KR102215401B1 - 연골 모자이크 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

다수의 상호연결된 연골 타일을 포함하는 연골 시트 및 생체적합성 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 다수의 상호연결된 연골 타일을 포함하는 연골 시트를 포함하는 연골 조성물의 제조 방법이 또한 제공된다.

Description

연골 모자이크 조성물 및 방법{CARTILAGE MOSAIC COMPOSITIONS AND METHODS}

<관련 출원의 상호-참조>

본 출원은 2013년 2월 22일 출원된 U.S. 가출원 제61/768,190호의 우선권을 주장하고, 이의 전체 내용은 참고문헌으로써 본원에 포함된다.

<연방 후원 연구 및 개발 하에 이루어지는 발명의 권리에 대한 설명>

해당 없음

<콤팩트 디스크 상으로 제출된 "서열 목록", 표 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록 참조>

해당 없음

연골 조직은 인간의 인체 전체에 걸쳐 발견될 수 있다. 연골 조직 내 세포는 연골세포로 지칭된다. 이러한 세포는 연골의 형성 및 유지와 연관되어 있는 콜라겐, 프로테오글리칸 및 엘라스틴과 같은 단백질을 생성시킨다. 특정 골 표면에는 유리질 연골이 존재하고, 그것은 통상적으로 관절 연골로 지칭된다. 관절 연골은 상당량의 콜라겐(관절 연골 건조 중량의 약 3분의 2)을 함유하며, 콜라겐의 가교-결합은 조직에 고도의 재료 강도 및 견고성을 부여한다. 이러한 기계적 특성은 신체 내에서의 관절 연골의 적정한 성능에 중요하다.

관절 연골은 혈관화되지 않고, 외상 또는 퇴행성 원인의 결과로 손상될 경우, 이와 같은 조직은 생체내 자가-복구 능력을 거의 또는 전혀 가지지 않는다. 다양한 치료용 용액들이 손상되거나 퇴화된 연골의 치료 및 복구를 위해 제시되어 있다. 조직 치유는 손상 부위를 둘러싸는 조직의 세포를 재분배하는 세포 이동을 포함한다. 그러나, 연골 조직에서, 연골세포가 그것의 고유한 골소강 위치로부터 이동하는 능력은 추정상의 매트릭스의 강도에 의해 매우 제한될 수 있다. 이동 결함을 보완하기 위하여, 연골 복구를 위한 다양한 외과적 수술은 회복 세포 또는 조직을 전달하는 것에 초점을 둔다. 예를 들어, 비록 그 결과의 섬유연골의 기계적 내구성이 흔히 만족스럽지 못하지만, 골수 자극술은 연골하골을 파괴함으로써 골수세포를 두드리기를 시도한다. 자가 연골세포 이식술(ACI)은 배양-확대된 연골세포의 전달을 통해 치료 부위에 연골세포 존재를 직접 쌓는다. 어느 정도의 임상적 성공과 관련되는 것에도 불구하고, ACI는 세포 배양 제제, 두-단계 외과적 수술 및 결손 부위에 연골의 작은 조각을 위치시키도록 하는 도전적인 수술 측면과 같은 기술적 난점과 연관된다.

한 측면에서, 모자이크 연골 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하기를 포함한다:

다수의 상호연결된 연골 타일을 포함하는 연골 시트; 및

생체적합성 담체.

일부 실시양태에서, 조성물은 연골 시트의 최대 두께 미만인 깊이를 갖는 채널에 의해 분리되는 타일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연골 시트는 약 0.25 mm 내지 약 5 mm의 최대 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 채널 밑에 있는 연골은 0.25 mm 미만의 두께를 갖는다.

일부 실시양태에서, 조성물은 천공에 의해 분리되는 타일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 천공은 미세천공이다.

일부 실시양태에서, 연골은 관절 연골이다. 일부 실시양태에서, 연골은 비-탈세포화 연골이다. 일부 실시양태에서, 연골은 연령 15세 이상인 인간 성인 사체 공여자로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 연골은 인간 소아 사체 공여자로부터의 것이다.

일부 실시양태에서, 타일은 둥근 형상이다. 일부 실시양태에서, 타일은 약 0.5 mm 내지 약 3 mm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 타일은 정사각형 또는 직사각형 형상이다. 일부 실시양태에서, 연골 타일은 약 0.5 mm 내지 약 3 mm의 평균 길이 및/또는 너비를 갖는다. 일부 실시양태에서, 타일은 크기 및/또는 형상이 실질적으로 균일하다.

일부 실시양태에서, 연골 시트는 하나 이상의 채널 밑 연골 내 천공을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 천공은 미세천공이다.

일부 실시양태에서, 생체적합성 담체는 동결보존 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 디메틸 술폭시드(DMSO) 및 혈청을 포함한다.

일부 실시양태에서, 연골 시트의 적어도 일부분은 생물학적 접착제로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 접착제는 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 피브린 아교, 폴리사카라이드 겔, 시아노아크릴레이트 아교, 젤라틴-레조르신-포르말린 접착제, 콜라겐 겔, 합성 아크릴레이트-기재 접착제, 셀룰로스-기재 접착제, 기저막 매트릭스, 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 자가 아교 또는 이들의 조합이다.

일부 실시양태에서, 연골 시트의 적어도 일부분은 탈무기질화 골과 결합된다. 일부 실시양태에서, 연골 시트의 적어도 일부분은 줄기 세포가 접종된 골 또는 연골 기질과 결합된다.

또 다른 측면에서, 모자이크 연골 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 하기를 포함한다:

인간 사체 공여자로부터의 연골 조직 수득 단계;

연골 조직을 다수의 채널 또는 천공을 갖도록 절단하여, 채널에 의해 분리된 다수의 상호연결된 연골 타일을 포함하는 연골 시트를 형성하는 절단 단계; 및

생체적합성 배지에의 연골 시트 현탁 단계.

일부 실시양태에서, 절단 단계가 연골 조직을 다수의 채널을 갖도록 절단하는 것을 포함하고, 여기서 다수의 채널 각각은 연골 조직의 최대 두께 미만인 깊이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 단계 전에, 연골 조직이 약 0.25 mm 내지 약 5 mm의 최대 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 다수의 채널 밑에 있는 연골이 0.25 mm 미만의 두께를 갖는다.

일부 실시양태에서, 절단 단계가 연골을 다수의 천공을 갖도록 절단하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 천공은 미세천공이다.

일부 실시양태에서, 연골 조직은 관절 연골 조직이다. 일부 실시양태에서, 연골 조직은 연령 15세 이상인 인간 성인 사체 공여자로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 연골 조직은 인간 소아 사체 공여자로부터의 것이다.

일부 실시양태에서, 절단 단계는 레이저 커터로, 기계식 블레이드로 또는 기계식 프레스로 연골 조직을 절단하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 단계는 레이저 커터로 연골 조직을 절단하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 단계는 약 15 % 내지 약 55 %의 속도, 약 2 % 내지 약 65 %의 전력 및 약 200 Hz 내지 약 2600 Hz의 주파수로 레이저 커터를 이용하여 연골 조직을 절단하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 절단 단계는 둥근 형상인 타일을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 타일은 약 0.5 mm 내지 약 3 mm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 단계는 정사각형 또는 직사각형 형상인 타일을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 타일은 약 0.5 mm 내지 약 3 mm의 평균 길이 및/또는 너비를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 단계는 크기 및/또는 형상이 실질적으로 균일한 타일을 형성하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 채널 밑 연골 내 천공을 만드는 것을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 천공은 미세천공이다.

일부 실시양태에서, 절단 단계 다음에, 방법은 식염수로 연골 시트를 세척하는 것을 더 포함한다.

일부 실시양태에서, 생체적합성 담체는 동결보존 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 디메틸 술폭시드(DMSO) 및 혈청을 포함한다.

일부 실시양태에서, 현탁 단계 전에, 방법은 연골 시트의 적어도 일부분을 생물학적 접착제로 코팅하는 것을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 현탁 단계 전에, 방법은 연골 시트의 적어도 일부분을 탈무기질화 골과 결합시키는 것을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 현탁 단계 전에, 방법은 연골 시트의 적어도 일부분을 줄기 세포가 접종된 골 또는 연골 기질과 결합시키는 것을 더 포함한다.

또 다른 측면에서, 대상체에서의 연골 또는 골 결함 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법이 본원에 기재되는 바와 같은 모자이크 연골 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 대상체에서의 연골 복구 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법이 본원에 기재되는 바와 같은 모자이크 연골 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 키트(예를 들어, 대상체에서의 연골 또는 골 결함을 치료하기 위한 또는 대상체에서의 연골을 복구하기 위한)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재되는 바와 같은 모자이크 연골 조성물을 포함한다.

도 1은 연골 조직으로부터 처리된 연골 구조체의 예. (A) 연골은 직사각형 컬럼 형상을 갖는 입자로 절단될 수 있다. (B) 연골 입자는 원기둥 또는 타원 컬럼 형상을 갖는 입자로 절단될 수 있다. (C) 연골은 상호연결된 타일형 또는 모자이크 구조체로 절단될 수 있다. 예를 들어, 연골 구조체는 너비 A, 길이 B 및 높이 C를 가질 수 있다. 구조체의 절단부, 새김부 또는 채널은 깊이 F 및 너비 H를 갖는다. 개별 컬럼은 높이 F, 너비 E 및 길이 D를 갖는다. 절단 후, 구조체는 최소 두께 G를 갖는다. (D) 연골 조직은 예를 들면 레이저를 사용하여 두 개 이상의 측면(예컨대 상부 및 하부)에서 절단될 수 있다.
도 2. 알려져 있는 연골세포 농도를 갖는 샘플의 표준 곡선. y-축은 카운테스®(Countess®) 자동화 세포 계수기로부터의 형광 판독치를 나타내며, x-축은 연골세포 농도(세포/μl)를 나타낸다.
도 3. 6-웰 조직 배양 플레이트에 위치된 (A) 성인 공여자 A로부터의 연골세포 샘플 및 (B) 소아 공여자 B로부터의 연골세포 샘플의 평균 형광 판독치.
도 4. 1 일차 및 6 주 배양 후에 측정된, 성인 공여자로부터 및 소아 공여자로부터의 연골세포 샘플의 평균 형광 판독치.
도 5. 공여자 C, D, E, F 및 G(각각 공여자 1, 2, 3, 4 및 5로 지칭되기도 함)에 대한 트리판 블루(Trypan Blue) 세포 생존률 검정. 레이저 절단 및 수동 절단 연골 입자에 대하여 세포 생존률을 측정하였다. 평균 세포 생존율은 백분율로 나타낸다. 용어 "신규(Denovo)"는 1 mm 정사각형으로 수동 절단된 소아 연골 생성물을 지칭한다.
도 6. 도 5의 하부 패널에 나타난 트리판 블루 및 프레스토 블루(Presto Blue) 검정의 살아있는 세포 계수 데이터를 도시하는 그래프.
도 7. 레이저 절단 및 수동 절단 연골 입자에 대한 6 주에서의 트리판 블루 세포 생존률 검정.
도 8. 수동 절단(A) 및 레이저 절단(B) 연골 조각의 조직 가장자리(백색 화살표)를 도시하는 공초점 현미경 이미지. 세포를 가시화하기 위하여, 미분해 연골 샘플에 인비트로겐(Invitrogen) 라이브/데드®(LIVE/DEAD®) 염색제를 사용하였다.
도 9. 수동 절단(A) 및 레이저 절단(B) 성인 연골 입자로부터 성장하는 연골세포 세포의 4x 배율 사진 이미지. 10 % FBS 및 2 % 항생제를 함유하는 연골세포 성장 배지가 있는 12-웰 배양 플레이트에 연골 입자를 위치시켰다. 배지는 주 2 회 교체하였다. 플레이트는 표준 세포 배양 조건(5 % CO₂를 포함하는 37 ℃ 인큐베이터) 하에서 배양하였으며, 이미지는 18 일에 얻었다.
도 10. 연골 조성물에 대한 예시적인 제조 방법의 개략도.
도 11. (A) 예시적인 모자이크 연골 구조체. 모자이크 연골 구조체(1100)는 바람직한 너비 또는 치수의 채널에 의해 분리되는 다중 타일을 포함할 수 있다. 타일은 임의의 바람직한 형상(예컨대, 정사각형)일 수 있고 임의의 바람직한 치수(예컨대, 약 1 mm x 1 mm 정사각형)일 수 있다. 모자이크 연골 구조체는 또한 하나 이상의 구멍(1110)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 구멍(1110)은 구조체의 한 측면(예컨대, 상부 표면)으로부터 구조체의 반대 측면(예컨대, 하부 표면)까지, 구조체를 통과하여 뻗는 구멍 또는 통로를 나타낼 수 있다. 구멍(1110)은 임의의 바람직한 형상(예컨대, 정사각형, 원 또는 타원)일 수 있고, 임의의 바람직한 치수(예컨대, 약 1 mm 직경 원, 약 1 mm x 1 mm 정사각형)를 가질 수 있다. (B) 모자이크 연골 구조체 내 구멍은 모자이크 연골 구조체 내부 및 이를 통과하는 영양소 또는 액체 관류를 허용하거나 강화시키도록 작동할 수 있다.
도 12. 모자이크 패턴 또는 원-형상 타일을 포함하는 예시적인 모자이크 연골 구조체(1200).
도 13. 각각 정사각형-형상 타일의 모자이크 패턴을 포함하는, 두 예시적인 모자이크 연골 구조체(1300) 및 (1310).
도 14. 모자이크 연골 구조체(1400)는, 배양 플라스크 또는 웰 또는 적용 부위에 구조체를 고정하도록 사용될 수 있는, 생물학적 접착제(예컨대, 피브린 겔 또는 아교 물질)로 코팅될 수 있다. 세포는 연골 구조체로부터, 예를 들어, 타일로부터 및 두 타일 사이에 배치된 채널로, 성장할 수 있다. 비슷하게, 세포는 다른 구조체 표면, 예를 들어 연골과 적용 부위 사이(예컨대, 플라스크의 표면, 플레이트 웰 또는 환자 치료 부위)로부터 성장할 수 있다.
도 15. 13 일차, 10x 배율의 소아 모자이크 연골 구조체. 세포는 모자이크 연골 가장자리 및 연골 구조체 밑으로부터 성장하는 것으로 보여질 수 있다.
도 16. 모자이크 연골 구조체의 4x 배율(A) 및 10x 배율(B). (A) 및 (B) 모두에서, 연골 세포는 연골 구조체로부터, 피브린 아교를 통해, 구조체를 떠나 성장하는 것으로 보여질 수 있다.
도 17. (A) 교합 형상을 가진 연골 입자. 연골 입자(1700)는 다중 돌출부(1710)를 갖는다. (B) 연골 입자의 돌출부는 다중 돌출부를 갖는 제2 연골 입자의 돌출부와 교합할 수 있고, 따라서 입자를 함께 유지하거나, 또는 입자가 서로에 관해 이동하는 것을 억제하도록 작동한다.
도 18. 중간 채널 부에 의해 분리된 다중 타일을 갖는 연골 구조체. 불연속적인 천공이 또한 채널에 적용될 수 있다(예컨대, 채널을 따라 점선을 형성하여 찢는 스트립 또는 천공된 찢는 선 특징부를 제공). 따라서, 연골 구조체는 채널 부 및 채널 부 내 천공을 모두 포함할 수 있다. 연골 구조체의 두께를 통과하여 연장될 수 있는 이러한 천공은, 연골 구조체가 적용되는 기초를 이루는 골 또는 조직으로부터 영양소 및 세포의 이동을 가능하게 할 수 있다.
도 19. 중간 채널 부에 의해 분리된 다중 타일을 가진 연골 구조체. 불연속적인 천공이 채널(예컨대, 채널을 따라 점선을 형성)에 적용될 수 있다. 개방 개구 비는 다양할 수 있다. 도 19에서 도시된 구조체에서, 개방 개구 비는 도 18에 보여진 천공의 것보다 더 크다.
도 20. 1 일, 3 주, 6 주, 9 주 및 12 주의 배양 후에 성인 모자이크 연골 조성물에 대하여, 프레스토 블루 검정에 의해 측정된, 평균 살아있는 세포 계수 데이터를 도시하는 그래프.
도 21. 12 주의 배양 후 성인 및 소아 모자이크 연골 조성물 내 총 콜라겐 함량(mg/1 cc)의 비교.
도 22. 12 주의 배양 후 성인 모자이크 연골 조성물 내 술페이트화 글리코스아미노글리칸(sGAG) 생성.
도 23. 12 주의 배양 후 성인 모자이크 연골 조성물 내 유형 II 콜라겐에 대한 면역조직화학. 연골 내 갈색 염색은 연골로부터 성장한 세포에 의해 생성된 유형 II 콜라겐을 나타낸다.
도 24. 레이저 절단에 의해 생성된 천공된 모자이크 연골 조성물.

I. 서론

한 측면에서, 본 발명은 연골 및/또는 골 복구 및 재생을 위한 다중 상호연결된 연골 타일을 포함하는 모자이크 연골 구조체에 관한 것이다. 본원에 개시된 모자이크 연골 구조체가 연골 구조체로부터 적용 부위(예컨대, 골 또는 연골 손상의 부위)로 연골세포 성장을 용이하게 하거나 촉진시키기 위한 넓은 표면적을 제공하는 동시에, 구조체 내 다중 타일의 상호연결이 또한 기존 자가 연골세포 이식술(ACI) 또는 모자이크형성술(mosaicplasty)과 비교하여 더 쉬운 처리 또는 외과적 이식술을 촉진한다. 게다가, 연골 내 천공은 연골 구조체 내부, 이를 통과 및 이를 거치는 영양소의 수혈을 용이하게 하여, 연골 구조체로부터 연골세포 성장을 강화시킨다.

II. 정의

본원에 사용되는 바와 같이, 다중 연골 타일을 포함하는 연골 구조체 또는 시트에 관하여 사용된 용어 "상호연결된 타일"은, 연골 조직을 통해 시트 내의 하나 이상의 다른 연골 타일과 부분적으로 또는 불완전하게 연결된 연골 타일을 지칭한다. 비-제한적인 예로서, 연골을 다중의 더 작은 부분 또는 타일로 분리시키는 천공된 선이 절단되어 있는 연골의 시트가, "부분적으로 연결된" 연골 타일을 포함한다. 그에 반해서, 연골의 절단되지 않은 시트(예컨대, 천공되지 않은 연골의 시트)는 "완전히 연결된" 것이다. 일부 실시양태에서, 상호연결된 연골 타일은 불연속적인 천공(예컨대, 미세천공, 개구, 구멍, 홀 또는 다른 통로)에 의해 분리되고, 연골 타일은 천공된 연골 근처 천공되지-않은 연골을 통해 하나 이상의 다른 연골 타일에 부분적으로 연결되어 유지된다. 일부 실시양태에서, 상호연결된 연골 타일은 연골 타일의 깊이 미만의 깊이를 갖는 채널에 의해 분리되고, 연골 타일은 채널 밑 연골을 통해 하나 이상의 다른 연골 타일에 부분적으로 연결되어 유지된다. 일부 실시양태에서, 상호연결된 연골 타일들은 모두 하나의 연골 조각으로부터 절단된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 성인 공여자"는 연령 15세 이상인 인간 공여자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 인간 성인 공여자는 공여 시점에 적어도 연령 18세 이상이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 소아 공여자"는 연령 12세 이하인 인간 공여자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 인간 소아 공여자는 공여 시점에 연령 1세 내지 12세이다.

III. 연골 조성물

한 측면에서, 모자이크 연골 구조체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하기를 포함한다: 연골 시트의 최대 두께 미만인 깊이를 갖는 채널에 의해 분리되는, 다수의 상호연결된 타일을 포함하는 연골 시트; 및 생체적합성 담체. 일부 실시양태에서, 연골 시트는 천공에 의해 분리되는 다수의 상호연결된 타일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연골 시트는, 연골 시트의 최대 두께 미만인 깊이를 갖는(예컨대, 타일의 두께 미만) 채널에 의해 분리되는, 다수의 상호연결된 타일을 포함한다.

연골 타일 형성 및 분리

일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물은 다수의 상호연결된 타일로 절단되었던 연골 시트를 포함한다. 상호연결된 연골 타일은 원, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 타원, 다각형, 지그-재그, 불규칙한 형상 등, 또는 다른 바람직한 형상 또는 형상의 조합으로 형상화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 타일은 크기 및/또는 형상에서 실질적으로 균일하다. 일부 실시양태에서, 연골 시트는 다른 크기 및/또는 형상을 갖는 타일을 포함한다. 모자이크 패턴으로 상호연결된 타일은 단일 단위로 함께 뭉쳐지고, 또한 치료 부위에 적용될 수 있는 다른 연골 구조체 상의 타일과 상호연결하거나 또는 맞물리도록 작동할 수도 있다.

일부 실시양태에서, 모자이크 연골 구조체는 원 형상을 갖는 상호연결된 타일의 연골 시트를 포함한다. 도 12는 원 모자이크 패턴을 갖는 예시적인 연골 구조체(1200)를 나타내고, 여기서 원-형상 타일은 천공에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 모자이크 연골 구조체는 정사각형 및/또는 직사각형 형상을 갖는 상호연결된 타일의 연골 시트를 포함한다. 도 13은, 각각, 천공에 의해 분리된 정사각형-형상 타일인, 정사각형 모자이크 패턴을 갖는 두 예시적인 연골 구조체(1300)를 나타낸다.

일부 실시양태에서, 연골 시트는 약 0.25 mm 내지 약 5 mm(예컨대, 약 0.25 mm, 약 0.5 mm, 약 0.75 mm, 약 1 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm, 약 3 mm, 약 3.5 mm, 약 4 mm, 약 4.5 mm 또는 약 5 mm)의 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 연골 시트는 "최대 두께", 예컨대, 연골 타일의 두께 및 "최소 두께", 예컨대, 연골 타일을 분리시키는 하나 이상의 채널 밑 연골의 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 연골 시트는 약 0.25 mm 내지 약 5 mm(예컨대, 약 0.25 mm, 약 0.5 mm, 약 0.75 mm, 약 1 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm, 약 3 mm, 약 3.5 mm, 약 4 mm, 약 4.5 mm 또는 약 5 mm)의 최대 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 연골 시트는 약 0.25 mm, 예컨대, 약 0.2 mm 미만, 약 0.15 mm, 약 0.1 mm, 약 0.09 mm, 약 0.08 mm, 약 0.07 mm, 약 0.06 mm, 약 0.05 mm, 약 0.04 mm, 약 0.03 mm, 약 0.02 mm 또는 약 0.01 mm 미만의 최소 두께를 갖는다.

일부 실시양태에서, 연골 타일은 약 0.5 mm 내지 약 3 mm(예컨대, 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 약 0.7 mm, 약 0.8 mm, 약 0.9 mm, 약 1 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm 또는 약 3 mm)의 평균 길이 및/또는 평균 너비를 갖는다. 일부 실시양태에서, 연골 타일은 약 0.5 mm 내지 약 3 mm(예컨대, 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 약 0.7 mm, 약 0.8 mm, 약 0.9 mm, 약 1 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm 또는 약 3 mm)의 평균 직경을 갖는다.

일부 실시양태에서, 연골 시트는 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 20 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 약 50 mm, 약 60 mm, 약 70 mm, 약 80 mm, 약 90 mm 또는 약 100 mm의 길이 및/또는 너비를 갖는다. 일부 실시양태에서, 연골 시트는 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 20 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 약 50 mm, 약 60 mm, 약 70 mm, 약 80 mm, 약 90 mm 또는 약 100 mm의 직경을 갖는다.

일부 실시양태에서, 상호연결된 타일은 천공(예컨대, 미세천공, 구멍, 개구 등)에 의해 분리된다. 천공에 의해 분리된 상호연결된 타일을 포함하는 모자이크 연골 조성물의 예는 도 24에 나타난다. 일부 실시양태에서, 천공은 약 5 미크론, 약 10 미크론, 약 15 미크론, 약 20 미크론, 약 25 미크론, 약 30 미크론, 약 35 미크론, 약 40 미크론, 약 45 미크론, 약 50 미크론, 약 60 미크론, 약 70 미크론, 약 80 미크론, 약 90 미크론 또는 약 100 미크론의 평균 직경을 갖는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 다공성 특성을 갖는 연골 구조체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 천공(예컨대, 개구)의 총 단면적은 연골 구조체 그 자체의 총 단면적에 비해 상대적으로 작을 수 있다. 일부 실시양태에서, 개구 면적 비는 더 높을 수 있다. 이런 이유로, 개방 개구 비는 경우에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 개방 개구 비는 0 % 내지 50 %의 범위 내 또는 그 이상일 수 있다. 더 큰 개방 개구 비의 구조체는 치료 부위에서 영양소의 흐름을 강화하도록 작동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개방 개구 비는 0 또는 실질적으로 0이 되어, 구조체가 연속적이거나 또는 실질적으로 연속적인 시트를 형성한다. 예컨대, 도 18 및 도 19 참조. 도 19에 도시된 개방 개구 비는 도 18에 나타난 것보다 더 크다.

일부 실시양태에서, 상호연결된 타일은, 연골 시트의 최대 두께 미만인 깊이를 갖는(예컨대, 타일의 두께 미만) 채널에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 0.2 mm, 약 0.3 mm, 약 0.4 mm, 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 약 0.7 mm, 약 0.8 mm, 약 0.9 mm, 약 1 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm, 약 3 mm, 약 3.5 mm 또는 약 4 mm의 깊이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 연골 시트는 타일을 분리시키는 채널을 포함하고, 연골 시트는 하나 이상의 채널 밑 연골 내 천공을 더 포함한다.

일부 실시양태에서, 채널 또는 천공(예컨대, 미세천공된) 부는 스코어 특징을 보여줄 수 있어, 사용자(예컨대, 내과의사 또는 외과의사)가 연골 구조체를 두 개 이상의 조각으로 쉽게 분리하거나 부술 수 있다.

연골 공급원

일부 실시양태에서, 연골은 관절 연골이다. 일부 실시양태에서, 관절 연골은 관절(예컨대, 무릎 관절 또는 주관절)의 관절 표면으로부터 또는 장골(예컨대, 대퇴골 또는 경골)로부터 수득된다.

일부 실시양태에서, 연골은 인간 성인 사체 공여자로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 공여자는 공여 시점에 연령 18세 이상인 성인 사체 공여자이다. 일부 실시양태에서, 공여자는 공여 시점에 연령 15세 내지 45세인 성인 사체 공여자이다. 일부 실시양태에서, 연골은 인간 소아 사체 공여자로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 공여자는 공여 시점에 연령 3세 내지 12세인 소아 사체 공여자이다.

생체적합성 담체

일부 실시양태에서, 생체적합성 담체는 완충된 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 담체는 동결보존 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 디메틸 술폭시드(DMSO) 및 혈청을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 담체는 비제한적으로, 글리세롤, DMSO, 히드록시에틸 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 부탄디올, 폴리비닐피롤리돈 또는 알기네이트와 같은 하나 이상의 냉동보호제를 포함한다.

일부 실시양태에서, 생체적합성 담체는 성장 배지를 포함한다. 성장 배지의 적합한 예에는 5 % 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 성장 배지에는 고 글루코스 DMEM을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 담체(예컨대, 성장 배지)는 하나 이상의 항생제를 포함한다.

추가적인 생물학적 성분

일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물은 하나 이상의 다른 생물학적 성분과 결합된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물의 적어도 일부분은 생물학적 접착제로 코팅된다. 예를 들어, 도 14 참조. 적합한 생물학적 접착제는 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 피브린 아교(예컨대, 티씰(TISSEEL)), 폴리사카라이드 겔, 시아노아크릴레이트 아교, 젤라틴-레조르신-포르말린 접착제, 콜라겐 겔, 합성 아크릴레이트-기재 접착제, 셀룰로오스-기재 접착제, 기저막 매트릭스(예컨대, 캘리포니아주 산호세 소재 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 마트리겔®(MATRIGEL®)), 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 자가 아교 및 이들의 조합을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물은 탈무기질화 골 매트릭스와 결합된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물은 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1 또는 약 1:1 탈무기질화 골 매트릭스:모자이크 연골의 비로 탈무기질화 골 매트릭스와 결합된다. 탈무기질화 골 매트릭스는 골 기질을 산, 예컨대 염산(HCl)에 적용하는 것에 의해 제조될 수 있다. 탈무기질화 골 매트릭스는 또한 시중에서 구입가능하다.

일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물은 줄기 세포와 같은 세포와 결합된다. 일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물은 줄기 세포가 접종된 골 또는 연골 기질과 결합된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물은 중간엽 줄기 세포가 접종된 골 또는 연골 기질(예컨대, 피질 및/또는 해면체 골 기질, 탈무기질화 피질 및/또는 해면체 골 기질, 골연골 기질 또는 연골 기질)과 결합된다. 줄기 세포-접종된 골 및 연골 기질, 및 이러한 기질의 제조 방법에 대해서는 그 각각의 내용이 본원에 참조로 포함되는 공개된 출원 US 2010/0124776호 및 U.S. 출원 제12/965,335호에 기재된다.

일부 실시양태에서, 천공(예컨대, 미세천공 또는 개구)은 조직 구조체 내부 및 이를 통과하는 동결보존물질의 통과 또는 침윤을 용이하게 하도록 작동할 수 있다. 예를 들어, 동결보존 프로토콜은 연골 시트 내부(예컨대, 채널, 타일 및 구조체의 다른 부분을 통과)에 천공(예컨대, 100 미크론 직경 이하의 천공)을 뚫도록 레이저를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 천공은 동결보존물질이 다르게는 단단한 타일에 빠르게 침윤하도록 할 수 있다. 따라서, 천공은 더 많은 세포가 밖으로 이동하고 영양소가 밑으로부터 또는 다르게는 이를 통하여 흐르도록 할 수 있을 뿐만 아니라, 연골 구조체 또는 시트의 강화된 동결보존이 가능하도록 할 수 있다. 추가로, 이 접근법을 이용하여, 연골 구조체의 큰 조각들이 동결보존될 수 있고, 천공은 동결보존을 위해 적절한 온도 구배를 유지하도록 돕고, 뿐만 아니라 연골에 동결보존물질의 빠른 침윤이 용이하도록 돕도록 작용할 수 있어, 동결보존 상태에 도달할 때까지 동결보존물질과 세포 사이의 접촉 시간의 기간을 최소화한다. 따라서, 본 발명의 모자이크 연골 구조체는, 긴 유통 기한을 가지고 쉽게 저장될 수 있는 것으로 생성될 수 있다.

생존 연골세포의 정량화 및 연골 조성물의 특성화

본 발명의 모자이크 연골 조성물은 타일 내 연골세포의 평균 수, 타일 내 평균 연골세포 생존률 또는 다른 연골 특성 또는 성질에 대해서 특성화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물은 적어도 50 %, 적어도 55 %, 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 % 이상의 평균 연골세포 생존률을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 세제곱 센티미터(cc) 당 적어도 약 50,000, 적어도 약 60,000, 적어도 약 70,000, 적어도 약 80,000, 적어도 약 90,000, 적어도 약 100,000, 적어도 약 150,000, 적어도 약 200,000, 적어도 약 250,000, 적어도 약 300,000, 적어도 약 350,000, 적어도 약 400,000, 적어도 약 450,000, 적어도 약 500,000, 적어도 약 550,000, 적어도 약 600,000, 적어도 약 650,000, 적어도 약 700,000, 적어도 약 750,000, 적어도 약 800,000, 적어도 약 850,000, 적어도 약 900,000, 적어도 약 950,000 또는 적어도 약 1 백만개의 생존 연골세포를 갖는 연골 타일을 포함한다. 일부 실시양태에서, cc 당 평균 연골세포 생존률 또는 연골세포의 양은 절단일 이후 1 일차에 측정된다.

연골 타일 중 연골세포의 양은 수많은 세포 계수 검정들 중 임의의 것에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 트리판 블루 또는 프레스토 블루 검정이 연골 타일 내 연골세포의 수를 정량화하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 연골 조직은 0 일차에 모자이크 연골 구조체로 절단된 다음, 1 일차에 모자이크 연골 구조체의 연골 타일 내 연골세포의 양이 측정된다. 일부 실시양태에서, 연골세포의 양 및/또는 세포 생존률은 절단일로부터 1 일차, 2 일차, 3 일차, 4 일차, 5 일차, 6 일차, 7 일차, 8 일차, 9 일차, 10 일차, 11 일차, 12 일차, 13 일차 또는 14 일차에 측정된다. 일부 실시양태에서, 연골세포의 양 및/또는 세포 생존률은 절단일로부터 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주 또는 6 주에 측정된다. 일부 실시양태에서, 샘플 내 연골세포의 양을 측정함에 있어서, 세포 계수 및/또는 생존률 시험용으로 연골세포를 단리하기 위하여, 샘플이 예컨대 콜라게나제를 사용한 분해에 적용된다.

일부 실시양태에서, 트리판 블루 검정이 세포 계수 및/또는 세포 생존률을 평가하는데 사용된다. 트리판 블루 검정은 생존 세포가 트리판 블루와 같은 불투과성 염료를 흡수하지 않지만, 사멸된 세포는 투과성이어서 염료를 흡수한다는 원리를 바탕으로 한다. 통상적으로, 트리판 블루 염색제를 샘플에 첨가한 다음, 샘플을 혼합한다. 샘플 분취량을 세포 계수기 슬라이드 상에 위치시키고 세포의 수를 계수한다. 개시 연골 샘플 크기를 바탕으로 cc 당 세포의 수를 계산한다.

일부 실시양태에서, 프레스토 블루 검정이 세포 계수 및/또는 세포 생존률을 평가하는데 사용된다. 프레스토 블루 프로토콜은 대사 검정을 사용한 간접적 연골세포 세포 계수를 포함한다. 세포 계수는 공지 농도 연골세포의 표준 곡선을 사용하여 미지 샘플에서의 계수를 측정하는 것에 의해 수행된다. 통상적으로, 1:10 비의 프레스토블루® 시약(캘리포니아주 칼스배드 소재, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 대 세포 배양 배지를 샘플에 첨가함으로써, 샘플을 배지로 피복시킨다. 세포의 대사 활성은 배지의 색상을 변화시킨다. 3 시간 인큐베이션 후, 각 샘플로부터 100 μl 분취량을 취하여, 플레이트 판독기에서의 판독을 위해 다중-웰 플레이트에 첨가한다.

일부 실시양태에서, 트리판 블루 검정 또는 프레스토 블루 검정이 아닌 다른 세포 계수 기술이 연골 샘플 내 연골세포 세포 계수를 측정하는데 사용된다. 예를 들어, 라이브/데드® 염색제(캘리포니아주 칼스배드 소재, 라이프 테크놀로지스) 또는 셀타이터-글로®(CellTiter-Glo®) 발광 세포 생존률 검정(위스콘신주 매디슨 소재, 프로메가(Promega))이 세포 생존률을 평가하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 퀀트(Quant)-iT™ DNA 검정 키트(캘리포니아주 칼스배드 소재, 라이프 테크놀로지스)가 예를 들면 피코그린(PicoGreen)과 함께 DNA 함량을 평가함으로써 세포 계수를 측정하는데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포 생존률은 하기의 수학식을 사용하여 계산될 수 있다:

(살아있는 세포 수/생+사멸 세포의 총 수)*100 % = 생존률 백분율

모자이크 연골 구조체는 또한 연골세포 성장의 특성에 대하여 평가될 수 있다. 예를 들면, 모자이크 연골 구조체는 일정 시간 기간(예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 주) 동안 배양된 다음, 글리코스아미노글리칸 생성, 콜라겐의 존재 또는 하나 이상의 연골-특이적 바이오마커의 존재와 같은, 하나 이상의 연골세포 성장의 특성에 대하여 검정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 모자이크 연골 구조체는 성인 공여자로부터의 것이고, 모자이크 연골 구조체는 소아 공여자로부터의 모자이크 연골 구조체로부터 수득되고 동일한 조건 하에서 배양된 이들 특성에 필적하는, 비제한적으로 글리코스아미노글리칸 생성, 콜라겐 함량 또는 연골-특이적 바이오마커 발현을 포함한 하나 이상의 연골세포 성장의 특성을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 모자이크 연골 구조체는 일정 시간 기간 동안 배양된 후, 글리코스아미노글리칸(GAG) 생성을 나타낸다(예컨대, 본원의 실시예 부문에서 기재된 바와 같음). 연골세포는 부분적으로 GAG 및 연골세포 간질 매트릭스의 다른 성분을 생성시키는 것에 의해 기능한다. 따라서, 글리코스아미노글리칸 생성을 관찰하는 것에 의해 연골 조직의 연골세포 활성을 평가하는 것이 가능하다. 글리코스아미노글리칸 함량은, 예를 들면, 디메틸메틸렌 블루(DMMB) 검정 또는 알시안(Alcian) 블루 염색을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 술페이트화 GAG(sGAG)의 수준이 측정된다. sGAG는 건강한 연골의 중요한 성분으로, 연령에 따라 감소되어 골관절염의 발병을 초래할 수 있다. sGAG는, 예를 들면, 시중에서 구입가능한 sGAG 검정 키트(워싱턴주 시애틀 소재, 카미야 바이오메디칼 컴패니(Kamiya Biomedical Company))를 사용하여 측정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 모자이크 연골 구조체는 일정 시간 기간 동안 배양된 후 콜라겐 생성을 나타낸다(예컨대, 본원의 실시예 부문에서 기술되는 바와 같음). 콜라겐 생성 및 콜라겐 함량은, 예를 들면, 히드록시프롤린 검정(캘리포니아주 밀피타스 소재, 바이오비손(BioVison))을 사용하여 측정될 수 있다. 콜라겐 생성 및 콜라겐 함량은 또한 비제한적으로 콜라겐 유형 II 항체 염색 프로토콜을 포함한 면역검정(예를 들면, 면역조직화학 또는 면역흡착제 검정, 예컨대, ELISA 검정)을 사용하여 측정될 수 있다.

IV. 연골 조성물 제조 방법

또 다른 측면에서, 연골 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 하기를 포함한다:

인간 사체 공여자로부터의 연골 조직 수득 단계;

다수의 채널 또는 천공을 갖도록 연골 조직을 절단하여, 채널에 의해 분리되는 다수의 상호연결된 타일을 포함하는 연골 시트를 형성하는 절단 단계; 및

생체적합성 배지에의 연골 시트 현탁 단계.

일부 실시양태에서, 연골 조직은 성인 사체 공여자로부터 수확된다. 일부 실시양태에서, 연골 조직은 공여 시점에 연령 15세 내지 45세인 성인 사체 공여자로부터 수확된다. 일부 실시양태에서, 연골 조직은 소아 사체 공여자로부터 수확된다. 조직은 사체 공여자의 임의의 연골 영역으로부터 수확될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연골은 공여자의 무릎 관절로부터 또는 장골로부터 수확된다. 일부 실시양태에서, 관절 연골은 공여자로부터 수확된다. 일부 실시양태에서, 공여자로부터 수득된 연골은 절단 단계 전에 약 0.25 mm 내지 약 5 mm(예컨대, 약 0.25 mm, 약 0.5 mm, 약 0.75 mm, 약 1 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm, 약 3 mm, 약 3.5 mm, 약 4 mm, 약 4.5 mm 또는 약 5 mm, 또는 약 0.5 mm 내지 약 2 mm)의 두께로 슬라이싱된다.

상호연결된 연골 타일은 원, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 타원, 다각형, 지그-재그, 불규칙한 형상 등, 또는 다른 바람직한 형상 또는 형상의 조합으로 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 타일은 크기 및/또는 형상에서 실질적으로 균일하다. 일부 실시양태에서, 연골 시트는 다른 크기 및/또는 형상을 가지는 타일을 포함한다.

일부 실시양태에서, 절단 단계는, 각각이 연골 조직의 최대 두께 미만인 깊이를 갖는 다수의 채널을 갖도록 연골 조직을 절단하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널은 연골 시트의 최대 두께 미만인 깊이를 갖는다(예컨대, 연골 조직의 두께 및/또는 타일의 두께 미만). 일부 실시양태에서, 채널은 약 0.2 mm, 약 0.3 mm, 약 0.4 mm, 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 약 0.7 mm, 약 0.8 mm, 약 0.9 mm, 약 1 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm, 약 3 mm, 약 3.5 mm 또는 약 4 mm의 깊이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 채널 밑에 있는 연골은 약 0.25 mm 미만, 예컨대, 약 0.2 mm, 약 0.15 mm, 약 0.1 mm, 약 0.09 mm, 약 0.08 mm, 약 0.07 mm, 약 0.06 mm, 약 0.05 mm, 약 0.04 mm, 약 0.03 mm, 약 0.02 mm 또는 약 0.01 mm 미만의 두께를 갖는다.

일부 실시양태에서, 절단 단계는 다수의 천공을 갖도록 연골을 절단하는 것을 포함한다. 천공은, 예를 들면, 미세천공, 구멍, 개구 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천공은 미세천공이다. 일부 실시양태에서, 천공은 개구이다. 일부 실시양태에서, 천공은 약 수십 미크론 단위 또는 그 미만의 직경일 수 있다. 일부 실시양태에서, 천공은 약 밀리미터 단위 또는 그 미만의 직경일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 천공은 약 5 미크론, 약 10 미크론, 약 15 미크론, 약 20 미크론, 약 25 미크론, 약 30 미크론, 약 35 미크론, 약 40 미크론, 약 45 미크론, 약 50 미크론, 약 60 미크론, 약 70 미크론, 약 80 미크론, 약 90 미크론 또는 약 100 미크론의 평균 직경을 갖는다.

일부 실시양태에서, 절단 단계는 다수의 채널을 갖도록 연골 조직을 절단하는 것을 포함하고, 하나 이상의 채널 밑 연골 내에 천공을 갖도록 절단하는 것을 더 포함한다.

일부 실시양태에서, 연골 조직은 약 0.5 mm 내지 약 3 mm(예컨대, 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 약 0.7 mm, 약 0.8 mm, 약 0.9 mm, 약 1 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm 또는 약 3 mm)의 평균 길이 및/또는 평균 너비를 갖는 타일로 절단된다. 일부 실시양태에서, 연골 조직은 약 0.5 mm 내지 약 3 mm(예컨대, 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 약 0.7 mm, 약 0.8 mm, 약 0.9 mm, 약 1 mm, 약 1.5 mm, 약 2 mm, 약 2.5 mm 또는 약 3 mm)의 평균 직경을 갖는 타일로 절단된다.

일부 실시양태에서, 연골 조직은 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 20 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 약 50 mm, 약 60 mm, 약 70 mm, 약 80 mm, 약 90 mm 또는 약 100 mm의 길이 및/또는 너비를 갖는 시트로 절단된다. 일부 실시양태에서, 연골 조직은 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 15 mm, 약 20 mm, 약 25 mm, 약 30 mm, 약 35 mm, 약 40 mm, 약 45 mm, 약 50 mm, 약 60 mm, 약 70 mm, 약 80 mm, 약 90 mm 또는 약 100 mm의 직경을 갖는 시트로 절단된다.

일부 실시양태에서, 연골 조직은 수동으로 절단된다. 일부 실시양태에서, 연골 조직은 절단 메커니즘을 사용하여 절단된다. 일부 실시양태에서, 절단 메커니즘은 레이저 절단 장치, 기계식 블레이드, 수동 절단 장치, 수동 프레싱 장치 등이다. 일부 실시양태에서, 절단 메커니즘은 공압 프레스, 예컨대 공기 프레스 또는 오일 프레스, 또는 스크류 프레스를 포함한다.

일부 실시양태에서, 연골 조직은 레이저 절단 장치를 사용하여 절단된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 레이저 절단 장치는 레이저 새김장치이다. 적합한 새김 레이저의 비-제한적인 예는 CO₂ 새김 레이저, 예컨대 에필로그 징(Epilog Zing) 30 와트 CO₂ 새김 레이저를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 단계는 약 10 % 내지 약 55 %(예컨대, 약 10 %, 약 15 %, 약 20 %, 약 25 %, 약 30 %, 약 35 %, 약 40 %, 약 45 %, 약 50 % 또는 약 55 %)의 속도, 약 0 % 내지 약 65 %(예컨대, 약 0 %, 약 1 %, 약 2 %, 약 5 %, 약 10 %, 약 15 %, 약 20 %, 약 25 %, 약 30 %, 약 35 %, 약 40 %, 약 45 %, 약 50 %, 약 55 %, 약 60 % 또는 약 65 %)의 전력, 및 약 10 Hz 내지 약 2600 Hz(예컨대, 약 10 Hz, 약 20 Hz, 약 30 Hz, 약 40 Hz, 약 50 Hz, 약 60 Hz, 약 70 Hz, 약 80 Hz, 약 90 Hz, 약 100 Hz, 약 150 Hz, 약 200 Hz, 약 250 Hz, 약 300 Hz, 약 350 Hz, 약 400 Hz, 약 450 Hz, 약 500 Hz, 약 550 Hz, 약 600 Hz, 약 650 Hz, 약 700 Hz, 약 750 Hz, 약 800 Hz, 약 850 Hz, 약 900 Hz, 약 950 Hz, 약 1000 Hz, 약 1100 Hz, 약 1200 Hz, 약 1300 Hz, 약 1400 Hz, 약 1500 Hz, 약 1600 Hz, 약 1700 Hz, 약 1800 Hz, 약 1900 Hz, 약 2000 Hz, 약 2100 Hz, 약 2200 Hz, 약 2300 Hz, 약 2400 Hz, 약 2500 Hz 또는 약 2600 Hz)의 주파수로 레이저 절단 장치를 이용하여 연골 조직을 절단하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 단계는 약 10 % 내지 약 50 %의 속도, 약 0 % 내지 약 45 %의 전력, 및 약 10 Hz 내지 약 2400 Hz의 주파수로 레이저 커터를 이용하여 연골 조직을 절단하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 단계는 약 15 % 내지 약 55 %의 속도, 약 2 % 내지 약 65 %의 전력, 및 약 200 Hz 내지 약 2600 Hz의 주파수로 레이저 커터를 이용하여 연골 조직을 절단하는 것을 포함한다. 연골 조직을 절단하기 위한 적합한 속도, 전력 및 주파수는 표 1에 나타난다.

일부 실시양태에서, 연골 조성물 내 평균 적어도 50 %의 연골세포가 생존가능하다. 일부 실시양태에서, 연골 조성물 내 평균 적어도 50 %, 적어도 55 %, 적어도 60 %, 적어도 65 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 % 또는 그 이상의 연골세포가 생존가능하다. 일부 실시양태에서, 연골 입자는 세제곱 센티미터(cc) 당 적어도 약 50,000, 적어도 약 60,000, 적어도 약 70,000, 적어도 약 80,000, 적어도 약 90,000, 적어도 약 100,000, 적어도 약 150,000, 적어도 약 200,000, 적어도 약 250,000, 적어도 약 300,000, 적어도 약 350,000, 적어도 약 400,000, 적어도 약 450,000, 적어도 약 500,000, 적어도 약 550,000, 적어도 약 600,000, 적어도 약 650,000, 적어도 약 700,000, 적어도 약 750,000, 적어도 약 800,000, 적어도 약 850,000, 적어도 약 900,000, 적어도 약 950,000 또는 적어도 약 1 백만개의 생존 연골세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, cc 당 평균 연골세포 생존률 또는 연골세포의 양은 절단일 이후 1 일차에 측정된다. 연골 샘플 내 연골세포의 양 및/또는 생존 연골세포의 수는 본원에서 기재된 바와 같이, 예를 들면 상기 부문 III에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.

추가적인 처리 단계

일부 실시양태에서, 절단 단계 후, 연골 조성물을 생체적합성 담체에 현탁시키기 전에, 모자이크 연골 조성물이 추가적인 처리 단계에 적용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 절단 단계 후, 연골 조성물을 생체적합성 담체에 현탁시키기 전에, 모자이크 연골 조성물이 하나 이상의 추가적인 처리 단계에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연골 조성물은 식염수로 세척된다. 일부 실시양태에서, 연골 조성물은 연골 매트릭스로부터의 연골세포 세포 방출을 촉진하는 하나 이상의 효소로 처리된다. 예를 들면, 조성물의 연골 매트릭스로부터의 연골세포 세포 방출을 돕기 위해서, 콜라게나제가 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연골 조성물은 콜라게나제 및/또는 프로나제와 혼합되고, 연골세포를 방출하는 데에 적합한 시간의 길이 동안 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)와 같은 성장 배지에서 인큐베이팅된다.

일부 실시양태에서, 연골 조성물은 탈무기질화 골 매트릭스와 결합된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 연골 조성물은 탈무기질화 골 매트릭스와 약 4:1, 약 3:1, 약 2:1 또는 약 1:1의 탈무기질화 골 매트릭스:연골 조성물의 비로 결합된다. 탈무기질화 골 매트릭스는, 예를 들면 골 기질을 산, 예컨대 염산(HCl)에 적용함으로써 제조될 수 있다. 탈무기질화 골 매트릭스는 또한 시중에서 구입가능하다.

일부 실시양태에서, 연골 조성물은 줄기 세포와 같은 세포와 결합된다. 일부 실시양태에서, 연골 조성물은 줄기 세포가 접종된 골 또는 연골 기질과 결합된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 연골 조성물은 중간엽 줄기 세포가 접종된 골 또는 연골 기질(예컨대, 피질 및/또는 해면체 골 기질, 탈무기질화 피질 및/또는 해면체 골 기질, 골연골 기질 또는 연골 기질)과 결합된다. 줄기 세포-접종된 골 및 연골 기질, 및 이러한 기질의 제조 방법에 대해서는 그 각각의 내용이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 2010/0124776호 및 U.S. 출원 제12/965,335호에 기재된다.

일부 실시양태에서, 연골 조성물의 적어도 일부분이 생물학적 접착제와 결합된다. 적합한 생물학적 접착제는, 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 피브린 아교(예컨대, 티씰), 폴리사카라이드 겔, 시아노아크릴레이트 아교, 젤라틴-레조르신-포르말린 접착제, 콜라겐 겔, 합성 아크릴레이트-기재 접착제, 셀룰로스-기재 접착제, 마트리겔®(MATRIGEL®)(캘리포니아주 산호세 소재, BD 바이오사이언시즈), 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일부 실시양태에서, 연골 조성물은 생체적합성 담체에 현탁된다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 담체는 완충된 용액(예컨대, 완충된 수용액)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 담체는 동결보존 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 디메틸 술폭시드(DMSO) 및 혈청을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 담체는, 글리세롤, DMSO, 히드록시에틸 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 부탄디올 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 하나 이상의 냉동보호제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

V. 연골 조성물의 치료적 사용

본원에 기재된 모자이크 연골 조성물은 그를 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 이론에 얽매이려는 것은 아니나, 본원에서 기재된 연골 절단 방법이 연골로부터 세포의 이동을 용이하게 하거나 강화시킬수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 상호연결된 타일을 형성하도록 연골 조직의 표면으로의 채널 및/또는 천공의 절단은 상기 채널이 부족한 연골 조직에 비해 증가된 표면적을 갖는 구조체를 만든다. 이 증가된 표면적은 절단되지-않은 연골 조직 내 연골세포 이동의 양에 비해 연골 조직으로부터 연골세포의 이동을 증가시키거나 강화시킬 수 있다. 게다가, 채널 및/또는 천공은 손상 부위에 연골 구조체 내부, 이를 통과 및 이를 거쳐 영양소가 쉽게 수혈되도록 작동할 수 있어, 강화된 재생 및 치유에 기여할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이 모자이크 연골 조성물이 대상체에 투여된 경우, 연골 시트 내 연골세포는 시트 밖으로 이동하여 복구 및 재생 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 연골세포는 연골형성을 통해 새로운 연골을 재생하거나 형성할 수 있다. 이와 같은 방식으로, 환자 내의 부위에 적용된 모자이크 연골 조성물은 연골 및/또는 골 결함을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 모자이크 연골 조성물로부터의 연골세포는 현장에서 새로운 연골을 재생하고 생성할 수 있다. 새롭게 확립된 연골세포 군집 및 연골 조직은 결함을 채우고, 치료 부위에서 기존의 고유 연골 및/또는 연골하골과 통합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 모자이크 연골 조성물(예컨대, 다수의 상호연결된 타일을 포함하는 연골 시트 및 생체적합성 담체를 포함하는 조성물)이 골 또는 연골 결함을 갖는 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물이 연골, 골, 인대, 힘줄, 반월상연골, 관절 또는 근육의 결함의 부위에 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 퇴행성 결함 또는 손상을 가지고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 외상성 결함 또는 손상을 가지고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 골관절염을 가지고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 근육 결함을 가지고 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 모자이크 연골 조성물은 대상체 내 연골을 복구하거나 또는 연골 성장 또는 재생을 촉진하기 위하여 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 모자이크 연골 조성물은 관절(예컨대, 무릎 관절), 골(예컨대, 대퇴골 또는 상완골) 또는 연골에 투여된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 모자이크 연골 조성물은 연조직 결함을 갖는 대상체에 그것의 복구 및 재생을 위하여 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 인대, 힘줄 또는 근육에 투여된다. 일부 실시양태에서, 연조직 결함은 인대, 힘줄 또는 근육의 염좌, 좌상, 타박상 또는 스트레스 손상이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 모자이크 연골 조성물은 대상체에 국소적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체 내에 외과적으로 이식된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 최소 침습 절차, 예컨대 관절경검사법으로 투여된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 모자이크 연골 조성물은 더 큰 시트로 사용자(예컨대, 내과의사 또는 외과의사)에게 제공되고 치료되는 결함(예컨대, 연골 결함)의 크기에 맞는 적절한 크기로 사용자에 의해 더 작은 조각으로 부서질 수 있다. 예를 들어, 연골 구조체는 구조체의 하나 이상의 채널을 따라, 또는 구조체의 천공된 부분을 따라, 두 조각으로 부서지거나 또는 분리될 수 있다.

VI. 키트

또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 모자이크 연골 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 다수의 상호연결된 타일을 포함하는 연골 시트; 및 생체적합성 담체를 포함하는 모자이크 연골 조성물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 키트는 연골, 골, 인대, 힘줄, 반월상연골, 관절 또는 근육 내 결함을 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 키트는 퇴행성 결함 또는 손상 연골, 골, 인대, 힘줄, 반월상연골, 관절 또는 근육을 갖는 대상체; 외상성 결함 또는 손상 연골, 골, 인대, 힘줄, 반월상연골, 관절 또는 근육을 갖는 대상체; 또는 골관절염을 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용된다.

일부 실시양태에서, 키트는 저장 및/또는 수송을 위한 용기 내 포장된, 본원에 기재된 바와 같은 모자이크 연골 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 조성물을 투여하기 위한 지시를 더 포함한다.

일부 실시양태에서, 키트는 임의로 생물학적 접착제 성분(예컨대, 피브린 아교의 경우, 피브리노겐 및 트롬빈)과 함께 본원에 기재된 다수의 상호연결된 타일을 포함하는 연골 시트를 포함하는 모자이크 연골 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연골 입자 및 생물학적 접착제(예컨대, 피브린 아교) 성분은 별도로 포장되며, 외과의사 또는 사용자가 연골의 위치지정 전에 수술 부위에 피브린 아교를 첨가한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 접착제(예컨대, 피브린 아교)는 치료 부위에의 투여 전에 연골 조성물과 결합된다.

일부 경우에, 키트는 골 및/또는 줄기 세포 성분과 함께 포장된 연골 조성물을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 키트는 탈무기질화 골 매트릭스와 함께 연골 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 세포(예컨대, 줄기 세포)와 함께 연골 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 세포(예컨대, U.S. 2010/0124776호에 기재된 바와 같은 골 기질과 결합된 지방질 유래 중간엽 성인 줄기 세포, 또는 U.S. 출원 제12/965,335호에 기재된 바와 같은 골연골 또는 연골 기질과 결합된 지방질 유래 중간엽 성인 줄기 세포)가 접종된 골 또는 연골 기질과 함께 연골 조성물을 포함한다.

VII. 실시예

하기의 실시예들은 청구 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하기 위하여 제공되는 것이다.

실시예 1: 모자이크 연골 시트를 생성시키기 위한 레이저 절단

레이저 절단 기술은 세포 생존률을 희생하지 않고 상호연결된 모자이크 연골 시트의 제조를 위한 비용 효율적인 접근법을 제공할 수 있다. 하기 기재되는 바와 같이, 레이저 처리 기술에 의해 제조된 다수의 상호연결된 타일을 포함하는 모자이크 연골 시트는 수동 절단 기술을 사용할 때 관찰되는 세포 생존률 결과에 필적하는 세포 생존률 결과를 나타내었다. 레이저 절단 기술의 사용은 비용, 오염, 및 처리 시간을 감소시키고, 추가적으로 증가된 양의 공여자 조직 생성물을 활용하도록 하는 것이 가능하다.

조직 절단 실험은, 소아 또는 성인 연골의 시트에 에필로그 징 30 와트 CO₂ 새김 레이저를 사용하여 세절된 연골 입자 및 모자이크 연골 구조체를 형성하도록 수행된다. 표 1은 가변적인 속도, 전력 및 주파수에서의 조직 절단 실험의 결과를 나타낸다.

<표 1>

적어도 부분적으로 이러한 발견에 기초하면, 15-55 %의 속도, 2-65 %의 전력 및 200-2600 Hz의 주파수로의 레이저 설정이 상호연결된 모자이크 연골 구조체를 생성하는 데에 바람직한 결과를 제공한다는 것이 명확해졌다.

실시예 2: 성인 또는 소아 공여자로부터의 관절 연골의 특성화

레이저 절단 프로토콜 또는 수동 절단 프로토콜 중 어느 하나를 사용하여, 신선한 사체 성인 및 소아 관절 연골 조직 샘플을 세절된 연골 입자로 처리하였다. 성인 공여자는 연령 15세 내지 36세였고, 소아 공여자는 연령 3개월 내지 12세였다. 레이저 절단 방법의 경우, 메스(scalpel)를 사용하여 얇은 슬라이스(예컨대, 1-5 mm의 두께를 갖는 시트)로 연골을 셰이빙하고, 슬라이싱된 시트를 에필로그 징 30 와트 새김 레이저를 사용하여 작은 입자(예컨대, 1 mm, 2 mm, 및/또는 3 mm 입자)로 세절하였다. 레이저 절단 패턴은 코렐드로우®(CorelDRAW®) 그래픽 소프트웨어 프로그램을 사용하여 설계하였다. 연골은 표 1에 기재된 바와 같은 에너지 수준 및 다른 레이저 파라미터를 사용하여 정사각형 형상의 입자로 세절하였다. 레이저 절단 절차 동안에는, 연골을 수화된 상태로 유지하였다. 세절된 입자는 그 다음 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 세척하였다. 연골 입자를 하기에 기재된 바와 같이 세포 계수, 세포 생존률 및 연골세포 성장에 대하여 특성화하였다. 모자이크 연골 조성물 또한, 예컨대 하기의 실시예 3에 기재되는 바와 같은 2 mm 연골 타일의 3x3 시트로 제조하고, 세포 계수, 세포 생존률 및 연골세포 성장에 대하여 특성화할 수 있다.

알려져 있는 연골세포의 농도를 갖는 샘플을 사용하여, 표준 곡선을 도 2에 나타난 바와 같이 작성하였다. y-축은 카운테스®(Countess®) 자동화 세포 계수기로부터의 형광 판독치를 나타내고, x-축은 연골세포 농도(세포/μl)를 나타낸다.

세포 계수, 공여자 A(성인) 및 B(소아), 1 일차: 세절일(1 일차)에 트리판 블루 염색 프로토콜에 이어서 카운테스® 자동화 세포 계수기에서의 분석을 사용하여 수확된 연골세포 중 일부를 세포 계수에 대하여 시험하였다. 콜라게나제로 연골 입자를 분해하여 연골세포를 단리하고, 그 혼합물을 그 다음 105 미크론 필터를 통하여 여과하여 단리된 세포로부터 임의의 미분해 매트릭스를 분리하였다. 도 3a 및 도 3b에 도시되는 실험의 경우, 동일한 양의 연골세포 샘플을 평가용 개별 플레이트 웰에 위치시켰다.

도 3a에 도시된 바와 같이, 레이저 절단으로 세절된 성인 공여자 연골 조직은, 도 2의 표준 곡선을 사용하여, 42,622 연골세포/μl의 세포 계수에 해당하는 21,636(표준 편차 578; CV % 2.67)의 평균 형광 판독치를 제공하였다. 수동 절단으로 세절된 성인 공여자 연골 조직은, 52,642 연골세포/μl의 세포 계수에 해당하는 24,853(표준 편차 1507; CV % 6.06)의 평균 형광 판독치를 제공하였다. 도 3b에 도시되는 바와 같이, 레이저 절단으로 세절된 소아 공여자 연골 조직은, 60,974 연골세포/μl의 세포 계수에 해당하는 27,528(표준 편차 2494; CV % 9.06)의 평균 형광 판독치를 제공하였다. 수동 절단으로 세절된 소아 공여자 연골 조직은, 103,211 연골세포/μl의 세포 계수에 해당하는 41,088(표준 편차 3472; CV % 8.45)의 평균 형광 판독치를 제공하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 세포 계수 면에서, 레이저 절단과 수동 절단 방법 사이에 큰 차이는 없을 수 있는 것으로 관찰되었다.

도 4는 상기 기재한 바와 같은 평균 형광 판독치를 나타낸다. 숫자들은 표준 곡선, 그리고 플레이트 판독기에서 평가하였을 때의 프레스토 블루 대사 검정으로부터의 형광 판독치를 사용하여 계산하였다. 6 주 세포 계수도 프레스토 블루 검정을 사용하여 수행하였다.

세포 계수, 공여자 C 내지 G( 6 주 ): 성인 및 소아 연골 모두로부터의 연골세포가 연골 매트릭스로부터 어떻게 성장하는지를 비교하기 위하여, 6-주 체외이식편 연구를 수행하였다. 3 명의 연구-동의 성인 공여자(공여자 C, E 및 G) 및 2 명의 연구-동의 소아 공여자(공여자 D 및 F)를 확보하였다. 샘플을 대략 1 mm 두께의 시트로 절단하고, 수동 또는 레이저 절단에 의해 2 mm 정육면체로 세절하고 0.3 ml 분취량으로 나누었다. 연골세포가 연골 샘플로부터 성장할 수 있는 지지체를 제공하는 티씰 피브린 아교(일리노이주 디어필드 소재, 박스터(Baxter))와 함께, 연골 입자를 플레이트 웰에 위치시켰다. 콜라게나제는 세포에 사용하지 않았다. 그 다음 연골세포 배지(캘리포니아주 샌디에고 소재, 셀 어플리케이션스(Cell Applications))를 첨가하고, 주 2 회 교체하였다.

6 주 후, (A) 트리판 블루 염색 프로토콜에 이어서 카운테스®(Countess®) 자동화 세포 계수기에서의 분석, 또는 (B) 프레스토 블루 염색 프로토콜에 이어서 시너지™(Synergy™) H1 혼성 플레이트 판독기에서의 분석 중 어느 하나를 사용하여, 세포 계수를 수행하였다. 프레스토 블루 프로토콜은 대사 검정을 사용한 간접적 연골세포 세포 계수를 포함한다. 세포 계수는 알려져 있는 연골세포 농도의 표준 곡선을 사용하여 미지 샘플의 계수를 측정하도록 수행된다. 통상적으로, 연골세포가 피브린과 결합되는 경우, 대사 검정 및 혼성 판독기가 대사 활성을 평가하는 것에 의해 연골세포 세포 계수를 간접적으로 측정하는 데에 사용될 수 있다. 이 경우, 대부분의 세포(예컨대, 95 % 내지 98 % 이상)가 생존가능한 것으로 가정될 수 있다.

도 5는 트리판 블루 프로토콜에 대한 살아있는 세포 수 계수 및 생존률 결과, 및 프레스토 블루 프로토콜에 대한 살아있는 세포 수 결과를 나타낸다. 트리판 블루 살아있는 세포 시험 결과에 도시된 바와 같이, 레이저 절단을 사용하는 새로운 연골 cc 당 1,052,167 ± 989,536 개의 살아있는 세포가 존재하였고, 수동 절단을 사용하는 새로운 연골 cc 당 375,333 ± 295,846 개의 살아있는 세포가 존재하였다.

도 6은 트리판 블루 및 프레스토 블루 프로토콜에 대한 살아있는 세포 수 계수 결과를 나타내고, 이는 도 5에 나타난 세포 계수 데이터를 바탕으로 한다. 여기에 나타난 트리판 블루 및 프레스토 블루 세포 계수 결과에 관하여, 단일 ANOVA 분석을 수행하였고, 이들 두 방법을 사용하여서는 살아있는 세포 수와 관련하여 유의성 있는 차이가 거의 없었다.

세포 계수, 공여자 C 내지 G: 도 7은, 도 5에 도시된 생존률 % 결과를 바탕으로 하는, 트리판 블루 프로토콜을 사용하여 공여자 C 내지 G에 대한 1 일차(즉, 절단 후 1 일) 세포 생존률 검정을 나타낸다. 여기에 도시된 바와 같이, 레이저 절단 연골 및 수동 절단 연골 모두에 대해 평균 세포 생존률은 약 86 %이다. 따라서, 연골 조직이 수동 절단 방법에 비해 세포 생존률을 희생하지 않으면서도 레이저 절단을 사용하여 세절될 수 있다는 것이 관찰되었다. 도 7에 나타나는 트리판 블루 생존률 결과에 관하여, 단일 ANOVA 분석을 수행하였고, 이들 두 방법을 사용하여서는 세포 생존률과 관련하여 유의성 있는 차이가 거의 없었다.

도 8a 및 8b는 수동 절단 및 레이저 절단(각각) 연골 조각의 조직 가장자리(백색 화살표)를 도시하는 공초점 현미경 이미지이다. 이러한 결과는 레이저 절단과 수동 절단 연골 조직 샘플을 비교하였을 때 세포 생존률의 유의성 있는 차이가 없었음을 나타낸다. 이와 같은 연구에는, 라이브/데드® 염색제(캘리포니아주 칼스배드 소재, 라이프 테크놀로지스)를 사용하였다. 간단히 말하자면, 미분해 연골 입자를 24-웰 플레이트의 웰에 위치시켰다. 1 ml PBS를 각 웰에 첨가한 다음 0.5 μl의 적색 및 녹색 염료를 첨가하였다. 플레이트를 호일로 덮고 최소 15 분 동안 방치시켰다. 연골 입자를 그 다음 슬라이드 상에 위치시키고, 레이저 설정 상 공초점 현미경법에 의해 이미지를 포착하였다.

레이저 절단이 수동 절단보다 더 빠르게 실행될 수 있다는 것 또한 발견되었다. 예를 들면, 동일한 양의 조직이 수동 절단을 통한 8 시간 대 레이저 절단을 통한 0.5 시간으로 세절될 수 있었다. 또한, 레이저 절단을 사용하면, 수동 절단과 비교하였을 때 균일하게 형상화된 조직 조각을 수득하는 것이 더 용이한 것으로 관찰되었다.

18 일에서의 현미경법 관찰: 도 9a 및 9b는 수동 절단(도 9a) 및 레이저 절단(도 9b) 성인 연골 입자로부터 성장하는 연골세포 세포의 사진 이미지를 제공한다. 구체적으로, 연골은 성인 공여자로부터 수득하고, 레이저 절단 또는 수동 절단 프로토콜 중 어느 하나로 세절하였다. 세절된 연골 입자를 10 % FBS 및 2 % 항생제가 있는 연골세포 성장 배지를 사용하여, 12 웰 배양 플레이트에 위치시켰다. 배지를 주 2 회 교체하였다. 배지는 5 % CO₂의 37 ℃ 인큐베이터(예컨대, 표준 세포 배양 조건)에서 배양하였다. 이미지(4x 배율)는 18 일에 얻었다. 여기에 나타난 바와 같이, 연골세포는 세절된 입자로부터 성장하는 것으로 관찰되었다.

성인 연골은 동종이계 이식 용으로 적절하지 않다는 것이 이전에 제기되어왔다. 그러나, 이 실시예는 성인 연골 구조체가 일정 시간 기간 동안 배양될 때, 소아 연골 구조체에 필적하는 연골세포 성장 및 매트릭스 생성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 따라서, 인간 성인 공여자로부터 또는 인간 소아 공여자로부터 얻은 연골 구조체는 이것이 필요한 대상체 내 연골 결함을 복구하는데에 유용할 수 있다.

실시예 3: 연골 샘플을 특성화하기 위한 12-주 체외이식편 연구

모자이크 연골 조성물의 매트릭스 생성 및 연골세포 성장을 추가로 비교하기 위하여, 12-주 체외이식편 연구를 수행하였다. 3 명의 연구 동의 성인 공여자 및 2 명의 연구 동의 소아 공여자들을 확보하였다. 세포 계수를 위하여, 1:10 비의 프레스토블루®(캘리포니아주 칼스배드 소재, 라이프 테크놀로지스) 대 배지를 사용하였다. 12 주 시점 후에는, 콜라겐 유형 II 면역조직화학은 물론 술페이트화 글리코스아미노글리칸(sGAG) 검정(워싱턴주 시애틀 소재, 카미야 바이오메디칼 컴패니), 히드록시프롤린 검정(캘리포니아주 밀피타스 소재, 바이오비손), 및 피코 그린 검정(뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재, 인비트로겐)을 사용한 DNA 분석을 샘플에서 수행하였다. 모든 결과 측정치는 단일 ANOVA 분석을 사용하여 평가하였다. 유의성은 p≤0.05로써 간주하였다.

연골 체외이식편 프로토콜:

1. 배지를 제거하고 연골 샘플을 PBS + 2 % 항생제로 세척한다.

2. 냉각한 레이저 플레이트 상에 조직을 가능한 한 평평하게 위치시킨다.

3. 조직에 몇 방울의 PBS + 2 % 항생제를 첨가하여 절단 동안 습기를 유지하도록 하고 플레이트를 레이저 내부에 위치시킨다.

4. 바람직한 레이저 주형을 선택하고 레이저 설정을 속도=50 %, 전력=30 % 및 Hz=2000으로 설정한다. 프린트를 선택하고 레이저로 넘어가기를 누른다.

5. 2.7 mL 내지 3 mL의 배지가 있는 15 ml 원뿔졸 튜브를 사용하여 0.3 cc의 연골을 덜어낸다. 3x3(6 mm x 6 mm) 시트 내 2 mm 정사각형을 포함한 모자이크 연골 시트가 형성되었다.

6. 웰의 바닥에 티씰 피브린 아교를 위치시키고 연골을 첨가한다.

7. 모든 샘플이 플레이트에 첨가된 후, 30 분 동안 아교가 건조되도록 한다.

8. 연골이 붙고 아교가 건조된 후, 4 mL 배지를 웰에 부드럽게 첨가하여 연골을 건드리지 않도록 한다.

9. 1 일차에, 배지를 제거하여 각 웰에 프레스토 블루, 1 mL 배지 + 110 μL 프레스토 블루를 혼입하고 4.5 시간 동안 인큐베이팅한다. 배지 및 프레스토블루를 제거하고 PBS + 2 % 항생제로 헹군다. 배지를 교체한다.

10. 배지를 주 2 회 교체한다.

11. 플레이트를 인큐베이팅한다. 3, 6, 9 및 12 주에 프레스토 블루로 세포 체외이식편 성장을 확인한다.

<표 2> 샘플 요약

<표 3> 12 웰 플레이트 레이아웃(샘플 지정)

결과

12-주 연구는 모자이크 연골 조성물이 세포 성장 및 매트릭스 생성을 나타냄을 입증하였다. 성인 공여자로부터의 모자이크 연골 조성물은, 소아 공여자로부터의 모자이크 연골 조성물과 같이(데이터 나타나지 않음), 12-주 체외이식편 연구의 과정에 걸쳐 시트 / 웰 당 세포의 수의 증가를 나타내었다(도 20).

히드록시프롤린 검정이 체외이식편의 총 콜라겐 함량을 측정하기 위해 사용되었다. 표 4 및 도 21에 나타난 바와 같이, 성인 공여자로부터의 모자이크 연골 조성물은 57.14±0.72 mg/ml의 총 콜라겐 함량을 가졌다. 소아 공여체는 총 44.95±3.32 mg/ml을 가짐으로써, 결과적으로 통계적인 차이가 없었다.

<표 4> 12 주의 체외이식편 후 히드록시프롤린 및 sGAG의 결과

술페이트화 글리코스아미노글리칸(sGAG)은 건강한 연골의 중요한 성분으로 나이가 들어감에 따라 감소하고 골관절염의 발병으로 이어질 수 있다. 12 주의 체외이식편 후 성인 모자이크 연골 샘플에 대한 평균 sGAG 함량은 199,541±37,371 ug/ml인 반면, 12 주의 체외이식편 후 소아 공여자 샘플에 대한 평균 sGAG 함량은 197,442±15,857 ug/ml로, 성인 및 소아 연골 조직으로부터의 샘플에서 sGAG 함량이 통계적인 차이를 가지지 않음을 나타낸다. 12 주의 배양 후 성인 공여자로부터의 모자이크 연골 조성물의 sGAG 염색은 도 22에 나타낸다.

면역조직화학을 또한 12 주 후 모자이크 연골 샘플에 수행하였다. 도 23에서 나타나는 바와 같이, 유형 II 콜라겐이, 모자이크 연골 조성물로부터 성장된 세포에 의해 생성되었다. 유형 II 콜라겐은 유리질 연골의 생성에 중요하고, 체외이식편의 바깥에 유리질 연골의 형성은, 본원에 기재된 바와 같은 모자이크 연골 조성물이 연골 복구에 효과적일 수 있음을 나타낸다.

전기한 발명이 이해의 명료성을 목적으로 예시 및 실시예에 의해 다소 상세하게 기재되기는 하였지만, 통상의 기술자는 첨부된 청구범위의 영역 내에서 특정의 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 또한, 본원에서 제공된 각 참고문헌은 각 참고문헌이 개별적으로 참조로 포함된 것처럼 동일한 정도까지 그 전체가 참조로써 포함된다.

Claims (78)

1. 고유, 생존 연골세포를 포함하는 다수의 상호연결된 연골 타일을 포함하는 연골 시트; 및
   생체적합성 담체
   를 포함하고,
   여기서 타일이 연골 시트의 최대 두께 미만인 깊이를 갖는 채널에 의해 분리되고, 연골 시트가 하나 이상의 채널 밑 연골 내 천공을 포함하는 것인, 모자이크 연골 조성물.
2. 제1항에 있어서, 연골 시트가 0.25 mm 내지 5 mm의 최대 두께를 갖는, 모자이크 연골 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 채널 밑 연골이 0.25 mm 미만의 두께를 갖는, 모자이크 연골 조성물.
4. 제1항에 있어서, 타일이 천공에 의해 분리되는, 모자이크 연골 조성물.
5. 제4항에 있어서, 천공이 미세천공인, 모자이크 연골 조성물.
6. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골이 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물.
7. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골이 비-탈세포화 연골인, 모자이크 연골 조성물.
8. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골이 연령 15세 이상인 인간 성인 사체 공여자로부터의 것인, 모자이크 연골 조성물.
9. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골이 인간 소아 사체 공여자로부터의 것인, 모자이크 연골 조성물.
10. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골이 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물.
11. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골이 연령 15세 이상인 인간 성인 사체 공여자로부터의 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물.
12. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골이 인간 소아 사체 공여자로부터의 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물.
13. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 타일이 크기 및/또는 형상에서 균일한, 모자이크 연골 조성물.
14. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 타일이 원 형상인, 모자이크 연골 조성물.
15. 제14항에 있어서, 타일이 0.5 mm 내지 3 mm의 평균 직경을 갖는, 모자이크 연골 조성물.
16. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 타일이 정사각형 또는 직사각형 형상인, 모자이크 연골 조성물.
17. 제16항에 있어서, 연골 타일이 0.5 mm 내지 3 mm의 평균 길이 및/또는 너비를 갖는, 모자이크 연골 조성물.
18. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 담체가 동결보존 배지를 포함하는, 모자이크 연골 조성물.
19. 제18항에 있어서, 동결보존 배지가 디메틸 술폭시드(DMSO) 및 혈청을 포함하는, 모자이크 연골 조성물.
20. 제18항에 있어서, 동결보존 배지가 글리세롤, DMSO, 히드록시에틸 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 부탄디올, 또는 폴리비닐피롤리돈 중 적어도 1종을 포함하는 냉동보호제를 포함하는, 모자이크 연골 조성물.
21. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골 시트의 적어도 일부분이 생물학적 접착제로 코팅되는, 모자이크 연골 조성물.
22. 제21항에 있어서, 생물학적 접착제가 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 피브린 아교, 폴리사카라이드 겔, 시아노아크릴레이트 아교, 젤라틴-레조르신-포르말린 접착제, 콜라겐 겔, 합성 아크릴레이트-기재 접착제, 셀룰로스-기재 접착제, 기저막 매트릭스, 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 자가 아교 또는 이들의 조합인, 모자이크 연골 조성물.
23. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골 시트의 적어도 일부분이 탈무기질화 골과 결합되는, 모자이크 연골 조성물.
24. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골 시트의 적어도 일부분이 줄기 세포가 접종된 골 또는 연골 기질과 결합되는, 모자이크 연골 조성물.
25. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 채널이 0.2 mm, 0.3 mm, 0.4 mm, 0.5 mm, 0.6 mm, 0.7 mm, 0.8 mm, 또는 0.9 mm의 깊이를 갖는, 모자이크 연골 조성물.
26. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 채널 밑 연골이 0.25 mm 미만, 0.2 mm, 0.15 mm, 0.1 mm, 0.09 mm, 0.08 mm, 0.07 mm, 0.06 mm, 0.05 mm, 0.04 mm, 0.03 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm 미만의 두께를 갖는, 모자이크 연골 조성물.
27. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 천공이 5 미크론, 10 미크론, 15 미크론, 20 미크론, 25 미크론, 30 미크론, 35 미크론, 40 미크론, 45 미크론, 50 미크론, 60 미크론, 70 미크론, 80 미크론, 90 미크론, 또는 100 미크론의 평균 직경을 갖는, 모자이크 연골 조성물.
28. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골 시트가 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 15 mm, 20 mm, 25 mm, 30 mm, 35 mm, 40 mm, 45 mm, 50 mm, 60 mm, 70 mm, 80 mm, 90 mm, 또는 100 mm의 길이, 너비, 또는 둘 다를 포함하는, 모자이크 연골 조성물.
29. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골 시트가 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 15 mm, 20 mm, 25 mm, 30 mm, 35 mm, 40 mm, 45 mm, 50 mm, 60 mm, 70 mm, 80 mm, 90 mm, 또는 100 mm의 직경을 포함하는, 모자이크 연골 조성물.
30. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 연골 시트에서의 연골세포의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 그 초과는 생존가능한, 모자이크 연골 조성물.
31. 제1항에 있어서,
    연골 시트에서 형성된 채널에 의해 분리된 다수의 상호연결된 연골 타일을 포함하는 1 mm 두께 연골 시트이며, 각각의 채널은 1 mm 미만의 개별 깊이를 갖고, 천공은 하나 이상의 채널 밑 연골 시트에서 형성되는 것인, 1 mm 두께 연골 시트; 및
    동결보존 배지인 생체적합성 담체
    를 포함하는, 모자이크 연골 조성물.
32. 제31항에 있어서, 타일이 정사각형 또는 직사각형 형상이고 크기가 균일한 것인, 모자이크 연골 조성물.
33. 제32항에 있어서, 연골 타일이 0.5 mm 내지 3 mm의 평균 길이 및 너비를 갖는 것인, 모자이크 연골 조성물.
34. 인간 사체 공여자로부터의 연골 조직 수득 단계;
    다수의 채널 및 천공을 갖도록 연골 조직을 절단해 냄으로써, 채널 및 천공에 의해 분리되고 고유, 생존 연골세포를 포함하는 다수의 상호연결된 연골 타일을 포함하는 연골 시트를 형성하는 절단 단계; 및
    생체적합성 배지에의 연골 시트 현탁 단계
    를 포함하고,
    여기서 다수의 채널 각각이 연골 조직의 최대 두께 미만인 깊이를 갖고, 천공이 하나 이상의 채널 밑 연골 내에 있는 것인,
    모자이크 연골 조성물 제조 방법.
35. 제34항에 있어서, 절단 단계 전에, 연골 조직이 0.25 mm 내지 5 mm의 최대 두께를 갖는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 다수의 채널 밑에 있는 연골이 0.25 mm 미만의 두께를 갖는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 연골 조직이 관절 연골 조직인, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
38. 제34항 또는 제35항에 있어서, 연골 조직이 연령 15세 이상인 인간 성인 공여자로부터의 것인, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
39. 제34항 또는 제35항에 있어서, 연골이 인간 소아 사체 공여자로부터의 것인, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
40. 제34항 또는 제35항에 있어서, 절단 단계가 레이저 커터로, 기계식 블레이드로 또는 기계식 프레스로 연골 조직을 절단하는 것을 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
41. 제34항 또는 제35항에 있어서, 연골이 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
42. 제34항 또는 제35항에 있어서, 연골이 연령 15세 이상인 인간 성인 사체 공여자로부터의 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
43. 제34항 또는 제35항에 있어서, 연골이 인간 소아 사체 공여자로부터의 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
44. 제40항에 있어서, 절단 단계가 레이저 커터로 연골 조직을 절단하는 것을 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
45. 제44항에 있어서, 절단 단계가 0.6 와트 내지 19.5 와트의 전력, 및 200 Hz 내지 2600 Hz의 주파수로 레이저 커터를 사용하여 연골 조직을 절단하는 것을 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
46. 제34항 또는 제35항에 있어서, 절단 단계가 크기 및/또는 형상에서 균일한 타일을 형성하는 것을 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
47. 제34항 또는 제35항에 있어서, 절단 단계가 원 형상인 타일을 형성하는 것을 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
48. 제47항에 있어서, 타일이 0.5 mm 내지 3 mm의 평균 직경을 갖는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
49. 제34항 또는 제35항에 있어서, 절단 단계가 정사각형 또는 직사각형 형상인 타일을 형성하는 것을 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
50. 제49항에 있어서, 타일이 0.5 mm 내지 3 mm의 평균 길이 및/또는 너비를 갖는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
51. 제34항에 있어서, 천공이 미세천공인, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
52. 제34항, 제35항 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 단계 후, 연골 시트가 식염수로 세척되는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
53. 제34항, 제35항 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 담체가 동결보존 배지를 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
54. 제53항에 있어서, 동결보존 배지가 디메틸 술폭시드(DMSO) 및 혈청을 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
55. 제53항에 있어서, 동결보존 배지가 글리세롤, DMSO, 히드록시에틸 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 부탄디올, 또는 폴리비닐피롤리돈 중 적어도 1종을 포함하는 냉동보호제를 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
56. 제34항, 제35항 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁 단계 전, 연골 시트의 적어도 일부분을 생물학적 접착제로 코팅하는 것을 더 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
57. 제56항에 있어서, 생물학적 접착제가 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 피브린 아교, 폴리사카라이드 겔, 시아노아크릴레이트 아교, 젤라틴-레조르신-포르말린 접착제, 콜라겐 겔, 합성 아크릴레이트-기재 접착제, 셀룰로스-기재 접착제, 기저막 매트릭스, 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 자가 아교 또는 이들의 조합인, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
58. 제34항, 제35항 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁 단계 전, 연골 시트의 적어도 일부분을 탈무기질화 골과 결합하는 것을 더 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
59. 제34항, 제35항 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁 단계 전, 연골 시트의 적어도 일부분을 줄기 세포가 접종된 골 또는 연골 기질과 결합하는 것을 더 포함하는, 모자이크 연골 조성물 제조 방법.
60. 제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 및 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 연골 또는 골 결함을 치료하는 데 사용되는, 모자이크 연골 조성물.
61. 제60항에 있어서, 연골이 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물.
62. 제60항에 있어서, 연골이 연령 15세 이상인 인간 성인 사체 공여자로부터의 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물.
63. 제60항에 있어서, 연골이 인간 소아 사체 공여자로부터의 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물.
64. 제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 및 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 연골을 복구하는 데 사용되는, 모자이크 연골 조성물.
65. 제64항에 있어서, 연골이 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물.
66. 제64항에 있어서, 연골이 연령 15세 이상인 인간 성인 사체 공여자로부터의 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물.
67. 제64항에 있어서, 연골이 인간 소아 사체 공여자로부터의 비-탈세포화 관절 연골인, 모자이크 연골 조성물.
68. 제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 및 제31항 중 어느 한 항의 모자이크 연골 조성물을 포함하는 키트.
69. 제68항에 있어서, 연골이 비-탈세포화 관절 연골인 키트.
70. 제68항에 있어서, 연골이 연령 15세 이상인 인간 성인 사체 공여자로부터의 비-탈세포화 관절 연골인 키트.
71. 제68항에 있어서, 연골이 인간 소아 사체 공여자로부터의 비-탈세포화 관절 연골인 키트.
72. 제68항에 있어서, 생체적합성 담체가 동결보존 배지를 포함하는 것인 키트.
73. 삭제
74. 삭제
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76. 삭제
77. 삭제
78. 삭제

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