KR102211832B1 - 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판을 포함하는 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 니코틴산, 니코틴아미드, 트립토판 또는 관련 화합물을 포함하는 새로운 약학 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예들에서, 이 약학 조성물은 소장 또는 대장에서 일부 또는 전체가 방출된다.

Description

니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판을 포함하는 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 조성물 {COMPOSITION CONTAINING NICOTINIC ACID AND/OR NICOTINAMIDE AND/OR TRYPTOPHAN FOR POSITIVELY INFLUENCING THE INTESTINAL MICROBIOTA}
본 발명은 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판을 포함하는 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 새로운 약학 조성물에 관한 것으로서, 이 약학 조성물은 소장 및/또는 대장에서 특이적으로 방출 (예로, 선택적으로 방출)된다.
다수의 장벽 염증 질환들이 장 세균총의 변화 및/또는 장 세균총과 장 간의 상호작용 장애로 인해 유발된다. 이들 장 염증은 인간과 다른 포유류들에서 (예, 개에서의 만성적인 특발성 대장염) 예를 들어 크론 질환 또는 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환 (IBD)을 발생시킨다. 이들 질환은 완전히 파악되지 않은 복잡한 면역학적 프로세스를 기반으로 한다. 하지만, 장 세균총의 변화 및 상호작용 장애는 다른 다수의 질환들의 원인 인자일 수 있다. 그 예로는, 아토피성 습진과 같은 아토피 질환, 알레르기 증상 또는 천식 (예, Bisgaard et al. 2011, J. Allergy Clin. Immunol. 128:646; Iebba et al. 2011, Dig. Dis. 29:531; Abrahamsson et al. 2012, J. Allergy Clin. Immunol. 129:434; Candela et al. 2012, BMC Microbiol. 12:95; Olszak et al. 2012, Science 336:489), 뿐만 아니라 동맥경화 및 그로 인한 관상 심장 질환과 같은 염증성 인자를 동반한 대사 질환, 지방과다 또는 당뇨병을 포함한다 (Ott et al. 2006, Circulation 113:929; Koren et al. 2011, PNAS 108 Suppl 1:4592; for reviews see Caesar et al. 2010, J. Intern. Med. 268:320; and Vrise et al. 2010, Diabetologia 53:606).
장내 세균총과 다양한 질환들 간의 연관성은 알려져 있지만, 관련 질환에 유익한 영향을 미치는 방식으로 세균총에 어떻게 영향을 미치는 지에 대해서는 파악되지 않았다.
니코틴산 (니아신, 비타민 B3), 니코틴아미드 (니코틴산 아미드) 및/또는 L-트립토판은 수십년간 니아신 결핍 질환 (예, 펠라그라)의 치료제로 사용되고 있다. 펠라그라는 니아신 투여 후 완화되는 장 염증을 동반할 수 있는데, 치료 원리는 장 염증으로 인한 비타민 결핍을 해소시키는 것이다 (Segal et al. 1986, Int. J. Colorectal Dis. 1:238; 및 Clayton et al. 1991, Eur. J. Pediatr. 150:498).
또한, 니코틴산은 혈중 콜레스테롤 지단백질에 대해 건강 증진 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다 (HDL/LDL 비율 및 LDL 소낭 크기; Wahlberg et al. 1990, J. Intern. Med. 228:151; Seed et al. 1993, Atherosclerosis 101:61; Elam et al. 2000, JAMA 284: 1263; McKenney et al. 2001, Am. J. Cardiol. 88:270).
본 발명의 과제는 인간과 동물에서 장내 세균총의 변화 및/또는 장내 세균총과 장 간의 상호작용 장애와 관련있는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 새로운 형태의 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명에서, 상기한 과제는, 니코틴산, 니코틴아미드, 트립토판 또는 본원에 기술된 다른 화합물을 포함하며, 장내 세균총에 유익한 효능을 미치는 것으로 여겨지는, 약학 조성물에 의해 해결된다. 바람직한 구현예에서, 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판이 투여되어, 장 점막과 장내 세균총에 국소적인 영향을 미친다. 예를 들어, 활성 성분은 변형시킬 장내 세균총이 위치한 회장 말단부 또는 대장에 선택적으로 투여되도록, 제형화된다. 동물 체내 (예, 인체)에서 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판으로 변환되는 다른 활성 성분들도 본 발명에 포함된다.
이에, 니코틴산 (니아신, 비타민 B3) 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 이들 3종의 물질은 각각, 또는 서로 조합 (2종 또는 3종의 조합)되어, 소장 및/또는 대장의 세균총에 항-염증성 방식으로 및/또는 유익한 방식으로 작용한다. 본 조성물은 회장 말단부 및/또는 대장에서의 특이적인 국부 또는 국소 효능을 위해 조절형 방출 및/또는 지연성 방출로 경구 투여하는데 적합하다. 치료 병태의 예로는 소장의 염증성 질환, 염증성 대장 질환에 대한 치료 또는 예방, 대장암의 예방, 및 장내 세균총의 변화 및/또는 장내 세균총과 장 간의 상호작용 장애로 인해 발생되는 기타 질환들의 예방을 포함한다. 또한, 본 조성물은 염증성 대장 질환 또는 낭염 (pouchitis)의 국부 및/또는 국소 치료를 위해, 대장 또는 주머니에 (신규)직장 투여하는데 적합하다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 질환 또는 병태를 본원에 기술된 약학 조성물로 치료하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 질환 또는 병태를 치료하는 약제의 제조에 있어서의 본원에 기술된 약학 조성물의 용도를 제공한다.
도 1은 ACE2-결핍 마우스에서 DCC 대장염의 악화가 니코틴아미드 또는 트립토판에 의해 예방됨을 보여준다. 상단 열: 음용수에 비히클 또는 니코틴아미드 (NAM)를 첨가하여 제공한, DSS-challenged ACE2-정상 (ACE2+/y) 및 ACE2-결핍 (ACE2-/y) 마우스에서의, 대장의 조직병리학적 변화 (DSS 투여 후 10일째에 헤마톡실린 에오신 염색; 막대: 100 ㎛ (a)), 체중 감소율 (b) 및 설사 스코어 (diarrhea score) (c). NAM 투여는 DSS 투여하기 3일전에 시작하였다. 하단 열: 정상 식이 (대조군) 또는 트립토판-다이펩타이드 식이 (Trp+)를 제공받은 DSS-challenged ACE2-정상 (ACE2+/y) 및 ACE2-결핍 (ACE2-/y) 마우스에서의, 대장의 조직병리학적 변화 (DSS 시험 투여 후 7일째에 헤마톡실린 에오신 염색; 막대: 100 ㎛ (d)), 체중 감소율 (e) 및 소와 (crypt) 손상 (f).
모든 값들은 마우스 3-10마리/그룹의 평균 및 표준 편차로 나타낸다.
*: P<0.05; ** 또는 ##: P<0.01.
도 2는 니코틴아미드 (2 x 600 mg 매일)를 투여하면서 0주 (wk)부터 4주까지 환자 3명에서의 크론 질환의 활동 지수 (CDAI)의 전개 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 덱스트란 소듐 설페이트 (DSS)로 대장염을 시험 발생시키고, 물에 혼합하여 위관 영양법으로 제공되는 니코틴아미드 (NAM), 식사에 혼합시킨 NAM의 조절 방출형 미니정제 또는 0.5% 메틸 셀룰로스 중의 현탁물로서 위관 영양법으로 제공되는 5-아미노살리실산 중 어느 하나를 처리한, 마우스의 대장 점막의 조직학적 스코어를 나타낸 것이다.
도 4는 덱스트란 소듐 설페이트 (DSS)으로 대장염을 시험 발생시키고, (1) 물에 혼합하여 위관 영양법으로 제공되는 니코틴아미드 (NAM), (2) 식이에 혼합되는 대조군 과립, (3) 3가지 용량으로 식이에 혼합되는 NAM의 조절 방출형 과립, 또는 (4) 식이에 혼합되는 5-아미노살리실산 (5-ASA 과립)의 조절 방출형 과립 제형을 처리한, 마우스의 질병 활동 지수 (DAI)를 나타낸 것이다. *, p < 0.05 vs. 대조군 과립; **, p < 0.01 vs. 대조군 과립; ***, p < 0.001 vs. 대조군 과립; ###, p < 0.001 vs. 수중의 동일 용량의 NAM.
도 5는 덱스트란 소듐 설페이트 (DSS)으로 대장염을 시험 발생시키고, (1) 물에 혼합하여 위관 영양법으로 제공되는 니코틴아미드 (NAM), (2) 식이에 혼합되는 대조군 과립, (3) 3가지 용량으로 식이에 혼합되는 NAM의 조절 방출형 과립, 또는 (4) 식이에 혼합되는 5-아미노살리실산 (5-ASA 과립)의 조절 방출형 과립 제형을 처리한, 마우스로부터 유래된 대장 조직 균질물의 마이엘로퍼옥시다제 (MPO) 함량을 나타낸 것이다. *, p < 0.05 vs. 대조군 과립; **, p < 0.001 vs. 대조군 과립.
도 6은 트립토판, 니코틴산 또는 니코틴아미드 결핍 식이 (Trp/Nia/NAM-무함유 식이)를 12일간 섭취하기 전 또는 섭취한 후, 마우스 5-8마리/그룹의 변 샘플에서의 주요 박테리아 문인 박테리오데테스와 피르미쿠테스의 상대적인 존재율을 도시한 것이다. Trp/Nia/NAM-무함유 식이에는, (1) NAM 또는 5-아미노살리실산 (5-ASA) 무함유 대조군 과립, (2) 3가지 용량으로 식이에 혼합되는 NAM 조절 방출형 과립 제형, 또는 (3) 식이에 혼합되는 5-아미노살리실산 (5-ASA 과립)의 조절 방출형 과립 제형을 포함시켰다.
도 7은 트립토판, 니코틴산 또는 니코틴아미드 결핍 식이 (Trp/Nia/NAM-무함유 식이)를 12일간 섭취하기 전 또는 섭취한 후, 마우스 5-8마리/그룹의 변 샘플에서의 세균총 조성에 대한 유사성 백분율 분석 (SIMPER) 결과를 도시한 것이다. Trp/Nia/NAM-무함유 식이에는, (1) NAM 또는 5-아미노살리실산 (5-ASA) 무함유 대조군 과립, (2) 3가지 용량으로 식이에 혼합되는 NAM 조절 방출형 과립 제형, 또는 (3) 식이에 혼합되는 5-아미노살리실산 (5-ASA 과립)의 조절 방출형 과립 제형을 포함시켰다. 미분류 박테로이데일리즈와 박테로이데일리즈 속 파라프레보텔라의 존재율은 막대의 해칭된 부분으로 가시화하였다.
본 발명의 핵심은, 장내 세균총에 유익한 효능을 나타내는, 니코틴산; 니코틴아미드; 트립토판; 동물의 체내 (예, 인체)에서 니코틴산, 니코틴아미드 또는 트립토판으로 변환되는 화합물; 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 (NAD); 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트 (NADP); NAD 또는 NADP 생합성의 중간 산물; 및 트립토판 다이펩타이드로부터 선택되는, 1, 2 또는 3종의 활성 성분(들)을 포함하는 약학 조성물이며, 이 약학 조성물은 하부 소장, 대장 또는 이 2부위에서 방출되도록 (예로, 조금씩 방출되거나 선택적으로 방출되도록) 지연형 방출로 설계된다.
본 발명자들은, 장내 항미생물 펩타이드의 방출 패턴을 바꿈으로써, 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판이 장내 세균총 (장내 모든 미생물, 특히 박테리아 전체)에 영향을 주어, 항-염증 효과를 가진다는 것을 알게 되었다. 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여한 후 변형된 장내 세균총은 염증-촉진 효과가 저하되거나 또는 항-염증성으로 되어, 인간 또는 다른 포유류 (예, 개에서의 만성 특발성 대장염)에서 크론 질환 또는 궤양성 대장염과 같은 IBD 증상들의 확실한 완화를 야기하거나 및/또는 뒷받침해준다. 아울러, 본원에서는, 먼저, 위장관의 병에 걸린 영역에서 활성 성분을 일정 부분 이상 방출하는 약학 조성물이, 병에 걸린 영역에 도달하기 전에 대부분 흡수되는 약학 조성물 보다 현저하게 우수한 효과를 가진다는 것을, 확인하게 되었다.
이에, 본원에서, "장내 세균총에 유익한 효능을 가진"은 건강에, 특히 본원에 기술된 한가지 이상의 질환 및 증상에 유익한 효과를 나타내는 장내 세균총의 변화 유발을 의미한다. 예를 들어, 유익한 효과는 병원성 박테리아의 수적 감소, 병원성 박테리아 : 이로운 박테리아의 비율 감소, 세균총의 다양성 증대, 세균총에 의해 장에서 유도되는 염증의 양적 감소, 및 세균총의 병리학적 장형 (enterotype) 변화의 일부 또는 전체 복원 (예, 박테로이데스, 프레보텔라 및 루미노코커스와 관련된 장형)과 관련있다. 일반적으로 염증성 장 질환에서 병원성으로 간주되는 박테리아로는, 예를 들어, 침습 특성 또는 병독성 인자를 가진 엔테로박테리에이시이 (예, 에스케리키아 콜라이), 설파이드를 생산하는 데설포비브리오 spp. 및 침습 특성을 가진 푸조박테리움 spp.를 포함한다. 이로운 것으로 일반적으로 간주되는 박테리아는 속명 락토바실러스, 비피도박테리움 및 패칼리박테리움으로부터 유래된 종, 예컨대 락토바실러스 카세이 (L. casei), 락토바실러스 플란타룸 (L. plantarum) 및 패칼리박테리움 프라우스니치이 (F. prausnitzii)를 포함한다. 염증성 장 질환에서 장 세균총에 대한 최근 리뷰로, Manichanh et al. 2012, Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9:599를 참조한다.
Hashimoto 등 (Nature 2012, 487:477)은 본 출원의 우선일 이후에 간행된 것으로, 그 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함되며, 이는 본원에 기술된 본 발명에 대한 추가적인 증거를 제시하고 있다. Hashimoto 등은, 마우스에서 트립토판의 흡수 불량이 자극적인 덱스트란 소듐 설페이트 (DSS)에 의해 유발되는 대장염의 중등도를 현저하게 심화시킨다는 것을 밝혀내었다. 식이성 트립토판 또는 니코틴아미드 보충은 이러한 대장염의 심화를 예방하였다. Hashimoto 등은, 중증 대장염에 대한 감수성 증가는 장의 세균총 변화가 원인이었으며, 다른 마우스에 이식하였을 때 수여체에서도 대장염의 중증도가 심화된다는 것을 입증하였다. 장 세균총에 유해한 변화는 특정 항미생물 펩타이드 (AMP), 특히 알파-디펜신 (defensin)의 상당한 양적 감소가 원인인 것으로 확인되었으며, 회장 말단부의 상피 세포에서의 이의 발현은 트립토판 또는 니코틴아미드에 의해 유발되는 mTOR 시그널링에 의해 주로 조절된다.
만성적인 장 염증은 대장암 발병 위험성을 상당히 높이기 때문에 (예, Ullman & Itzkowitz 2011, Gastroenterology 140:1807), 본 발명에 따른 조성물의 사용은 또한 재발성 장 염증 또는 만성 장 염증 사례에서 대장암의 예방 방법이다.
정상적인 장 세균총 확립 또는 재-확립에 의한 또는 이로운 박테리아의 보충에 의한 치료학적 개입이 다양한 질환 모델들과 해당 인간 질환들에서 유익한 것으로 입증되고 있다. 예를 들어, Olszak 등 (Science 2012, 336:489)은, 최근, IBD 또는 천식에 대한 뮤라인 무균 모델에서, 병에 걸린 장기내 불변성 자연 살상 T 세포의 병적 축적이 마우스 신생아에 정상 세균총을 군락화시킴으로써 예방할 수 있다는 것을 입증하였다. 연구들을 통해, 여러가지 질환들에서 특정 프리바이오틱, 프로바이오틱 또는 신바이오틴의 유익한 효과들이 입증되었다. 예를 들어, 락토바실러스는 비만에서 혈중 콜레스테롤 수치를 낮출 수 있지만, 기전은 여전히 완전히 해명되지 않았다 (Caesar et al. 2010, J. Intern. Med. 268:320). 염증성 장 질환에서, VSL#3 (비피도박테리움 브레비 (Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis), 락토바실러스 액시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플라타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 델키브루에키 ssp. 불가리쿠스 (Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus) 및 스트렙토코커스 서모필러스 (Streptococcus thermophilus)의 혼합물)와 같은 일부 프로바이오틱스들만 제한된 수의 임상 실험들에서 성공적으로 사용되고 있다. 적어도 수종의 박테리아 균주를 보충하는 것은 통상적으로 유의한 치료학적 이점을 제공하는데 필연적인 것으로 보인다. 복합적인 박테리아 개입에 따른 놀라운 효능에 대한 최근 예가 클로스트리듐 디피실리 (Clostridium difficile)에 대한 성공적인 변 이식 사례이다 (van Nood et al. 2013, New Engl. J. Med. 368:407).
장내 세균총의 병리학적 변화는, 또한 아토피 장애에 기인한 다른 다수의 질환들 뿐만 아니라 염증성 인자를 수반한 대사 질환에서 인과적인 역할을 할 수 있기 때문에, 이러한 질환에 대한 치료 및/또는 예방 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 특히, 아래 질환들은 이러한 증상의 예이다:
- 피부: 알레르기, 아토피성 습진, 건선;
- 폐: 낭포성 섬유증, 천식, COPD;
- 혈관: 관상 심장 질환, 동맥경화, 죽상동맥경화;
- 내분비계: 당뇨병, 비만.
장 점막 및 장내 세균총, 장 염증 및 장 점막에 대한 직접 치료에 국소적으로 작용하기 위한, 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판 (및 관련 활성 성분)의 창의적이고 특이적인 국소 사용은, 이들 화합물의 종래 공지되지 않은 뜻밖의 역할에 대한 본원에 언급된 식견으로부터 비롯된다. 이러한 사용은 흡수되어 전신 작용할 것으로 여겨지는 활성 성분의 통상적인 사용과는 현저히 다르다. 새로운 항-염증 효과 및/또는 이의 장내 세균총을 변형시키는 효과로 인해, 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판 (및 본원에 언급된 그외 화합물들)은, 소장 및/또는 염증성 대장 질환을 치료하기 위한 활성 성분으로서 적합하다. 구체적인 예로는, 장 염증의 치료, 대장암의 예방, 및 장내 세균총 변화 및/또는 장내 세균총과 장 간의 상호작용 장애로 인한 기타 질환의 치료 또는 예방을 포함한다. 바람직하게는, 이들 활성 성분은, 활성 성분이 상부 소장에서 가능한 가장 많이 체내 흡수되지 않도록 보호하고, 오히려 변형시킬 장내 세균총이 위치한 회장 말단부 또는 대장으로의 방출 (예, 조절형 방출 및/또는 지연형 방출)을 상당히 달성하는, 약학 제형에 사용된다 (예, 활성 성분은 회장 말단부 및/또는 대장에서 선택적으로 방출됨).
특히, 본원에 기술된 활성 성분은, 크론 질환, 궤양성 대장염, 낭염, 대장의 다른 만성 질환 또는 대장의 염증, 우회 대장염 (diversion colitis), 감염성 장염, 항생제-관련 설사, 예컨대 클로스트리듐 디피실리성 설사, 감염성 대장염, 게실염, 및 조사 (irradiation), 항생제, 화학요법, 약제학적 산물 또는 화학제로 인해 발생된 염증의 치료 뿐만 아니라, 대장암의 예방, 및 장내 세균총 변화 및/또는 장내 세균총과 장 간의 상호작용 장애에 기인한 기타 질환들을 치료하기 위해, 약제를 국소 방출 (예, 조절형 및/또는 지연형 방출)로 사용하는데 적합하다.
청구 물질은 인간과 다른 포유류들에서, 특히 가축 및 유용 동물에서 비슷한 기원을 가진 질환을 치료 또는 예방하는데 동일하게 유용하다. 상기한 동물의 예로는 개, 고양이, 말, 카멜 또는 소가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
활성 성분, 즉, 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판은 시판되는, 예컨대 Merck KgaA에서 생산되는 임의 형태로 사용될 수 있다. 트립토판은 단일 아미노산 또는 다이펩타이드, 예컨대 Gly-Trp 다이펩타이드로서 사용될 수 있다.
니코틴산, 니코틴아미드 및 트립토판 외에도, 다른 관련 화합물들도 본원에 기술된 본 발명에 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 또는 동물 체내에서 상기한 물질들 중 하나로 (예로, 가수분해, 대사에 의해) 변환되는 화합물, 예컨대 니코틴산 에스테르가 적합하다. 아울러, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 (NAD) 또는 NAD 포스페이트 (NADP) 합성의 중간 산물, 예로, N-포르밀키누레닌, L-키누레닌, 3-하이드록시-L-키누레닌, 3-하이드록시안트라닐레이트, 2-아미노-3-카르복시무코네이트 세미알데하이드, 퀴놀리네이트 및 베타-니코티네이트 D-리보뉴클레오티드도 사용할 수 있다. 다른 예로 NAD와 NADP를 포함한다.
니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판 (또는 전술한 다른 물질들 중 하나)을 포함하는 약학 조성물은, 활성 성분의 지연성 방출로 경구 투여하거나, 또는 직장 적용 방식 (예, 관장 또는 좌제)을 통해 투여할 수 있다. 활성 성분의 전달 부위는, 바람직하게는, 염증 프로세스를 저해하기 위한 소장 및/또는 대장의 하부 영역이며, 따라서, 예컨대 유기체에서 최대 흡수 및 대사를 달성하여 전신 효과를 나타내는 적용 방식과는 기본적으로 다르다. 아울러, 본 발명에 따른 투여 방식과 본 발명에 따른 투여량은 부작용 발생 가능성을, 예를 들어 니코틴산의 전신 투여와 관련하여 기술된 바와 같은 부작용 발생 가능성을 최소화한다.
본원에서, "하부 소장"은 소장의 후반부이며, "회장 말단부"는 회장의 후반부이다.
이와 관련하여, 본 발명은, 조합 조제물, 예컨대, 니코틴산 및/또는 니코틴아미드과, 니코틴산의 전형적인 부작용을 낮추는, 아세틸살리실산 및/또는 프로스타글란딘 D2 길항제, 예로 라로피프란트 (laropiprant)의 조합을 포함한다. 상기한 조합의 조성과 투여량은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 아울러, 니코틴산 대신 니코틴아미드를 사용하는 것이 본 발명에 바람직하며, 이는 부작용 발생 가능성을 최소화한다.
회장 말단부 및/또는 대장에서 항-염증 효과 및/또는 장내 세균총 변형 효과를 가진 활성 성분의 경구 투여용 제형을 제조하기 위해서는, 조절형 및/또는 지연형 방출 방식을 사용하는 것이 유익하며 혁신적이다. 최적의 보충을 위한 예컨대, 펠라그라의 경우, 전형적인 (일부 경우에는 또한 지연형임) 방식과는 대조적으로, 본 발명의 특정 구현예는 소장의 상부와 위에서의 흡수가 일부 또는 실질적으로 방지된다.
크론 질환 또는 궤양성 대장염을 치료하기 위해, 경구 및/또는 직장 적용 방식 (예, 관장)이 적합하다. 궤양성 대장염의 경우 낭염을 치료하기 위해서는, 직장 적용 (예, 관장)이 바람직하다. 또한, 전술한 경구 제형, 예컨대 지연형 방출 조제물을 경구 투여함으로써 유지할 수 있다. 임의의 다른 대장염 형태의 대증 요법 (symptomatic therapy)의 경우, 장내 세균총을 치료학적으로 변형시키기 위해 경구 적용과 직장 적용을 선택할 수 있다. 경구 적용은 대장암, 특히 궤양성 대장염에서 대장암을 예방하고, 장내 세균총의 변화 및/또는 장내 세균총과 장 간의 상호작용 장애로 인해 일부 또는 실질적으로 발생된 그외 질환들을 예방하는데, 바람직하다.
경구 투여의 경우, 특수 제제 (special galenics) (소위 조절형 방출, 서방형 또는 지연형 방출 형태)로 인해 활성 성분의 방출을 조절 및/또는 지연시키는 특수 투약 형태가 특히 적합하다. 이러한 투약 형태로는 단순 정제 및 코팅 정제, 예컨대 필름 정제 또는 당의정제일 수 있다. 정제는 통상 둥근형 또는 양면 볼록형이다. 정제를 구별할 수 있는 장방형 정제 (Oblong tablet) 형태도 가능하다. 아울러, 과립제, 회전 타원체 (spheroids), 펠렛제 또는 마이크로캅셀제가 바람직하며, 작은 봉지 (sachet)나 캡슐 안에 적절할 경우 충진된다.
용어 "지연형 방출"은 바람직하게는 지연 기간을 경과한 후 활성 성분을 방출시키는 약학 제형이다. 특정 구현예에서, 지연은 제형내 활성 성분을 하부 소장 (예, 회장 말단부) 및/또는 대장에서 일정 부분 이상 방출시키는데 충분하다.
용어 "조절형 방출"은 바람직하게는 약학 제형 또는 그 구성 성분이 장기간에 걸쳐 하나 이상의 활성 성분을 방출 또는 전달하는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 그 기간은 제형내 활성 성분을 하부 소장 (예, 회장 말단부) 및/또는 대장에서 일정 부분 이상 방출시키는데 충분하다.
지연은, 예를 들어, 위액에 내성을 나타내며 pH에 따라 용해되는 코팅제에 의해, 마이크로셀룰로스 및/또는 멀티 매트릭스 (MMX) 기술을 이용함으로써, 여러가지 담체 매트릭스를 이용함으로써 또는 이들 기술을 조합 사용함으로써, 편리하게 달성된다. 그 예로는, 조절형 방출 및/또는 지연형 방출을 위한 다양한 혼합물 형태로 아크릴 폴리머 및/또는 메타크릴레이트 폴리머를 포함하는 필름 코팅제를 포함한다. 예를 들어, 활성 성분 (들)은 일반적인 미세결정 셀룰로스 또는 젤라틴 매트릭스 안에 함유되거나, 또는 MMX 기술을 이용하여 함유시킬 수 있으며, 이는 활성 성분(들)의 지연성 방출을 제공하는 물질로 코팅된다. 활성 성분은, 공지의 방법을 이용하여 코딩된 대용량 (large-volume) 캡슐 (예, 용량이 0.68 ml인 젤라틴) 안에 넣는 것이 바람직하다. 적합한 코팅제로는, 수-불용성 왁스 및 폴리머, 예컨대 폴리메타크릴레이트 (예, 제품 포트폴리오, 상품명 Eudragit®, 특히 Eudragit® S 및 Eudragit® L, Evonik Industries AG, Essen, Germany), 및 수-불용성 셀룰로스 (예, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스)가 있다. 적절한 경우, 수용성 폴리머 (예로, 폴리비닐피롤리돈), 수용성 셀룰로스 (예로, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스 또는 하이드록시프로필 셀룰로스), 폴리소르베이트 80, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 락토스 또는 만니톨도 코팅 물질에 포함될 수 있다.
예를 들어, Eudragit® S와 L 화합물의 조합 (예로, Eudragit® L/S 100)은, 회장 말단부에서 형성되는 pH > 6.4에서 본 발명에 따른 활성 성분들의 조절형 방출을 구현한다. Eudragit® 조제물 및 이의 혼합물 (L, S 및 R 화합물)의 사용 역시 활성 성분의 패키지에 고려가능한 것이며, 따라서, 전체 위장관의 선택된 부위에서의 국소적인 사용은 특정 pH 값에서의 조절형 방출을 통해 달성할 수 있다.
또한, 약학 조성물은, 결합제, 충진제, 유동화제, 윤활제 및 흐름 조절제와 같은 약제학적 부형제 성분을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은, 적절한 경우, 추가적인 활성 성분과 약학 조성물에서 통상적인 부형제, 예를 들어, 탈쿰, 아라비아 검, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 코코아 버터, 수계 및 비-수계 담체, 동물성 또는 식물성 지질 물질, 파라핀 유도체, 글리콜 (특히, 폴리에틸렌 글리콜), 다양한 가소제, 분산제, 유화제 및/또는 보존제와 함께, 제형화될 수 있다.
직장 적용을 위한 관장제 또는 좌제를 제조하기 위해서는, 활성 성분의 조제물을 적정 용매에 용해시킨 다음 공지의 약학적 방법에 따라 관장제나 좌제로 가공할 수 있다.
최종 투약 형태에서의 활성 성분의 함량은 경구 투여의 경우 1 - 3000 mg, 바람직하게는 100 - 1000 mg이며; 관장제 및/또는 좌제의 경우에는 활성 성분을 10 mg - 5000 mg의 함량을 포함할 수 있다. 염증성 질환의 강도 및 중증도에 따라, 투약 형태는 매일 1회 또는 수회로, 또는 의사가 정한 다른 투약 용법으로 투여한다.
본원에서, 용어 "치료", "치료한다" 및 "치료하는"은 본원에 기술된 바와 같이 질환 또는 장애의 진행 또는 이로 인한 한가지 이상의 증상을 회복, 발병 지연 또는 저해하는 것을 의미한다. 일부 구현예들에서, 치료제는 하나 이상의 증상이 발현된 이후에 투여할 수 있다. 다른 구현예들에서, 치료제는 증상이 없을 때 투여할 수 있다. 예를 들어, 치료제는 증상이 발현되기 전에 의심되는 개체 (예, 증상의 병력 및/또는 유전적 요인이나 다른 의심되는 요인을 토대로 함)에게 투여할 수 있다. 또한, 치료는 증상이 해소된 후에도, 예를 들어 이의 재발을 예방하거나 지연시키기 위해, 계속될 수 있다.
본원에서, 용어 "예방" 및 "예방한다"는 치료하지 않은 대조군 개체군과 비교하여 질환, 장애 또는 이의 한가지 이상의 증상을 발병을 지연하거나 또는 발병 가능성을 낮추는 것을 의미한다.
본원에 기술된 본 발명의 다른 측면은 치료할 개체의 유전적 및/또는 미생물학적 데이타 및 특별한 필요성에 준하여 청구된 약제를 효과적으로 사용하는 것에 관한 것이다. 모든 타입의 질환 (특히, 장내 세균총과 장 간의 상호작용에 장애가 발생한 질환)에 대한 개체의 유전학적 소인과 약물유전학에 대한 새로운 식견은, 예를 들어, 약제 및/또는 이의 대사산물 및/또는 이의 하류 작동자 (downstream effector)와 상호작용하는, 세포 표면 수용체, 수송체 단밸직, 대사 효소 또는 신호 전달 단백질을 코딩하는 관련 위험 유전자 및 유전자들의 유전자 분석 등의 증거에 기반한 개인 맞춤형 의료가, 본원에 기술된 약제의 사용 타입, 적용 방식, 사용 횟수(들), 용량 및/또는 투약 용법과 관련된 정보 제공과 개선에 기여할 수 있음을 시사해준다. 이러한 개인 맞춤형 치료가 유익할 수 있는 개체로는, 혈청 트립토판 감소 개체, B0AT1 (예로, 장의 상피 세포에서) 발현이 변형된 개체 및 B0AT1 다형성 개체를 포함한다. 이는 특히 변 샘플에서 세균총의 변화가 확인되었을 때, 장내 세균을 분석하는데에도 마찬가지로 적용된다. 본 발명은 따라서 본 발명에 따른 약제에 특히 감수성인 개체를 동정하거나 및/또는 본 발명에 따른 약제를 개체의 상황에 따라 조절하기 위한, 적합한 유전자 및/또는 미생물 테스트 방법의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은, 개체의 유전적 특성 및 미생물학적 특성에 따라 여러가지 투여 방식으로 여러가지 성분 (니코틴산 및/또는 니코틴아미드 및/또는 트립토판)의 사용을 확실히 포함한다. 이를 위해, 실험실 테스트 및/또는 적정 테스트 키트를 사용할 수 있으며, 또한 예를 들어 혈액, 뇨 또는 그외 체액에서 적정 파라미터들을 분석하거나 또는 변 샘플을 취하기 위해, 의사, 사용자 및/또는 환자가 선택한 측정 방법, 장치 및/또는 키트도 사용할 수 있다.
실시예
본 발명의 교시 내용을 유리하게 전개하고, 더욱 발전시킬 수 있는 다양한 가능성들이 존재한다. 이를 위해, 본 발명을 예를 들어 기술한 아래 실시예들을 참조한다.
실시예 1:
Hashimoto (Nature 2012, 487:477)가 발표된 이래로, 우선권 출원 시점에 공개되지 않은 새로운 사실이 제기되었으며, 이는 본 발명의 내용을 뒷받침해주며, 예시하기 위한 목적으로 본원에서 간략하게 기술한다: 장의 상피 세포 표면에 존재하는 중성 아미노산 수송체 B0AT1 (이것은 트립토판을 수송함)의 발현이 안지오텐신 변환 효소 2 (ACE2) (Kowalczuk et al. 2008, FASEB J. 22:2880; Camargo et al. 2009, Gastroenterology 136:872)의 존재와 연계되어 있다는 것은 알려져 있다. ACE2 결함은 아미노산 결핍 질환 (소위 하르트누프 병)을 발병시키며, 이 질환의 패턴은 펠라그라와 유사하여, 트립토판과 니코틴아미드의 공급을 증가함으로써 치료할 수 있다. 현재, 마우스 모델을 통해, ACE2 무기능성 마우스 (유전자형: Ace2-/y)는, 덱스트란 소듐 설페이트 (DSS) 물질을 제공하여 인위적으로 유발시킨 장 염증에 대해, 정상 유전자형 (Ace2+/y)을 가진 마우스 상당히 더 심각한 고통을 받는다는 것이 확인되었다. 흥미롭게도, 니코틴아미드 (NAM)의 예방적이고 지속적인 투여시, 또는 트립토판 다이펩타이드의 복용시 (이는 본원에서 이용가능하지 않은 B0AT1 이외의 다른 수송체를 통해 흡수됨), 이러한 작용을 유전적으로 정상인 마우스 수준으로까지 약화시킬 수 있었다. 관련 데이타는 도 1에 요약 개시하며, 마우스 모델에 비추어 인간 및 동물 사용하기 위한 본 발명의 내용, 발견 사실과 청구 내용을 뒷받침해준다.
실시예 2:
니코틴아미드 복용시 장내 세균총의 변화를 분석하기 위해, 종래 기술에 따라 변 샘플에서 게놈 DNA를 분리하여 정량하고, 박테리아의 16S RNA의 가변성 부위를 증폭시켰으며, 이때 증폭 산물에는 식별을 위한 적정 마커가 제공된다. 증폭 산물에 대한 고성능 피로시퀀싱을 수행한 후, 수득한 모든 서열들을 대상으로 품질 관리 (quality control)를 수행하고, 박테리아 DNA 서열에 대한 보좌 데이타베이스와 다단계 서열 비교로 분석한다. 처리 및 무처리 개체들의 변 샘플에서 수득한 장내 세균총에 대한 전형적인 단면도의 차이를, 관찰 및 확인된 질환의 증상 및 개체의 관련 유전 인자와 연관지어, 평가한다.
도 2는 크론 질환을 앓고 있으며 4주간 통상적으로 제형화된 고용량의 니코틴아미드를 복용한 (매일 2 x 600 mg) 환자 3명의, 크론 질환의 활동 지수 (CDAI), 즉 여러가지 질환 매개변수들로부터 일반적인 기준에 따라 계산된 질병의 활동성의 진행을 도시한 것이다. CDAI < 150인 값은 관해에 해당된다. 크론 질환을 앓고 있는 환자 3명 모두 니코틴아미드 투여에 대해 확실하게 반응하였으며, 이들 중 2명은 치료 기간 중에 관해되었다.
Hashimoto et al. 2012 (Nature 487:477)에 언급된, 뮤라인 대장염 모델에서 니코틴아미드의 기저 기전과 유익한 효과 (실시예 1)는, 본 실시예에서 확인된 니코틴아미드 보충에 따른 인간 크론 질환자의 임상적인 개선과 부합된다.
실시예 3:
크론 질환 환자와 궤양성 대장염 환자의 장 점막에서의 ACE2 발현이 건강한 개체에서의 수치와 현저하게 다르지 않음에도 불구하고 (데이타 도시 안함), 점막에서 염증이 발생된 영역에서의 B0AT1의 발현은 매우 많이 감소되었으며 통계학적으로 유의하다는 것을 놀랍게도 확인하게 되었다 (P 값 < 0.05) (표 1을 참조함). 아울러, 여러가지 요인으로 장 염증을 앓고 있는 환자로부터 유래된 대조군 샘플 (소위 질환 특이성 대조군)은 입원한 정상인 (HN)과 유의하게 다르지 않았다. 이는 보편적인, 비-특이적인 결핍 질환 또는 아미노산 결핍과, 본 발명에서 효능이 새롭게 밝혀진 IBD 치료에 있어서의 니코틴산, 니코틴아미드 및/또는 트립토판 (및 관련 화합물)의 특이적인 효과에 반하는 결론이다.
크론 질환 궤양성 대장염 IBD 샘플 모두 염증이 발생된 IBD 샘플 모두 염증이 없는 IBD 샘플 모두 다른 장 질환에서 염증이 발생된 샘플 다른 장 질환에서 염증이 발생되지 않은 샘플
염증 부위 비-염증성 부위 염증 부위 비-염증성 부위
HN에 대한 편차
-8.77
-1.55
-31.02
-2.15
-5.44
-18.43
-1.92
-1.52
-1.01
P 값 0.0002 0.2772 0.0000 0.0207 0.0000 0.0000 0.0485 0.1093 0.3632
표 1: 기본 값 (입원한 정상 대조군의 샘플의 값, HN, 즉 장 염증이 없는 환자)에 대한 B0AT1의 mRNA 발현
본 실시예에서 확인된 IBD 환자에서 관찰되는 트립토판 수송체 결핍은, 트립토판 수송체 결핍으로 인해 대장염이 악화된 마우스의 상황에 해당된다 (Hashimoto et al. 2012, Nature 487:477; 실시예 1 참조).
실시예 4:
니코틴아미드를 장 상피에 표적 전달함에 있어 조절형 방출 제형의 이점을 규명하기 위해, 덱스트란 소듐 설페이트 (DSS) 대장염 마우스 모델에서 개념 증명 실험을 수행하였다. DSS 대장염은 인간 염증성 장 질환에 대한 후보 약물의 효능을 조사하기 위해 표준화된 대장염 모델이다. DSS 대장염에 통상 효과적인 치료 대조군으로서, 5-아미노살리실산 (5-ASA)을 사용하였다. 5-ASA는 생리 pH에서 거의 용해되지 않으므로, 0.5% 메틸셀룰로스 중의 현탁물로서 투여하였다.
위장관의 길이, 통과 시간 및 pH 환경 측면에서의 종-특이적인 차이로 인해, 조절형 방출 제형을 치료할 유기체에 맞게 개조하였다. 뮤라인 위장관의 파라미터를 기반으로 (Koopman et al. 1978, Lab. Anim. 12:223; McConnell et al. 2008, J. Pharm. Pharmacol. 60:63), 마우스에서의 개념 증명을 위한 뮤라인-특이 제형을 조제하였다.
99% NAM을 윤활제로서 1% 마그네슘 스테아레이트 (둘다 Caelo, Hilden, Germany)와 혼합한 분말을 이용하여 조절 방출형 미니정제를 조제하였다. 블랜딩한 후, 분말 유동성 (안식각; <35°) 및 크기 분포 (레이저 회절; 주요 입자 분획: 100 - 200 ㎛)에 대해 분말의 특징을 규명하여, 양호한 분말 유동성을 확보하였다. 그런 후, 회전 압축하고, 필름을 통한 NAM의 확산에 의해 NAM 방출을 조절하기 위해, 수-불용성 폴리머인 Kollidon SR 30 D (BASF, Ludwigshafen, Germany)로 필름 코팅하여, 미니정제를 제조하였다. 코팅 제형은 다음과 같다: Kollicoat SR 20 D (49.9%), 글리세롤 모노스테아레이트 60 (0.743%), 프로필렌 글리콜 (0.743%), 레드 철 산화물 (0.4%), 폴리소르베이트 80 (0.314%), 및 물 ad 100%.
글리세롤 모노스테아레이트 60 (Caelo)를 절반의 물과 함께 80℃로 가열하고, Ultraturrax (IKA, Staufen, Germany)로 에멀젼화하였다. 그런 후, 레드 철 산화물 (Caelo)을 첨가하고, 다시 5분간 분산시켰다 (제1 용기). 폴리소르베이트 80 (Caelo), 프로필렌 글리콜 (Caelo) 및 폴리머 분산제를 제2 용기에서 합하여, 자기 교반기를 사용하여 교반하였다. 제1 용기의 냉각시킨 (<30℃) 에멀젼을 제2 용기의 폴리머 분산물과 합하고, 나머지 물을 첨가하였다. 분산물을 1시간 교반한 다음 여과 (<500 ㎛)하였다. 유동층 장치 (Mycrolab, Huttlin, Schopfheim, Germany)에서 액체 공급 속도 약 1 ml/min 및 분무압 0.7 bar 조건으로, 미니정제를 배치 크기 50 g으로 코팅하였다. 분무 후, 45℃에서 체적 유량 8 m³으로 정제를 사전-가열하였다. 분무하는 동안, 체적 유량을 45℃에서 16 m³로 높였다. 약 38℃의 생산 온도가 관찰되었다. 분무 후, 다시 45℃에서 10분간 경화시키기 위해 정제를 16 m³로 유동화하였다. 마지막 가공 단계에서, 가열을 중단시키고, 끈적해지지 않도록 정제 베드를 <30℃로 냉각시켰다. 정제를 6.2 ± 0.04 mg/cm²로 코팅하였다. 약물의 방출은 패들 장치 (DT6, Erweka, Heusenstamm, Germany)에서 Ph. Eur.에 따라 50 rpm에서 측정하였다. pH4의 약산성 위장액이 마우스에서 예상되어, 포스페이트 완충제 (pH 4)를 용해 매질로 사용하였다 (McConnell et al. 2008, J. Pharm. Pharmacol. 60: 63-70). 약물 농도는, 262 nm에서 UV 흡광도로 측정하였다. 미코팅 정제는 정제의 작은 크기와 니코틴아미드의 고 수용성으로 인해 순각적인 약물 방출을 나타내었다. Kollidon SR 코팅을 이용하여, 마우스의 소장내 타겟 부위를 덮도록 약물 방출을 최적화하였다 (지체 시간 약 15분, 3시간 동안 일정한 약물 방출). 미니정제를 트립토판/니아신-무함유 식이 분말과 균질하게 혼합하고, 길이 약 2 cm x 직경 1 cm의 펠렛을 최소량의 멸균수를 사용하여 제조하고, 1회용 분획으로 -20℃에서 냉동시켜 저장하고, 마우스 공급하기 위해 매일 사용전에 해동하였다.
C57BL/6J 수컷 마우스 (특정 병원체 부재 동물; Taconic Europe, Ry, Denmark)를 6-7주령에 시험 시설에 옮겨 2주간 순응시켰다. 순응 기간 동안의 사료는 Altromin (Lage, Germany) 사의 Altromin 1324였다. 2주간의 순응 기간이 끝난 후, 사료를 트립토판, 니코틴산 또는 니코틴아미드가 첨가되지 않은 Ssniff (Soest, Germany) 사의 주문 제작 사료 (Trp/Nia/NAM-무함유 사료)로 바꾸었다. 사료를 바꾼 당일에, 하기 명시된 바와 같이 치료 용법을 개시하였다. Trp/Nia/NAM-무함유 사료와 치료제는 마우스를 희생시킬 때까지 투여하였다. 12일간 Trp/Nia/NAM-무함유 사료를 식이한 후, 음용수에 1.5% DSS (MP Biomedicals, Illkirch, France)로 4일간 마우스에 시험 투여한 다음, 희생시켰다.
치료 용법은, 다음과 같이 치료하는, 각각 마우스 10마리로 구성된 그룹 4개를 사용하여 수행하였다:
그룹 1: 비히클 (멸균수) 0.25 mL을 매일 경구 위관 영양으로 투여함.
그룹 2: 멸균수 중의 니코틴아미드 (Cat. No. 4488; Caelo) 용액 0.25 mL (6　mg/mL; 최종 용량: ca. 60 mg/kg 체중)을 매일 경구 위관 영양으로 투여함.
그룹 3: 사료에 균질하게 분산시킨 조절 방출형 NAM 미니정제 (최종 용량: ca. 60 mg/kg 체중, 식품 섬취량 2.5 g/마우스/일을 기준으로 함).
그룹 4: 0.5% 메틸셀룰로스 (Cat. No. M7140, Sigma-Aldrich)에 15　mg/mL 농도로 현탁시킨 5-아미노살리실산 (5-ASA; Cat. No. A3537, Sigma-Aldrich, Brondby, Denmark) 0.25 mL (최종 용량: ca. 150 mg/kg 체중)을 매일 경구 위관 영양으로 투여함.
투여 용액들은 투여 직전에 매일 동일 스톡 용액으로부터 신선하게 준비하였다.
사료 교체 직전, DSS 대장염 유발 직전 및 희생 직전에, 장내 미생물 분석을 위해 각 동물로부터 변 2 덩어리에 해당되는 신선한 변 샘플을 채취하였다. 변 샘플을 액체 질소에 즉시 순간 동결시켜, -80℃에 보관하였다. 순간-동결은 주위 온도에서 다양한 증식 특징을 가진 여러가지 박테리아들의 비율을 유지시키기 위해 수행하였다.
동물을 희생시킨 즉시, 대장을 0.9% 염수로 헹구고, "스위스 롤 (Swiss roll)" 샘플을 준비하였다 (Moolenbeek and Ruitenberg 1981: Lab. Anim. 15: 57). 간략하게는, 세척한 대장을 길게 개복하고, 융모가 밖으로 향하도록 말고, 이 롤을 포름알데하이드에 고정한 다음, 표준 절차에 따라 파라핀에 포매하였다. "스위스 롤" 조제물은 동일한 단편 슬라이드 상에서 전체 대장 점막을 길이 방향으로 정량적인 조직학적 분석을 가능하게 할 수 있다. 단편들을 표준 절차에 따라 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 2명의 독립적인 맹검 조사자에 의해 샘플을 분석하고, 파라미터 3개를 이용한 하기 시스템에 따라 스코어를 매겼다:
염증의 중증도 : 0, 점막 고유층내 염증 세포가 드뭄; 1, 점막 고유층내 과립구의 수가 증가됨, 점막하 부종; 2, 점막 아래까지 이어지는 염증성 세포의 융합; 3, 염증성 침윤이 점막을 지나 확산됨.
소와의 손상 (Crypt damage) : 0, 소와 무손상; 1, 기저층 1/3 소실; 2, 기저층 2/3 소실; 3, 소와 전체 소실; 4, 상피 표면의 침식 변화; 5, 융합성 침식.
궤양 : 0, 궤양 없음; 1, 궤양 병소가 1 또는 2곳; 2, 궤양 병소가 3 또는 4곳; 3, 융합성 또는 확장성 궤양.
최고 조직학적 스코어는 3 + 5 + 3 = 11이었다.
전체 대장 점막에 대한 맹검 조직학적 검사를 본원에 청구된 NAM 제형들의 치료 효과에 대한 하드 엔드포인트 (hard endpoint)로서 선정하였다.
4가지 그룹의 조직학적 스코어를 도 3에 평균 및 표준 편차로 나타낸다. 최상으로 보존시켜 준비한 대장 샘플과 단편들만 사용하였다 (아래 내용에서 동물의 수를 괄호 안에 표시함). 스코어는 다음과 같다:
그룹 1 (물 대조군): 6.25 ± 1.39 (n = 8);
그룹 2 (NAM 수용액): 5.14 ± 1.07 (n = 7);
그룹 3 (NAM 제어 방출형 정제): 3.38 ± 0.92 (n = 8);
그룹 4 (5-ASA): 6.50 ± 1.60 (n = 8).
음용수에 용해시킨 NAM은 물 대조군과 비교하여 조직학적 염증 스코어에 저하 경향만을 유발한 반면 (p = 0.1), NAM 조절형 방출 제형과 물 대조군 간에 (p < 0.001), 또한 중요하게는 NAM 수용액과 NAM 조절 방출형 간에 (p < 0.01) 매우 유의한 차이가 관찰되었다. 흥미롭게도, 치료 대조군 5-ASA (이는 정상적인 DSS 대장염을 완화시키며, 인간의 염증성 장 질환의 치료에 널리 사용됨)는 트립토판 또는 니아신 없이는 DSS 대장염을 완화시킬 수 없었다 (도 3). 이러한 사실은, 장내 세균총과 대장염에 대한 NAM의 유익한 효과가 경구 위관 영양법을 통한 전신 전달법을 사용하는 것이 최상이 아니며, 장내 조절형 방출 제형이 최적이며, NAM의 일차 효과가 장내 국소 환경에 대한 것이라는, 본 발명의 개념을 뒷받침해준다.
실시예 5:
니코틴아미드를 장 상피로 표적 전달하기 위한 조절형 방출 제형을 추가로 규명하기 위해, 덱스트란 소듐 설페이트 (DSS) 대장염 마우스 모델에서 2차 개념 증명 실험을 수행하였다. 이러한 2차 보다 큰 규모의 개념 증명 실험에서, NAM의 조절형 방출 과립 제형을 3가지 용량으로 실험하였다. DSS 대장염에 통상 유효한 치료 대조군으로서, 5-아미노살리실산이 포함된 조절 방출형 과립제를 사용하였다 (5-ASA 과립제; PENTASA, Ferring Pharmaceuticals, Saint-Prex, Switzerland).
NAM의 조절형 방출 제형은, 25% 니코틴아미드, 70% 다이베이직 칼슘 포스페이트 및 5% 포비돈 K30으로 이루어진 과립이다. 평균 입자 크기는 234 ㎛였다. 이후, 과립을 에틸셀룰로스 7로 필름 코팅하여, 무게는 30% 증가되었고, 평균 입자 크기는 640 ㎛이 되었다. 여과하여, 355 ㎛ 보다 작은 크기의 입자는 제거하였다. 대조군 과립은 NAM 대신 동량의 다이베이직 칼슘 포스페이트로 대체하였다.
C57BL/6J 수컷 마우스 (특정 병원체 부재 동물; Charles River Laboratories, Saint-Germain-sur-l'Arbresle, France)를 >12주령에 시험 시설에 옮기고, 장내 미생물을 농화 및 안정시키기 위해 1.5개월간 순응시켰다. 순응 기간 동안의 사료는 SAFE (Scientific Animal Food and Engineering, Augy, France) 사의 diet A4였다. 순응 기간이 끝난 후, 사료를 트립토판, 니코틴산 또는 니코틴아미드가 첨가되지 않은 Ssniff (Soest, Germany) 사의 주문 제작 사료 (Trp/Nia/NAM-무함유 사료)로 바꾸었다. Trp/Nia/NAM-무함유 사료는 분말로 공급받았으며, 이를 이용하여 사료 펠렛을 과립 무첨가, NAM 또는 5-ASA 무첨가 대조군 과립, NAM 과립 또는 5-ASA 과립과 함께 준비하였다. 과립들은 사료에 균질하게 분산시켰다. 길이 약 2 cm x 직경 1 cm의 사료 펠렛을 최소량의 멸균수를 사용하여 조제하고, 1회용 분획으로 -20℃에서 냉동시켜 저장한 후, 마우스에 제공시 매일 사용전에 해동하였다. 사료 펠렛내 과립의 함량은 체중 30 g 및 1일 사료 섭취량 3 g을 기준으로 계산하여, 다음과 같이 정하였다.
5-ASA 과립제 (5-ASA 표적 용량: 150 mg/kg 체중; 5-ASA 함량: 52%): 4.5 mg 5-ASA + 사료 3 g; 8.65 mg 과립 + 3 g 사료; 2.88 g 과립/사료 kg. 다른 과립의 경우 고정 용량도 유사한 방식으로 계산하였다.
NAM 과립제 (NAM 표적 용량: 30, 60 또는 120 mg/kg 체중; NAM 함량: 19.1%): 30 mg/kg NAM의 경우, 과립 1.57 g/사료 kg; 60 mg/kg NAM의 경우, 과립 3.14 g/사료 kg; 120 mg/kg NAM의 경우, 과립 6.28 g/사료 kg.
대조군 과립은 NAM 과립 120　mg/kg 투여군과 동일한 비율로, 즉, 과립 6.28 g /사료 kg으로 사료에 첨가하였다.
사료를 과립이 첨가 또는 무첨가된 Trp/Nia/NAM-무함유 사료로 바꾼 당일, 경구 위관 영양 치료 용법을 하기 명시된 바와 같이 그룹 1과 그룹 2에서 시작하였다. 과립이 첨가 또는 무첨가된 Trp/Nia/NAM-무함유 사료와 위관 영양 치료는 마우스를 희생시킬 때까지 투여하였다. Trp/Nia/NAM-무함유 사료를 12일간 식이한 후, 음용수에 1.5% DSS (TDB Consultancy, Uppsala, Sweden)로 5일간 마우스에 시험 투여한 다음, 다시 2일간 정상 음용수를 제공한 후 희생시켰다.
치료 용법은, 다음과 같이 치료하는, 각각 마우스 10마리로 구성된 그룹 7개를 사용하여 수행하였다:
그룹 1: 0.1 mL 비히클 (멸균수)을 매일 경구 위관 영양으로 투여함.
그룹 2: 멸균수 중의 NAM (Sigma-Aldrich, Brondby, Denmark) 용액 0.1 mL (18 mg/mL; 최종 용량: ca. 60 mg/kg 체중)을 매일 경구 위관 영양으로 투여함.
그룹 3: 사료 + 대조군 과립 (과립의 양은 그룹 6과 동일함).
그룹 4: 사료 + NAM 과립 (최종 용량: 30 mg/kg 체중).
그룹 5: 사료 + NAM 과립 (최종 용량: 60 mg/kg 체중).
그룹 6: 사료 + NAM 과립 (최종 용량: 120 mg/kg 체중).
그룹 7: 사료 + 5-ASA 과립 (최종 용량: 150 mg/kg 체중).
투여 용액들은 투여 직전에 매일 동일 스톡 용액으로부터 신선하게 준비하였다.
사료 교체 직전, DSS 대장염 유발 직전 및 희생 직전에, 장내 미생물 분석을 위해 각 동물로부터 변 2 덩어리에 해당되는 신선한 변 샘플을 채취하였다. 변 샘플을 액체 질소에 즉시 순간 동결시켜, -80℃에 보관하였다. 순간-동결은 주위 온도에서 다양한 증식 특징을 가진 여러가지 박테리아들의 비율을 유지시키기 위해 수행하였다.
DSS 시험 자극을 개시한 이래로, 마우스의 전반적인 건강 상태와 질환 활동 지수 (DAI)와 관련된 파라미터, 즉, 설사 및 가시적인 혈변을 매일 모니터링하였다. 희생시킨 후, 대장 염증의 육안 스코어 평가를 수행하였다. DAI는 Melgar et al. 2005 (Am J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288:G1328)에 따라 계산하였으며, 이론 최대값은 9이다. 표 2 및 도 4에 요약 개시된 DAI 데이타는, 실시예 4의 데이타와 마찬가지로, NAM 수용액은 본 실험 설정에서 비-유의한 향상 경향만 나타낸 반면, NAM 조절 방출형 제형 (NAM 과립)은 DAI를 매우 유의하고 약물 의존적인 방식으로 감소시키는 것을 나타났다. 중요하게도, 60 mg/kg으로 NAM을 복용한 NAM 과립 그룹은 60 mg/kg NAM을 수용액으로 복용한 그룹 보다 현저하게 낮은 DAI를 나타내었다 (표 2). 5-ASA 과립제는 치료 효능에 대해 비-유의한 경향을 나타내었다.
그룹 DAI 통계적 유의성
물 5.70 ± 0.24 적용 불가
NAM 수용액
(60 mg/kg)		 5.40 ± 0.25 물 대비 유의하지 않음
대조군 과립 5.00 ± 0.25 적용 불가
NAM 과립제
(30 mg/kg)		 3.56 ± 0.35 p = 0.03 vs. 대조군 과립
NAM 과립제
(60 mg/kg)		 2.11 ± 0.35 p < 0.01 vs. 대조군 과립;
p < 0.001 vs. NAM 수용액 (60 mg/kg)
NAM 과립제
(120 mg/kg)		 1.90 ± 0.23 p <0.001 vs. 대조군 과립
5-ASA 과립제
(150 mg/kg)		 4.67 ± 0.42 물 또는 대조군 과립 대비 유의하지 않음
표 2: 질환 활동 지수 (DAI) 데이타 및 이의 통계적 분석.
다형핵 호중구 과립구의 과립구 안에 포함된 효소인 마이엘로퍼옥시다제 (MPO)의 양은 호중구 동원에 대한 정량적인 조직 마커이며, 간접적으로 DSS 대장염에서 호중구에 의해 매개되는 급성 대장 염증을 정량할 수 있다.
뮤라인 대장 조직의 MPO 함량을 분석하기 위해, 대표적인 대장 조직 샘플을 Hycult MPO 마우스 ELISA 키트 (Cat. No. HK210; Hycult Biotech; CliniSciences, Nanterre, France)를 제조사의 권고에 따라 사용하여 분석하였다.
NAM 수용액은 단지 비-유의한 MPO 감소 경향을 나타낸 반면, 60 및 120 mg/kg 용량으로 NAM 과립을 복용한 마우스 그룹에서는 MPO 수준의 현저한 감소가 관찰되었는데, 이는 조절형 방출 제형으로 투여하였을 때에만 NAM가 유의한 치료학적 효과를 나타낸다는 것을 다시금 보여준다 (표 3, 도 5).
그룹 MPO 통계적 유의성
물 236.41 ± 9.1 적용 불가
NAM 수용액
(60 mg/kg)		 219.71 ± 12.16 물 대비 유의하지 않음
대조군 과립 240.25 ± 5.18 적용 불가
NAM 과립제
(30 mg/kg)		 234.61 ± 21.96 대조군 과립 대비 유의하지 않음
NAM 과립제
(60 mg/kg)		 212.42 ± 10.08 p < 0.05 (p = 0.036) vs. 대조군 과립
NAM 과립제
(120 mg/kg)		 202.76 ± 4.97 p <0.001 vs. 대조군 과립
5-ASA 과립제
(150 mg/kg)		 232.69 ± 6.73 물 또는 대조군 과립 대비 유의하지 않음
표 3: 대장에서 마이엘로퍼옥시다제 (MPO) 수준의 정량 및 통계적 분석.
실시예 6:
실시예 4 및 실시예 5에 기술된 동물 실험들의 결과는 NAM 조절형 방출 제형의 유의한 치료학적 효능을 시사하였으므로, 실시예 5에 기술된 실험의 마우스의 장내 미생물을 Hashimoto et al. 2012 (Nature 487:477)에 기술된 바와 완전히 동일한 방법과 장치(16srDNA phylogenies and 454 tag sequencing)를 사용하여 분석하였다. 조절 방출형 과립을 복용한 5개의 그룹 (그룹 3-7)의 경우, 실시예 5에 언급된 질환 파라미터를 분석하기 전에 맹검으로 동물 8마리를 선택하였다. 영양 개입 전 (정상, 기준 포인트로서 비-대장염 유발성 플로라 (non-colitogenic flora))과 Trp/Nia/NAM-무함유 사료를 12일간 제공한 후 (DSS 시험 자극 즉시, 실시예 5), 이들 마우스 모두에서 유래된 변 샘플을 비교하였다.
도 6은, Trp/Nia/NAM-무함유 사료를 12일간 섭취하면 우세한 문이 박테리오데테스에서 피르미쿠테스로 극적으로 바뀐다는 것을 보여준다. 이는, NAM 조절 방출형 과립에 의해 일부, 그리고 용량-의존적인 방식으로 예방할 수 있었다. 5-ASA 조절 방출형 과립도 동일한 추세를 나타내었다 (도 6). 아울러, 박테리아 그룹에 대한 보다 상세한 유사성 퍼센트 분석 (SIMPER)으로, NAM 조절형 방출이 미분류 박테로이데일리즈 및 박테로이데일리즈 속 파라프레보텔라 (도 7; 빗금친 부분)의 확대를 유도한다는 것이 확인되었다.
박테로이데일리즈 과의 유익한 공생주는 포유류 장내 유세한 대표적인 부류에 속하며, 이는 식이성 다당류를 가수분해하여 숙주가 이용할 수 있는 단쇄 지방산 (SCFA)으로 변환할 수 있기 때문에, 영양분 처리에 중요하다. NAM 조절형 방출 과립을 이용한 치료시, 확대된 박테로이데일리즈 그룹에서 발군된 것과 가장 상동적인 게놈들이 상기한 SCFA 생산주에 속하였다. 특히, 이들 유용 공생주의 우세성과 형성되는 장내 SCFA 수준은 인간 염증성 장 질환에서 저하된다 (Frank et al. 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:13780). 프리바이오틱스 또는 프로바이오틱스에 의한 이러한 미생물총의 확대 뿐만 아니라 이의 SCFA 생산 증대가 설치류DSS 대장염에 치료학적으로 유효한 것으로 입증되었다 (Osman et al. 2006, BMC Gastroenterol. 28;6:31; Maslowski et al. 2009, Nature 461:1282). 아울러, 박테로이데일즈는 염증 반응을 억제할 수 있는 면역조절성 탄수화물 구조 (다당류 A)를 분비하는 것으로 입증되었다 (Mazmanian et al. 2008, Nature 453:620).
요컨대, 장내 NAM의 조절형 방출은 유용 미생물총의 용량 의존적인 증가를 유도하며, 대장염을 완화한다.
상기한 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 그 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

Claims (21)

  1. 니코틴산; 니코틴아미드; 트립토판; 트립토판 다이펩타이드; 또는 이들의 조합에서 선택되는 활성 성분을 포함하는,
    병원성 박테리아의 수적 감소, 병원성 박테리아 : 이로운 박테리아의 비율 감소, 장내 세균총(intestinal microbiota)의 다양성 증대, 또는 장내 세균총의 병리학적 장형 (enterotype) 변화의 일부 또는 전체 복원에 의해, 장내 세균총의 변화를 유발하는 것을 특징으로 하는, 장내 세균총 개선용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이, 변화시킬 장내 세균총 (intestinal microbiota)이 위치한, 회장 말단부, 대장 또는 이들 모두에서 국소적인 효능을 위해 상기 활성 성분을 방출하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 회장 말단부, 대장 또는 이들 모두에서의 특이적인 국소 효능을 위해 상기 활성 성분을 지연 방출하는 경구 투여용으로 제형화되는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 회장 말단부, 대장 또는 이들 모두에서의 특이적인 국소 효능을 위해 상기 활성 성분을 조절 방출하는 경구 투여용으로 제형화되는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 니코틴아미드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    - 소장의 염증성 질환, 또는 대장의 질환의 치료 또는 예방을 위해; 대장암의 예방을 위해; 장내 세균총이 염증-촉진 효과가 저하되거나 항-염증성이 되도록 변형시켜 질환을 치료 또는 예방하기 위해; 장내 세균총의 병리학적 변화의 치료 또는 예방을 위해; 또는 이들의 조합을 위해; 또는
    - 장내 세균총이 염증-촉진 효과가 저하되거나 항-염증성이 되도록 변형시켜 질환을 치료 또는 예방하기 위해; 장내 세균총의 병리학적 변화의 치료 또는 예방을 위해; 또는 이들의 조합을 위해,
    활성 성분을 지연 또는 조절 방출하는 경구 투여용으로 제형화되는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 대장 또는 낭에 직장 투여 또는 신(neo)직장 투여되거나, 또는 염증성 대장 질환 또는 낭염을 치료하기 위해 제형화되는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 변화시킬 장내 세균총 (intestinal microbiota)이 위치한, 회장 말단부, 대장 또는 이들 모두에서 국소적인 효능을 위해 상기 활성 성분을 선택적으로 방출하기 위해 제형화되는, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 최종 투약 형태 당 활성 성분 1 - 3000 mg의 함량으로 경구 투여하기 위해 제형화되거나; 또는 최종 투약 형태 당 활성 성분 100 - 1000 mg의 함량으로 경구 투여하기 위해 제형화되는, 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 최종 투약 형태 당 활성 성분 10 - 5000 mg의 함량으로 직장 투여 또는 신직장 투여하기 위해 제형화되는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 염증성 장 질환의 치료 또는 예방,
    (b) 대장암의 치료 또는 예방, 또는
    (c) 아토피 질환에 기인한 질환, 또는 염증성 인자를 수반한 대사 질환의 치료 또는 예방, 또는 피부 알레르기, 아토피성 습진, 건선, 낭포성 섬유증, 천식, COPD, 관상 심장 질환, 동맥경화, 죽상동맥경화, 당뇨병, 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환 또는 이들의 조합의 치료 또는 예방
    에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 염증성 장 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 염증성 장 질환이 궤양성 대장염 또는 크론 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 트립토판 다이펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제5항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 장내 세균총이 염증-촉진 효과가 저하되거나 항-염증성이 되도록 변형시켜 질환을 치료 또는 예방하기 위해; 장내 세균총의 병리학적 변화의 치료 또는 예방을 위해; 또는 이들의 조합을 위해 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
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