KR20160115202A - 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도 - Google Patents

면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20160115202A
KR20160115202A KR1020150042407A KR20150042407A KR20160115202A KR 20160115202 A KR20160115202 A KR 20160115202A KR 1020150042407 A KR1020150042407 A KR 1020150042407A KR 20150042407 A KR20150042407 A KR 20150042407A KR 20160115202 A KR20160115202 A KR 20160115202A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
cells
virus
composition
clostridium butyricum
Prior art date
Application number
KR1020150042407A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101773059B1 (ko
Inventor
장영효
이종수
백자영
신예슬
Original Assignee
한국생명공학연구원
충남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원, 충남대학교산학협력단 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020150042407A priority Critical patent/KR101773059B1/ko
Priority to CN201680003213.7A priority patent/CN107075460B/zh
Priority to PCT/KR2016/002839 priority patent/WO2016153247A1/ko
Publication of KR20160115202A publication Critical patent/KR20160115202A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101773059B1 publication Critical patent/KR101773059B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23L1/3014—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54—Acetic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/32—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the digestive tract
    • A23V2200/3204—Probiotics, living bacteria to be ingested for action in the digestive tract
    • C12R1/145—

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

본 발명은 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum ) 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 조성물, 프로바이오틱 조성물, 항균용 조성물, 부티르산(butyric acid) 또는 아세트산(acetic acid) 생산용 조성물 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 부티르산 또는 아세트산을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도{Clostridium butyricum strain enhancing immunity and having antiviral activity and uses thereof}
본 발명은 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 조성물, 프로바이오틱 조성물, 항균용 조성물, 부티르산(butyric acid) 또는 아세트산(acetic acid) 생산용 조성물 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 부티르산 또는 아세트산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
면역은 크게, 태어날 때부터 지니고 있는 선천면역(innate immunity)과 후천적으로 생활하면서 적응되어 얻어지는 획득면역(acquired immunity)으로 구분된다. 선천면역은 일명 '자연면역'이라고도 하며 항원에 대해 비특이적으로 반응하는 특징을 가진다. 선천적인 면역체계로는 항원의 침입을 차단하는 피부, 점액조직, 산성의 위산, 혈액에 존재하는 보체(complement)계 및 항미생물펩타이드 그리고 TLR(Toll like receptor)를 포함하는 Pattern Recognition Receptors 등이 포함이 되고, 세포로는 식균작용을 담당하는 대식세포(macrophage)와 다형핵 백혈구(polymorpho nuclear leukocyte), 감염세포를 죽일 수 있는 K 세포 등이 있다. 실제로 대부분의 병원체 감염은 이 선천면역에 의해 초기에 방어된다.
선천면역계는 기본적으로 자기와 비자기를 구분한다. 즉, 자기와 병원체를 구분하여 인식을 하는데 비자기로 인식이 되는 요소들은 고유한 분자생화학적 특성을 갖고 있는데 이를 PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern)라 하고, 이를 인식하는 수용체를 PRR (Pattern Recognition Receptor)이라고 한다. 현재까지 알려져 있는 PRR은 네 종류로 구분될 수 있는데 TLR (Toll like receptor), RLH (RIG-I-like helicase), NLR (Nod-like receptor), CLR (C-type lectin receptor) 등이 그것이다. 각각의 PRR들은 인식하는 PAMP의 특이성에 따라서 차이를 보이며 선천면역계의 활성화 기전에 시작 역할을 담당한다.
생체내 선천적 방어 면역시스템 중 바이러스 감염에 대한 방어기전으로 최근 가장 중요시되는 연구 분야는 인터페론(interferon)에 의해 유도되는 선천성 면역 분야이며, 이러한 인터페론 매개 면역의 활성화는 다양한 바이러스성 전염병 병원체에 대한 근본적인 예방 방법이 될 수 있다. 따라서 인터페론 활성화 기전 연구 및 인터페론을 유도시킬 수 있는 면역 조절제제의 개발 연구가 활발하다.
또한, 병원체의 감염에 따른 선천면역의 방어기작의 하나로 면역인자들 (염증 사이토카인들)이 분비가 되고, 이들 인자들에 의해 염증반응이 유발되어 병원체에 대한 방어가 이루어진다. 따라서 적정한 수준의 염증반응 유도 역시 다양한 전염병 병원체에 대한 예방 및 치료 방법이 될 수 있고, 이를 유도시킬 수 있는 면역증강제제의 개발 연구는 필요하다.
바이러스(virus)란 라틴어로 독성물질을 의미하며, 세균여과지(0.22㎛)를 통과하는 일군의 감염형 병원성 입자를 의미한다. 바이러스는 숙주세포의 종류에 따라 박테리오 파지, 식물바이러스, 동물바이러스로 분류하기도 하며, 핵산의 종류에 따라 DNA 바이러스, RNA 바이러스로 분류할 수 있다. 바이러스 질병으로 최근 신종플루, AI 및 구제역 등 다양한 바이러스 질병이 사회적으로 큰 문제를 일으키며 바이러스 질병의 효과적인 대책에 대한 고민이 사회적으로 큰 관심을 불러일으키고 있다.
현재 바이러스성 질병을 예방하기 위해서 가장 좋은 방법은 백신 접종이다. 그럼에도 불구하고 RNA 바이러스에 의한 질병은 대체적으로 많은 바이러스 혈청형(아형) 생성 등에 따른 백신의 효율성 문제가 중요한 문제로 대두가 되고 있어 백신의 문제를 보완해 줄 수 있는 바이러스 예방용 억제제의 개발 및 보급은 중요한 사항이며, 이를 위해 특히 바이러스에 대한 초기 방어시스템인 생체내 선천적 면역시스템을 자극하여 개체의 면역력을 높여주는 예방제제의 발굴 및 개발은 중요한 제제 개발 방법이 될 수 있다. 생체내 선천적 면역시스템을 자극하여 개체의 면역력을 높여주는 방법으로, 면역 조절 작용을 갖는 식품을 섭취하기도 하는데, 이러한 기능성 식품 소재로서 생균제가 시판되고 있다. 생균제로 이용되는 대표적인 미생물로 유산균, 낙산균, 바실러스균, 효모균, 곰팡이균 등이 이용되고 있는데, 유산균으로는 락토바실러스 속, 락토코쿠스 속, 스트렙토코쿠스 속, 페디오코쿠스 속, 엔테로코쿠스 속 등에 속하는 종을 들 수 있고, 낙산균으로는 클로스트리디움 부티리쿰이 대표적이다. 생균제는 사람 및 동물의 장내에 분포하여 장내 유해 미생물 생장 억제, 이상 발효의 치료, 혈중 콜레스테롤 저하, 면역 기능의 증진 등의 효과를 나타내며, 항암 작용도 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 생균제를 사람이 섭취하여 건강을 증진할 수 있도록 유산균 함유 발효 유제품 및 정장제가 상용화되어 널리 음용 또는 식용되고 있다. 최근에 유산균에 의한 바이러스 감염억제에 관한 연구결과들이 보고되었다. 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)과 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)를 보충한 분유를 섭취함으로써 로타바이러스에 의한 유아 설사증을 예방하는 데 효과가 있는 것으로 보고되었으며, 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 식물유래 유산균도 보고되었다. 또한, 유산균은 발효 산업의 대표적 미생물로서, 유산균에 대한 대부분의 연구는 내산성, 내담즙산성 및 유해 미생물 억제 활성을 갖는 유산균에 의해서 주로 수행되었다.
단순포진바이러스(HSV)는 투명액으로 가득 차있는 수포형태로 나타나는 통증을 수반한 피부 또는 점막 병변을 일으키는 원인이다. 단순포진바이러스(HSV) 1형(HSV-1)은 주로 입, 얼굴 및 눈을 감염시킨다. 단순포진바이러스(HSV) 2형(HSV-2)은 주로 생식기 및 엉덩이를 감염시킨다. 그러나, 1형 및 2형 혈청형 각각은 모든 부위에서 감염을 일으킬 수 있다. 단순포진바이러스(HSV)에 의한 1차 감염은 일반적으로 감염 부위에 약한 발열 병변을 발생시킨다. 치료기간은 평균적으로 8일 내지 12일이며, 이 기간에 바이러스가 신경절로 이동하여 이곳에서 잠복상태로 지내게 된다. 잠복상태의 바이러스는 육체적 또는 감정적 스트레스, 추위, 열, 면역기능 저하 또는 분명치 않은 원인 등을 포함한 여러가지 원인에 의해 다시 활성화될 수 있다. 활성화되면 이로 인해 2차 감염 발생을 유발한다.
수포성 구내염 바이러스(VSV)는 대부분의 포유류 세포를 감염시키고 감염된 세포의 전체 단백질 중 최대 60%의 바이러스 단백질을 발현하는 음성 가닥(negative stranded) RNA 바이러스이다. 자연적으로, VSV는 돼지, 소 그리고 말을 감염시키며 입과 발 주위에 수포병(vesicular disease)을 유발한다. VSV에 의한 인체 감염이 보고되었지만, VSV는 인간에게서 심각한 증상을 유발하지 않는다.
인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스 (Orthomyxoviridae)에 속하며 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS의 여덟 개의 네가티브 센스 RNA 단편을 갖고 있는 바이러스이다. 이 중 외피 단백질을 이루고 있는 두개의 단백질 헤마글루티닌 (hemagglutinin: 이하 "HA"라 약칭함)과 뉴라미니다아제(neuraminidase: 이하 "NA"라 약칭함)는 면역항체를 유도하는데 중요한 면역원이며, 이들은 항원의 대/소변이(antigenic shift and drift) 과정을 통해 변형되는 특징을 갖고 있다. 이런 독감 바이러스의 변화는 동일 아종내의 다른 독감 바이러스에 대하여 형성된 면역도 회피할 수 있게 할 수 있으며, 일반적으로 독감 바이러스에 의해 유도된 면역은 단기간에 소실되기 때문에 매 시즌에 유행이 예측되는 바이러스에 대하여 새로이 면역을 유도해야 한다.
뉴캐슬병(Newcastle disease)은 가금에서 치명적이고 전염성이 강한 제 1종 가축 전염병으로 백신을 접종하지 않은 닭에 감염될 때는 100% 폐사율을 초래하며, 적절한 백신을 하지 않는 경우 호흡기 및 소화기 증상과 산란계에서 산란율 저하로 경제적인 피해를 일으키는 치명적인 질병이다. 매년 발생주의보를 발표하고 있으나 발생이 계속 증가하고 전국적으로 발생되는 추세에 있으며 양계 농가에 큰 피해를 주고 있다. 뉴캐슬병의 주요 증상은 처음에는 졸기 시작하여 콧물, 기침 등의 호흡기 증상이 나타나고 녹색 설사를 하다 죽는다. 또한, 적절한 백신을 하지 않은 경우 백신 항체가가 낮은 산란계나 종계는 산란율이 떨어지거나 중지되기도 하고 예방 접종을 했더라도 접종 시기나 방법이 잘못되어 항체가가 높지 않은 닭에서는 다리와 목이 마비되는 신경증상이 나타나기도 한다.
한편, 한국공개특허 제2010-0044472호에서는 '장내 유해세균 억제능과 면역 증강작용을 하는 클로스트리디움 부티리쿰 아이디씨씨 9207 백미 발효물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2013-0028279호에서는 '신규한 부틸산 생산 균주'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 성인과 유아의 분변으로부터 2종의 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum ) 균주를 분리하였는데, 상기 2종의 균주는 다종의 RNA 바이러스 및 DNA 바이러스에 대해 항바이러스 활성이 우수한 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 유해세균에 대한 항균 활성, 내산성 및 내담즙성, 항생제 내성 및 장내 점착성이 우수하여 항바이러스용뿐만 아니라 프로바이오틱 또는 항균용으로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 2종의 균주는 부티르산(butyric acid) 및 아세트산(acetic acid)을 생산하므로, 부티르산 또는 아세트산 생산용으로도 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum ) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 부티르산(butyric acid) 또는 아세트산(acetic acid) 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 부티르산 또는 아세트산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 면역 및 항바이러스 활성이 우수한 신규의 클로스트리디움 부티리쿰 균주를 획득할 수 있으며, 본 발명의 균주 및 이의 배양액을 이용하는 경우, 항바이러스용 조성물, 프로바이오틱 조성물, 항균용 조성물, 부티르산(butyric acid) 또는 아세트산(acetic acid) 생산용으로 관련 산업에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 균주인 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) Fb5-3의 16S rRNA 유전자 염기서열을 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 분리한 균주인 클로스트리디움 부티리쿰 S-45-5의 16S rRNA 유전자 염기서열을 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 분리한 균주인 클로스트리디움 부티리쿰 Fb5-3의 낙산 및 유기산 분석 결과이다.
도 4는 본 발명에서 분리한 균주인 클로스트리디움 부티리쿰 S-45-5의 낙산 및 유기산 분석 결과이다.
도 5는 수포성 구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus, VSV)(1.0 MOI)에 대한 본 발명의 S-45-5 균주의 항바이러스성을 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 6는 인플루엔자바이러스(Influenza virus, PR8)에 대한 본 발명의 S-45-5 균주의 항바이러스성을 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 7은 수포성 구내염바이러스(VSV)(0.01 MOI)에 대한 본 발명의 S-45-5 균주의 항바이러스성을 인간배아 신장세포인 HEK293T 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 8은 단순 포진 바이러스(Herpes simplex virus, HSV)(3.0 MOI)에 대한 본 발명의 S-45-5 균주의 항바이러스성을 인간배아 신장세포인 HEK293T 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 9는 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus, NDV)(1.0 MOI)에 대한 본 발명의 S-45-5 균주의 항바이러스성을 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 10은 단순 포진 바이러스(Herpes simplex virus, HSV)(3.0 MOI)에 대한 본 발명의 S-45-5 균주의 항바이러스성을 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 11은 Raw264.7 세포 및 HEK293T 세포를 대상으로 본 발명의 S-45-5 균주의 선천면역인자(pro-inflammatory Cytokine & Interferon) 유도 효능을 검증한 결과이다.
도 12는 마우스 대식세포주에서의 S-45-5 균주의 항바이러스 관련 유전자들(IFN-β, ADAR1, GBP1, ISG20, ISG56, Mx1, OAS-1β, P56, PKR, ISG15, OAS)의 발현 유도를 검증한 결과이다.
도 13은 마우스 대식세포주에서의 S-45-5 균주의 항바이러스 관련 신호 전달 분자들의 활성화를 검증한 결과이다.
도 14는 마우스에서 S-45-5 균주의 인플루엔자 바이러스 감염 억제 실험 결과이다.
도 15는 마우스에서 S-45-5 균주의 사이토카인과 IgA 분비 유도 실험을 나타낸다. (DPT는 Day Post-Infection)
도 16은 수포성 구내염바이러스(VSV)(1.0 MOI)에 대한 본 발명의 Fb5-3 균주의 항바이러스성을 Raw264.7 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 17은 인플루엔자바이러스(PR8)(1.0 MOI)에 대한 본 발명의 Fb5-3 균주의 항바이러스성을 Raw264.7 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 18은 뉴캐슬병바이러스(NDV)(1.0 MOI)에 대한 본 발명의 Fb5-3 균주의 항바이러스성을 Raw264.7 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 19는 단순 포진 바이러스(HSV)(3.0 MOI)에 대한 본 발명의 Fb5-3 균주의 항바이러스성을 Raw264.7 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 20은 수포성 구내염바이러스(VSV)(0.01 MOI)에 대한 본 발명의 Fb5-3 균주의 항바이러스성을 HEK293T 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 21은 단순 포진 바이러스(HSV)(3.0 MOI)에 대한 본 발명의 Fb5-3 균주의 항바이러스성을 HEK293T 세포를 이용하여 분석한 결과이다.
도 22는 Raw264.7 세포를 대상으로 본 발명의 Fb5-3 균주의 선천면역인자(pro-inflammatory Cytokine & Interferon) 유도 효능을 검증한 결과이다.
도 23은 본 발명에서 분리한 2종 균주의 내담즙성을 조사한 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 클로스트리디움 부티리쿰 균주는 항균성, 내산성 및 내담즙성을 가지며, 부티르산(butyric acid; 낙산) 및 아세트산(acetic acid)을 생산하는 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 성인과 유아의 분변으로부터 균주를 분리하였고, 그 중 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 뛰어난 균주를 분리하였으며, 이를 클로스트리디움 부티리쿰 균주로 동정한 것이다. 상기 클로스트리디움 부티리쿰 균주는 클로스트리디움 부티리쿰 Fb5-3 균주(기탁번호 KCTC12753BP) 또는 클로스트리디움 부티리쿰 S-45-5 균주(기탁번호 KCTC12754BP)일 수 있으며, 한국생명공학연구원에 2015년 02월 03일자로 기탁하였다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 조성물을 제공한다. 상기 면역 증진 및 항바이러스용 조성물은 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 이용될 수 있다.
상기 조성물이 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물인 경우에, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다. 본 발명의 선천면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸, 외용제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다. 약학 조성물의 제제화 방법은 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
"항바이러스(antiviral)"의 의미는 어떤 농도에서 바이러스의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항바이러스용 조성물에서, 상기 바이러스는 오르토믹소비리대(Orthomixoviridae), 랍도비리대(Rhabdoviridae), 파라믹소비리대(Paramixoviridae) 및 허피스비리대(Herpesviridae) 중에서 선택된 하나 이상의 바이러스일 수 있다. 바람직하게는, 상기 오르토믹소비리대(Orthomixoviridae)는 인플루엔자바이러스(Influenza virus)이고, 랍도비리대(Rhabdoviridae)는 수포성구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus)이며, 파라믹소비리대(Paramixoviridae)는 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus)이고, 허피스비리대(Herpesviridae)는 단순포진바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.
본 발명의 클로스트리디움 부티리쿰 Fb5-3 균주, 클로스트리디움 부티리쿰 S-45-5 균주 또는 이의 배양액 각각은 장 세포 부착성, 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 항생제 내성 전이의 위험이 적으며, 장내 유해한 병원성 세균을 억제하고, 항 바이러스 및 면역증강 효과를 나타내므로, 생균제로서 갖추어야 할 상기 조건을 모두 유의적으로 만족하므로, 생균제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양현탁액이거나 건조분말 형태일 수 있다. 또한, 주성분인 상기 클로스트리디움 부티리쿰 Fb5-3 균주, 클로스트리디움 부티리쿰 S-45-5 균주 또는 이의 배양액의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.
담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 트레할로스(Trehalose), 옥수수 전분(corn starch), 콩기름(soybean oil), 미세결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitorl)이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP: polyvinyipyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starch glycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone) 중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulose sodium), 베타-시클로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠(methyl p-hydroxy benzoate, methlparaben), 파라옥시안식향산프로필(propyl p-hydroxybenzoate, propylparaben), 또는 소르빈산칼륨(potassium sorbate) 중에서 선택하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 클로스트리디움 부티리쿰 Fb5-3 균주, 클로스트리디움 부티리쿰 S-45-5 균주를 접종하여 배양시켜 얻어지는 균주 배양물에 프로바이오틱 활성을 갖는 미생물을 추가로 접종하여 배양시킨 균주 배양물은 프로바이오틱 활성을 갖는 생균제로 동물에 투여되거나 또는 식품, 의약품, 동물약품 또는 유산균제와 함께 동물에 투여될 수 있으며 바람직하게는 가축의 사료 첨가제 또는 보조사료로 사용되며, 상기 생균제를 양돈에 급여시 초유에 함유된 풍부한 영양소와 유용 생리활성물질로 양돈의 증체율 증가 및 이유 자돈의 설사발생을 없게 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.
"항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 세균의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 항균성은 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 및 푸소박테리움 속(Fusobacterium sp.) 중에서 선택된 하나 이상에 대한 항균성일 수 있으며, 바람직하게는 엔테로박터 클로아세아(Enterobacter cloacea ), 슈도모나스 에로기노사(Pseudomonas aeroginosa), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus ), 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes ) 및 푸소박테리움 바리움(Fusobacterium varium) 중에서 선택된 하나 이상에 대한 항균성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 또는 사료첨가제 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 이의 배양액을 식품 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다. 상기 사료는 가축의 사료로, 육계 사료, 양돈 사료 또는 축우사료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 부티르산(butyric acid) 또는 아세트산(acetic acid) 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 부티르산 또는 아세트산을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 의해 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
낙산균 분리
성인과 신생아로부터 분변을 혐기적으로 채취하여 희석한 다음 Reinforced Clostridial Medium(RCM, Difco) 배지에 도말 접종한 다음 혐기적(Anaerobic system, H20:C02:N2=8:5:88%, Forma Scientific)으로 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양 후 출현한 집락을 순수분리하고, -80℃에 보존하여 실험에 사용하였다. 분리된 균주들은 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 분석을 통한 동정이 이루어졌다. 구체적으로, 각각의 분리균주의 콜로니 샘플의 16S rDNA 증폭을 위하여 정방향 프라이머 27F(5'-agagtttgatccctcag-3' : 서열번호 3) 및 역방향 프라이머 1492R(5'-ggttaccttgttacgactt-3' : 서열번호 4)을 사용하여 처음 사이클은 95℃에서 2분, 30 사이클은 95℃에서 20초, 50℃에서 40초, 72℃에서 1분 30초, 마지막 사이클은 72℃에서 5분 및 4℃에서 10분의 조건으로 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR 산물은 증폭된 유전자(gene)의 크기를 전기영동을 통해 1차적으로 확인한 후, (주)바이오팩트에 시퀸싱 분석을 의뢰하였다.
낙산 생성능 분석
낙산 및 유기산 대사산물 분석은 GC(Gas chromatography)를 이용하여 이루어 졌다. 낙산균 Fb5-3 및 S-45-5를 PYG 액체배지에 37℃에서 48시간 배양한 배양 상등액을 시료로 사용하였고, 분석을 위한 스탠다드로는 에탄올, 아세트산, 부탄올 및 부티르산을 사용하였다. 낙산균 배양 상등액과 스탠다드를 0.22㎛의 필터로 여과하여 동등한 양의 10% (v/v) 인산과 혼합하여 HP-INNOWax column (60 m×250 ㎛×0.25 ㎛, Agilent Technologies)이 장착된 GC-FID에 1㎕ 주입하였다. 헬륨은 유속 1 ㎖/min으로 캐리어 가스로 사용하였다. 오븐 온도는 10℃의 속도로 170℃로 50℃에서 증가하도록 프로그래밍하였다. 인젝터 및 검출기 온도는 250℃로 설정하였다.
낙산균의 항바이러스 효능 검증 및 세포독성시험
마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포와 증식을 하면서 형광을 발현하는 GFP-VSV (vesicular stomatitis virus)을 이용하여 낙산균에 대해 항바이러스 효능 실험을 진행하였다. 항바이러스 효능 실험 이전에 낙산균의 Raw264.7 세포에 대한 세포 독성 실험을 수행하였다. 그 결과 5×107 균수 이하의 낙산균에 의해서는 세포 사멸을 관찰할 수 없었다. 다음으로 항바이러스 활성을 나타내는 최소한의 낙산균수를 정하기 위해 낙산균수에 따른 항바이러스 효능 실험을 수행한 결과 1×103의 낙산균수에서 GFP-VSV의 증식을 억제하는 일부 낙산균을 확인하였고, 이를 토대로 낙산균 125개 균주에 대한 항바이러스 효능실험을 1×103의 균수로 수행하였다.
낙산균 S-45-5 및 Fb5-3 균주의 RNA 바이러스 (Vesicular stomatitis virus, Influenza virus, Newcastle disease virus), DNA 바이러스 (Herpes simplex virus)에 대한 항바이러스 활성 실험을 다음과 같이 확인하였다. 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포와 인간 배아 신장 세포(인간배아 신장세포)인 HEK293T 세포를 배양하여 실험에 사용하였다(Raw264.7 세포는 8×105 cells/well; HEK293T 세포는 3×105 cells/well). 12-well TC 플레이트에 세포 접종(Cell seeding)한 후 1% FBS가 첨가된 DMEM에 낙산균을 1×103의 수로 처리하였다. 음성 대조구는 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조구는 마우스 또는 인간 IFN-B (500 units/ml)를 처리하였다. 낙산균 처리 12시간 후 VSV-gfp (MOI : 1.0), PR8-gfp (MOI : 1.0), NDV-gfp (MOI : 1.0), HSV-gfp (MOI : 3.0)를 접종하였다. 접종 2시간 후 접종액을 제거하고 PBS로 3회 세척하고, 10% FBS 첨가된 DMEM으로 교체해주었다. 10~12시간 후 바이러스 감염 정도를 측정하였다.
또한, 세포 생존도 측정 실험은 다음과 같이 수행하였다. 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포와 인간 배아 신장 세포(인간배아 신장세포)인 HEK293T 세포를 키워 실험에 사용하였다(Raw264.7 세포는 8×105 cells/well; HEK293T 세포는 3×105 cells/well). 12-well TC 플레이트에 세포 접종한 후 1% FBS가 첨가된 DMEM에 낙산균을 1×103의 수로 처리하였다. 음성 대조구는 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조구는 마우스 또는 인간 IFN-B (500 units/ml)를 처리하였다. 낙산균 처리 12시간 후 VSV-gfp (MOI : 1.0 또는 0.01), PR8-gfp (MOI : 1.0), NDV-gfp (MOI : 1.0), HSV-gfp (MOI : 3.0)를 접종하였다. 접종 후 2시간 후 접종액을 제거하고 PBS로 3회 세척하고 10% FBS 첨가된 DMEM으로 교체해주었다. 12, 24시간 후 0.4% 트립토판 블루로 염색하여 세포사멸을 확인하였다.
S-45-5 균주의 선천면역인자 ( pro - inflammatory Cytokine & Interferon ) 유도 효능 검증
마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포와 인간 배아 신장 세포(인간배아 신장세포)인 HEK293T 세포를 키워 실험에 사용하였다(Raw264.7 세포, 8×105 cells/well; HEK293T 세포, 3×105 cells/well). 6-well TC 플레이트에 세포를 접종한 후 1% FBS가 첨가된 DMEM에 낙산균을 1×103의 수로 처리하였다. 음성 대조구는 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조구는 LPS(lipopolysaccharide) 분말(100ng/ml)을 처리하였다. 처리 후, 12시간, 24시간의 상층액을 ELISA를 이용하여 IFN-β, TNF-α, IL-6의 값을 측정하였다.
마우스 대식세포주에서의 S-45-5 균주의 항바이러스 관련 유전자들의 발현 유도 검증
마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 키워 실험에 사용하였다(Raw264.7 세포, 8×105 cells). 6-well TC 플레이트에 세포 접종한 후 1% FBS가 첨가된 DMEM에 낙산균을 1×103의 수로 처리하였다. 음성 대조구는 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였다. 처리 후, 12시간에 세포를 모아서 real-time qPCR을 이용하여 IFN-β와 IFN 관련 유전자들의 mRNA 값을 측정하였다.
마우스 대식세포주에서의 S-45-5 균주의 항바이러스 관련 신호 전달 분자들의 활성화 검증
인터페론(Interefron)이나 염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine) 등의 분비는 체내에 침입한 바이러스에 대응하는 중요한 선천면역의 기전요소로 이들 사이토카인들이 분비되기 위해서는 세포에 자극된 신호들에 반응하는 특이 분자들의 활성화가 중요하다. 상기의 결과에서 낙산균은 면역세포 및 상피세포의 인터페론을 비롯한 사이토카인들의 분비를 유도하였고, 인터페론과 IFN-연관 유전자 레벨 역시 증가하였다. 따라서 본 발명에서는 세포내 신호전달 분자들의 활성화 정도를 특이 항체를 이용하여 확인하였다. 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 키워 실험에 사용하였다(Raw264.7 세포, 8×105 cells). 6-well TC 플레이트에 세포 접종한 후 1% FBS가 첨가된 DMEM에 낙산균을 1×103의 수로 처리하였다. 음성 대조구는 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조구는 LPS(lipopolysaccharide) 분말(100ng/ml)을 처리하였다. 처리 후, 0, 8, 12, 24시간에 세포를 모으고 각각의 단백질에 대한 항체와 웨스턴 블럿을 수행하여 신호전달에 관련된 단백질들의 활성형인 인산화 형태(phosphorylation form)의 단백질을 확인하였다.
마우스에서 S-45-5 균주의 인플루엔자 바이러스 감염 억제 실험
낙산균의 경구투여에 의한 In vivo 항인플루엔자 효능 검증 (Challenge test) 시험을 수행하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 6주령의 Female Balb/c 마우스를 사용하였고, 음성 대조구 그룹에는 PBS를, 실험군에는 S-45-5 균주의 낙산균(1×103)을 21일 동안 매일 경구투여 하였고, 양성 대조구 그룹에는 IFN-β를 바이러스 감염 12시간 전에 비강으로 투여하였다. 전처리 후, 각 그룹에 인플루엔자(H3N2 또는 H5N2)를 5LD50로 감염시켰다. 13일 동안 체중 변화와 치사율을 측정하였다.
마우스에서 S-45-5 균주의 사이토카인과 IgA 분비 유도 실험
6주령된 암컷 Balb/c 마우스를 실험에 사용하였다. 마우스에 PBS 또는 S-45-5 균주(1×103)을 10일 혹은 21일 동안 매일 경구투여하였다. 10일과 21일째 인플루엔자 바이러스(H1N1)를 비강으로 감염시킨 후 각각 12, 24, 36 시간에 혈청, BAL 유체(fluid), 소장액(small intestinal fluid)을 채취하였다. ELISA를 통해서 IL-6, IFN-β, IgA의 분비된 양을 측정하였다.
Fb5 -3 균주의 항바이러스 활성 실험 및 세포독성 시험
RNA 바이러스(Vesicular stomatitis virus, Influenza virus, Newcastle disease virus), DNA 바이러스 (Herpes simplex virus)에 대한 항바이러스 활성 실험을 수행하였다. 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포와 인간 배아 신장 세포(인간배아 신장세포)인 HEK293T 세포를 키워 실험에 사용하였다(Raw264.7 세포, 8×105 cells/well; HEK293T 세포, 3×105 cells/well). 12-well TC 플레이트에 세포 접종한 후 1% FBS가 첨가된 DMEM에 낙산균을 1×103의 수로 처리하였다. 음성 대조구는 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고 양성 대조구는 마우스 또는 인간 IFN-B (500 units/ml)를 처리하였다. 낙산균 처리 12시간 후 VSV-gfp (MOI : 1.0), PR8-gfp (MOI : 1.0), NDV-gfp (MOI : 1.0), HSV-gfp (MOI : 3.0)를 접종하였다. 접종 후 2시간 후 접종액을 제거하고 PBS로 3회 세척하고, 10% FBS 첨가된 DMEM으로 교체해 주었다. 10~12시간 후 바이러스 감염정도를 측정하였다.
세포 생존도 측정 실험은 다음과 같이 수행하였다. 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포와 인간 배아 신장 세포(인간배아 신장세포)인 HEK293T 세포를 키워 실험에 사용하였다(Raw264.7 세포, 8×105 cells/well; HEK293T 세포, 3×105 cells/well). 12-well TC 플레이트에 세포 접종한 후 1% FBS가 첨가된 DMEM에 낙산균을 1×103의 수로 처리하였다. 음성 대조구는 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고 양성 대조구는 마우스 또는 인간 IFN-B (500 units/ml)를 처리하였다. 낙산균 처리 12시간 후 VSV-gfp (MOI : 1.0 또는 0.01), PR8-gfp (MOI : 1.0), NDV-gfp (MOI : 1.0), HSV-gfp (MOI : 3.0)를 접종하였다. 접종 후 2시간 후 접종액을 제거하고 PBS로 3회 세척하고 10% FBS 첨가된 DMEM으로 교체해주었다. 12, 24 시간 후 0.4% 트립토판 블루로 염색하여 세포사멸을 확인하였다.
Fb5 -3 균주의 선천면역인자 ( pro - inflammatory Cytokine & Interferon ) 유도 효능 검증
마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 키워 실험에 사용하였다(8×105 cell/well). 6-well TC 플레이트에 세포 접종한 후 1% FBS가 첨가된 DMEM에 낙산균을 1×103의 수로 처리하였다. 음성 대조구는 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고 양성 대조구는 LPS(lipopolysaccharide) 분말(100ng/ml)을 처리하였다. 처리 후, 12시간, 24시간의 상층액을 ELISA를 이용하여 IL-6, TNF-α의 값을 측정하였다.
분리 균주의 내산성 및 내담즙성
내산성 실험은 HCl로 pH 1.0 ~ 6.0으로 각각 조절한 RCM 액체배지에 낙산균주들을 2시간 처리 후 접종하여 37℃, 48시간 배양 후 흡광도(OD 600)를 이용하여 생존율을 측정하였다. 내담즙성은 Bacto oxgall(Difco)의 농도를 0.3, 1.0, 3.0%(w/v) 농도로 각각 RCM 평판배지에 첨가하여 낙산균주들을 배양한 후 성장도를 측정하였다.
분리 균주의 유해세균 길항능력 시험
유해균은 장내질병에 주로 관련되는 것으로 KCTC(한국생명공학연구원 미생물자원센터)에서 분양받은 대장균 KCTC 2441, 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) KCTC 2208, 시겔라 플랙스네리(Shigella flexneri) KCTC 22192, 엔테로박터 클로아세아(Enterobacter cloacea) KCTC 1685, 슈도모나스 애로기노사(Pseudomonas aeroginosa) KCTC 2004, 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) KCTC 2729, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 3881, 엔테로박터 애로게네스(Enterobacter aerogenes) KCTC 2190, 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile) KCTC 5009, 캠필로박터 제주니(campylobacter jejuni) KCTC 5327, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) KCTC 3269 , 푸소박테리움 바리움(fusobacterium varium) KCTC 15085 균주 12종과 질병관리본부에서 분양받은 대장균 O157, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 균주 3종 등 총 15종을 지시 균주로 사용하였다.
유해세균 길항능력 시험은 페이퍼 디스크 (8mm, Yoyo Roshi Kaisha, Japan)를 이용하여 억제환의 직경(mm, diameter)을 측정하였다. 약 24시간 배양한 지시 균주의 농도를 106-7 CFU/ml로 조정하여 Mueller-Hinton agar 배지에 도말 건조한 후, 분리균주의 배양 상등액 100 ㎕를 멸균된 디스크에 접종하여 48시간 배양하였다. 상등액은 액체 배양액을 pH 4 및 pH 6으로 조절하고, 멤브레인(0.22 ㎕ 기공 크기, Sartorius, France)로 균체를 제거하여 준비하였다. 대조구는 균을 접종하지 않은 RCM 액체배지를 동량 사용하여 항균력을 비교하였다.
분리 균주의 항생제 감수성 시험
항생제는 카나마이신(30㎍/disc), 페니실린(10㎍), 세파로신(30㎍), 클린다마이신(2㎍), 테트라사이클린(30㎍), 젠타마이신(10㎍), 스트렙토마이신(10㎍), 암피실린(10㎍), 벤코마이신(30㎍)의 총 9가지의 항생제가 사용되었다. 항생제 시험은 Muller-Hinton 배지에 분리균주를 106-7 CFU/ml이 되도록 도말한 다음, 항생제 디스크를 배지 위에 접종하였다. 37℃에서 48시간 배양한 후 억제환의 직경(mm, diameter)을 측정하여 크기에 따라 내성의 정도를 확인하였다.
분리 균주의 유산균의 증식 촉진시험
유산균 증식 촉진시험을 위하여 락토바실러스 및 비피도박테리움 균을 선정하여 성장 효과를 분석하였다. 분리 균주들은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K3108, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) K3564, 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) K3600, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) K3237, 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei) K3510, 락토바실러스 사케이 아종 사케이(Lactobacillus sakei subsp . sakei) K3603, 비피도박테리움 롱검 아종 롱검(Bifidobacterium longum subsp . longum) K3128, 비피도박테리움 카테눌라툼(Bifidobacterium catenulatum) K3221, 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum subsp . infantis) K3249, 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) K3202 를 사용하였다. 낙산균 배양액과 유산균을 1:1로 MRS 액체배지에 혼합배양하여 유산균의 CFU/ml를 분석하였다.
분리 균주의 장내 정착력 시험
장내 정착력 시험을 위하여 분리 균주들의 Caco-2 세포주와 HT29 세포주에 대한 부착능을 알아보았다. 낙산균 107～109을 세포주(5.0x105)에 2시간 동안 감염시킨 후 real-time qPCR을 수행하였다. 각 샘플의 CT 값을 스탠다드 커브에 대입하여 박테리아의 수를 측정하였다.
실시예 1. 낙산균 분리
분리된 균주들은 동정을 위하여 PCR을 통해 16S rRNA 유전자를 증폭하고, 1,400bp의 부분적인 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 NCBI의 BLAST 분석 프로그램을 사용하여 상동성을 비교한 결과, 성인에서는 Fb5-3(서열번호 1)이, 신생아에서는 S-45-5(서열번호 2)가 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)과 상동성을 보였다(도 1 및 도 2).
실시예 2. 낙산 생성능 분석
낙산 및 유기산 분석 결과 Fb5-3 및 S-45-5 두 균주 모두 부티르산을 가장 많이 생성하였고, 두 번째로는 아세트산을 생성하는 것을 확인하였다. Fb5-3은 부티르산을 60%로 가장 많이 생성하며, 두 번째로 아세트산을 32% 생성하는 것을 확인하였다. S-45-5는 부티르산을 56%로 가장 많이 생성하며, 두 번째로 아세트산을 35% 생성하는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).
실시예 3. 낙산균의 항바이러스 효능검증 및 세포독성시험
마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포와 증식을 하면서 형광을 발현하는 GFP-VSV (vesicular stomatitis virus)을 이용하여 낙산균에 대해 항바이러스 효능실험을 진행하였다. 항바이러스 효능 실험 이전에 낙산균의 Raw264.7 세포에 대한 세포 독성 실험을 수행하였다. 그 결과 5×107 균수 이하의 낙산균에 의해서는 세포 사멸을 관찰할 수 없었다. 다음으로 항바이러스 활성을 나타내는 최소한의 낙산균수를 정하기 위해 낙산균수에 따른 항바이러스 효능 실험을 수행한 결과 1×103의 낙산균수에서 GFP-VSV의 증식을 억제하는 일부 낙산균을 확인하였고, 이를 토대로 낙산균 125개 균주에 대한 항바이러스 효능실험을 1×103의 균수로 수행하였다. 낙산균 125개 균주에 대한 항바이러스 효능실험을 수행한 결과 125개의 균주 중에서 S-45-5와 Fb5-3 균주의 항바이러스 효능이 가장 크게 나타난 것을 확인하였다(데이터 미제시).
또한, 도 5 내지 도 10과 같이 수포성 구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus), 인플루엔자바이러스(Influenza virus) 및 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus)인 RNA 바이러스와 단순 포진 바이러스(Herpes simplex virus)인 DNA 바이러스에 대한 낙산균 (S-45-5)의 항바이러스 효과를 입증하기 위해 면역세포와 상피세포에서 GFP의 발현을 통해 바이러스의 증식 정도를 확인하였다. 그 결과 인터페론-β를 전처리한 세포에서와 마찬가지로 낙산균을 처리한 세포에서도 RNA 바이러스뿐만 아니라 DNA 바이러스의 증식도 현저히 감소하였다(도 5 내지 도 10의 Viral Titer 또는 Viral Replication으로 표시한 값 참고). 또한 세포독성실험 결과, 바이러스 증식에 의한 세포사멸 역시 감소하는 것으로 나타났으며, 결과적으로 낙산균에 의한 항바이러스 효능이 입증되었다(도 5 내지 도 10).
실시예 4. 본 발명의 S-45-5 균주의 선천면역인자( pro - inflammatory Cytokine & Interferon ) 유도 효능 검증
도 11과 같이 낙산균에 의해 Raw264.7 세포와 HEK293T 세포로부터 선천면역인자 사이토카인 및 인터페론-β의 유도능이 강하게 나타났다. 인터페론-β는 바이러스, 암세포 등의 외부물질에 반응하여 분비되는 사이토카인으로 세포내 항암 및 항바이러스 작용을 일으켜 면역반응을 유도하는 물질이다. TNF-a는 면역 및 염증반응의 매개물질로 대식세포주를 활성화시키며 B-세포를 증식시키고, IL-6는 B-세포를 활성화시켜 항체생산을 증가시켜 항원특이적 면역반응을 촉진하는 중요한 사이토카인이다. 따라서, 낙산균으로 인해 면역작용이 증가하고, 항바이러스 효과가 나타난다는 점을 알 수 있었다(도 11).
실시예 5. 마우스 대식세포주에서의 S-45-5 균주의 항바이러스 관련 유전자들의 발현 유도 검증
도 12와 같이 낙산균에 의해 면역세포인 Raw 264.7 세포에서 인터페론 관련 유전자, 항바이러스 관련 유전자들의 발현양이 증가됨을 확인하였다. 결론적으로 낙산균에 의해 자극된 면역세포에서 선천면역의 주요 유전자들의 전사가 유도되고 유도된 주요 유전자들에 의해 만들어지는 인터페론을 포함하는 사이토카인들에 의해서 외부로부터의 RNA 혹은 DNA 바이러스들의 복제를 억제할 수 있다(도 12).
실시예 6. 마우스 대식세포주에서의 S-45-5 균주의 항바이러스 관련 신호 전달 분자들의 활성화 검증
도 13과 같이 TLR4 리간드인 LPS를 처리한 Raw 264.7 세포처럼 낙산균을 처리한 세포에서 시간이 지남에 따라 인터페론 신호전달 경로의 활성화와 관련이 있는 IRF3, TBK1, STAT1 분자들의 인산화를 확인하였고, 염증작용과 관련된 사이토카인의 분비에 관련하는 NF-kB 신호전달 경로의 활성화가 p65, ERK, p38 등의 인산화에 의해 확인되었다(도 13). 대조구의 Raw 264.7 세포와 비교하여 TLR4 리간드인 LPS를 처리한 Raw 264.7 세포와 낙산균을 처리한 Raw 264.7 세포에서는 LPS 및 낙산균을 처리하고 8시간부터 IRF3, TBK1, STAT1 분자들의 인산화 및 p65, ERK, p38 등의 인산화가 이루어짐을 확인하여 인터페론 신호전달 경로의 활성화와 염증작용과 관련된 사이토카인의 분비 활성화가 이루어짐을 확인하였다.
실시예 7. 마우스에서 S-45-5 균주의 인플루엔자 바이러스 감염 억제 실험
도 14와 같이 바이러스 공격 후 대조구 그룹에서는 9일 이내에 모두 치사된 것에 반해 낙산균 (S-45-5)을 경구 투여한 그룹에서는 20%만이 치사되었고, 체중변화 역시 회복됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 낙산균의 경구 투여로 인해 마우스의 선천면역이 증강되어 인플루엔자 바이러스 감염 및 증식을 억제함으로써 마우스의 생존에 탁월한 효능을 보이는 것으로 확인되었다(도 14).
실시예 8. 마우스에서 S-45-5 균주의 사이토카인과 IgA 분비 유도 실험
낙산균을 경구 투여한 마우스의 혈청과 BALF(bronchoalveolar lavage fluid) 그리고 소장 내 IFN-β와 염증성 사이토카인인 IL-6의 분비량이 증가하였고, 분비형 IgA가 유도됨을 확인하였다. 결론적으로 낙산균의 경구 투여가 혈액 내, 소화기계, 호흡기계에서 여러 면역인자들의 분비를 촉진하는 것으로 보아, 낙산균이 전신적인 면역증강에 탁월한 효능을 보이는 것으로 분석되었다(도 15).
실시예 9. Fb5 -3 균주의 항바이러스 활성 실험 및 세포독성 시험
도 16 내지 도 21과 같이 낙산균 (Fb5-3)의 항바이러스 효과를 입증하기 위해 면역세포와 상피세포에서 GFP의 발현을 통해 바이러스의 증식 정도를 확인하였고, 그 결과 인터페론-β를 전처리한 세포에서와 마찬가지로 낙산균을 처리한 세포에서도 RNA 바이러스뿐만 아니라 DNA 바이러스의 증식도 현저히 감소하였다(도 16 내지 도 21의 Viral Titer 또는 Viral Replication으로 표시한 값 참고). 또한 세포독성실험 결과, 바이러스 증식에 의한 세포사멸 역시 감소하는 것으로 나타났다. 결론적으로 S-45-5 균주와 같이 Fb5-3 균주의 항바이러스 효능이 입증되었다(도 16 내지 도 21).
실시예 10. Fb5 -3 균주의 선천면역인자( pro - inflammatory Cytokine & Interferon) 유도 효능 검증
도 22와 같이 낙산균에 의해 면역세포인 Raw264.7 세포로부터 선천면역인자 사이토카인의 유도능이 강하게 나타났다. TNF-α는 면역 및 염증반응의 매개물질로 대식세포주를 활성화시키며 B-세포를 증식시키고, IL-6는 B-세포를 활성화시켜 항체생산을 증가시켜 항원특이적 면역반응을 촉진하는 중요한 사이토카인이다. 따라서, 낙산균으로 인해 면역작용이 증가한다고 할 수 있다(도 22).
실시예 11. 분리 균주의 내산성 및 내담즙성
내산성 결과 2개의 낙산균 모두 pH 2에서 60%, pH 3에서 90%의 생존율을 나타내었다. pH 2에서 60% 이상의 생존율을 보여 상당한 내산성을 보이고 있다(표 1). 내담즙성 결과 2개의 낙산균 모두 담즙산이 3% 함유된 배지에서 성장할 수 있을 정도의 내성을 가지고 있으므로 담즙산 내성이 높다(도 23).
균주 내산성
pH1 pH2 pH3 pH4 pH5 pH6
Fb5-3 -a + + ++ ++ ++
S-45-5 - + + ++ ++ ++
a -, 0%; w, 60% 이하; +, 60～90%; ++, 90% 이상
실시예 12. 분리 균주의 유해세균 길항능력 시험
pH를 조절하지 않은 배양상등액(pH 4)에서 Fb5-3 균주의 경우 엔테로박터 클로아세아(Enterobacter cloacea), 슈도모나스 에로기노사(Pseudomonas aeroginosa), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes) 및 푸소박테리움 바리움(Fusobacterium varium)에 대해 항균력을 가지는 것으로 보였고, S-45-5 균주의 경우 슈도모나스 에로기노사(Pseudomonas aeroginosa), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes)에 대해 항균력을 가지는 것으로 보였다. pH를 조절한 분리균주들의 배양상등액(pH 6)에서는 병원균에 대한 항균력이 나타나지 않았다(표 2). 이들 병원성세균이 억제되는 기작은 생성되는 낙산과 pH 저하 그리고 항균물질의 생성 등 여러 요인이 관련된 것으로 추측된다.
균주 엔테로박터 클로아세아 슈도모나스 에로기노사 비브리오 파라헤몰리티커스 엔테로박터 에로게네스 푸소박테리움 바리움
pH4 pH6 pH4 pH6 pH4 pH6 pH4 pH6 pH4 pH6
Fb5-3 + - + - + - + - + -
S-45-5 - - + - - - + - + -
a Inhibition zones (mm, diameter); -, 0mm; w+, 1mm 이하; +,1mm 이상
실시예 13. 분리 균주의 항생제 감수성 시험
항생제에 대한 억제환을 분석한 결과 2개의 낙산균 모두 9가지의 항생제 중 페니실린(10㎍/disc), 테트라사이클린(30㎍), 앰피실린(10㎍), 반코마이신(30㎍)에 대해 20mm 이상의 억제환이 나타나 내성이 가장 없음을 나타내었으며, 카나마이신(30㎍), 세팔로신(30㎍), 클린다마이신(2㎍), 젠타마이신(10㎍)에 대해서는 20mm 이하의 억제환이 나타나 미약한 감수성을 나타내었다. 또한 스트렙토마이신(10㎍)의 항생제에 대해 강한 내성을 보이는 것으로 확인되었다(표 3).
균주 카나마이신
(클리어존,
mm)		 페니실린 세팔로신 클린다마이신 테트라사이클린 젠타마이신 스트렙토마이신 앰피실린 반코마이신
Fb5-3 12 20 17 16 28 11 - 31 20
S-45-5 14 26 19 17 35 15 8 27 28
실시예 14. 분리 균주의 유산균의 증식 촉진시험
분석 결과 Fb5-3 균주 배양액에 대해 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 53%, 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 50%, 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카레이(L. paracasei subsp . Paracarei) 150%, 락토바실러스 카제이(L. casei) 25%, 비피도박테리움 카테눌라툼(B. catenulatum) 114%의 증식 효과를 보였다. S-45-5 균주 배양액에 대해 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 15%, 락토바실러스 살리바리우스 (L. salivarius) 100%, 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 25%, 락토바실러스 사케이 아종 사케이 (L. sakei sub . sakei) 76%, 비피도박테리움 카테눌라툼(B. catenulatum) 71%의 증식 효과를 보였다. Fb5-3와 S-45-5의 배양 상등액을 접종한 유산균은 모두 락토바실러스 사케이 아종 사케이 (L. sakei sub . sakei)와 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus)에 증식 효과를 보였다(표 4).
균주 Fb5-3 S-45-5
배양액 상등액 배양액 상등액
Lactobacillus plantarum +a - w -
Lactobacillus reuteri - - - -
Lactobacillus salivarius - - ++ -
Lactobacillus rhamnosus + - w -
Lactobacillus paracasei subsp . paracasei ++ - - -
Lactobacillus sakei sub . sakei - w + w
Lactobacillus acidophilus - w - w
Lactobacillus casei w - - -
Enterococcus faecium - - - -
Bifidobacterium longum subsp . longum - - - -
Bifidobacterium catenulatum ++ w + w
Bifidobacterium longum subsp . infantis - - - -
Bifidobacterium bifidum - - - -
a -, 0%; w, 50% 이하; +, 50∼99%; ++, 100% 이상
실시예 15. 분리 균주의 장내 정착력 시험
분리 균주의 장내 정착력 시험 결과 107 CFU/ml를 감염시켰을 때 부착된 균의 수는 약 104CFU/ml 정도로 나타났으며, 감염시키는 균수를 증가시키면 부착되는 균수도 조금씩 증가되는 경향을 보였다. 균주 107 CFU/ml과 108CFU/ml를 감염시킨 경우에는 HT29 세포주에서 59%의 부착율을 보였으며, Caco-2 세포주에서는 65%의 부착율을 보여 Caco-2 세포주에 더 많이 부착되는 경향을 보였지만 109CFU/ml를 감염시킨 경우에는 두 세포주간의 차이에 통계학적 유의성이 없었다.
한국생명공학연구원 KCTC12753BP 20150203 한국생명공학연구원 KCTC12754BP 20150203
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Clostridium butyricum strain enhancing immunity and having antiviral activity and uses thereof <130> PN14381 <160> 4 <170> KoPatentIn <210> 1 <211> 1388 <212> DNA <213> Clostridium butyricum <400> 1 nggcgtggcg gcgtgcttac catgcagtcg agcgatgaag ctccttcgga agtggattag 60 cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctcata gaggggaata gcctttcgaa 120 aggaagatta ataccgcata agattgtagt accgcatggt acagcaatta aaggagtaat 180 ccgctatgag atggacccgc gtcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc 240 gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacatt gggactgaga cacggcccag 300 actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gggaaaccct gatgcagcaa 360 cgccgcgtga gtgatgacgg ccttcgggtt gtaaaactct gtctttgggg acgataatga 420 cggtacccaa ggaggaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 480 ggcaagcgtt gtccggattt actgggcgta aagggagcgt aggtggatat ttaagtggga 540 tgtgaaatac tcgggcttaa cctgggtgct gcattccaaa ctggatatct agagtgcagg 600 agaggaaagg agaattccta gtgtagcggt gaaatgcgta gagattagga agaataccag 660 tggcgaaggc gcctttctgg actgtaactg acactgaggc tcgaaagcgt ggggagcaaa 720 caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga atactaggtg taggggttgt 780 catgacctct gtgccgccgc taacgcatta agtattccgc ctggggagta cggtcgcaag 840 attaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcag cggagcatgt ggtttaattc 900 gaagcaacgc gaagaacctt acctagactt gacatctcct gaattactct gtaatggagg 960 aagccacttc ggtggcagga agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttattgt tagttgctac catttagttg 1080 agcactctag cgagactgcc cgggttaacc gggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1140 catgcccctt atgtctaggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaat gagatgcaac 1200 ctcgcgagag tgagcaaaac tataaaaccg atctcagttc ggattgtagg ctgaaactcg 1260 cctacatgaa gctggagttg ctagtaatcg cgaatcagaa tgtcgcggtg aatacgttcc 1320 cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagttgg caatacccaa agttcgtgag 1380 ctaacccg 1388 <210> 2 <211> 1424 <212> DNA <213> Clostridium butyricum <400> 2 gncggngtgc taccatgcag tcgagcgatg aagctccttc gggagtggat tagcggcgga 60 cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctc atagagggga atagcctttc gaaaggaaga 120 ttaataccgc ataagattgt agtaccgcat ggtacagcaa ttaaaggagt aatccgctat 180 gagatggacc cgcgtcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg 240 cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac attgggactg agacacggcc cagactccta 300 cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggggaaac cctgatgcag caacgccgcg 360 tgagtgatga cggtcttcgg attgtaaagc tctgtcttta gggacgataa tgacggtacc 420 taaggaggaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 480 gttgtccgga tttactgggc gtaaagggag cgtaggtgga tatttaagtg ggatgtgaaa 540 tacccgggct taacctgggt gctgcattcc aaactggata tctagagtgc aggagaggaa 600 aggagaattc ctagtgtagc ggtgaaatgc gtagagatta ggaagaatac cagtggcgaa 660 ggcgcctttc tggactgtaa ctgacactga ggctcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 720 agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatactag gtgtaggggt tgtcatgacc 780 tctgtgccgc cgctaacgca ttaagtattc cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa 840 ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cagcggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 900 cgcgaagaac cttacctaga cttgacatct cctgaattac tctgtaatgg aggaagccac 960 ttcggtggca ggaagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1020 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc taccatttag ttgagcactc 1080 tagcgagact gcccgggtta accgggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1140 cttatgtcta gggctacaca cgtgctacaa tggtcggtac aatgagatgc aacctcgcga 1200 gagtgagcaa actataaaac cgatctcagt tcggattgta ggctgaaact cgcctacatg 1260 aagctggagt tgctagtaat cgcgaatcaa atgtcgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1320 tacacacgcc cgtcacacca tgagagttgg cataccaagt tcgtgagcta accgcagagc 1380 agcgacctat ggtaggtcag cgattgnggt gagncgtaac aggg 1424 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agagtttgat ccctcag 17 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (13)

  1. 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 클로스트리디움 부티리쿰 균주는 항균성, 내산성 및 내담즙성을 가지며, 부티르산(butyric acid) 및 아세트산(acetic acid)을 생산하는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 클로스트리디움 부티리쿰 균주는 클로스트리디움 부티리쿰 Fb5-3 균주(KCTC12753BP) 또는 클로스트리디움 부티리쿰 S-45-5 균주(KCTC12754BP)인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 바이러스는 오르토믹소비리대(Orthomixoviridae), 랍도비리대(Rhabdoviridae), 파라믹소비리대(Paramixoviridae) 및 허피스비리대(Herpesviridae) 중에서 선택된 하나 이상의 바이러스인 것을 특징으로 하는 면역 증진 및 항바이러스용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 오르토믹소비리대(Orthomixoviridae)는 인플루엔자바이러스(Influenza virus)이고, 랍도비리대(Rhabdoviridae)는 수포성구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus)이며, 파라믹소비리대(Paramixoviridae)는 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus)이고, 허피스비리대(Herpesviridae)는 단순포진바이러스인 것을 특징으로 하는 면역 증진 및 항바이러스용 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항균성은 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 및 푸소박테리움 속(Fusobacterium sp.) 중에서 선택된 하나 이상에 대한 항균성인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항균성은 엔테로박터 클로아세아(Enterobacter cloacea), 슈도모나스 에로기노사(Pseudomonas aeroginosa), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes) 및 푸소박테리움 바리움(Fusobacterium varium) 중에서 선택된 하나 이상에 대한 항균성인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 또는 사료 첨가제 형태인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 부티르산(butyric acid) 또는 아세트산(acetic acid) 생산용 조성물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 부티르산 또는 아세트산을 생산하는 방법.
KR1020150042407A 2015-03-26 2015-03-26 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도 KR101773059B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150042407A KR101773059B1 (ko) 2015-03-26 2015-03-26 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도
CN201680003213.7A CN107075460B (zh) 2015-03-26 2016-03-22 具有增强免疫及抗病毒活性的丁酸梭菌菌株及其用途
PCT/KR2016/002839 WO2016153247A1 (ko) 2015-03-26 2016-03-22 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150042407A KR101773059B1 (ko) 2015-03-26 2015-03-26 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160115202A true KR20160115202A (ko) 2016-10-06
KR101773059B1 KR101773059B1 (ko) 2017-08-31

Family

ID=56978890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150042407A KR101773059B1 (ko) 2015-03-26 2015-03-26 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도

Country Status (3)

Country Link
KR (1) KR101773059B1 (ko)
CN (1) CN107075460B (ko)
WO (1) WO2016153247A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102249897B1 (ko) * 2019-12-13 2021-05-10 옥민 부티르산 생산능, 유해세균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 obl_1 균주 및 이의 용도
JP7067827B1 (ja) * 2021-03-11 2022-05-16 ミヤリサン製薬株式会社 インターフェロン産生促進剤

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2989889A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Ascus Biosciences, Inc. Methods, apparatuses, and systems for analyzing microorganism strains from complex heterogeneous communities, predicting and identifying functional relationships and interactions thereof, and selecting and synthesizing microbial ensembles based thereon
US10851399B2 (en) 2015-06-25 2020-12-01 Native Microbials, Inc. Methods, apparatuses, and systems for microorganism strain analysis of complex heterogeneous communities, predicting and identifying functional relationships and interactions thereof, and selecting and synthesizing microbial ensembles based thereon
US9938558B2 (en) 2015-06-25 2018-04-10 Ascus Biosciences, Inc. Methods, apparatuses, and systems for analyzing microorganism strains from complex heterogeneous communities, predicting and identifying functional relationships and interactions thereof, and selecting and synthesizing microbial ensembles based thereon
AU2017206051B2 (en) 2016-01-07 2023-04-20 Native Microbials, Inc. Methods for improving milk production by administration of microbial consortia
EP3562954A1 (en) 2016-12-28 2019-11-06 Ascus Biosciences, Inc. Methods, apparatuses, and systems for analyzing complete microorganism strains in complex heterogeneous communities, determining functional relationships and interactions thereof, and identifying and synthesizing bioreactive modificators based thereon
CN106591195B (zh) * 2016-12-29 2019-10-08 中国科学院水生生物研究所 一种适用于水产动物的微生物免疫增强剂及其应用
CN110913702A (zh) 2017-04-28 2020-03-24 埃斯库斯生物科技股份公司 利用微生物的人造生物集合在反刍动物中用于支持谷物加强剂和/或能量加强剂饮食的方法
EP3619315A4 (en) * 2017-05-05 2021-01-27 White Dog Labs, Inc. SINGLE CELL PROTEIN PRODUCTS AND INTEGRATED PROCESS FOR THE MANUFACTURING OF ETHANOL AND SINGLE CELL PROTEIN
CN108478603B (zh) * 2018-04-03 2020-09-04 潍坊华英生物科技有限公司 一种灭活丁酸梭菌注射剂
CN108342345A (zh) * 2018-04-27 2018-07-31 江南大学 一种唾液乳杆菌特异性培养基及其应用
KR20190127156A (ko) * 2018-05-03 2019-11-13 씨제이제일제당 (주) 항바이러스 및 면역조절 효능을 가지는 락토바실러스 플란타럼 cjlp17 및 이를 포함하는 조성물
WO2021234650A1 (en) * 2020-05-21 2021-11-25 Superbrewed Food, Inc. Method of treating or preventing an infection
CN113308396B (zh) * 2021-05-18 2023-03-21 上海市公共卫生临床中心 一种植物乳杆菌及在制备新冠疫苗免疫增强剂中的应用
KR102587892B1 (ko) 2021-07-21 2023-10-12 주식회사 에치와이 홍삼을 영양원으로 이용하여 균주의 특성이 강화되고 면역 기능이 증진된 락토바실러스 파라카제이 hy7017 균주 및 이의 용도
CN115704002B (zh) * 2021-08-11 2024-04-26 北京科为博生物科技有限公司 一种丁酸梭菌cc02001及其应用
CN116998635A (zh) * 2023-08-28 2023-11-07 威海优乐生物科技有限公司 一种南美白对虾养殖用饲料添加剂及其制备方法和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10194980A (ja) * 1996-11-15 1998-07-28 Nippon Kayaku Co Ltd 水産養殖動物のウイルス感染防除方法、ウイルス感染防除剤及び酪酸菌死菌体の使用
JP2010095504A (ja) 2008-10-17 2010-04-30 Ace Bio Product Kk 微生物を活用した口内炎及び帯状疱疹剤の発明
KR20110124976A (ko) * 2010-05-12 2011-11-18 일동제약주식회사 장내 유해세균 억제능과 면역 증강작용을 하는 클로스트리디움 부티리쿰 아이디씨씨 9207 백미 발효물
US9854804B2 (en) * 2011-01-04 2018-01-02 Korean Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Antifungal composition comprising polycyclic peptide compound and method for preparing the same
KR101335454B1 (ko) * 2011-11-29 2013-12-02 (주) 피엘바이오 신규한 락토바실러스 속 균주 및 이의 생균제 용도
KR20140114524A (ko) * 2013-03-15 2014-09-29 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 신규한 부틸산 생산 균주

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102249897B1 (ko) * 2019-12-13 2021-05-10 옥민 부티르산 생산능, 유해세균에 대한 항균 활성, 혈전분해 활성, 리폭시게나아제 억제 활성 및 지질과산화물 생성 억제 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 obl_1 균주 및 이의 용도
JP7067827B1 (ja) * 2021-03-11 2022-05-16 ミヤリサン製薬株式会社 インターフェロン産生促進剤
WO2022190317A1 (ja) * 2021-03-11 2022-09-15 ミヤリサン製薬株式会社 インターフェロン産生促進剤

Also Published As

Publication number Publication date
KR101773059B1 (ko) 2017-08-31
CN107075460B (zh) 2020-12-25
WO2016153247A1 (ko) 2016-09-29
CN107075460A (zh) 2017-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101773059B1 (ko) 면역 증진 및 항바이러스 활성을 가지는 클로스트리디움 부티리쿰 균주 및 이의 용도
KR101772870B1 (ko) 프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 플란타럼 및 이의 용도
ASML A et al. The beneficial role of probiotics in monogastric animal nutrition and health
KR101075557B1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
KR101452234B1 (ko) 장수마을 성인으로부터 분리한 배변활동에 도움을 주는 신규한 유산균 락토바실러스 퍼멘텀
KR20110006455A (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
CA2776868A1 (en) Compositions and methods and uses related thereto
EP3747989A1 (en) Lactobacillus plantarum cjlp17 having antiviral and immunomodulatory efficacy and composition comprising same
KR20120100608A (ko) 면역관련 및 염증성 질환의 예방 및 치료 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 사케이(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ) Ｋ101
EP3950928A1 (en) Kimchi lactic acid bacteria lactobacillus sakei wikim0109 having efficacy for relief of arthritis
KR102175113B1 (ko) 항바이러스 효과 및 면역조절 효능을 가지는 락토바실러스 플란타럼 cjlp475 균주 및 이를 포함하는 조성물
Asghar et al. Selection, characterisation and evaluation of potential probiotic Lactobacillus spp. isolated from poultry droppings
KR20160046826A (ko) 유아의 과도한 울음용 프로바이오틱
JP4565057B2 (ja) イムノグロブリンａ誘導能の高い新規乳酸菌
KR101075558B1 (ko) 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물
KR20180011490A (ko) 프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 퍼멘텀 및 이의 용도
CN110997898A (zh) 包括植物乳杆菌cjlp475菌株和植物乳杆菌cjlp17菌株的组合物及其用途
KR20180075463A (ko) 프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 퍼멘텀 및 이의 용도
KR101772875B1 (ko) 프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 플란타럼 및 이의 용도
KR102175115B1 (ko) 락토바실러스 플란타럼 cjlp475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 cjlp243 균주를 포함하는 조성물 및 이의 용도
KR102327753B1 (ko) 면역 증진, 항바이러스 및 항균 활성을 가지는 유산균 YH-Lpro-37 및 이의 용도
KR100954882B1 (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 감염억제 효과를 가지는 신규 유산균 및 이를 포함하는 조성물
KR101772872B1 (ko) 프로바이오틱 활성을 갖는 신규 락토바실러스 플란타럼 및 이의 용도
KR101838280B1 (ko) 관절염의 개선 활성을 갖는 류코노스톡 시트리움 wikim56 및 이를 포함하는 조성물
JP2015513911A (ja) 新たに分離したバチルス・リケニフォルミス及びそれを利用したプロバイオティクス

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant