRF8 양성세포, IRF5 양성세포, TLR-4 양성세포, OX42 양성세포, CD14 양성세포, CD16 양성세포, 인테그린-α4 양성세포, 인테그린-β1 양성세포, CD68 양성세포 중, 단독, 혹은 복수의 마커 조합으로 특징되는 세포이다.
상기 마커 중, 예를 들면, Iba1 양성세포, CD1lb 양성세포 등은 마이크로글리아뿐만 아니라, 마크로파지에서도 발현하고 있다. 예를 들면, 이하의 어느 하나의 특징과 조합시키는 것에　의해서, 마크로파지가 아니라, 마이크로글리아라고, 판단하는 것이 가능하다.
- 마이크로글리아에 특징적인 형태(돌기)
-퓨린 작동성 수용체인 P2Y12의 발현
본 발명에 있어서, 특별히 기재한 없는 한, 배지는 기본 배지로서 작성할 수 있다. 그 기본 배지의 예로서는, IMDM 배지나 199배지, 이글 최소 필수 배지(EMEM), 알파-MEM 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 햄 F12 배지, RPMI1640 배지, 피셔 배지, 글래스고(Glasgow) MEM, 및 그것들의 혼합물을 들 수 있다. 기본 배지는 혈청 또는 사이토카인을 함유하고 있을 수도 있다.
접착형의 배양의 경우에는, 세포의 접착 특성의 향상을 위해서, 배양접시의 표면을 콜라겐I, 콜라겐IV, 젤라틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴, 매트리겔 TM(Becton, Dickinsonand Company) 등의 세포지지 기질로 코팅할 수도 있다.
본 발명에서 사용하는 VEGF, IL-3, IL-34, M-CSF, GM-CSF 등의 사이토카인은 천연의 것을 사용할 수도 있고, 유전자공학에 의해 조제하거나, 리콤비난트(recombinant) 사이토카인을 사용할 수도 있다. 그 때, 이것들의 사이토카인의 전장을 포함할 필요는 없고, 리셉터와의 결합에 관계되는 영역을 포함하는 일부분의 단백질이나 펩티드라도 좋다. 또, 리셉터와의 결합력을 잃지 않을 정도로 아미노산 서열이나 입체구조에 개변을 첨가한 단백질이나 펩티드이라도 좋다. 게다가, 이것들의 사이토카인의 리셉터에 대해서 아고니스트로서 기능할 수 있는 단백질이나 펩티드나 약제 등이더라도 좋다.
II. 스크리닝 방법
(마이크로글리아의 활성화가 관여하는 질환의 치료약 스크리닝 방법)
본 발명은 상기 I에 의해 수득된 마이크로글리아와 시험 물질을 접촉시키고, 마이크로글리아에 대해서 작용하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
「시험 물질」은 어떠한 공지 화합물 및 신규 화합물일 수도 있고, 예를 들면, 핵산, 당질, 지질, 단백질, 펩티드, 유기 저분자 화합물, 콤비나트리얼 케미스트리 기술을 사용해서 제작된 화합물 라이브러리, 고상합성이나 퍼지 디스플레이법에 의해 제작된 랜덤 펩티드 라이브러리, 혹은 미생물, 동식물, 해양생물 등 유래의 천연성분 등을 들 수 있다.
스크리닝의 방법에 있어서는, 상기 I에 의해 수득된 마이크로글리아를 시험 물질과 접촉시키고, 마이크로글리아로의 영향(예를 들면, 형태변화, 사이토카인 생산ㆍ방출, 탐식 등)의 정도를 측정한다. 그리고 그 정도와, 시험 물질과 접촉시키지 않은 마이크로글리아의 경우 정도를 비교해서 영향의 정도를, 시험 물질과 접촉시키지 않은 경우와 비교해서 현저하게 변화시키는 시험 물질을 효과적인 구성요소로 선택한다.
측정법에 있어서는, 당해 분야에서 공지 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면 마이크로글리아를 촬상해서 화상처리하는 것에 의해서 형태변화를 파악하거나, 배양 상청에 방출된 사이토카인의 농도를 ELISA법으로 측정하거나, 비드를 탐식한 상태를 화상처리에 의해 수치화할 수 있다.
이렇게 해서, 스크리닝된 시험 물질은 척수의 외상, 뇌졸중에 의한 신경장애, 간질, 신경 장애성 동통, 혈관 폐색성의 안질환, 탈수초 질환(다발성경화증, 귈랑바레 증후군 등), 정신질환(억울, 정신분열증, 자폐증, 발달 장애, 의존증 등), 뇌경색, 나수-하코라병, 신경변성질환(특히, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측색경화증 등) 등의 예방 혹은 치료제 또는 기억 혹은 학습능력 개선제로서 사용할 수 있다.
(오더 메이드 치료약을 스크리닝하는 방법)
본 발명에 있어서, 「오더 메이드 치료약」이란 어떤 환자 개인의 개성에 들어 맞은 최적의 치료약을 의미한다.
본 발명에서는, 척수의 외상, 뇌졸중에 의한 신경장애, 간질, 신경 장애성 동통, 혈관 폐색성의 안질환 또는 신경변성질환을 이환하는 대상의 체세포로부터 제조된 인공 다능성 줄기세포를 분화유도시키는 것에 의해 수득된 상기 마이크로글리아와 기존의 치료약을 접촉시키고, 마이크로글리아에 대해서 작용하는 치료약의 스크리닝 방법을 제공한다. 이렇게, 스크리닝된 치료약은 인공 다능성 줄기세포를 수립된 대상에 있어서 최적의 치료약이 될 수 있다.
본 발명에 있어서의 기존의 치료약으로서 예를 들면, 바클로펜, 티자니딘 등의 척수 외상 치료약, 페니토인, 페노바르비탈, 카르바마제핀, 밸프로산, 에톡삭시미드, 조니사미드, 가바펜틴, 토피라메이트, 라모트리진, 레비티라세탐 등의 간질약, 프레가발린 등의 신경 장애성 동통치료약, 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민, 메만틴 등의 알츠하이머병 치료약 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
실시예
이하에, 본 발명의 실시예를 참조해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 마이크로글리아의 제조
(1) 피더 세포(Mouse Embryonic Fibroblast; MEF)
마우스(계통; ICR)의 태자(E13.5)를 실체 현미경 하에서 해부하고, 탈혈 후 핀셋으로 두부, 손발, 내장을 제거했다. 남은 부위를 가위로 작게 썰고, 소화액(0.05% 트립신-에틸렌디아민 4초산(EDTA)(Invitrogen사)+1/1000 recombinant DNase(Takara사))을 태자 1체당 10㎖ 첨가했다. 실온에서 약 1시간, 스터러에서 교반하면서 분산하고, 등량의 배지 A(D-MEM(Sigma사)+10% 소 태아 혈청(FBS)(Equitech-Bio사)+1/100 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen사))을 첨가해서 효소반응을 정지시켰다. 세포분산액을 셀 스트레이너(70φ; BD Falcon사)에 통과시켜서 회수하고, 원심분리(300G, 3분) 후 상청액을 제외했다. 펠릿을 배지 A에 재현탁해서 계수 후, 30분간 0.1% 젤라틴(Sigma사)/인산 완충 생리식염수(PBS)(wako사) 코팅한 플라스크(150㎠; TPP사)에 4×106개/플라스크로 파종했다. 3일간 배양 후, PBS로 세정 후, 0.05% 트립신-EDTA를 첨가해서 세포를 박리시켰다. 등량의 배지 A를 첨가해서 효소반응을 정지시키고 회수하고, 원심분리 후의 펠릿을 셀 벙커1(Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.)에 현탁해서 동결보존했다. 다음에 동결보존한 세포를 해동시키고, 상기와 동일한 조건으로 젤라틴 코팅한 플라스크에 2×106개/플라스크로 파종했다. 3일간 배양 후, 상기와 동일한 수법으로 세포를 박리시키고, 새롭게 상기와 같은 조건으로 젤라틴 코팅한 플라스크에 2×106개/플라스크로 파종했다. 3일간 배양 후, 플라스크내의 배지를 배지 A에 10㎍/㎖의 미토마이신C(MMC; Sigma사)를 첨가한 것으로 교환해서 증식을 정지시키고, 90분 배양 후에 PBS로 세정한 후에, 상기와 동일한 수법으로 세포를 박리시켰다. 수득된 세포는 상기와 동일한 수법으로 동결보존했다. 동결보존한 MMC처리된 MEF는 사용하는 전날에 해동시키고, 젤라틴 코팅한 10cm 세포배양 디쉬에 5×105개/디쉬로 파종했다.
(2) hiPS 세포
도쿄대학 스템 셀 뱅크에서 구입한 TkDA3-4주와 교토대학 iPS 세포연구소에서 구입한 201B7주를 사용했다.
피더 세포는(1)에 기재된 방법으로 제작한 MEF를 사용하고, 배지는 DMEM(Invitrogen사) + 20% KnockOut Serum Replacement(KSR)(Gibco사) + 1/100 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen사)로 하고, 세포 박리액은 Dissociation Solution(Repro CELL사)를 사용했다.
(3) Stromal 세포(10T1/2)
독립행정법인 이화학연구소 바이오 리소스 센터로부터 입수했다.
배지는 BME(Invitrogen사) + 10% 소 태아 혈청(FCS)(Hyclone사) + 1/100 GlutaMAX1(Invitrogen사)+1/100 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen사)), 세포박리액은 0.05% 트립신-EDTA(Invitrogen사)를 사용했다.(150㎠ 플라스크에서 계대 유지하고, 주 2회의 빈도로 계대하고, 매회 약 1/8배(1플라스크의 세포를 약 8플라스크에 계대)의 세포밀도로 했다(5×105∼5×106개/플라스크의 범위 내로 유지). 계대수 p30까지의 물을 MMC에 의한 증식저해를 한 후에 사용했다. MMC 처리된 10T1/2는 젤라틴 코팅한 10cm 세포배양 디쉬 상에 1×106개/디쉬로 파종했다.
(4) 초대배양 랫트 아스트로사이트
신생태아(P5-7)부터 대뇌를 분리하고, 실체 현미경 하에서 핀셋을 사용해서 수막을 벗겼다. 배지B(AdDMEM/F12(Invitrogen사) + 10% 소 태아 혈청(FCS)(Hyclone사) + 1/100 GlutaMAX1(Invitrogen사)+1/100 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen사))을 첨가해서 피펫팅하는 것에 의해, 기계적으로 뇌를 파괴해서 분산시켰다. 정치시켰을 때의 상청액을 회수하고, 셀 스트레이너(100Φ; BDFalcon사)에 통과시켜서 원심분리(200G 4분)하고, 펠릿을 회수했다. 수득된 세포를 배지B에 재현탁하고, 계수 후 폴리-D-리신(PDL)코팅 플라스크(75㎠; BD사)에 5×105개/플라스크로 파종했다. 파종 2일 및 5일 후에 배지B를 교환(쉐이커에서 3시간 진탕 후) 고, 7일간 배양한 것을 사용했다. 세포회수전에 쉐이커에서 3시간 진탕하고, 배지B를 PBS로 치환한 후에 추가로 5시간 진탕 했다. PBS를 제거 후에 0.25% 트립신-EDTA(NACALAI TESQUE, INC.)을 첨가하고, 쉐이커로 3분 진탕 후에 등량의 배지B에서 효소반응을 정지 후 회수했다. 수득된 세포는 원심분리(300G 3분) 하고, 펠릿을 셀 벙커에서 동결보존했다. 동결보존한 아스트로사이트를 해동시키고, 젤라틴 코팅한 10cm 세포배양 디쉬에 2.5×105개/디쉬로 파종하고, 4일 후에 배지B를 교환, 7일째에 공생 배양용 배지C(DMEM(Invitrogen사) + 10% FCS(Hyclone사) + 1/100 GlutaMAX1(Invitrogen사)+1/100 피루브산 나트륨(Invitrogen사) + 1/100HEPES(Invitrogen사) + 1/100 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen사))로 교환 후 3시간 배양하고 나서 사용했다.
(5) 분화유도
공정 1
(2)에 기재된 방법으로 계대한 hiPS 세포가 접착한 10cm 세포배양 디쉬를 PBS로 세정하고, Dissociation Solution(ReproCELL사)를 1.5㎖ 첨가하고, 흔들면서 MEF를 벗겨냈다. 벗겨진 MEF를 아스피레이터로 흡수하고, 추가로 PBS로 세정 후, 분화 배지D(IMDM(Invitrogen사) + 15% 소 태아 혈청(FCS)(EquitechLab사) + 1/100 GlutaMAX1)(Invitrogen사) + 1/100ITS-X(Invitrogen사) + 0.5mmol/l모노티오글리세롤(wako사) + 50㎍/㎖ L-아스코르브산 인산 에스테르 마그네슘염n수화물(wako사) + 1/100 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen사))을 10㎖ 첨가하고, 셀 스크레이퍼(scraper)로 hiPS 세포를 긁었다. 수득된 hiPS 세포를(3)에 기재된 방법으로 계대한 10T1/2 상에 1/40(1디쉬의 세포를 약 40디쉬로 파종)의 밀도로, 20ng/㎖VEGF(PEPROTECH사; 비특허문헌 4: Blood 2008 111: 5298-5306에 의하면 첨가하지 않을 수도 있다)을 첨가해서 파종했다. 파종 3, 6, 8, 10, 12일 후에 분화 배지E(IMDM(Invitrogen사) + 15% 소 태아 혈청(FCS)(EquitechLab사) + 1/100 GlutaMAX1)(Invitrogen사) + 1/100ITS-G(Invitrogen사) + 0.5mmol/l모노티오글리세롤(wako사) + 50㎍/㎖ L-아스코르브산 인산 에스테르 마그네슘염n수화물(wako사)+1/100 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen사))에 20ng/㎖ VEGF(PEPROTECH사; 비특허문헌 4에 의하면 첨가하지 않을 수도 있다)를 첨가한 것으로 교환하고, 13일째에 회수했다. 셀 스크레이퍼(scraper)로 Sac를 파괴하면서 세포배양 디쉬로부터 벗겨내고, 셀 스트레이너(40Φ)를 통해서 회수했다. 원심분리(120G(100∼150G로 회수율과 순도에 영향이 없는 것을 확인했다) 10분 브레이크없음)한 펠릿을 분화 배지E에 재현탁했다. 수득된 세포는 약 50%가 CD34 양성이라는 점에서, 혈액 전구세포를 제작할 수 있었다고 판단했다.
공정 2
공정 1에서 수득된 혈액 전구세포를, 50ng/㎖ 에리트로포이에틴(PEPROTECH사)를 첨가해서 10T1/2 상에서 배양해서 수득된 적혈구의 헤모글로빈형이 6일째까지 모두 태아형이라는 점에서 혈액 전구세포로부터의 분화유도 6일째까지는 모두가 원시조혈이라고 판단했다.
공정 1에서 수득된 전세포에 50ng/㎖ IL-3(PEPROTECH사)와 50ng/㎖ GM-CSF(PEPROTECH사)를 첨가해서 세포배양 디쉬 5장분의 재현탁액을 1장의 세포배양 디쉬 내의 10T1/2 상에 파종했다. 3일 후에 50ng/㎖ IL-3과 50ng/㎖ GM-CSF를 포함하는 분화 배지E를 5㎖ 추가하고, 6일 후에 피펫팅에 의해 회수했다. 회수한 세포 현탁액을 원심분리(300G 3분)하고, 펠릿의 세포가 모두(100%) CD14 양성이라는 점에서, 6일째까지는 원시조혈인 것과 합쳐서 판단하고, 이들을 원시 단구로 했다.
공정 3
공정 2에서 수득된 원시 단구는 공생 배양용 배지F(DMEM(Invitrogen사) + 10% FCS(EquitechLab사) + 1/100 GlutaMAX1(Invitrogen사) + 1/100피루브산 나트륨(Invitrogen사) + 1/100HEPES(Invitrogen사) + 1/100 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen사))에서 재현탁하고, 50ng/㎖ M-CSF(PEPROTECH사)와 50ng/㎖ IL-34(PEPROTECH사)를 첨가하고, (4)에 기재된 초대배양 랫트 아스트로사이트 상에 1/2의 밀도로 파종했다. 파종 2일 후에 배지F에 50ng/㎖ M-CSF와 50ng/㎖ IL-34을 첨가한 배지를 5ml 추가하고, 4일 및 7일째에는 배지를 7㎖ 회수해서 원심분리(300G 3분)하고, 상기의 배지F에 M-CSF와 IL-34를 첨가한 배지에 50ng/㎖ TGF-β1(PEPROTECH사; 넣지 않아도 분화율에 영향이 없다)을 첨가한 배지 8㎖에서 펠릿을 재현탁해서 되돌렸다. 파종 9일 후(25일 후까지는 동일한 결과가 수득되었다)에 피펫팅에 의해 세포를 회수했다.
(6) Iba1 면역염색
(5)에 기재된 방법에서 회수한 세포를 PDL/라미민 코팅 플레이트(Biocoat; Corning사)에 파종하고, 다음날 접착세포를 4% 파라포름알데히드(PFA)/PBS를 사용해서 4℃에서 1시간 고정했다. 고정한 세포는 PBS로 3회 세정 후, 0.1% TritonX-100/PBS로 5분 처치하고, PBS로 3회 세정후 에 블록킹 용액(1.5% 당나귀 혈청/PBS)으로 30분 처치했다. 다음에 1/50 항Iba1 항체(Abcam사)/블록킹 용액을 4℃에서 하룻밤 반응시키고, PBS로 3회 세정 후에 1/500 AlexaFluor 488 donkey anti-goatIgG(H+L) + 1/10,000 Hoechst 33342(Invitrogen사)/블록킹 용액을 첨가해서 90분 반응시켰다. 마지막으로 PBS로 3회 세정하고, 형광현미경관찰했다.
형광현미경으로 촬영한 상을 도 1에 나타낸다. 회수한 세포의 전부(100%)가 Iba1 양성이고, 돌기를 신장하고 있었다(도 2). 이것은 본 방법에 의해, hiPS 세포에서 분화된 세포가 마이크로글리아인 것임을 나타내고 있다.
실시예 2: 피더 프리 iPS 세포를 사용한 마이크로글리아의 제조
(1) 피더 프리 iPS 세포의 유지 배양
도쿄대학 스템 셀 뱅크에서 구입한 TkDA3-4주를 사용했다. 코팅에는 iMatrix-511(nippi사)를, 박리액에는 0.5×Tripleselect(Triple TM select CTS(Invitrogen사)와 0.5mol/lEDTA pH8.0(NacalaiTesque사), PBS(Wako사)를 2:1:1로 혼합한 것), 배지는 AK03N(Ajinomoto사)를 사용했다.
(2) 분화유도
공정 1
(1)에 기재된 방법에서 계대한 iPS 세포가 접착한 6구멍 세포접착 플레이트를 PBS로 세정하고, ReLeSR(STEM CELL Technologies사)를 1㎖/well 첨가하고, 37℃에서 10분간 처치했다. 재차 PBS로 세정 후, 분화 배지D를 10㎖ 첨가하고, 셀 스크레이퍼(scraper)로 hiPS 세포를 긁어 냈다. 수득된 hiPS 세포를 실시예 1의(3)에 기재된 방법으로 계대한 10T1/2 상에 약 1/10(6well 플레이트 1well분의 세포를 10cm 디쉬2 디쉬에 파종)의 밀도로, 20ng/㎖ VEGF(PEPROTECH사; 비특허문헌 4에 의하면 첨가하지 않을 수도 있다)를 첨가해서 파종했다. 파종 3, 6, 8, 10, 12일 후에 분화 배지E에 20ng/㎖ VEGF(PEPROTECH사; 비특허문헌 4에 의하면 첨가하지 않을 수도 있다)를 첨가한 것으로 교환하고, 13일째에 회수했다. 셀 스크레이퍼(scraper)로 Sac를 파괴하면서 세포배양 디쉬로부터 벗겨내고, 셀 스트레이너(40Φ)을 통해서 회수했다. 원심분리(120G(100∼150G로 회전률과 순도에 영향이 없는 것을 확인했다) 10분 브레이크없음)한 펠릿을 분화 배지E에 재현탁했다.
공정 2
공정 1에서 수득된 전세포에 IL-3(50ng/㎖; PEPROTECH사)와 GM-CSF(50ng/㎖; PEPROTECH사)를 첨가해서 세포배양 디쉬 5장분의 재현탁액을 1장의 세포배양 디쉬 내의 10T1/2 상에 파종했다. 3일 후에 IL-3과 GM-CSF를 포함하는 분화 배지E를 5㎖ 추가하고, 6일후에 피펫팅에 의해 회수했다.
공정 3
공정 2에서 수득된 원시 단구는 공생 배양용 배지F에서 재현탁하고, 50ng/㎖ M-CSF(PEPROTECH사)와 50ng/㎖ IL-34(PEPROTECH사)를 첨가하고, 실시예 1의 (4)에 기재된 초대 배양 랫트 아스트로사이트 상에 1/2의 밀도로 파종했다. 파종 2일 후에 혈구분화 배지F에 M-CSF와 IL-34를 첨가한 배지를 5㎖ 추가하고, 4일 및 7일째에는 배지를 7㎖ 회수해서 원심분리(300G 3분)하고, 상기의 혈구 분화 배지F에 M-CSF와 IL-34을 첨가한 배지에 50ng/㎖ TGF-β1(PEPROTECH사; 들어갈 수 없어도 분화율에 영향이 없는 것을 확인했다)을 첨가한 배지 8㎖에서 펠릿을 재현탁해서 되돌렸다. 파종 9일후에 피펫팅에 의해 세포를 회수했다.
(3) Iba1 면역염색
공정 3에서 회수한 세포를 PDL/라미민 코팅 플레이트(Biocoat;Corning사)에 파종하고, 다음날 접착세포를 4% 파라포름알데히드(PFA)/PBS를 사용해서 4℃에서 1시간 고정했다. 고정한 세포는 PBS로 3회 세정 후, 0.1% TritonX-100/PBS로 5분 처치하고, PBS로 3회 세정 후에 블록킹 용액(1.5% 당나귀 혈청/PBS)으로 30분 처치했다. 다음에 1/50 항Iba1 항체(Abcam사)/블록킹 용액을 4℃에서 하룻밤 반응시키고, PBS로 3회 세정 후에 1/500 AlexaFluor 488 donkey anti-goatIgG(H+L) + 1/10, 000 Hoechst 33342(Invitrogen사)/블록킹 용액을 첨가해서 90분 반응시켰다. 마지막으로 PBS로 3회 세정하고, 형광현미경 관찰했다. 그 결과, 회수한 세포의 전부(100%)가 Iba1 양성이고, 돌기를 신장하고 있었다. 이것은 본 방법에 의해, 피더 프리 hiPS 세포보다 분화된 세포가 마이크로글리아인 것임을 나타내고 있다.
실시예 3: 혈액 전구세포 제작 단계의 분화 유도 기간검토
(1) 분화유도
공정 1
실시예 1의 (2)에 기재된 방법으로 계대한 hiPS 세포가 접착한 10cm 세포배양 디쉬를 PBS로 세정하고, Dissociation Solution(ReproCELL사)를 1.5㎖ 첨가하고, 흔들면서 MEF를 벗겨냈다. 벗겨진 MEF를 아스피레이터로 흡수하고, 추가로 PBS로 세정 후, 분화 배지D를 10㎖ 첨가하고, 셀 스크레이퍼(scraper)로 hiPS 세포를 긁어 냈다. 수득된 hiPS 세포를 실시예 1의 (3)에 기재된 방법으로 계대한 10T1/2 상에 1/40(1디쉬의 세포를 약 40디쉬로 파종)의 밀도로, 20ng/㎖ VEGF(PEPROTECH사; 비특허문헌 4에 의하면 첨가하지 않을 수도 있다)를 첨가해서 파종했다. 파종 3, 6, 8, 10, 12일 후에 분화 배지E에 20ng/㎖ VEGF(PEPROTECH사; 비특허문헌 4에 의하면 첨가하지 않을 수도 있다)를 첨가한 것으로 교환하고, 임의의 일수 배양 후 회수했다. 셀 스크레이퍼(scraper)로 Sac를 파괴하면서 세포배양 디쉬로부터 벗겨내고, 셀 스트레이너(40Φ)을 통해서 회수했다. 원심분리(120G(100∼150G로 회수율과 순도에 영향이 없는 것을 확인했다) 10분 브레이크없음)한 펠릿을 분화 배지E에 재현탁했다.
공정 2∼공정 3
실시예 2의 공정 2∼공정 3과 동일한 방법으로 실시했다.
(2) Iba1 면역염색
실시예 2의 (3)과 동일한 방법으로 실시했다.
혈액 전구세포제작 기간을 6, 13, 20, 27일로 설정해서 마이크로글리아로의 분화유도를 실시한 바, 모든 조건에서 마이크로글리아 제작 가능하지만, 특히 13∼27일에 있어서 마이크로글리아 분화유도 효율이 좋았다.
실시예 4: 원시 단구 제작단계의 분화 유도 기간검토
(1) 분화유도
공정 1
실시예 1의 (2)에 기재된 방법으로 계대한 hiPS 세포가 접착한 10cm 세포배양 디쉬를 PBS로 세정하고, Dissociation Solution(ReproCELL사)를 1.5㎖ 첨가하고, 흔들면서 MEF를 벗겨냈다. 벗겨진 MEF를 아스피레이터로 흡수하고, 추가로 PBS로 세정 후, 분화 배지D를 10㎖ 첨가하고, 셀 스크레이퍼(scraper)로 hiPS 세포를 긁어냈다. 수득된 hiPS 세포를 실시예 1의 (3)에 기재된 방법으로 계대한 10T1/2 상에 1/40(1디쉬의 세포를 약 40디쉬로 파종)의 밀도로, 20ng/㎖ VEGF(PEPROTECH사; 비특허문헌 4에 의하면 첨가하지 않을 수도 있다)를 첨가해서 파종했다. 파종 3, 6, 8, 10, 12일 후에 분화 배지E에 20ng/㎖ VEGF(PEPROTECH사; 비특허문헌 4에 의하면 첨가하지 않을 수도 있다)를 첨가한 것으로 교환하고, 13일째에 회수했다. 셀 스크레이퍼(scraper)로 Sac를 파괴하면서 세포배양 디쉬로부터 벗겨내고, 셀 스트레이너(40Φ)을 통해서 회수했다. 원심분리(120G(100∼150G로 회수율과 순도에 영향이 없는 것을 확인했다) 10분 브레이크없음)한 펠릿을 분화 배지E에 재현탁했다.
공정 2
공정 1에서 수득된 전세포에 IL-3(50ng/㎖; PEPROTECH사)와 GM-CSF(50ng/㎖; PEPROTECH사)를 첨가해서 세포배양 디쉬 5장분의 재현탁액을 1장의 세포배양 디쉬 내의 10T1/2 상에 파종했다. 3일 후에 IL-3과 GM-CSF를 포함하는 분화 배지E를 5㎖ 추가하고, 임의의 기간배양 후에 피펫팅에 의해 회수했다. 회수한 세포 현탁액을 원심분리(300G 3분)하고, 펠릿의 세포를 다음 공정에 적용했다.
공정 3
공정 2에서 수득된 단구는 공생 배양용 배지F에서 재현탁하고, M-CSF(50ng/㎖; PEPROTECH사)와 IL-34(50ng/㎖; PEPROTECH사)를 첨가하고, 실시예 1의 (4)에 기재된 초대 배양 랫트 아스트로사이트 상에 1/2의 밀도로 파종했다. 파종 2일 후에 배지F에 M-CSF와 IL-34를 첨가한 배지를 5㎖ 추가하고, 4일 및 7일째에는 배지를 7㎖ 회수해서 원심분리(300G 3분)하고, 배지F에 M-CSF와 IL-34를 첨가한 배지에 TGF-β1(50ng/㎖; PEPROTECH사; 첨가하지 않아도 분화율에 영향이 없는 것을 확인했다)을 첨가한 배지 8㎖에서 펠릿을 재현탁해서 되돌렸다. 파종 9일후에 피펫팅에 의해 세포를 회수했다.
(2) Iba1 면역염색
실시예 2의( 3)과 동일한 방법으로 실시했다.
단구 유도 일수를 0(공정 2를 스킵한 것을 편의상 0일이라고 표기했다), 1, 6, 10, 13, 17, 20일로 실험한 바, 모든 유도 일수에 있어서 마이크로글리아를 효율 높게 제작할 수 있었다.
실시예 5: 사이토카인 농도 검토
(1) 분화유도
공정 1
실시예 4의 공정 1과 동일한 방법으로 혈액 전구세포를 제작했다.
공정 2
공정 1에서 수득된 전세포에 각각 임의의 농도로 IL-3(PEPROTECH사)와 GM-CSF(PEPROTECH사)를 첨가해서 세포배양 디쉬 5장분의 재현탁액을 1장의 세포배양 디쉬 내의 10T1/2 상에 파종했다. 3일 후에 세포파종 시와 동일한 농도의 IL-3과 GM-CSF를 포함하는 분화 배지E를 5㎖ 추가하고, 6일간 배양 후에 피펫팅에 의해 회수했다. 회수한 세포 현탁액을 원심분리(300G 3분)하고, 펠릿의 세포를 다음 공정에 적용했다.
공정 3
공정 2에서 수득된 단구는 공생 배양용 배지F에서 재현탁하고, 각각 임의의 농도로 M-CSF(PEPROTECH사)와 IL-34(PEPROTECH사)를 첨가하고, 실시예 1의 (4)에 기재된 초대 배양 랫트 아스트로사이트 상에 1/2의 밀도로 파종했다. 파종 2일 후에 배지F에 M-CSF와 IL-34을 세포 파종시와 동일한 농도로 첨가한 배지를 5㎖ 추가하고, 4일 및 7일째에는 배지를 7㎖ 회수해서 원심분리(300G 3분)하고, 상기의 배지F에 M-CSF와 IL-34을 세포파종시와 동일한 농도로 첨가한 배지에 TGF-β1(PEPROTECH사)를 첨가한 배지 8㎖에서 펠릿을 재현탁해서 되돌렸다. 파종 9일후에 피펫팅에 의해 세포를 회수했다.
(2) Iba1 면역염색
실시예 2의 (3)과 동일한 방법으로 실시했다. 결과를 표 1에 정리한다. 실시예 1의 결과를 기준으로 해서, 동등한 분화유도 효율을 0, 1/10 이하의 분화유도 효율을 △로 했다.각 사이토카인 농도는 각각 0, 25, 50, 100ng/㎖로 실험을 실시하고, 모든 조건에서 마이크로글리아를 제작 가능했다. 공정 2에서는 IL-3을 25ng/㎖ 이상, 혹은 GM-CSF를 50ng/㎖ 이상 첨가하면, 특히 분화유도 효율이 좋았다. 공정 3에서는 M-CSF를 25ng/㎖ 이상으로 첨가하면 특히 효율이 좋았다.
Figure 112019026652432-pct00001
(산업상의 이용가능성)
본 발명의 방법에 의해, 다능성 줄기세포로부터 효율적으로 마이크로글리아를 제조할 수 있다. 수득되는 마이크로글리아는 마이크로글리아 자체의 연구, 마이크로글리아가 관련되는 질환의 연구 등, 여러 가지 기초 연구에 이용 가능하다. 또, 마이크로글리아를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이크로글리아가 관여하는 질환의 치료약 스크리닝 방법, 또는, 개개의 환자로부터 수립한 마이크로글리아를 사용해서 개인에게 최적인 치료약을 선별하는, 소위 오더 메이드 치료약의 선택에 있어서 매우 유용하다. 또, 세포치료로의 이용도 기대된다.

Claims (11)

  1. 이하의 공정을 포함하는 다능성 줄기세포로부터 마이크로글리아를 제조하는 방법:
    (a) 다능성 줄기세포를 7일간 이상 피더 세포와 공생 배양하고, 혈액 전구세포를 얻는 공정,
    (b) 공정(a)에서 수득된 혈액 전구세포를 IL-3 및/또는 GM-CSF의 존재하에서 피더 세포와 공생 배양하고, 원시 단구를 얻는 공정, 및
    (c) 공정(b)에서 수득된 원시 단구를 M-CSF의 존재하에서 아스트로사이트와 공생 배양 또는 아스트로사이트 상청액을 사용해서 배양하는 공정.
  2. 제1 항에 있어서, 공정(a)의 배양기간이 13일 이상인 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 공정(c)에서, IL-34의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1 항에 있어서, 공정(b)에서, IL-3 및 GM-CSF의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항에 있어서, 피더 세포가 10T1/2 세포 또는 OP9 세포인 방법.
  6. 제1 항에 있어서, 공정(a)에서, VEGF의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기세포가 iPS 세포인 방법.
  8. 제7 항에 있어서, iPS 세포가 인간 또는 마우스 유래인 방법.
  9. (a) 다능성 줄기세포를 7일간 이상 피더 세포와 공생 배양하고, 혈액 전구세포를 얻는 공정,
    (b) 공정(a)에서 수득된 혈액 전구세포를 IL-3 및/또는 GM-CSF의 존재하에서 피더 세포와 공생 배양하고, 원시 단구를 얻는 공정,
    (c) 공정(b)에서 수득된 원시 단구를 M-CSF의 존재하에서 아스트로사이트와 공생 배양 또는 아스트로사이트 상청액을 사용해서 배양하는 공정, 및
    (d) 공정(c)에서 제조된 마이크로글리아를 사용하여 마이크로글리아가 관여하는 질환의 예방 혹은 치료제 또는 기억 혹은 학습능력 개선제를 스크리닝하는 공정을 포함하는,
    마이크로글리아가 관여하는 질환의 예방 혹은 치료제 또는 기억 혹은 학습능력 개선제를 스크리닝하는 방법.
  10. 제9 항에 있어서, 마이크로글리아가 관여하는 질환이 척수의 외상, 뇌졸중에 의한 신경장애, 간질, 신경 장애성 동통, 혈관 폐색성의 안질환, 탈수초 질환, 정신질환, 뇌경색, 나수-하코라병 또는 신경변성질환인 스크리닝 방법.
  11. 제10 항에 있어서, 신경변성질환이 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 근위축성 측색경화증인 스크리닝 방법.
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