KR102203360B1 - 아스타잔틴을 포함하는 나노 리포좀 - Google Patents

아스타잔틴을 포함하는 나노 리포좀 Download PDF

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김기현
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Abstract

본 발명의 나노 리포좀은 음이온성 계면활성제가 아스타잔틴과 함께 인지질층에 봉입된 형태를 가지고 있다. 음이온성 계면활성제는 전자와 아스타잔틴의 접촉을 막아 높은 안정성을 가질 수 있다. 본 발명의 나노 리포좀은 선택적으로 포화 및 불포화 지방산이 인지질층에 추가로 봉입된 형태를 가질 수 있다. 이에 따라, cis 및 trans 형태로 존재하는 아스타잔틴의 안정성을 더욱 높일 수 있다. 나아가, 본 발명의 나노 리포좀에서 지방산이 첨가된 제형은 상승적인 염증 개선효과를 가질 수 있다.

Description

아스타잔틴을 포함하는 나노 리포좀 {Nano-liposomes Comprising Astaxanthin}
본 발명은 아스타잔틴을 포함하는 나노 리포좀에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상기 나노 리포좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
아스타잔틴(astaxanthin; 3,3'-dihydroxy-β,β-carotene-4,4'-dione)은 화학식 C40H52O4로 나타내어지며, 자연계에 광범위하게 분포하는 비타민 A의 전구물질인 베타카로틴으로 대표되는 아스타잔틴 계열의 크산토필(xanthophyll)에 속하는 색소중의 하나이다(Di Mascio, P. et al. (1991) Am. J. Clin. Nutr., 53:194S-200S). 실제로 인간이 섭취하는 많은 식품에 존재하는 주홍색 또는 밝은 오렌지색의 색소인 아스타잔틴은 천연적으로 생산되어 해상 및 수상동물에 가장 널리 존재하고, 특히 새우, 붉은 도미류(red seabream), 연어(salmon) 및 바다가재(lobster) 등과 같은 해양 동물 조직에 존재하는 것으로 알려져 있다(Fujita, et al. (1983) Nippon Suisan Gakkaishi., 49:1855-1869; Johnson, E.A. (1991) Crit. Rev. Biotechnol., 11:297-326; Nelis, et al. (1991) J. Appl. Bacteriol., 70:181-191). 또한, 게나 가재를 삶으면 빨갛게 되는 것은 색소 단백질이 분해되어 붉은 아스타잔틴의 색이 나타나기 때문이다.
아스타잔틴은 정상적인 호기적 대사과정 중 발생하는 활성 산소에 의한 세포 내 DNA, 단백질, 지질 등의 손상, 세포 및 조직의 노화와 발암을 유발하는 반응을 억제할 뿐만 아니라, 강력한 생물학적 항산화제로 강한 유리 라디칼(hydroxy or peroxy radicals)의 생성을 억제하는 작용을 하므로 지질의 과산화(peroxidation) 및 산화적 손상을 방지함으로써 LDL-콜레스테롤, 세포막 및 조직을 보호한다(Palozza et al.(1992) Arch. Biochem. Biophys., 297:291-295; Shimidzu, et al. (1996) Fish Sci., 62:134-137). 아스타잔틴이 단원자 산소를 제거시킬 수 있는 항산화력에서 비타민 E인 α-토코페롤(tocoperol) 보다 100 내지 500배 더 활성이 높고, β카로틴보다는 10배 이상 더 강력한 항산화제 기능을 갖고 있다고 알려져 있다.
또한, 아스타잔틴은 LPS로 유도된 NF-kB transcriptional activity에 의한 염증성반응에 대해 NO 생성 억제 및 염증성 유전자들의 발현 조절을 유발하므로, 항산화 작용뿐만 아니라 항염 작용도 있는 것으로 알려져 있다(Journal of life science, 40(2011) 1079-1085).
하지만, 아스타잔틴은 융점이 높은 화합물(약 160℃내지 200℃로서, 물에 불용성이며, 유기용매나 지방 및 오일에서의 가용성이 극히 낮으며, 특히, 가열로 이성체화되는 경향이 있으며, 열, 산소나 빛으로 쉽게 변성되는 경향이 있다. 이러한 특성으로 인해 아스타잔틴은 앞서 언급한 바와 같은 다양한 유용성에도 불구하고 그 활용이 미비하고 제품화가 제한되어 있는 실정이다.
한국공개 특허 10-2009-0107036호 및 한국공개 10-2013-0079401호에는 카로티노이드 성분과 폴리글리세린 지방산 에스테르를 포함하는 유화제 성분을 포함하는 유화 조성물이 개시되어 있다. 이들 공개특허들은 물에 불용성인 카로티노이드를 분산시키기 위해 비이온성 유화제인 폴리글리세린 지방산 에스테르를 카로티노이드 대비 수십에서 수백 배 이상 사용하고 있다. 그러나, 상기 문헌과 같이 비이온성 유화제를 사용하는 경우 별도의 분산제가 필요한 만큼 분산성이 우수하지 않을 뿐만 아니라, 카로티노이드가 열, 산소나 빛에 대한 안정성이 취약한 성질이 전혀 고려되지 않는다. 또한, 폴리글리세린 지방산 에스테르와 같은 고분자 물질은 고함량으로 사용되면 피부의 장벽 기능을 파괴하는 부작용을 유발할 수 있다.
이와 같이, 아스타잔틴의 항산화 및 항염 효능을 유지하면서도 분산성 뿐만 아니라 광 및 열 안정성을 높일 수 있는 제형에 대한 연구가 필요한 실정이었고, 본 발명자들은 아스타잔틴(astaxanthin) 및 음이온성 계면활성제가 인지질 이중층 내에 봉입된 나노 리포좀이 높은 분산성 및 경피 투과율을 가질 뿐만 아니라 가혹조건 하에 보관 안정성이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 하나의 기술적 과제는, 아스타잔틴(astaxanthin) 및 음이온성 계면활성제가 인지질 이중층 내에 봉입된 것인, 안정성이 향상된 아스타잔틴 함유 나노 리포좀을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 하나의 기술적 과제는, (a) 인지질 및 음이온성 계면활성제를 포함하는 수상 및 (b) 아스타잔틴 및 오일을 포함하는 유상의 혼합에 의해 수득되는 것인, 아스타잔틴 함유 나노 리포좀의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 하나의 기술적 과제는, 상기 나노 리포좀을 포함하는 염증 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
나노 리포좀 제형
상기와 같은 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 아스타잔틴(astaxanthin) 및 음이온성 계면활성제가 인지질 이중층 내에 봉입된 것인, 안정성이 향상된 아스타잔틴 함유 나노 리포좀을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “나노 리포좀”은 인지질 이중막으로 이루어진 나노 크기의 구형 입자가 주성분인 콜로이드성 입자형 제형을 의미한다. 나노 리포좀은 리포좀막을 구성하는 인지질이 생체 적합성이 우수하므로 인체에 적용할 수 있는 가장 적절한 제형 중의 하나로 여겨지고 있다. 수난용성 약물들은 소수성 부분에 친화성을 갖는 경우가 많아 이들을 이중막을 구성하는 인지질 분자 사이에 삽입시키는 형태로 가용화할 수 있어 난용성 약물 가용화 제형으로서 리포좀 기반 제품이 연구 개발되어 오고 있다. 그러나 리포좀 인지질막내에 약물을 끼워넣어 삽입시키는 경우 인지질 분자 사이의 충분한 공간 확보가 어려워 소수성 약물의 삽입농도가 높지 못한 단점이 있다. 특히, 리포좀의 응집(aggregation)과 융합 (fusion)은 리포좀의 불안정화의 주요 원인이 된다. 즉, 소수성 약물이 막에 높은 농도로 삽입되어 있을 경우, 리포좀의 응집 또는 융합을 심화시켜 제조 후 보관과정에서 또는 투여 후 작용 부위에 도달하기 전에 지질 이중막을 뚫고 나와 약물이 석출될 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 음이온성 계면활성제가 아스타잔틴과 함께 인지질 이중층 내에 봉입된 나노 리포좀을 도출하였다. 이러한 나노리포좀 또는 선택적으로 지방산을 추가로 함유하는 나노 리포좀은 높은 분산성을 나타내면서도 약물이 석출되지 않고 나아가 열 및 빛에 대한 안정성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 나노 리포좀의 모식도를 도 1에 나타내었다. 본 발명의 나노 리포좀에 있어, 아스타잔틴, 음이온성 계면활성제, 및 선택적으로 포함되는 지방산과 같은 주요 구성성분은 인지질 이중층 내에 봉입된 구조를 가지며, 일부 아스타잔틴 등은 인지질 이중막 내부 또는 외부에 분산되어 존재할 수 있다. 본원에서는, 나노 리포좀이란 봉입되지 않은 일부의 아스타잔틴 등의 구성성분을 포함하는 전체 제형을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 “아스타잔틴(astaxanthin)”은 468nm(헥산)에 흡수 극대를 갖는 적색의 색소이고, 카로티노이드의 일종 크산토필에 속해 있다(Davies, B.H.: In“Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments", T. W. Goodwin ed., 2nd ed.,38-165, Academic Press, NY, 1976.). 아스타잔틴의 화학 구조는 3,3'-dihydroxy-β,β-carotene-4.4'-dione(C40H5204, 분자량 596.82)이다. 아스타잔틴은 기존에 강력한 항산화 활성을 갖는 물질로 알려 알려져 있다.
아스타잔틴은 상기 3(3')-위치의 2개의 OH기를 가지며, 여기에 지방산이 결합되어 에스테르 형태를 이룰 수 있다. 참고적으로, 유포지아목(Euphausiacea)으로부터 얻어지는 아스타잔틴은 지방산 2개 결합된 디에스테르(Yamaguchi et al, Bull. Jap. Sos. Sci. Fish., 1983, 49, p.1411-1415.), H. pluvialis로부터 얻어진 것은 3S，3S'-체이고, 지방족 1개 결합된 모노에스테르체가 많이 함유되어 있다(Renstrom, B. et al, Comp. Biochem., 1981, 69, p.625- 627.). 또한, Phaffia Rhodozyma에서 얻어지는 아스타잔틴은 지방산과 에스테르 형성하지 않는 프리체로 존재 하고 있다(Andrewes, A.G. et al, Phytochem., 1976, 15, p.1003-1007.). 본원에서는 특별히 언급하지 않는 이상 “아스타잔틴”은 OH기가 치환되지 않은 아스타잔틴뿐만 아니라 아스타잔틴 모노 에스테르, 및 아스타잔틴 디에스테르를 포함하는 유도체를 지칭한다.
아스타잔틴은 분자 중앙의 이중 결합이 존재함에 따라 cis-, trans-의 기하이성질체도 존재한다. 예를 들면, All-trans 체, 13-cis 체, 9-cis 체, 및 15-cis 체 등의 기하이성질체가 존재한다. 모든 기하이성질체의 아스타잔틴은 항산화효과를 나타내고 있으나, cis-이성질체, 특히 9-cis 이성질체가 가장 우수한 항산화효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Biochem Biophys Res Commun.,　2007 May 25;357(1):187-93. Epub 2007 Mar 28). 본원에서 특별히 언급하지 않는 이상 “아스타잔틴”은 모든 기하이성질체를 포함한다.
아스타잔틴은 분자의 양단에 존재하는 환구조의 3(3')-위치의 수산기의 입체 배치에 의해 이성체가 존재하는 3S, 3S'-체, 3S, 3R'-체(meso-체), 3R, 3R'-체의 3종이 있다. Phaffia Rhodozyma에서 얻어지는 아스타잔틴은 3R, 3R'-체(Andrewes, A.G. et al, Phytochem., 1976, 15, p.1009-1011.)이고, 통상 천연에서 발견되는 3S,3S'-체와 반대인 구조를 갖고 있다. 본원에서 특별히 언급하지 않는 이상 “아스타잔틴”은 입체이성질체를 모두 포함한다.
본원에서 아스타잔틴은 천연 추출물로부터 수득되거나 합성되는 것일 수 있다. 구체적으로, 아스타잔틴은 헤마토코커스 조류로부터 추출된 것일 수 있다. 헤마토코커스 조류 추출물의 유래로서는, 구체적으로는 헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis), 헤마토코커스·라커스트리스(Haematococcus lacustris), 헤마토코커스·카펜시스 (Haematococcus capensis), 헤마토코커스·드로에바겐시스(Haematococcus droebakensis), 헤마토코커스·짐바 비엔시스(Haematococcus zimbabwiensis) 등이 열거된다. 또한, 아스타잔틴은 이를 함유하는 천연물로부터 분리·추출한 아스타잔틴 함유 오일로부터 수득되는 것일 수 있다. 이러한 아스타잔틴 함유 오일로서는, 예를 들면 적색효모 파피아, 녹조헤마토코커스, 해양성 세균 등을 배양하고, 그 배양물로부터의 추출물, 남극 크릴새우(Antarctic krill) 등으로부터의 추출물을 들 수 있다.
본원에서 제한되지 않는 일 실시예에 따르면, 본 발명의 제형에 따른 나노 리포좀이 열 및 빛에 의해 안정성을 나타내며, 전체 아스타잔틴의 함량 및/또는 9-cis 체의 함량을 장기간 유지할 수 있다.
본원에서 제한되지 않는 일 실시예에 따르면, 본 발명의 제형에 따른 나노 리포좀은 일반적인 나노 리포좀과 비교하여 우수한 경피 흡수율을 나타낼 수 있다.
본원에서 제한되지 않는 일 실시예에 따르면, 본 발명의 아스타잔틴 함유 나노 리포좀은 유효성분으로 아스타잔틴을 가져 항산화 및 항염 용도로 경피에 적용될 수 있다. 특히, 본 발명의 아스타잔틴 함유 나노 리포좀은 지방산을 추가로 포함함에 따라 항산화 효과가 유지되며 증가된 항염 효과를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “음이온성 계면활성제”는 친수성 부위가 음전하를 갖는 계면활성제를 의미한다. 본원의 일 구현예에 따르면, 음이온성 계면활성제가 나노 리포좀의 인지질 이중층에 포함되어, 음이온성 계면활성제의 음전하 부위가 나노 리포좀 표면에 존재할 수 있다. 이에 따라 나노 리포좀의 분산성이 향상되고, 리포좀의 균일성이 극대화될 수 있다(실험예 4 및 5). 또한, 음이온성계면활성제가 전자와 아스타잔틴의 접촉을 막아 아스타잔틴의 분해 또는 석출을 저해할 수 있어 아스타잔틴의 안정성을 향상시킬 수 있다. 본원의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 음이온성 계면활성제를 추가적으로 사용함에 따라 고온 및 일광 노출에 따른 나노리포좀의 안정성을 높일 수 있음을 확인하였다 (실험예 1 내지 3). 나아가, 본 발명의 제형은 음이온성 계면활성제의 첨가에 따라 이를 갖지 않는 나노리포좀과 비교하여 경피 흡수율이 현저히 상승될 수 있다(실험예 6).
구체적으로, 상기 음이온성 계면활성제는 C10-20알킬 포스페이트 또는 C10-20알킬 설페이트일 수 있다. 또한, 상기 음이온성 계면활성제는 포타슘 세틸 포스페이트(Potassium Cetyl Phosphate), 소듐 라우릴 설페이트(Sodium Lauryl sulfate) 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate), 소듐 라우레스 설페이트(Sodium Laureth sulfate), 및 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 음이온성 계면활성제는 포타슘 세틸 포스페이트(Potassium Cetyl Phosphate)일 수 있으며, 이는 다른 음이온성 계면활성제들보다 피부에 자극을 나타내지 않으므로 바람직하게 사용될 수 있다. 대표적인 음이온 계면활성제인 소듐 라우릴 설페이트(Sodium Lauryl sulfate)는 EWG (Environmental Working group) 그린 등급이나 유해성 논란이 있어 사용이 기피되고 있는 실정으로, 본원에서는 대안적으로 안전하며 친환경적인 포타슘 세틸 포스페이트를 사용하더라도 높은 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 나노 리포좀은 상기 음이온성 계면활성제를 아스타잔틴 1 중량부를 기준으로 1 내지 10 중량부, 구체적으로 2 내지 5 중량부, 보다 구체적으로 3 내지 5 중량부만큼 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 내에서 나노 리포좀의 분산성 및 유효성분의 안정성을 극대화할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “인지질 이중층”은 친수성 헤드(head)와 소수성 테일(tail)을 가지고 있는 인지질들이 2개층으로 구성된 막을 의미한다. 통상적으로 친수성 헤드들이 이중층의 표면 및 내부상에 노출되어 있고, 인지질 이중층의 소수성 테일은 노출되지 않는다. 상기 인지질 이중층은 리포좀 표면에 노출된 친수성 헤드 영역, 소수성 테일 영역, 및 리포좀 내부에 노출된 친수성 헤드 영역으로 구성된다. 본 발명에 따른 나노 리포좀에서 아스타잔틴은 상기 인지질 이중층을 관통할 수 있다. 즉, 상기 아스타잔틴의 양쪽 OH기는 친수성 헤드 영역이 안정적으로 존재할 수 있으며, 아스타잔틴의 중심체인은 소수성 테일 영역 내에 안정적으로 존재할 수 있다. 음이온성 계면활성제 및 선택적으로 지방산은 나노 리포좀에서 지용성 부위는 친수성 헤드 영역에 소수성 부위는 소수성 헤드 영역에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인지질 이중층은 인지질 이중층을 구성하는 인지질은 중성지질, 음이온성 인지질 및 양이온성 인지질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다. 상기 중성지질은 L-a-포스파티딜콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다. 상기 음이온성 인지질은 L-α-포스파티딕산, L-α-포스파티딜-DL-글리세롤, 카디오리핀, L-a-포스파티딜이노시톨, 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)], 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린], 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)], 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린], 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)], 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린], 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린], 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)], 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린], 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스페이트,1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌글리콜2000], 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌글리콜)2000], 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[PDP(폴리에틸렌글리콜)2000], 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)], 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린], 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스페이트 및 올레산 으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다. 상기 양이온성 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판, 디올레오일 글루타마이드, 디스테아로일 글루타마이드, 디팔미토일 글루타마이드, 디올레오일 아스파르타마이드, 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판, 3ß-[N-(N'N'-디메틸아미노에탄)카바모일], 메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다. 구체적으로, L-a-포스파티딜콜린일 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 나노 리포좀은 상기 인지질을 아스타잔틴 1 중량부를 기준으로 1 내지 10 중량부, 구체적으로 2 내지 5 중량부, 보다 구체적으로 3 내지 5 중량부 만큼 포함하는 것일 수 있다. 상기 함량으로 아스타잔틴이 포함될 경우 나노 리포좀의 분산성 및 유효성분의 안정성이 극대화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “지방산”은 지방족 탄화수소의 말단이 카르복실기인 것을 의미한다. 본원의 일 구현예에 따르면, 지방산이 나노 리포좀의 인지질 이중층에 추가로 봉입된 것일 수 있다. 이 경우, 지방산의 카르복실기가 나노 리포좀의 표면에 존재할 수 있다. 이는 리포좀 막에 탄력을 줄 뿐만 아니라 아스타잔틴의 산화를 방지하는 역할을 할 수 있다. 본원의 실시예에 따르면, 본 발명자들은 지방산을 추가적으로 사용함에 따라 열 및 일광 노출에 대한 안정성을 극대화할 수 있음을 확인하였다 (실험예 1 내지 3). 본원의 일 구현예에 따르면, 상기 지방산은 엘라이드산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 올레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 및 카프릴릭/카프릭트리글레사라이드(MCT)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 한 종 이상이 될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 지방산은 포화지방산, 불포화지방산, 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 지방산은 포화지방산 및 불포화지방산의 혼합물일 수 있다. 여기에서 포화지방산은 C10-20 포화 지방산일 수 있으며, 한 종류 또는 그 이상이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 포화지방산은 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 및 스테아린산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 포화지방산일 수 있다. 불포화지방산은 C10-20 불포화 지방산일 수 있으며, 한 종류 또는 그 이상이 사용될 수 있다. 상기 불포화지방산은 엘라이드산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 및 아라키돈산로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 불포화지방산일 수 있다. 나노 리포좀 포화지방산 및 불포화지방산의 혼합물을 포함하는 경우 불포화지방산은 cis-아스타잔틴을 안정화시키며, 포화지방산은 trans-아스타잔틴을 안정화시켜, 나노 리포좀 내 아스타잔틴의 trans 및 cis 형태 모두의 안정성이 높게 나타날 수 있다. 즉, 포화지방산 및 불포화지방산 모두가 첨가된 나노 리포좀은 열 및 일광 조건하에서도 아스타잔틴 전체의 함량이 높게 유지될 수 있다. 특히, 9-cis 아스타잔틴의 함량이 높게 유지될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 나노 리포좀은 상기 지방산을 아스타잔틴 1 중량부를 기준으로 0.1 내지 1.5 중량부만큼 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 나노 리포좀은 포화지방산 및 불포화지방산을 아스타잔틴 1 중량부를 기준으로 각각 0.1 내지 1.5 중량부, 구체적으로 0.2 내지 1.0 중량부, 보다 구체적으로 0.3 내지 0.6 중량부 포함하는 것일 수 있다. 이보다 많은 함량으로 포함될 경우 리포좀의 형성이 불완전할 수 있으며, 낮은 함량으로 포함할 경우 아스타잔틴의 안정성 개선이 미미할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 나노 리포좀 내부공간에는 수상이 존재할 수 있다. 상기 수상에는 극성분자와 같은 수용성의 유효성분이 용해된 형태로 포함될 수 있으며, 지용성의 유효성분이 용해되지 않는 상태로 봉입될 수도 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 나노 리포좀은 양이온성 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 양이온성 아미노산은 예를 들어, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 또는 이들의 유도체일 수 있다. 양이온성 아미노산을 추가로 함유함에 따라 리포좀의 안정적 형성을 나타낼 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 나노 리포좀은 양이온성 아미노산을 아스타잔틴 1 중량부를 기준으로 0.1 내지 0.5 중량부로 포함할 수 있다. 이보다 많은 함량으로 양이온성 아미노산을 포함할 경우, 리포좀의 분산성이 저해될 수 있으며, 이보다 적은 함량으로 양이온성 아미노산을 포함할 경우, 리포좀의 안정적 형성 효과가 미미할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 나노 리포좀은 후술하는 제조방법에 의해 제조된 것일 수 있다.
제조방법
본원의 과제를 해결하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 안정성이 향상된 아스타잔틴 함유 나노 리포좀을 제공한다.
본원의 나노 리포좀은 (a) 인지질 및 음이온성 계면활성제를 포함하는 수상 및 (b) 아스타잔틴 및 오일을 포함하는 유상의 혼합하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 수득되는 것일 수 있다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같으며, 나노 리포좀의 특성, 성분간 함량비, 및 제형은 전술한 바와 같다. 본 발명의 나노 리포좀을 구성하는 구성성분간 함량비는 상기 제조방법에 첨가되는 성분의 함량에 비례하여 형성된다.
상기 수상은 인지질 및 음이온성 계면활성제 등을 증류수에 첨가하여 교반하여 제조될 수 있다. 상기 수상은 60 내지 90℃의 온도하에서 교반되는 것일 수 있다. 상기 수상의 교반 조건은 2,000 내지 4,000rpm의 속도일 수 있다.
상기 유상은 금속 킬레이트화제를 추가로 포함할 수 있으며, 대표적인 예로 EDTA-2NA를 포함할 수 있다.
상기 수상에는 전술한 지방산이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 수상에는 전술한 양이온성 아미노산이 추가로 포함될 수 있다.
상기 유상은 아스타잔틴을 오일의 존재하에서 용매에 첨가하여 교반하여 제조될 수 있다. 상기 유상은 10 내지 30℃구체적으로 실온에서 교반되는 것일 수 있다. 상기 유상의 교반 조건은 2,000 내지 4,000rpm의 속도일 수 있다.
상기 용매는 알코올 및 글리세린의 혼합물일 수 있으며, 구체적으로 글리세린 및 에탄올의 혼합물일 수 있다. 상기 유상에 첨가되는 오일은 당업계에 사용되는 화장료용 오일이라면 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 예를 들어 MCT 오일이 사용될 수 있다.
상기 수상 및 유상은 혼합되어 리포좀을 형성하도록 할 수 있다. 구체적으로, 수상 및 유상을 혼합하고 교반하여 혼합액을 제조한 후, 리포좀을 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 혼합액을 Microfluidizer (MF)를 이용하여 800 내지 1,200 bar에서 리포좀을 형성시킬 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 리포좀에 당업계에 사용되는 방부제를 첨가할 수 있다.
화장료 조성물
본 발명의 기술적 과제를 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 나노 리포좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 나노 리포좀에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 나노 리포좀은 피부에 적용되어 항산화 및 항염, 진정, 노화방지, 주름개선, 보습 효과를 나타낼 수 있으며, 이는 나노 리포좀이 갖는 아스타잔틴의 높은 항산화력을 나타냄에 기인한다. 또한, 본 발명의 나노 리포좀은 신생아와 아토피성 피부에 사용할 수 있으며, 예민하고 민감한 모든 피부에 부작용 없이 적용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 나노 리포좀을 포함하는 화장료 조성물은 염증 개선용도를 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 나노 리포좀이 지방산, 구체적으로 포화지방산과 불포화지방산의 혼합물을 추가로 포함하는 경우, 지방산과 아스타잔틴의 시너지 효과에 의해 상승된 염증개선용도를 가질 수 있다. 본원의 일 실험예에 따르면, 지방산과 아스타잔틴이 하나의 제형으로 투여되어 상승된 염증개선 용도를 가짐을 확인하였다(실험예 7.2).
본원에서 사용되는 용어 "염증 개선” 또는 “항염증" 이란, 염증을 억제하는 작용을 의미하며, 항산화 기반의 NO 생성 억제에 의한 염증 억제 및 사이토카인 발현 억제에 의한 염증 억제를 포함한다. 특히, 지방산을 추가로 갖는 본 발명의 나노 리포좀에서는 특히 IL-1βTNF-α 등의 사이토카인 발현 억제가 우수하게 나타날 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 목적하는 상기 효과를 달성하기 위해, 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 상세하게는, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이 경우 상기 화장료 조성물은 계면활성제, 유화제, 비누산, 용매, 착색제, 보존제, 항산화제, 소포제, 항균제, 항재침착제, 효소, 식물 또는 미네랄 오일, 지방, 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 보존제, 단백질, 실리콘, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식 물 추출물, 왁스 등을 포함하는 부형제를 함유할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 아스타잔틴 함유 나노 리포좀은, 음이온성 계면활성제가 인지질 이중층 내에 봉입되어 표면에 음전하를 나타냄에 따라, 안정적인 분산성과 고온 및 일광의 가혹 조건에 대한 아스타잔틴의 높은 안정성을 나타낸다.
나아가, 본 발명의 아스타잔틴 함유 나노 리포좀은 선택적으로 지방산을 추가로 포함함에 따라 열 및 일광 노출에 대한 안정성이 극대화될 수 있으며, 고온 및 일광의 가혹 조건 하에서 보관되어 나노 리포좀 내의 높은 아스타잔틴 함량이 유지될 수 있다.
특히, 본 발명의 나노 리포좀이 포화지방산과 불포화지방산을 동시에 포함하는 경우, 각각 trans-아스타잔틴 및 cis-아스타잔틴을 안정화시켜, 고온 및 상호이성질화 반응이 쉽게 나타날 수 있는 아스타잔틴의 일광의 가혹 조건 하에서의 전체 함량이 높게 유지될 수 있다.
또한, 본 발명의 아스타잔틴 함유 나노 리포좀은 높은 경피 투과율을 나타내며, 특히 음이온계면활성제 및 지방산의 추가 함유에 의해 현저한 경피 투과율 상승을 나타낼 수 있다.
본 발명의 아스타잔틴 함유 나노 리포좀은 유효성분으로 아스타잔틴을 가져 항산화 및 항염 용도로 경피에 적용될 수 있다. 특히, 지방산이 추가로 첨가된 나노 리포좀은 상승된 염증개선 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 나노 리포좀의 모식도이다.
도 2는 시료 1 및 2의 고온 보관 후 시료의 색 변화를 나타낸 도이다.
도 3은 시료 1 및 2의 일광 노출 후 시료의 색 변화를 나타낸 도이다.
도 4 및 도 5는 HPLC 분석을 위한 지표물질 Area 와 검량선을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 나노 리포좀에 대한 HPLC 정량 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 나노 리포좀의 입도 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8 및 도 9는 인공피부 투과 실험에 있어 멤브레인 및 Reservoir에 존재하는 액체의 HPLC 정량 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 Astaxanthin과 Oleic acid 각각의 NO 생성 억제 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 Astaxanthin과 Oleic acid를 혼합한 실험군의 NO 생성 억제 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 12 및 13은 Astaxanthin과 Oleic acid의 혼합 시료가 전염증성 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α 각각의 발현에 미치는 영향을 Western blot을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 리포좀 현탁액의 제조
유효성분인 아스타잔틴을 포함하는 리포좀 현탁액 시료 1 내지 시료 5를 다음의 과정을 통해 제조하였다.
1) 수상의 제조
수상을 하기의 표 1의 조성으로 혼합한 후 80℃로 가온하여10분간 교반한 후 (3,000rpm) 냉각하였다.
2) 유상의 제조
유상을 하기의 표 1의 조성으로 혼합한 후 실온에서 10분간 교반하였다(3,000rpm).
3) 수상과 유상의 혼합
상기 수상과 상기 유상을 혼합하여 20분간 교반하였다.
4) 리포좀 현탁액의 제조
상기 혼합액을 Microfluidizer (MF)를 이용하여 1000bar에서 3회 순환하여 나노 리포좀 현탁액을 얻었다.
5) 방부제 처리
이후 표 1에 기재된 방부제를 첨가한 후 10분간 교반하였다(500rpm).
시료 1 시료 2 시료 3 시료 4 시료 5
DI water 수상 42.47 40.47 40.07 40.07 39.67
EDTA-2NA 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03
Hydrogenated Phospatidylcholine 2 2 2 2 2
Potassium Cetyl Phosphate 0 2 2 2 2
Lauric acid 0 0 0.2 0 0.2
Stearic Acid 0 0 0.1 0 0.1
Oleic acid 0 0 0 0.2 0.2
Linolenic acid 0 0 0 0.1 0.1
Arginine 0 0 0.1 0.1 0.2
Ethanol 유상 10 10 10 10 10
Glycerin 40 40 40 40 40
MCT Oil 4 4 4 4 4
Astaxanthin 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
SHD-62(1,2-Hexanediol) 방부제 1 1 1 1 1
Total 100 100 100 100 100
실험예 1. 온도 변화에 따른 안정성 평가
실험방법
시료 1 및 시료 2를 121℃의 온도 가혹조건하에서 15분간 보관하였다. 보관 후 시료의 사진을 도 2에 도시하였다. 비교 군으로서 시료 1의 실온 보관 후의 사진도 함께 나타냈다.
성상 분석 결과
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음이온성 계면활성제가 인지질층에 봉입되지 않은 시료 1은 121℃가혹 조건 하에서 아스타잔틴이 분해되어 붉은 색이 현저히 옅어진 것을 확인할 수 있었다. 반면, 음이온성 계면활성제 및 아스타잔틴이 함께 인지질층에 봉입된 시료 2는 121℃의 가혹 조건 하에서도 아스타잔틴이 분해되지 않아 붉은 색이 유지됨을 확인할 수 있었다. 이는 음이온성 계면활성제의 활용에 따른 결과로 판단된다.
시료 3~5에 대해서도 121℃가혹 조건 하에서 실험하였으며, 본원에 데이터를 도시하지 않았지만 이 경우에도 아스타잔틴이 분해되지 않아 붉은색을 유지함을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 일광 노출에 따른 안정성 평가
실험방법
시료 1 및 시료 2를 일반 유리 용기에 보관하여 일광에 90일간 노출시켰다. 보관 중에 일정한 시간에 찍은 사진을 도 3에 나타내었다.
성상 분석 결과
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음이온성 계면활성제가 인지질층에 봉입되지 않은 시료 1은 일광 노출하에서 아스타잔틴이 쉽게 분해되어 붉은 색이 점차 옅어지는 것을 확인할 수 있었다. 시료 1은 90일 이후 거의 투명에 가까워졌다. 음이온성 계면활성제 및 아스타잔틴이 함께 인지질층에 봉입된 시료 2는 일광 노출하에서 아스타잔틴의 분해율이 낮아 붉은색이 유지됨을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 일광 노출에 따른 함량 평가
실험방법
시료 1 내지 5를 일반 유리 용기에 보관하여 일광에 90일간 노출시켰다. 보관 후 아스타잔틴의 함량을 측정하였다. 아스타잔틴과 관련된 논문(Anal Bioanal Chem.　2009 Nov;395(6):1613-22)에 공지된 HPLC분석 방법을 이용하여 sigma-aldrich사에서 구매한 지표물질(all-trans-Astaxanthin)과 비교한 결과, 아스타잔틴은 trans-astaxanthin, 15-cis-astaxanthin, 9-cis-astaxanthin, 13-cis-astaxanthin, astaxanthin ester 1(아스타잔틴 모노에스테르), 및 astaxanthin ester 2(아스타잔틴 디에스테르)의 6가지의 피크로 존재함을 확인할 수 있었다. 비교를 위해 차광하여 90일간 보관한 시료 1에 대한 결과도 함께 측정하였다.
HPLC분석방법
기기 : agilent Technologies 1260 infinity
Column : Eclipse plus C18 (5 μ, 4.6×250mm)
UV 파장 : 474 nm
HPLC 분석 결과
HPLC 분석 결과 지표물질 Area와 검량선을 도 4 및 도 5에 나타내었으며, HPLC 정량 분석하여 피크의 면적을 측정한 결과를 하기 표 2 및 도 6에 나타내었다.
50ppm
단위 (mAU*s)		 시료 1
[일광차단]		 시료 1 시료 2 시료 3 시료 4 시료 5
trans-Astaxanthin 145.7 139.8 71.0 161.5 94.6 137.05
15-cis-Astaxanthin 214.9 36.0 58.4 168.3 179.5 192.1
9-cis-Astaxanthin 885.3 160.7 248.6 698.8 746.2 773.7
13-cis-Astaxanthin 1008.3 209.9 278.4 819.8 861.8 910.8
Astaxanthin esters1 480.9 181.7 136.4 385.2 383.8 424.5
Astaxanthin esters2 1465.6 134.1 393.6 1130.3 1157.2 1259.75
Total 4200.7 862.2 1186.4 3363.9 3423.1 3697.9
시료 1을 90일간 일광 조건에 노출한 경우, 차광 보관한 것과 비교하여 아스타잔틴의 함량이 현저히 감소함을 알 수 있었다. 그러나 음이온계면활성제가 아스타잔틴과 함께 인지질층에 함께 봉입된 시료 2의 경우, 음이온계면활성제가 첨가되지 않은 시료 1과 비교하여 분해되지 않은 아스타잔틴의 함량이 30% 이상으로 나타남을 알 수 있었다.
한편, 음이온계면활성제 및 지방산이 아스타잔틴과 함께 인지질층에 봉입된 시료 3및 4의 경우, 음이온계면활성제가 첨가되지 않은 시료 1과 비교하여 분해되지 않은 아스타잔틴의 함량이 약 4배 가량으로 나타남을 알 수 있었다. 불포화지방산은 cis-astaxanthin을 포화지방산은 trans-astaxanthin을 안정화하는 경향이 있음을 알 수 있었다.
특히, 9-cis 이성질체가 가장 우수한 항산화 효과를 가지는 점을 감안하면, 불포화 지방산을 포함시키는 경우가 포화 지방산을 단독으로 포함시키는 경우보다 우수한 항산화 효과를 나타내는 제형으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
한편, 포화지방산과 불포화지방산을 함께 사용한 시료 5의 경우, HPLC 분석 에서 cis-astaxanthin 및 trans-astaxanthin의 함량이 높은 것으로 나타났다, 이는 불포화 지방산과 포화 지방산을 같이 사용하는 경우 cis-astaxanthin 및 trans-astaxanthin 을 전체적으로 안정화시켜, 불포화지방산 또는 포화지방산을 단독으로 첨가한 것과 비교하여 전체 함량이 증가됨을 알 수 있었다. 아스타잔틴은 상호 이성질화 반응이 쉽게 나타날 수 있으므로, 전체 함량이 가장 중요하다는 점을 고려하면, 불포화 지방산과 포화지방산을 동시에 함유하는 것이 보다 바람직하다.
실험예 4. 리포좀의 제타 전위 측정
제타전위는 매질과 분산된 입자에 부착된 고정 유체 층 사이의 전위차로 제타 전위는 콜로이드 분산물의 안정성을 나타내는 주요 지표로 활용된다. 제타 전위의 크기는 분산액에서 유사하게 하전 된 인접 입자 사이의 정전기 반발 정도를 나타낸다. 구체적으로, 제타전위에 따른 안정성은 표 3과 같이 표현될 수 있다.
제타 전위 [mV]
0 ~ ± 5 빠른 응고 또는 응집
± 10 ~ ± 30 초기 불안정성
± 30 ~ ± 40 중간정도의 안정성
± 40 ~ ± 60 우수한 안정성
± 61 탁월한 안정성
시료 5의 제타 전위를 측정한 결과를 표 4에 나타내었다.
Astaxanthin Liposome (광안정도 개선)
Time / s pH Temp / degC Potential (Signal) / mV Potential (ZP) / mV Conductivity / mS/cm
0.00 6.78 26.58 -4179.54 -144.38 0.10
5.00 6.78 26.58 -4235.16 -146.30 0.10
10.00 6.79 26.56 -4229.21 -146.10 0.10
15.00 6.79 26.58 -4286.25 -148.07 0.10
20.00 6.78 26.56 -4287.08 -148.10 0.10
25.00 6.79 26.56 -4301.17 -148.58 0.10
30.00 6.78 26.56 -4294.56 -148.35 0.10
35.00 6.78 26.55 -4303.23 -148.65 0.10
40.00 6.79 26.55 -4303.57 -148.67 0.10
45.00 6.78 26.55 -4320.99 -149.27 0.10
50.00 6.79 26.55 -4312.19 -148.96 0.10
55.00 6.78 26.55 -4315.96 -149.09 0.10
이상과 같이 본 발명에 따른 리포좀은 제타 전위값이 -144mV ~ -149mV로 측정되어, 매우 높은 분산 안정성을 갖는 것으로 나타났다. 이는 음이온성 계면활성제의 인지질층 봉입에 따라 높은 반발력을 갖게 된 결과로 판단된다.
실험예 5. 리포좀의 입도 분석
리포좀의 입도는 체내 약물 동태에 영향을 줄 수 있다. 즉, 입도가 너무 작을 경우 체내 소실 속도가 빨라 원하는 시간만큼의 약물 효능을 발휘할 수 없으며, 반대로 너무 클 경우 경피흡수율이 저해될 수 있다.
말번(Malvern)사의 입도 분석기 제타사이저 나노 ZS(Zetasizer Nano ZS)를 이용하여 시료 5의 입도를 분석하였다. 상기 입도 분석기는 나노입자의 브라운 운동을 수식으로 계산하여 입자 크기를 분석하는 바, 주사전자현미경 분석에 비하여 입자 크기가 큰 값으로 나타난다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
입도 분석 결과, 시료 5내의 평균 입자 크기(D50)은 약 187nm이며, D95는 305nm로 나타나 경피 흡수용도에 적절한 크기와 높은 균일성을 갖는 것으로 확인되었다.
실험예6. 리포좀 현탁액의 피부투과 시험
생체 외 피부 흡수 시험- 실험방법
본 발명의 리포좀 현탁액의 경피흡수율을 측정하기 위해, 생체 외 피부흡수시험 가이드라인(식품의약품안전처)을 따라 진행하였다. 생체 외 피부 흡수시험방법은 시험물질이 피부를 통과하는 것을 확인하는 것으로 피부 표면에 시험물질을 도포 혹은 적용하여 일정한 시간 이후 피부 안쪽 용액저장소에 이동한 양을 측정하는 방법으로, 인간 또는 다른 종의 다세포 동물의 피부, 또는 인공피부를 사용할 수 있다. 특히 인공 피부를 사용하는 경우 시험물질에 대하여 반복 측정이 가능하며 실험 동물을 사용하지 않고 노출 조건에 대한 연구가 가능하다. 생체 외 피부흡수시험은 물질의 조성에 따른 피부 흡수와 투과를 비교할 수 있어, 인체 내 피부흡수에 의한 위험성 평가 등에 유용한 모델로 사용할 수 있다.
본 실험예에서는, 밀리포아(미국)사의 경피흡수시험용 인공 Membrane Strat-M을 사용하여, Franz-Diffusion Cell and System (LOGAN사 미국)에 장착하여 실험하였다. Franz-Diffusion Cell은 비폐색(non-occluded) 조건으로 공여 챔버(donor chamber)를 파라 필름(para film)으로 밀봉하지 않은 상태로 유지하였다. 기타 조건은 표 5과 같이 조절하였다.
인공피부 Strat-M Membrane
피부 면적(Area of skin) 1.326665cm2
시료 용액의 양(Volume of sample solution) 0.5ml
수용체 매질(Receptor medium) PBS
수용체 매질의 양(Volume of Receptor medium) 5ml
온도(Temperature) 37 °C
교반속도(Stirbar speed) 500rpm
샘플링 분액(Sampling Aliquot) 1ml
샘플링 시간(Sampling time) 2h
각 시험물질을 용매와 혼합하여 공여 챔버에 로딩(loading)하고 일정 시간 이후에 멤브레인 및 Reservoir에 있는 액체를을 채취하여 아스타잔틴의 성분을 HPLC로 분석하여 시험물질의 피부 투과율을 확인하였다. 또한, 피부에 남아 있는 잔존량을 측정하였다. 계산이 불가능하도록 지속적으로 노출시킨 경우 투과 상수 (permeability constant, Kp)를 이용하여 흡수율을 계산하였다.
시료의 준비
상기 제조예 1의 공정에 따라, 시료 1, 2, 및 5를 준비하였다. 또한, 대조군으로 음이온성계면활성제 및 지방산을 사용하지 않은 대조군을 하기 표 6의 조성으로 제조하였다.
대조군
DI water 수상 48.47
EDTA-2NA 0.03
Hydrogenated Phospatidylcholine 0
Potassium Cetyl Phosphate 0
Lauric acid 0
Oleic acid 0
Arginine 0
Ethanol 유상 10
Glycerin 40
MCT Oil 0
Astaxanthin 0.50
SHD-62(1,2-Hexanediol) 방부제 1
Total 100
실험결과: 음이온성계면활성제 사용에 의한 경피흡수 개선 여부
전술한 실험 방법에 따라 2,500ppm의 농도로 대조군, 시료 1, 2, 및 5를 상기 인공피부에 처리하여, 2시간 이후에 피부 투과 정도를 측정하였다. 즉, 대조군, 시료 1, 2, 및 5의 경피투과후 멤브레인 및 Reservoir에 존재하는 용액에 대한 HPLC 분석 결과를 도 8 및 도 9에 각각 나타내었다. 처리 후 멤브레인 및 Reservoir에 존재하는 아스타잔틴 농도의 상대값 mAU*S을 표 7에 나타내었다.
(mAU*s) 　 Trans 15cis 9cis 13cis ester1 ester2 Total %
대조군 4.6 0 4.2 4.8 0 4.6 18.2 100
시료 1 18.6 6.2 26.3 32.9 25.6 21.5 131.1 720.3297
시료 2 36.9 41.9 182.4 186.7 83.2 234.9 766 4208.791
시료 5 46.6 38.1 168.7 173.3 72.1 197.8 696.6 3827.473
HPLC분석결과 대조군 대비 시료 1에서 7배 높은 흡수율을 보였고 시료2 및 5에서 각각42, 38배의 흡수율을 보였다. 아스타잔틴은 일반 리포좀 제형으로 처리하는 것만으로도 경피 투과를 개선하는 효과가 있으며, 음이온계면활성제 및 지방산의 첨가에 따라 일반 리포좀 제형과 비교하여 현저히 우수하게 경피 투과를 개선하는 효과가 있음을 확인하였다.
관련하여, 대표적인 음이온 계면활성제인 소듐 라우릴 설페이트(Sodium Lauryl sulfate)는 EWG (Environmental Working group) 그린 등급이나 유해성 논란이 있어 사용이 기피되고 있는 실정이며, 상기 실험예에서는 안전하며 친환경적인 음이온 계면활성제인 포타슘 세틸 포스페이트를 사용하더라도 높은 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 7. 아스타잔틴 및 지방산의 복합 제형의 항산화 및 항염 활성검토
전술한 실험예들을 통해 본 발명자들은 아스타잔틴의 안정성을 극대화할 수 있는 지방산이 사용된 제형을 도출하게 되었다. Oleic acid과 같은 지방산은 NO에 의한 항산화 반응으로 염증 개선 효과가 있다고 알려져 있다(48 (2010) 4499-505, Free Radical Biology & Medicine). 본원에서는 지방산의 병용투여가 아스타잔틴의 항산화 및 항염 작용에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
실험예 7.1 NO 어세이
실험방법
RAW 264.7 세포주를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48-well plate에 4.0×105 cells/ml의 농도로 각 well에 500 μl씩 분주하여 37 ℃, 5%, CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 Astaxanthin을 1, 3, 5, 7 및 10uM의 농도로 처리하여 1시간 동안 배양한 후, LPS를 0.1 μg/ml 의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 상등액을 100 μl씩 취해 새로운 96-well plate에 넣은 후 Nitric Oxide Detection kit(Intron Biotechnology, south Korea)의 N1 buffer를 50 μl 첨가하고 10분간 상온에서 incubation 한 후, 다시 N2 buffer를 넣고 10분간 상온방치 한 뒤에 ELISA reader (Synergy HTX Multi-Mode Reader, Bio-tex, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 표준품으로 Nitrite standard를 사용하여 표준 용량곡선을 작성하고 질소산화물(nitrite, NO2-)의 생성을 산출하였다. Oleic acid는 100, 200, 300, 400, 500uM의 농도로 처리하고 1시간 동안 배양한 후, LPS 0.1 ug/ml의 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 이 후 과정은 Astaxanthin의 효능 검사 방법과 동일하게 진행하였다.
또한 Astaxanthin과 Oleic acid를 혼합하였을 때의 항염 효능을 확인하기 위하여 Astaxanthin 3uM과 5uM, Oleic acid 300uM을 각각 혼합하여 동일한 효능 검사 방법으로 진행하였다.
실험결과
활성산소의 일종으로 최근 염증유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO는 높은 반응성을 가진 생체 생성분자로서, NOS (Nitric oxide synthase)에 의해 L-arginine으로부터 생성된다. 염증반응에 관여하는 핵심적인 분자인 NO는 염증매개물로써 염증반응을 가속화시켜 생체의 질환을 더욱 악화시킨다. LPS 자극에 의한 RAW 264.7 세포주의 NO 생성 증가 기전에 미치는 Astaxanthin과 Oleic acid의 작용을 확인하기 위하여 NO assay를 실시하였다.
Astaxanthin과 Oleic acid 각각의 NO 생성 억제 실험 결과를 도 10에 나타내었다. Astaxanthin과 Oleic acid를 각각 처리한 실험군에서는 각각 농도 의존적으로 NO 생성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었고 LPS를 처리한 군과 비교시 유의한 감소를 확인할 수 있었다. 또한 Astaxanthin과 Oleic acid를 혼합한 실험군의 NO 생성 억제에 대한 측정결과를 도 11에 나타내었다. Astaxanthin 단독 처리군에 비해 더 뛰어난 NO 생성 억제능을 보이지는 않았지만 항염 효능에 대한 기능이 유지됨을 알 수 있었다.
실험예 7.2 전염증성 cytokines(IL-1βTNF-α) 생성 억제
실험방법
전염증성 cytokines의 생성 변화를 확인하기 위하여 western blot 실험법을 통해 단백질 수준에서의 변화를 확인하였다. RAW 264.7 세포주를 10% FBS를 포함한 DMEM 에 현탁시킨 후 60mm cell culture dishes에 1.5×106 cells/ml 의 세포수가 되도록 3 ml씩 분주하여 37 ℃ 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 Astaxanthin, Oleic acid, 그리고 Astaxanthin과 Oleic acid를 혼합한 시료를 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후 LPS(0.1 μg/ml)를 처리하고 24시간 배양하였다. 이후 세포의 배지를 제거하고 Cold PBS로 세척한 후 단백질 추출 buffer인 RIPA buffer(Intron Biotechnology, south Korea)에 proteinase inhibitor(Intron Biotechnology, south Korea)를 1/100 넣어 사용하여 단백질을 추출하였다. 추출은 RIPA buffer로 30분간 lysis시킨 후 원심분리(13,000rpm, 30min, 4℃)하여 단백질 상층액을 분리하였다. 단백질의 농도는 bovine serum albumin(BSA)을 기준으로 Bio-Rad protein assay reagent를 사용하여 정량 하였다. 정량한 단백질을 10% polyacrylamide gel에 전기영동하고 iBlot2 transfer machine(Invitrogen by thermo fisher scientific)을 사용하여 transfer를 진행하였다.
Transfer가 된 membrane을 5% 탈지분유를 포함한 1X TBS with Tween20(Intron Biotechnology)에 넣고 상온에서 1시간 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 IL-1β antibody (1:500, ABBKINE, USA), TNF-α antibody (1:1,000, ABBKINE, USA), β-actin antibody(1:1,000, ABBKINE, USA)를 이용하여 4℃에서 하루밤 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 1X TBS with Tween20(Intron Biotechnology) 용액으로 3회 세척 후 horseradish peroxidase (HRP) 결합 2차 항체 (anti-Rabbit IgG, ABBKINE, anti-mouse IgG, Thermo fisher scientific)를 1: 2,000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응한 뒤 1X TBS with Tween20(Intron Biotechnology) 용액으로 3회 세척하였다. 단백질은 Enhanced Chemiluminescence (ECL) 방법을 이용해 iBright FL1000(Invitrogen by thermos fisher scientific)에서 결과를 확인하였다.
실험결과
염증 반응 동안 TNF-α 분비와 합성은 증가하며 IL-1β나 IL-6 등의 전염증성 사이토카인 생성에 주도적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. RAW264.7 세포에서 Astaxanthin, Oleic acid, 그리고 Astaxanthin과 Oleic acid의 혼합 시료가 전염증성 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α의 발현에 미치는 영향을 Western blot을 이용하여 측정하여, 그 결과를 각각 도 12 및 도 13에 나타내었다.
RAW264.7 세포에 LPS(0.1 μg/mL)를 처리한 군에서는 세포만 배양한 대조군에 비해 IL-1β은 약 70%, TNF-α는 약 40% 정도 발현량이 증가한 것을 확인하였고 Astaxanthin 25uM 처리군에서는 IL-1β과 TNF-α모두에서 LPS 단독처리군 대비 약 10%의 발현량 감소를 보였다. Oleic acid의 경우 150uM의 농도로 진행하였고 TNF-α에서 약 20%의 발현량 감소를 확인하였다. 또한 Astaxanthin과 Oleic acid를 혼합한 시료에서는 TNF-α, IL-1β 모두 약 20 - 25%의 생성 억제 활성을 확인하였다. 이 결과를 통해 염증반응 시 나타나는 사이토카인에 의한 세포독성이 Astaxanthin과 Oleic acid에 의해 억제되고 있고 두 시료를 혼합하였을 때 더 큰 사이토카인 발현량 억제를 통해 더 큰 항염 효능이 있음을 시사하고 있다.
종합적으로, 아스타잔틴 및 지방산은 NO로 인한 항산화 기반 염증 반응에는 상승적인 효과를 보이진 않더라도, 전염증성 사이토카인 (IL-1β, TNF-α)의 발현 조절 기반한 염증 개선에 상승적인 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 따라서, 지방산이 첨가된 본 발명의 아스타잔틴 함유 나노리포좀 제형은 상승된 염증개선 효과를 가진다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 아스타잔틴(astaxanthin), 지방산, 및 음이온성 계면활성제가 인지질 이중층 내에 봉입된 것인, 안정성이 향상된 아스타잔틴 함유 나노 리포좀으로서,
    상기 지방산은 C10-20 불포화 지방산 및 C10-20 포화 지방산의 혼합물이며, 상기 포화지방산 및 불포화지방산을 아스타잔틴 1 중량부를 기준으로 각각 0.2 내지 1.0 중량부 포함되는 것이고,
    상기 음이온성 계면활성제는 C10-20알킬 포스페이트 또는 C10-20알킬 설페이트인 것인, 나노 리포좀.
  2. 제1항에 있어서, 음이온성 계면활성제는 아스타잔틴 1 중량부를 기준으로 1 내지 10 중량부 포함된 것인, 나노 리포좀.
  3. 제1항에 있어서, 인지질 이중층은 아스타잔틴 1 중량부를 기준으로 1 내지 10 중량부 포함된 것인, 나노 리포좀.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양이온성 아미노산이 추가로 상기 인지질 이중층 내에 봉입된 것인, 나노 리포좀.
  9. 제1항에 있어서,
    본원의 나노 리포좀은 (a) 인지질, 지방산, 및 음이온성 계면활성제를 포함하는 수상 및 (b) 아스타잔틴 및 오일을 포함하는 유상을 혼합하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 수득되는 것인, 나노 리포좀.
  10. 제1항 내지 제3항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 나노 리포좀을 포함하는 염증 개선용 화장료 조성물.
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