KR102249897B1 - 부티르산 생산능, 유해세균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 obl_1 균주 및 이의 용도 - Google Patents
부티르산 생산능, 유해세균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 obl_1 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 부티르산 생산능, 유해세균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) OBL_1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주는 염증 또는 혈전증 개선을 위한 식품 및 치료제 개발 그리고 항균제 및 부티르산 생산 등의 관련 산업 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 부티르산 생산능, 유해세균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상이 나타나는 것을 의미한다. 정상인 경우 염증반응은 외부 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부 물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.
현재까지는 염증 반응의 물리적 불편함을 감소시키는 제약학적 제제를 투여하여 치료하고 있으나 일반적인 항염증성 약제는 광범위한 질병의 치료에 사용되고, 동일한 약제가 종종 상이한 질병의 치료에 이용되는 경우가 있기 때문에 치료작용 및 부작용을 공유하게 된다. 따라서 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 염증 질환 치료제 개발은 필수적이고 시급한 실정이며, 부작용에 대한 우려가 없는 인체에 안전한 항염제의 필요성이 대두되고 있다.
한편, 대부분의 클로스트리디움 균은 강력한 독성을 갖는 미생물로 분류된다. 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)이 생산하는 독소 1g이면 사람 수 백명을 괴사시킬 수 있는 강력한 독성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 그런데 유일하게도 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)은 독성이 없고 유기물분해가 뛰어나며 포도당을 분해하여 초산과 낙산을 생산하는 그람양성의 편성혐기성균이다. 이 균은 초산과 낙산 생산능력이 우수하며 내생포자를 형성하여 생존율이 우수하고 포자를 형성한 경우 열에 강하고 장기간 생존이 유지되는 특징이 있다. 클로스트리디움 부티리쿰은 장내 유익한 균으로 유산균과의 공생이 가능하고 많은 종류의 비타민 B군 등을 생산하여 유산균이 이용할 수 있게 한다. 또한 클로스트리디움 부티리쿰이 생산한 유기산인 초산과 낙산은 장관상피세포로 흡수되어 상피세포에서 에너지원으로 사용되어 상피세포의 성장을 촉진하는 역할을 한다.
한편, 한국등록특허 제1873629호에는 '병원성 미생물에 대한 길항능을 가지는 신규한 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 이용'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1773059호에는 '면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '유해세균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제 억제 활성, 지질과산화 억제 활성 및 부티르산 생산능을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주 및 이의 용도'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 막걸리로부터 분리한 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) OBL_1 균주(KCTC14060BP)가 장출혈성 대장균에 대해 항균 활성이 있고, 부티르산 생산능을 가지며, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 부티르산(butyric acid) 생산능, 유해세균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제(lipoxygenase) 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 가지며, 기탁번호가 KCTC14060BP인 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) OBL_1 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 유해세균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 부티르산 생산용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주는 장출혈성 대장균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제 억제 활성, 지질과산화물 생성 억제 활성 및 부티르산(butyric acid) 생산능을 가지므로, 염증 또는 혈전증 개선을 위한 식품 및 치료제 개발 그리고 항균제 및 부티르산 생산 등의 관련 산업 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분리·동정한 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) OBL_1 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 리폭시게나아제(lipoxygenase) 억제 활성을 나타낸 것이다. IDM: 양성대조군으로 사용한 인도메타신(indomethacin).
도 3은 본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 부티르산(butyric acid) 생산능을 나타낸 것이다. Control: 증류수 처리군.
도 4는 본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 지질과산화물 생성 억제 활성을 나타낸 것이다. Control: 증류수 처리군.
도 5는 본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 혈전분해 활성을 나타낸 것이다. Control: 증류수 처리군.
도 2는 본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 리폭시게나아제(lipoxygenase) 억제 활성을 나타낸 것이다. IDM: 양성대조군으로 사용한 인도메타신(indomethacin).
도 3은 본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 부티르산(butyric acid) 생산능을 나타낸 것이다. Control: 증류수 처리군.
도 4는 본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 지질과산화물 생성 억제 활성을 나타낸 것이다. Control: 증류수 처리군.
도 5는 본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 혈전분해 활성을 나타낸 것이다. Control: 증류수 처리군.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 부티르산(butyric acid) 생산능, 유해세균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제(lipoxygenase) 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 가지며, 기탁번호가 KCTC14060BP인 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) OBL_1 균주를 제공한다.
본 발명에서는 막걸리로부터 부티르산 생산능, 유해세균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 균주를 분리·동정하였으며, 이를 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) OBL_1 균주로 명명하여 한국생명공학연구원(KCTC)에 2019년 12월 5일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC14060BP).
본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주(KCTC14060BP)가 항균 활성을 보이는 상기 유해세균은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양의로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 안전성 면에서 아무런 문제가 없는 범위의 양으로 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 상기 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예를 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토쥬스 등), 식혜 등을 포함한다.
본 발명의 건강기능식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 저해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한, 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 염증성 질환은 기관지염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 아토피성 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 건선, 아나필락시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염 및 만성 전립선염 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 건조물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10×109 CFU로 투여하는 것이 좋으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 유해세균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
"항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 세균의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해세균은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항균 조성물은 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 건조물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 당질은 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alcalase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "혈전증"이란, 혈전에 의해 발생되는 질환으로, 혈전색전증이라고도 하며, 특히 혈전에 의해 혈관이 막힌 질환을 일컫는다.
용어 "혈전"은 주로 혈소판과 세포성분을 둘러싼 섬유소로 구성된 혈액성분의 응집을 말하며, 혈액의 기타 형성된 혈액 요소와 뒤섞인 것으로 주로 혈소판 및 피브린의 응집물로 이루어진다.
상기 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽, 발포정 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 건강기능식품 조성물은 혈전분해 활성을 증가시키기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물을 식품첨가물로 사용하는 경우 식품의 종류, 식품 제조시 통상적으로 첨가되는 성분은 상기 전술한 바와 같다.
본 발명은 또한, 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항혈전 약학 조성물이 예방 또는 치료 효과를 가지는 질병은 다양하고, 예를 들어 고혈압, 심장병, 뇌졸증, 심근경색 등이 있으나, 이에 제한되지 않으며, 혈전 및 혈소판의 응집으로 유발되는 질병은 모두 이에 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 조합으로 사용될 수 있으며, 본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 상기 전술한 바와 같다.
본 발명은 또한, 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 부티르산 생산용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 부티르산을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 의해 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 분리 및 동정
막걸리 시료를 생리식염수에 희석한 후 LB 배지(1% sucrose, 1% yeast extract, 0.15% NaH2PO4)에 접종하고 배지가 든 플라스크를 구연산 및 탄산수소나트륨(1:2) 혼합물과 물이 들어간 통에 두고 이산화탄소가 발생되기 시작하면 통 뚜껑을 닫고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후에, 배양액을 고체 배지에 도말하여 형성된 콜로니를 선별하여 순수분리하였다. 선별 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열(서열번호 1) 분석을 통해 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)으로 판명되었으며, 표준 균주의 16S rRNA 염기서열을 토대로 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과, 클로스트리디움 부티리쿰 AB075768과 가장 가까운 근연관계로 확인되었다(도 1). 최종적으로, 선발된 균주를 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주로 명명하고 한국생명공학연구원(KCTC)에 2019년 12월 5일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC14060BP).
실시예 2. 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 항균 활성
장출혈성 대장균(Escherichia coli) O157:H7(ATCC 43894)은 ATCC(American Type Culture Collection)로 부터 분양받아 지시균주로 사용하였으며, 측정 방법은 디스크 확산법을 이용하였다. LB(Luria-Bertani) 배지에서 37℃, 24시간 동안 배양한 장출혈성 대장균(Escherichia coli) O157:H7 배양액 200㎕를 LB 아가 플레이트에 도말하고, 멸균된 10㎜ 여과지 디스크를 단단하게 플레이트에 놓았다. OBL_1 균주는 배지(표 1)에서 37℃, 24시간 동안 배양한 후 배양액을 상기 페이퍼 디스크에 처리한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 페이퍼 디스크 주변의 억제환(clear zone)의 직경을 측정하였으며, 음성 대조군으로는 증류수를 사용하였다. 그 결과, 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주는 대장균 O157:H7에 대해 우수한 항균력을 나타내었다(표 2).
구성 | w/v(%) |
Glucose | 2.44 |
Yeast extract | 2.08 |
Tryptone | 1 |
(NH4)2SO4 | 0.1 |
NaHCO3 | 0.1 |
MnSO4·H2O | 0.02 |
MgSo4·7H2O | 0.02 |
CaCl2 | 0.002 |
유해 세균 | 억제환 직경크기 |
Escherichia coli O157:H7 | 2.3 cm |
실시예 3. 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 리폭시게나아제 억제 활성
리폭시게나아제(lipoxygenase)는 정상적인 세포에서는 발현이 미비하지만, 염증이 유발되면 류코트리엔(leukotrienes) 물질의 증가로 인해 활성을 나타낸다. 본 실시예 3에서는 OBL_1 균주 배양액(OD600=1.0) 100㎕와 200mM 보레이트 완충액(borate buffer, pH 9.0) 1㎖을 넣은 후 기질인 리놀렌산(linoleic acid, 0.6 mM/㎖ in ethanol) 2㎖을 추가하여 혼합한 후 234nm에서 보정값을 측정한 다음, 상기 혼합물에 리폭시게나아제 10,000 unit/㎖ 100㎕를 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후 234nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성대조군은 인도메타신(indomethacin, Sigma)을 0.05%(w/v)로 에탄올에 녹여서 사용하였다. 리폭시게나아제 억제 활성(%)은 다음과 같은 식에 의해 산출되었다.
리폭시게나아제 억제 활성(%)={1-(b'-b)/(a'-a)}×100
a: 효소 무첨가군
a': 효소 첨가군
b: 효소 무첨가 및 시료 첨가군
b': 효소 및 시료 첨가군
그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주는 양성대조군으로 사용한 인도메타신보다 리폭시게나아제 억제 활성이 우수한 것을 확인하였다.
실시예 4. 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 부티르산 생산능
OBL_1 균주 배양액(OD600=1.0)을 원심분리한 후 수득한 상층액을 동결건조하고 1㎖의 증류수에 용해시켜 부티르산(butyric acid) 검출용 시료를 준비하였다. 시료에 1㎖의 증류수를 첨가한 후, 5%(v/v) 이소프로판올 및 5%(v/v) 에탄올과 미리 혼합한 증류수에 용해시킨 0.3%(w/v) 크리스탈 바이올렛 용액을 2-3 방울을 첨가하였다. 2분간 상온에 방치한 후, 1㎖의 농축된 염산(HCl)을 파란색 링이 나타날 때까지 반응 시험관의 측면으로부터 천천히 떨어뜨렸다. 양성대조군으로 부티르산(butyric acid, sigma-aldrich) 표준물질을 사용하였다. 그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 본 발명의 OBL_1 균주 시료의 경우 양성대조군과 마찬가지로 파란색 링을 나타내는 것을 통해 OBL_1 균주가 부티르산을 생산한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 지질과산화물 생성 억제 활성
지질과산화물 생성 억제 활성은 마우스 간 마이크로솜(microsome) 파쇄액을 이용하여 TBARS(thiobarbituric acid-reactive substances) 방법을 통해 확인하였다(Wong et al., 1981, J. Inorganic. Biochem., 14, 127-134). 구체적으로, OBL_1 균주 배양액(OD600=1.0) 시료, 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5), 간 마이크로솜 파쇄액(1㎖ 중 1mg의 단백질 함유), 0.1mM 아스코르브산염(ascorbate) 및 5mM FeSO4(Iron(II) sulfate)을 잘 혼합한 후 37℃에서 반응시켜 과산화를 유도시켰다. 대조구는 시료를 첨가하지 않고 상기와 동일한 방법으로 실시하였다. 반응액에 3M 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)과 2.5N HCl의 혼합용액을 가하고 원심분리 후 상등액에 0.67% TBA(thiobarbituric acid)를 넣고 가열하여 발색시켰다. 반응액은 535nm에서 흡광도를 측정하였으며, 지질과산화물의 생성 억제율을 대조구 흡광도에 대한 상대값으로 나타내었다. 그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 대조군(Control)에서는 지질과산화물 생성 억제 활성이 거의 없는 반면, OBL_1 균주 처리군에서는 지질과산화물의 생성 억제 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 클로스트리디움 부티리쿰 OBL_1 균주의 혈전분해 활성
0.6% 피브리노겐(fibrinogen, Sigma, 미국)을 0.05M 붕산나트륨(sodium borate) 버퍼(pH 7.5)에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 용해시킨 후 페트리 디쉬에 10㎖씩 분주하고, 트롬빈(thrombin, 1,000 units, Sigma)을 40 units/㎖의 농도로 희석한 후 총 20 unit이 되도록 페트리 디쉬에 가하여 균일하게 혼합되도록 잘 흔들어준 후 상기 혼합물을 약 15분 동안 굳혀 피브린 응고물(fibrin clot)을 형성시킨 후에 사용하였다. 상기 피브린 배지에 페이퍼 디스크(paper disc)를 올려두고, OBL_1 균주 배양액(OD600=1.0)을 50㎕ 점적(dripping)하여 37℃ 배양기에서 반응시킨 후 일정한 시간 간격을 두고 최대 6시간까지 피브린이 분해되어 생기는 투명대(환)의 면적을 측정하였다. 직경은 서로 수직인 두 개의 지름을 측정하였고, 투명대가 타원인 경우에는 가장 긴 지름과 가장 짧은 지름을 측정하여 투명대의 면적을 구하였으며, 대조구로는 증류수를 점적하였다. 그 결과, OBL_1 균주 배양액을 점적하고 1시간 후부터 혈전분해 현상이 나타났으며, 6시간 후에 혈전분해 활성을 측정한 결과, OBL_1 균주를 처리하였을 경우 35 units/㎖으로, 혈전분해 활성이 우수하다는 것을 확인하였다(도 5).
<110> OK, MIN
Okbiolab Co., Ltd.
<120> Clostridium butyricum OBL_1 strain having butyric acid production
ability, antibacterial activity against harmful bacteria,
fibrinolytic activity, lipoxygenase inhibition activity and lipid
peroxidation production inhibition activity and uses thereof
<130> PN19484
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> Clostridium butyricum
<400> 1
ccgggcgggc taccatgcag tcgagcgatg aactccttcg ggagtggatt agcggcggac 60
gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctca tagaggggaa tagcctttcg aaaggaagat 120
taataccgca taagattgta gtaccgcatg gtacagcaat taaaggagta atccgctatg 180
agatggaccc gcgtcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc 240
gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ttgggactga gacacggccc agactcctac 300
gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggggaaacc ctgatgcagc aacgccgcgt 360
gagtgatgac ggtcttcgga ttgtaaagct ctgtctttag ggacgataat gacggtacct 420
aaggaggaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 480
ttgtccggat ttactgggcg taaagggagc gtaggtggat atttaagtgg gatgtgaaat 540
acccgggctt aacctgggtg ctgcattcca aactggatat ctagagtgca ggagaggaaa 600
ggagaattcc tagtgtagcg gtgaaatgcg tagagattag gaagaatacc agtggcgaag 660
gcgcctttct ggactgtaac tgacactgag gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta 720
gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gaatactagg tgtaggggtt gtcatgacct 780
ctgtgccgcc gctaacgcat taagtattcc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac 840
tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc agcggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 900
gcgaagaacc ttacctagac ttgacatctc ctgaattact ctgtaatgga ggaagccact 960
tcggtggcag gaagacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1020
ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatt gttagttgct accatttagt tgagcactct 1080
agcgagactg cccgggttaa ccgggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1140
ttatgtctag ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca atgagatgca acctcgcgag 1200
agtgagcaaa actataaaac cgatctcagt tcggattgta ggctgaaact cgcctacatg 1260
aagctggagt tgctagtaat cgcgaatcag aatgtcgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1320
gtacacaccg cccgtcacac catgagagtg gcaataccca aagttcggag taaccgcagg 1380
aggcgcgact aagagtcgcg g 1401
Claims (8)
- 부티르산(butyric acid) 생산능, 장출혈성 대장균(Escherichia coli) O157:H7(ATCC 43894)에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제(lipoxygenase) 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 가지며, 기탁번호가 KCTC14060BP인 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) OBL_1 균주.
- 삭제
- 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 삭제
- 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장출혈성 대장균(Escherichia coli) O157:H7(ATCC 43894)에 대한 항균용 조성물.
- 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 삭제
- 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 부티르산 생산용 미생물 제제.
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WO2011055927A2 (ko) * | 2009-11-03 | 2011-05-12 | 운석식품(주) | 초산성 생장 혼합 미생물 조성물 및 이의 용도 |
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-
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