KR102191695B1 - 전이 억제제 - Google Patents

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바이오마크 파마슈티칼스 리미티드
노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티
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Abstract

본 발명은 암을 치료 또는 예방하는 방법 및 화합물에 관한 것이다. 상기 방법 및 화합물은 암의 발생, 유지, 증식을 억제 또는 저해와, 암세포 전이의 억제를 포함한다.

Description

전이 억제제{Inhibitors of Metastasis}
관련출원의 상호참조
본 출원은 전문이 참고문헌으로 본 명세서에 포함된, 2013년 4월 5일자 미합중국 가특허출원 제 61/808,966호를 우선권으로 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 항체, 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 및 펩티드를 포함하는 조성물 및 제제, 및 전이성 암의 예방 및 치료, 특히 암세포의 증식, 전이 및/또는 혈관신생의 감소, 차단, 또는 억제를 위한 이들의 이용방법에 관한 것이다.
전자적으로 제출한 텍스트의 설명
전자적으로 제출한 텍스트의 내용은 전문이 참고문헌으로 본 명세서에 포함되었다: 서열목록의 컴퓨터 해독가능본(filename: BMRK_006_01WO_SubSeqList_ST25.txt, date recorded: May 12, 2014, file size 58 kilobytes).
MARCKS 단백질(미리스토일화 알라닌-풍부 C-키나제 기질, Myristoylated Alanine-Rich C-Kinase Substrate)은 단백질 키나제 C(PKC)의 아주 흔한 인산화 표적이다(참조: Li et al ., Journal of Biological Chemistry 276; 40982 (2002)). MARCKS는 다음과 같은 3개의 발생학적으로 보존된 영역을 가진다(참조: Aderem et al., Nature 1988; 332:362-364; Thelen et al., Nature 1991; 351:320-322; Hartwig et al., Nature 1992; 356:618-622; Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271:18797-18802): N-말단, 인산화 부위 영역(phosphorylation site domain, PSD; 효과기 영역(effector domain)으로도 알려짐), 다중 상동성 2 영역(multiple homology 2 (MH2) domain). 상기 N-말단, N-말단 글리신 잔기에 아미드 결합으로 연결된 미리스틴산을 가지는 24개의 아미노산 잔기를 포함하는 알파-아미노산 서열은 세포막(참조: Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271:18797-18802), 및 경우에 따라서 칼모듈린(calmodulin)(Matsubara et al., J Biol Chem 2003; 278:48898-48902)에 MARCKS의 결합에 관여한다. 이 24개 아미노산 서열은 MANS 펩티드로 알려져 있다. MANS 펩티드 및 관련 펩티드는 미합중국 특허 제7,265,088호; 제7,529,926호; 제7,544,772호; 제8,492,518호; 제8,501,911호; 제7,918,293,870호; 및 제8,563,689호에 개시되어 있으며; 이들의 전문은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
당업계에서는 암세포의 전이, 암세포의 증식, 종양의 성장, 및/또는 혈관신생의 억제를 포함하는, 암을 예방하고, 치료하고 억제하는, 새롭고, 안전한 치료방법의 필요성이 대두되었다. 본 발명은 이들과 다른 필요성에 관한 것이다.
본 발명은 암을 예방 또는 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암세포의 전이, 암세포의 증식, 종양의 성장 또는 혈관신생을 억제하는 방법 및 조성물이 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 미리스토일화 알라닌-풍부 C-키나제 기질(MARCKS, Myristoylated Alanine-Rich C-Kinase Substrate)의 억제를 포함하는, 암세포의 전이, 암세포의 증식, 종양의 성장 또는 혈관신생을 억제하는 방법 및 조성물이 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 조성물은 펩티드, 폴리펩티드, 항체 또는 이들의 단편, 및 안티센스 폴리뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 및 숏-헤어핀 RNA(shRNA) 등 핵산분자와 같은 MARCKS-억제 화합물을 포함한다. 본 명세서에 기술된 "MARCKS-억제 핵산분자(MARCKS-inhibitory nucleic acid molecule)"는 MARCKS의 발현 및/또는 기능을 감쇄시키는 폴리뉴클레오티드 또는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 일컫는다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 조성물은 하나 또는 그 이상의 MARCKS-관련 펩티드를 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 MARCKS-관련 펩티드는 MARCKS의 MH2 영역에 상응한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 미리스토일화 N-말단 서열(MARCKS의 24개 아미노산 단편인 MANS 펩티드)-관련 펩티드(즉, "MANS-관련 펩티드")이다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 MANS 펩티드(MANS peptide); 4개 또는 그 이상의 아미노산을 가지고 MANS 펩티드에서 N-말단 아미노산 서열에서 발견되는 것과 같은 서열을 포함하는 MANS의 비치환 단편(unsubstituted fragment); MANS 펩티드 또는 MANS 펩티드 단편에서 발견되는 서열과 대체적으로 동일한 서열을 포함하는 펩티드(peptide); 예를 들면, 아세틸기와 N-말단 미리스토일화 또는 N-말단 아실화되는 MANS 펩티드와 동일하거나 대체적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 MANS 펩티드(MANS peptide) 또는 MANS 펩티드 단편(MANS peptide fragment); C-말단이 화학적으로 변형된 MANS 펩티드와 동일하거나 대체적으로 동일한 MANS 펩티드(MANS peptide) 또는 MANS 펩티드 단편(MANS peptide fragment)이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 명세서에 개시된 MARCKS-억제 화합물은 항체 또는 항체의 단편이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 항체 또는 항체의 단편은 MARCKS 단백질의 기능을 억제한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 항체 또는 항체의 단편은 MARCKS 단백질의 N-말단 또는 MARCKS 단백질의 MH2 서열에 결합한다. 놀라웁게도, 본 발명자들은 여러가지 형태의 MARCKS-억제 화합물이 실험실 조건에서 암세포의 이동을 억제하고 생체 조건에서 전이를 억제하는 효과를 발견하였다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 공격적인 암 세포주들의 이동(migration)을 억제한다. 본 명세서에 개시된 MARCKS-억제 화합물은 포유동물의 종양에서 암세포들의 전이를 억제한다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 종양은 고형(solid)이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 종양은 비-고형(non-solid)이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 명세서에 개시된 MARCKS-억제 화합물은 림프종(lymphoma) 또는 백혈병(leukemia)과 연관된 암세포의 전이를 억제한다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 MARCKS-억제 폴리뉴클레오티드 또는 MARCKS-억제 핵산분자를 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 MARCKS의 발현 및/또는 기능을 감쇄시키는 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, 또는 miRNA 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 단백질 유사체 또는 MARCKS의 발현을 조절하는 miR21의 유사체(mimic)와 같은 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 MARCKS-관련 또는 MANS-관련 펩티드이다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드는 MARCKS의 N-말단 미리스토일화 영역에 상응한다. 따라서, 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 MANS-관련 펩티드이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드 및 화학적으로 변형된 MANS-관련 펩티드는 공격적인 암 세포주의 이동을 차단한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 암세포의 전이를 억제하는데 사용한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 생체 조건에서 암세포의 전이를 억제하는 효과를 나타낸다. 전이성 질환(metastatic disease)의 생체내에서 억제 지점은 폐 조직, 심장 조직, 장 조직(intestine tissue), 및 횡경막 조직 등을 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 암세포 전이, 암세포 증식, 종양 세포 성장, 또는 혈관신생을 치료 및 예방하는데 사용한다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암세포, 또는 암세포의 발생, 유지, 증식, 또는 전이에 역할을 하는 다른 세포에 MARCKS-억제 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료 또는 예방하는 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암세포에 전이-억제량의 MARCKS-억제 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암세포에 전이-억제량의 MANS-관련 펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암세포에 전이-억제량의 서열번호 1 내지 서열번호 231(inclusive), 서열번호 234, 및 서열번호 235로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고, 상기 펩티드 서열의 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산이 선택적으로 화학적 변형이 이루어진 펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 종양에서의 암세포의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암세포에 전이-억제량의 MANS-관련 펩티드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 서열번호 1 내지 서열번호 231(inclusive), 서열번호 234, 및 서열번호 235로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고, 상기 펩티드 서열의 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산이 선택적으로 화학적 변형이 이루어진 펩티드의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면,
상기 펩티드의 N-말단 아미노산이,
＊직쇄형(linear), 분지형(branched), 포화 또는 불포화 C2(아세틸)~C24 지방족 카복실산의 아미드,
＊트리플루오르아세트산의 아미드,
＊벤조산의 아미드, 또는
＊C1~C24 지방족 알킬술폰산의 아미드 형태로 아실화(acylation)에 의해 화학적으로 변형되거나; 또는,
상기 펩티드의 N-말단 아미노산의 N-말단 아민기가,
＊C1~C24 지방족 알킬기,
＊직쇄형 2-(C1~C24 지방족 알킬)옥시에틸기, 또는
＊오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸기(n은 0 내지 10)로 알킬화(alkylation)됨으로써 화학적으로 변형된다.
본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 N-말단 아미드는 아세틸 또는 미리스토일기이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면,
상기 펩티드의 C-말단 아미노산이,
＊암모니아의 아미드,
＊C1~C24 지방족 알킬 아민의 아미드,
＊히드록실-치환된 C2~C24 지방족 알킬아민의 아미드,
＊직쇄형 2-(C1~C24 지방족 알킬)옥시에틸아민기의 아미드, 또는
＊오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸아민기(n은 0 내지 10)의 아미드 형태로 상기 펩티드 C-말단 아미노산의 C-말단 카복실산기에 아미드를 형성함으로써 화학적으로 변형된다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암세포, 또는 개체에 각각 MANS-관련 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 암세포의 전이를 억제하거나 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (서열번호 1); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (서열번호 2); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (서열번호 4); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (서열번호 7); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (서열번호 11); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (서열번호 16); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERP (서열번호 22); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAER (서열번호 29); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAE (서열번호 37); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAA (서열번호 46); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAA (서열번호 56); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEA (서열번호 67); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGE (서열번호 79); N-미리스토일-GAQFSKTAAKG (서열번호 92); N-미리스토일-GAQFSKTAAK (서열번호 106); N-미리스토일-GAQFSKTAA (서열번호 121); N-미리스토일-GAQFSKTA (서열번호 137); N-미리스토일-GAQFSKT (서열번호 154); N-미리스토일-GAQFSK (서열번호 172), N-미리스토일-GAQFS (서열번호 191), N-미리스토일-GAQF (서열번호 211), N-아세틸-RGAQFSKTAAK (서열번호 234), N-아세틸-RGAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 234), N-아세틸-RAKGE (서열번호 235), 및 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 N-아세틸-GAQFSKTAAK (서열번호 106; BIO-11006), N-미리스토일-AKGE (서열번호 219; BIO-91200), N-미리스토일-GAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 106; BIO-11002), N-미리스토일-GAQFSKTAAK (서열번호 106; BIO-11000), N-아세틸-GAQFSKTAA (서열번호 121; BIO-10901), N-미리스토일-GAQFSKTAAK (서열번호 121; BIO-10900), 및 N-아세틸-GAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 106; BIO-11026)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 일부 아미노산은 d-구조(configuration)로 존재한다. 예를 들면, 상기 펩티드는 N-아세틸-GAQFS(d)KTAA(d)K (서열번호 106; BIO-11037)(6번 및 10번 위치의 라이신(K)은 d-구조이다).
본 발명의 일부 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 치료적 응용에 적절한 특성, 예를 들어, 암의 치료와 같은 특성을 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 실시태양에 따르면, 본 명세서에 개시된 일부 MANS-관련 펩티드는 MANS 펩티드 또는 MANS-관련 펩티드 외의 다른 펩티드에 비하여 증대된 용해도(solubility)를 나타낸다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 본 명세서에 개시된 일부 MANS-관련 펩티드는 MANS 펩티드 또는 MANS-관련 펩티드외의 다른 펩티드에 비하여 혈장(plasma)에서 보다 긴 반감기(half-lives)를 나타낸다.
본 발명의 일부 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드는 암세포의 이동을 감소시킨다. 예를 들면, 본 발명의 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드(예를 들면, BIO-11006, BIO-11002, BIO-10901, BIO-10900, BIO-11000 또는 BIO-91200)는, 세포를 10uM 내지 200uM의 펩티드로 전처리하거나; 20uM 내지 200uM의 펩티드로 전처리하거나; 25uM 내지 75uM의 펩티드로 전처리함으로써, 암세포의 이동을 감소시킨다. 본 발명의 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드는 약 1uM 내지 500uM, 약 5uM 내지 250uM, 약 10uM 내지 200uM의 농도로 투여함으로써, 암세포의 이동을 감소시킨다. 본 발명의 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드는 약 1uM, 약 5uM, 약 10uM, 약 25uM, 약 50uM, 약 100uM, 약 150uM, 약 200uM, 또는 약 500uM의 농도로 투여함으로써, 암세포의 이동을 감소시킨다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 펩티드의 효과를 측정하기 위하여 암세포를 실험실 조건에서 펩티드로 처리한다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 암세포는 환자로부터 유래한다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 환자가 펩티드 처리에 반응할 것인가를 측정하기 위하여, 암세포를 실험실 조건에서 펩티드로 처리한다.
본 발명의 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드를 약 0.01mg/kg/day 내지 약 10mg/kg/day의 용량으로 환자에게 투여함으로써, 암세포의 이동을 감소시킨다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드는 약 0.1mg/kg/day 내지 약 5.0mg/kg/day의 용량으로 환자에게 투여함으로써, 암세포의 이동을 감소시킨다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드는 약 0.5mg/kg/day 내지 약 2.5mg/kg/day의 용량으로 환자에게 투여함으로써, 암세포의 전이를 억제시킨다. 예를 들면, MARCKS-관련 펩티드는 약 0.01, 약 0.05, 약 0.1, 약 0.5, 약 0.75, 약 1.0, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2.0, 약 2.25, 약 2.5, 약 2.75, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 5.0, 약 6.0, 약 7.0, 약 8.0, 약 9.0, 약 10.0mg/kg/day 또는 그 이상의 용량으로 환자에게 투여함으로써, 암세포의 이동을 감소시킨다.
본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 펩티드의 용액 또는 현탁액의 흡입(inhalation), 또는 건조분말 제제의 흡입에 의해 투여된다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 펩티드의 액상 제제 또는 현탁액으로 주사된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 주사는 암세포를 포함하는 1차 종양 부위(primary tumor region)로 투여된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 암세포는 포유동물의 종양에 존재한다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 종양은 고형이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 종양은 비-고형이다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 본 명세서에 개시된 MARCKS-억제 화합물은 림프종(lymphoma) 또는 백혈병(leukemia)과 연관된 암세포의 전이를 억제한다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 액상 제제는 등장성(isotonic)이다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 액상 제제는 완충액이다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 펩티드의 전이-억제량은 ml 당 약 0.1 내지 약 100uM의 범주이다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 펩티드의 전이-억제량은 ml 당 약 1 내지 약 10uM의 범주이다. 상기 펩티드은 암 치료에 유용한 추가적인 약물을 포함하는 조성물 형태나, 또는 투여를 위해 추가적인 약물과 함께 제제화된다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 포유동물에 MARCKS-억제 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에 있어서 암세포의 전이를 치료 및 예방하는 방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 MARCKS의 발현 또는 활성을 감소시키는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산분자이다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, 또는 miRNA이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 폴리뉴클레오티드는 약 10nM 내지 10uM, 또는 약 20nM 내지 약 500nM, 또는 약 30nM 내지 약 300nM, 또는 약 40nM 내지 약 200nM, 또는 약 50nM 내지 약 100nM의 양으로 투여된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 MARCKS의 발현을 조절하는 miR21의 유사체이다. 예를 들면, 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 폴리뉴클레오티드는 miR21의 유사체이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드와 핵산분자는 펩티드, 단백질, 지질, 스테롤, 고분자, 전이제(transfection reagent)와 같은 전달제(delivery agent), 또는 당업계에 주지된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산분자 전달제와 함께 투여된다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 비-소형-세포 폐암종(non-small-cell lung carcinoma, NSCLC) 세포를 전처리하고, 포유동물에 MANS-관련 펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 암을 치료 또는 예방하거나, 포유동물 암세포의 전이를 억제하는 방법이 제공되는데, 상기 펩티드는 최소 약 1.5, 최소 약 1.6, 최소 약 1.7, 최소 약 1.8, 최소 약 1.9, 최소 약 2.0, 최소 약 2.1, 최소 약 2.2, 최소 약 2.3, 최소 약 2.4, 최소 약 2.5, 최소 약 2.6, 최소 약 2.7, 최소 약 2.8, 최소 약 2.9, 최소 약 3.0, 또는 그 이상의 유주지수(migration index)를 나타낸다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 상기 펩티드의 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 또는 200umolar의 농도로 존재한다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 이동기간(migration period)은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 NSCLC 세포를 50umolar의 농도 및 약 12시간의 이동기간(migration period)으로 전처리하면, 최소 약 1.5의 유주지수(migration index)를 나타낸다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 NSCLC 세포를 100umolar의 농도 및 약 12시간의 이동기간으로 전처리하면, 최소 약 2.0의 유주지수를 나타낸다.
본 발명의 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드는 약 0.01mg/kg/day 내지 약 10mg/kg/day의 용량으로 환자에게 투여함으로써, 암전이를 포함하는 암의 치료 및 예방하는 방법이 제공된다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드는 약 0.1mg/kg/day 내지 약 5.0mg/kg/day의 용량으로 투여된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드는 약 0.5mg/kg/day 내지 약 2.5mg/kg/day의 용량으로 투여된다. 예를 들면, MARCKS-관련 펩티드는 암을 치료 및 예방하기 위하여, 약 0.01, 약 0.05, 약 0.1, 약 0.5, 약 0.75, 약 1.0, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2.0, 약 2.25, 약 2.5, 약 2.75, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 5.0, 약 6.0, 약 7.0, 약 8.0, 약 9.0, 약 10.0mg/kg/day 또는 그 이상의 용량으로 투여된다.
미리스토일화 알라닌-풍부 C-키나제 기질(MARCKS) 단백질은 여러가지 세포의 활동과 연관되어 있다. 예를 들면, MARCKS 단백질은 세포 분비(secretion), 탈과립(degranulation), 이동(migration) 및 유전자 발현(expression)에 총체적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 연구결과는 세포를 자극하기 이전에 MANS 펩티드로 전처리하는 경우, 서로 다른 세포의 활동에 영향을 주는 MARCKS 단백질(즉, MANS 펩티드)의 미리스토일화 N-말단 서열과 동일한 펩티드의 능력에 기반한다. 이 모든 경우에 미스센스 대조구 펩티드(missense control peptide, MANS 펩티드 아미노산의 임의적 아미노산 서열로 구성되며, 본 명세서에서는 "RNS 펩티드"로 일컫는다)는 MANS 펩티드에 의해 발휘되는 활성과 비교하면 효과가 없었다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 조성물은 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 또는 이들의 단편, 및 폴리뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 및 숏-헤어핀 RNA(shRNA)와 같은 핵산분자를 포함하는 MARCKS-억제 화합물을 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 조성물은 하나 또는 그 이상의 미리스토일화 알라닌-풍부 C-키나제 기질(MARCKS)-관련 펩티드를 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, MARCKS-관련 펩티드는 MARCKS 단백질의 MH2 영역에 상응한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 상기 조성물은 MARCKS 단백질의 N-말단 서열에 상응하는 펩티드를 포함하는 MARCKS-억제 펩티드를 포함한다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 발명에서 제공되는 MARCKS-억제 화합물은 항체이다. 본 명세서에서, "항체(antibody)"라는 용어는 최소한 하나의 항원-결합 영역을 가지는 결합 단백질을 의미하고, 단클론 항체, 다클론 항체, 및 항체의 단편, 및/또는 재조합 폴리펩티드, 융합 단백질, 및 면역접합체(immunoconjugate)와 같은 변이체를 포함한다. 상기 항체의 단편의 예로서는, 이에 한정되는 것은 아니나, Fab 단편, Fc 단편, Fv 단편, dAb 단편, 단리된 CDR 영역, F(ab')2, 두개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 이가 단편(bivalent fragment), 및 단일 사슬(single chain) Fv (scFv)을 포함한다. 당업자라면 상기 항체 또는 단편이, 이에 한정되는 것은 아니나, 마우스, 쥐, 토끼, 영장류(primate), 라마(llama) 및 사람을 포함하는 어떠한 종(species)으로부터도 생성될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 당업자라면 상기 항체 또는 단편이 키메라, 인간화 또는 완전 인간(fully human)일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암을 치료 또는 예방하는 조성물 및 방법이 제공된다. 본 명세서에 개시된 암을 치료 또는 예방하는 방법은, 이에 한정되는 것은 아니나, 전이(metastasis), 암세포의 증식(proliferation), 종양의 성장(growth), 또는 혈관신생(angiogenesis)을 포함하는 여러 측면에서의 암의 치료 또는 예방을 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암을 치료 또는 예방하는 조성물 및 방법이 제공되는데, 상기 방법은 암세포, 또는 예를 들면 상피세포와 같은 암세포의 발생, 유지, 증식, 또는 전이에 역할을 하는 다른 세포에 MARCKS-억제 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 암세포의 전이를 억제하는 조성물 및 방법이 제공되는데, 상기 방법은 MARCKS-억제 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MARCKS-억제 화합물은 MARCKS 또는 MARCKS 펩티드에 결합하는 MARCKS-억제 펩티드, 항체 또는 이들의 단편, 또는 MARCKS 단백질의 기능을 억제하는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 및 숏-헤어핀 RNA(shRNA)와 같은 핵산분자이다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 암세포의 전이를 억제하는 MANS-관련 펩티드이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암세포의 전이를 억제하는 MARCKS-억제 펩티드가 제공된다. 본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물을 이용하는 암의 치료방법이 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 방법은 암세포를 MARCKS-억제 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 암세포는 종양으로 존재한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 MARCKS-억제 펩티드는 MANS-관련 펩티드이다. 본 명세서에서, "MANS-관련 펩티드(MANS-realted peptide)"라는 용어는, MANS 펩티드 또는 MANS와 대체적으로 동일한 펩티드; MANS 펩티드에서 발견되는 최소 4개의 연속하는 아미노산을 포함하거나, 또는 MANS 펩티드에서 발견되는 최소 4개의 연속하는 아미노산을 포함하는 펩티드에 대체적으로 동일한 MANS 펩티드의 단편을 일컫는다. 따라서, MANS-관련 펩티드는 4 내지 24개의 아미노산 길이를 갖는다. 본 명세서에서, "대체적으로 동일한(substantially identical)"이라는 용어는, 두 펩티드 사이의 아미노산 서열 비교 또는 두 펩티드 절편(즉, 참조 아미노산의 서열의 절편) 사이의 아미노산 서열 비교에 있어서, 펩티드 또는 펩티드 절편의 아미노산 서열이 최소 75%의 서열 동일성, 최소 80%의 서열 동일성, 최소 90%의 서열 동일성, 최소 95%의 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다. 바람직하게는, 펩티드의 아미노산 서열은 MANS 펩티드 또는 MANS 펩티드 절편에 80%의 서열 동일성을 가진다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 MANS 펩티드에 동일하거나 대체로 동일한 4 내지 24개의 연속되는 아미노산을 포함할 수도 있고, 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 MANS 펩티드와 동일하거나 대체로 동일한 4 내지 24개의 연속하는 아미노산을 포함할 수 있고, MANS 펩티드에 존재하지 않는 예를 들면 알기닌과 같은 최소한 하나의 N-말단 아미노산을 포함할 수도 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 MARCKS-억제 펩티드는 화학적으로 변형된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 MARCKS-억제 펩티드는 N-말단 위치가 아실화되는 MANS-관련 펩티드이다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 MANS-관련 펩티드는 N-말단 위치가 아세틸기로 아실화된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 상기 MANS-관련 펩티드는 N-말단 위치가 미리스토일화된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 MANS-관련 펩티드는 C-말단 위치가 화학적으로 변형된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 상기 MANS-관련 펩티드는 C-말단 위치가 아민(예를 들면, 암모니아)과 아미드를 형성하여 화학적으로 변형된다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 MANS-관련 펩티드는 N-말단 및 C-말단 위치가 화학적으로 변형된다. 하기 표 1은 그들의 N-말단이 미리스토일화되나 C-말단은 비치환되는 본 발명의 펩티드를 개시한다. 일부 대조구 펩티드(RNS 펩티드)들이 표 1 및 표 2에 개시되어 있고, 미리스토일화된다. 하지만, RNS 펩티드는 본 발명의 범주에 있는 것으로 고려되지는 않는다.
N-말단이 미리스토일화되고 C-말단 위치가 화학적으로 변형된 본 발명의 MANS-관련 펩티드들
펩티드 번호 N- 미리스토일화 아미노산 서열 서열번호
펩티드 1 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 1 MANS
펩티드 2 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 2
펩티드 4 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 4
펩티드 7 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 7
펩티드 11 GAQFSKTAAKGEAAAERPGE 서열번호 11
펩티드 16 GAQFSKTAAKGEAAAERPG 서열번호 16
펩티드 22 GAQFSKTAAKGEAAAERP 서열번호 22
펩티드 29 GAQFSKTAAKGEAAAER 서열번호 29
펩티드 37 GAQFSKTAAKGEAAAE 서열번호 37
펩티드 46 GAQFSKTAAKGEAAA 서열번호 46
펩티드 56 GAQFSKTAAKGEAA 서열번호 56
펩티드 67 GAQFSKTAAKGEA 서열번호 67
펩티드 79 GAQFSKTAAKGE 서열번호 79
펩티드 92 GAQFSKTAAKG 서열번호 92
펩티드 106 GAQFSKTAAK 서열번호 106
펩티드 121 GAQFSKTAA 서열번호 121
펩티드 137 GAQFSKTA 서열번호 137
펩티드 154 GAQFSKT 서열번호 154
펩티드 172 GAQFSK 서열번호 172
펩티드 191 GAQFS 서열번호 191
펩티드 211 GAQF 서열번호 211
펩티드 232 GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF 서열번호 232 RNS
하기 표 2는 N-말단 및/또는 C-말단 위치가 치환되거나 화학적으로 변형되는 본 발명의 MANS-관련 펩티드 단편을 개시한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 이들 MANS 펩티드의 활성 단편은 표 1에 개시된 바와 같이, N-말단이 미리스토일화될 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, C-말단 위치에서의 화학적 변형은 예를 들면, 암모니아와 같은 아민과의 아미드 형성과 같은 아미드화(amidation)를 포함한다. 펩티드 234(서열번호 234)는 N-말단이 화학적으로 변형될 수 있고(예를 들면, N-아세틸 유사체(analog), Ac-RGAQFSKTAAK), 또한 그의 N-말단 및 그의 C-말단이 화학적으로 변형될 수 있는(예를 들면, N-말단 아세틸-, C-말단 암모니아 유사체와의 아미드, Ac-RGAQFSKTAAK-NH2 펩티드 106(서열번호 106)의 N-말단 알기닌- 치환된 펩티드 상동체(homolog)(RGAQFSKTAAK)이다. 펩티드 235(서열번호 235)는 N-말단이 화학적으로 변형될 수 있고(예를 들면, N-아세틸 유사체, Ac-RAKGE), 또한 그의 N-말단 및 그의 C-말단이 화학적으로 변형될 수 있는(예를 들면, N-말단 아세틸-, C-말단 암모니아 유사체와의 아미드, Ac-RAKGE-NH2) 펩티드 219의 N-말단 알기닌-치환 펩티드 유사체(RAKGE)이다. 바람직한 N-말단 변형 또는 치환은 미리스토일 및 아세틸기 뿐만 아니라, N-말단 알기닌기, N-말단 아세틸-알기닌기, 및 N-말단 미리스토일-알기닌기를 포함한다. 바람직한 C-말단의 변형은 암모니아로부터의 아민기를 포함한다.
N-말단 및/또는 C-말단에서 화학적으로 변형될 수 있는 MARCKS-관련 펩티드 서열들
MANS 펩티드 및
활성 MANS -관련 펩티드 단편
펩티드 No . 아미노산 서열 서열번호
펩티드 1 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 1 MANS
펩티드 2 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 2
펩티드 3 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 3
펩티드 4 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 4
펩티드 5 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 5
펩티드 6 QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 6
펩티드 7 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 7
펩티드 8 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 8
펩티드 9 QFSKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 9
펩티드 10 FSKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 10
펩티드 11 GAQFSKTAAKGEAAAERPGE 서열번호 11
펩티드 12 AQFSKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 12
펩티드 13 QFSKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 13
펩티드 14 FSKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 14
펩티드 15 SKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 15
펩티드 16 GAQFSKTAAKGEAAAERPG 서열번호 16
펩티드 17 AQFSKTAAKGEAAAERPGE 서열번호 17
펩티드 18 QFSKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 18
펩티드 19 FSKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 19
펩티드 20 SKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 20
펩티드 21 KTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 21
펩티드 22 GAQFSKTAAKGEAAAERP 서열번호 22
펩티드 23 AQFSKTAAKGEAAAERPG 서열번호 23
펩티드 24 QFSKTAAKGEAAAERPGE 서열번호 24
펩티드 25 FSKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 25
펩티드 26 SKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 26
펩티드 27 KTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 27
펩티드 28 TAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 28
펩티드 29 GAQFSKTAAKGEAAAER 서열번호 29
펩티드 30 AQFSKTAAKGEAAAERP 서열번호 30
펩티드 31 QFSKTAAKGEAAAERPG 서열번호 31
펩티드 32 FSKTAAKGEAAAERPGE 서열번호 32
펩티드 33 SKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 33
펩티드 34 KTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 34
펩티드 35 TAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 35
펩티드 36 AAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 36
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펩티드 40 FSKTAAKGEAAAERPG 서열번호 40
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펩티드 126 KTAAKGEAA 서열번호 126
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펩티드 131 GEAAAERPG 서열번호 131
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펩티드 133 AAAERPGEA 서열번호 133
펩티드 134 AAERPGEAA 서열번호 134
펩티드 135 AERPGEAAV 서열번호 135
펩티드 136 ERPGEAAVA 서열번호 136
펩티드 137 GAQFSKTA 서열번호 137
펩티드 138 AQFSKTAA 서열번호 138
펩티드 139 QFSKTAAK 서열번호 139
펩티드 140 FSKTAAKG 서열번호 140
펩티드 141 SKTAAKGE 서열번호 141
펩티드 142 KTAAKGEA 서열번호 142
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펩티드 144 AAKGEAAA 서열번호 144
펩티드 145 AKGEAAAE 서열번호 145
펩티드 146 KGEAAAER 서열번호 146
펩티드 147 GEAAAERP 서열번호 147
펩티드 148 EAAAERPG 서열번호 148
펩티드 149 AAAERPGE 서열번호 149
펩티드 150 AAERPGEA 서열번호 150
펩티드 151 AERPGEAA 서열번호 151
펩티드 152 ERPGEAAV 서열번호 152
펩티드 153 RPGEAAVA 서열번호 153
펩티드 154 GAQFSKT 서열번호 154
펩티드 155 AQFSKTA 서열번호 155
펩티드 156 QFSKTAA 서열번호 156
펩티드 157 FSKTAAK 서열번호 157
펩티드 158 SKTAAKG 서열번호 158
펩티드 159 KTAAKGE 서열번호 159
펩티드 160 TAAKGEA 서열번호 160
펩티드 161 AAKGEAA 서열번호 161
펩티드 162 AKGEAAA 서열번호 162
펩티드 163 KGEAAAE 서열번호 163
펩티드 164 GEAAAER 서열번호 164
펩티드 165 EAAAERP 서열번호 165
펩티드 166 AAAERPG 서열번호 166
펩티드 167 AAERPGE 서열번호 167
펩티드 168 AERPGEA 서열번호 168
펩티드 169 ERPGEAA 서열번호 169
펩티드 170 RPGEAAV 서열번호 170
펩티드 171 PGEAAVA 서열번호 171
펩티드 172 GAQFSK 서열번호 172
펩티드 173 AQFSKT 서열번호 173
펩티드 174 QFSKTA 서열번호 174
펩티드 175 FSKTAA 서열번호 175
펩티드 176 SKTAAK 서열번호 176
펩티드 177 KTAAKG 서열번호 177
펩티드 178 TAAKGE 서열번호 178
펩티드 179 AAKGEA 서열번호 179
펩티드 180 AKGEAA 서열번호 180
펩티드 181 KGEAAA 서열번호 181
펩티드 182 GEAAAE 서열번호 182
펩티드 183 EAAAER 서열번호 183
펩티드 184 AAAERP 서열번호 184
펩티드 185 AAERPG 서열번호 185
펩티드 186 AERPGE 서열번호 186
펩티드 187 ERPGEA 서열번호 187
펩티드 188 RPGEAA 서열번호 188
펩티드 189 PGEAAV 서열번호 189
펩티드 190 GEAAVA 서열번호 190
펩티드 191 GAQFS 서열번호 191
펩티드 192 AQFSK 서열번호 192
펩티드 193 QFSKT 서열번호 193
펩티드 194 FSKTA 서열번호 194
펩티드 195 SKTAA 서열번호 195
펩티드 196 KTAAK 서열번호 196
펩티드 197 TAAKG 서열번호 197
펩티드 198 AAKGE 서열번호 198
펩티드 199 AKGEA 서열번호 199
펩티드 200 KGEAA 서열번호 200
펩티드 201 GEAAA 서열번호 201
펩티드 202 EAAAE 서열번호 202
펩티드 203 AAAER 서열번호 203
펩티드 204 AAERP 서열번호 204
펩티드 205 AERPG 서열번호 205
펩티드 206 ERPGE 서열번호 206
펩티드 207 RPGEA 서열번호 207
펩티드 208 PGEAA 서열번호 208
펩티드 209 GEAAV 서열번호 209
펩티드 210 EAAVA 서열번호 210
펩티드 211 GAQF 서열번호 211
펩티드 212 AQFS 서열번호 212
펩티드 213 QFSK 서열번호 213
펩티드 214 FSKT 서열번호 214
펩티드 215 SKTA 서열번호 215
펩티드 216 KTAA 서열번호 216
펩티드 217 TAAK 서열번호 217
펩티드 218 AAKG 서열번호 218
펩티드 219 AKGE 서열번호 219
펩티드 220 KGEA 서열번호 220
펩티드 221 GEAA 서열번호 221
펩티드 222 EAAA 서열번호 222
펩티드 223 AAAE 서열번호 223
펩티드 224 AAER 서열번호 224
펩티드 225 AERP 서열번호 225
펩티드 226 ERPG 서열번호 226
펩티드 227 RPGE 서열번호 227
펩티드 228 PGEA 서열번호 228
펩티드 229 GEAA 서열번호 229
펩티드 230 EAAV 서열번호 230
펩티드 231 AAVA 서열번호 231
펩티드 232 GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF 서열번호 232 RNS
펩티드 233 GKASQFAKTA 서열번호 233 RNS2
펩티드 234 RGAQFSKTAAK 서열번호 234
펩티드 235 RAKGE 서열번호 235
MANS 펩티드는 미리스토일화(MA)되고, 24개의 아미노산 서열을 갖는다(MA-GAQFSKTAAKGEAAARPGEAAVA). 이론에 구애되지는 않으나, 이론적으로 상기 펩티드는 세포막에 자연적으로 부착되고, 단백질 키나제 C(PKC)에 의해 MARCKS 단백질의 인산화를 방해하는 총장(full length) MARCKS 단백질과 저촉된다.
MANS 펩티드는 실험실 및 생체 조건에서 배상세포(goblet cell)의 탈과립화(degranulation)를 유의적으로 억제하는 것이 밝혀졌다. MANS는 또한 호중구(neutrophil) 및 중배엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)의 이동속도에 영향을 준다. 또한, MANS에 의해 사람 백혈구의 탈과립화가 억제된다. 본 발명의 일 측면에 따르면, 암 세포주를 MANS-관련 펩티드로 처리하는 경우, 이들 암 세포주의 이동이 감소된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 암세포의 전이를 억제한다. 따라서, 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 MANS-관련 펩티드는 개체에서 전이성 암을 치료 또는 예방하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는, 예를 들면, 암의 치료와 같은 치료적 응용에 적합한 특성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 MANS 펩티드에 비하여 증대된 용해도를 나타낸다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 일부 MANS-관련 펩티드는 MANS 펩티드 또는 MANS-관련 펩티드외의 다른 펩티드에 비하여 혈장(plasma)에서 보다 긴 반감기(half-lives)를 나타낸다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 암세포의 증식의 치료에 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 MANS-관련 펩티드는 암세포의 증식 또는 이동을 억제한다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 일부 MANS-관련 펩티드는 MANS 펩티드는 MANS-관련 펩티드보다 더 낮은 농도에서 암세포의 증식 및/또는 이동을 더욱 억제한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, MANS-관련 펩티드는 이하로 구성된 그룹으로부터 선택된다:
N-미리스토일-GAQFSKTAAK (서열번호 106; BIO-11000)
N-아세틸-GAQFSKTAAK (서열번호 106; BIO-11006);
N-미리스토일-AKGE (서열번호 219; BIO-91200);
N-미리스토일-GAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 106; BIO-11002);
N-아세틸-GAQFSKTAA (서열번호 121; BIO-10901);
N-아세틸-GAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 106; BIO-11026);
N-아세틸-GAQFS(d)KTAA(d)K (서열번호 106; BIO-11037)
(6번 및 10번 위치에서의 라이신은 d-구조이다);
N-아세틸-RGAQFSKTAAK (서열번호 234; BIO-11027);
N-아세틸-RGAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 234; BIO-11028); 및
N-아세틸-RAKGE (서열번호 235; BIO-91204).
본 발명의 일 측면에 따르면, 4 내지 24개의 아미노산을 가지고 MANS 펩티드에서 발견되는 아미노산 서열과 동일하거나 대체적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩티드들이 유용하다. 이들 펩티드들은 본 명세서에서 MANS-관련 펩티드(MANS-related peptide)로 일컫어지고, 예시적인 MANS-관련 펩티드들이 상기 표 2에 서열번호 1 내지 231, 234, 및 235로 개시되어 있다. 표 2는 또한 대조구로 사용되며, 아미노산 서열의 순서가 본 발명에서의 효과와 관련이 있는 임의적 서열(random sequence, RNS 펩티드 232 (서열번호 232) 뿐만 아니라, 2차 임의적 서열 대조구 펩티드열(second random sequence control peptide) 233 (RNS2; 서열번호 233)을 개시한다. 펩티드 234 및 235 (서열번호 234 및 235)는 각각 펩티드 106 및 219의 N-말단 알기닌-치환 펩티드 상동체(homolog)이다. 알기닌은 예를 들면, 아세틸기 또는 미리스토일기로 아실화될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 발명에 유용한 펩티드들은 상기 표 2에 개시된 아미노산 서열을 가지는 합성 펩티드들로 구성된 그룹으로부터 선택된다(임의적 서열 펩티드 232 및 233 제외).
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명에 유용한 펩티드들은 N-말단 및/또는 C-말단이 화학적으로 변형될 수 있는 표 2에 개시된 아미노산 서열(서열번호 1 내지 231(inclusive), 234, 및 235)의 펩티드들로부터 선택될 수 있다.
표 2에 개시된 펩티드들에 있어서, 바람직하고도 상호 독립적인 N-말단의 화학적 변형은,
상기 펩티드의 N-말단 아미노산이
＊직쇄형(linear), 분지형(branched), 포화 또는 불포화 C2(아세틸)~C24 지방족 카복실산의 아미드,
＊트리플루오르아세트산의 아미드,
＊벤조산의 아미드, 및
＊C1~C24 지방족 알킬술폰산의 아미드 형태로 아실화(acylation)되거나; 또는,
상기 펩티드의 N-말단 아미노산의 N-말단 아민기가
＊C1~C24 지방족 알킬기,
＊직쇄형 2-(C1~C24 지방족 알킬)옥시에틸기,
＊오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸기(n은 0 내지 10)로 알킬화(alkylation)되는 것을 포함한다.
표 2에 개시된 펩티드들에 있어서, 바람직하고도 상호 독립적인 C-말단의 화학적 변형은, C-말단 아미노산이
＊암모니아의 아미드,
＊C1~C24 지방족 알킬아민의 아미드,
＊히드록실기-치환된 C2~C24 지방족 알킬아민의 아미드,
＊직쇄형 2-(C1~C24 지방족 알킬)옥시에틸아민기의 아미드, 또는
＊오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸아민기(n은 0 내지 10)의 아미드 형태로 상기 펩티드 C-말단 아미노산의 C-말단 카복실산기에 아미드를 형성하는 것을 포함한다.
또한, 상기 펩티드 C-말단 아미노산의 C-말단 카복실산기는 이하로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 에스테르 형태이다: C1 내지 C24 지방족 알킬 알코올의 에스테르, 2-(오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에탄올기(n은 0 내지 10)의 에스테르, 및 직쇄형 PEG-아민(상기 PEG의 분자량은 1,000 내지 25,000달톤이다)의 에스테르.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 카복실산기 및 술폰산기와 같은 기(group)의 지방족 부분 및 알코올과 아민기는 최소한 C3의 환(ring)(즉, 최소한 사이클로프로필 환)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 예를 들면, 아세틸기 또는 미리스토일기에 의해 각각 아세틸-GAQFSKTAAK (N-말단 아세틸 서열번호 106) 및 미리스토일-GAQFSKTAAK (N-말단 미리스토일 서열번호 106)와 같이 N-말단이 변형될 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 (예를 들면, 암모니아의 아미드에 의해) GAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 106 C-말단 아미드)와 같이 C-말단이 변형될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 예를 들면 아세틸-GAQFSKTAAK-NH2와 같은 N-아세틸-펩티드-C-아미드(암모니아와)로서 N-말단 및 C-말단이 변형될 수 있다. (N-말단 아세틸 서열번호 106 C-말단 아미드) 및 미리스토일-GAQFSKTAAK-NH2 (N-말단 미리스토일 서열번호 106 C-말단 아미드). 이들 펩티드는 본 발명의 방법에 사용될 수 있으며, 암세포의 전이를 억제하는 그들의 능력을 측정하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 발명의 용도를 확인할 수 있는 펩티드는 아미노산 서열 AKGE (서열번호 219)을 포함하는 펩티드 그룹(group)으로부터 선택될 수 있다. 이러한 펩티드로서는 서열번호 1 내지 서열번호 54, 서열번호 56 내지 서열번호 64, 서열번호 67 내지 서열번호 75, 서열번호 79 내지 서열번호 87, 서열번호 93 내지 서열번호 100, 서열번호 108 내지 서열번호 114, 서열번호 124 내지 서열번호 129, 서열번호 141 내지 서열번호 145, 서열번호 159 내지 서열번호 162, 서열번호 178 내지 서열번호 180, 서열번호 198, 서열번호 199, 서열번호 219, 및 서열번호 235를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시태양으로서, 이들 펩티드는 N-말단 아미노기가 미리스토일화 또는 아세틸화된다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 발명은 암세포를 MANS-관련 펩티드인 이동-조절 펩티드(migration-modulating peptide)의 이동-억제량으로 처리하고, 상기 세포를 상기 펩티드와 함께 반응시켜 이동-억제된 암세포를 형성하는 단계를 포함하는, 유액(fluid) 또는 조직(tissue)에서 주화성 인자(chemotactic agent)의 증가하는 농도구배(increasing concentration gradient)로의 암세포 전이를 완화하는 방법을 개시한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 이동-조절 펩티드는 MANS-관련 펩티드로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 다른 측면에 따르면, MANS-관련 펩티드는 아미노산 서열 GAQFSKTAAK (서열번호 106)을 포함한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 MANS-관련 펩티드는 N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (서열번호 1) N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (서열번호 2); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (서열번호 4); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (서열번호 7); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (서열번호 11); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (서열번호 16); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERP (서열번호 22); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAER (서열번호 29); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAE (서열번호 37); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAA (서열번호 46); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAA (서열번호 56); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEA (서열번호 67); N-미리스토일-GAQFSKTAAKGE (서열번호 79); N-미리스토일-GAQFSKTAAKG (서열번호 92); N-미리스토일-GAQFSKTAAK (서열번호 106); N-미리스토일-GAQFSKTAA (서열번호 121); N-미리스토일-GAQFSKTA (서열번호 137); N-미리스토일-GAQFSKT (서열번호 154); N-미리스토일-GAQFSK (서열번호 172), N-미리스토일-GAQFS (서열번호 191), N-미리스토일-GAQF (서열번호 211), N-아세틸-RGAQFSKTAAK (서열번호 234), N-아세틸-RGAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 234), N-아세틸-RAKGE (서열번호 235), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 MANS-관련 펩티드는 N-미리스토일-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (서열번호 1; MANS 펩티드); N-미리스토일-GAQFSKTAAK (서열번호 106; BIO-11000); N-아세틸-GAQFSKTAAK (서열번호 106; BIO-11006); N-아세틸-GAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 106; BIO-11026); N-미리스토일-AKGE (서열번호 219; BIO-91200); N-미리스토일-GAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 106; BIO-11002); N-아세틸-GAQFSKTAA (서열번호 121; BIO-10901); N-아세틸-RGAQFSKTAAK (서열번호 234; BIO-11027); N-아세틸-RGAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 234; BIO-11028); 및, N-아세틸-RAKGE (서열번호 235; BIO-91204)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명의 펩티드의 전이-억제 용량은 약 0.01mg/kg/day 내지 약 10mg/kg/day의 범위 내에 있다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 펩티드의 전이-억제 용량은 약 0.1mg/kg/day 내지 약 5.0mg/kg/day이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 상기 펩티드의 전이-억제 용량은 약 0.5mg/kg/day 내지 약 2.5mg/kg/day이다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드의 전이-억제 용량은 약 0.01, 약 0.05, 약 0.1, 약 0.5, 약 0.75, 약 1.0, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2.0, 약 2.25, 약 2.5, 약 2.75, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 5.0, 약 6.0, 약 7.0, 약 8.0, 약 9.0, 약 10.0mg/kg/day, 또는 그 이상이다.
본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 암세포의 전이를 억제하는 방법을 제공하는데, 이때 투여는 경구(oral), 정맥내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 흡입(inhalation) 또는 좌약(suppository) 경로에 의한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 암세포의 전이를 억제하는 방법을 제공하는데, 이때 투여는 MARCKS-억제 화합물의 액상 용액(liquid solution), 현탁액(suspension) 또는 건조 분말제제(dry powder formulation)의 흡입에 의해 이루어진다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 암을 치료하는 방법이 제공되는데, 이때 MARCKS-억제 화합물은 개체에 MARCKS-억제 화합물의 액상 용액 또는 건조 분말 조성물의 흡입에 의해 투여된다. 예를 들면, 본 발명의 일 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 개체에 MANS-관련 화합물의 액상 용액 또는 현탁액 또는 건조 분말제제의 흡입에 의해 투여된다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, MANS-관련 펩티드는 정맥, 복강, 또는 근육 주사, 또는 경구 또는 좌약 투여에 의해 투여된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 암세포의 전이를 억제하거나, 또는 암을 치료하는 방법을 개시하는데, 이때 MANS-관련 펩티드는 펩티드의 액상 제제의 주사에 의해 투여되고, 상기 액상 제제는 등장성(isotonic)이며, 액상 또는 현탁액 제제는 완충액이고, 주사는 개체의 전신(systemic)에 행해진다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 주사는 종양 부위에 가해진다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 주사는 종양에 가해진다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 암세포의 전이를 억제하는 방법을 개시하는데, 이때 암세포는 포유동물에 존재한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 개시하는데, 이때 MANS-관련 펩티드는 종양을 가지는 개체에 투여된다. 상기 본 발명의 펩티드는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용되는 부형제(excipient) 또는 성분(ingredient)으로 제제화되어, 예를 들면 1차 종양(primary tumor)에서의 암세포와 같은 암세포에 투여하는데 유용한 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 용액(solution) 또는 액, 특히 완충액, 바람직하게는 인산 완충액 중의 현탁액(suspension)일 수 있으며, 투여는 주사(injection) 또는 흡입(inhalation)이 바람직하다. 등장액(isotonic solution) 또는 현탁액(suspension)이 바람직하다.
본 발명의 항체, 폴리뉴클레오티드, 핵산 분자, 또는 펩티드의 조성물의 투여는, 1차 종양부위(primary tumor region)에 주사(예를 들면, 1차 종양에 직접 주사하거나, 또는 1차 종양의 인접부위에 주사하거나, 혹은 1차 종양을 이송하는 혈관에 주사)하는 경우, 개과(canine), 고양이과(feline), 및 사람(human) 환자와 같은 포유동물에의 투여가 효과적이고, 주사는 일정한 간격(예를 들면, 매 1시간 내지 72시간)으로, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가적인 화학요법 약물(chemotherapy drug)과 조합하거나 별도로 행해지는 것을 예상할 수 있다.
펩티드 투여 전, 도중 또는 후에, MARCKS-억제 항체, 폴리뉴클레오티드, 핵산분자, 또는 펩티드 제제 외에, 화학요법 약물 및 암 특이적 항체를 포함하는 하나 또는 그 이상의 추가적인 치료제가 투여될 수 있다. 예시적인 화학요법 제제는, 이에 한정되는 것은 아니나, 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 젬시타빈(gemcitabine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시타라빈(cytarabine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 히드록시유레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아니딘(thioguanadine), 다우노루비신(daunorubicin), 독스루비신(doxurubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포시드(etoposide), 에니포시드(eniposide), 콜히친(colchicine), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 및 도세탁셀(docetaxel)을 포함한다. 또한, 예시적인 암-특이적(cancer-specific) 약물 또는 항체는, 이에 한정되는 것은 아니나, 아파티닙(Afatinib), 알데스루킨(Aldesleukin), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 악시티닙(Axitinib), 벨리무맙(Belimumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 보테조밉(Bortezomib), 보수티닙(Bosutinib), 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin), 카보자티닙(Cabozantinib), 카나키누맙(Canakinumab), 카필조밉(Carfilzomib), 세툭시맙(Cetuximab), 크리조티닙(Crizotinib), 다브라페닙(Dabrafenib), 다사티닙(Dasatinib), 네노수맙(Denosumab), 엘로티닙(Erlotinib), 에벨로무스(Everolimus), 제피티닙(Gefitinib), 이부리투모맙 티욱세탄(Ibritumomab tiuxetan), 이브루티닙(Ibrutinib), 이마티닙(Imatinib), 이필리무맙(Ipilimumab), 라파티닙(Lapatinib), 닐로티닙(Nilotinib), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 파니투무밥(Panitumumab), 파조파닙(Pazopanib), 퍼두주맙(Pertuzumab), 포나티닙(Ponatinib), 레고라페닙(Regorafenib), 리툭시맙(Rituximab), 로미뎁신(Romidepsin), 룩소리티닙(Ruxolitinib), 시푸에셀-T(Sipuleucel-T), 소라페닙(Sorafenib), 템시로리무스(Temsirolimus), 토실리주맙(Tocilizumab), 토파시티닙(Tofacitinib), 토시투모맙(Tositumomab), 트라메티닙(Trametinib), 트라쯔맙(Trastuzumab), 반데타닙(Vandetanib), 베무라페닙(Vemurafenib), 비스모데집(Vismodegib), 비리노스탓(Vorinostat), 및 지브-아플리버셉트(Ziv-aflibercept)를 포함한다.
투여는 예를 들면, 암 환자의 기도를 통한 흡입에 의해 이루어지며, 암세포를 가지는 조직을 코팅하는 액체 또는 건조 분말의 에어로졸(aerosol) 또는 스프레이(spray)로서, 혹은 전이 이전의 암세포를 가지는 유액 또는 조직에 가해지거나 암세포와 접촉하는 주사액제(liquid for injection)로서 투여된다. 인지질 (phospholipid)과 같은 유연한(mild) 표면 활성제는 MANS-관련 펩티드의 가용화(solubilization) 및 경막 흡수(transmembrane uptake)를 용이하게 한다. 투여는 또한 예를 들면, 암세포를 가지는 조직에 뿌려질 수 있는 건조 분말, 바람직하게는 나노입자 또는 마이크로입자 분말에 의해 행해질 수도 있다. 펩티드 제제에 마이크로입자 탄수화물 담체(carbohydrate carrier)를 가하면, 나노입자 펩티드가 기도 및 상피 조직에 흡입되는 것을 용이하게 한다.
MARCKS-억제 항체, 폴리뉴클레오티드, 핵산분자, 또는 펩티드 조성물의 바람직한 사용방법은 전이되기 이전의 암세포를 포함하는 종양의 조직 또는 그 부근에 주사하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "효과량(effective amount)" 또는 "치료적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 원하는 효과(즉 암세포의 전이 및/또는 증식의 억제, 및/또는 개체의 암을 억제, 치료 또는 예방)를 얻기 위하여, 본 발명을 실시하는데 사용되는 조성물의 독성을 나타내지 않으면서(nontoxic) 충분한(sufficient) 양을 일컫는다. 따라서, 본 발명의 방법에 의한 활성은 의학적 치료 및/또는 예방 둘 다를 포함하며, 예를 들면 암의 증세, 증상 또는 원인의 감쇄 또는 완화를 포함한다. 본 발명의 화합물의 치료적 유효량은 생리적으로 허용되는 부형제 조성물로서 투여되었을 때, 효과적인 세포간 농도(intracellular concentration) 및 조직에서의 국부 농도(local concentration)를 얻기에 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 "암(cancer)"이라 함은 일반적으로 조절되지 않은 세포성장(unregulated cell growth)으로 특징지어지는 포유동물에서의 생리적 조건을 의미하거나 기술한다. 암의 예로서는, 이에 한정되는 것은 아니나, 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 아세포종(blastoma), 육종(sarcoma)(지방 육종, 골 육종, 혈관 육종, 내피 육종(endotheliosarcoma), 림프관 육종(lymphangiosarcoma), 림프관 내피 육종(lymphangioendotheliosarcoma), 평활근 육종(leiomyosarcoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 점액 육종, 연골 육종을 포함), 뼈파괴세포종, 신경내분비종, 중피종, 척색종, 활액막종, 신경초종(schwanoma), 뇌수막종, 선암종, 흑색종, 백혈병 또는 림프종을 포함한다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로서는, 편평세포 암(squamous cell cancer, 예를 들어, 상피의 편평세포 암), 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐의 선암과 편평암, 소세포 폐암종을 포함하는 폐암(lung cancer), 복막암(cancer of peritoneum), 간세포 암(hepatocellular cancer), 위장암을 포함하는 위암, 췌장암, 교아종, 자궁 경부암, 난소암, 간암(liver cancer), 방광암, 간세포암(hepatoma), 유방암, 결장암(colon cancer), 직장암, 대장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암종(hepatic carcinoma), 항문암, 음경암종, 고환암, 식도암(esophageal cancer), 담도 종양, 위잉 종양(Ewing's tumor), 기저 세포암, 선암, 땀샘암, 피지선암종, 갑상선 유두암(papillary carcinoma), 유두 선암, 낭포 선암, 속질 암종, 기관지 원성암종, 신장 세포암, 담관암, 융모암(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 태생기암(embryonal carcinoma), 태생성 신혼합 종양(Wilms' tumor), 고환 종양, 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경 교종(glioma), 성상 세포종, 수아 종, 두개 인두종(craniopharyngioma), 상의세포종, 송과체종, 혈관모 세포종, 청신경종(acoustic neuroma), 핍지교종(oligodendroglioma), 뇌수막종(meningioma), 흑색종, 신경아 세포종, 망막 아종, 백혈병, 림프종, 다중 골수종, Waldenstrom의 마크로글로불린 혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 골수이형성 증후군(myelodysplastic disease), 중쇄병(heavy chain disease), 신경 내분비계 종양, 신경초종, 및 기타 암종, 머리와 목의 암, 성숙 AML(AML with maturation), 미분화 급성 골수성 백혈병(AML without differentiation)을 포함하는 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemias)과 같은 골수 종양(myeloid neoplasias), 급성 전골 수구성 백혈병, 급성 골수 단구성 백혈병, 급성 단구성 백혈병(acute monocytic leukemias), 골수형성이상 증후군(myelodysplastic syndromes), 만성 골수성 백혈병을 포함하는 만성 골수 증식 질환(chronic myeloproliferative disorder), 중추 신경계 종양, 예를 들어, 뇌 종양(신경 교종, 신경아 세포종, 성상 세포종, 수아 종, 뇌질 피복 세포증, 및 망막아세포종), 고형 암(비강 인두암, 기저 세포암, 췌장암, 담즙관, 카포시 육종, 고환암, 자궁(uterine), 또는 질 또는 자궁경부암(vaginal or cervical cancer), 난소암, 일차성 간암(primary liver cancer) 또는 자궁 내막암(endometrial cancer), 혈관계 종양(혈관 육종과 혈관주위 세포종), 혈액 종양형성(hematologic neoplasia) 및 종양-유사 조건, 예를 들면 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)(버킷의 림프종(Burkitt's lymphoma), 작은 림프구 림프종/만성병 림프구 백혈병, 균상식 육종(mycosis fungoides), 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종, 큰 확산 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 갓번짐 림프종(marginal zone lymphoma), 모양 세포성 백혈병(hairy cell leukemia) 및 림프형질세포 림프종(lymphoplasmacytic leukemia)), B-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종 포함하는 림프구 전구체 세포의 종양, 및 T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종, 흉선종(thymoma), 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-cell 림프종과 큰 과립 림프성 백혈병을 포함하는 성숙 T 및 NK 세포의 종양, 골용해성 골암(osteolytic bone cancer), 및 골전이(bone metastasis)를 포함한다.
도 1은 12시간의 이동시간(migration time) 이후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분(cell count field)를 나타낸다.
도 2의 좌측 사진은 50umolar MANS 펩티드의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타내고, 우측 사진은 100umolar MANS 펩티드의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타낸다.
도 3의 좌측 사진은 50umolar RNS 펩티드의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타내고, 우측 사진은 100umolar RNS 펩티드의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타낸다.
도 4의 좌측 사진은 50umolar MANS-관련 펩티드 BIO-11002의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타내고, 우측 사진은 100umolar MANS-관련 펩티드 BIO-11002의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타낸다.
도 5의 좌측 사진은 50umolar의 MANS-관련 펩티드 BIO-10901의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타내고, 우측 사진은 100umolar MANS-관련 펩티드 BIO-10901의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타낸다.
도 6의 좌측 사진은 50umolar MANS-관련 펩티드 BIO-91200의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타내고, 우측 사진은 100umolar MANS-관련 펩티드 BIO-91200의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타낸다.
도 7의 좌측은 50umolar의 MANS 펩티드, BIO11002, BIO10901, BIO91200, 또는 RNS 펩티드를 전처리하거나 펩티드를 처리하지 않은(대조구) 이후 얻어지는 이동된 세포수를 나타낸 그래프이고, 우측은 100umolar의 MANS 펩티드, BIO11002, BIO10901, BIO91200, 또는 RNS 펩티드를 전처리하거나 펩티드를 처리하지 않은(대조구) 이후 얻어지는 이동된 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 8의 좌측은 본 발명의 펩티드를 50umolar 전처리하고 프로토콜에 따른 12시간의 처리 이후, 유주지수(migration index)가 더 높을수록 덜 이동하는 공격적(aggressive) 사람 NSCLC 세포주의 유주지수를 나타낸 그래프이다.
도 8의 우측은 본 발명의 펩티드를 100umolar 전처리하고 프로토콜에 따른 12시간의 처리 이후, 유주지수가 더 높을수록 덜 이동하는 공격적인 사람 NSCLC 세포주의 유주지수를 나타낸 그래프이다.
도 9는 50umolar의 MANS, RNS, BIO-11000, 또는 BIO-11006를 처리하거나 펩티드를 처리하지 않은(대조구) 공격적인 사람 NSCLC 세포주를 이용한 실험에서의 세포수(좌측 패널) 및 유주지수(migration index number, 우측 패널)를 각각 나타낸 그래프이다.
도 10은 100umolar의 MANS, RNS, BIO-11000, 또는 BIO-11006를 처리하거나 펩티드를 처리하지 않은(대조구) 공격적인 사람 NSCLC 세포주를 이용한 실험에서의 세포수(좌측 패널) 및 유주지수(우측 패널)를 각각 나타낸 그래프이다.
도 11은 A549 세포에 펩티드를 처리하지 않거나, 시험 펩티드(MANS, RNS, BIO-11006, BIO-11000, BIO-91200, 또는 BIO-10901)를 10umolar(위 좌측 패널), 25umolar(위 우측 패널), 또는 50umolar(아래 패널) 전처리하고 12시간 경과한 후의 이동된 세포수를 나타낸다.
도 12는 BIO-11006, BIO-11006(100uM in PBS)를 암세포 접종후 3일째부터 시작하여 22일 동안 매일 1회씩 복강주사(50㎕) 또는 흡입(30분, Nebulizer Delivery System, Aeroneb Lab.) 처리한 동물에서, 좌측 폐, 우측 폐, 심장, 및 횡경막(diaphragm)에서의 마우스 당 평균 종양수를 나타낸다.
도 13은 Nebulizer Delivery System(Aeroneb Lab.)을 이용한 흡입에 의하여 사람 선암(adenocarcinoma) 세포(PC-9)의 주사에 대하여 15일째 또는 4일째부터 하루 1회씩 30일 넘도록 BIO-11006(100uM in PBS)를 처리한 마우스에서 좌측 폐, 우측 폐, 심장, 및 횡경막(diaphragm)에서의 마우스 당 평균 종양수를 나타낸다.
도 14는 Nebulizer Delivery System(Aeroneb Lab.)을 이용한 30일이 넘는 흡입(inhalation)에 의해 PC-9 세포의 주사에 대한 15일째 또는 4일째부터 하루 1회씩 BIO-11006(100uM in PBS)를 처리한 마우스에서 전체 종양수를 나타낸다.
도 15는 매일 담체(대조구), A549 암세포 주사에 대하여 -1일 또는 +3일 에어로졸화 BIO-11006, A549 암세포 주사에 대하여 -1일 또는 +3일 에어로졸화 MANS로 처리한 마우스에서 발견되는 전이결절(metastatic nodule)의 수를 나타낸다. 에어로졸화 펩티드(100uM in PBS)는 Nebulizer Delivery System(Aeroneb Lab.)을 이용한 흡입에 의하여 투여하였다. *, p<0.05, 대조구와 대비하여 통계학적으로 유의미; a, 실험구 사이에 통계학적으로 무의미.
도 16은 PC9 세포에 100nM MARCKS siRNA 또는 대조구 siRNA를 투여한 이후 MARCKS 단백질의 수준을 나타낸다.
도 17은 A549 세포에 100nM MARCKS siRNA 또는 대조구 siRNA를 투여한 이후 MARCKS 단백질의 수준을 나타낸다.
도 18은 100nM MARCKS siRNA 또는 대조구 siRNA를 투여한 후 PC9 암세포의 이동을 나타낸다.
도 19는 100nM MARCKS siRNA 또는 대조구 siRNA를 투여한 후 A549 암세포의 이동을 나타낸다.
도 20은 PC9 세포에서의 50nM 음성 대조구(HiPerfect vehicle; A 레인) 또는 50nM miR21 억제제(B 레인)를 처리한 이후 웨스턴 블롯에 의한 MARCKS의 발현을 나타낸다.
도 21은 miR21 억제(50nM 또는 100nM miR21 억제제) 또는 miR21 활성화(50nM 또는 100nM miR21 유사체)한 이후 PC9 암세포의 이동을 나타낸다.
이상에서 본 발명을 기술하였지만, 이하에서는 동일한 내용을 본 명세서에 오직 설명을 목적으로 포함하고, 본 발명을 제한하지 않는 실시예를 참조하여 설명할 것이다.
암 세포주의 이동에 대한 펩티드의 효과
이동분석 프로토콜
사람 폐의 선암(adenocarcinoma)으로부터 유래된 공격적 전이세포주인 CL1-5 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 37℃, 95% 산소/5% CO2의 조건으로 사용하기 이전까지 배양하였다. 이동분석을 위해서는 트랜스웰 플레이트(24-웰, 8-㎛ 공경(pore size); Costar, Cambridge, MA, USA)를 사용하였다. 트랜스웰 플레이트의 하부 챔버를 600㎕의 10% FBS를 함유하는 기본배지로 채웠다. 세포(1 x 105)를 50 또는 100uM의 지정된 펩티드로 30분 동안 전처리하고, 100㎕의 1% BSA를 함유하는 기본배지에 현탁시켜 상부 챔버에 가한 다음, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 여과지의 상부 표면에 있는 세포를 면봉으로 제거하고, 여과지의 하부 표면으로 이동한 세포를 세정하고, 고정하며, 헤마톡실린으로 염색하고, 현미경 하에서 계수하였다. 이동의 백분율 변화를 여과지의 하부 표면으로 이동한 세포수를 계수하여 측정하였다. 1개의 막 당 최소한 3개의 분리된 부분이 현미경으로 관찰되었다(n=4).
선택적 트랜스웰법
초대 CL1-5 세포(primary CL1-5 cell)는 사람 폐의 선암으로부터 유래되었다. 이동분석을 위하여 24-웰, 8-㎛ 공경(pore size)을 가지는 트랜스웰 플레이트(Costar, Cambridge, MA, USA)를 사용하였다. 트랜스웰 플레이트의 하부 챔버를 600㎕의 10% FBS를 함유하는 기본배지로 채웠다. 1-2 x 105 세포를 100㎕의 1% BSA를 함유하는 기본배지에 현탁시켰다. 암세포를 전배양한 후, 원하는 농도의 시험 펩티드를 상부 챔버에 직접 가하였다. 그런 다음, 플레이트를 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 여과지의 상부 표면에 있는 세포를 면봉으로 제거하였다. 여과지의 하부 표면으로 이동한 세포를 세정하고, 고정하며, 헤마톡실린으로 염색하고, 현미경 하에서 계수하였다. 1개의 막 당 최소한 5개의 분리된 부분이 현미경으로 관찰되었다(n=3). 이동 백분율 변화를 여과지의 하부 표면으로 이동한 세포수를 계수하여 측정하였다.
"수(count)"는 하부 챔버로 이동하고 40배의 광학 현미경에 의해 계수된 세포의 실제 개수를 의미하고, 매 처리당 10개의 임의 선택된 부분(field)에서 하부 표면으로 이동한 세포의 평균 개수로 나타낸다.
"지수(index)"는 펩티드 존재하에 이동한 세포의 개수를 임의로 이동한 세포(대조구)의 개수로 나눈 것이다. 지수(index) = 대조구 세포수/ 처리한 세포수. 이러한 계산은 MANS-관련 펩티드로 30분 전처리하여 차단된 세포의 이동 정도를 반영한다.
도 1은 12시간의 이동시간(migration time) 경과 후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분(cell count field)을 나타낸다.
도 2의 좌측 사진은 50umolar MANS 펩티드의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타내고, 우측 사진은 100umolar MANS 펩티드의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타낸다.
도 3의 좌측 사진은 50umolar RNS 펩티드의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타내고, 우측 사진은 100umolar RNS 펩티드의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타낸다.
도 4의 좌측 사진은 50umolar MANS-관련 펩티드 BIO-11002의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타내고, 우측 사진은100umolar MANS-관련 펩티드 BIO-11002(N-미리스토일-서열번호 106-NH2)의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 얻어지는 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타낸다.
도 5의 좌측 사진은 50umolar의 MANS-관련 펩티드 BIO-10901(N-미리스토일-서열번호 121)의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타내고, 우측 사진은 100umolar MANS-관련 펩티드 BIO-10901의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타낸다.
도 6의 좌측 사진은 50umolar MANS-관련 펩티드 BIO-91200(N-미리스토일-서열번호 219)의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타내고, 우측사진은 100umolar MANS-관련 펩티드 BIO-91200의 전처리 및 12시간의 이동시간 경과 후 음성 대조군의 세포를 계수한 부분을 나타낸다.
도 7의 좌측은 50umolar의 MANS 펩티드, RNS 펩티드, 및 MANS-관련 펩티드인 BIO-11002(서열번호 106), BIO-10901(서열번호 121), BIO-91200(서열번호 219)을 전처리하거나 펩티드를 처리하지 않은 경우(대조구)의 이동된 세포수를 나타낸 그래프이다. MANS 펩티드의 경우, 세포수는 약 40; RNS 펩티드의 경우, 세포수는 약 95; BIO-11002(서열번호 106)의 경우, 세포수는 약 50; BIO-10901(서열번호 121)의 경우, 세포수는 약 60; BIO-91200(서열번호 219)의 경우, 세포수는 약 65이었다. 각 MANS-관련 펩티드인 BIO-11002, BIO-10901, BIO-91200은 대조구 및 RNS 임의 서열 펩티드에 비하여 유의적으로 감소된 공격적인(aggressive) 사람 NSCLC 세포주(CL1-5)의 이동 세포수를 나타내었다.
도 7의 우측은 100umolar의 MANS 펩티드, RNS 펩티드, 및 MANS-관련 펩티드인 BIO-11002(서열번호 106), BIO-10901(서열번호 121), BIO-91200(서열번호 219)을 전처리하거나 펩티드를 처리하지 않은 경우(대조구)의 이동된 세포수를 나타낸 그래프이다. MANS 펩티드의 경우, 세포수는 약 20; RNS 펩티드의 경우, 세포수는 약 90; BIO-11002(서열번호 106)의 경우, 세포수는 약 25; BIO-10901(서열번호 121)의 경우, 세포수는 약 35; BIO-91200(서열번호 219)의 경우, 세포수는 약 40; 대조구의 경우, 세포수는 약 90이었다. 각 MANS-관련 펩티드인 BIO-11002, BIO-10901, BIO-91200은 대조구 및 RNS 임의 서열 펩티드에 비하여 유의적으로 감소된 공격적인 사람 NSCLC 세포주(CL1-5)의 이동 세포수를 나타내었다.
도 8의 좌측은 본 발명의 펩티드를 50umolar 전처리하고 프로토콜에 따라 12시간 처리한 후, 공격적인 사람 NSCLC 세포주의 유주지수(migration index)를 나타낸 그래프인데, 유주지수가 더 높을수록 덜 이동하는 것을 의미한다. 유주지수 값은 다음과 같다: 대조구 = 1; MANS 펩티드 = 약 2.5; RNS 펩티드 = 약 1.1; BIO-11002 = 약 2.7; BIO-10901 = 약 1.75; BIO-91200 = 약 1.7. 각 MANS-관련 펩티드인 BIO-11002, BIO-10901, BIO-91200은 대조구나 RNS 펩티드에 비하여 유의적으로 증가된 유주지수 값을 나타내었다.
도 8의 우측은 본 발명의 펩티드를 100umolar 전처리하고 프로토콜에 따라 12시간 처리한 후, 공격적인 사람 NSCLC 세포주의 유주지수를 나타낸 그래프인데, 유주지수가 더 높을수록 덜 이동하는 것을 나타낸다. 유주지수 값은 다음과 같다: 대조구 = 1; MANS 펩티드 = 약 4.3; RNS 펩티드 = 약 1; BIO-11002 = 약 3.8; BIO-10901 = 약 2.7; BIO-91200 = 약 2.4. 각 MANS-관련 펩티드인 BIO-11002, BIO-10901, BIO-91200은 대조구나 RNS 펩티드에 비하여 유의적으로 증가된 유주지수 값을 나타내었다.
도 9는 공격적인 사람 NSCLC 세포주(CL1-5)를 이용한 실험에서 50umolar의 펩티드를 처리한 결과, 각 세포수 및 유주지수를 나란히 나타낸 그래프이다. 펩티드를 처리하지 않은 대조구는 약 105개의 세포수와 1.0의 유주지수를 나타냈다. 프로토콜에 따른 50umolar의 MANS 펩티드 전처리 후 12시간 경과의 결과는 약 45개의 세포수와 2.5의 유주지수를 나타냈다. 50umolar의 RNS 펩티드 전처리 후 12시간 경과의 결과는 약 90개의 세포수와 1.3의 유주지수를 나타냈다. 50umolar의 BIO-11000 펩티드 전처리 후 12시간 경과의 결과는 약 70개의 세포수와 1.5의 유주지수를 나타냈다. 50umolar의 BIO-11006 펩티드 전처리 후 12시간 경과의 결과는 약 50개의 세포수와 2의 유주지수를 나타냈다. 이러한 결과는 높은 값의 유주지수는 작은 이동과 연관되고, 작은 이동은 높은 값의 유주지수와 연관된다는 사실을 의미한다. 각 MANS-관련 펩티드들, 즉 MANS, BIO-11000, 및 BIO-11006은 대조구 및 RNS 펩티드에 비하여 감소된 세포수 및 증가된 유주지수를 나타내었다.
도 10은 공격적인 사람 NSCLC 세포주(CL1-5)를 이용한 실험에서 100umolar의 펩티드를 처리한 결과, 각 세포수 및 유주지수를 나란히 나타낸 그래프이다. 펩티드를 처리하지 않은 대조구는 약 105개의 세포수와 1.0의 유주지수를 나타냈다. 프로토콜에 따라 100umolar의 MANS 펩티드 전처리 후 12시간 경과의 결과는 약 35개의 세포수와 3.5의 유주지수를 나타냈다. 100umolar의 RNS 펩티드 전처리 후 12시간 경과의 결과는 약 95개의 세포수와 1.2의 유주지수를 나타냈다. 100umolar의 BIO-11000 펩티드 전처리 후 12시간은 약 50개의 세포수와 2.3의 유주지수를 나타냈다. 100umolar의 BIO-11006 펩티드 전처리 후 12시간은 약 50개의 세포수와 약 2.1의 유주지수를 나타냈다. 100umolar의 BIO-91200 펩티드 전처리 후 12시간 경과의 결과는 약 55개의 세포수와 약 2.1의 유주지수를 나타냈다. 이러한 결과는 높은 값의 유주지수는 작은 이동과 연관되고, 작은 이동은 높은 값의 유주지수와 연관된다는 사실을 의미한다. 각 MANS-관련 펩티드들, 즉 MANS, BIO-11000, BIO-11006, 및 BIO-91200은 대조구 및 RNS 펩티드에 비하여 감소된 세포수 및 증가된 유주지수를 나타낸다.
동소 폐주사 제노그래프(orthotopic lung injection xenograph) 모델을 이용한 MANS 펩티드 또는 BIO-11006에 의한 폐암 전이의 억제
MANS 펩티드 또는 BIO-11006 처리 이후 생체내 암세포의 전이활성을 동소 폐주사 제노그래프(orthotopic lung injection xenograph) 모델을 이용하여 평가하였다. 100uM의 PBS, 또는 PBS + MANS, BIO-11006(서열번호 106), 또는 대조구 RNS 펩티드로 4시간 전처리한 후, PC-9 세포를 누드 마우스 폐의 좌엽(left lobe)에 주사하였다. 7일 후, 이들 마우스를 PBS(Con), RNS(추가의 대조구 펩티드), MANS 또는 BIO-11006 50nmole을 복강주사로 매 3일마다 1회 전신 처리하였다. 종양세포 접종 후 25일(6회 주사)째에, 마우스를 희생시키고 반대쪽 폐(contralateral lung) 및 다른 기관에서의 전이된 종양결절(tumor nudule)을 계수하였다. 하기 표 3에서 보듯이, MANS, RNS 또는 BIO-11006-처리구는 PBS-처리구나 서로 서로를 대비할 때 주사부위에서 종양의 평균 크기에서 차이가 없었는데, 이는 이들 처리가 종양형성(tumorigenesis)에 영향을 주지 않는다는 사실을 의미한다. 그러나, PBS- 또는 RNS-처리구와 대비하여 전이결절(metastatic nodule)의 의미있는 감소가 MANS 및 BIO-11006 처리 마우스의 반대편 폐 및 다른 기관에서 확인되었다; 실제로, MANS 또는 BIO-11006 펩티드는 다른 폐 부위나 다른 기관으로의 모든 전이를 종양으로부터 근본적으로 완전히 차단하였다.
생체 조건에서의 MARCKS-관련 펩티드의 암전이 억제효과

그 룹 		종양 크기
(mm) 		전이된 폐종양의 개수 전이 (영향받은 마우스/전체 마우스)
Mean ± SE Mean±SE
(L't; R't) 		심장 비장 장 횡경막
PBS (n=3) 1.50±0.26 1.67±0.29;
5.67±0.77		 1/1 2/3 1/3 2/3
RNS (n=4) 1.72±0.41 1.00±0.40;
5.75±0.01		 3/4 2/4 1/4 3/4
MANS (n=4) 1.48±0.54 0;0 0/4 0/4 0/4 0/4
BIO-11006 (n=2) 1.61±0.37 0;0 0/2 0/2 0/2 0/2
이러한 생체 조건에서의 실험결과는 MANS-관련 펩티드에 의한 MARCKS 기능의 억제가 생체 조건에서 폐 암세포의 전이를 감소시킨다는 사실을 지지한다.
A549 암 세포주의 이동에 대한 펩티드의 효과
사람 선암종(adenocarcinoma)-유도 폐포 상피세포주 A549(침습 세포주)를 미합중국 종균협회(ATCC)로부터 입수하여, 10% 우태아 혈청 및 100U/ml 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640의 75cm2 조직배양 플라스크에서 배양하였다. 세포는 37℃, 95% 대기 및 5% CO2 조건에서 배양 3일째 되는 날 꽉 차게 배양되었고, 계대로(by passage) 유지하였다.
시험 펩티드들(MANS, RNS, BIO-11006, BIO-11000, BIO-11002, BIO-91200 및 BIO-10901)을 pH 7.0의 PBS에 용해시키고, 용해도를 높이기 위해 천천히 2시간 동안 소용돌이를 일으켰다.
트랜스웰 플레이트(24-웰, 8-㎛ 공경(pore size); Costar, Cambridge, MA, USA)를 이동분석을 위해 사용하였다. 트랜스웰 플레이트의 하부 챔버를 600㎕의 10% FBS를 함유하는 기본배지로 채웠다. 세포(1 x 105)를 50 또는 100uM의 지정된 펩티드로 30분 동안 전처리하고, 1% BSA를 함유하는 100㎕의 기본배지에 현탁시켜 상부 챔버에 가한 다음, 세포를 37℃에서 12시간 동안, PBS(대조구), 또는 10, 25 또는 50uM의 지정된 펩티드에서 배양하였다. 여과지의 상부 표면에 있는 세포를 면봉으로 제거하고, 여과지의 하부 표면으로 이동한 세포를 세정하고, 고정하며, 헤마톡실린으로 염색하고, 현미경 하에서 계수하였다. 이동에 있어서 백분율 변화를 여과지의 하부 표면으로 이동한 세포수를 계수하여 측정하였다. 각 농도에서의 총 3회의 반복실험에서 막 당 최소한 4개의 분리된 부분이 현미경으로 관찰되었다. "Prizm"이라는 통계 소프트웨어가 데이타 분석에 사용되었다.
도 11에서 보듯이, 각 시험 펩티드의 처리는 대조구(펩티드 무처리) 또는 RNS 펩티드에 비하여 감소된 세포수를 나타내었다. 각 MANS-관련 펩티드(MANS, RNS, BIO-11006, BIO-11000, BIO-11002, BIO-91200, 및 BIO-10901)의 50uM 처리는 대조구 및 RNS 펩티드에 비하여 감소된 이동 세포수 및 증가된 유주지수를 나타냈다. 낮은 농도에서, 몇몇 MANS-관련 펩티드의 효과는 MANS 펩티드에 비하여 유의적으로 상이하였다. 특히, 25uM의 BIO-11006, BIO-11002, 또는 BIO-91200를 처리하면, 대조구(펩티드 무처리) 및 대조구 RNS 펩티드 뿐만 아니라 MANS 펩티드에 비하여 유의적으로 감소된 세포수를 나타내었다(도 11).
상술한 바를 종합하면, 본 실시예의 결과는 MANS-관련 펩티드가 공격적인 암 세포주의 이동을 차단하며, 몇몇 MANS-관련 펩티드는 최소한 3개의 서로 다른 암 세포주의 이동에 영향을 준다는 사실을 나타낸다. 상기 결과는 최소한 2개의 서로 다른 MANS-관련 펩티드로 포유동물에 주사된 암세포의 전이를 차단하거나 억제할 수 있다는 사실을 시사하였다.
폐암 이식에 있어서 BIO-11006 펩티드의 영향
본 실시예에서는 SCID 마우스에서의 동소 폐암 이식모델에서 BIO-11006 펩티드에 의한 폐암 전이억제를 평가하였다. 사람 선암종 세포(PC-9)(1-2 x 105)를 40㎕의 0.5mg/mL의 MatrigelTM(BD Bioscience)을 함유하는 PBS(pH 7.4)에 현탁시키고, SCID 마우스(n=3)의 왼쪽 폐에 29 게이지 니들이 장착된 시린지로 주사하였다. BIO-11006을 PBS 중 100uM 용액으로 암세포 접종 이후 3일째부터 22일간 하루 1회 복강내 주사(50㎕)하거나, 암세포 접종 이후 3일째부터 22일간 30분에 걸쳐 Nebulizer Delivery System(Aeroneb Lab)을 이용하여 에어졸 흡입시켰다. 도 12는 시험 화합물의 투여경로에 따른(복강내 주사 대 흡입) 좌측 폐, 우측 폐, 심장 및 횡경막에서의 마우스 당 평균 종양수를 나타낸다. BIO-11006의 복강내 주사와 흡입 모두 우측 폐, 심장에서 50% 이상, 횡경막에서는 100% 암세포 전이를 감소시켰다. 따라서, 두 가지 투여경로 모두 암세포 전이에 유의적인 억제효과를 나타내었다.
폐암 전이의 억제
본 실시예에서는 BIO-11006 펩티드에 의한 폐암 전이억제를 SCID 마우스에서의 동소 폐암 이식모델에서 평가하였다. 사람 선암종 세포(PC-9)(1-2 x 105)를 40㎕의 0.5mg/mL의 MatrigelTM(BD Bioscience)을 함유하는 PBS에 현탁시키고, SCID 마우스(n=3)의 왼쪽 폐에 29 게이지 니들이 장착된 시린지로 주사하였다. BIO-11006을 PBS 중 100uM 용액으로 Nebulizer Delivery System (Aeroneb Lab)을 이용하여 암세포 접종 이후 25일간 30분에 걸쳐 4일째 또는 15일째부터 에어졸 흡입으로 투여하였다. 실험이 종료될 무렵, 마우스를 희생시키고, 폐, 심장 및 횡경막 조직을 수득하여 각 조직의 종양결절의 수를 측정하였다. 이 실험의 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다. 도 13은 암세포 접종 이후 4일째부터 처리를 시작하였을 때, 좌측 폐, 심장 및 횡경막에서의 종양 전이가 60~90% 억제되고, 암세포 접종 이후 15일째부터 처리를 시작하였을 때, 폐, 심장 및 횡경막에서의 종양 전이가 약 50% 억제되었음을 나타낸다. 도 14는 암세포 접종 이후 15일째 또는 4일째부터 펩티드를 처리하였을 때, 모든 조직에서 발견되는 종양결절의 총 개수를 나타낸다. 도 14는 암세포 접종 이후 15일째부터 펩티드를 처리하였을 때 종양결절이 감소되고, 암세포 접종 이후 4일째부터 펩티드를 처리하였을 때 종양결절이 더욱 감소하는 것을 나타낸다.
펩티드의 항-전이 효능
본 실시예는 본 발명의 시험 화합물의 사람 폐 선암종을 가지는 SCID 마우스에 대한 항-전이 효능(anti-metastatic efficacy)을 입증한다. 우선, 개별 환기 케이지 속의 암컷 NOD.CB17-Prkdcscid/NCrHsd, Mus musculus 마우스(Harlan, The Netherlands)를 임의로 각 8마리씩 6개의 그룹으로 나누었다. 이어, A549 세포(2.5 x 106)를 꼬리 정맥을 통하여 마우스에 주사하였다. 에어졸화 담체(aerosolized vehicle)를 대조구로 하고; 제2 그룹과 제3 그룹은 에어졸화 시험 화합물 BIO-11006을 7주간 매일 네뷸라이저(nebulizer, Aeroneb Lab)를 이용하여 암세포 접종 이전 -1일(제2 그룹)부터 혹은 암세포 접종 이후 +3일(제3 그룹)부터의 주사 투여로 하였다. 제4그룹과 제5그룹은 에어졸화 시험 화합물 MANS 펩티드를 7주간 매일 네뷸라이저(Aeroneb Lab)를 이용하여 암세포 접종 이전 -1일(제4 그룹)부터 혹은 암세포 접종 이후 +3일(제5 그룹)부터의 주사 투여로 하였다. 에어로졸 전달을 위하여, 각 시험 화합물의 용액(100uM)을 PBS(pH 7.0)에 제조하고, 각 처리를 위해서 5mL의 시험 화합물 용액을 한번에 4마리의 마우스를 가지는 챔버에 30분에 걸쳐 에어로졸 분무하였다. 마우스의 체중을 7주간 매일 측정하였다.
마우스의 한 그룹(n=7)은 정상 대조구로 하였는데, 이들은 시험 기간동안 마우스의 건강 상태를 측정하는데 사용한 무처리 마우스이다. 모든 그룹의 동물은 53일째 희생시켰으며, 실험결과를 표 4와 도 15에 나타내었다. 도 15는 BIO-11006과 MANS 펩티드의 53일째 투여와 A549 세포주사 이후 폐에서의 전이결절의 수를 비교한 결과이다. 표 4는 폐에서의 전이결절의 개수뿐만 아니라, 국소 종양결절(focal tumor nodule) 및/또는 원격전이(distant metastasis)를 가지는 동물의 수를 나타낸다. 총체적으로 볼 때, 시험 펩티드는 A549 세포 주사에 비하여 -1일째 또는 +3일째부터 BIO-11006 또는 MANS 펩티드를 투여한 동물에서 종양 전이를 대체적으로 억제하였다(70-80%) (도 15). 더욱이, 처리 마우스에서의 종양결절의 수는 담체 대조구에 비하여 유의적 감소를 나타내었고, 처리 마우스 어느 것도 원격전이의 증거를 보이지 않았다(표 4). A549 세포 주사에 비하여 -1일째 또는 +3일째부터 BIO-11006 또는 MANS 펩티드를 투여한 마우스의 7/8에서 국소 종양결절이 발견되었다.
BIO-11006 또는 MANS를 처리한 마우스에서의 전이결절 및 원격전이
그 룹 폐에서의 전이결절 개수
Mean ± SEM 		비 고

담체 대조구
97±21		 전체 동물에서의 다 병소(multi-focal)
종양결절(8/8)
횡경막과 흉골(sternum)에서의 원격전이(2/8)
BIO -11006 펩티드
(-1일 처리구 )
34±14		 7/8 동물에서의 일부 병소 종양결절
원격전이 없음
BIO -11006 펩티드
(+3일 처리구 )
21±6		 7/8 동물에서의 일부 병소 종양결절
원격전이 없음
MANS 펩티드
(-1일 처리구 )
22±7		 4/8 동물에서의 일부 병소 종양결절
원격전이 없음
MANS 펩티드
(+3일 처리구 )
13±4		 7/8 동물에서의 일부 병소 종양결절
원격전이 없음
MANS-관련 펩티드의 마우스 흑색종에서의 항-전이 활성
본 실시예에서는 4개의 서로 다른 경로로 투여된 MANS-관련 펩티드의 상대적 항-전이활성을 동계(syngeneic) 마우스 모델을 이용하여 측정하였다. DMEM 배지 중 마우스 흑색종 세포주 B16F10 2 x 106의 200㎕ 세포 현탁액을 발바닥 또는 귀의 등쪽 피부와 연골사이에 주사하거나; 또는, 정맥내, 근육내, 또는 복강내 주사하였다.
세포 접종후 2일째, 동물들을 각 그룹 당 개체수 10으로 임의 분할하였다. 서로 다른 그룹의 동물에 MANS-관련 펩티드를 복강내(ip), 정맥내(iv), 또는 근육내(im)로 약 6.25mg/kg의 용량으로 투여하였다. 일부 그룹에서는, 전임상 분무기(preclinical nebulizer, Aeroneb Lab; Aerogen)를 이용하여 흡입 경로로 동물을 처리하였다(5ml의 PBS 중 0.1mM MANS-관련 펩티드). 1개 그룹은 담체 대조구(vehicle control)로 하고, 근육내로 PBS를 처리하였다. 펩티드는 6주에 걸쳐 하루 걸러 한번씩 투여하였다.
종양 점수(tumor scoring)는 매주 행하였다. 6주간 처리후, 모든 동물들을 인도적으로 희생시키고 림프 노드 및 다른 조직 시료를 수집하여, 포르말린에 고정시키고 전이성 흑생종 세포의 존재를 평가하기 위하여 조직병리학적 관찰을 행하였다. 임상적 독성 사인(clinical toxic sign)과 증세는 6주 투여 후에 평가하였다. 종양의 크기와 사망개체수는 실험기간의 끝무렵 평가하였다. 본 실시예의 결과는 MANS-관련 펩티드는 마우스 흑색종 모델에서 종양의 전이를 억제함을 나타내었다.
암세포에서의 MARCKS의 siRNA 넉다운
본 실시예는 암세포의 이동에 대한 MARCKS 발현의 siRNA 넉다운의 영향을 알아보기 위하여 수행되었다. PC-9 또는 A-549 사람 폐 암세포를 플라스틱제 웰에 접종하고, 세포가 70%를 채울 때까지 배양하였다. 그런 다음, 세포를 Ambion(Austin, TX)으로부터 입수한 100nM MARCKS siRNA 또는 대조구 siRNA(100nM)로 DharmaFECT DuoTransfection 시약(Dharmacon, Lafayette, CO)을 이용하여 형질도입시켰다. 72시간이 경과한 후, 세포를 수집하고 MARCKS 특이 항체를 이용한 면역블롯 분석을 위하여 SDS/PAGE로 분리하였다. 내생 MARCKS의 siRNA-유도 하향조절(down regulation)을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. 도 16 및 도 17에서 보듯이, MARCKS 단백질은 대조구 siRNA로 처리한 세포와 대비하여, kfid PC9 세포에서 거의 60%(도 16), A549 세포에서 거의 50%(도 17) 넉다운되었다.
세포이동에 대한 siRNA에 의한 MARCKS 넉다운의 효과를 트랜스웰 분석(transwell assay)에 의하여 확인하였다. siRNA 넉다운에 이어, PC-9 또는 A549 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건하에 배양하였다. 이동분석을 위해 Transwell® 플레이트(24-웰, 8-㎛ 공경)를 사용하였다. 하부 챔버는 600㎕ 기본 배지 + 10% FBS를 함유하였다. 세포(1 x 105)를 100㎕ 기본 배지 + 1% BSA에 현탁시켜 상부 챔버에 가하고; 플레이트를 12시간 배양하였다. 여과막의 하부면으로 이동하는 세포를 헤막토실린으로 염색하고 계수하였다. 막 1개당 최소 3개의 분리된 부분이 현미경으로 관찰되었다.
본 실시예의 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다. MARCKS siRNA의 처리는 PC-9 및 A549 세포 둘 다의 이동을 유의적으로 억제하였다. MARCKS의 siRNA 넉다운은 PC9 세포주의 세포이동을 90% 감소시켰고(도 18), A549 세포주의 세포이동을 거의 50% 감소시켰다(도 19). 따라서, MARCKS 발현의 억제는 암세포의 이동을 유의적으로 감소시키는 결과를 가져왔다.
microRNA21의 억제는 암세포의 이동을 증가시킨다.
MicroRNA 21(miR21)은 세포에서 MARCKS의 수준을 조절한다. 본 실시예에서는 PC9 사람의 폐 암세포를 50nM 또는 100nM의 miR21 억제제 또는 miR21 유사체, 또는 담체만의 음성 대조구로 형질도입하였다. MARCKS의 수준을 웨스턴 블롯에 의해 48시간 후에 측정하였다. 50nM miR21 억제제의 처리는 세포에서 약 2.5배 만큼 MARCKS의 수준을 증가시켰다(도 20). 이러한 값은 12시간 동안 이동 챔버(migration chamber)에 위치시켰을때 세포의 이동능력(migration capability)과 일치하였다. 50nM 또는 100nM의 miR21 억제제로 세포를 처리하면, MARCKS 수준의 증가와 상관되어 이동이 증가되는 반면, 세포를 miR21 유사체로 처리하면 MARCKS 수준의 감소와 상관되어 이동이 감소하였다(도 21). 세포를 HiPerfect 담체 대조구로 처리하면, 처리하지 않은 PC9 세포와 비교하여 같은 수준의 이동을 나타내었다(도 21). 본 실시예의 결과는 miR21 억제를 통한 MARCKS 발현의 증가는 암세포의 이동을 증가시킴을 나타낸다. 또한, miR21의 활성화는 PC9 세포의 이동을 감소시켰다.
이들 결과를 종합하면, 본 실시예는 암세포의 이동, 암세포의 전이는 MANS-관련 펩티드 및 억제 microRNA(즉, miR21 유사체)를 포함하는 서로 다른 MARCKS 억제 수단을 이용하여 MARCKS를 표적으로 하여 억제할 수 있음을 나타낸다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서의 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 상응하는 어떠한 방법 및 재료도 본 발명을 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료가 본 명세서에 기술되었다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물이 상기 간행물이 언급된 본 발명의 특이적 측면을 개시하고 설명하기 위한 목적으로, 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
이상 본 발명을 그들의 특이적인 실시태양에 의해 기술하였으나, 더욱 변형이 가능하고, 이러한 응용은, 일반적으로, 발명의 원리를 따르고, 본 발명이 속하는 기술분야 내의 공지되거나 통상적인 실시범위 내 및 상술하고 첨부된 특허청구범위의 범주 내의 기본적인 특징에 응용될 수 있는 것과 같이 본 명세서의 개시로부터 출발하는 어떠한 변형, 이용, 또는 본 발명의 적용을 망라하는 것으로 이해될 것이다.
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Gly 1 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 1 5 10 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala 1 5 10 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala 1 5 10 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 <210> 98 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 1 5 10 <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 1 5 10 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 1 5 10 <210> 102 <211> 11 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Gly Glu 1 5 <210> 142 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala 1 5 <210> 143 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala 1 5 <210> 144 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala 1 5 <210> 145 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 <210> 146 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 1 5 <210> 147 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro 1 5 <210> 148 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly 1 5 <210> 149 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu 1 5 <210> 150 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala 1 5 <210> 151 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala 1 5 <210> 152 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 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<213> Homo sapiens <400> 211 Gly Ala Gln Phe 1 <210> 212 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Ala Gln Phe Ser 1 <210> 213 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 213 Gln Phe Ser Lys 1 <210> 214 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 214 Phe Ser Lys Thr 1 <210> 215 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 215 Ser Lys Thr Ala 1 <210> 216 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 216 Lys Thr Ala Ala 1 <210> 217 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 217 Thr Ala Ala Lys 1 <210> 218 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 218 Ala Ala Lys Gly 1 <210> 219 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 219 Ala Lys Gly Glu 1 <210> 220 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220 Lys Gly Glu Ala 1 <210> 221 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221 Gly Glu Ala Ala 1 <210> 222 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 222 Glu Ala Ala Ala 1 <210> 223 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 223 Ala Ala Ala Glu 1 <210> 224 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 224 Ala Ala Glu Arg 1 <210> 225 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 225 Ala Glu Arg Pro 1 <210> 226 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 226 Glu Arg Pro Gly 1 <210> 227 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Arg Pro Gly Glu 1 <210> 228 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 228 Pro Gly Glu Ala 1 <210> 229 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 229 Gly Glu Ala Ala 1 <210> 230 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 230 Glu Ala Ala Val 1 <210> 231 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 231 Ala Ala Val Ala 1 <210> 232 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNS missense control peptide <400> 232 Gly Thr Ala Pro Ala Ala Glu Gly Ala Gly Ala Glu Val Lys Arg Ala 1 5 10 15 Ser Ala Glu Ala Lys Gln Ala Phe 20 <210> 233 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RNS2 missense control peptide <400> 233 Gly Lys Ala Ser Gln Phe Ala Lys Thr Ala 1 5 10 <210> 234 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated MANS peptide fragment <400> 234 Arg Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 235 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated MANS peptide fragment <400> 235 Arg Ala Lys Gly Glu 1 5

Claims (37)

  1. MARCKS 단백질(미리스토일화 알라닌-풍부 C-키나제 기질, Myristoylated Alanine-Rich C-Kinase Substrate)-억제 화합물을 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물에 있어서,
    상기 MARCKS 단백질-억제 화합물은 서열번호 106, 121, 219 및 234로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열을 가지는 펩티드이고,
    상기 암은 고형 암인 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드의 N-말단 아미노산은 직쇄형(linear), 분지형(branched), 포화, 또는 불포화 C2(아세틸)~C24 지방족 카복실산의 아미드, 트리플루오르아세트산의 아미드, 벤조산의 아미드, 또는 C1~C24 지방족 알킬술폰산의 아미드 형태로 아실화(acylation)되거나; 또는,
    상기 펩티드의 N-말단 아미노산의 N-말단 아민기가 C1~C24 지방족 알킬기, 직쇄형 2-(C1~C24 지방족 알킬)옥시에틸기, 또는 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸기(n은 0 내지 10)로 알킬화(alkylation)되는 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    N-말단 아미드는 아세틸 또는 미리스토일기인 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    펩티드 용액 또는 현탁액의 흡입, 또는 건조분말 제제의 흡입에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    펩티드 액상 제제의 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    개체에 정맥내, 근육내, 복강내 주사, 또는 경구 또는 좌약에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서,
    상기 고형 암은 폐암인 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드는 0.01mg/kg/day 내지 10mg/kg/day의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드는 0.5mg/kg/day 내지 2.5mg/kg/day의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제1항에 있어서,
    암세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제1항에 있어서,
    암의 치료에 유용한 부가적인 약물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 제25항에 있어서,
    상기 부가적인 약물은 화학요법 약물인 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 화학요법 약물은 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 젬시타빈(gemcitabine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시타라빈(cytarabine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 히드록시유레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아니딘(thioguanadine), 다우노루비신(daunorubicin), 독스루비신(doxurubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포시드(etoposide), 에니포시드(eniposide), 콜히친(colchicine), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 파클리탁셀(paclitaxel), 및 도세탁셀(docetaxel)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  37. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드는 Ac-GAQFSKTAAK-OH (서열번호 106), Ma-GAQFSKTAAK-OH (서열번호 106), Ma-GAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 106), Ac-RGAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 234), Ac-GAQFSKTAA-OH (서열번호 121), Ma-RGAQFSKTAAK-NH2 (서열번호 234), 및 Ma-AKGE-OH (서열번호 219)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    암의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
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