KR102151290B1

KR102151290B1 - 1―［1―（벤조일）―피롤리딘―2―카보닐］―피롤리딘―2―카보니트릴 유도체

Info

Publication number: KR102151290B1
Application number: KR1020157015736A
Authority: KR
Inventors: 어니스트 지랄트 레도; 테레사 탈라고 크루아; 로저 프라데스 코사노; 솔레다드 로요 그라시아
Original assignee: 유니버시테이트 드 바르셀로나; 펀다시오 인스티튜트 드 르세르카 바이오메디카 (아이알비 바르셀로나); 이프로테오스 에스.엘
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2020-09-03
Also published as: BR112015010377A2; SI2917209T1; HK1214597A1; RS55865B1; ZA201504269B; JP2015536965A; HRP20170485T1; PT2917209T; EP2917209B1; MX367488B; AU2013343430B2; US10125097B2; CA2890042A1; LT2917209T; EA028422B1; WO2014072498A1; BR112015010377A8; PL2917209T3; CY1118818T1; KR20150082634A

Abstract

본 발명은 약학적 활성을 가지는 1-[1-(벤조일)-피롤리딘-2-카보닐]-피롤리딘-2-카보니트릴 유도체,
[화학식 (I)]

이러한 화합물의 제조 공정, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 인지 장애의 치료 및/또는 예방 용도에 관한 것이다.

Description

1―［1―（벤조일）―피롤리딘―2―카보닐］―피롤리딘―2―카보니트릴 유도체{1-[1-(BENZOYL)-PYRROLIDINE-2-CARBONYL]-PYRROLIDINE-2-CARBONITRILE DERIVATIVES}

본 발명은 약학적 활성을 가진 화합물, 특히 일부 1-[1-(벤조일)-피롤리딘-2-카보닐]-피롤리딘-2-카보니트릴 유도체, 이러한 화합물의 제조 공정, 이를 포함하는 약학적 조성물, 및 이의 인지 장애의 치료 및/또는 예방 용도에 관한 것이다.

프롤릴 올리고펩티다아제(EC 3.4.21.26)(POP), 프롤릴 엔도펩티다아제(PREP)로도 알려진, 는 세린 프로테아제이며, L-프롤린 잔기의 C-말단 측에서 펩티드의 가수분해를 촉매한다. 이는 포유동물에 널리 분포되어 있고, 뇌를 포함하는 다양한 장기로부터 정제될 수 있다.

상기 효소는 학습 및 기억 기능과 연관된 프롤린-함유 뉴로펩티드의 분해(breakdown)에 중요한 역할을 한다(Wilk S et al., Life Sci . 1983;33:2149-57; O'Leary RM, O'Connor B, J. Neurochem . 1995;65:953-63).

프롤릴 올리고펩티다아제 억제 효과는 신경퇴행성 과정(neurodegenerative processes)과 연관된 인지 결핍의 치료에서 테스트되었다. 파킨슨 질환은 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(MPTP), 물질 P의 고갈을 생성하는 신경독(neurotoxin), 으로 처리된 원숭이에서 생성되었다. S-17092, 강력한 POP 억제제, 는 후속 처리는 인지 과제(cognitive tasks)의 성능을 증가시켰다(Schneider JS et al., Neuropsychopharmacology 2002;26(2):176-82). 또한, POP 억제는 생체 외에서(ex vivo) α-시누클레인의 올리고머화를 억제한다[Myohanen TT et al., Br. J. Pharmacol . 2012;166(3):1097-113]. 알츠하이머 질환(AD)의 경우, 동물 모델에서의 여러 가지 생체 내(in vivo) 실험은 POP 억제가 신경보호(neuroprotective) 및 인지-강화(cognition-enhancing) 효과를 이끄는 것을 보여주었다(Kato A et al., J. Pharmacol . Exp . Ther . 1997;283(1):328-35 and Toide K et al., Rev. Neurosci. 1998;9(1):17-29). 신경보호(neuroprotective) 효과는 원래 카츠베(Katsube) 그룹에 의해 관찰되었으며, 이는 피질 및 소뇌의 과립세포가 POP 억제제인 ONO-1603의 처리에 의한 나이-유발 세포사멸(age-induced apoptosis)로부터 예방되었을 때이다(Katsube N et al., J. Pharmacol . Exp . Ther . 1999;288(1):6-13).

인지 결핍의 치료에서 POP 억제제로의 임상 시험은 단지 몇몇의 경우에 수행되었다. 1상 임상 연구에서 모레인(Morain) 그룹(Morain P et al., Br. J. Clin . Pharmacol. 2000;50(4):350-9)은 새로운 경구 활성 프롤릴 엔도펩티다아제 억제제 S 17092를 발견하였으며, 이는 건강한 노인 피험체에서 인지-향상 특성 및 명확한 투여량-의존성(dose-dependency)을 보여주었고; 게다가, 부작용이 발견되지 않았다. 후속 연구는 이 화합물에 대한 추가적인 약간의 기분-안정 특성(slight mood-stabilizing properties)을 암시한다(Morain P et al., Neuropsychobiology 2007;55(3-4):176-83).

프롤릴 올리고펩티다아제 활성은 여러 신경 퇴행성 질환, 알츠하이머 질환(AD), 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환 및 다발성 경화증(MS), 에서 변경될 것으로(사후) 보고되었다(Mantle D et al., Clin . Chim . Acta 1996;249(1-2):129-39).

또한, 신경 퇴행성 질환, 예컨대 AD, MS 및 파킨슨 질환, 의 발병(pathogenesis)에 신경염증(neuroinflammation) 역할을 가리키는 증거가 상당량 있다(Hirsch EC et al., Lancet Neurol . 2009;8(4):382-97, Philips T et al., Lancet Neurol . 2011;10(3):253-63). POP는 뇌의 Tβ4에서 항-염증 테트라펩티드 Ac-SDKP의 방출에 연관된 주요 효소로 간주되고 있다(Yang F et al., Hypertension 2004;43(2):229-36, Nolte WM et al., Biochemistry 2009;48(50):11971-81). 이는 POP 억제가 신경염증 감소에 도움이 되고, 따라서 POP 억제제는 염증 성분으로 알츠하이머 및 파킨슨 질환과 같은 신경 퇴행성 질환의 치료에 유용할 수 있고 이들 질환과 연관된 인지 장애 개선에 특히 도움이 될 것으로 예상된다.

대뇌 피질의 뇌 영역에 걸쳐 확산 되어있는 노인성 플라크(Senile plaques)는 AD의 전형적인 신경 병리학적 특징이다.

이들 플라크의 주요 단백질 성분은 아밀로이드 β-펩티드이다(Aβ). Aβ의 퇴적은 뇌에서 신경 기능 장애(dysfunction) 및 죽음을 촉발시킨다. 이 펩티드는 β-아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 유래된다. 정상 조건 하에서, APP는 Aβ 생성을 배제하는 가용성 APPα 생성을 위하여 α-세크레타아제에 의해 쪼개진다.

흥미롭게도, POP 억제는 세포 내 IP3 수준을 증가시키며, 이는 APPα 생산의 자극에 기여할 수 있고, 다시 Aβ 생성을 감소시킨다.

또한, 로스너(Rossner)(Rossner S et al., Neurochem . Res. 2005;30(6-7):695-702)는 Aβ 플라크에 영향을 받은 AD 환자의 뇌 구조에서 적은 POP 면역반응 뉴런(immunoreactive neurons)을 발견하였다.

또한, 물질 P는 β-아밀로이드 단백질의 신경독 작용(neurotoxic action)을 억제할 수 있는 것으로 보인다(Kowall NW et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 1991;88(16):7247-51). 프롤릴 올리고펩티다아제 억제제는 물질 P의 대사를 억제하여 물질 P의 수준을 유지하는데 도움이 되고, 이는 β-아밀로이드 단백질의 신경독 작용(neurotoxic action)을 억제할 수 있다.

상기 효과의 관점에서, 프롤릴 올리고펩티다아제 억제제는 질환과 연관된 인지 장애의 개선에 도움이 알츠하이머 질환의 치료에 유용한 약물이 될 수 있다고 생각된다.

또한, 프롤릴 올리고펩티다아제는 다발성 경화증(MS)과 연관이 있을 수 있는 여러 요인과 연관되어 있다. 예를 들어, POP는 미세 아교 세포(microglia)의 조절에 관여된다(Klegeris A et al., Glia 2008;56(6):675-85). 실제로, 최근 보고서는 POP 와 MS의 직접 연결을 규명했다; RR-MS 환자의 혈장 POP 활성은 현저하게 감소하였다(Tenorio-Laranga J et al., J Neuroinflammation 2010;7:23). 흥미롭게도, 감소는 질환 증상의 중증도와 상관 관계가 있으나, 환자의 연령과는 관계가 없다. 대신에, POP 활성과 연령과의 역 상관 관계가 건강한 대조군에서 관찰되었고, 노인 대조군에서 수준은 MS 환자에서 발견된 것과 비슷하였다.

파킨슨 질환의 신경병리학적 특징은 루이체(Lewy bodies)로 알려진 세포내 봉입체(intracellular inclusions)와 함께 흑색질 치밀부(substantia nigra pars compacta)에서 멜라닌화된 도파민 작용성 뉴런의 진행성 퇴행(progressive degeneration)이다. 루이체(Lewy bodies)의 주요 구성 요소는 140 아미노산 단백질인 α-시누클레인이다. 특정 조건 하에서, α-시누클레인 단량체는 세포 독성 불용성 피브릴을 생성할 수 있는 원섬유(protofibril) 또는 프리피브릴라 응집체(prefibrillar aggregates)를 형성하도록 상호작용한다. 이들 피브릴(fibril)은 프로테아좀에 의해 분해되지 않고, 그들은 이 세포내 단백질 분해 시스템의 기능을 손상시킨다. 이는 세포질에서의(Bennett MC, Pharmacol . Ther . 2005;105(3):311-31) α-시누클레인 원섬유(protofibril)의(그리고 프로테아좀에 의해 분해된 다른 단백질) 축적에 이르게 하며, 결과적으로, α-시누클레인 원섬유(protofibril)는 파킨슨 질환 환자의 뇌에서 증가하였다. 이들 피브릴은 α-시누클레인 과발현 세포 및 마우스 모델에서 신경 독성과 연관이 있다(Masliah E et al., Science 2000;287(5456):1265-9; Gosavi N et al., J. Biol . Chem . 2002;277(50):48984-92). 미스 폴드 α-시누클레인의 이상 축적은 미토콘드리아 변화를 이끌며, 이는 산화 스트레스를 촉진하고 세포 사멸을 불러일으킬 수 있다(Hsu LJ et al., Am. J. Pathol. 2000;157(2):401-10). 또한, α-시누클레인 유전자에서 세 점 돌연변이(A53T, A30P 또는 E46K)는 파킨슨 질환의 가족성 형태(familial form)의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다(Polymeropoulos MH et al., Science 1997;276(5321):2045-7; Zarranz JJ et al., Ann. Neurol . 2004;55(2):164-73).

시험관에서(in vitro) 단백질을 야생형 돼지 POP의 클론과 함께 배양했을 때 α-시누클레인의 응집속도가 향상된 것을 보여주었고, 이 향상은 POP 농도에 의존한다(Brandt I et al., Peptides 2008;29(9):1472-8). 게다가, POP 활성이 없는 돌연변이 변종(S544A)은 응집 속도가 가속화되지 않았다.

향상된 응집 또한 POP 억제제의 첨가에 의해 예방될 수 있고, 그 효과는 POP 효소 활성에 의존적임을 암시한다. 최근의 증거는 POP 억제제가 인간의 α-시누클레인 과발현 신경모세포종(neuroblastoma) SH-SY5Y 세포에서 산화 스트레스에 의해 유도된 상승된 α-시누클레인 응집을 차단할 수 있다 Myohanen TT et al., Br. J. Pharmacol. 2012; 166(3):1097-113. POP는 SH-SY5Y 세포에서 α-시누클레인과 공존(colocalize)하고, 이 공존(colocalization)은 POP 억제제와 함께 배양 후 사라지며, 이는 POP 및 α-시누클레인 사이의 상호 작용을 가리킨다. POP 억제제의 5일 처리는 A30P α-시누클레인 형질전환 마우스의 뇌에서 가용성 α-시누클레인을 감소시켰다.

따라서, 뇌 POP 활성의 억제는 α-시누클레인 응집을 예방하고, 따라서, 루이체(Lewy bodies)에 존재하는 세포 독성 원섬유(protofibril)의 형성을 예방한다. 따라서, POP 억제제는 잠재적으로 α-시누클레인 응집이 가속된 신경 퇴행성 장애의 치료에 치료적 가치를 가질 수 있다.

POP를 억제할 수 있는 화합물은 랫에서 스코폴라민에 의해 유도된 실험적 건망증(experimental amnesia)을 예방하는 효과가 있고, POP 억제제는 니모닉(mnemonic) 기능장애의 완화 기능을 가지는 것으로 추론된다(Yoshimoto T et al., J. Pharmacobiodyn . 1987;10:730-5).

로스마린산(rosmarinic acid)의 아만성 투여 효과, 비경쟁적 POP 억제제(상대적으로 높은 IC50 값인 63.7 μM), 는 랫에서 모리스 수중 미로(Morris water maze)로 테스트되었고, 공간 기억의 향상이 보고되었다(Park DH et al., Fitoterapia 2010;81(6):644-8).

양극성 장애를 가진 환자는 혈청에서 높은 수준의 POP 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 최근, POP는 이 질병의 치료를 위한 타겟으로서 중요성을 얻고 있고, 특히 이노시톨-1,4,5-P3 (IP3)의 대사에서 그의 연관 때문이다. IP3은 신경펩티드의 캐스케이드(cascade)에서 신호의 전달에 중요한 분자이다. 특정 수용체에 대한 결합을 통해, 신경펩티드는 IP3의 증가를 유도하고, 이는 소포체의 막에서 이의 수용체와 결합하고 Ca2+의 방출을 유도하며, 이는 학습 및 기억에 중요한 역할을 하는 하는 것으로 생각된다. 최근의 연구 결과는 POP가 IP3의 농도를 조절하는 것을 보여준다(Komatsu Y J. Neurosci . 1996;16:6342-52). 따라서, 진핵생물 딕티오스텔리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum)에서 POP의 유전자 파괴가 IP3의 상승을 통해 리튬에 대한 저항성을 유도하는 것으로 알려져있고(Schulz I et al., Eur . J. Biochem . 2002;269:5813-20), 또한 POP의 단백질 분해 활성을 감소시키고, 이는 POP에 대한 안티센스 인간 신경 교종 세포에서 고농도 IP3에 대한 책임이 있다. 이 효과는 또한 이들 세포가 특정 POP 억제제로 처리된 경우 관찰되었다(Williams RS et al., EMBO J. 1999;18:2734-45).

IP3 신호 경로는 여러 약물 치료 기분 안정제(리튬, 카바마제핀 및 발프로산) 및 양극성 장애를 야기할 수 있는 IP3 신호 조절 메커니즘 결함과 연관되어 있다. 게다가, 기분 안정제 약물은 양극성 장애의 치료에 통상적으로 사용되며, 발프로산은 재조합 POP의 활성을 직접적으로 억제한다(Cheng L et al., Mol . CeII . Neurosci. 2005;29: 155-61). 요약하자면, POP 억제제가 표유동물에서 양극성 정동 장애의 예방 및/또는 치료에 유용하다는 강력한 증거가 있다. 따라서, POP의 신규한 억제제의 제공은 이 장애 또는 질환의 치료에 흥미가 있다.

요약하자면, 여러 인지 과제에서 여러 POP 억제제의 효과가 특징지어져 있고, POP 억제제가 학습 및 기억에 긍정적인 효과를 가지고 있다는 일종의 합의가 있다(Morain P et al., CNS Drug. Rev. 2002;8(1):31-52; Shinoda M et al., Eur . J. Pharmacol . 1996;305(1-3):31-8; Marighetto A et al., Learn. Mem . 2000;7(3):159-69; Toide K et al., Pharmacol . Biochem . Behav . 1997;56(3):427-34; Schneider JS et al., Neuropsychopharmacology 2002;26(2):176-82).

여러 특허 및 특허 출원은 POP 억제제를 개시하고 있다: WO 2008/077978 A1, WO 2005/027934 A1, JP 2011-037874 A2, WO 2005/002624 A1, WO 2004/060862 A2, WO 03/04468 A1; DE 196 03 510 A1, US 2006/0100253 A1 및 US 6,159,938 A, 그러나 오직 몇몇의 화합물만이 생체내(in vivo) 연구를 경험하였고(JTP-4819, S 17092, Z-321, ONO-1603, Y-29794, ZTTA, Z-Pro-Prolinal, 및 KYP-2047), 오직 상기 리스트의 첫 세 개만이 임상 시험에 진입하였고, 그들 중 누구도 시장에 도달하지 못했다.

POP 억제제의 존재에도 불구하고, 여전히 당해 기술분야에서는 POP와 높은 친화력을 같은 대체 화합물 및 인지 장애를 치료하기 위하여 사용되는 경우 억제제의 작용이 일어나는 뇌에 도달하는 혈액-뇌 장벽을 통과하는 양호한 용량의 제공이 필요하다. 이는 인지 장애의 치료에 사용하기 위한 좋은 후보가 될 화합물의 중요한 기능이다.

본 발명자들은 이에 성공적으로 1-[1-(벤조일)-피롤리딘-2-카보닐]-피롤리딘-2-카보니트릴 유도체의 시리즈(series)를 발견하였고, 높은 효능으로 POP를 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 평행 인공 막(parallel artificial membrane)을 통과(cross)할 수 있으며, 이는 혈액-뇌 장벽을 통과하는 능력을 예측하는 방법도 가능하다. 이러한 두 가지 특성은 본 발명의 화합물을 인지 장애의 치료에 사용하기 위한 이상적인 후보로 만들었다.

따라서, 본 발명의 일 측면은 화학식 (I)를 가지는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 전구약물(prodrug), 또는 용매화물에 관한 것이다:

[화학식 (I)]

여기서,

R¹, R², R³ 및 R⁴ 는 독립적으로 C₁ _- ₄알콕시, C₁ _- ₄알킬카보닐옥시, 벤질옥시, 페닐카보닐옥시, 나프틸카보닐옥시, 퀴놀리닐카보닐옥시, 이소퀴놀리닐카보닐옥시, 트리플루오로메틸, 할로겐 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R⁵ 는 할로겐, 니트릴, C₁ _- ₄알콕시, C₁ _- ₄알킬씨오, C₁ _- ₄알킬, C₁ _-4 알킬카보닐옥시, 페닐, 페녹시, 페닐씨오 및 트리플루오로메틸로 이루어진 군으로부터 선택되며;

R⁶ 는 수소, 플루오르 및 메틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 전구약물(prodrug), 또는 용매화물의 제조하는 공정에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 전구약물(prodrug), 또는 용매화물 및 약학적으로 허용가능한 담체, 애주번트(adjuvant) 또는 비히클(vehicle) 중 적어도 어느 하나를 포함하는 약제 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 약제로서의 용도, 특히 인지 장애의 예방 및/또는 치료를 위한, 인 상기에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 전구약물(prodrug), 또는 용매화물, 특히 인지 장애의 예방 및/또는 치료

본 발명의 또 다른 측면은 포유동물의 인지 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 전구약물(prodrug), 또는 용매화물의 치료 양(therapeutic amount)을 상기 치료가 필요한 환자(patient)에 투여한다. 특정 양태에서, 상기 장애는 정신분열증(schizophrenia), 양극성 정동 장애(bipolar affective disorder), 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환과 연관된 인지 장애이다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 전구약물(prodrug), 또는 용매화물의 용도에 관한 것으로, 약제의 제조를 위하여, 특히 인지 장애의 예방 및/또는 치료를 위하여 더욱 특별히 정신분열증(schizophrenia), 양극성 정동 장애(bipolar affective disorder), 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환과 연관된 인지 장애를 위한 것이다. 이들 측면 및 바람직한 양태는 또한 추가적으로 청구항에서 정의된다.

본 발명의 문맥에서, 다음 용어는 하기 상세한 의미를 가진다.

본원에서 사용된 C₁ _- ₄알킬은, 기 또는 기의 일부로서, 1 내지 4개의 탄소 원자를 가지는 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소 라디칼로 정의되며, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 세크-부틸 및 털트-부틸이 있다. 알킬 라디칼은 임의로 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있으며, 예컨대 아릴, 할로, 히드록시, 알콕시, 카복시, 시아노, 카보닐, 아실, 알콕시카보닐, 아미노, 니트로, 머캅토, 알킬씨오 등이 있다. 아릴로 치환하면 우리는 "아르알킬" 라디칼을 가지며, 예컨대 벤질 및 페네틸이 있다.

용어 C₁ _- ₄알콕시는 C₁ _- ₄알킬옥시 또는 C₁ _- ₄알킬 에테르 라디칼을 의미하며, 용어 C₁ _- ₄알킬은 상기에서 정의된 바와 같다. 적합한 알킬 에테르 라디칼의 예로는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소-프로폭시, n-부톡시, i-부톡시, 세크-부톡시 및 털트-부톡시를 포함한다.

용어 C₁ _-4 알킬카보닐옥시는 -C(=O)-O- 기에 결합한 C₁ _- ₄알킬을 의미하며, 용어 C₁ _- ₄알킬은 상기에서 정의된 바와 같다.

"할로겐", "할로" 또는 "할(hal)" 은 브로모, 클로로, 요오도 또는 플루오로에 관한 것이다.

"니트릴", "시아노" 또는 "카보니트릴"은 -C≡N 기에 관한 것이다.

용어 C₁ _- ₄알킬카보닐은 카보닐 -C(=O)- 기와 연결된 C₁ _- ₄알킬에 관한 것이다.

용어 페녹시는 페닐옥시 또는 페닐 에테르 라디칼을 의미한다.

용어 페닐씨오는 씨오에테르 기 -S- 와 연결된 페닐을 의미한다.

정의에서 사용된 임의의 분자 모이어티(moiety)상 라디칼 위치는 이러한 모이어티가 화학적으로 안정하다면 어디든지 있을 수 있음을 주목해야 한다.

달리 언급하지 않는 한, 본원의 임의의 변이체의 정의에서 사용된 라디칼은 모든 이성질체를 포함한다.

용어 "염"은 본 발명에 따라 사용된 활성 화합물의 임의의 형태로서, 상기 화합물은 이온 형태 또는 대전되고 반대-이온(counter-ion)(양이온 또는 음이온)과 결합하거나 용액 중에 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 이 정의는 4차 암모늄 염 및 다른 분자 및 이온과 활성 분자의 착체(complexes)를 포함하며, 특히, 이온 상호작용을 통해 형성된 착체를 포함한다. 상기 정의는 특정한 생리학적으로 허용가능한 염을 포함하고; 이 용어는 "약리학적으로 허용가능한 염" 또는 "약학적으로 허용가능한 염"에 해당하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 문맥에서 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 생리학적으로(보통 독성이 아닌 것을 의미하며, 특히, 반대-이온의 결과로서) 용인되는 임의의 염을 의미하며, 치료를 위하여 적절한 방식으로 사용되는 경우, 특히, 인간 및/또는 포유동물에서 적용되거나 사용된다. 이들 생리학적으로 허용되는 염은 양이온 또는 염기와 함께 형성될 수 있고, 본 발명의 문맥에서, 본 발명에 따라 사용된 적어도 하나의 화합물에 의해 형성된 염으로 이해되어야 하며 -보통 산(탈양성자화된(deprotonated))- 예컨대, 음이온, 특히 인간 및/또는 포유동물에 사용되는 경우이다. 이들 생리학적으로 허용가능한 염은 또한 음이온 또는 산과 함께 형성될 수 있고, 본 발명의 문맥에서, 본 발명에 따라 사용된 적어도 하나의 화합물에 의해 형성된 염으로 이해되어야 하며 - 보통 양성자 첨가된(protonated), 예를 들어 질소 - 예컨대, 양이온 및 적어도 하나의 생리학적으로 용인된 음이온, 특히 인간 및/또는 포유동물에서 사용되는 경우이다. 이 정의는 특히 본 발명의 문맥에서 생리학적으로 용인된 산에 의해 형성된 염을 포함하며, 즉, 생리학적으로 용인된 유기 또는 무기 산과 특정 활성 화합물의 염 - 특히 인간 및/또는 포유동물에 사용되는 경우이다. 이 유형의 염의 예는 이들과 함께 형성된다: 염산, 히드로브롬산, 황산, 메탄설폰산, 포름산, 아세트산, 옥살산, 숙신산, 말산, 타르타르산, 만델산, 푸마르산, 락트산 또는 시트르산.

본 발명에 따른 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 활성 화합물의 임의의 형태를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 상기 화합물은 다른 분자에 비-공유 결합에 의해 결합된다(보통 극성 용매), 특히 수화물 및 알코올레이트(alcoholates), 예를 들어, 메탄올레이트(methanolate). 바람직한 용매화물은 수화물이다.

임의의 화합물, 화학식 (I)의 화합물의 전구약물(prodrug), 은 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 용어 "전구약물(prodrug)"은 이의 가장 넓은 의미로 사용되며 본 발명의 화합물로 생체 내(in vivo)에서 변환되는 이의 유도체를 포함한다. 전구약물(prodrug)의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 화학식 I 의 화합물의 유도체 및 대사물을 포함하며, 이는 생가수분해성(biohydrolyzable) 모이어티(moieties) 예컨대, 생가수분해성 아미드, 생가수분해성 에스테르, 생가수분해성 카바메이트, 생가수분해성 카보네이트, 생가수분해성 우레이드(ureides), 및 생가수분해성 포스페이트 유사체를 포함한다. 바람직하게, 카복실 기능성기를 가진 화합물의 전구약물(prodrugs)는 카복실산의 저급 알킬 에스테르이다. 카복실레이트 에스테르는 분자 상에 존재하는 임의의 카복실산 모이어티(moieties)의 에스테르화에 의해 편리하게 형성된다. 전구약물은 일반적으로 잘-알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있으며, 예컨대 "Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6th ed.(Donald J. Abraham ed., 2001, Wiley), "design and Applications of Prodrugs"(H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers) 및 Krogsgaard-Larsen et al. "Textbook of Drug design and Discovery" Taylor & Francis (April 2002)에 기재되어 있다.

상기 화학식 (I)로 표시되는 본 발명의 화합물은 카이랄 중심의 존재에 따른 거울상 이성질체를 포함하거나 다중 결합의 존재에 따른 이성질체를 포함한다(예를 들어, Z, E). 단일 이성질체, 거울상 이성질체 또는 부분 입체 이성질체 및 이의 혼합물은 본 발명의 범주 내에 있다.

또한, 본원에 언급된 임의의 화합물은 토토머(tautomers)로서 존재할 수 있다. 구체적으로, 용어 토토머(tautomers)는 화합물의 둘 이상의 구조 이성질체 중 하나로서 평형 상에 존재하고 즉시 하나의 이성질체의 형태에서 다른 형태로 전환된다. 통상의 토토머 쌍은 아민-이민, 아미드-이미드산, 케토-에놀, 락탐-락팀, 등이다.

달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 화합물은 또한 동위원소-표지된 형태를 포함하며, 즉, 오직 하나 이상의 동위원소-풍부한 원자의 존재에서 상이한 화합물. 예를 들어, 중수소(deuterium) 또는 삼중수소(tritium)에 의해 적어도 하나의 수소 원자가 치환되거나, ¹³C- 또는 ¹⁴C-풍부한 탄소에 의해 적어도 하나의 탄소가 치환되거나, ¹⁵N-풍부한 질소에 의해 적어도 하나의 질소가 치환된 것을 제외한 본 발명의 구조를 가지는 화합물은 본 발명의 범주 내에 있다.

화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물은 바람직하게 약학적으로 허용가능한 또는 실질적으로 순수한 형태이다. 약학적으로 허용가능한 형태를 의미하는 것으로, 그 중에서도(inter alia), 보통 약학적 첨가제, 예컨대 희석제 및 담체, 를 제외하는 순도의 약학적으로 허용가능한 수준을 가지며, 보통 투여량 수준에서 독성(toxic)으로 여겨지는 어떤 물질을 포함하지 않는다. 약물(drug substance) 순도 수준은 바람직하게 50% 이상, 더 바람직하게 70% 이상, 가장 바람직하게 90% 이상이다. 바람직한 양태에서, 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염, 용매화물 또는 전구약물(prodrugs)은 95% 이상이다.

전술한 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 전구약물(prodrugs)"은 임의의 염, 용매화물, 또는 임의의 다른 화합물을 나타내며, 받는 사람에게 투여시, 이는 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있다. 그러나, 비-약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 및 전구약물(prodrugs) 또한 본 발명의 범주 내에 있음을 이해할 수 있으며, 이는 이들은 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 및 전구약물(prodrugs)의 제조에 유용할 수 있기 때문이다. 염, 용매화물 및 전구약물(prodrugs)의 제조는 당해 분야에 공지된 방법에 의해서 수행될 수 있다.

본원에 사용된 "치료하다(treat)", "치료하는(treating)" 및 "치료(treatment)"는 질환 또는 질병, 예컨대, 인지 장애의 근절, 제거, 전환(reversion), 완화, 변경(modification), 또는 조절을 포함한다.

본원에 사용된, 용어 "예방(prevention)", "예방하는(preventing)", "예방의(preventive)", "예방하다(prevent)" 및 "예방(prophylaxis)"은 질환 또는 질병, 예컨대, 인지 장애, 이의 발병 전에, 의 발명 또는 발전을 회피, 최소화 또는 어렵게하는 화학식 (I)의 화합물의 능력을 나타낸다.

따라서, "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)" 및/또는 "예방하는(preventing)" 또는 "예방(prevention)" 에 의해, 전체적으로, 적어도 피험체를 고통스럽게 하는(afflicting) 질병과 연관된 증상의 억제 또는 개선을 의미하고, 억제 및 개선은 적어도 변수의 크기(magnitude of a parameter)를 나타내는 넓은 의미로 사용된다, 예를 들어, 치료될 질병과 연관된 증상, 예컨대, 인지 장애. 이와 같이, 본 발명의 방법은 또한 질병이 완전히 억제되는 상황을 포함하고, 예를 들어, 발생으로부터 예방, 또는 정지, 예를 들어, 종료, 이로써 피험체가 더 이상 질병을 겪지 않는다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 인지 장애를 예방하고 관리하는 것을 모두 포함한다.

본원에 사용된, 용어 "인지 장애"는 사고(thinking), 학습 또는 기억과 연관된 정신적인 활동의 결핍에 의해 특징지어지는 어떤 질병을 의미한다. 이러한 장애의 예로는 인지불능(agnosias), 기억상실증(amnesias), 실어증(aphasias), 행동 불능(apraxias), 일시정신착란(deliriums), 치매(dementias), 및 학습 장애를 포함한다.

인지 장애는 뉴런 또는 뉴런 사이에서 신호의 전단에 연관된 다른 구조의 손실 또는 손상에 의해 특징지어지는 다른 질병과 연관(즉, 이의 존재하에 발생 또는 원인이 된다) 될 수(그리고 자주 있다) 있다. 따라서, 인지 장애는 신경 퇴행성 질환과 연관될 수 있으며, 예컨대, 알츠하이머 질환, 피질기저 퇴행(corticobasal degeneration), 크루츠펠트-야콥 질환(Creutzfeldt-Jacob disease), 전측두엽 퇴화(frontotemporal lobar degeneration), 헌팅턴 질환, 다발성 경화증, 정상 뇌압 수두증(normal pressure hydrocephalus), 유기 만성 뇌 증후군(organic chronic brain syndrome), 파킨슨 질환, 픽 질환(Pick disease), 진행성 핵상안근 마비(progressive supranuclear palsy), 또는 노인성 치매(senile dementia)(알츠하이머 유형).

인지 장애는 또한 중추 신경계의 정상적인 기능을 손상시키는 다른 질병과 연관될 수 있으며, 정신 장애(psychiatric disorders), 예컨대, 불안 장애(anxiety disorders), 해리성 장애(dissociative disorders), 기분 장애(mood disorders), 예로서, 양극성 정동 장애(bipolar affective disorder), 정신분열증(schizophrenia), 그리고 신체형 및 꾀병(somatoform and factitious disorders)을 포함한다.

본원에 기재된 화합물은 인지불능(agnosias), 기억상실증(amnesias), 실어증(aphasias), 행동 불능(apraxias), 일시정신착란(deliriums), 치매(dementias), 학습 장애 및 다른 인지 장애를 치료하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 치매의 예로는 AIDS 치매 증후군(AIDS dementia complex), 빈스완거 질환(Binswanger's disease), 루이체 치매(dementia with Lewy Bodies), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 다경색 치매(multi-infarct dementia), 픽 질환(Pick's disease), 의미 치매(semantic dementia), 노인성 치매(senile dementia), 및 혈관성 치매(vascular dementia)를 포함한다.

본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 학습 장애의 예로는 아스퍼거 증후군(Asperger's syndrome), 주의력 결핍 장애(attention deficit disorder), 주의력 결핍 과잉행동장애(attention deficit hyperactivity disorder), 자폐증(autism), 소아기 붕괴성 장애(childhood disintegrative disorder), 및 레트 증후군(Rett syndrome)을 포함한다.

본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 실어증(aphasia)의 예로는 진행성 비-유창성 언어장애(progressive non-fluent aphasia)를 포함한다.

본원에 기재된 화합물은 또한 정신적인 활동의 결핍을 가지는 환자를 치료하기 위하여 사용될 수 있으며, 이는 가볍거나 그렇지 않으면 크게 일상 생활에 방해가 되지 않는다. 가벼운 인지 손상은 이러한 질병의 예이다: 가벼운 인지 손상을 가진 환자는 치매의 증상을 보여주나(예를 들어, 언어 또는 기억의 어려움), 이들 증상의 중증도는 치매의 진단이 적절하지 않을 수 있다. 본원에 기재된 화합물은 가벼운 인지 손상 및 다른, 인지 장애의 유사하게 덜 심각한 형태를 치료하는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 포유동물의 인지장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 본 발명의 화합물의 치료 양(therapeutic amount)을 상기 치료가 필요한 환자(patient)에 투여한다.

본 발명의 특정 양태에 있어서, 본원에 설명된 화합물은 정신분열증(schizophrenia), 양극성 정동 장애(bipolar affective disorder), 알츠하이머 질환 또는 파킨슨 질환과 연관된 인지 장애를 가진 환자를 치료하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 전구약물(prodrug) 또는 용매화물에 있어서, R¹ 은 수소이고; R², R³ 및 R⁴ 는 C₁ _- ₄알콕시, C₁ _- ₄알킬카보닐옥시, 벤질옥시, 페닐카보닐옥시, 나프틸-카보닐옥시, 퀴놀리닐카보닐옥시 및 이소퀴놀리닐카보닐옥시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; R⁵ 는 할로겐, 니트릴, C₁ _- ₄알콕시, C₁ _- ₄알킬씨오, C₁ _- ₄알킬, 페닐, 페녹시, 페닐씨오 및 트리플루오로메틸로 이루어진 군으로부터 선택되고 R⁶ 는 수소, 플루오르 및 메틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 양태에서, R² 및 R⁴ 는 수소, 할로겐, 트리플루오로메틸 및 C₁ _- ₄알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

또 다른 특정 양태에서, R² 는 수소 및 메톡시로 이루어진 군으로부터 선택되고 R⁴ 는 플루오르, 트리플루오로메틸 및 메톡시로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 특정 양태에서, R⁵ 는 플루오르이다.

특정 양태에서, R² 및 R⁴ 는 C₁ _- ₄알콕시, C₁ _- ₄알킬카보닐옥시 및 벤질옥시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.

특정 양태에서, R² 및 R⁴ 는 메톡시이다.

또 다른 양태에서, R³ 는 벤질옥시이다.

또 다른 양태에서, R¹ 는 수소이다.

또 다른 양태에서, R⁵ 는 플루오르, 메톡시, 메틸씨오 및 페닐로 부터 선택되고, 바람직하게 플루오르이다.

또 다른 양태에서, R⁶ 는 수소 또는 플루오르이다.

추가의 바람직한 양태에서, 상이한 치환기를 위하여 상기의 선호물(preferences)이 결합된다. 또한, 본 발명은 상기 화학식의 바람직한 치환체의 이러한 조합을 가리킨다.

화학식 (I)에 해당하는 본 발명의 특정 개별 화합물은 하기 화합물을 포함한다:

(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-메톡시피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-페닐피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-(메틸씨오)피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-메틸피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-시아노피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-(트리플루오로메틸)- 피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-(털트-부톡시) 피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-아세톡시피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S)-1-(4-아세톡시-3,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S)-1-(4-벤조일옥시-3,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S)-1-(3,4-디벤질옥시-5-메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S)-1-(3,4-디벤조일옥시-5-메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S)-1-(3-아세톡시-4,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((2S)-1-(3-피바로일옥시-4,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((S)-1-(4-(벤질옥시)벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((S)-1-(3-(벤질옥시)벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((S)-1-(2-(벤질옥시)벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((S)-1-(4-(벤질옥시)-3-(트리플루오로메틸)벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

(S)-1-((S)-1-(4-(벤질옥시)-3-플루오로벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;

또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 전구약물(prodrug) 또는 용매화물.

상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물은 다음 일반 반응식에 도시된 것과 같은 이용가능한 합성 절차에 의해 수득할 수 있다:

절차 E에 대한 상세한 반응식

첫 번째 단계에서 화학식 (II)의 에스테르를 극성 유기 용매(바람직하게 양자성 극성 유기 용매)에 용해하고 부유시켰다, 예컨대 에탄올(EtOH) 또는 메탄올 또는 극성 유기 용매의 혼합물. 수성 염기 용액을 첨가하고 혼합물을 유지하여 가수분해 반응을 수행하였다, 일반적으로 환류 하에서, 실온 및 가수분해의 종료까지 용매 혼합물의 환류 온도 사이를 포함하는 온도에서, 일반적으로 0.5 내지 4 시간의 기간 동안, 바람직하게 1-2 시간. 염기 용액은 바람직하게 무기 본성(inorganic nature)이고, 예컨대 희석(dillute) 알칼리, 예를 들어 NaOH 이다. 그 이후, 반응 혼합물은 실온에 방치하고, 바람직하게, 약 1/5의 반응 부피로 농축하였다. 그 이후, 얼음조(ice bath)에서 냉각하는 동안, 중화에 효과적일 수 있도록 반응 혼합물을 천천히 산성 용액 예컨대 1M HCl 용액에 첨가하였다. 산성화(acidification)가 침전물을 만든 경우, 화학식 (VII)의 생성물을 제공하기 위하여 고체를 여과하고 물로 세척하였다. 침전물을 수득할 수 없는 경우, 결과 용액을 적절한 유기 용매, 예컨대 에틸 아세테이트, 로 여러 번 추출하고, 유기상을 건조하고 증발시켰다. 화학식 (VII)의 조 생성물을 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)로 정제하였다.

화학식 (III)의 아민의 탈보호는 약 산성 조건에서 달성하였으며, 예컨대 히드로겐 클로라이드 용액을 유기 용매, 예컨대 디옥산, 에 첨가하거나, TFA/DCM 혼합물과, 0℃ 내지 실온의 낮은 온도에서 달성하였다. 반응은 실온에서 1-3 시간 교반하였다. 그 이후 하이드로클로라이드 염 또는 트리플루오로아세테이트 염을 수득하기 위하여, 용매를 건조하도록 증발시켰고, 사용된 산에 따른다.

화학식 (IX)의 화합물은 쇼튼-바우만(Schotten-Baumann) 조건 하에서 화학식 (VII)의 카복실산 및 화학식 (VI)의 아민으로부터 제조하였다. 따라서, 염소화제(chlorinating agent), 예컨대 옥살릴 클로라이드,를 유기 용매, 예컨대 톨루엔, 중의 화학식 (VII)의 카복실산 용액에 첨가하였다. 반응은 화학식 (VIII)의 카복실산 클로라이드의 형성을 허용하기 위하여 1 내지 2 시간 동안 50℃ 내지 80℃에서 교반하였다. 용매의 증발 후에, 조 결과물은 유기 용매, 예컨대 THF, 에서 가용화하고 O℃의 낮은 온도에서 화학식 (VI)의 수성 염기성 용액, 일반적으로 화학식 (VI)의 아민의 수성 NaOH 용액, 에 첨가하였다. 반응 혼합물은 낮은 온도에서 1 내지 2 시간 교반하고 실온에서 2 내지 4 시간 동안 교반하였다. 그 이후, 용매를 증발시키고 잔여 수성 분획을 HCl 용액의 첨가에 의해 pH (3-4)로 조절하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기상을 브라인으로 세척하고, 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 필요한 경우 조 생성물을 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)로 정제하였다.

그 이후, 화학식 (IX)의 생성물을 염기의 존재 하에, 예컨대 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA), 화학식 (IV)의 (S)-피롤리딘-2-카보니트릴과 결합시키고, 커플링제, 예컨대 카보디이미드, 에 의해 도움을 받았다. 특히, 화학식 (IX)의 화합물을 비양자성 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄, 에 용해하고 DIEA와 함께 카보디이미드에 첨가하였다, 예를 들어 고체-지지 카보디이미드, 예컨대 N-사이클로 헥실카보디이미드, N'-메틸 폴리스티렌. 5분 후에, 화학식 (IV)의 (S)-피롤리딘-2-카보니트릴 및 추가 DIEA를 첨가하였다. 반응은 실온에서 8 내지 16시간 교반하였다. 그 이후, 반응 혼합물을 여과하고 잔여 고체를 비양자성 유기 용매로 세척하였다. 여과는 건조하도록 증발시켰다. 그 이후, 조 생성물을 프리퍼레이티브 RP-HPLC(preparative RP-HPLC)로 정제하였다.

대신에, 화학식 (I)의 화합물은 반응식 E에 도시되고 하기와 같이 제조할 수 있다:

아민-기능화된 수지(amine-functionalised resin) 예컨대, 화학식 (X)의 시이버(Sieber) 아미드 수지를 폴리에틸렌 다공성 디스크가 장착된 주사기에 배치하였다. 수지는 디클로로메탄(DCM) 및 디메틸포름아미드(DMF)와 같은 유기 용매로 세척하여 팽창하였다. 수지의 아민기가 보호된 경우(즉, 시이버(Sieber) 아미드 수지의 경우), 보호기의 제거(예컨대, 플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 보호기)는 DMF 중의 피페리딘 용액과 같은 아민 염기 용액 처리에 의해 달성되었다.

[화학식 (X)]

다음 수지로부터 보호기의 제거는, 화학식 (V)의 Fmoc-보호된 L-프롤린을 활성제, 예컨대 적절한 유기 용매, 예컨대 DMF, 중의 트리아졸(즉, TBTU), 및 아민 염기, 예컨대 DIEA, 를 사용해 부착하였다. 혼합물은 1 내지 2 시간 동안 교반하였다. 여과 및 세척 후에, 커플링의 정도는 카이저 테스트(Kaiser test)를 사용하여 모니터 되었고, 필요한 경우 재-커플링을 수행하였다. 화학식 (XI)의 생성물을 수득하기 위하여 아민 염기 용액, 예컨대 DMF 중의 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF 혼합물 처리에 의해 Fmoc를 제거하였다. Fmoc 제거는 p-니트로페닐 에스테르 NF31 테스트를 사용하여 평가할 수 있다.

[화학식 (XI)]

화학식 (XII)의 생성물을 수득하기 위하여 적절한 유기 용매, 예컨대 DMF, 중의 첨가제, 예컨대 HOAt, 및 아민 염기, 예컨대 DIEA, 의 존재 또는 부재 하에 활성제, 예컨대 PyBOP, 를 사용하여, 화학식 (XI)의 생성물을 화학식 (IX)와 결합하였다. 혼합물을 1 내지 2 시간의 총 반응 시간 동안 손으로 교반하였다. 체계적인(systematic) 재-커플링을 동일한 양 및 시간을 사용하여 수행하였다. 커플링의 정도는 p-니트로페닐 에스테르 NF31 테스트를 사용하여 모니터 될 수 있다.

[화학식 (XII)]

대신에, 화학식 (XII)의 생성물은 또한 단계적으로 수득할 수 있으며, 먼저 화학식 (XI)를 화학식 (XIII)의 화합물과 커플링하고, 그 다음 Fmoc 보호기를 제거한 다음 화학식 (VII)의 화합물과 커플링 하였다.

화학식 (VII)의 생성물, 철저하게 적절한 유기 용매, 예컨대 DCM, 로 세척하고 건조한, 을 플라스크에 옮기고, 트리플루오로아세틱 무수물 및 피리딘을 소량 유기 용매에 첨가하였다. 혼합물을 20 내지 40℃의 온도에서 8 내지 16시간 유지하였다. 그 이후, 반응 혼합물을 여과하고 수지를 동일한 유기 용매로 세척하였다. 여과액을 수집하고 용매를 건조하도록 증발시켰다. 조 결과물을 적절한 용매, 예컨대 에틸 아세테이트, 에 용해하고 포화 NaHCO₃ 용액 및 5% aq. KHSO₄ 용액으로 세척하였다. 유기상을 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 조 생성물(The crude)을 H₂O:CH₃CN 에 넣고 화학식 (I)의 펩티드 니트릴을 수득하기 위하여 동결 건조하였다.

대신에, 화학식 (XII)의 펩티딜-수지를 1-2 시간 동안 TFA/H₂O/TIS의 혼합물로 처리할 수 있다. 그 이후, 수지를 여과하고 TFA로 세척하고, 여과액을 수집하고 용매를 건조하도록 증발시켰다. 조 생성물(The crude)을 H₂O:CH₃CN에 재부유시키고 동결 건조하였다. 조 결과물 펩티드 아미드를 적절한 유기 용매, 예컨대 DCM, 에 넣고 니트릴로 변환하였다, 예를 들어 포스포러스 펜톡시드, 티타늄 테트라클로라이드, 씨오닐 클로라이드, 트리플루오로아세틱 무수물/피리딘 또는 트리페닐포스핀/카본테트라클로라이드. 혼합물을 실온에서 8 내지 16시간 유지하고, 용매를 증발시키고 잔여물을 에틸 아세테이트에 넣었다. 유기 용액을 연속적으로 aq. KHSO₄ 용액 및 aq. NaHCO₃ 용액으로 세척하였다. 유기상의 건조 및 증발로 화학식 (I)의 펩티드 니트릴을 수득하였다.

조 생성물은 RP-HPLC 에 의해 정제되었다.

상기 본 발명의 화합물의 제조하는 공정은 입체 이성질체가 생기게 하며, 이들 이성질체는 통상적인 기술에 의해 분리될 수 있다, 예컨대, 프리퍼레이티브(preparative) 크로마토그래피. 카이랄 중심이 있다면, 화합물은 라세믹 형태로 제조할 수 있고, 또는 각각의 거울상 이성질체는 거울상특정 합성(enantiospecific synthesis) 또는 분해능(resolution)에 의해 각각 제조할 수 있다.

시작 생성물로서 사용된 화학식 (II), (III), (IV) 및 (V)의 화합물뿐만 아니라 화학식 (VII)의 화합물의 일부는 각각 상업적으로 이용가능하고 또한 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 양태에서는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 전구약물(prodrug) 또는 용매화물의 제조하는 공정을 제공한다.

일 양태에서, 상기 공정은 하기 단계를 포함한다:

a) 화학식 (IX)의 화합물을 화학식 (XI)의 화합물과 반응시켜 화학식 (XII)의 화합물을 수득하는 단계:

[화학식 (IX)]

여기서, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶ 는 상기 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다:

[화학식 (XI)]

여기서 중합체는 본원에-기재된 합성 방법의 반응 조건 하에서 불활성화되는 중합체이고 불용성이나 본원에-사용된 용매 중에서 팽창가능하며, 예컨대, 저급 가교-결합된 폴리스티렌 및 폴리에틸렌글리콜-접합된(polyethyleneglycol-grafted) 폴리스티렌 중합체이다.

[화학식 (XII)]

b) 화학식 (XIV)의 화합물을 수득하기 위하여 화학식 (XII)의 화합물을 가수분해하는 단계

[화학식 (XIV)]

및

c) 화학식 (I)의 화합물을 수득하기 위하여 화학식 (XIV)의 화합물을 카복사미드 기가 니트릴 기로 변형될 수 있는 조건에 종속시키는 단계;

여기서, b) 및 c) 단계는 각각 또는 원 포트 반응(one pot reaction)으로 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 전구약물(prodrug) 또는 용매화물을 제조하는 공정은 하기 단계를 포함한다:

a) 화학식 (IX)의 화합물을 화학식 (IV)의 화합물과 반응시키는 단계:

[화학식 (IX)]

여기서, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶ 는 상기 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다

[화학식 (IV)]

또 다른 양태에서, 공정은 하기 단계를 포함한다:

a) 화학식 (XI)의 화합물을 화학식 (XIII)의 화합물과 반응시키는 단계:

[화학식 (XI)]

[화학식 (XIII)]

여기서, R⁵ 및 R⁶ 는 상기 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다

b) Fmoc 보호기를 제거하는 단계

c) 화학식 (VII)의 화합물과 반응시키는 단계;

[화학식 (VII)]

여기서, R¹, R², R³ 및 R⁴ 는 상기 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다

d) 화학식 (I)의 화합물을 수득하기 위하여 지지 중합체로부터 결과 생성물을 가수분해하는 단계

[화학식 (I)]

여기서, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶ 는 상기 정의된 바와 같다.

일반 화학식 (I)의 화합물은 인지 장애의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌으며, 특히 중추 신경계의 다른 질환 또는 질병과 연관된 인지 장애에 유용하다.

본 발명의 특정 양태에서, 인지 장애는 정신분열증(schizophrenia), 양극성 정동 장애(bipolar affective disorder), 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인지 장애이다.

또한, 본 발명은 환자에게 투여하기 위하여, 본 발명의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체, 전구약물(prodrug) 또는 입체 이성질체를 약학적으로 허용가능한 담체, 애주번트(adjuvant), 또는 비히클(vehicle)과 함께 포함하는 약제 또는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 보조 물질(auxiliary materials) 또는 첨가제는 담체, 부형제, 지지 물질, 윤활제, 충전제, 용매, 희석제, 착색제, 향미 조절제, 예컨대, 설탕, 항산화제, 결합제(binders), 접착제, 붕해제, 항-지지제(anti-adherents), 활주제, 및/또는 점착제(agglutinants) 중에서 선택될 수 있다. 좌약(suppositories)의 경우, 이는 비경구 적용을 위한 왁스 또는 지방산 에스테르 또는 방부제, 유화제 및/또는 담체를 의미할 수 있다. 이들 보조 물질(auxiliary materials) 및/또는 첨가제 및 사용될 양의 선택은 약학적 조성물의 적용 형태에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 따른 약제 또는 약학적 조성물은 인간 및/또는 동물 적용에 적합한 임의의 형태일 수 있으며, 바람직하게 인간으로서 유아, 어린이 및 성인을 포함하고, 당업자에게 공지된 표준 절차에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 제형은 전신 또는 국소 적용을 위하여 적응될 수 있고, 구체적으로 피부, 경피(transdermal), 피하, 근육 내, 관절 내, 복강 내, 정맥 내, 동맥 내, 방광 내, 골 내(intraosseous), 해면체 내(intracavernosal), 비강 내(intranasal), 폐, 구강(buccal), 설하(sublingual), 눈, 유리체 내, 경피(percutaneous), 직장(rectal), 질(vaginal), 경구(oral), 경막 외(epidural), 척추강 내(intrathecal), 뇌실 내(intraventricular), 대뇌 내(intracerebral), 대뇌 내(intracerebroventricular), 낭 내(intracisternal), 척추 내(intraspinal), 척추 근처(perispinal), 두개골 내(intracranial), 펌프 장치와 함께 또는 없이 바늘 또는 카테터를 통한 전달, 또는 다른 적용 경로.

일 양태에서, 약학적 조성물은 고체 또는 액체의 경구 형태이다. 경구 투여에 적합한 투여 형태는 정제, 알약, 캐플릿(caplet), 젤 캡(gel caps), 츄잉검, 캡슐, 과립, 드롭(drops), 시럽 또는 용액일 수 있고 당업계에 공지된 통상의 부형제, 예컨대, 결합제(binding agents), 예를 들어, 시럽, 아카시아(acacia), 젤라틴, 솔비톨, 트래거캔스(tragacanth), 또는 폴리비닐피롤리돈; 충전제, 예를 들어, 락토스, 설탕, 옥수수 전분, 칼슘 포스페이트, 솔비톨 또는 글리신; 정제 윤활제(tabletting lubricants), 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트; 붕해제, 예를 들어, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 소듐 전분 글리콜레이트 또는 미세결정 셀룰로스; 또는 약학적으로 허용가능한 습윤제, 예컨대, 소듐 라우릴 설페이트를 함유할 수 있다.

다른 양태에서, 약학적 조성물은 비-경구 비강 내 투여를 위한 제품의 형태이며, 바람직하게 비강 내 투여를 위한 제품의 형태이다. 일반적으로 비강 내 투여는 전달 장치로서 비강 스프레이, 스퀴즈 보틀(squeeze bottles), 및 액체 드로퍼(liquid droppers)을 사용하여 수행된다. 이들 장치와 함께 사용하기 위해, 약학적 조성물은 바람직하게 본 발명의 화합물의 액체 용액 또는 부유액이다.

조성물은 혼합, 충전 또는 정제의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 반복된 혼합 작업은 대량의 충전제를 사용하는 이들 조성물을 통한 활성제의 분배를 사용할 수 있다. 이러한 작업은 당해 기술 분야에서 통상적이다. 정제는, 예를 들어, 습식 또는 건식 과립화에 의해 제조될 수 있고 임의로 보통 약학적 관습(practice)에 공지된 방법에 따라 코팅할 수 있으며, 특히 장용성 코팅일 수 있다.

약학적 조성물은 또한 비경구 투여에 적합할 할 수 있으며, 예컨대, 멸균 용액, 부유액 또는 재구성할 수 있는 건조제(reconstitutable dry preparations), 에어로졸(aerosols) 또는 스프레이의 적절한 단위 투여 형태일 수 있다. 적절한 부형제는, 예컨대, 벌킹제(bulking agents), 완충제(buffering agents) 또는 계면 활성제일 수 있다.

본 발명의 조성물은, 경피 적용을 위해, 용해된 형태 또는 패치에 침전(deposit) 시킴으로써 제형화될 수 있다.

피부 적용제(Skin applications)는 연고, 젤, 크림, 로션, 부유제 또는 에멀전(emulsion)을 포함한다.

직장 적용(rectal application)의 적절한 형태는 좌약에 의한다.

언급된 제형은 표준 방법, 예컨대, 스페인 및 US 약전 및 비슷한 참고 문헌에 기재된 또는 나타난 것을 이용하여 제조한다.

본 발명의 일 양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 치료상으로 유효량을 사용하는 것이 바람직하다. 의사는 본 치료제의 투여량을 결정하는데 가장 적합할 것이고, 투여 형태 및 선택된 특정 화합물에 따라 달라지며, 나아가, 치료 중인 환자에 따라 달라질 것이며, 환자의 나이, 치료할 질환 또는 질병의 유형에 따라 달라질 것이다. 조성물을 경구 투여하는 경우, 대량의 활성제가 주어진 비경구적 투여하는 경우보다 동일한 효과를 생산하기 위해 필요할 것이다. 화합물은 유사한 치료제와 동일한 방식으로 유용하며, 투여량 수준은 일반적으로 이들 다른 치료제와 함께 사용되는 것과 동일하다. 활성 화합물은 일반적으로 한 번 이상 투여될 것이고, 예를 들어, 하루에 1, 2, 3, 또는 4번, 일반적인 총 일일 투여량인 0.1 내지 1000 mg/kg/일의 범위로 투여될 것이다.

본 발명의 화합물 및 조성물은 복합 치료를 제공하기 위하여 다른 약물과 함께 사용될 수 있다. 다른 약물은 동일한 조성물의 일부를 형성할 수 있고, 또는 동시 또는 상이한 시간에 투여하기 위하여 별도의 조성물로서 제공될 수 있다.

특히, 적어도 하나의 화학식 (I)의 화합물 및 적어도 하나의 다른 약물의 조합을 동시, 별도 또는 연속 투여를 위해 제형화 할 수 있으며, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 첨가제, 애주번트(adjuvant), 또는 비히클(vehicle)과 함께 제형화 될 수 있다. 이는 화학식 (I)의 화합물 및 다른 약물의 조합을 투여할 수 있다는 의미를 가진다:

a) 동일한 약제 제형의 일부의 조합일 때, 그 다음 둘 다 항상 동시에 투여된다.

b) 두 유닛의 조합일 때, 그들 중 하나 각각은 동시, 연속 또는 별도 투여의 가능성을 높인다. 특정 양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 다른 약물(즉, 두 개의 단위에서)과 독립적으로 투여되나, 동시에 투여된다. 다른 특정 양태에서, 화학식 (I)의 화합물이 먼저 투여되고, 그 다음, 다른 약물이 별도로 또는 연속적으로 투여된다. 또 다른 특정 양태에서, 다른 약물이 먼저 투여되고, 그 다음, 화학식 (I)의 화합물이 투여된다, 별도로 또는 연속적으로, 정의된 바와 같이.

본 발명의 문맥에서, 다음의 두문자(acronyms) 및 약자가 사용되었으며, 그 의미는 아래에 설명하였다:

AcOEt 에틸 아세테이트

AcSDKP N-아세틸-세릴-아스파틸-리실-프롤린

AD 알츠하이머 질환

BBB 혈액-뇌 장벽

Boc 털트-부톡시카보닐

BSA 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin)

DBU 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔

DCM 디클로로메탄

DIEA N,N'-디이소프로필에틸아민

DMF 디메틸포름아미드

DMSO 디메틸설폭시드

DPPIV 디펩티딜 펩티다아제 IV

EtOH 에탄올

Fmoc 9-플루오레닐메톡시카보닐

FPLC 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast protein liquid chromatography)

HOAt 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸

IP3 이노시톨 트리포스페이트

IPTG 이소프로필 β-D-1-씨오갈락토피라노시드

LB 라이소제니(Lysogeny) 브로스

MALDI-TOF 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화-타임-오브-플라이트

MK-801 디조실핀(Dizocilpine) (INN)

MS 다발성 경화증

OD 광학 밀도

PAMPA 평행 인공 막 투과성 분석

PBS 포스페이트 완충 식염수

PC 포스파티딜콜린

PE 포스파티딜에탄올아민

pETM10 플라스미드 pETM10

PI 포스파티딜이노시톨

POP 프롤릴 올리고펩티다아제

hPOP 인간 프롤릴 올리고펩티다아제

PREP 프롤릴 엔도펩티다아제(POP 및 PREP 가 동의어인 것을 주목)

PS 포스파티딜세린

PyBOP (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트

RP-HPLC 역상 고 성능 액체 크로마토그래피

SD 표준 편차

SDS-PAGE 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아민 젤 전기영동

TBTU O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보로네이트

TFA 트리플루오로아세트산

THF 테트라히드로퓨란

TIS 트리이소프로필실란

Tris 트리스(히드록시메틸)아미노메탄

Tβ4 티모신 베타-4 단백질

Z-G-P-AMC (N-벤질옥시카보닐-Gly-Pro-메틸쿠마리닐-7-아미드)

도 1은 PBS + 비히클, MK-801 + 비히클 및 MK-801 및 실시예 4의 화합물에 대한 신규한 물체 인식(novel object recognition)(NOR) 테스트에서 얻어진 결과를 비교한 도면이다.
도 2는 PBS + 비히클, MK-801 + 비히클 및 MK-801 및 실시예 4의 화합물에 대한 수동 회피 과제 테스트(passive avoidance task test)에서 얻어진 결과를 비교한 도면이다.

하기 실시예는 단지 본 발명의 특정 양태의 예시일 뿐이며 어떠한 방식으로 이를 제한하는 것으로 생각할 수 없다.

실시예

실시예에 설명된 준비에 사용되는 특정 합성 조건

절차 A: 화학식 (I)의 카복실산에 화학식 (II)의 에스테르를 가수분해

화학식 (II)의 에스테르(1 mmol)는 95% EtOH 에 가용화 하였다. NaOH(3.7 mmol)을 첨가하고 반응은 약 2시간 동안 환류 하에 유지하였다. 그 후에 실온에 도달하도록 방치하였다. 반응 혼합물을 약 15-20 mL로 농축한 후, 얼음조(ice bath)에서 냉각하는 동안, 이 용액을 천천히 1M HCL 용액에 첨가하였다. 흰 고체 침전물, 여과에 의해 수득된, 은 물로 세척하고 다음 합성 단계 이전에 잘 건조시켰다. 침전물이 나타나지 않은 경우, 결과 혼합물을 AcOEt(3x)로 추출하고, 유기상을 건조하고 증발시켰다. 필요한 경우, 조 생성물은 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의해 정제하였다.

절차 B: 화학식 (VI)의 아민을 수득하기 위한 Boc 보호된 화학식 (III)의 아민의 탈보호

Boc 보호된 화학식(III)(1 mmol)의 아민을 0℃에서 천천히 디옥산(20 ml) 중 4M HCl에 첨가하였다. 반응은 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 그 다음 용매는 화학식 (VI)의 아민의 히드로클로라이드 염을 수득하기 위하여 건조 상태로 증발시켰다.

절차 C: 화학식 (VIII)의 카복실산 클로라이드 형성을 통해 화학식 (VI)의 아민과 화학식 (VII)의 카복실산의 커플링.

옥살릴 클로라이드(1.5 mmol)를 톨루엔(5 ml) 중의 화학식 (VII)의 카복실산 용액에 첨가하였다. 반응은 화학식 (VIII)의 카복실산 형성을 허용하기 위하여 1.5 시간 동안 50℃에서 교반하였다. 용매의 증발 이후, 조 결과물(resulting crude)은 THF에서 용해하고 0℃에서 화학식 (VI)(1.1 mmol)의 아민의 수성 NaOH 용액에 첨가하였다. 반응은 0℃에서 1.5시간 그리고 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 그 이후, THF 를 증발시키고, 나머지 수성 분획물을 1M HCl 용액 첨가에 의해 산 pH (3-4)로 조절하고, AcOEt로 추출하였다. 유기상을 브라인으로 세척하고, 건조하고, 여과하고 증발시켰다. 필요한 경우, 화학식 (IX)의 조 생성물을 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)로 정제하였다.

절차 D: 용액에서 화학식 (IV)의 (S)-피롤리딘-2-카보니트릴과 화학식 (IX)의 커플링

화학식 (IX)의 생성물(1.2 mmol)을 DCM에 용해시키고, N-사이클로헥실카보디이미드, N'-메틸 폴리스티렌(3 mmol), 에 DIEA(1 mmol)과 함께 첨가하였다. 5분 후에, 화학식 (IV)의 (S)-피롤리딘-2-카보니트릴(1 mmol) 및 DIEA(1 mmol)을 첨가하였다. 반응은 실온에서 밤새 교반하였다. 그 이후, 반응 혼합물을 여과하고 나머지 고체를 DCM으로 세척하였다. 여과액을 건조하도록 증발시켰다. 그 이후, 조 생성물을 프리퍼레이티브 RP-HPLC(preparative RP-HPLC)로 정제하였다.

절차 E: 고체-상에서 합성을 위한 일반 절차:

수지의 팽창/컨디셔닝(Swelling/conditioning): 화학식 (X)의 시이버(Sieber) 아미드 수지(1 eq)를 폴리에틸렌 다공성 디스크가 장착된 주사기에 배치하였다. 상기 수지는 DCM 및 DMF로 세척하여 팽창되었다. 플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 보호기의 제거는 DMF에서 20% 피페리딘 용액 처리에 의해 달성하였다.

[화학식 (X)]

그 이후, 화학식 (V)의 Fmoc-보호된 L-프롤린(4 eq)을 DMF에서 TBTU(4 eq) 및 DIEA(8 eq)를 사용하여 수지에 부착하였다. 혼합물을 90분 동안 간헐적으로 손으로 교반하였다. 여과 및 세척 이후, 커플링의 정도는 카이저 테스트(Kaiser test)를 사용하여 모니터하고, 재-커플링은 필요한 경우 수행되었다. Fmoc를 화학식 (XI)의 생성물을 수득하기 위하여 DMF에서 20% 피페리딘 용액 및 이후 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF(20:5:5:70) 용액의 처리에 의해 제거하였다. Fmoc 제거는 p-니트로페닐 에스테르 NF31 테스트를 사용하여 평가하였다(Madder, A. et al., Eur . J. Org. Chem . 1999;(11):2787-91 에 설명되어있다).

[화학식 (XI)]

화학식 (IX)의 생성물(2 eq)은 DMF에서 PyBOP(2 eq), HOAt(6 eq) 및 DIEA(6 eq)를 사용하여 화학식 (XII)의 생성물을 수득하기 위하여 화학식 (XI)와 결합(coupled)되었다. 혼합물을 간헐적으로 총 반응 시간, 90분, 동안 손으로 교반하였다. 체계적인(systematic) 재-커플링은 동일한 양 및 시간을 사용하여 수행하였다. 커플링의 정도는 p-니트로페닐 에스테르 NF31 테스트를 사용하여 모니터하였다.

대신에, 화학식 (XIII)의 생성물(4 eq)은 DMF에서 PyBOP(4 eq), HOAt(12 eq) 및 DIEA(12 eq)를 사용하여 화학식 (XI)의 생성물과 결합하였다. 혼합물을 간헐적으로 총 반응 시간, 90분, 동안 손으로 교반하였다. 커플링의 정도는 p-니트로페닐 에스테르 NF31 테스트를 사용하여 모니터하고, 재-커플링은 필요한 경우 수행되었다. Fmoc 기는 DMF에서 20% 피페리딘 용액의 처리 및 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF(20:5:5:70) 용액의 처리에 의해 제거하였다.

이어서, 화학식 (VII)의 생성물(4 eq)은 DMF에서 PyBOP(4 eq), HOAt(12 eq) 및 DIEA(12 eq)를 사용하여 화학식 (XII)의 생성물을 얻기 위하여 설립(incorporated)되었다. 혼합물을 간헐적으로 총 반응 시간, 90분, 동안 손으로 교반하였다. 커플링의 정도는 p-니트로페닐 에스테르 NF31 테스트를 사용하여 모니터하고, 재-커플링은 필요한 경우 수행되었다.

[화학식 (XII)]

화학식 (XII)의 생성물, DCM으로 완전히 세척되고 건조된, 을 둥근 바닥 플라스크로 옮기고, DCM 중의 트리플루오로아세틱 무수물(5 eq) 및 피리딘(10 eq)(약 2 mL/100 mg)을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 유지하였다. 그 이후, 반응 혼합물을 여과하고 수지를 DCM으로 세척하였다. 여과액을 수집하고 용매를 건조하도록 증발시켰다. 조 결과물을 AcOEt에 용해하고, 포화 NaHCO₃ 용액 및 5% aq. KHSO₄ 용액으로 세척하였다. 유기상을 건조하고, 여과하고 증발시켰다. 조 생성물(the crude)은 H₂O:CH₃CN(1:1)에 흡수되고(taken up in) 화학식 (I)의 펩티드 니트릴을 수득하기 위하여 동결 건조하였다.

대신에, 화학식 (XII)의 펩티딜-수지는 1-2시간 동안 TFA/H₂O/TIS (95:2.5:2.5, 약 2-5 mL/100 mg)의 혼합물로 처리할 수 있다. 그 이후, 수지는 여과하고 TFA로 세척하고, 여과액을 수집하고 용매를 건조하도록 증발시켰다. 조 생성물(the crude)은 H₂O:CH₃CN(1:1)에서 재부유시키고 동결 건조하였다. 조 결과물 펩티드 아미드는 DCM에 흡수되고(taken up in) 트리플루오로아세틱 무수물(5 eq) 및 피리딘(10 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 유지하고, 용매를 증발시키고 잔여물은 AcOEt에 흡수되었다(taken up in). 이어서, 유기 용액은 5% KHSO₄ 용액 및 aq. 10% NaHCO₃ 용액으로 세척하였다. 유기상을 건조 및 증발시켜 화학식 (I)의 펩티드 니트릴을 수득하였다.

조 생성물을 RP-HPLC로 정제하였다.

중간체 화합물의 합성:

중간체 1: 4- 벤질옥시 -3,5- 디메톡시벤조산

메틸 3,5-디메톡시-4-히드록시벤조에이트(2.0 g, 9.4 mmol), 포타슘 카보네이트(3.2 g, 22.6 mmol) 및 포타슘 요오다이드(iodide)(500 mg, 3.0 mmol)를 둥근-바닥 플라스크에 넣었다. 아세톤(200 mL)을 첨가하였다. 반응은 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그 이후, 벤질 클로라이드(4.3 mL, 37.7 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하고 교반을 8시간 동안 환류에서 유지하였다. 그 후, 반응을 실온까지 냉각하여 방치하였다. 물을 첨가하고 디에틸에테르로 3가지 추출물이 수행되고, 유기 추출물을 브라인으로 세척하고 건조하고 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)로 정제하였고, 1.7 g(5.7 mmol)을 수득하였다. 이어서, 메틸 에스테르의 가수분해는 4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산(2.4 g, 7.9 mmol)을 수득하기 위하여 상기 절차 A에 따라서 수행하였다.

중간체 2: (2S,4R)-4- 메톡시피롤리딘 -2- 카복실산

상업적으로 이용가능한 (2S,4R)-1-(털트-부톡시카보닐)-4-메톡시피롤리딘-2-카복실산(221 mg, 1.5 mmol)으로부터 시작하여, 생성물을 추가의 정제없이 상기 절차 B에 따라 히드로클로라이드 염을 정량적인 수율로 수득하였다.

중간체 3: (S)-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2- 카복실산

상업적으로 이용가능한 (S)-1-(털트-부톡시카보닐)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카복실산(150 mg, 1.0 mmol)으로부터 시작하여, 생성물을 추가의 정제없이 상기 절차 B에 따라 히드로클로라이드 염을 정량적인 수율로 수득하였다.

중간체 4: (2S,4S)-4-( 메틸씨오 ) 피롤리딘 -2- 카복실산

상업적으로 이용가능한 (2S,4S)-1-(털트-부톡시카보닐)-4-메틸씨오-피롤리딘-2-카복실산(310 mg, 1.93 mmol)으로부터 시작하여, 생성물을 추가의 정제없이 상기 절차 B에 따라 히드로클로라이드 염을 정량적인 수율로 수득하였다.

중간체 5: (2S,4S)-4- 메틸피롤리딘 -2- 카복실산

상업적으로 이용가능한 (2S,4S)-1-(털트-부톡시카보닐)-4-메틸피롤리딘-2-카복실산(500 mg, 2.18 mmol)으로부터 시작하여, 생성물을 추가의 정제없이 상기 절차 B에 따라 히드로클로라이드 염을 정량적인 수율로 수득하였다.

중간체 6: (2S,4R)-4- 아세톡시피롤리딘 -2- 카복실산

상업적으로 이용가능한 트랜스-L-히드록시프롤린(500 mg, 3.81mmol)을 6N 염산(1 mL)에 용해하였다. 빙초산(Glacial acetic acid)(1 mL)을 첨가하고, 용액을 얼음조(ice bath)에서 0℃로 냉각하였다. 그 이후, 아세틸 클로라이드(10 mL)를 천천히 첨가하였다. 몇 분 후에, 생성물을 에테르의 첨가의 도움으로 침전을 통해 수득하였다. 화합물(626 mg, 2.98 mmol), 히드로클로라이드 염 형태인, 은 여과, 에테르로 세척, 건조하여 분리하고 다음 단계에서 직접 사용하였다.

중간체 7: (2S,4R)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 메톡시 - 피롤리딘 -2-카 복실 산

중간체 1(4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산)(425 mg, 1.5 mmol) 및 중간체 2((2S,4R)-4-메톡시피롤리딘-2-카복실산)(1.5 mmol)으로부터 상기 설명된 절차 C에 따라 제조하였다. 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의한 정제로 원하는 생성물(428 mg, 1.0 mmol)을 수득하였다.

중간체 8: (2S,4R)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 플루오로피롤리 -딘-2- 카복실산

중간체 1(4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산)(714 mg, 2.5 mmol) 및 상업적으로 이용가능한 (2S,4R)-4-플루오로피롤리딘-2-카복실산(363 mg, 2.7 mmol)으로부터 상기 설명된 절차 C에 따라 제조하였다. 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의한 정제로 원하는 생성물(670 mg, 1.7 mmol)을 수득하였다.

중간체 9: (2S,4S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 페닐피롤 - 리딘 -2-카 복실 산

중간체 1(4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산)(700 mg, 2.4 mmol) 및 상업적으로 이용가능한 (2S,4S)-4-페닐피롤리딘-2-카복실산(608 mg, 2.7 mmol)으로부터 상기 설명된 절차 C에 따라 제조하였다. 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의한 정제로 원하는 생성물(700 mg, 1.5 mmol)을 수득하였다.

중간체 10: (S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리 -딘-2- 카복실산

중간체 1(4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산)(260 mg, 0.9 mmol) 및 중간체 3((S)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카복실산)(1.0 mmol)으로부터 상기 설명된 절차 C에 따라 제조하였다. 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의한 정제로 원하는 생성물(366 mg, 0.9 mmol)을 수득하였다.

중간체 11: (2S,4S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4-( 메틸씨오 )- 피롤리딘 -2- 카복실산

중간체 1(4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산)(505 mg, 1.75 mmol) 및 중간체 4((2S,4S)-4-(메틸씨오)피롤리딘-2-카복실산)(1.93 mmol)으로부터 상기 설명된 절차 C에 따라 제조하였다. 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의한 정제로 원하는 생성물(537 mg, 1.24 mmol)을 수득하였다.

중간체 12: (2S,4S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 메틸피롤리딘 -2-카 복실 산

중간체 1(4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산)(384 mg, 1.33 mmol) 및 중간체 5((2S,4S)-4-메틸피롤리딘-2-카복실산)(1.47 mmol)으로부터 상기 설명된 절차 C에 따라 제조하였다. 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의한 정제로 원하는 생성물(342 mg, 0.85 mmol)을 수득하였다.

중간체 13: (2S,4R)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 아세톡시피롤리딘 -2- 카복실산

중간체 1(4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산)(400 mg, 1.39 mmol) 및 중간체 6((2S,4R)-4-아세톡시피롤리딘-2-카복실산)(1.53 mmol)으로부터 상기 설명된 절차 C에 따라 제조하였다. 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의한 정제로 원하는 생성물(342 mg, 0.85 mmol)을 수득하였다.

중간체 14: 4- 아세톡시 -3,5- 디메톡시벤조산

4-히드록시-3,5-디메톡시벤조산(300 mg, 1.51 mmol)을 0℃에서 피리딘(732 μL, 9.08 mmol)에 용해하였다. 아세틱 무수물(214　μL, 2.27　mmol)을 혼합물을 교반하면서 드롭와이즈(dropwise)로 첨가하였다. 얼음조(ice bath)를 2시간 동안 방치하고, 이 후 혼합물을 얼음물에 부었다. 혼합물을 DCM(3x)으로 추출하고, 유기상은 4-아세톡시-3,5-디메톡시벤조산(266 mg, 1.10 mmol)을 수득하기 위하여 1N HCl 용액(3x), 물, 브라인으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 증발시켰다.

중간체 15: 4- 벤조일옥시 -3,5- 디메톡시벤조산

4-히드록시-3,5-디메톡시벤조산(300 mg, 1.51 mmol)을 물(6 mL)에 용해한 후 이소프로판올(2.5 mL)을 첨가하고, 이어서 포타슘 카보네이트(523 mg, 3.78 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 하에서 유지하고 0℃로 냉각하였다. 그 이후 벤조일 클로라이드(185 μL, 1.59 mmol)를 격렬하게 교반된 반응 혼합물에 드롭와이즈(dropwise)로 첨가하였다. 두꺼운 하얀 침전물이 첨가 중에 형성되었다. 혼합물을 반응 혼합물을 차갑게 유지하는 중에 6M HCl로 냉각되기 전에 추가로 20분 동안 교반하였다. 고체는 여과에 의해 수집되고, 하얀 고체로서(401 mg, 1.33 mmol) 4-벤조일옥시-3,5-디메톡시벤조산을 수득하기 위하여 냉수로 세척하고 건조하였다.

중간체 16: 3,4- 디벤질옥시 -5- 메톡시벤조산

메틸 3,4-디히드록시-5-메톡시벤조에이트(300 mg, 1.51 mmol), 포타슘 카보네이트(1.0 g, 7.3 mmol) 및 포타슘 요오다이드(iodide)(161 mg, 0.97 mmol) 둥근-바닥 플라스크에 넣었다. 아세톤(60 mL)을 첨가하였다. 반응은 30분 동안 실온에서 교반하였다. 그 이후, 벤질 클로라이드(1.39 mL, 12.1 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 교반은 8시간 동안 환류에서 유지하였다. 그 후, 반응은 실온으로 냉각되도록 방치하였다. 물을 첨가하고 디에틸에테르로 3가지 추출이 수행되고, 유기 추출물을 브라인으로 세척하고 건조하고 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)로 정제하고, 377 mg(1.0 mmol)를 수득하였다. 이어서, 메틸 에스테르의 가수분해는 3,4-디벤질옥시-5-메톡시벤조산(144 mg, 0.4 mmol)을 수득하기 위하여 상기 절차 A에 따라 수행하였다.

중간체 17: 3,4- 디벤조일옥시 -5- 메톡시벤조산

3,4-디히드록시-5-메톡시벤조산(300 mg, 1.63 mmol)을 물(6 mL)에 용해한 후 이소프로판올(2.5 mL)을 첨가하고, 이어서 포타슘 카보네이트(1.13 g, 8.15 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 하에서 유지하고 0℃로 냉각하였다. 그 이후, 벤조일 클로라이드(388 μL, 3.34 mmol)를 격렬하게 교반된 반응 혼합물에 드롭와이즈(dropwise)로 첨가하였다.혼합물을 반응 혼합물을 차갑게 유지하는 중에 6M HCl로 냉각되기 전에 추가로 20분 동안 교반하였다. 그 이후, 이를 AcOEt로 희석하고 상을 분리하였다. 유기상을 연속하여 1M HCl 용액 및 브라인으로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 증발시켰다. 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의한 조 생성물(the crude)의 정제로 하얀 고체로서 3,4-디벤조일옥시-5-메톡시벤조산(548 mg, 1.40 mmol)을 수득하였다.

중간체 18: 3- 아세톡시 -4,5- 디메톡시벤조산

3-히드록시-4,5-디메톡시벤조산(300 mg, 1.51 mmol)을 0℃에서 피리딘(732 μL, 9.08 mmol)에 용해하였다. 아세틱 무수물(214　μL, 2.27　mmol)을 혼합물을 교반하는 중에 첨가하였다. 얼음조(ice bath)를 2시간 동안 유지하고, 그 후 혼합물을 얼음물에 부었다. 혼합물을 3-아세톡시-4,5-디메톡시벤조산(277 mg, 1.15 mmol)을 수득하기 위하여 DCM(3x)으로 추출하고, 유기상을 1N HCl 용액(3x), 물(2x) 및 브라인(2x)으로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 증발시켰다.

중간체 19: 3- 피바로일옥시 -4,5- 디메톡시벤조산

클로로포름(2 mL) 중의 3-히드록시-4,5-디메톡시벤조산(300 mg, 1.51 mmol) 및 피리딘(244 μL, 3.02 mmol) 용액을 30분 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물에 클로로포름(2 mL) 중의 피바로일 클로라이드(196 μL, 1.59 mmol)를 실온에서 드롭와이즈(dropwise)로 첨가하고, 반응은 TLC 에 따른 이의 완료까지(3시간 정도) 교반하였다. 그 이후, 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 1M HCl 용액을 첨가하고 상을 분리하였다. 유기상을 연속하여 1M HCl 용액(2x), 물 및 브라인으로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 증발시켰다. 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의한 정제로 4-피바로일옥시-3,5-디메톡시벤조산(321 mg, 1.14 mmol)을 수득하였다.

중간체 20: 4- 벤질옥시 -3- 트리플루오로메틸벤조산

4-히드록시-3-트리플루오로메틸벤조산(1.0 g, 4.9 mmol) 및 포타슘 카보네이트(1.6 g, 11.6 mmol)를 둥근-바닥 플라스크에 넣었다. DMF(10 mL)를 첨가하고 반응은 5분 동안 실온에서 교반하였다. 그 이후, 벤질 클로라이드(2.2 mL, 19.4 mmol)를 반응혼합물에 첨가하고 4시간 동안 환류에서 유지하였다. 그 후, 반응은 실온에서 냉각되도록 방치하였다. 물을 첨가하고 에틸 아세테이트(3x50 mL)로 3가지 추출물을 수행하고, 유기상을 브라인으로 세척하고, 건조하고 증발시켰다. 조 생성물(The crude)을 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)로 정제하고, 1.3 g(3.4 mmol)을 수득하였다. 이어서, 벤질 에스테르의 가수분해는 4-벤질옥시-3-트리플루오로메틸벤조산(320 mg, 1.1 mmol)을 수득하기 위하여 상기 절차 A에 따라 수행되었다.

중간체 21: 4- 벤질옥시 -3- 플루오로벤조산

4-히드록시-3-플루오로벤조산(1.0 g, 6.4 mmol), 포타슘 카보네이트(2.7 g, 19.2 mmol) 및 포타슘 요오다이드(iodide)(532 mg, 3.2 mmol)을 둥근-바닥 플라스크에 넣었다. 아세톤(140 mL)을 첨가하고 반응은 30분간 실온에서 교반하였다. 그 이후, 벤질 브로마이드(3.8 mL, 32.0 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 12시간 동안 환류에서 유지하였다. 그 후, 반응은 실온에서 냉각되도록 방치하였다. 물을 첨가하고 에틸 아세테이트(3x50 mL)로 3가지 추출물을 수행하고, 유기상을 브라인으로 세척하고, 건조하고 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)로 정제하고, 1.2 g(3.5 mmol)을 수득하였다. 이어서, 벤질 에스테르의 가수분해는 4-벤질옥시-3-플루오로메틸벤조산(612 mg, 2.5 mmol)을 수득하기 위하여 상기 절차 A에 따라 수행되었다.

실시예 1:

(S)-1-((2S,4R)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 메톡시피롤리딘 -2-카보닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 (S)-피롤리딘-2-카보니트릴(58 mg, 0.4 mmol) 및 중간체 7((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-메톡시피롤리딘-2-카복실산)(220 mg, 0.5 mmol)를 상기 절차 D에 따라 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 10 mg(0.02 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 2:

(S)-1-((2S,4R)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 플루오로피롤리딘 -2-카 보 닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(500 mg, 0.30 mmol, 1 eq), 상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(400 mg, 1.2 mmol) 및 중간체 8((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-플루오로피롤리딘-2-카복실산)(239 mg, 0.60 mmol)로부터 시작하여, 생성물을 상기 절차 E에 따라 제조하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 80 mg(0.17 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 3:

(S)-1-((2S,4S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 페닐피롤리딘 -2- 카보닐 ) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(500 mg, 0.38 mmol, 1 eq), 상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(516 mg, 1.53 mmol) 및 중간체 9((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-페닐피롤리딘-2-카복실산)(351 mg, 0.76 mmol)로부터 시작하여, 생성물을 상기 절차 E에 따라 제조하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 16 mg(0.03 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 4:

(S)-1-((2S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2-카 보 닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(250 mg, 0.19 mmol, 1 eq), 상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(258 mg, 0.77 mmol) 및 중간체 10((S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카복실산)(161 mg, 0.38 mmol)으로부터 시작하여, 생성물을 상기 절차 E에 따라 제조하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 18 mg(0.036 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 5:

(S)-1-((2S,4S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4-( 메틸씨오 ) 피롤리딘 -2-카보닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(500 mg, 0.38 mmol, 1 eq), 상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(516 mg, 1.53 mmol) 및 중간체 11((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-(메틸씨오)피롤리딘-2-카복실산)(330 mg, 0.76 mmol)로부터 시작하여, 생성물을 상기 절차 E에 따라 제조하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 22 mg(0.043 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 6:

(S)-1-((2S,4S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 메틸피롤리딘 -2- 카보닐 ) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(300 mg, 0.18 mmol, 1 eq), 상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(247 mg, 0.73 mmol) 및 중간체 12((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-메틸피롤리딘-2-카복실산)(146 mg, 0.37 mmol)로부터 시작하여, 생성물을 상기 절차 E에 따라 제조하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 10 mg(0.02 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 7:

(S)-1-((2S,4R)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 시아노피롤리딘 -2-카보닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(516 mg, 1.53 mmol) 및 Boc-트랜스-4-시아노-L-프롤린(368 mg, 1.53 mmol)를, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(500 mg, 0.38 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. 수지로부터 디펩티드 절단 이후, 중간체 1(4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산)(145 mg, 0.5 mmol)을 카복실산 클로라이드의 형성을 경유하여 절차 C에 따라 니트릴 디펩티드 결과물과 결합하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 11 mg (0.03 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 8:

(S)-1-((2S,4S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4-( 트리플루오로메틸 )- 피롤리딘 -2- 카보닐 ) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(135 mg, 0.40 mmol), (2S,4S)-Fmoc-4-트리플루오로메틸-피롤리딘-2-카복실산(162 mg, 0.40 mmol) 및 중간체 1(4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산)(115 mg, 0.40 mmol)를, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(165 mg, 0.10 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 13 mg(0.045 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 9:

(S)-1-((2S,4R)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4-( 털트 - 부톡시 ) 피롤리딘 -2- 카보닐 ) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(135 mg, 0.40 mmol), Fmoc-4-털트-부톡시-L-프롤린(164 mg, 0.40 mmol) 및 중간체 1(4-벤질옥시-3,5-디메톡시벤조산)(115 mg, 0.40 mmol)를, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(165 mg, 0.10 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 22 mg(0.076 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 10:

(S)-1-((2S,4R)-1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤조일 )-4- 아세톡시피롤리딘 -2-카 보 닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(165 mg, 0.10 mmol, 1 eq), 상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(135 mg, 0.40 mmol) 및 중간체 13((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-아세톡시피롤리딘-2-카복실산)(90 mg, 0.20 mmol)으로부터 시작하여, 생성물을 상기 절차 E에 따라 제조하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 6.2 mg(0.012 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 11:

(S)-1-((2S)-1-(4- 아세톡시 -3,5- 디메톡시벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2-카보닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(135 mg, 0.40 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(149 mg, 0.40 mmol) 및 중간체 14(4-아세톡시-3,5-디메톡시벤조산)(96 mg, 0.40 mmol)를, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(165 mg, 0.10 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 25 mg(0.054 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 12:

(S)-1-((2S)-1-(4- 벤조일옥시 -3,5- 디메톡시벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2-카 보 닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(135 mg, 0.40 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(149 mg, 0.40 mmol) 및 중간체 15(4-벤조일옥시-3,5-디메톡시벤조산)(121 mg, 0.4 mmol)를, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(165 mg, 0.10 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 26 mg(0.051 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 13:

(S)-1-((2S)-1-(3,4- 디벤질옥시 -5- 메톡시벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2-카보닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(135 mg, 0.40 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(149 mg, 0.40 mmol) 및 중간체 16(3,4-디벤질옥시-5-메톡시벤조산)(146 mg, 0.4 mmol)를, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(165 mg, 0.10 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 24 mg(0.041 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 14:

(S)-1-((2S)-1-(3,4- 디벤조일옥시 -5- 메톡시벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2-카 보 닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(135 mg, 0.40 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(149 mg, 0.40 mmol) 및 중간체 17(3,4-디벤조일옥시-5-메톡시벤조산)(157 mg, 0.4 mmol)를, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(165 mg, 0.10 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 31 mg(0.052 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 15:

(S)-1-((2S)-1-(3- 아세톡시 -4,5- 디메톡시벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2-카보닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(135 mg, 0.40 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(149 mg, 0.40 mmol) 및 중간체 18(3-아세톡시-4,5-디메톡시벤조산)(96 mg, 0.4 mmol)를, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(165 mg, 0.10 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 22 mg(0.048 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 16:

(S)-1-((2S)-1-(3- 피바로일옥시 -4,5- 디메톡시벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2- 카보닐 ) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(135 mg, 0.40 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(149 mg, 0.40 mmol) 및 중간체 19(3-피바로일옥시-4,5-디메톡시벤조산)(113 mg, 0.4 mmol)를, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(165 mg, 0.10 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 19 mg(0.040 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 17:

(S)-1-((S)-1-(4-( 벤질옥시 ) 벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2- 카보닐 ) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(150 mg, 0.45 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(166 mg, 0.45 mmol) 및 4-벤질옥시벤조산(101 mg, 0.45 mmol)을, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(200 mg, 0.15 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 17 mg(0.038 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 18:

(S)-1-((S)-1-(3-( 벤질옥시 ) 벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2- 카보닐 ) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(150 mg, 0.45 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(166 mg, 0.45 mmol) 및 3-벤질옥시벤조산(101 mg, 0.45 mmol)을, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(200 mg, 0.15 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 8 mg(0.018 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 19:

(S)-1-((S)-1-(2-( 벤질옥시 ) 벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2- 카보닐 ) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(150 mg, 0.45 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(166 mg, 0.45 mmol) 및 2-벤질옥시벤조산(101 mg, 0.45 mmol)을, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(200 mg, 0.15 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 5 mg(0.011 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 20:

(S)-1-((S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3-( 트리플루오로메틸 ) 벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2- 카보닐 ) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(150 mg, 0.45 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(166 mg, 0.45 mmol) 및 중간체 20(4-벤질옥시-3-트리플루오로메틸벤조산)(132 mg, 0.45 mmol)을, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(200 mg, 0.15 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 32 mg(0.061 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

실시예 21:

(S)-1-((S)-1-(4-( 벤질옥시 )-3- 플루오로벤조일 )-4,4- 디플루오로피롤리딘 -2-카보닐) 피롤리딘 -2- 카보니트릴

상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 L-프롤린(Fmoc-L-Pro-OH)(150 mg, 0.45 mmol), Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린(166 mg, 0.45 mmol) 및 중간체 21(4-벤질옥시-3-플루오로벤조산)(109 mg, 0.45 mmol)을, 단계적으로 상기 절차 E에 설명된 것과 같이 커플링을 통해 순차적으로 상업적으로 이용가능한 시이버(Sieber) 아미드 수지(200 mg, 0.15 mmol, 1 eq)에 결합(coupled)하였다. RP-HPLC에 의한 정제로 14 mg(0.030 mmol)의 최종 생성물을 수득하였다.

약리학적 데이터

(인간) 프롤릴 올리고펩티다아제 활성에 대한 신규한 화합물의 억제 효과 측정

프롤릴 올리고펩티다아제(POP)의 발현 및 정제

POP 는 E.coli 에서 발현 및 하기 요약된 문헌 절차(Tarrago T et al., ChemBioChem 2006;7:827-33)에 따른 His 꼬리 융합을 사용한 친화 정제(affinity purification)를 통해 수득하였다:

hPOP 발현: E. coli BL21 수용성 세포(competent cells)를 pETM10 hPOP로 형질전환 하였다. 발현을 유도하기 위하여, 카나마이신(50 μg/mL)을 함유하는 LB 배지(50 mL)의 전-배양은 하나의 콜로니에 접종하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음 날, LB 배지(500 mL)의 두 배양물(cultures)에 접종하고 밤새 배양(10 mL)하였다. 접종 배양물은 37℃에서 220 rpm 으로 OD₅₉₅ 가 1.2까지 성장시켰다. 그 이후, IPTG 를 첨가하고(1mM 의 최종 농도) 유도(induction)를 25℃에서 밤새 수행하였다. 세포를 수확하고(3500 g, 15 분, 4℃) 펠렛을 부유 버퍼(50 mL)에 부유시키고[Tris-HCl pH 8(50 mM), NaCl(300 mM), 이미다졸(1 mM)] 4 사이클(각 15초의 초음파 처리 및 15초의 휴식으로 이루어진)을 이용한 50%의 강도 및 0.5 펄스에서 초음파 처리하고, 샘플은 얼음에 보관하였다. 초음파 처리 후, 샘플을 원심분리(40 000 g, 30 분, 4℃)하고 상등액을 즉시 POP 정제에 사용하였다. AKTA 익스플로러(explorer) FPLC 시스템을 정제에 사용하였다. 상등액을 이전에 5 칼럼 부피의 부유 버퍼로 평형화된 HiTrapQuelating 칼럼(5 mL)에 1 mL/분의 유속으로 적용하였다. 칼럼을 기저 수준으로 돌아가는 280 nm에서의 흡광도까지 부유 버퍼로 세척하였다. 그 이후, 칼럼을 5 부피의 세척 버퍼로 세정하였다(50 mM Tris-HCl, pH 8, 300 mM NaCl, 30 mM 이미다졸). 용출을 4 부피의 용출 버퍼로 수행하였다(50 mM Tris-HCl, pH 8, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸). 분획(4 mL)을 전체 용출 동안 수집하였다. POP 활성을 모든 분획에서 체크하고 양성(positive)인 것을 SDS-PAGE로 분석하고 바이오세이프 코마시 스테인 G-250(Biosafe Comassie Stain G-250)으로 염색하였다. 양성 분획을 수집하고 버퍼로서 Tris-HCl(50 mM, pH 8)로 HiPrep 26/10 탈염화 칼럼의 사용으로 탈염하였다. 재조합 hPOP를 표준으로 BSA와 Bio-Rad 단백질 분석(Protein Assay)로 정량하였다. 재조합 효소의 부분표본(Aliquots)을 제조하고 즉시 액체 질소로 동결시킨 후 -80℃에 저장하였다.

POP 억제 분석

POP 활성을 Toide et al (Toide K et al., J. Pharmacol . Exp . Ther . 1995;274:1370-8)에 설명된 방법에 따라 결정하였다, POP 기질로서 Z-G-P-AMC (N-벤질옥시카보닐-Gly-Pro-메틸쿠마리닐-7-아미드)를 사용하였다. 반응은 다수의 반응의 동시 모니터링이 허용되는 96-웰 미량정량판(microtiter plates)에서 수행하였다. 각 반응에 있어서, 활성 버퍼(134 ml, 100 mM Na/K 포스페이트 버퍼, pH 8.0)를 hPOP(hPOP 배치(batch)의 활성에 따라, 20 내지 60 nM의 범위) 및 대응하는 새로운 화합물 용액(3 ml)로 37℃에서 15분간 전-배양하였다. 새로운 화합물의 저장액을 DMSO(100 mM)에서 제조하고, 희석액을 DMSO로 이 저장액으로부터 제조하였다. 대신에, 반응은 다른 활성 버퍼를 사용하여 수행하였고(141 μL, 100 mM Tris-아세테이트, 10 mM BSA, 1mM DTT, pH 7.3), hPOP(10 nM) 및 상응하는 새로운 화합물 용액(3 μl)(조건 B)으로 전-배양하였다.

전 배양 후, Z-G-P-AMC(10 ml, 3 mM in 40% 1,4-디옥산)을 첨가하고(3 μl, 40%의 1,4-디옥산 중에 1.5 mM, 조건 B), 반응은 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 반응은 소듐 아세테이트(150 ml, 1 M, pH 4)를 첨가하여 정지하였고 AMC의 형성은 형광측정법(fluorimetrically)으로 측정하였다. 여기(excitation) 및 방출(emission) 파장은 각각 360/40 및 485/20 nm 이었다.

여러 농도 지점(25 pM 내지 400 μM의 범위)은 각 화합물에서 측정하였다. 프롤릴 올리고펩티다아제에서 억제 활성은 수학식 1(eq 1) 에 따라 계산하였다. 각각의 새로운 화합물에 대해, hPOP의 존재 하(a) 및 부재 하(b)에서 형광을 측정하였다. 최대 형광(0% 억제 활성)은 억제 화합물의 부재에서 hPOP의 샘플로부터 수득하였다. 신규한 화합물의 억제 효능을 측정하기 위하여, 활성은 화합물의 로그(log) 농도에 대해 도시하였고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism software)를 이용하여 시그모이드 곡선(sigmoid curve)을 조절하고, IC₅₀ 값, POP 활성의 50%를 억제하는데 필요한 화합물의 농도로서 정의되는, 은 결과 곡선으로부터 측정하였다.

여기서:

a 는 기질 + 테스트된 화합물 + hPOP 존재하의 형광 강도에 상응하고,

b 는 기질 + 테스트된 화합물 존재하의 형광 강도에 상응하고,

c 는 기질 + hPOP 존재하의 형광 강도에 상응하고,

d 는 기질 존재하의 형광 강도에 상응한다.

새로운 화합물은 인간 프롤릴 올리고펩티다아제에 대해 높은 억제 효능을 나타내었다. 결과는 표 1에 요약하였다.

표 1: 인간 프롤릴 올리고펩티다아제의 억제.

(*) 조건 B에서 측정

연관 프롤린 특정 프로테아제에 대한 억제 활성

디펩티딜 펩티다아제 IV(DPPIV)의 활성에 새로운 화합물의 효과를 테스트하였다. 상기 프롤릴 올리고펩티다아제에 억제 활성을 결정하는 절차를 따르며, G-P-AMC(H-Gly-Pro-메틸쿠마리닐-7-아미드)를 기질로서 사용하였다. 활성 버퍼 및 상응하는 화합물 용액으로 DPPIV의 전 배양 후에, G-P-AMC(10 ml, 40% 1,4-디옥산 중에 750 mM)를 첨가하고, 반응은 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 반응은 소듐 아세테이트(150 ml, 1 M, pH 4)를 첨가하여 정지하였고 AMC의 형성은 형광측정법(fluorimetrically)으로 측정하였다. 여러 농도 지점(100 mM 내지 400 mM의 범위)은 각 화합물에서 측정하였다. DPPIV 에서 억제 활성은 수학식 1(eq 1)에 따라 계산하였다. 신규한 화합물 중에 디펩티딜 펩티다아제 IV에 대한 억제 활성을 보이는 것은 없었고(IC₅₀ 값은 400 μM 이상), 따라서 특정 POP 억제제이다.

추가로, 섬유아세포(fibroblast) 활성 단백질(FAP)에 대한 새로운 화합물의 억제 활성을 테스트하였다. POP에 대한 억제 활성의 측정을 위하여 상기 기재된 것과 유사한 절차를 따랐고, Z-G-P-AMC를 기질로 사용하였으며, 100 μM의 최종 농도에서 측정하였다. 분석에 사용된 버퍼는 50 mM Tris, 1M NaCl, 1mg/ml BSA pH: 7.5 였다. 재조합 인간 FAP은 활성 버퍼에서 2 μg/mL의 저장 농도에서 사용하였고, 분석에서 최종 농도 0.1 μg/mL로 이끌었다. 각 새로운 화합물의 저장액은 DMSO 중에 20 mM로 제조하고 편리하게 희석하였다. 활성 버퍼 및 상응하는 새로운 화합물 용액과 37℃에서 15분 동안 FAP의 전 배양 후에, 기질(50 ml, 활성 버퍼 중의 100 mM)을 첨가하고, 반응은 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 반응은 소듐 아세테이트(150 ml, 1 M, pH 4)를 첨가하여 정지하였고 AMC의 형성은 형광측정법(fluorimetrically)으로 측정하였다. 여러 농도 지점(100 mM 내지 400 mM의 범위)은 각 화합물에서 측정하였다. DPPIV 에서 억제 활성은 수학식 1(eq 1)에 따라 계산하였다. 신규한 화합물 중에 디펩티딜 펩티다아제 IV에 대한 억제 활성을 보이는 것은 없었고(IC₅₀ 값은 400 μM 이상), 따라서 특정 POP 억제제이다.

화학물의 투과성 특성 측정

평행 인공막 투과성 분석 (PAMPA)

Kansy M et al., J. Med . Chem . 1998;41(7):1007-10 에 기재된 평행 인공막 투과성 분석(Parallel artificial membrane permeability assay)(PAMPA)은 수동 확산(Di L et al., Eur . J. Med . Chem . 2003;38(3):223-32)에 의해 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통과하는 화합물의 용량(capacity)을 측정하는데 사용하였다. 화합물의 효과적인 투과성(P _e )은 200 μM의 시작 농도에서 측정하였다. 버퍼 용액은 제조사의 지시에 따라 상업적으로 농축된 것으로부터 제조하였다. pH 는 0.5 M NaOH 용액을 사용하여 7.4로 조절하였다. 새로운 화합물의 저장액은 DMSO에서 제조하였고 버퍼 용액으로 최종 200 μM 농도까지 희석하였다.(0.5% DMSO 함량). PAMPA 샌드위치(sandwich)는 분리하고 각 도너 웰(donor well)은 200 μM의 화합물 용액으로 채웠다. 어셉터 판(acceptor plate)은 도너 판(donor plate) 안에 넣고, 막의 아래면이 버퍼와의 접촉을 보장 하였다. 도데칸 중의 4 μL의 포스포리피드 혼합물(20 mg/mL)을 각 웰의 필터에 첨가하고, 200 μL의 버퍼 용액을 각 어셉터 웰에 첨가하였다. 판을 덮고 100 rpm 에서 궤도 교반 하에서 4시간 동안 포화 습도 분위기에 실온에서 배양하였다. 4시간 후에, 어셉터 및 도너 구획의 함량을 HPLC에 의해 분석하였다: 도너 판으로부터 각 웰의 150 μL 및 어셉터 판으로부터 각 웰의 150 μL를 HPLC 바이알로 옮겼고, 역-상 C₁₈ 칼럼(150 mm x 4.6 mm x 5 μm, 100 Å)으로 각 샘플을 주입하였다(100 μL/어셉터 웰로부터 주입, 10 μL/도너 웰로부터 주입 및 t ₀ 참조에 대한). 또한, 전송은 MALDI-TOF 분광분석법(spectrometry)으로 확인하였다.

사용한 포스포리피드 혼합물은 돼지 극성 지질 추출물이었고, 다음 조성으로 아반티(Avanti) 극성 지질에 의해 제공되었다: 12.6% 포스파티딜콜린(PC), 33.1% 포스파티딜에타놀아민(PE), 18.5% 포스파티딜세린(PS), 4.1% 포스파티딜이노시톨(PI), 0.8% 포스파티드산(phosphatidic acid) 및 30.9% 의 다른 화합물.

4시간 후의 효과적인 투과성(P _e )은 수학식 2를 이용하여 계산하였고 이동 백분율은 수학식 3을 이용하여 계산하였다:

여기서:

t 는 시간(h)이고,

C _A (t) 는 시간 t 에서 어셉터 웰의 화합물 농도이고,

C _D ( t ₀ ) 는 시간 t ₀ 에서 도너 웰의 화합물 농도이다.

표 2에 나타내는 표시된 Pe 값에 기초하여, 신규한 화합물은 BBB를 통과하는 우수한 투과성을 보여주었다(표 3)

표 2: 표시된 P_e 값

표 3: 새로운 화합물의 효과적인 투과성(P_e) 및 이동의 백분율

인지 장애 동물 모델에서 학습 및 기억에 새로운 화합물의 효과

새로운 화합물은 인지 장애에 대한 약리학적 모델에서 인지 인핸서(enhancer)로서 이들의 효능을 평가하였다. 새로운 화합물의 효과는 미처리된 및 MK-801-처리된 설치류(마우스 또는 랫)에서 평가하였다. MK-801은 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체의 비-경쟁적 길항제이며, 이는 동물의 다양한 학습 및 기억 패러다임 성과를 손상시켰다(Castellano C et al., Curr . Drug Targets 2001;2:273-83.; Riedel G et al., Behav . Brain Res. 2003;140:1-47). 또한, MK-801은 설치류 행동에 다양한 효과를 생산하였으며, 감각 처리(sensory processing), 운동 과다증(hypermotility), 상동증(stereotypy) 및 운동실조(ataxia)의 결핍을 포함한다. MK-801 처리에 의해 유도된 행동 표현형은 인지 결핍의 동물 모델에서 널리 사용되었다(Bardgett ME et al., Brain Res. Bull. 2003;60:131-42; Van der Staay FJ et al., Behav . Brain Res. 2011;220:215-29; Mutlu O et al., Pharmacol . Biochem . Behav . 2011;99:557-65).

테스트된 화합물이 인지 인핸서(enhancer)로서 역할을 하는지 측정하기 위하여서, 보통 인지 행동으로 복원할 수 있는 능력은 널리 사용되는 테스트로 테스트되었으며 예컨대, 신규한 물체 인식 테스트(novel object recognition test)(Dere E et al., Neurosci . Biobehav . Rev. 2007;31:673-704; Boess FG et al., J. Pharmacol. Exp . Ther . 2007;321:716-25); 수동 또는 억제 회피 과제(passive or inhibitory avoidance task)(Sarter M et al., Psychopharmacology ( Berl ) 1992;107:144-59); 모리스 수중 미로(the Morris water maze)(D'hooge R et al., Brain Res. Rev. 2001;36:60-90); 및 T-미로 교대 과제(the T-maze alternation task)(Boess FG et al., Neuropharmacology 2004;47:1081-92; Spowart-Manning L et al., Behav . Brain Res. 2004;151:37-46).

새로운 POP 억제제의 평가를 위한 대표 실시예로서, 각 행동 테스트에 따른 프로토콜, 뿐만 아니라 물체 인식 테스트 및 수동 회피 테스트에서 얻어진 결과를 기재하였다.

신규한 물체 인식 과제(Novel object recognition task)

신규한 물체 인식 과제(novel object recognition (NOR) task)는 신규한 물체를 탐구하는 설치류의 자연 선호에 기초하였다(Ennaceur A et al., Behav . Brain Res. 1988;31:47-59). 이는 시각 학습 및 기억 결핍에 대한 비-보상 테스트와 연관되어있다. 간단하게, 3 가지 시험으로 이루어진 NOR 과제 절차: 습관화(habituation), 훈련(training) 및 유지(retention). 각 동물은 물체의 부재하에 10분 동안 40-cm 직경의 원형 아레나(arena)에 습관화시켰다(습관환 세션). 다음 날, 동물은 훈련 시험을 위하여 원형 아레나에 10분 동안 배치하였고, 두 가지 동일한 물체를 대칭 위치로 배치하였다. 이 단계는 연속적인 이틀에 걸쳤다. 3번째 날에, 물체 중 하나를 상이한 물체로 교체하였다. 훈련 시험에서 사용되지 않은 물체를 유지(retention) 시험에서 사용하였다. 그 이후, 동물을 10분 동안 자유롭게 탐구할 수 있도록 허용하고, 각 물체를 탐구하는데 소요된 시간을 기록하였다. 동물은 신규한 물체를 탐구하는데 더 많은 시간을 소요할 것으로 예측되었고, 이는 온전한(intact) 인지 기억의 표지이다. 구별 지수(index of discrimination)는 다음과 같이 계산하였다: 새로운 물체를 탐구하는데 소요한 시간 빼기(minus) 기존의 물체를 탐구하는데 소요한 시간, 을 양 물체를 탐구한 총 시간으로 나누고, 100을 곱하였다. 높은 구별 지수(index of discrimination)는 더 우수한 기억 유지(retention)을 반영하는 것으로 간주하였다.

상응하는 테스트된 POP 억제제, 갓 PBS 중에 5% Tween 80으로 용해된, 는 5 mg/Kg의 양으로 피하(s.c.) 투여하였고, 동물 체중의 10 g 당 0.1 mL의 부피로 투여하였다. 15분 후에, PBS 버퍼 중에 용해된 MK-801은 0.2 mg/kg의 양으로 복강 내(i.p.) 주입하였고, 동물 체중의 10 g 당 0.1 mL의 부피로 주입하였다. 대조군 그룹은 MK-801을 i.p.로 투여하고 동일한 부피의 비히클(vehicle)을 s.c.로 투여하였다(PBS와 5% of Tween 80). 다른 대조군 그룹은 PBS i.p. 및 동일한 부피의 비히클 s.c.를 받았다. 약물 투여량은 행동 및 신경화학적 연구에 따라 의도된 효과를 보여주는 거승ㄹ 선택하였다. 동물은 두 가지 약물을 훈련 기간 뿐만 아니라 테스트 세션 이전 중 매일 투여하였다.

실시예 4의 화합물을 투여하였을 때 얻어진 결과, 본 발명의 화합물의 대표, 는 도 1에 나타내었다.

실시예 4의 화합물에 도시된 것과 같이, 본 발명의 화합물은 NOR 테스트에서 MK-801-유도된 기억 장애로 전환될 수 있다.

수동 회피 과제(Passive avoidance task)

수동 회피 과제의 평가를 위해서, 동일한 크기의 광 구획(light compartment) 및 암 구획(dark compartment)의 2-구획 박스를 사용하였다. 2 구획은 올릴 수 있는 기요틴(guillotine) 문으로 구분하였다. 사용한 장치는 이 테스트를 위한 절차에 따랐다. 하나의 충격 세션 및 평가 세션이 주어지고, 24시간의 간격의 인터세션(intersession)에 의해 구분하였다. 충격 세션에서, 설치류는 광 구획에 배치하였다. 20초의 적응(accommodation) 기간 후에, 설치류가 암 구획으로 들어가자 마자, 다른 구획으로의 기요틴 문은 열리고 다시 낮아졌다. 그 이후, 짧고 약한 발 충격을 투여하였다. 설치류는 60초 충격 종료 이후 장치에서 제거하고 다시 홈 케이지(home cage)에 넣었다. 평가 세션에서, 이전 세션 동안 암 구획에 받은 충격의 기억 유지(retention)의 표시로 동물이 암 구획으로 들어가는데 걸리는 시간(초)을 측정하였다. 두 번째 평가 세션은 초기 충격 세션 일 주일 후에 수행하였다. 상응하는 평가된 화합물을 충격 세션 35분 후에 주입하고, 그 다음 i.p.로 MK-801을 주입하고, 또는 대조군인 경우 PBS, 물체 인식 테스트에 기재된 것과 같은 동일한 투여량 및 부피로 주입하였다. 추가적으로 POP 억제제를 받은 동물은 암 구획에 들어가는데 큰 지연 시간을 보여준 반면에, MK-801로 처리된 동물만 홀로 작은 충격 세션의 기억의 유지를 보여주었으며, 더 나은 기억 유지의 표시이다.

실시예 4의 화합물을 투여한 경우 얻어진 결과, 본 발명의 화합물의 대표, 는 도 2에 나타내었다.

실시예 4의 화합물에 도시한 것과 같이, 본 발명의 화합물은 수동 회피 테스트에서 MK-801-유도된 기억 장애로 전환될 수 있다.

수중 미로(Water maze)(모리스 탈출 테스트(Morris escape test))

모리스 물 탈출 성과는 물 탱크에서 평가하였고, 이 테스트에 대한 표준 절차 및 크기에 따라, 약 22℃의 온도에서 라텍스로 염색된 수돗물로 채웠다. 회색 폴리에틸렌 실린더로 이루어진 탈출 플랫폼은 수면 아래 1.5 cm 침수시켰다. 상응하는 평가된 POP 억제제는 훈련 및 테스트 세션 35분 전에 s.c. 투여하였고, 그 다음 15분 후에 MK-801을 i.p. 주입, 대조군의 경우 PBS, 물체 인식 테스트에서 기재한 것과 동일한 투여량 및 부피로 주입하였다. 동물은 훈련 세션, 뿐만 아니라 평가 세션 동안 매일 두 화합물로 주입되었다.

설치류는 2 세트 사이에 2-일 간격으로 연속된 3일 동안 2 세트의 훈련 세션을 받았다. 3 가지 시험의 2 세트로 이루어진 각 훈련 세션은 짧은 간격을 두고(in close succession) 이루어졌다. 시험은 설치류를 풀(pool)에 탱크의 벽을 마주보게 배치하여 시작하였다. 네 시작 위치(북, 동, 남, 및 서)는 무작위 순서로 사용하였다. 탈출 플랫폼은 언제나 동일한 사분면이었다. 시험은 동물이 탈출 플랫폼에 올라오거나 60초가 경과하자마자, 어떤 이벤트가 처음 발생하든 종료하였다. 설치류가 플랫폼에 도달하면, 그들을 탱크 위의 특정 위치에서 스케이프(scape) 플랫폼과 연관시키는 것을 허용하기 위하여 30초 동안 머무를 수 있도록 허용하였다. 그 이후, 플랫폼에서 떨어뜨리고 다음 시험을 시작하였다. 만약 동물이 60초 내에 플랫폼을 찾지 못하면, 실험자에 의해 플랫폼에 올려졌고 30초 동안 머무를 수 있도록 허용하였다. 첫 번째 훈련 세션 동안 시각적 단서는 플랫폼의 위치를 표시하여 위치하였다. 이 단서는 다음 세션을 위하여 제거하였다. 훈련 세션 동안 플랫폼에 도달하는 지연 시간을 기록하였다.

훈련 세션의 두 번째 세트가 끝난 다음날, 평가를 수행하였다: 플랫폼을 제거하고, 훈련 세션 동안 위치된 플랫폼에 설치류가 풀(pool)의 사분면에 소요한 시간을 60초 동안 측정하였다. 조사(probe) 시험에서, 모든 동물은 동일 시작 위치에서 반대의 목표 사분면으로 풀어주었다. MK-801 처리된 동물은 플랫폼이 있는 위치를 효과적으로 학습하고 기억할 수 없었을 뿐만 아니라, 긴 수영 거리 및 탈출 지연 시간에서 보이는 것과 같이, 이들 동물이 목표 사분면에 소요한 시간을 다른 사분면에 도달한 시간과 비교하여도 마찬가지였다. MK-801로 처리된 동물 및 상응하는 POP 억제제로 처리된 동물은 테스트에서 더 나은 성과를 보여주었고, 플랫폼 위치를 학습하는(목표 사분면에 소요한 시간의 더 높은 백분율을 반영할 때), 따라서 MK-801의 효과는 효과적으로 전환된 것을 보여주었다. 동물은 일주일 동안 휴식하고 후에 추가로 4일 훈련을 하였다. 5일째 플랫폼을 제거하고 두 번째 평가를 수행하였다.

T-미로 교대 과제(T-maze alternation task)

작업 기억(Working memory)은 T-미로 교대 과제를 사용하여 테스트하였다. 실험은 일반 크기 및 절차에 따라, 나무로 조립되고 검은색으로 칠해진 T-미로에서 수행하였다. 측면 길은 이동문에 의해 주요 길로부터 닫혔다. 습관화 1 주일 전에, 동물이 그들의 자유-섭식 체중의 85%를 유지하기 위하여, 모든 동물은 부분적으로 음식을 제한하고 실험의 나머지 부분을 통틀어 그 방식을 유지하였다. 비디오 카메라는 테스트 세션을 녹화하기 위하여 T-미로 ~1m 위에 위치하였다. T-미로는 상이한 동물 사이에서는 청소했으나, 상이한 시험 사이에서는 그러지 아니하였다. 전체 실험은 3 부분으로 구성하였다: 습관화(habituation), 훈련(training) 및 테스팅(testing). 습관화(habituation) 중에, 모든 동물을 그들이 두 조각의 음식을 먹거나 90초가 지날 때까지 T-미로 위에 놓았다. 이는 하루에 3번씩 5일간 반복하였다. 훈련(training) 중에, 모든 동물은 하루에 6 개의 시험을 받았다. 각 시험은 두 개의 달리기로 이루어졌다: 강제 달리기(forced run) 및 자유 달리기(free run). 강제 달리기에서, 설치류는 T-미로의 하나의 목표 암(arm)에서 음식의 조각을 얻도록 강제하고, 다른 목표 암(arm)은 문으로 막았다. 그 이후, 동물은 10초 지연 기간 동안 시작 암(arm)에 다시 놓았다. 자유 달리기(free run)의 시작 부분에서, 동물은 목표 암(arm) 중에 고르는 것을 허용하였다. 만약 동물이 그들이 강제 달리기(forced run) 중에 강제된 곳 반대 암(arm)을 고르면, 그들은 음식을 보상으로 받았다. 만약 동물이 그들이 강제된 곳과 동일한 암(arm)을 고르면, 그들은 음식을 보상받지 못하였다. 5분간 시험 간격이 있었다. 훈련(training) 기간은 대조군 동물이 연속 2일 동안 >70% 올바른 선택을 한 후에 끝났다. 동물은 기준에 도달하기까지 7-12일 걸렸다. 14일 동안 기준에 도달하지 못한 동물은 본 연구에서 퇴출하였다. 그 이후, 설치류는 10 또는 40초의 지연 기간에 그들의 성과를 테스트되었다. 동물은 훈련일 동안 3 번의 10초 지연 및 3 번의 40초 지연 시험을 받았다. 약물 훈련( testing)을 위해, 설치류는 약물 노출 15분 후에 6 번의 10초 지연 시험을 받았다. 지연 및 강제-달리기(forced-run) 음식 위치의 순서(왼쪽 또는 오른쪽)는 매일 무작위였고, 동일한 지연 또는 동일한 강제-암(arm) 위치는 연속 3 가지 시험을 위하여 사용하지 않았다. 목표 진입(entries)은 암(arm)에서 4 발자국 위치하는 것으로 정의하였다.

상응하는 평가된 POP 억제제는 물체 인식 테스트에 기재된 것과 동일한 투여량 및 부피로, 테스트 세션 35분 전에 s.c. 주입하였고, 15분 후에 MK-801, 또는 대조군의 경우에 PBS를 i.p. 주입하였다.

대조군 동물은 가까운-기회 수준 성과 학습 곡선을 보여주고(약 50%의 올바른 암(arm) 진입(entries)), 훈련(training)의 1 및 4일 사이, 70%의 올바른 암(arm) 진입(entries)의 안정기(plateau)에 도달하기까지 11 및 14일 사이에서 점진적 상승을 보여주었다. 이들의 성과는 10 및 40초 지연 시험에서 안정적으로 유지되었다. MK-801로 처리된 동물은 교대 과제(alternation task)를 효과적으로 배울 수 없었고, 지연 시험에서 기회 수준 이하로 수행하였다. MK-801로 처리된 동물 및 상응하는 POP 억제제로 처리된 동물은 테스트에서 더 나은 성과를 보여주었고, 지연 시험에서 대조 동물과 비슷한 학습 곡선 및 기억 유지로, 따라서 MK-801의 효과는 효과적으로 반전된 것을 보여주었다.

Claims

화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 거울상 이성질체(enantiomer), 부분 입체 이성질체(diastereoisomer), 기하 이성질체(geometric isomer) 또는 용매화물:
[화학식 (I)]

여기서,
R¹; R², R³ 및 R⁴ 는 C_1-4알콕시, C_1-4알킬카보닐옥시, 벤질옥시, 페닐카보닐옥시, 나프틸카보닐옥시, 퀴놀리닐카보닐옥시, 이소퀴놀리닐카보닐옥시, 트리플루오로메틸, 할로겐 및 수소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R⁵ 는 할로겐, 니트릴, C_1-4알콕시, C_1-4알킬씨오, C_1-4알킬, 페닐, 페녹시, 페닐씨오 및 트리플루오로메틸로 이루어진 군으로부터 선택되며;
R⁶ 는 수소, 플루오르 및 메틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1항에 있어서, R² 및 R⁴ 는 수소, 할로겐, 트리플루오로메틸 및 C₁ _- ₄알콕시로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 화합물.
제2항에 있어서, R² 는 수소 및 메톡시로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴ 는 플루오르, 트리플루오로메틸 및 메톡시로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R³ 는 벤질옥시인 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R⁵ 는 플루오르인 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R⁶ 는 수소 또는 플루오르인 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기로부터 선택되는 것인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 거울상 이성질체(enantiomer), 부분 입체 이성질체(diastereoisomer), 기하 이성질체(geometric isomer) 또는 용매화물:
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-메톡시피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-페닐피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-(메틸씨오)피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-메틸피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-시아노피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S,4S)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-(트리플루오로메틸)- 피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-(털트-부톡시) 피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S,4R)-1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조일)-4-아세톡시피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S)-1-(4-아세톡시-3,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S)-1-(4-벤조일옥시-3,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S)-1-(3,4-디벤질옥시-5-메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S)-1-(3,4-디벤조일옥시-5-메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((2S)-1-(3-아세톡시-4,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴; 및
(S)-1-((2S)-1-(3-피바로일옥시-4,5-디메톡시벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기로부터 선택되는 것인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 거울상 이성질체(enantiomer), 부분 입체 이성질체(diastereoisomer), 기하 이성질체(geometric isomer) 또는 용매화물:
(S)-1-((S)-1-(4-(벤질옥시)벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((S)-1-(3-(벤질옥시)벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((S)-1-(2-(벤질옥시)벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴;
(S)-1-((S)-1-(4-(벤질옥시)-3-(트리플루오로메틸)벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴; 및
(S)-1-((S)-1-(4-(벤질옥시)-3-플루오로벤조일)-4,4-디플루오로피롤리딘-2-카보닐)피롤리딘-2-카보니트릴.
하기 단계를 포함하는 제1항 내지 제3항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 거울상 이성질체(enantiomer), 부분 입체 이성질체(diastereoisomer), 기하 이성질체(geometric isomer) 또는 용매화물을 제조하는 공정:
a) 화학식 (IX)의 화합물을 화학식 (XI)의 화합물과 반응시켜 화학식 (XII)의 화합물을 수득하는 단계:
[화학식 (IX)]

여기서, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶ 는 상기 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다:
[화학식 (XI)]

[화학식 (XII)]

b) 화학식 (XIV)의 화합물을 수득하기 위하여 화학식 (XII)의 화합물을 가수분해하는 단계
[화학식 (XIV)]

; 및
c) 화학식 (I)의 화합물을 수득하기 위하여 화학식 (XIV)의 화합물을 카복사미드 기가 니트릴 기로 변형될 수 있는 조건에 종속시키는 단계;
여기서, b) 및 c) 단계는 각각 또는 원 포트 반응(one pot reaction)으로 수행될 수 있다.
화학식 (IX)의 화합물을 화학식 (IV)의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제3항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 거울상 이성질체(enantiomer), 부분 입체 이성질체(diastereoisomer), 기하 이성질체(geometric isomer) 또는 용매화물을 제조하는 공정:
[화학식 (IX)]

여기서, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶ 는 상기 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다
[화학식 IV]

.
제1항 내지 제3항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 중 적어도 하나, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 거울상 이성질체(enantiomer), 부분 입체 이성질체(diastereoisomer), 기하 이성질체(geometric isomer) 또는 용매화물; 및 약학적으로 허용가능한 담체, 애주번트(adjuvant) 또는 비히클(vehicle)을 포함하는, 인지 장애(cognitive disorder)의 치료 및/또는 예방에 있어 의약로서 사용하기 위한 약학적 조성물.
제11항에 있어서, 상기 인지 장애(cognitive disorder)는 정신분열증(schizophrenia), 양극성 정동 장애(bipolar affective disorder), 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환과 연관된 인지 장애인 것인 약학적 조성물.
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