ES2714863T3 - Péptidos del inhibidor de MARCKS para la inhibición de metástasis - Google Patents

Péptidos del inhibidor de MARCKS para la inhibición de metástasis Download PDF

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Abstract

Un compuesto inhibidor de MARCKS para usar en un método para inhibir la metástasis de células cancerosas, en el que el compuesto inhibidor de MARCKS es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 231, la SEQ ID NO: 234, y SEQ ID NO: 235; en el que el aminoácido N-terminal y/o de terminal C de la secuencia peptídica se modifica químicamente

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos del inhibidor de MARCKS para la inhibición de metástasis
Campo de la invención
Esta invención se refiere a péptidos, para uso en la inhibición de la metástasis de células cancerosas.
Descripción del archivo de texto presentado electrónicamente
Los contenidos del archivo de texto enviado electrónicamente se incluyen en este documento como referencia en su totalidad: Una copia en formato legible por ordenador del Listado de Secuencias (nombre de archivo: BMRK_006_01WO_SubSeqList_ST25.txt, fecha registrada: 12 de mayo de 2014, tamaño de archivo 58 kilobytes). Antecedentes de la invención
La proteína MARCKS (Sustrato de quinasa C rica en alanina miristoilada) es un objetivo de fosforilación ubicuo de la proteína quinasa C (PKC) (Li et al., Journal of Biological Chemistry 276; 40982 (2002)). La MARCKS tiene tres regiones conservadas evolutivamente (Aderem et al., Nature 1988; 332: 362-364; Thelen et al., Nature 1991; 351: 320-322; Hartwig et al., Nature 1992; 356: 618-622; Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271: 18797-18802): un terminal N, un dominio de sitio de fosforilación (o PSD; también conocido como dominio efector) y un dominio de homología múltiple 2 (MH2). El términal N, una secuencia de alfa-aminoácidos que comprende 24 residuos de aminoácidos con una fracción de ácido mirístico unido a través de un enlace amida al residuo de glicina terminal N, está involucrado en la unión de MARCKS a membranas en células (Seykora et al., J Biol Chem 1996; 271: 18797­ 18802) y posiblemente a calmodulina (Matsubara et al., J Biol Chem 2003; 278: 48898-48902). Esta secuencia de 24 aminoácidos se conoce como el péptido MANS. El péptido MANS y los péptidos relacionados se divulgan en la patente de EE.UU. Números 7,265,088; 7,529,926; 7,544,772; 8,492,518; 8,501,911; 7,918,293,870; y 8,563,689. Rombouts et al (Cancer Letters vol 333, no. 2, 29 January 2013) enseñan que la inhibición de la expresión de MARKS reduce la migración de las células cancerosas de colón humanas en vitro.
Subsiste la necesidad en la técnica de terapias nuevas y seguras dirigidas a inhibir la metástasis de células cancerosas. La presente invención aborda estas y otras necesidades.
Breve resumen de la invención.
Se describen en este documento métodos y composiciones útiles para prevenir o tratar cáncer. Se describen métodos y composiciones para inhibir la metástasis de células cancerosas, proliferación de células cancerosas, crecimiento de tumor, o angiogénesis. Se describen métodos y composiciones para prevenir e inhibir la metástasis de células cancerosas, proliferación de células cancerosas, crecimiento de tumor, o angiogénesis, que comprenden la inhibición de sustrato de quinasa C rica en alanina miristoilada (MARCKS). Las composiciones comprenden compuestos inhibidores de MARCKS que incluyen péptidos, polipéptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, y moléculas de ácido nucleico tales como polinucleótidos antisentido, aptámeros, ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN micro (ARNmi), y ARN de horquilla corta (ARNhc). Las “moléculas de ácido nucleico inhibidoras de MARCKS” como se utiliza en este documento se refieren a polinucleótidos o moléculas de ácido nucleico tales como ARNip, ARNmi, ARNhc, o polinucleótidos antisentido, que reducen la expresión y/o función de MARCKS. Las composiciones descritas en este documento pueden comprender uno o más péptidos relacionados con MARCKS. Los péptidos relacionados con MARCKS corresponden al dominio MH2 de MARCKS. Los péptidos pueden ser péptidos relacionados con secuencia de terminal N miristoiladas (péptido MANS, que es un fragmento de 24 aminoácidos de MARCKS) (es decir, “péptidos relacionados con MANS”). Los péptidos relacionados con MANS se seleccionan del grupo que consiste de: péptido MANS; fragmentos no sustituidos de MANS que contienen cuatro o más aminoácidos y que comprenden la misma secuencia encontrada en la secuencia de aminoácidos de terminal N en el péptido MANS; los péptidos comprenden una secuencia sustancialmente idéntica a la secuencia encontrada en el péptido MANS o fragmento de péptido MANS; péptido MANS o fragmentos de péptido MANS con la secuencia de aminoácidos idéntica o sustancialmente idéntica como el péptido MANS que son terminales N miristoilados o terminales N acilados con, por ejemplo, un grupo acetilo; y el péptido MANS o fragmentos de péptido MANS con la secuencia de aminoácidos idéntica o sustancialmente idéntica como el péptido MANS que se modifican químicamente en el terminal C. Los péptidos relacionados con MANS pueden ser modificados químicamente tanto en el terminal C como en el terminal N. Los compuestos inhibidores de MARCKS descritos en este documento pueden ser anticuerpos o fragmentos de los mismos. El anticuerpo o fragmento del mismo inhibe las funciones de la proteína MARCKS. El anticuerpo o fragmento del mismo se une al terminal N de la proteína MARCKS o la secuencia MH2 de la proteína MARCKS. Encontramos de forma sorprendente que el uso de diferentes tipos de compuestos inhibidores de MARCKS exhibe un efecto inhibidor sobre la migración de células cancerosas in vitro e inhibe la metástasis in vivo. Los compuestos inhibidores de MARCKS exhiben un efecto inhibidor sobre la migración de estirpes celulares cancerosas agresivas. Los compuestos inhibidores de MARCKS descritos en este documento inhiben la metástasis de células cancerosas en un tumor en un mamífero. El tumor puede ser un tumor sólido. El tumor puede ser un tumor no sólido. Los compuestos inhibidores de MARCKS proporcionados en este documento inhiben la metástasis de células cancerosas asociadas con un linfoma o leucemia.
Los compuestos inhibidores de MARCKS pueden comprender polinucleótidos inhibidores de MARCKS o moléculas de ácido nucleico inhibidoras de MARCKS. Los compuestos inhibidores de MARCKS descritos en este documento pueden ser polinucleótidos de ARN antisentido, ARNip, ARNhc, o ARNmicro que inhiben la expresión y/o función de MARCKS. Los compuestos inhibidores de MARCKS descritos en este documento pueden ser imitadores de proteínas o polinucleótidos que regulan la Expresión de MARCKS, tales como imitadores de miR21.
Los compuestos inhibidores de MARKS descritos en este documento pueden ser péptidos relacionados con MARCKS o relacionados con MANS. Los péptidos relacionados con MARCKS descritos en este documento pueden corresponder al dominio miristoilado de terminal N de MARCKS. Por lo tanto, los péptidos relacionados con MARCKS descritos en este documento pueden ser péptidos relacionados con MANS. Los péptidos relacionados con MANS y ciertos péptidos relacionados con MANS modificados químicamente descritos en este documento pueden bloquear la migración de estirpes celulares cancerosas agresivas. Los péptidos relacionados con MANS descritos en este documento se pueden utilizar para ejercer un efecto inhibidor sobre la metástasis de células cancerosas. Los compuestos inhibidores de MARCKs descritos en este documento pueden exhibir efectos de bloqueo sobre la metástasis de células cancerosas in vivo. Los sitios de inhibición de enfermedad metastásica incluyen por lo menos tejido pulmonar, tejido cardíaco, tejido del bazo, tejido intestinal y tejido del diafragma. Los péptidos relacionados con MANS descritos en este documento se pueden utilizar para tratar o prevenir la metástasis de células cancerosas, proliferación de células cancerosas, crecimiento de células de tumor, o angiogénesis.
Se describen en este documento composiciones y métodos para tratar o prevenir cáncer que comprende la administración de un compuesto inhibidor de MARCKS a una célula cancerosa o a una célula que cumple una función en el desarrollo, mantenimiento, proliferación, o metástasis de células cancerosas. Se describe un método en este documento para inhibir la metástasis de una célula cancerosa que comprende la administración a la célula cancerosa de una cantidad que inhibe la metástasis de un compuesto inhibidor de MARCKS. Se describe un método en este documento para inhibir la metástasis de una célula cancerosa que comprende la administración a la célula cancerosa de una cantidad que inhibe la metástasis de un péptido relacionado con MANS.
En un aspecto de la invención se proporciona un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método para inhibir la metástasis de una célula cancerosa, en la que el compuesto inhibidor de MARCKS es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 231 (inclusive), SEQ ID NO: 234, y SEQ ID NO: 235; en la que el aminoácido de terminal N y/o terminal C de la secuencia de péptidos se modifica químicamente.
Se describe en este documento un método para tratar cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido relacionado con MANS. También descrito en este documento se proporciona un método para tratar cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 231 (inclusive), SEQ ID NO: 234, y SEQ ID NO: 235; en la que el aminoácido de terminal N y/o terminal C de la secuencia de péptidos opcionalmente se modifica químicamente.
En una realización de la presente invención, el aminoácido de terminal N del péptido se modifica químicamente mediante la acilación del aminoácido de terminal N del péptido en la forma de una amida seleccionada del grupo que consiste de:
• una amida de un ácido carboxílico C2 (acetil) a C24 alifático que puede ser lineal, ramificada, saturada, o insaturada, • una amida de ácido trifluoroacético,
• una amida de ácido benzoico, y
• una amida de un ácido alquil sulfónico alifático C1 a C24; o
• el grupo amina de terminal N del aminoácido de terminal N del péptido se puede alquilar con un grupo seleccionado del grupo que consiste de:
• un grupo alquilo C1 a C24 alifático,
• un grupo 2-(alquilo C1 a C24 alifático)oxietilo lineal,
• un grupo omega-metoxi-pol¡(et¡lenoox¡)n-et¡lo, en el que n es desde 0 hasta 10.
En una realización adicional de la presente invención, la amida de terminal N se selecciona del grupo que consiste de acetilo y miristoilo.
En otra realización de la presente invención, el aminoácido de terminal C del péptido se modifica químicamente mediante la formación de amida en el grupo de ácido carboxílico de terminal C del aminoácido de terminal C del péptido en la forma de una amida seleccionada del grupo que consiste de:
• una amida de amoniaco,
• una amida de una alquil amina Ci a C24 alifática,
• una amida de una alquil amina C2 a C24 alifática sustituida con hidroxilo,
• una amida de un grupo (alquilo C1 a C24 alifát¡co)ox¡etilam¡na lineal, y
• una amida de un grupo omega-metoxi-pol¡(et¡lenoox¡)n-et¡lam¡na, en el que n es desde 0 hasta 10.
En una realización de la presente invención, el péptido se selecciona del grupo que consiste de N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO: 1); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID No: 2); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID No: 4); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID No: 7); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID No: 11); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID No: 16); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID No: 22); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID No: 29); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID No: 37); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID No: 46); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID No: 56); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID No: 67); N-miristoil-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID No: 79); N-miristoil-GAQFSKTAAKG (SEQ ID No: 92); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106); N-miristoil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121); N-miristoil-GAQFSKTA (SEQ ID No: 137); N-miristoil-GAQFSKT (SEQ ID No: 154); N-miristoil-GAQFSK (SEQ ID No: 172), N-miristoil-GAQFS (SEQ ID No: 191), N-miristoil- GAQF (SEQ ID No: 211), N-acetil-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234), N-acetil-RGAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 234), N-acetil-RAKGE (SEQ ID NO: 235), y una combinación de los mismos.
En una realización, el péptido se selecciona del grupo que consiste de N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106); N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219); N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106); N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 121); y N-acetil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106). En una realización, ciertos aminoácidos están presentes en la configuración d. Por ejemplo, en una realización, el péptido es N-acetil-GAQFS(d)KTAA(d)K (SEQ ID NO: 106), en el que la lisina (K) en las posiciones 6 y 10 del péptido son de configuración d.
Los péptidos relacionados con MANS exhiben propiedades que los hacen adecuados para uso en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres. Por ejemplo, en una realización, ciertos péptidos relacionados con MANS divulgados en este documento exhiben solubilidad mejorada en relación con el péptido o péptidos MANS diferentes de los péptidos relacionados con MANS. En otra realización, ciertos péptidos relacionados con MANS proporcionados en este documento exhiben vidas medias más largas en plasma que el péptido o péptidos MANS diferentes de los péptidos relacionados con MANS.
El péptido relacionado con MARCKS exhibe migración reducida de células cancerosas. Por ejemplo, en una realización, el tratamiento previo de células cancerosas con un péptido relacionado con MANS (por ejemplo, N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106); N-miristoil- AKGE (SEQ ID No: 219); N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106); N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 121); y N-acetil-GAQFSKTAAK- NH2 (SEQ ID No: 106)) puede reducir la migración de las células cancerosas cuando las células se pretratan con desde aproximadamente 10 pm de péptido hasta aproximadamente 200 pm de péptido; o se pretratan con desde aproximadamente 20 pm hasta aproximadamente 200 pm; o se pretratan con desde aproximadamente 25 pm de péptido hasta aproximadamente 75 pm de péptido. En una realización, el péptido relacionado con MARCKS exhibe migración reducida de células cancerosas cuando se administra a concentraciones de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 pM, aproximadamente 5 pM a aproximadamente 250 pM, o aproximadamente 10 pM a aproximadamente 200 pM. En una realización, el péptido relacionado con MARCKs exhibe migración reducida de células cancerosas cuando se administra a concentraciones de aproximadamente 1 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 25 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente 200 pM, o aproximadamente 500 pM. En una realización, las células cancerosas se tratan con el péptido in vitro para determinar los efectos del péptido. En una realización, las células cancerosas se derivan de un paciente. En una realización adicional, las células cancerosas se tratan con el péptido in vitro para determinar si el paciente es probable que responda al tratamiento con el péptido.
En una realización, el péptido relacionado con MARCKS exhibe metástasis reducida de células cancerosas cuando se administra a un paciente a concentraciones de aproximadamente 0.01 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/día. En una realización adicional, el péptido relacionado con MARCKS exhibe metástasis reducida de células cancerosas cuando se administra a un paciente a concentraciones de aproximadamente 0.1 mg/kg/día a aproximadamente 5.0 mg/kg/día. En aún una realización adicional, el péptido relacionado con MARCKS exhibe metástasis reducida de células cancerosas cuando se administra a un paciente a concentraciones de aproximadamente 0.5 mg/kg/día a aproximadamente 2.5 mg/kg/día. Por ejemplo, el péptido relacionado con MARCKS exhibe migración reducida de células cancerosas cuando se administra a un paciente a concentraciones de aproximadamente 0.01, aproximadamente 0.05, aproximadamente 0.1, aproximadamente 0.5, aproximadamente 0.75, aproximadamente 1.0, aproximadamente 1.25, aproximadamente 1.5, aproximadamente 1.75, aproximadamente 2.0, aproximadamente 2.25, aproximadamente 2.5, aproximadamente 2.75, aproximadamente 3.0, aproximadamente 3.5, aproximadamente 4.0, aproximadamente 5.0, aproximadamente 6.0, aproximadamente 7.0, aproximadamente 8.0, aproximadamente 9.0, aproximadamente 10.0, o más mg/kg/día.
En una realización, el péptido se administra mediante inhalación de una solución o suspensión líquida, o mediante inhalación de una formulación de polvo seco del péptido. En otra realización, el péptido se administra mediante inyección de una formulación o suspensión líquida del péptido. En una realización adicional, la inyección está en una región de tumor primaria, en la que la región contiene la célula cancerosa. En una realización adicional, la célula cancerosa reside en un tumor en un mamífero. En una realización, el tumor es un tumor sólido. En otra realización, el tumor es un tumor no sólido. En una realización, los compuestos inhibidores de MARCKS proporcionados en este documento inhiben la metástasis de células cancerosas asociadas con un linfoma o leucemia. En otra realización, la formulación líquida es isotónica. En otra realización, la formulación líquida es tamponada.
En una realización, la cantidad que inhibe metástasis del péptido está en el rango desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 100 micromoles por mililitro. En una realización adicional, la cantidad que inhibe metástasis del péptido está en el rango desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 micromoles por mililitro. En otra realización, el péptido está en una formulación que comprende un fármaco adicional útil en el tratamiento de cáncer, o se formula para administración con un fármaco adicional.
Se describe en este documento un método para tratar o prevenir cáncer o inhibir metástasis de una célula cancerosa en un mamífero, en la que el método comprende administrar a dicho mamífero un compuesto inhibidor de MARCKS. El compuesto inhibidor de MARCKS puede ser un polinucleótido o molécula de ácido nucleico que reduce la expresión o actividad de MARCKS. El polinucleótido inhibidor de MARCKS puede ser un ARN antisentido, ARNip, ARNhc, o ARNmi. El polinucleótido inhibidor de MARCKS se puede administrar en una cantidad desde aproximadamente 10 nM hasta 10 pM, o desde aproximadamente 20 nM hasta aproximadamente 500 nM, o desde aproximadamente 30 nM hasta aproximadamente 300 nM, o desde aproximadamente 40 nM hasta aproximadamente 200 nM, o desde aproximadamente 50 nM hasta aproximadamente 100 nM. El polinucleótido inhibidor de MARCKS puede ser un imitador de un ARNmi que regula la expresión de MARCKS. Por ejemplo, el polinucleótido inhibidor de MARCKS es un imitador de miR21. Los polinucleótidos y moléculas de ácido nucleico se pueden administrar juntos con un agente de suministro tal como un péptido, proteína, lípido, esterol, polímero, reactivo de transfección, o cualquier agente de suministro de polinucleótido o ácido nucleico conocido en la técnica.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un péptido para uso en un método para inhibir la metástasis de una célula cancerosa en un mamífero, en la que el método comprende administrar a dicho mamífero un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1 a la SeQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 234, y SEQ ID NO: 235; en la que el aminoácido de terminal N y/o terminal C de la secuencia de péptidos se modifica químicamente, y en la que dicho péptido exhibe un índice de migración de por lo menos aproximadamente 2.0 luego del tratamiento previo de células de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) con una concentración de 100 pmol de dicho péptido y un periodo de migración de 12 horas. El péptido puede exhibir un índice de migración de por lo menos aproximadamente 1.5, por lo menos aproximadamente 1.6, por lo menos aproximadamente 1.7, por lo menos aproximadamente 1.8, por lo menos aproximadamente 1.9, por lo menos aproximadamente 2.0, por lo menos aproximadamente 2.1, por lo menos aproximadamente 2.2, por lo menos aproximadamente 2.3, por lo menos aproximadamente 2.4, por lo menos aproximadamente 2.5, por lo menos aproximadamente 2.6, por lo menos aproximadamente 2.7, por lo menos aproximadamente 2.8 por lo menos aproximadamente 2.9, por lo menos aproximadamente 3.0, o más, luego del tratamiento previo de células de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En una realización adicional, el péptido relacionado con MANS está presente en una concentración de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, o 200 pmolar de dicho péptido. En otra realización, el periodo de migración es de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 15, 20, 21, 22, 23, o 24 horas. En una realización, el péptido relacionado con MANS exhibe un índice de migración de por lo menos aproximadamente 1.5 luego del tratamiento previo de células NSCLC con una concentración de 50 pmolar de dicho péptido y un periodo de migración de aproximadamente 12 horas. En otra realización, el péptido relacionado con MANS exhibe un índice de migración de por lo menos aproximadamente 2.0 luego del tratamiento previo de células NSCLC con una concentración de por lo menos aproximadamente 100 pmolar de dicho péptido y un periodo de migración de aproximadamente 12 horas.
El péptido se puede administrar al sujeto en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/día. El péptido relacionado con MANS se puede administrar a concentraciones de aproximadamente 0.1 mg/kg/día a aproximadamente 5.0 mg/kg/día. En aún una realización adicional, el péptido relacionado con MANS se puede administrar a concentraciones de aproximadamente 0.5 mg/kg/día a aproximadamente 2.5 mg/kg/día. Por ejemplo, el péptido relacionado con MANS se administra en una dosis de aproximadamente 0.01, aproximadamente 0.05, aproximadamente 0.1, aproximadamente 0.5, aproximadamente 0.75, aproximadamente 1.0, aproximadamente 1.25, aproximadamente 1.5, aproximadamente 1.75, aproximadamente 2.0, aproximadamente 2.25, aproximadamente 2.5, aproximadamente 2.75, aproximadamente 3.0, aproximadamente 3.5, aproximadamente 4.0, aproximadamente 5.0, aproximadamente 6.0, aproximadamente 7.0, aproximadamente 8.0, aproximadamente 9.0, aproximadamente 10.0, o más mg/kg/día para el tratamiento o prevención de cáncer que incluye inhibir la metástasis de cáncer.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 presenta un campo de recuento de células de un control negativo después de un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 2A presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 50 amolar de péptido MANS seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 2B presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 100 pmolar de péptido MANS seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 3A presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 50 pmolar de péptido RNS seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 3B presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 100 pmolar de péptido RNS seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 4A presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 50 pmolar de péptido relacionado con MANS N-miristoil- GAQFSKTAAK-NH2 (s Eq ID No: 106) seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 4B presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 100 pmolar de péptido relacionado con Ma Ns N-miristoil- GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106 seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 5A presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 50 pmolar de péptido relacionado con MANS SEQ ID NO: 121) seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 5B presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 100 pmolar de péptido relacionado con MANS SEQ ID NO: 121) seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 6A presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 50 pmolar de péptido relacionado con MANS N-miristoil- AKGE (SEQ ID No: 219) seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 6B presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 100 pmolar de péptido relacionado con MANS N-miristoil- AKGE (SEQ ID No: 219) seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 7A presenta gráficamente los números de células migradas obtenidos 12 horas después del tratamiento previo a 50 pmolar con el péptido MANS, N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106), N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121), N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219), o péptido RNS, o sin péptido (control).
La Figura 7B presenta gráficamente los números de células migradas obtenidos 12 horas después del tratamiento previo a 100 pmolar con el péptido MANS, N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106), N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121), N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219), o péptido RNS, o sin péptido (control).
La Figura 8A presenta gráficamente el índice de migración de células de la estirpe celular del NSCLC humano agresivo, en el que un valor alto del índice de migración significa menor migración después del tratamiento previo con los péptidos de la invención a 50 pmolar seguido por 12 horas de tratamiento de acuerdo con el protocolo. La Figura 8B presenta gráficamente el índice de migración de células de la estirpe celular del NSCLC humano agresivo, en el que un valor alto del índice de migración significa menor migración después del tratamiento previo con los péptidos de la invención a 100 pmolar seguido por 12 horas de tratamiento de acuerdo con el protocolo. La Figura 9 presenta gráficamente los números de células respectivos (panel izquierdo) y el número de índice de migración (panel derecho) para MANS, RNS, N-miristoil-GAQFSKTAAK (SeQ ID No: 106), o N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106), o control (sin péptido) en experimentos utilizando 50 pmolar del péptido indicado y la estirpe celular NSCLC humana agresiva.
La Figura 10 presenta gráficamente los números de células respectivos (panel izquierdo) y el número de índice de migración (panel derecho) para MANS, RNS, N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106), N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106), N-miristoil- AKGE (SEQ ID No: 219), o control (sin péptido) en experimentos utilizando 100 pmolar del péptido indicado y la estirpe celular NSCLC humana agresiva.
La Figura 11 muestra los números de células migradas 12 horas después del tratamiento previo de células A549 sin péptido o con el péptido de prueba indicado (MANS, RNS, N-acetil-GAQFSKTAAK, N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106), N-miristoil- GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106, N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219), o N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121)) a 10 pmolar (panel izquierdo superior), 25 pmolar (panel derecho superior) o 50 pmolar (panel inferior) de péptido.
La Figura 12 muestra el número promedio de tumores por ratón en el pulmón izquierdo, pulmón derecho, corazón, y diafragma en animales tratados con N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106). N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) (100 pM en PBS) se administró una vez al día durante 22 días, iniciando a los 3 días posteriores a la inoculación de célula cancerosa, a través inyección intraperitoneal (50 pL) o inhalación (30 mins, Sistema de Suministro de Nebulizador, Aeroneb Lab).
La Figura 13 muestra el número promedio de tumores por ratón en el pulmón izquierdo, pulmón derecho, corazón, y diafragma en ratones a los que se administra N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) (100 pm en PBS) mediante inhalación utilizando un Sistema de Suministro de Nebulizador (Aeroneb Lab) durante 30 días, una vez al día iniciando en el Día 15 o en el Día 4 en relación con la inyección de células de adenocarcinoma humano (PC-9). La Figura 14 muestra el número total de tumores en ratones a los que se administra N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) (100 pM en PBS) mediante inhalación utilizando un Sistema de Suministro de Nebulizador (Aeroneb Lab) durante 30 días, una vez al día iniciando en el Día 15 o en el Día 4 con relación a la inyección de células PC-9. La Figura 15 representa el número de nódulos metastásicos encontrados en ratones tratados cada dos días con control de vehículo, N-acetil-GAQFSKTAAK aerosolizado (SEQ ID No: 106) iniciando en el Día -1 o día 3 con relación a la inyección de células cancerosas A549, o MANS aerolizado iniciando en el Día -1 o día 3 con relación a la inyección de células cancerosas A549. Los péptidos aerolizados (100 pM en PBS) se administraron mediante inhalación utilizando el Sistema de Suministro de Nebulizador (Aeroneb Lab). *, p<0.05, estadísticamente significativo en comparación con el grupo control; a, estadísticamente no significativo en comparación entre los grupos.
La Figura 16 muestra el nivel de proteína MARCKS luego de la administración de ARNip de MARCKS de 100 nMo ARNip de control en células PC9.
La Figura 17 muestra el nivel de proteína MARCKS luego de la administración de ARNip de MARCKS de 100 nMo ARNip de control en células A549.
La Figura 18 muestra la migración de células cancerosas PC9 luego de tratamiento con ARNip de MARCKS de 100 nM o ARNip de control.
La Figura 19 muestra la migración de A549 células cancerosas luego de tratamiento con ARNip de MARCKS de 100 nM o ARNip de control.
La Figura 20 muestra la expresión de MARCKS en células PC9 mediante Western Blot luego de tratamiento con control negativo 50 nM (vehículo HiPerfect; carril A) o inhibidor de miR21 50 nM (carril B).
La Figura 21 muestra la migración de células cancerosas PC9 luego de inhibición de miR21 (inhibidor de mir-21 50 nM o 100 nM) o activación de miR21 (imitador de miR-21 50 nM o 100 nM).
Descripción detallada de la invención
La proteína del sustrato de quinasa C rica en alanina miristoilada (MARCKS) ha sido implicada previamente en múltiples procesos celulares. Por ejemplo, se ha mostrado que la proteína MARCKS está involucrada integralmente en la secreción celular, desgranulación, migración y expresión génica. Estos estudios se basaron en la capacidad de un péptido idéntico a la secuencia de terminal N miristoilada de la proteína MARCKS (es decir, péptido MANS) para afectar los procesos en diferentes tipos de células cuando las células se trataron previamente con el péptido MANS antes de estimulación. En todos estos casos, un péptido de control de sentido erróneo (que consiste en una secuencia de aminoácidos aleatoria de los aminoácidos del péptido MANS, y que se denomina en este documento como el péptido RNS) no tuvo efecto en relación con la actividad mostrada por el péptido MANS.
En una realización, las composiciones comprenden compuestos inhibidores de MARCKS tales como cualquier tipo de compuesto inhibidor conocido en la técnica que incluye péptidos, polipéptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, y polinucleótidos o moléculas de ácido nucleico, tales como polinucleótidos antisentido, aptámeros, ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN micro (ARNmi), y ARN de horquilla corta (ARNhc). En una realización, las composiciones comprenden uno o más péptidos relacionados con el sustrato de quinasa C enriquecido con alanina miristoilado (MARCKS). En otra realización, los péptidos relacionados con MARCKS corresponden al dominio MH2 de MARCKS. En otra realización, las composiciones comprenden péptidos inhibidores de MARCKS, que incluyen péptidos que corresponden a la secuencia de terminal N.
En una realización, el compuesto inhibidor de MARCKS proporcionado en este documento es un anticuerpo. Como se utiliza en este documento, el término “anticuerpo” se refiere a una proteína de unión que tiene por lo menos un dominio de unión a antígeno e incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, y fragmentos y/o variantes de anticuerpo, que incluyen polipéptidos recombinantes, proteínas de fusión, e inmunoconjugados. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo de la invención incluyen, pero no se limitan a, el fragmento Fab, el fragmento Fe, el fragmento Fv, el fragmento dAb, regiones de CDR aisladas, F(ab’)2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos, y moléculas de Fv de cadena sencilla (scFv). El experto reconocerá que los anticuerpos o fragmentos proporcionados en este documento se pueden generar a partir de cualesquier especies que incluyen, pero no se limitan a, ratón, rata, conejo, primate, llama y humano. El experto reconocerá adicionalmente que los anticuerpos o fragmentos proporcionados en el presente documento pueden ser quiméricos, humanizados o completamente humanos.
Se proporcionan composiciones y métodos para tratar o prevenir cáncer. Los métodos para tratar o prevenir cáncer divulgados en este documento incluyen tratar o prevenir todos los aspectos del cáncer que incluyen, pero no se limitan a, metástasis, crecimiento de tumor, proliferación de células cancerosas, y angiogénesis. Se describen composiciones y métodos para tratar o prevenir cáncer que comprenden la administración de un compuesto inhibidor de MARCKS a una célula cancerosa o a una célula que cumple una función en el desarrollo, mantenimiento, proliferación, o metástasis de células cancerosas, tales como, por ejemplo, una célula endotelial.
En un aspecto, se proporcionan composiciones para inhibir la metástasis de células cancerosas, en las que el método comprende administrar compuestos inhibidores de MARCKS. En una realización, los compuestos inhibidores de MARCKS son péptidos inhibidores de MARCKS. También se describen los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a MARCKS o péptidos de MARCKS, o polinucleótidos o moléculas de ácido nucleico que incluyen polinucleótidos antisentido, aptámeros, ARNip, ARNmi, y ARNhc que inhiben las funciones de la proteína MARCKS. En una realización adicional de la invención, los péptidos son péptidos relacionados con MANS, en los que los péptidos inhiben la metástasis de células cancerosas. En una realización, se proporcionan los péptidos inhibidores de MARCKS que inhiben la metástasis de células cancerosas. Se describen métodos para tratar cánceres utilizando las composiciones divulgadas en este documento. Los métodos proporcionados pueden comprender poner en contacto una célula cancerosa con un péptido inhibidor de MARCKS. La célula cancerosa puede estar presente en un tumor. El péptido inhibidor de MARCKS puede ser un péptido relacionado con MANS. Como se utiliza en este documento, el término “péptido relacionado con MANS” se refiere a un péptido MANS o un péptido sustancialmente idéntico a MANS; o un fragmento de péptido MANS que contiene por lo menos cuatro aminoácidos contiguos encontrados en el péptido MANS, o es sustancialmente idéntico a un péptido que contiene por lo menos 4 aminoácidos contiguos encontrados en el péptido MANS. Por lo tanto, los péptidos relacionados con MANS son desde 4 hasta 24 aminoácidos en longitud. Como se utiliza en este documento, el término “sustancialmente idéntico” significa, con respecto a la comparación de las secuencias de aminoácidos de dos péptidos o comparación de las secuencias de aminoácidos de dos segmentos de péptido (por ejemplo, segmentos de una secuencia de aminoácidos de péptido de referencia), que la secuencia de aminoácidos de los péptidos o segmentos de péptidos tienen por lo menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia, por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, o por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de los péptidos tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia al péptido MANS o el fragmento de péptido MANS. En una realización, el péptido relacionado con MANS puede comprender un péptido desde 4 hasta 24 aminoácidos en longitud que es idéntico a o sustancialmente idéntico al péptido MANS y puede comprender adicionalmente uno o más aminoácidos adicionales. Por ejemplo, en una realización, el péptido relacionado con MANS comprende desde 4 hasta 24 aminoácidos contiguos idénticos a o sustancialmente idénticos al péptido MANS y adicionalmente comprende por lo menos un aminoácido de terminal N que no está presente en el péptido MANS tal como, por ejemplo, arginina.
En una realización, el péptido inhibidor de MARCKS se modifica químicamente. En una realización, el péptido inhibidor de MARCKS es un péptido relacionado con MANS que se acila en la posición de terminal N. En una realización adicional, el péptido relacionado con MANS se acila con un grupo acetilo en la posición de terminal N. En otra realización, el péptido relacionado con MANS se miristoila en la posición de terminal N. En otra realización, el péptido relacionado con MANS se modifica químicamente en la posición de terminal C. En una realización adicional, el péptido relacionado con MANS se modifica químicamente en la posición de terminal C mediante formación de una amida con una amina (por ejemplo, amoniaco). En otra realización, el péptido relacionado con MANS se modifica químicamente en la posición de terminal N y terminal C. La Tabla 1 enumera los péptidos relevantes para la invención actual que se miristoilan en su posición de terminal N, pero no se sustituyen en su posición de terminal C. Ciertos péptidos de control (péptidos r Ns ) se enumeran en las Tablas 1 y 2, y se miristoilan. Sin embargo, los péptidos RNS no se considera que residen dentro del alcance de la invención actual.
Tabla 1. Péptidos relacionados con MANS de la invención que se miristoilan en el terminal N y que se pueden modificar químicamente en la posición del terminal C como se describe aquí
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La Tabla 2 enumera péptidos relacionados con fragmentos de MANS de la invención, que se pueden sustituir o modificar químicamente en la posición de terminal N y/o terminal C. En una realización, estos fragmentos activos del péptido MANS se pueden miristoilar en la posición de terminal N como aquellas en la Tabla 1. En otra realización, la modificación química en la posición de terminal C comprende amidación, por ejemplo, formación de una amida con una amina, tal como, por ejemplo, amoniaco. El péptido 234 (SEQ ID NO: 234) es un homólogo de péptido sustituido con arginina en el terminal N del péptido 106 (SEQ ID NO: 106; RGAQFSKTAAK), que se puede modificar químicamente en el terminal N (por ejemplo, análogo de acetilo de terminal N, Ac- RGAQFSKTAAK), y que también se puede modificar químicamente en su terminal N y su terminal C (por ejemplo, acetil- de terminal N, amida de terminal C con el análogo de amoniaco, Ac-RGAQFSKTAAK-NH2). El péptido 235 (SEQ ID NO: 235) es un homólogo de péptido sustituido con arginina de terminal N del péptido 219, (SEQ ID NO: 219; RAKGE) que se puede modificar químicamente en el terminal N (por ejemplo, análogo de acetilo de terminal N, Ac-RAKGE), y que también se puede modificar químicamente en su terminal N y su terminal C (por ejemplo, acetil- terminal N, -amina de terminal C con análogo de amoniaco, Ac-RAKGE-NH2). Las modificaciones o sustituciones de terminal N preferidos Las modificaciones o sustituciones de terminal N preferidos incluyen grupos miristoilo y acetilo, así como también grupos arginina de terminal N, grupos acetil-arginina de terminal N, y grupos miristoil-arginina de terminal N. La modificación de terminal C preferida incluye el grupo amida de amoniaco.
Tabla 2. Secuencias de péptido relacionado con MARCKS que se puede modificar químicamente en la posición de terminal N y/o terminal C como se describe en este documento
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El péptido MANS se miristoila (denotado como MA), y contiene la secuencia de 24 aminoácidos MA-GAQFSKTAAKGEAAARPGEAAVA. Sin desear estar limitado por la teoría, se teoriza que el péptido interfiere con la proteína MARCKS de longitud completa que se adhiere naturalmente a la membrana celular y que interfiere con la fosforilación de proteína MARCKS mediante quinasa C de proteína (PKC).
Se ha mostrado que el péptido MANS proporciona una reducción significativa en la desgranulación de células caliciformes ambas in vitro y in vivo. La MANS también afecta la velocidad de migración de neutrófilos y células madre mesenquimales. La degranulación de leucocitos humanos también se inhibe mediante MANS. En un aspecto de esta invención, el tratamiento de ciertas estirpes de células cancerosas con péptidos relacionados con MANS reduce la migración de aquellas estirpes de células cancerosas. En una realización, los péptidos relacionados con MANS exhiben inhibición de metástasis de células cancerosas. Por lo tanto, en una realización, los péptidos relacionados con MANS proporcionados se pueden utilizar para tratar o prevenir cáncer metastásico en un sujeto en necesidad del mismo. En algunas realizaciones, los péptidos relacionados con MANS exhiben propiedades que los hacen adecuados para uso en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres. Por ejemplo, en una realización, los péptidos relacionados con MANS exhiben solubilidad mejorada con relación a péptido MANS. En otra realización, algunos péptidos relacionados con MANS exhiben vidas medias más largas en plasma que el péptido MANS o con relación a péptidos diferentes de péptidos relacionados con MANS. Los péptidos relacionados con MANS pueden ser útiles en el tratamiento de proliferación de células cancerosas. Por ejemplo, en una realización, los péptidos relacionados con MANS puede inhibir la proliferación y o migración de células cancerosas. En otra realización, algunos péptidos relacionados con MANS pueden proporcionar mayor inhibición de proliferación y o migración de células cancerosas a más bajas concentraciones que el péptido MANS o diferentes péptidos relacionados con MANS.
En un aspecto, el péptido relacionado con MANS se selecciona del grupo que consiste de:
N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106;)
N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106);
N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219);
N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106);
N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No. 121);
N-acetil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106);
N-acetil-GAQFS(d)KTAA(d)K (SEQ ID No: 106) (Lys en las posiciones 6 y 10 del péptido son de configuración d; N-acetil-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234);
N-acetil-RGAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 234); y
N-acetil-RAKGE (SEQ ID NO: 235).
En un aspecto, los péptidos que tienen 4 a 24 aminoácidos y que tienen secuencias de aminoácidos que son idénticas a o son sustancialmente idénticos a las secuencias de aminoácidos encontradas en el péptido MANS pueden ser útiles en uno o más aspectos de esta invención. Estos péptidos en este documento se mencionan como péptidos relacionados con MANS, y los péptidos relacionados con MANS de ejemplo se enumeran en la Tabla 2 como las SEQ ID NOs: 1 a 231,234, y 235. La Tabla 2 también incluye la secuencia de aminoácidos del péptido de secuencia aleatoria (RNS) No. 232 (SEQ ID NO: 232), que se utiliza como un control y para demostrar que el orden de la secuencia de aminoácidos puede ser relevante para la eficacia en esta invención, así como también un segundo péptido de control aleatorio 233 (RNS2; SEQ ID NO: 233). Los péptidos 234 y 235 (SEQ ID NO: 234 y 235) son homólogos de péptido sustituidos de arginina en terminal N de los péptidos 106 y 219, respectivamente. La arginina se puede acilar con, por ejemplo, un grupo acetilo o un grupo miristoilo.
En una realización, los péptidos que pueden ser útiles en la invención actual se pueden seleccionar del grupo que consiste de péptidos sintéticos que tienen las secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 2 (que excluyen los péptidos de secuencia aleatoria 232 y 233).
En otra realización, los péptidos que pueden ser útiles en la invención actual se puede seleccionar de péptidos de secuencias de aminoácidos que se enumeran en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 1 a 231 (inclusive), 234, y 235) y que se modifican químicamente en el terminal N y/o terminal C.
Las modificaciones químicas del terminal N independientes preferidas de los péptidos enumerados en la Tabla 2 incluyen la modificación del grupo amina de terminal N mediante la acilación del aminoácido de terminal N del péptido en la forma de una amida seleccionada del grupo que consiste de:
• una amida de un ácido carboxílico C2 (acetil) a C24 alifático que puede ser lineal, ramificada, saturada, o insaturada, • una amida de ácido trifluoroacético,
• una amida de un ácido benzoico, y
• una amida de un ácido alquil sulfónico C1 a C24 alifático; o
• el grupo amina de terminal N del aminoácido de terminal N del péptido se puede alquilar con un grupo seleccionado del grupo que consiste de:
• un grupo alquilo C1 (metilo) a C24 alifático,
• un grupo 2-(alquilo C1 a C24 alifático)oxietilo lineal,
• un grupo omega-metoxi-pol¡(et¡lenoox¡)n-et¡lo, en el que n es desde 0 hasta 10.
Las modificaciones de terminal C independientes preferidos químicas de los péptidos enumerados en la Tabla 2 incluyen la formación de amida en el grupo de ácido carboxílico de terminal C del aminoácido de terminal C del péptido en la forma de una amida seleccionada del grupo que consiste de:
• una amida de amoniaco,
• una amida de una alquil amina C1 a C24 alifática,
• una amida de una alquil amina C2 a C24 alifática sustituida con hidroxilo,
• una amida de un grupo (alquilo C1 a C24 alifát¡co)ox¡etilam¡na lineal, y
• una amida de un grupo omega-metoxi-pol¡(et¡lenoox¡)n-et¡lam¡na, en el que n es desde 0 hasta 10.
Adicionalmente, el grupo de ácido carboxílico de terminal C del aminoácido de terminal C del péptido está opcionalmente en la forma de un éster seleccionado del grupo que consiste de:
• un éster de un alquil alcohol C1 a C24 alifático,
• un éster de un grupo 2-(omega-metoxi-poli(etilenooxi)n)-etanol, en el que n es desde 0 hasta 10, y • un éster de una PEG-amina lineal, el componente de PEG de peso molecular desde 1,000 hasta 25,000 Daltons. En una realización, las porciones alifáticas de los grupos tales como grupos de ácido carboxílico y grupos ácido sulfónico y alcohol y grupos amino pueden comprender un anillo de por lo menos C3 (es decir, por lo menos un anillo ciclopropilo).
En una realización, el péptido se puede modificar en el terminal N, por ejemplo, por un grupo acetilo o un grupo miristoilo, como una amida de terminal N, tal como Acetil-GAQFSKTAAK (acetilo de terminal N SEQ ID No: 106) y miristoil- GAQFSKTAAK (miristoilo de terminal N SEQ ID No: 106), respectivamente. En otra realización, el péptido se puede modificar en el terminal C (por ejemplo, mediante una amida con amoniaco) tal como GAQFSKTAAK-NH2 (amida de terminal C SEQ ID No: 106). En otra realización, el péptido se puede modificar en el terminal N y se puede modificar en el terminal C, por ejemplo, como el N-acetil- péptido-C-amida (con amoniaco) tal como Acetil-GAQFSKTAAK-NH2 (acetilo de terminal N SEQ ID No: 106 amida de terminal C) y Miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (miristoilo de terminal N SEQ ID No: 106 amida de terminal C). Estos péptidos se pueden utilizar en los métodos de esta invención y para determinar su habilidad para inhibir la metástasis de células cancerosas.
En una realización, un péptido que puede encontrar uso en esta invención se puede seleccionar del grupo de péptidos que contienen la secuencia de aminoácidos AKGE (SEQ ID No: 219). Dichos péptidos incluyen la SEQ ID No: 1 a la SEQ ID No: 54, SEQ ID No: 56 a la SEQ ID No: 64, SEQ ID No: 67 a la SEQ ID No: 75, SEQ ID No: 79 a la SEQ ID No: 87, SEQ ID No: 93 a la SEQ ID No: 100, SEQ ID No: 108 a la SEQ ID No: 114, SEQ ID No: 124 a la SEQ ID No: 129, SEQ ID No: 141 a la SEQ ID No: 145, SEQ ID No: 159 a la SEQ ID No: 162, SEQ ID No: 178 a la SEQ ID No: 180, SEQ ID No: 198, SEQ ID No: 199, SEQ ID No: 219, y SEQ ID NO: 235. En una realización actualmente preferida, estos péptidos se miristoilan o acetilan en el grupo amino de terminal N.
En una realización, un péptido de la invención se puede utilizar en un método para atenuar la metástasis de una célula cancerosa hacia un gradiente de concentración creciente de un agente quimiotáctico en un fluido o tejido, el método que comprende tratamiento de dicha célula cancerosa con una cantidad de migración-inhibición de un péptido de migración-modulación e incubación de dicha célula con dicho péptido para formar una célula cancerosa inhibida en migración, en la que el péptido es un péptido relacionado con MANS.
En una realización, el péptido de migración-modulación se selecciona del grupo que consiste de péptidos relacionados con MANS. En otro aspecto, el péptido relacionado con MANS comprende la secuencia de aminoácidos GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106).
En otra realización, el péptido relacionado con MANS se selecciona del grupo que consiste de N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID No: 1) N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV (SEQ ID No: 2); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA (SEQ ID No: 4); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA (SEQ ID No: 7); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE (SEQ ID No: 11); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPG (SEQ ID No: 16); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID No: 22); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID No: 29); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAE (SEQ ID No: 37); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAA (SEQ ID No: 46); N-miristoil- GAQFSKTAAKGEAA (SEQ ID No: 56); N-miristoil-GAQFSKTAAKGEA (SEQ ID No: 67); N-miristoil-GAQFSKTAAKGE (SEQ ID No: 79); N-miristoil-GAQFSKTAAKG (SEQ ID No: 92); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106); N-miristoil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121); N-miristoil-GAQFSKTA (SEQ ID No: 137); N-miristoil-GAQFSKT (SEQ ID No: 154); N-miristoil-GAQFSK (SEQ ID No: 172), N-miristoil-GAQFS (SEQ ID No: 191), N-miristoil-GAQF (SEQ ID No: 211), N-acetil-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234), N-acetil-RGAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 234), Nacetil- RAKGE (SEQ ID NO: 235), y una combinación de los mismos.
En otra realización, el péptido relacionado con MANS se selecciona del grupo que consiste de:
• N-miristoil-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID No: 1; péptido MANS);
• N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11000);
• N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106; BIO-11006);
• N-acetil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106; BIO-11026);
• N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219; BIO-91200);
• N-mir¡sto¡l-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106; BIO-11002);
• N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No. 121; BIO-10901)
• N-acetil-RGAQFSKTAAK (SEQ ID No: 234; BIO-11027)
• N-acetil-RGAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 234; BIO-11028), y
• N-acetil-RAKGE (SEQ ID NO: 235; BIO-91204).
En una realización, la dosis que inhibe la metástasis de un péptido de esta invención puede estar en el rango de aproximadamente 0.01 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/día. En una realización adicional, la dosis que inhibe la metástasis de un péptido es aproximadamente 0.1 mg/kg/día a aproximadamente 5.0 mg/kg/día. En aún una realización adicional, la dosis que inhibe la metástasis de un péptido es aproximadamente 0.5 mg/kg/día a aproximadamente 2.5 mg/kg/día. Por ejemplo, la dosis que inhibe la metástasis de un péptido de esta invención es aproximadamente 0.01, aproximadamente 0.05, aproximadamente 0.1, aproximadamente 0.5, aproximadamente 0.75, aproximadamente 1.0, aproximadamente 1.25, aproximadamente 1.5, aproximadamente 1.75, aproximadamente 2.0, aproximadamente 2.25, aproximadamente 2.5, aproximadamente 2.75, aproximadamente 3.0, aproximadamente 3.5, aproximadamente 4.0, aproximadamente 5.0, aproximadamente 6.0, aproximadamente 7.0, aproximadamente 8.0, aproximadamente 9.0, aproximadamente 10.0, o más mg/kg/día.
En una realización de la presente invención, la administración es mediante rutas oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, inhalación o supositorio. En otra realización, la administración es mediante inhalación de una solución o suspensión líquida o formulación de polvo seco del compuesto inhibidor de MARCKS. En una realización, un compuesto inhibidor de MARCKS se administra a un sujeto en necesidad del mismo mediante inhalación de una solución o suspensión líquida o formulación de polvo seco del compuesto inhibidor de MARCKS. Por ejemplo, en una realización, un péptido relacionado con MANS se administra a un sujeto en necesidad del mismo mediante inhalación de una solución o suspensión líquida o formulación de polvo seco del péptido relacionado con MANS. En otra realización, un péptido relacionado con MANS se administra mediante inyección intravenosa, intraperitoneal, o intramuscular, o mediante administración oral o supositorio.
En la presente invención, el péptido relacionado con MANS se puede administrar es mediante inyección de una formulación líquida del péptido, y en el que la formulación líquida es isotónica, y en el que la formulación líquida o suspensión está tamponada, y en la que la inyección es sistémica en un sujeto. En otra realización, la inyección está en la región de un tumor. En otra realización, la inyección está en el tumor.
Los péptidos de esta invención se pueden formular utilizando uno o más excipientes o ingredientes farmacéuticamente aceptables para proporcionar composiciones farmacéuticas útiles para la administración a células cancerosas, tales como células cancerosas en un tumor primario. Dichas composiciones pueden ser como soluciones o suspensiones en un líquido, especialmente en una solución tamponada, en el que el tampón de fosfato es útil, cuando la administración por inyección o por inhalación es útil. Las soluciones o suspensiones isotónicas son realizaciones preferidas.
Se anticipa que la administración de un anticuerpo, polinucleótido, molécula de ácido nucleico o composición de péptidos de esta invención en mamíferos tales como caninos, felinos y pacientes humanos, puede ser efectiva si se realiza mediante inyección en una región tumoral primaria (por ejemplo, directamente en un tumor primario, o en un margen de un tumor primario, o en un vaso sanguíneo que alimenta un tumor primario) en el mamífero, en el que la inyección se realiza a intervalos regulares (por ejemplo, cada 1 a cada 72 horas), opcionalmente en combinación con o por separado con uno o más de otros fármacos de quimioterapia adicionales.
Uno o más agentes terapéuticos adicionales, que incluyen fármacos quimioterapéuticos y anticuerpos específicos para el cáncer, se puede administrar adicionalmente al anticuerpo de inhibidor de MARCKS, polinucleótido, molécula de ácido nucleico, o formulación de péptido, antes, durante, o después de la administración del péptido. Los fármacos quimioterapéuticos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, temozolomida, gemcitabina, capecitabina, cladribina, clofarabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, metotrexato, pemetrexed, pentostatina, tioguanadina, daunorrubicina, doxurrubicina, epirrubicina, idarrubicina, topotecan, irinotecan, etoposida, eniposida, colchicina, vincristina, vinblastina, vinorelbina, paclitaxel, y docetaxel. Agentes específicos contra el cáncer y anticuerpos de ejemplo incluyen pero no se limitan a, Afatinib, Aldesleukina, Alemtuzumab, Axitinib, Belimumab, Bevacizumab, Bortezomib , Bosutinib, Brentuximab vedotin, Cabozantinib, Canakinumab, Carfilzomib, Cetuximab, Crizotinib,Dabrafenib, Dasatinib, Denosumab, Erlotinib, Everolimus, Gefitinib, Ibritumomab tiuxetan, Ibrutinib, Imatinib, Ipilimumab, Lapatinib, Nilotinib, Obinutuzumab, Ofatumumab, Panitumumab, Pazopanib, Pertuzumab, Ponatinib, Regorafenib, Rituximab, Romidepsin, Ruxolitinib, Sipuleucel-T, Sorafenib, Temsirolimus,Tocilizumab, Tofacitinib, Tositumomab, Trametinib, Trastuzumab, Vandetanib, Vemurafenib, Vismodegib, Vorinostat, y Ziv-aflibercept.
La administración puede ser, por ejemplo, por inhalación tal como un aerosol o aerosol líquido o en polvo seco, como en las vías respiratorias de un paciente con cáncer, cuyo aerosol puede formar un recubrimiento en un tejido que contiene una célula cancerosa, o como un líquido para inyección en un fluido o tejido que contenga o esté en contacto con una célula cancerosa antes de la metástasis. Se contempla el uso de un agente surfactante suave como un fosfolípido para ayudar a la solubilización y la absorción de la transmembrana del péptido relacionado con MANS. La administración también puede ser, por ejemplo, mediante un polvo seco, preferiblemente un polvo de nanopartículas o micropartículas, aplicable por aspersión sobre un tejido que contiene una célula cancerosa. La adición de un portador de carbohidratos en micropartículas a la preparación del péptido facilitará el suministro por inhalación del péptido en nanopartículas en las vías respiratorias y en las áreas de tejido epitelial.
Un método preferido de aplicación del anticuerpo inhibidor de MARCKS, polinucleótido, molécula de ácido nucleico, o composición de péptido comprende la inyección en tejido en o proximal a un tumor, cuyo tumor contiene una célula cancerosa antes de la metástasis.
Como se utiliza en este documento, la frase “cantidad efectiva” o “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente de las composiciones utilizadas en la práctica de la invención que es efectiva para lograr el efecto deseado, es decir, para inhibir la metástasis y/o la proliferación de una célula cancerosa y/o para inhibir, tratar o prevenir el cáncer en un sujeto en necesidad del mismo. Por lo tanto, la actividad contemplada por los presentes métodos incluye tanto tratamiento médico terapéutico como tratamiento profiláctico, según sea apropiado, que incluye, por ejemplo, una reducción y/o alivio de los signos, síntomas o causas de un cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz de compuesto de esta invención es normalmente una cantidad tal que cuando se administra en una composición de excipiente fisiológicamente tolerable, es suficiente para lograr una concentración intracelular y una concentración local efectivas en el tejido.
“Cáncer” en el presente documento se refiere o describe la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (que incluye liposarcoma, sarcoma osteogénico, angiosarcoma, endotelioarcoma, linfangiosarcoma linfangioendotelioma sarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, fibrosarcoma, myxosarcoma, condrosarcoma), osteoclastoma, tumores neuroendocrinos, mesotelioma, cordoma, sinovioma, schwanoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o neoplasias linfoides. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células epidermoides (por ejemplo, cáncer de células epidermoides epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma epidermoide del pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal, que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o útero, carcinoma de glándula salival, carcinoma de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma de ano, carcinoma de pene, cáncer de testículo, cáncer de esófago, tumores del tracto biliar, tumor de Ewing, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hematoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom; enfermedad mielodisplásica, enfermedad de cadena pesada, tumores neuroendocrinos, Schwanoma y otros carcinomas, cáncer de cabeza y cuello, neoplasias mieloides tales como leucemias mielógenas agudas, que incluyen AML con maduración, AML sin diferenciación, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda y leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicos y trastornos mieloproliferativos crónicos, que incluyen leucemia mielógena crónica, tumores del sistema nervioso central, por ejemplo, tumores cerebrales (glioma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma y retinoblastoma), tumores sólidos (cáncer nasofaríngeo, carcinoma de células basales, cáncer de páncreas, cáncer del conducto biliar, sarcoma de Kaposi, cáncer testicular, cáncer de útero, cérvix o cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado primario o endometrio) cáncer, tumores del sistema vascular (angiosarcoma y hemangiopericitoma), neoplasias hematológicas y afecciones neoplásicas similares, por ejemplo, linfoma de Hodgkin; linfomas no Hodgkin (linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeño/leucemia linfocítica crónica, micosis fungoide, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de zona marginal, leucemia de células pilosas y leucemia linfoplasmocítica), tumores de células precursoras de linfocito, incluyendo leucemia/linfoma linfoblástico agudo de células B, y leucemia/linfoma linfoblástico agudo de células T, timoma, tumores de células T y NK maduras, que incluyen leucemias de células T periféricas, leucemia de células T adultas/linfomas de células T y Leucemia linfocítica granular grande, cánceres óseos osteolíticos y metástasis óseas.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, debe observarse que estos ejemplos, como las realizaciones descritas anteriormente, son ilustrativos y no deben interpretarse como que limitan el alcance de la invención de ninguna manera.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Efectos de los péptidos en la migración de estirpes celulares de cáncer
Protocolo para un ensayo de migración
Las células CL1-5, una estirpe celular agresivamente metastásica derivada de un adenocarcinoma humano, se cultivaron en medios RPMI 1640 con FBS al 10%, 37°C a un oxígeno al 95%/ CO2 al 5% hasta que estén listas para uso. Se utilizaron placas Transwell (24 pozos, tamaño de poro de 8 um; Costar, Cambridge, Mass., EE.UU.) Para realizar el ensayo de migración. Las cámaras inferiores de las placas Transwell se cargaron con 600 pl de medio basal que contenía un FBS al 10%. Las células (1 * 105) se pretrataron con 50 o 100 pM del péptido de prueba indicado durante 30 minutos, y luego se suspendieron en 100 pl de medio basal que contenía BSA al 1% y se agregaron a la cámara superior, y luego las células Se incubaron a 37°C durante 12 h. Las células en la superficie superior de los filtros se eliminaron utilizando hisopos de algodón, y las células que migraron a la superficie inferior de los filtros se lavaron, se fijaron y se tiñeron con hematoxilina y se contaron bajo el microscopio. El porcentaje de cambio en la migración se determinó contando el número de células que migraron a la superficie inferior de los filtros. Se contaron por lo menos 3 campos microscópicos separados por membrana (n=4).
Método alternativo de Transwell
Las células primarias CL1-5 se originaron a partir de cáncer de pulmón adenocarcinoma humano. Se utilizaron placas Transwell con 24 pozos, tamaño de poro de 8 p (Costar, Cambridge, Mass., EE.UU.) Para realizar el ensayo de migración. Las cámaras inferiores de las placas Transwell se cargaron con 600 pL de medio basal que contenía un FBS al 10%. Las células (1-2 x 105) se suspendieron en 100 pL de medio basal que contenía BSA al 1%. El péptido de prueba a la concentración deseada se agregó a la cámara superior directamente o después de la preincubación con células cancerosas. Las placas se incubaron a 37°C durante 12 horas. Las células en la superficie superior de los filtros se eliminaron utilizando hisopos de algodón. Las células que migraron a la superficie inferior de los filtros se lavaron, se fijaron y se tiñeron con hematoxilina y se contaron bajo el microscopio. Se cuentan por lo menos cinco campos microscópicos separados por membrana (n=3). El porcentaje de cambio en la migración se determinó al contar el número de células que migraron a la superficie inferior de los filtros.
El recuento significa el número real de células que migraron a la cámara inferior y se contaron con un microscopio de luz con un aumento de 40x, presentado como el número promedio de células en 10 campos elegidos al azar para cada tratamiento.
El “índice” se calculó al dividir el número de células que migraron en presencia de péptidos por el número de células que migraron al azar (grupo de control). Índice = recuento de células de control/recuento de células tratadas. Este cálculo puede reflejar el grado en que la migración de las células se bloqueó mediante un tratamiento previo de 30 minutos con péptidos relacionados con MANS.
La Figura 1 presenta un campo de recuento de células de un control negativo después de un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 2A presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 50 pmolar de péptido MANS seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 2B presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 100 pmolar de péptido MANS seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 3A presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 50 pmolar de péptido RNS seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 3B presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 100 pmolar de péptido RNS seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 4A presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 50 pmolar de péptido relacionado con MANS N-miristoilo - SEQ ID NO: 106 - NH2 seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 4B presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 100 pmolar de péptido relacionado con MANS N-miristoilo - SEQ ID NO: 106 - NH2 seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 5A presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 50 pmolar de péptido relacionado con MANS N-acetilo - SEQ ID NO: 121 seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 5B presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 100 pmolar de péptido relacionado con MANS N-acetilo - SEQ ID NO: 121 seguido por un tiempo de migración de 12 horas.
La Figura 6A presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 50 pmolar de péptido relacionado con MANS N-miristoilo - SEQ ID NO: 219 seguido por un tiempo de migración de 12 horas. La Figura 6B presenta un campo de recuento de células obtenido después del tratamiento previo con 100 pmolar de péptido relacionado con MANS N-miristoilo - SEQ ID NO: 219 seguido por un tiempo de migración de 12 horas. La Figura 7A presenta números de células migradas obtenidos 12 horas después del tratamiento previo a 50 pmolar con el péptido MANS, péptido RNS, y péptidos de prueba relacionados MANS N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 6), N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 121), y N-miristoil-AKGE (SEQ ID NO: 219), y control (sin péptido). Para el péptido MANS, el número de células fue aproximadamente 40; para el péptido RNS, el número de células fue aproximadamente 95; para N-miristoil-GAQFSKTAAKNH2 (SEQ ID NO: 106), el número de células fue aproximadamente 50); para N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 121), el número de células fue aproximadamente 60; y para N-miristoil-AKGE (SEQ ID NO: 219), el número de células fue aproximadamente 65. Cada uno de los péptidos relacionados con MANS MANS, N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106), N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121), y N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219) números de células migradas significativamente reducidos de la estirpe celular NSCLC humana agresiva (CL1-5) con relación al control y al péptido de secuencia aleatoria RNS.
La Figura 7B presenta números de células migradas obtenidos 12 horas después del tratamiento previo a 100 pmolar con el péptido MANS, péptido RNS, y péptidos de prueba relacionados MANS N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 106), N-acetil- GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 121), y N-miristoil-AKGE (SEQ ID NO: 219), y control (sin péptido). para el péptido MANS, el número de células fue aproximadamente 20); para el péptido RNS, el número de células fue aproximadamente 90; para N-miristoil-GAQFSKTAAK- NH2 (SEQ iD No : 106), el número de células fue aproximadamente 25; para N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 121), el número de células fue aproximadamente 35; y para N-miristoil-AKGE (SEQ ID NO: 219), el número de células fue aproximadamente 40; para el control (sin péptido), el número de células fue aproximadamente 90. Cada uno de los péptidos relacionados con MANS MANS, N-miristoil- GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 106), N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 121), y N-miristoil-AKGE (SEQ ID NO: 219) demuestra números de células migradas significativamente reducidos de la estirpe celular NSCLC humana agresiva (CL1-5) con relación al control y al péptido de secuencia aleatoria RNS.
La Figura 8A presenta el índice de migración de células de la estirpe celular del NSCLC humano agresivo, en el que un valor alto del índice de migración significa menor migración después del tratamiento previo con un péptido o composición de péptidos de la invención a 50 pmolar seguido por 12 horas de tratamiento de acuerdo con el protocolo. Los siguientes son los valores del índice de migración: control = 1; péptido MANS = aproximadamente 2.5; péptido RNS = aproximadamente 1.1; N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106) = aproximadamente 2.7; N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121) = aproximadamente 1.75; y N-miristoil- AKGE (SEQ ID No: 219) = aproximadamente 1.7. Cada uno de los péptidos relacionados con Ma NS MANS, N-miristoil-GAQFSKTAAKNH2 (SEQ ID No: 106), N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121), y N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219) demostraron números de índice de migración significativamente en aumento con relación al control y al péptido RNS.
La Figura 8B presenta el índice de migración de células de la estirpe celular del NSCLC humano agresivo, en el que un valor alto del índice de migración significa menor migración después del tratamiento previo con un péptido o composición de péptidos de la invención a 100 pmolar seguido por 12 horas de tratamiento de acuerdo con el protocolo. Los siguientes representan los valores del índice de migración: control = 1; péptido MANS = aproximadamente 4.3; péptido RNS = aproximadamente 1; N-miristoil-GAQFSKTAAKNH2 (SeQ ID No: 106) =aproximadamente 3.8; N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121) = aproximadamente 2.7; y N-miristoil- AKGE (SEQ ID No: 219) = aproximadamente 2.4. Cada uno de los péptidos relacionados con MANS MANS, N-miristoil-GAQFSKTAAK- NH2 (SEQ ID No: 106), N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121), y N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219) demostraron números de índice de migración significativamente en aumento con relación al control y al péptido RNS.
La Figura 9 presenta gráficamente los números de células respectivos lado a lado y los resultados del número de índice de migración de 50 pmolar de tratamiento previo con péptido en experimentos utilizando la estirpe celular NSCLC humana agresiva (CL1-5). El control sin tratamiento previo con péptido proporciona un número de células de aproximadamente 105; y el número de índice de migración = 1.0 Los resultados después de 50 pmolar de tratamiento previo con el péptido MANS seguido por 12 horas de acuerdo con el protocolo proporcionan un número de células de aproximadamente 45; de índice de migración de aproximadamente 2.5. Los resultados después de 50 pmolar de tratamiento previo con el péptido RNS proporcionan un número de células de aproximadamente 90; e índice de migración de aproximadamente 1.3. Los resultados después de 50 pmolar de tratamiento previo con N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) proporcionan un número de células de aproximadamente 70; e índice de migración de aproximadamente 1.5. Los resultados después de 50 pmolar de tratamiento previo con BIO-11006 proporcionan un número celular de aproximadamente 50; e índice de migración de aproximadamente 2. Los resultados demuestran que los valores altos del índice de migración se asocian con menor migración, y la menor migración se asocia con valores altos de índice de migración. Cada uno de los péptidos relacionados con MANS MANS, N-miristoil- GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106), y N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) demostraron números de células migradas reducidos y números de índice de migración en aumento con relación al control y al péptido RNS.
La Figura 10 presenta gráficamente números de células respectivos lado a lado y resulta el número de índice de migración para 100 pmolar de tratamiento previo con péptido en experimentos utilizando la estirpe celular NSCLC humana agresiva (CL1-5). El control sin tratamiento previo con péptido proporciona un número de células de aproximadamente 105; y el número de índice de migración = 1.0. Los resultados después de 100 pmolar de tratamiento previo con el péptido MANS seguido por 12 horas de acuerdo con el protocolo proporcionan un número de células de aproximadamente 35; e índice de migración de aproximadamente 3.5. Los resultados después de 100 pmolar de tratamiento previo con el péptido RNS proporcionan un número de células de aproximadamente 95; e índice de migración de aproximadamente 1.2. Los resultados después de 100 pmolar de tratamiento previo con N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) proporcionan un número de células de aproximadamente 50; e índice de migración de aproximadamente 2.3. Los resultados después de 100 amolar de tratamiento previo con N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) proporcionan un número de células de aproximadamente 50; e índice de migración de aproximadamente 2.1. Los resultados después de 100 jmolar de tratamiento previo con N-miristoil- AKGE (SEQ ID No: 219) proporcionan un número de células de aproximadamente 55; e índice de migración de aproximadamente 2.1. Los resultados demuestran que valores altos de índice de migración se asocian con menos migración celular, y menos migración celular se asocia con valores altos de índice de migración. Cada uno de los péptidos relacionados con MANS MANS, N-miristoil- GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106), N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106), y N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219) demostraron números de células migradas reducidos y números de índice de migración en aumento con relación al control y al péptido RNS.
EJEMPLO 2. Inhibición de metástasis de cáncer de pulmón por el péptido MANS o BIO-11006 utilizando modelo de xenoinjerto de inyección de pulmón ortotópico.
La actividad metastásica de células cancerosas in vivo después del tratamiento con el péptido MANS o BIO-11006 se evaluó en el modelo de xenografía de inyección ortotópica de pulmón. Después del tratamiento previo con PBS, o PBS MANS, N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) (SEQ ID NO: 106), o con el péptido RNS de control a 100 |jM durante 4 horas, se inyectaron células PC-9 en el lóbulo izquierdo del pulmón de ratones desnudos. Siete días después, estos ratones recibieron tratamiento sistémico con solo PBS (Con), RNS (péptido de control adicional), MANS o N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) a 50 nmoles por inyección intraperitoneal una vez cada tres días. A los 25 días (6 inyecciones) después de la siembra de estas células tumorales, los ratones se sacrificaron y se contó el número de nódulos tumorales metastatizados en el pulmón contralateral y otros órganos. Como se muestra en la Tabla 3 a continuación, los grupos tratados con MAnS, RNS o N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) no mostraron diferencias en el tamaño promedio del tumor en el sitio de inyección en comparación con los tratados con PBS o entre sí, lo que sugiere que estos tratamientos no afectan la tumorigénesis. Sin embargo, se observó una disminución significativa de los nódulos metastásicos en el pulmón contralateral y otros órganos en los ratones tratados con MANS y N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) en comparación con los grupos tratados con PBS o RNS; de hecho, el tratamiento con los péptidos MANS o BIO-11006 esencialmente bloqueó totalmente todas las metástasis del tumor a otros sitios pulmonares, así como a otros órganos.
Tabla 3. El efecto supresor de los péptidos relacionados con MARCKS en la metástasis del cáncer in vivo
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Estos resultados in vivo apoyan el concepto de que la inhibición de la función MARCKS por los péptidos relacionados con MANS puede reducir la diseminación metastásica de células de cáncer de pulmón in vivo.
Ejemplo 3. Efectos peptídicos en la migración de estirpes celulares de cáncer A549
La estirpe celular epitelial alveolar derivada de adenocarcinoma humano A549 (una estirpe celular invasiva) se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC)y se cultivó en RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. En matraces de cultivo de tejidos de 75 cm2. Las células alcanzaron la confluencia en el tercer día de cultivo a 37°C en una atmósfera de aire al 95% y CO2 al 5% y se mantuvieron mediante un paso en serie.
Los péptidos de prueba (MANS, RNS, BIO-11006, BIO-11000, N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106), N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219), y N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121) se disolvieron en PBS a un pH de 7.0; mezcla lenta de vórtice durante aproximadamente dos horas de solubilidad ayudada.
Se utilizaron placas Transwell (24 pozos, tamaño de poro de 8 jM ; Costar, Cambridge, Mass., EE.UU.) para realizar el ensayo de migración. Las cámaras inferiores de las placas Transwell se cargaron con 600 pl de medio basal que contenía un FBS al 10%. Las células (1x105) se suspendieron en 100 pl de medio basal que contenía BSA al 1% y se agregaron a la cámara superior, y las placas se incubaron a 37°C con CO2 al 5% durante 12 horas en PBS (control), o los péptidos de prueba indicados a 10, 25 o 50 pM. Las células sobre la superficie superior de los filtros se eliminaron utilizando hisopos de algodón. Las células que migraron a la superficie inferior de los filtros se lavaron, se fijaron y se tiñeron con hematoxilina y se contaron bajo el microscopio. El porcentaje de cambio en la migración se determina al contar el número de células que migraron a la superficie inferior de los filtros. Se cuentan por lo menos cuatro campos microscópicos separados por membrana, con un total de tres experimentos repetidos en cada concentración. El software de estadísticas “Prizm” se utilizó para el análisis de datos.
Como se muestra en la figura 11, el tratamiento con cada uno de los péptidos de prueba dio como resultado un número de células reducido después del tratamiento en relación con el control (sin péptido) o con el péptido RNS. A 50 pm, cada uno de los péptidos relacionados con MANS MANS, BIO-11006, N-miristoil- GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106), N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID No: 106), N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219), y N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID No: 121) mostraron una disminución en el número de células migradas y un mayor número de índices de migración en relación con el control y el péptido RNS. A concentraciones más bajas, el efecto de varios péptidos relacionados con MANS fue significativamente diferente incluso en comparación con el péptido MANS. En particular, a 25 pm, el tratamiento con BIO-11006, BIO-11002, o N-miristoil-AKGE (SEQ ID No: 219) dio como resultado un número de células significativamente reducido en comparación con el control (sin péptido) o el control del péptido RNS, así como en comparación con el péptido MANS (Figura 11).
En conjunto, los resultados de los estudios mostraron que los péptidos relacionados con MANS pueden bloquear la migración de estirpes celulares de cáncer agresivas, y que varios péptidos relacionados con MANS mostraron un efecto sobre la migración de por lo menos tres estirpes de células de cáncer diferentes. Los resultados de los estudios también mostraron que por lo menos dos péptidos relacionados con MANS diferentes fueron capaces de bloquear o inhibir la metástasis de células cancerosas inyectadas en mamíferos (es decir, ratones).
Ejemplo 4. Efectos del péptido BIO-11006 en la implantación de cáncer de pulmón
En este estudio, se evaluó la inhibición de la metástasis del cáncer de pulmón por el péptido N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) en un modelo de implante de cáncer de pulmón ortotópico en ratones SCID. Se suspendieron células de adenocarcinoma humano (PC-9) (1-2 * 105) en 40 pL de PBS, pH 7.4 que contenían 0.5 mg/mL de Matrigel™ (BD Bioscience) y se inyectaron en el pulmón izquierdo de ratones SCID (n=3) utilizando una jeringa con aguja de calibre 29. N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) (100 mM, en PBS) se administró ya sea (a) por inyección i.p. (50 pL) una vez al día durante 22 días iniciando a los 3 días posteriores a la inoculación de célula cancerosa o (b) mediante inhalación por aerosol utilizando un Sistema de Suministro de Nebulizador (Aeroneb Lab) durante 30 min una vez al día durante 22 días iniciando a los 3 días posteriores a la inoculación de célula cancerosa. Los resultados del estudio se representan en la Figura 12, que presenta gráficamente el número promedio de tumores en el pulmón derecho, corazón, y diafragma como una función de la ruta de administración del compuesto de prueba (inyección ip versus inhalación). Tanto la administración i.p. y en aerosol de N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) redujeron la metástasis de células cancerosas en más de 50% en el pulmón derecho y corazón, y 100% en el diafragma. Por lo tanto, ambas rutas de administración tienen efectos inhibidores significativos sobre la metástasis de células cancerosas.
EJEMPLO 5. Inhibición de metástasis de cáncer de pulmón
En este estudio, se investigó la inhibición de metástasis de cáncer de pulmón mediante N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) en un modelo de implante de cáncer de pulmón ortotópico en ratones SCID. Se suspendieron células de adenocarcinoma humano (PC-9) (1-2 x 1 o5) en 40 pL de PBS que contenía 0.5 mg/mL de Matrigel™ (BD Bioscience) y se inyectaron en el pulmón izquierdo de ratones SCID (n=3) utilizando una aguja de calibre 29. Se administró N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) iniciando ya sea a los 4 días o 15 días posteriores a la inoculación de célula cancerosa mediante aerosol utilizando 100 pM de solución en PBS mediante el Sistema de Suministro de Nebulizador (Aeroneb Lab) durante 30 min una vez al día durante 25 días posteriores a la inoculación de célula cancerosa. Al final del experimento, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tejidos de los pulmones, corazón y diafragma y se midió el número de nódulos tumorales en cada tejido. Los resultados de este experimento se presentan gráficamente en las Figuras 13 y 14. La Figura 13 muestra que cuando se inició el tratamiento a los 4 días después de inoculación de células cancerosas, el tumor metástasis se inhibió por 60-90% en el pulmón izquierdo, corazón, y diafragma, y en 100% en el pulmón derecho. Cuando se inició el tratamiento a los 15 días después de inoculación de células cancerosas, la inhibición de de la metástasis de tumor fue aproximadamente 50% en los pulmones, corazón, y diafragma. La Figura 14 representa el número total de nódulos de tumor encontrados en todos los tejidos cuando se inició el tratamiento de péptido a los 15 días posteriores a la inoculación de célula cancerosa o 4 días posteriores a la inoculación de célula cancerosa. Como se muestra en la Figura 14, el tratamiento de péptido que inicia a los 15 días posteriores a la inoculación de célula cancerosa resulta en nódulos de tumor reducidos, y el tratamiento de péptido que inicia a los 4 días después de inoculación resulta incluso nódulos de tumor reducidos adicionales.
Ejemplo 6. Eficacia antimetastásica de los péptidos
Este ejemplo demuestra la eficacia antimetastásica de los compuestos de prueba de la invención en ratones SCID que portan células de adenocarcinoma de pulmón humano. Los ratones hembra NOD.CB17-Prkdcscid/NCrHsd, Mus musculus (Harlan, Países Bajos), alojados en jaulas con ventilación individual, se asignaron al azar a seis grupos de ocho ratones cada uno. Se inyectaron células A549 (2.5 x 106) en los ratones a través de la vena de la cola. El grupo de control recibió vehículo PBS en aerosol; mientras que los grupos 2 y 3 recibieron el compuesto de prueba en aerosol N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) ya sea desde -1 día antes de la inyección de células cancerosas (grupo 2) o desde 3 días después de la inyección de células cancerosas (grupo 3) en días alternos durante 7 semanas a través de nebulizador (Aeroneb Lab). Los grupos 4 y 5 recibieron el péptido MANS del compuesto de prueba en aerosol desde -1 día antes de la inyección de la estirpe celular de cáncer (grupo 4) o desde 3 días después de la inyección de la estirpe celular (grupo 5) en días alternos durante 7 semanas a través de un nebulizador (Aeroneb Lab). Para el suministro de aerosol, se preparó una solución de cada compuesto de prueba (100 |j M) en PBS, pH 7.0. Para cada tratamiento, 5 mL de solución del compuesto de prueba se aerosolizaron durante 30 minutos en una cámara que contenía cuatro ratones a la vez. Los ratones se monitorizaron para determinar el peso corporal en días alternos durante 7 semanas.
Un grupo de ratones (n=7) sirvió como control normal. Estos fueron ratones no tratados sin tratamiento que se utilizaron para controlar el estado de salud de los ratones durante el período de estudio. Todos los animales de todos los grupos fueron sacrificados en el día 53. Los resultados se proporcionan en la Tabla 4 y la Figura 15. La Figura 15 compara el número de nódulos metastásicos en los pulmones después de la administración respectiva de de N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) y péptido MANS en el día 53 después de la inyección de células A549. La Tabla 4 muestra el número de nódulos metastásicos en los pulmones, así como el número de animales con nódulos tumorales focales y/o metástasis a distancia. En general, los péptidos de prueba mostraron una inhibición sustancial de la metástasis tumoral (70-80%) en animales a los que se administró BIO-11006 o péptido MANS a partir del día -1 o el día 3 en relación con la inyección de células A549 (Figura 15). Más aún, el número de nódulos metastásicos en ratones tratados se redujo significativamente en relación con los receptores de control del vehículo, y ninguno de los ratones tratados mostró evidencia de metástasis a distancia (Tabla 4). Hubo pocos nódulos tumorales focales en 7/8 de ratones tratados con el péptido N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) a partir del Día -1 o el Día 3 en relación con la inyección de células A549.
TABLA 4. Nódulos metastásicos y metástasis a distancia en ratones tratados con N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID No: 106) o MANS
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Ejemplo 7. Actividad antimetastásica de los péptidos relacionados con MANS en el melanoma murino
En este estudio, la actividad antimetastásica relativa de los péptidos relacionados con MANS administrados por cuatro vías diferentes se determina utilizando un modelo de ratón singénico. La estirpe celular de melanoma murino B16F10 se inyectan 2x10® células en 200 pl de suspensión celular en medio DMEM en la almohadilla de la pata o entre la piel y el cartílago en el lado dorsal de la oreja; o por inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal.
Dos días después de la inoculación celular, los animales se asignan al azar y se dividen en grupos que consisten en n=10 en cada grupo. Los animales en diferentes grupos se administran con péptido relacionado con MANS por vía intraperitoneal (ip), intravenosa (iv) o intramuscular (im) respectivamente a una dosis de aproximadamente 6.25 mg/kg. En algunos grupos, los animales se tratan por vía de inhalación (5 ml de péptido relacionado con MANS 0.1 mM en PBS) utilizando un nebulizador preclínico (Aeroneb Lab; Aerogen). Un grupo de ratones sirve como control de vehículo y se trata con PBS por ruta im. Los péptidos se administran en días alternos durante 6 semanas.
La puntuación del tumor se realiza semanalmente. Después de 6 semanas de tratamiento, todos los animales se sacrifican humanamente y los ganglios linfáticos y otras muestras de tejido se recolectan, se fijan en formalina y se someten a histopatología para evaluar la presencia de células de melanoma metastásico. Los signos y síntomas tóxicos clínicos se evalúan durante el período de administración de 6 semanas. La carga tumoral y la mortalidad se evalúan al final del período de estudio. Los resultados del estudio mostrarán que los péptidos relacionados con MANS inhiben la metástasis tumoral en un modelo de melanoma murino.
Ejemplo 8. Atenuación de ARNip de MARCKS en células de cáncer
Este estudio se realizó para determinar los efectos de la atenuación de ARNip de la expresión de MARCKS sobre la migración de células cancerosas. Las células de cáncer de pulmón humano PC-9 o A-549 se sembraron en pozos de plástico y se cultivaron hasta que las células alcanzaron el 70% de confluencia. Las células se transfectaron luego con 100 nM de ARNip de mArCKS o ARNip de control (100 nM) de Ambion (Austin, TX) al utilizar el reactivo de duotransfección DharmaFECT (Dharmacon, Lafayette, CO). Después de 72 horas, se recolectaron las células y se separaron cantidades equivalentes de proteínas por SDS/pAg E para el análisis Western blot utilizando anticuerpos específicos de MARKS. Se realizó un análisis de transferencia Western para confirmar la regulación descendente inducida por ARNip de MARCKS endógenas. Como se muestra en las Figuras 16 y 17, la proteína MARCKS se atenuó en aproximadamente un 60% en las células PC9 (Figura 16) y aproximadamente el 50% en las células A549 (Figura 17) en comparación con las células tratadas con ARNip de control.
Los efectos de atenuación de MARCKS por ARNip sobre la migración celular se determinaron utilizando un ensayo de Transwell. Tras la eliminación de ARNip, las células PC-9 o A549 se cultivaron en medio RPMI 1640 con FBS al 10% a 37°C, con CO2 al 5%. Se utilizaron placas Transwell® (24 pozos, tamaño de poro de 8 um) para los ensayos de migración. Las cámaras inferiores contenían 600 pl de medio basal FBS al 10%. Las células (1 x 105) se suspendieron en 100 pl de medio basal BSA al 1% y se agregaron a la cámara superior; Las placas se incubaron durante 12 h. Las células que migraron a la superficie inferior de los filtros se tiñeron con hematoxilina y se contaron. Se contaron por lo menos 3 campos microscópicos separados por membrana.
Los resultados del estudio se muestran en las Figuras 18 y 19. El tratamiento con ARNip de MARCKS inhibió significativamente la migración de las células PC-9 y A549. La atenuación de ARNip de MARCKS dio como resultado una reducción del 90% en la migración celular para la estirpe celular PC9 (Figura 18) y resultó en una reducción de aproximadamente el 50% en la migración celular para la estirpe celular A549 (Figura 19). Por lo tanto, la inhibición de la expresión de MARCKS produce una reducción significativa en la migración de las células cancerosas.
Ejemplo 9. Inhibición de ARNmicro21 aumenta la MARCKS y mejora la migración de células cancerosas
El ARNmicro 21 (miR21) regula los niveles de MARCKS en las células. En estos estudios, las células de cáncer de pulmón humano PC9 se transfectaron con 50 nM o 100 nM de inhibidor de miR21 o un imitador de mir21, o un control negativo de solo vehículo. Los niveles de MARCKS se midieron 48 horas después por Western Blot. El tratamiento con el inhibidor de miR21 (50 nM) aumentó los niveles de MARCKS en las células en ~2.5 veces (Figura 20). Estos valores se correlacionan con la capacidad de migración de las células cuando se colocan en cámaras de migración durante un período de 12 horas. Las células tratadas con el inhibidor de miR21 a 50 o 100 nM mostraron una migración mejorada que se correlacionaba con niveles aumentados de MARCKS, mientras que las células tratadas con imitador de miR21 mostraron una migración disminuida que se correlacionaba con niveles disminuidos de MARCKS (Figura 21). Las células tratadas con control de vehículo HiPerfect mostraron el mismo nivel de migración con respecto a las células PC9 no tratadas (Figura 21). Los resultados del estudio mostraron que un aumento en la expresión de MARCKS a través de la inhibición de miR21 aumenta la migración de células cancerosas. Más aún, la activación de miR21 dio lugar a una disminución de la migración de células PC9.
Tomados en conjunto, los estudios mostraron que la migración de células cancerosas y la metástasis de las células cancerosas se pueden inhibir al objetivar MARCKS utilizando varios medios diferentes de inhibición de MARCKS, que incluyen los péptidos relacionados con MANS y los ARNmicro inhibidores, es decir, un imitador de miR21.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y materiales, similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, se pueden utilizar en la práctica o la prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen en el presente documento.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto inhibidor de MARCKS para usar en un método para inhibir la metástasis de células cancerosas, en el que el compuesto inhibidor de MARCKS es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 231, la SEQ ID NO: 234, y SEQ ID NO: 235; en el que el aminoácido N-terminal y/o de terminal C de la secuencia peptídica se modifica químicamente.
2. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de la reivindicación 1, en el que el aminoácido de terminal N del péptido se modifica químicamente por acilación del aminoácido de terminal N del péptido en la forma de una amida seleccionada de grupo que consiste en:
una amida de un ácido carboxílico C2 (acetilo) a C24 alifático que puede ser lineal, ramificada, saturada o insaturada, una amida de ácido trifluoroacético,
una amida de ácido benzoico y
una amida de un ácido alquil sulfónico C1 a C24 alifático; o
el grupo amina de terminal N del aminoácido de terminal N del péptido se puede alquilar con un grupo seleccionado del grupo que consiste en:
un grupo alquilo alifático C1 a C24,
un grupo 2-(alquilo alifático C1 a C24) oxietilo lineal,
un grupo omega-metoxi-poli (etilenoxi) n-etilo, donde n es de 0 a 10.
3. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de la reivindicación 1 o 2, en el que la amida de terminal N se selecciona del grupo que consiste en acetilo y miristoilo.
4. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el aminoácido de terminal C del péptido se modifica químicamente por formación de amida en el grupo de ácido carboxílico de terminal C de la de terminal C aminoácido del péptido en forma de una amida seleccionada del grupo que consiste en:
una amida de amoníaco,
una amida de una alquil amina C1 a C24 alifática,
una amida de una alquil amina C2 a C24 alifática sustituida con hidroxilo,
una amida de un grupo 2-(alquilo C1 a C24 alifático) oxietilamino lineal y
una amida de un grupo omega-metoxi-poli (etilenoxi)n-etilamina, donde n es de 0 a 10.
5. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de la reivindicación 4, en el que el péptido comprende una sustitución de aminoácidos de configuración d.
6. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de la reivindicación 4, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en N-acetil-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 106); N-miristoil-AKGE (s Eq ID NO: 219); N-miristoil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 106); N-miristoil-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO: 106); N-acetil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 121); N-miristoil-GAQFSKTAA (SEQ ID NO: 121); N-acetil-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 106121); y acetil-GAQFS (d) KTAA (d) K (SEQ ID NO 106).
7. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en Ac-GAQFSKTAAK-OH (SEQ ID NO: 106), Ma-GAQFSKTAAK-OH (SEQ ID NO: 106), MA-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 106), Ac-RGAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 234), Ac-GAQFSKTAA-OH (SEQ ID NO: 121), Ma-RGAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 234), y Ma-AKGE-OH (SEQ ID NO: 219).
8. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el método comprende la administración por inhalación de una solución o suspensión líquida, o por inhalación de una formulación de polvo seco del péptido, o por inyección de una formulación líquida del péptido, o por inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal o por administración oral o de supositorios.
9. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de la reivindicación 8, en el que la inyección es un tumor que contiene la célula cancerosa.
10. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de la reivindicación 8, en el que el tumor es un tumor sólido o un tumor no sólido.
11. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el péptido se administra en una dosis de entre aproximadamente 0.01 mg/kg/día a 10 mg/kg/día, preferiblemente de entre aproximadamente 0.5 mg/kg/día a 2.5 mg/kg/día.
12. Un compuesto inhibidor de MARCKS para uso en un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el compuesto inhibidor de MARCKS se proporciona como una formulación que comprende un fármaco adicional útil en el tratamiento del cáncer, preferiblemente en el que el fármaco adicional es una quimioterapia fármaco, preferiblemente en el que el fármaco quimioterapéutico se selecciona de carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, temozolomida, gemcitabina, cladribita, periquitador, clofarabina, cistabina, fletarina, fludarabina, brotinotransparentes, clofarabina, cincarabina, cincarabina, flácido epirubicina, idarubicina, topotecán, irinotecán, etopósido, enipósido, colchicina, vincristina, vinblastina, vinorelbina, paclitaxel y docetaxel.
13. Un péptido para uso en un método para inhibir la metástasis de una célula cancerosa en un mamífero, en el que el método comprende administrar a dicho mamífero un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 a la Se Q ID n O: 231, SEQ ID NO: 234, y SEQ ID NO: 235; en el que el aminoácido de terminal N y/o de terminal C de la secuencia peptídica se modifica químicamente, y en el que dicho péptido exhibe un índice de migración de al menos aproximadamente 2.0 después del tratamiento previo de células de carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) con una concentración de 100 mmol de dicho péptido y un período de migración de 12 horas.
14. Un péptido para uso en un método de la reivindicación 13, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en Ac-GAQFSKTAAK-OH (SEQ ID NO: 106), Ma-GAQFSKTAAK-OH (SEQ ID NO: 106), MA-GAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 106), Ac-RGAQFSKTAAK-NH2 (SEQ ID NO: 234), Ac-GAQFSKTAA-OH (SEQ ID NO: 121), Ma-RGAQFSKTAAKNH2 (SEQ ID NO: 234) y Ma -AKGE-OH (SEQ ID NO: 219).
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