RS55865B1 - Derivati 1-[1-(benzoil)-pirolidin-2-karbonil]-pirolidin-2-karbonitrila - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenja koja imaju farmakološku aktivnost, a posebno na neke od derivata 1 - [1 - (benzoil)-pirolidin-2-karbonil]-pirolidin-2-karbonitrila, postupke za pripremu takvih jedinjenja, do farmaceutskih kompozicija koje ih sadrže. Jedinjenja iz pronalaska mogu biti korišćena u terapiji i/ ili profilaksi kognitivnih poremećaja.

POZADINA

[0002]Prolilna oligopeptidaza (EC 3.4.21.26) (POP), takođe poznat kao prolilna endopeptidaza (PREP) je serinska proteaza koja katalizuje hidrolizu peptida na C-terminalnom delu L-prolinskih ostataka. On je široko distribuiran kod sisara i može da se prečisti iz različitih organa, uključujući i mozak.

[0003]Enzim igra važnu ulogu u razgradnji neuropeptida koji sadrže prolin u vezi sa funkcijama učenja i pamćenja (Wilk S et al., Life Sci. 1983; 33: 2149-57; OLeary RM, O'Connor B, J. Neurochem. 1995; 65: 953-63).

[0004]Efekti inhibicijc prolilnc oligopeptidaze su testirani u tretmanu kognitivnih deficita vezanih za neurodegenerativne procese. Parkinsonova bolest je generisana kod majmuna tretmanom sa 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinom (MPTP), nervnim otrovom koji proizvodi pražnjenje supstance P. Naknadno tretiranje sa S-17092, snažnim POP inhibitorom, povećava performanse kognitivnih zadataka (Schneider JS et al, Neuropsychopharmacology 2002; 26 (2): 176-82). Takođe je otkriveno da inhibicija POP sprečava oligomerizaciju a-sinukleina ex vivo [Myohanen TT et al, Br. J. Pharmacol. 2012, 166 (3): 1097-1 13]. U slučaju Alchajmerove bolesti (AD), nekoliko in vivo eksperimenata na životinjskim modelima je pokazalo da POP inhibicija dovodi do neuroprotektivnih i kognitivno-poboljšavajućih efekata (Kato et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997; 283 (1): 328-35 i Toide K et al, Rev. Neurosci. 1998; 9 (1): 17-29). Neuroprotektivni efekti su prvobitno zapaženi od strane Katsube grupe, kada su kortikalne i cerebralne granula ćelije zaštićene od starosno indukovane apoptoze tretmanom sa POP inhibitorom ONO-1603 (Katsube N et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999; 288 (1): 6-13).

[0005]Kliničke studije sa POP inhibitorima u tretmanu kognitivnih deficita su izvedene samo u nekoliko slučajeva. U fazi I kliničke studije Morainove grupe (Morain P et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 2000; 50 (4): 350-9) utvrđeno je da je S 17092, novi oralno aktivni inhibitor prolilne endopeptidaze, pokazao svojstva poboljšanja spoznaje kod zdravih starih osoba i jasnu doznu zavisnost; štaviše, nisu detektovani neželjeni efekti. Kasnije studije predlažu dodatna blaga svojstva stabilizacije raspoloženja za ovo jedinjenje (Morain P et al., Neuropsychobiology 2007; 55 (3-4): 176-83).

[0006]Za aktivnost prolil oligopeptidaze je prijavljeno da se menja (post mortem) kod nekoliko neurodegenerativnih bolesti, uključujući Alchajmerovu bolest (AD), Parkinsonovu bolest, Hantingtonovu bolest i multiplu sklerozu (MS) (Mantle D et al., Clin. Chim. Acta 1996; 249 (1 -2): 129-39).

[0007]Postoji značajna količina dokaza koji ukazuju na ulogu neuroinflamacije u patogenezi neurodegenerativnih bolesti kao što su AD, MS i Parkinsonove bolesti (Hirsch EC et al., Lancet Neurol. 2009; 8 (4): 382-97, Philips T et al., Lancet Neurol. 2011; 10 (3): 253-63). Smatra se da je POP glavni enzim umešan u oslobađanje antiinflamatomog tetrapeptida Ac-SDKP iz Tp4 u mozgu (Yang F et al., Hypertension 2004; 43 (2): 229-36., Nolte WM et al., Biochemistrv 2009; 48 (50): 11971-81). Ovo sugeriše da POP inhibicija može pomoći u smanjenju neuroinflamacije i posledično POP inhibitori mogu biti korisni u lečenju neurodegenerativnih bolesti sa inflamatornim komponentama kao što su Alchajmerova i Parkinsonova bolest, a naročito pomažu u poboljšanju kognitivnih poremećaja povezanih sa ovim bolestima.

[0008]Senilni plakovi koji se šire preko područja kore mozga su tipična neuropatološka obeležja AD. Glavna proteinska komponenta ovih plakova je amiloidniP-peptid (AP). Taloženje Ap aktivira neuronske disfunkcije i smrti u mozgu. Ovaj peptid potiče odP-amiloid prekursornog proteina (APP). Pod normalnim uslovima, APP se čepa pomoću a-sekretaze da se generiše rastvorljivi APP a koji isključuje Ap generaciju.

[0009]Zanimljivo, inhibicija POP povećava intracelularne IP3 nivoe, koji mogu doprineti stimulaciji proizvodnje APPa, što bi zauzvrat smanjilo Ap generaciju.

[0010]Dodamo, Rossner (Rossner S et al., Neurochem. Res. 2005; 30 (6-7): 695-702) je ustanovio manje POP imunoreaktivnih neurona u strukturama mozga AD pacijenata pogođenih sa Ap plakovima.

[0011]Dodamo čini se da supstanca P može potisnuti neurotoksično dejstvoP-amiloidnog proteina (Kowall NW et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 1991; 88 (16) 7247-51). Inhibitori prolilne oligopeptidaze inhibiraju metabolizam supstance P pomažući u održavanju nivoa supstance P koji mogu da potisnu neurotoksično dejstvoP-amiloidnog proteina.

[0012]U pogledu gore navedenih efekata, smatra se da inhibitori prolilne oligopeptidaze mogu biti korisni lekovi za lcčcnjc Alchajmcrovc bolesti, koji pomažu u poboljšanju kognitivnih poremećaja povezanih sa bolešću.

[0013]Prolilna oligopeptidaza je takođe povezan sa nekoliko faktora koji mogu biti relevantni za multiplu sklerozu (MS). Na primer, POP je uključen u regulaciju toksičnosti mikroglija (Klegeris A et al., Glia 2008; 56 (6): 675-85). Zaista, nedavni izveštaj je uspostavio direktnu vezu između POP i MS; plazmatske POP aktivnosti pacijenata sa RR-MS su značajno smanjene (Tenorio-Laranga J et al., J. Neuroinflammation 2010; 7: 23). Zanimljivo, smanjenje je bilo u korelaciji sa težinom simptoma bolesti, ali ne i sa godinama pacijenta. Umesto toga, inverzna korelacija između POP aktivnosti i starosti je zabeležena kod zdravih kontrola, i kod starijih kontrole nivoa su bile uporedive sa onima nađenim kod MS pacijenata.

[0014]Neuropatološko obeležje Parkinsonove bolesti je progresivna degeneracija melanizovanih dopaminergičnih neurona u substanciji nigra pars compacta zajedno sa intraćelijskim inkluzijama poznatim kao Levijeva tela. Glavna komponenta Levijevih tela je protein od 140 aminokiselina, a-sinuklein. Pod određenim uslovima, a-sinukleinski monomeri stupaju u interakciju da formiraju prefibrilarne agregate ili protofibrile, koji mogu uzrokovati citotoksične nerastvorljive fibrile. Ova vlakna ne mogu biti degradirana od strane proteazoma i oni narušavaju funkciju ovog intracelularnog proteolitičkog sistema. Ovo dovodi do akumulacije a-sinukleinskih protofibrila (i drugih proteina koji se degradiraju proteazomima) u citozolu (Bennett MC, Pharmacol. Ter. 2005; 105 (3): 311 -31) i kao posledica, a-sinukleinski protofibrili su povećani u mozgu pacijenata sa Parkinsonovom bolešću. Ova vlakna su povezana sa neurotoksičnošću kod a-sinukleinskih prekomerno eksprimiranih ćelija i mišjim modelima (Masliah E et al., Science 2000; 287 (5456): 1265-9.; Gosavi N et al., J. Biol.Chem. 2002; 277 (50): 48984-92).

[0015]Abnormalna akumulacija nepravilno savijenog a-sinukleina može dovesti do mitohondrijalnih promena koje mogu da promovišu oksidativni stres i evociraju smrt ćelija (Hsu Lj et al., Am. J. Pathol. 2000; 157 (2): 401 - 10). Dalje, tri tačke mutacije (A53T, A30P ili E46K) u a-sinukleinskom genu su poznate da su uključene u patogenezu porodičnih oblika Parkinsonove bolesti (Polymeropoulos MH et al., Science 1997; 276 (5321): 2045-7; Zarranz JJ et al., Ann. Neurol. 2004; 55 (2): 164-73).

[0016]Pokazano je in vitro da je stopa agregacije a-sinukleina bila poboljšana kada je protein inkubiran sa klonom divljeg tipa svinjske POP, a ovo poboljšanje je zavisilo od koncentracije POP (Brandt I et al., Peptides 2008; 29 (9): 1472-8). Štaviše, mutirani varijanta bez POP aktivnosti (S544A) nije ubrzala stopu agregacije.

[0017]Poboljšana agregacija se takođe može sprečiti dodavanjem POP inhibitora, sugerišući da je efekat bio zavistan od POP enzimske aktivnosti. Nedavni dokazi predlažu da POP inhibitori mogu da blokiraju povećanu a-sinukleinsku agregaciju izazvanu oksidativnim stresom kod humanog neuroblastoma sa a-sinukleinskom prekomernom ekspresijom SH-SY5Y ćelija Myohanen TT et al., Br. J. Pharmacol. 2012;166 (3): 1097-113. POP ko-lokalizuje sa a-sinukleinom u SH-SY5Y ćelijama, a ova kolokalizacija nestaje nakon inkubacije sa inhibitorima POP, ukazujući na interakcije između POP i a-sinukleina. Tretman od 5 dana sa POP inhibitorom smanjuje količinu rastvorljivog a-sinukleina u mozgu A30P a-sinukleinskih transgenih miševa.

[0018]Stoga, inhibicija moždane POP aktivnosti može da spreči a-sinukleinsku agregaciju i tako, sprečava formiranje citotoksičnih protofibrila prisutnih u Levijevim telima. Stoga, inhibitori POP mogu potencijalno da imaju terapeutsku vrednost u lečenju neurodegenerativnih poremećaja gde je opisana ubrzana a-sinukleinska agregacija.

[0019]Jedinjenja sposobna da inhibiraju POP su efikasna u sprečavanju eksperimentalne amnezije izazvane skopolaminom kod pacova, zaključujući da inhibitori POP imaju funkcije u olakšavanju mnemoničkih disfunkcija (Yoshimoto T et al., J. Pharmacobiodvn. 1987; 10: 730-5).

[0020]Efekat subhronične primene rozmarinske kiseline, nekonkurentnog POP inhibitora (sa relativno visokom IC50 vrcdnošću od 63,7U.M), je testiran u Morrisovom vodenom lavirintu kod pacova, i prijavljeno je poboljšanje u prostornoj memoriji (Park DH et al., Fitoterapia 2010; 81 (6): 644-8).

[0021]Utvrđeno je da pacijenti sa bipolarnim poremećajem imaju visoke nivoe aktivnosti POP u serumu. U poslednjih nekoliko godina, POP je dobio na značaju kao meta za lečenje ovih bolesti, posebno zbog njegovog učešća u metabolizmu inozitola-l,4,5-P3 (IP3). IP3 je ključni molekul u prenosu signala u kaskadi neuropeptida. Preko vezivanja za specifične receptore, neuropeptidi indukuju povećanje IP3, koji se vezuje za svoj receptor na membrani endoplazmatskog retikuluma i indukuje oslobađanje Ca<2+>, za koji se veruje da igra ključnu ulogu u učenju i pamćenju. Noviji nalazi su pokazali da POP modulira koncentraciju IP3-a. (Komatsu Y J. Neurosci. 1996; 16: 6342-52). Tako je poznato da poremećaj gena POP u eukariotskomDictyostelium diseoideumindukuje otpornost na litijum preko visine IP3 (Schulz, et al., Eur. J. Biochem. 2002; 269: 5813-20), a takođe smanjuje proteolitičku aktivnost POP, koji je odgovoran za visoku koncentraciju IP3-a u humanim glioma antisens ćelijama za POP. Ovaj efekat je takođe primećen kada su ove ćelije tretirane sa specifičnim POP inhibitorima (Williams RS et al., EMBO J. 1999; 18:2734-45).

[0022]IP3 signalni put je uključen u delovanju nekoliko lekova kao terapeutskih stabilizatora raspoloženja (litijuma, karbamazepina i valproične kiseline) i nedostaci u mehanizmima koji regulišu IP3 signalizaciju mogu prouzrokovati bipolarni poremećaj. Štaviše, lek kao stabilizator raspoloženja koji se najčešće koristi za lečenje bipolamog poremećaja, valproična kiselina direktno inhibira aktivnost rekombinantne prolilne oligopeptidaze (Cheng L et al., Mol. Cell. Neurosci. 2005; 29: 155-61). Ukratko, postoje jaki dokazi da su POP inhibitori korisni u prevenciji i / ili lečenju bipolarnog afektivnog poremećaja kod sisara. Stoga, obezbeđivanje novih inhibitora prolilne oligopeptidaze je zanimljivo u terapiji ovog poremećaja ili bolesti.

[0023]Ukratko, okarakterisani su efekti nekoliko inhibitora prolilne oligopeptidaze (POP) u različitim kognitivnim zadacima i postoji neka vrsta konsenzusa da inhibitori POP imaju pozitivne efekte na učenje i pamćenje (Morain P et al., CNS Drug. Rev2002: 8 (1): 31-52; Shinoda M et al., Eur. J. Pharmacol. 1996, 305 (1-3): 31-8; Marighetto et al., Learn. Mem. 2000, 7 (3): 159-69; Toide K et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 1997:

56 (3): 427-34; Schneider JS et al., Neuropsychopharmacology 2002; 26 (2): 176-82).

[0024]Nekoliko patenata i patentnih prijava otkrivaju inhibitore POP: WO 2008/077978 Al, WO 2005/027934 Al, JP 2011-037874 A2, WO 2005/002624 Al, WO 2004/060862 A2, WO 03/04468 Al; DE 196 03 510 Al, US 2006/0100253 Al i US 6.159.938 A, ali samo nekoliko jedinjenja je podvrgnutoin vivostudijama (JTP-4819, S 17092, Z-321, ONO-1603, Y-29794, ZTTA, Z-Pro-Prolinal, i KYP-2047), samo prva tri na listi su započela klinička ispitivanja i nijedan od njih nije stigao na tržišno mesto.

[0025]Uprkos postojanju inhibitora POP, još uvek postoji potreba u tehnici da se obezbede alternativna jedinjenja sa visokim afinitetom za POP i sa dobrim kapacitetom da prelaze krvno-moždanu barijeru da dosegnu do mozga gde se delovanje inhibitora odvija kada se koriste u lečenju kognitivnih poremećaja. Ovo je važna karakteristika za jedinjenja da budu dobri kandidati za upotrebu u terapiji kognitivnih poremećaja.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0026]Pronalazači su sada uspešno otkrili da serija derivata 1 - [1 - (benzoil)-pirolidin-2-karbonil]-pirolidin-2-karbonitrila nije samo sposobna da inhibira POP sa visokom sposobnošću već su sposobni da prolaze kroz paralelnu veštačku membranu koja je dobro prihvaćena metoda za predviđanje sposobnosti da prolaze krvno-moždanu barijeru. Ova dva svojstva čine jedinjenja sadašnjeg pronalaska idealnim kandidatima za upotrebu u terapiji kognitivnih poremećaja.

[0027]Stoga, se jedan aspekt pronalaska odnosi na jedinjenja koja imaju formulu (I):

pri čemu

R1, R<2>, R<3>i R<4>su nezavisno odabrani iz grupe koju čine Ci^alkoksi, Ci^alkilkarboniloksi, benziloksi, fenilkarboniloksi, naftil karboniloksi, hinolinilkarboniloksi, isohinolinilkarboniloksi, trifluorometil, halogen i vodonik;

R5 je odabran iz grupe koju čine halogen, nitril, Ci^alkoksi, Ci^alkiltio, Ci^alkil, Ci^alkilkarboniloksi, fenil, fenoksi, feniltio i trifluorometil;

R<6>je odabran iz grupe koju čine vodonik, fluor i metil;

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, enantiomer, dijastereoizomer, geometrijski izomer ili solvat.

[0028]Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na postupke za dobijanje jedinjenja formule (I) kao što je iznad definisano ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, enantiomera, dijastereoizomera, geometrijskog izomera ili solvata.

[0029]Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na lek ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedno jedinjenje formule (I) kao što je prethodno definisano, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, enantiomer, dijastereoizomer, geometrijski izomer ili solvat i farmaceutski prihvatljiv nosač, adjuvans ili vehikulum.

[0030]Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na jedinjenje formule (I) kao što je gore definisano, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, enantiomer, dijastereoizomer, geometrijski izomer ili solvat, za upotrebu kao lek, posebno za prevenciju i / ili lečenje kognitivnih poremećaja.

OPIS SLIKA

[0031]

Slika 1 je grafičko poređenje rezultata dobijenih u testu prepoznavanja novog objekta (NOR) za PBS + nosač, MK-801 + nosač i MK-801 i jedinjenje iz primera 4

Slika 2 je grafičko poređenje rezultata dobijenih u testu pasivnog izbegavanja zadatka za PBS + nosač, MK-801 + nosač i MK-801 i jedinjenje iz primera 4.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0032]U kontekstu sadašnjeg pronalaska, sledeći izrazi imaju značenje detaljnije u nastavku.

[0033]Kako je ovde korišćeno Ci^alkil, kao grupa ili kao deo grupe, definiše ravan ili razgranati lanac zasićenih radikala ugljovodonika koji imaju od 1 do 4 atoma ugljenika kao što su metil, etil, n-propil, i-propil, n-butil, i-butil, sek-butil i terc-butil. Alkil radikali mogu biti opciono supstituisani sa jednim ili više supstituenata kao što su aril, halo, hidroksi, alkoksi, karboksi, cijano, karbonil, acil, alkoksikarbonil, amino, nitro, merkapto, alkiltio, itd. Ako je supstituisan arilom imamo "aralkil" radikal, kao što su benzil i fenetil.

[0034]Izraz Ci^alkoksi označava Ci^alkiloksi ili Ci^alkil etar radikal, gde je izraz Ci^alkil kako je gore definisano. Primeri pogodnih alkil etar radikala uključuju metoksi, etoksi, n-propoksi, izo-propoksi, n-butoksi, i-butoksi, sek-butoksi i terc-butoksi.

[0035]Izraz Ci^alkilkarboniloksi označava jedan Ci^alkil vezan za jednu -C (= 0) -0- grupu gde je izraz Ci^alkil kao što je gore definisano.

[0036]"Halogen", "halo" ili "hal" se odnosi na brom, hlor, jod ili fluor.

[0037]"Nitril", "cijano" ili "karbonitril" se odnosi na grupu -C-N.

[0038]Izraz CiJtalkilkarbonil se odnosi na jedan Ci^alkil povezan sa jednom karbonil -C (= 0) - grupom.

[0039]Izraz fenoksi označava feniloksi ili fenil radikal etra.

[0040]Izraz feniltio označava jedan fenil vezan za tioetarsku grupu -S-.

[0041]Treba napomenuti da položaji radikala na bilo kojem molekulskom ostatku koji se koristi u definicijama mogu biti bilo gde na takvom ostatku sve dok je isti hemijski stabilan.

[0042]Radikali korišćeni u definicijama bilo koje varijable ovde obuhvataju sve moguće izomere osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0043]Izraz "so" se mora shvatiti kao svaki oblik aktivnog jedinjenja korišćenog u skladu sa ovim pronalaskom u kome je pomenuto jedinjenje u jonskom obliku ili je naelektrisano i povezano sa suprotnim jonom (jednim katjonom ili anjonom) ili je u rastvoru. Ova definicija takođe obuhvata kvaternerne amonijumove soli i komplekse aktivnog molekula sa drugim molekulima i jonima, posebno, komplekse formirane putem jonske interakcije. Definicija posebno uključuje fiziološki prihvatljive soli; ovaj izraz se mora shvatiti kao ekvivalent "farmakološki prihvatljive soli" ili "farmaceutski prihvatljive soli".

[0044]Izraz "farmaceutski prihvatljive soli" u kontekstu ovog pronalaska označava bilo koju so koja se toleriše fiziološki (obično označava da nije toksična, naročito kao rezultat kontra jona) kada se koristi na odgovarajući način za tretman, primenjena ili korišćena, naročito kod ljudi i / ili sisara. Ove fiziološki prihvatljive soli mogu biti formirane sa katjonima ili bazama i, u kontekstu ovog pronalaska, se podrazumeva da su soli formirane od najmanje jednog jedinjenja korišćenog u skladu sa pronalaskom-normalno kiseline (deprotonovane) - kao što je anjon, posebno kada se koriste na ljudima i / ili sisarima. Ove fiziološki prihvatljive soli mogu takođe biti formirane sa anjonima ili kiselinama i, u kontekstu ovog pronalaska, se shvataju kao soli formirane od najmanje jednog jedinjenja korišćenog u skladu sa pronalaskom - normalno protonovane, na primer u atmosferi azota - kao katjon i najmanje jedan fiziološki tolerisani anjon, naročito kada se koristi na ljudima i / ili sisarima. Ova definicija specifično obuhvata u kontekstu ovog pronalaska soli formirane pomoću jedne fiziološki prihvatljive kiseline, tj soli specifičnog aktivnog jedinjenja sa fiziološki prihvatljivim organskim ili neorganskim kiselinama - naročito kada se ona koristi na ljudima i / ili sisarima. Primeri ove vrste soli su one formirane sa: hlorovodoničnom kiselinom, bromovodoničnom kiselinom, sumpornom kiselinom, metansulfonskom kiselinom, mravljom kiselinom, sirćetnom kiselinom, oksalnom kiselinom, ćilibarnom kiselinom, jabučnom kiselinom, vinskom kiselinom, mandeličnom kiselinom, fumarnom kiselinom, mlečnom kiselinom ili limunskom kiselinom.

[0045]Izraz "solvat" u skladu sa ovim pronalaskom treba razumeti kao značenje za svaki oblik aktivnog jedinjenja u skladu sa pronalaskom u kome je pomenuto jedinjenje povezano nekovalentnom vezom za drugi molekul (obično polarni rastvarač), uključujući naročito hidrate i alkoholate, kao na primer, metanolat. Poželjan solvat je hidrat.

[0046]Jedinjenja predmetnog pronalaska predstavljena prethodno opisanom formulom (I) mogu da obuhvataju enantiomere u zavisnosti od prisustva hiralnih centara ili izomere zavisno od postojanja višestrukih veza (npr Z, E). Pojedinačni izomeri, enantiomeri ili dijastereoizomeri i njihove smeše spadaju unutar obima predmetnog pronalaska.

[0047]Pored toga, bilo koja jedinjenja na koja se ovde odnosi mogu postojati kao tautomeri. Specifičnije, izraz tautomer se odnosi na jedan od dva ili više strukturnih izomera jedinjenja koja postoje u ravnoteži i lako konvertuju iz jednog izomernog oblika u drugi. Uobičajeni tautomerni parovi su amin-imin, amid-imidinska kiselina, keto-enol, laktam-laktim, itd.

[0048]Ukoliko nije drugačije navedeno, jedinjenja iz ovog pronalaska nameravaju da uključuju izotopski obeležene oblike tj jedinjenja koja se razlikuju samo u prisustvu jednog ili više izotopski obogaćenih atoma. Na primer, jedinjenja koja imaju sadašnje strukture, izuzimajući zamenu najmanje jednog atoma vodonika deuterijumom ili tricijumom ili zamenu najmanje jednog ugljenika sa<13>C- ili<14>C -obogaćenim ugljenikom ili zamenu najmanje jednog azota sa<15>N-obogaćenim azotom su unutar obima ovog pronalaska.

[0049]Jedinjenja formule (I) ili njihove soli ili solvati su poželjno farmaceutski prihvatljivi ili pretežno čistog oblika. Pod farmaceutski prihvatljivim oblikom podrazumeva se, između ostalog, da ima farmaceutski prihvatljiv nivo čistoće bez normalnih farmaceutskih aditiva kao što su: razblaživači i nosači, ne uključujući materijale koji se smatraju toksičnim pri normalnim nivoima doziranja. Nivoi čistoće za lekovite supstance su poželjno iznad 50%, poželjnije iznad 70%, najpoželjnije iznad 90%. U preporučenom izvođenju to je preko 95% jedinjenja formule (I), ili njegove soli, ili solvata.

[0050]Kao što je ranije zabeleženo, izraz "farmaceutski prihvatljive soli, solvati" se odnosi na bilo koju so, solvat koji je, nakon primene na primaocu, sposoban da obezbedi (direktno ili indirektno) jedinjenje kao što je ovde opisano. Međutim, biće priznato da ne-farmaceutski prihvatljive soli, i solvati takođe spadaju unutar obima pronalaska pošto oni mogu biti korisni u pripremi farmaceutski prihvatljivih soli i solvata. Priprema soli i solvata može biti izvedena pomoću postupaka poznatih u tehnici.

[0051]Kako je ovde korišćeno, izrazi "lečenje", "tretiranje" i "tretman" obuhvataju suzbijanje, uklanjanje, vraćanje, olakšanje, modifikaciju ili kontrolu bolesti ili stanja, kao što je kognitivni poremećaj.

[0052]Kako je ovde korišćeno, izrazi "prevencija", "koji sprečava", "preventivni", "sprečavanje" i "profilaksa" se odnose na sposobnost jedinjenja formule (I) da izbegnu, minimiziraju ili otežaju početak ili razvoj bolesti ili stanja, kao što je kognitivni poremećaj, pre njenog početka.

[0053]Dakle, pod "tretiranjem" ili "tretmanom" i / ili "prevencijom" ili "sprečavanjem", u celini, podrazumeva se najmanje potiskivanje ili ublažavanje simptoma povezanih sa stanjem koje utiče na subjekta, gde se suzbijanje i poboljšanje koriste u širem smislu da se odnose na najmanje smanjenje u veličini parametra, npr simptoma povezanog sa stanjem koje se leči, kao što je kognitivni poremećaj. Kao takav, postupak iz predmetnog pronalaska takođe uključuje situacije u kojima je stanje potpuno inhibirano, npr sprečeno od dešavanja, ili zaustavljeno, npr prekinuto, tako da subjekt ne doživljava stanje. Kao takav, ovaj postupak obuhvata i prevenciju i upravljanje kognitivnim poremećajem.

[0054]Izraz "kognitivni poremećaj", kako je ovde korišćen, označava bilo koje stanje koje karakteriše deficit mentalnih aktivnosti u vezi sa mišljenjem, učenjem, ili memorijom. Primeri takvih poremećaja uključuju agnozije, amnezije, afazije, apraksije, delirijume, demencije i poremećaje učenja.

[0055]Kognitivni poremećaj može biti (i često je) povezan sa (to jest, biti uzrokovan ili se javlja u prisustvu) drugih stanja karakterisanih oštećenjem ili gubitkom neurona ili drugih struktura uključenih u prenošenju signala između neurona. Stoga, kognitivni poremećaji mogu biti povezani sa neurodegenerativnim bolestima kao što su Alchajmerova bolest, kortikobazalna degeneracija, Creutzfeldt-Jacobsova bolest, frontotemporalne lobarne degeneracije, Hantingtonova bolest, multipla skleroza, hidrocefalus normalnog pritiska, organski sindrom hroničnog mozga, Parkinsonova bolest, Pickova bolest, progresivna supranuklearna paraliza, ili senilna demencija (Alchajmerovog tipa).

[0056]Kognitivni poremećaji mogu takođe biti povezani sa drugim stanjima koja ometaju normalno funkcionisanje centralnog nervnog sistema, uključujući psihijatrijske poremećaje kao što su anksiozni poremećaji, disocijativni poremećaji, poremećaji raspoloženja kao što je bipolarni afektivni poremećaj, šizofrenija i somatoformni i veštački poremećaji.

[0057]Jedinjenja ovde opisana mogu da se koriste za lečenje agnozija, amnezija, afazija, apraksija, delirijuma, demencija, poremećaja učenja i druge kognitivne poremećaje.

[0058]Primeri demencija koji mogu biti tretirani sa metodama iz ovog pronalaska uključuju kompleks AIDS demencije, Binsvangerovu bolest, demenciju sa Levijevim telima, frontotemporalne demencije, multi-infarktne demencije, Pikovu bolest, semantičke demencije, senilne demencije i vaskularne demencije.

[0059]Primeri poremećaja učenja koji se mogu tretirati postupcima iz ovog pronalaska uključuju Aspergerov sindrom, poremećaj nedostatka pažnje, hiperaktivni poremećaj nedostatka pažnje, autizam, dezintegrativni poremećaj u detinjstvu i Retov sindrom.

[0060]Primeri afazije koji se mogu tretirati sa postupcima iz ovog pronalaska uključuju progresivnu ne-tečnu afaziju.

[0061]Jedinjenja ovde opisana mogu takođe da se koriste za lečenje pacijenata koji imaju deficite u mentalnim aktivnostima koji su blagi ili koji inače značajno ne ometaju svakodnevni život. Blago kognitivno oštećenje predstavlja primer takvog stanja: pacijent sa blagim kognitivnim oštećenjem pokazuje simptome demencije (npr., poteškoće sa jezikom ili memorijom) ali ozbiljnost ovih simptoma je takva da dijagnoza demencije ne može biti odredjena. Jedinjenja ovde opisana mogu da se koriste za lečenje blagih kognitivnih pogoršanja i drugih, sličnih blažih oblika kognitivnih poremećaja.

[0062]U jednoj posebnoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, ovde opisana jedinjenja mogu da se koriste za lečenje pacijenata koji imaju kognitivni poremećaj povezan sa šizofrenijom, bipolarnim afektivnim poremećajem, Alchajmerovom bolešću ili Parkinsonovom bolešću. U posebnoj realizaciji predmetnog pronalaska u jedinjenjima formule (I) ili njegovoj farmaceutski prihvatljivoj soli, enantiomeru, dijastereoizomeru, geometrijskom izomeru ili solvatu, R<1>je vodonik; R<2>, R<3>i R<4>su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od Ci^alkoksi, Ci.4alkilkarboniloksi, benziloksi, fenilkarboniloksi, naftil-karboniloksi, hinolinilkarboniloksi i isohinolinilkarboniloksi; R<5>je izabran iz grupe koja se sastoji od halogena, nitrila, Ci^alkoksi, Ci^alkiltio, Ci.

4alkila, fenila, fenoksi, feniltio i trifluorometila i

R<6>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, fluora i metila;

[0063]U jednoj posebnoj realizaciji, R<2>i R<4>su nezavisno odabrani iz grupe koju čine vodonik, halogen, trifluorometil i Ci^alkoksi.

U drugom posebnom izvođenju, R<2>je odabran iz grupe koju čine vodonik i metoksi i R<4>je odabran iz grupe koju čine fluor, trifluorometil i metoksi.

[0064]U drugom posebnom izvođenju, R<5>je fluor.

[0065]U jednoj posebnoj realizaciji, R<2>i R<4>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine Ci^alkoksi, Ci.4alkilkarboniloksi i benziloksi.

[0066]U jednoj posebnoj realizaciji, R<2>i R<4>su metoksi.

[0067]U drugoj realizaciji, R<3>je benziloksi.

[0068]U drugoj realizaciji R<1>je vodonik.

[0069]U drugoj realizaciji, R<5>je odabran od fluora, metoksi, metiltio i fenila, poželjno fluor.

[0070]U drugoj realizaciji, R<6>je vodonik ili fluor.

[0071]U dodatnim poželjnim realizacijama, kombinovani su prioriteti gore opisani za različite supstituente. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na takve kombinacije poželjnih supstitucija u formulama iznad.

[0072]Posebna pojedinačna jedinjenja iz pronalaska koja spadaju pod formulom (I) uključuju jedinjenja navedena u nastavku:

• (S)-1-((2S, 4R)- l-(4- (benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4- metoksipirolidin-2-karbonil)

pirolidin-2-karbonitril

• (S)- 1-((2S, 4R)-1 -(4- (benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-fluoropirolidin- 2-karbonil)

pirolidin-2-karbonitril

• (S)-1-((2S, 4S)- 1 -(4- (benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-fenilpirolidin-2-karbonil)

pirolidin-2-karbonitril

• (S)-1 -((2S)-1 -(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidine-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril • (S)-1-((2S, 4S)-l-(4- (benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(metiltio)pirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril • (S)-1 -((2S, 4S)-1 -(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-metilpirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril • (S)- 1 -((2S, 4R)- l-(4- (benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-cijanopirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril • (S)-l -((2S, 4S)-l-(4- (benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(trifluorometil)-pirolidin-2-karbonil) pirolidm-2-karbonitril • (S)-1-((2S, 4R)-l-(4- (benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(terc-butoksi)pirolidin-2-karbonil) pirolidm-2-karbonitril • (S)-1-((2S, 4R)-l-(4- (benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-acetoksipirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril • (S)-1 -((2S)-1 -(4-acetoksi-3,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidm-2-karbonil)pirolidin-2-karbonitril • (S)-1 -((2S)-1 -(4-benzoiloksi-3,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril • (S)-1 -((2S)-1 -(3,4-dibenziloksi-5-metoksi-benzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril • (S)-1 -((2S)-1 -(3,4-dibenzoiloksi-5-metoksi-benzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril • (S)-1 -((2S)-1 -(3-acetoksi-4,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil)pirolidin-2-karbonitril • (S)-1 -((2S)-1 -(3-pivaloiloksi-4,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril • (S)-1 -((S)-1 -(4-(bcnziloksi)bcnzoil)-4,4-difluoropirolidm-2-karbonil)pirolidin-2-karbonitril • (S)-1-((S)-1 -(3-(benziloksi)benzoil)-4,4-difluoropirolidm-2-karbonil)pirolidin-2-karbonitril • (S)-1-((S)-1 -(2-(benziloksi)benzoil)-4,4-difluoropirolidm-2-karbonil)pirolidin-2-karbonitril • (S)-1 -((S)-1 -(4-(benziloksi)-3-(trifluorometil)benzoil)-4,4difluoropirolidin-2-karbonil)

pirolidin-2-karbonitril

• (S)-1 -((S)-1 -(4-(benziloksi)-3-fluorobenzoil)-4,4-difluoropirolidm-2-karbonil)pirolidin-2-

karbonitril

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, enantiomer, dijastereoizomer, geometrijski izomer ili solvat.

[0073] Jedinjenja formule (I) prethodno definisana mogu da se dobiju putem raspoloživih sintetičkih postupaka kao što je ilustrovano sledećim opštim šemama:

DETALJNA ŠEMA ZA POSTUPAK

[0074]

[0075]U prvom koraku estar formule (II) se rastvara ili suspenduje u polarnom organskom rastvaraču (poželjno protonskom polarnom organskom rastvaraču), kao što je etanol (EtOH) ili metanol ili smeši polarnih organskih rastvarača. Vodeni bazni rastvor je dodat i hidrolitička reakcija se odvija održavanjem smeše, tipično pod refluksom, na temperaturi između sobne temperature i temperature refluksa smeše rastvarača do završetka hidrolize, tipično tokom perioda od 0,5 do 4 sati, poželjno 1 -2 sata. Bazni rastvor je poželjno neorganske prirode, kao što je razblažena alkalija, na primer NaOH. Zatim je reakciona smeša ostavljena da dostigne sobnu temperaturu i, poželjno, koncentrovana do otprilike petine reakcione zapremine. Reakciona smeša se zatim polako dodaje kiselinskom rastvoru, kao što je rastvor 1 M HC1 da se izvrši neutralizacija, dok se hladi u ledenom kupatilu. Ako zakišeljavanje dovodi do precipitacije, čvrsti ostatak je profiltriran i ispran vodom, obezbeđujući proizvod formule (VII). Ukoliko se ne dobije talog, dobijeni rastvor je ekstrahovan nekoliko puta sa odgovarajućim organskim rastvaračem kao što je etilacetat, organska faza je osušena i uparena. Sirovi proizvod formule (VII) je prečišćen fleš hromatografijom.

[0076]Uklanjanje zaštite sa amina formule (III) se postiže pod blago kiselim uslovima, kao što je dodavanje u rastvoru hlorovodonika u organskom rastvaraču kao što je dioksan, ili sa TFA/DCM smešom, na niskoj temperaturi u rasponu od 0°C do sobne temperature. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1-3 sata. Rastvarač se zatim upari do suva, da bi se dobila hidrohloridna so ili trifluoroacetatna so amina formule (VI), u zavisnosti od upotrebljene kiseline.

[0077]Jedinjenje formule (IX) se dobija iz karboksilne kiseline formule (VII) i amina formule (VI) pod Schotten-Baumann uslovima. Tako, agens za hlorovanjc, kao što je oksalil hlorid je dodat u rastvor karboksilne kiseline formule (VII) u organskom rastvaraču kao što je toluen. Reakcija je mešana na temperaturi između 50°C i 80°C tokom 1 do 2 sata kako bi se omogućilo formiranje hlorida karboksilne kiseline formule (VIII). Nakon isparavanja rastvarača, dobijeni sirovi proizvod je rastvoren u organskom rastvaraču kao što je TKF i dodat vodenom baznom rastvoru amina formule (VI), tipično vodenom NaOH rastvoru amina formule (VI), pri niskoj temperaturi kao što je 0°C. Reakciona smeša je mešana na niskoj temperaturi tokom 1 do 2 sata i na sobnoj temperaturi tokom 2 do 4 sata. Zatim je rastvarač uparen i preostala vodena frakcija je podešena na kiseli pH (3-4) dodavanjem rastvora HC1 i ekstrahovana sa etil acetatom. Organska faza je isprana slanom vodom, osušena, filtrirana i uparena. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom kada je to potrebno.

[0078]Proizvod formule (IX) se zatim kupluje sa (S)-pirolidin-2-karbonitrilom formule (IV) u prisustvu baze, kao što je N,N-diizopropiletilamin (DIEA), i potpomognut reagensom za kuplovanje, kao što je karbodiimid. Posebno, jedinjenje formule (IX) je rastvoreno u aprotonskom organskom rastvaraču kao što je dihlorometan i dodato u karbodiimid, na primer karbodiimid podržan čvrstim kao što je N-cikloheksilkarbodiimid, N'-metil polistiren, zajedno sa DIEA. Nakon 5 min, dodati su (S) - pirolidin-2-karbonitril formule (IV) i pomoćni DIEA. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 8 do 16 sati. Zatim je reakciona smeša profiltrirana i preostali čvrsti ostatak je ispran sa aprotonskim organskim rastvaračem. Filtrat je uparen do suvog. Sirovi proizvod je zatim prečišćen preparativnom RP-HPLC.

[0079]Alternativno, jedinjenja formule (I) se mogu dobiti kao što je ilustrovano u Šemi E i opisano dole:

[0080]Smola aminski-funkcionalizovana poput Sieber amidne smole formule (X) se stavlja u špric opremljen sa polietilenskim poroznim diskom. Smola je nabubrila od ispiranja sa odgovarajućim organskim rastvaračima kao što su dihlormetan (DCM) i dimetilformamid (DMF). Kada je aminska grupa smole zaštićena (odnosno u slučaju Sieber amidna smola), uklanjanje zaštitne grupe (kao što je fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) zaštitna grupa) se postiže tretmanom sa aminskim baznim rastvorom kao što je rastvor piperidina u DMF-u.

[0081]Nakon uklanjanja zaštitne grupe sa smole, Fmoc-zaštićeni L-Prolin formule (V) je vezan za smolu pomoću aktivirajućeg agensa, kao što je triazol (tj TBTU) i aminske baze kao što je DIEA u odgovarajućem organskom rastvaraču kao što je DMF. Smeša je mešana tokom 1 do 2 sata. Nakon filtracije i ispiranja, stepen kuplovanja se može pratiti korišćenjem Kaiser- ovog testa, ponovno kuplovanje je izvedeno kada je to potrebno. Fmoc je uklonjen dajući proizvod formule (XI) pomoću tretmana sa baznim rastvorom amina kao što je rastvor piperidina u DMF-u i/ili smeše proizvoda piperidin/DBU/toluen/DMF. Fmoc uklanjanje se može proceniti korišćenjem testa p-nitrofenil estra NF31.

[0082]Proizvod formule (XI) je kuplovan sa proizvodom formule (IX), dajući proizvod formule (XII) korišćenjem aktivirajućeg agensa kao što je PyBOP, u prisustvu ili u odsustvu aditiva kao što su HOAt, i aminske baze kao što je DIEA u odgovarajućem organskom rastvaraču kao što je DMF. Smeša je mešana ručno tokom ukupnog reakcionog vremena od 1 do 2 sata. Sistematsko ponovno kuplovanje se vrši korišćenjem istih količina i vremena. Obim kuplovanja se može se pratiti korišćenjem testa p-nitrofenil estra NF31.

[0083]Alternativno, proizvod formule (XII) se može takođe dobiti stepenastim kuplovanjem proizvoda (XI) prvo do jedinjenja formule (XIII), praćenim uklanjanjem Fmoc zaštitne grupe i zatim kuplovanjem sa jedinjenjem formule (VII).

[0084]Proizvod formule (XII), koji je dobro ispran sa odgovarajućim organskim rastvaračem kao što je DCM i osušen, prenet je u bocu, kome su dodati anhidrid trifluorosirćetne kiseline i piridin u maloj količini organskog rastvarača. Smeša je održavana na temperaturi od 20 do 40°C tokom 8 do 16 sati. Zatim je reakciona smeša profiltrirana i smola je isprana sa istim organskim rastvaračem. Filtrati su sakupljeni i rastvarač je uparen do suva. Rezultujući sirovi proizvod je rastvoren u odgovarajućem rastvaraču kao što je etil acetat i ispran sa zasićenim rastvorom NaHC03i 5% vod. rastvorom KHSO4. Organska faza je osušena, filtrirana i uparena. Sirovi proizvod je preuzet u H20:CH3CN i liofilizovan da se dobije peptidni nitril formule (I).

[0085]Alternativno, peptidil-smola formule (XII) se može tretirati smešom TFA/H20/TIS tokom 1 -2 sata. Zatim je smola filtrirana i isprana sa TFA, filtrati su sakupljeni i rastvarač je uparen do suva. Sirovi proizvod je ponovo suspendovan u smeši H20:CH3CN i liofilizovan. Dobijeni sirovi peptidni amid se preuzima u odgovarajućem organskom rastvaraču kao što je DCM i konvertuje u nitril na primer u prisustvu fosfor pentoksida, titanijum tetrahlorida, tionil hlorida, anhidrida trifluorosirćetne kiseline/piridina ili trifenilfosfina/ karbontetrahlorida. Smeša je održavana na sobnoj temperaturi tokom 8 do 16 časova, rastvarač je uparen i ostatak je preuzet u etilacetatu. Organski rastvor je zatim ispran sa vod. rastvorom KHSO4i vod. rastvorom NaHC03. Sušenje i uparavanje organske faze daje peptidni nitril formule (I).

[0086]Sirovi proizvod je prečišćen pomoću RP-HPLC.

[0087]Gde se gore opisani postupci za pripremu jedinjenja prema pronalasku dovode do mešavine stereoizomera, ovi izomeri se mogu razdvojiti konvencionalnim tehnikama, kao što je preparativna hromatografija. Ako postoje hiralni centri, jedinjenja mogu biti pripremljena u obliku racemata, ili pojedinačni enantiomeri mogu biti pripremljeni bilo enantiospecifičnom sintezom ili razdvajanjem.

[0088]Jedinjenja formule (II), (III), (IV) i (V), kao i neka od jedinjenja formule (VII), korišćena kao polazni proizvodi su ili komercijalno dostupna i mogu takođe biti pripremljena metodama dobro poznatim stručnjacima u oblasti.

[0089]Stoga, u jednom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za dobijanje jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, enantiomera, dijastereoizomera, geometrijskog izomera ili solvata.

[0090]U jednoj realizaciji postupak obuhvata korake:

a) reagovanje jedinjenja formule (IX):

u kome su R<1>, R<2>, R<3>, R4,R5i R<6><k>ao što je prethodno definisano u formuli (I), sa jedinjenjem formule

(XI):

gde polimer označava polimer koji je inertan pod reakcionim uslovima postupka sinteze ovde opisanog i koji je nerastvorljiv, ali bubri u rastvaračima koji su ovde angažovani kao što su nizak unakrzno-vezan polistiren i polietilenglikol-kalemljeni polistirenski polimeri. da se dobije jedinjenje formule (XII); b) hidroliza jedinjenja formule (XII) da se dobije jedinjenje formule (XTV)

i

c) izlaganje jedinjenja formule (XTV) pod uslovima koji su sposobni da transformišu karboksamidnu grupu u nitrilnu grupu da bi se dobilo jedinjenje formule (I); gde se koraci b) i c) mogu izvesti odvojeno

ili reakcijom u jednoj posudi.

[0091] U drugoj realizaciji sadašnjeg pronalaska proces za dobijanje jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, enantiomera, dijastereoizomera, geometrijskog izomera ili solvata, obuhvata korake:

a) reagovanje jedinjenja formule (IX):

u kome suR<1>,R2, R<3>,R4,R<5>i R<6>kao što je prethodno definisano u formuli (I), sa jedinjenjem formule

(IV)

[0092]U još jednoj realizaciji postupak obuhvata korake:

a) reagovanje jedinjenja formule (XI):

gde polimer označava polimer koji je inertan pod reakcionim uslovima postupka sinteze ovde otkrivenog i nerastvorljiv, ali bubri u rastvaračima ovde korišćenim kao što su niži unakrsno-vezani polistiren i polietilenglikol-nakalemljeni polistirenski polimeri.

sa jedinjenjem formule (XIII):

u kome su R<5>i R<6>kao što je gore definisano u formuli (I)

b) uklanjanje Fmoc zaštitne grupe

c) reakcija sa jedinjenjem formule (VII);

u kome su R<1>, R<2>, R<3>i R<4>kao što je definisano iznad u formuli (I)

d) hidroliza rezultujućeg produkta iz potpornog polimera da bi se dobilo jedinjenje formule (I)

[0093]Utvrđeno je da su jedinjenja opšte formule (I) korisna u tretmanu kognitivnih poremećaja, naročito kognitivnih poremećaja povezanih sa drugim bolestima ili stanjima centralnog nervnog sistema.

[0094]U posebnoj realizaciji predmetnog pronalaska, kognitivni poremećaj je jedan kognitivni poremećaj povezan sa bolešću izabranom iz grupe koju čine šizofrenija, bipolarni afektivni poremećaj, Alchajmerova bolest i Parkinsonova bolest.

[0095]Sadašnji pronalazak dalje obezbeđuje lekove ili farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje iz ovog pronalaska, ili njegovu farmaceutsku so, ili stereoizomer, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, adjuvansom ili vehikulumom, za primenu kod pacijenta.

[0096]Pomoćni materijali ili aditivi farmaceutske kompozicije prema sadašnjem pronalasku mogu biti izabrani između nosača, ekscipijenasa, potpornih materijala, lubrikanasa, punioca, rastvarača, razblaživača, sredstava za bojenje, korigenasa ukusa kao što su šećeri, antioksidansi, veziva, adhezivi, sredstva za raspadanje, sredstva protiv lepljenja, sredstva za kliženje i / ili adherirajuća sredstva. U slučaju supozitorija, ovo može da podrazumeva voskove ili estre masnih kiselina ili konzervanse, emulgatore i / ili nosače za parenteralnu primenu. Izbor ovih pomoćnih materijala i / ili aditiva i količine koje se koriste zavisiće od oblika primene farmaceutske kompozicije.

[0097]Lek ili farmaceutska kompozicija prema sadašnjem pronalasku mogu biti u bilo kom obliku pogodnom za primenu na ljudima i / ili životinjama, poželjno humanu primenu uključujući odojčad, decu i odrasle i mogu se proizvesti pomoću standardnih postupaka koji su poznati stručnjacima u tehnici. Stoga, formulacija u skladu sa pronalaskom može biti prilagodjena za topikalnu ili sistemsku primenu, naročito za dermalnu, transdermalnu, subkutanu, intramuskularnu, intraartikularnu, intraperitonealnu, intravenoznu, intra-arterijsku, intravezikularnu, intrakoštanu, intrakavernoznu, intranazalnu, pulmonarnu, bukalnu, sublingvalnu, okularnu, intravitrealnu, perkutanu, rektalnu, vaginalnu, oralnu, epiduralnu, intratekalnu, intraventrikularnu, intracerebralnu, intracerebroventrikularnu, intracisternalnu, intraspinalnu, perispinalnu, intrakranijalnu, isporuku putem igala ili katetera sa ili bez uređaja tipa pumpe, ili drugim putevima primene.

[0098]U jednoj realizaciji farmaceutske kompozicije su u oralnom obliku, bilo kao čvrste ili tečne. Pogodni dozni oblici za oralnu primenu mogu biti tablete, pilule, kaplete, gel kapsule, žvakaće gume, kapsule, granule, kapi, sirupi ili rastvori i mogu sadržati konvencionalne ekscipijense poznate u struci, kao što su vezivna sredstva, na primer sirup, akacija, želatin, sorbitol, tragakanta, ili polivinilpirolidon; punioce, na primer laktozu, šećer, kukuruzni škrob, kalcijum fosfat, sorbitol ili glicin; lubrikanse kod tabletiranja, na primer magnezijum stearat; sredstva za dezintegraciju, na primer škrob, polivinilpirolidon, natrijum škrob glikolat ili mikrokristalnu celulozu; ili farmaceutski prihvatljiva sredstva za kvašenje kao što je natrijum lauril sulfat.

[0099]U sledećoj realizaciji farmaceutske kompozicije su u obliku proizvoda za ne-parenteralnu intranazalnu primenu, poželjno u obliku proizvoda za intranazalnu primenu. Tipično intranazalna primena se obavlja korišćenjem nazalnih sprejeva, boca za istiskivanje i tečnih kapaljki kao uređaja za isporuku. Da bi se koristile sa ovim uređajima, farmaceutske kompozicije su pogodno tečni rastvori ili suspenzije jedinjenja prema pronalasku.

[0100]Kompozicije mogu biti pripremljene konvencionalnim postupcima mešanja, punjenja ili tabletiranja. Ponovljene operacije mešanja se mogu koristiti za distribuiranje aktivnog sredstva putem tih kompozicija koje koriste velike količine punioca. Takve operacije su konvencionalne u stanju tehnike. Tablete mogu na primer biti pripremljene vlažnom ili suvom granulacijom i izborno obložene prema postupcima dobro poznatim u normalnoj farmaceutskoj praksi, posebno sa enteričnom oblogom.

[0101]Farmaceutske kompozicije mogu takođe biti prilagođene za parenteralnu primenu, kao što su sterilni rastvori, suspenzije ili suvi preparati za rekonstituciju, aerosoli ili sprejevi u odgovarajućim jediničnim doznim oblicima. Odgovarajući ekscipijensi se mogu koristiti, kao što su sredstva za punjenje, sredstva za puferovanje ili površinski aktivne materije.

[0102]Kompozicija prema pronalasku može biti formulisana u obliku depozita u rastvorenom obliku ili u flasterima za perkutanu primenu.

[0103]Primene na koži uključuju masti, gelove, kreme, losione, suspenzije ili emulzije.

[0104]Pogodan oblik za rektalnu primenu je pomoću supozitorija.

[0105]Pomenute formulacije biće pripremljene korišćenjem standardnih metoda kao što su one opisane ili navedene u Španskoj i US farmakopeji i sličnim referentnim tekstovima.

[0106]U jednoj realizaciji pronalaska poželjno je da se jedinjenje formule (I) koristi u terapeutski efikasnim količinama. Lekar će odrediti doze sadašnjih terapeutskih agenasa koje će biti najpogodnije i variraće sa oblikom primene i posebno odabranim jedinjenjem, a osim toga, one će varirati sa pacijentom koji je pod tretmanom, starošću pacijenta, vrstom oboljenja ili stanjem koje se leči. Kada se kompozicija primenjuje oralno, biće potrebne veće količine aktivnog agensa da se proizvede isti efekat kao manja količina koja je data parenteralno. Jedinjenja su korisna na isti način kao uporedivi terapeutski agensi i dozni nivo je istog reda veličine kao kada se generalno koristi sa ovim drugim terapeutskim agensima. Aktivna jedinjenja se tipično primenjuju jednom ili više puta dnevno, na primer 1, 2, 3 ili 4 puta dnevno, sa tipičnim ukupnim dnevnim dozama u opsegu od 0,1 do 1000 mg/kg/dan.

[0107]Jedinjenja i kompozicije iz ovog pronalaska mogu da se koriste sa drugim lekovima da obezbede kombinovanu terapiju. Ostali lekovi mogu da formiraju deo iste kompozicije, ili će biti obezbeđeni kao posebna kompozicija za primenu u isto vreme ili u različito vreme.

[0108]Naročito, kombinacija najmanje jednog jedinjenja formule (I) i najmanje jednog drugog leka može biti formulisana za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu, sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, aditivom, adjuvansom ili vehikulumom. Ovo ima implikaciju da kombinacija jedinjenja formule (I) i drugog leka može biti primenjena:

a) Kao kombinacija koja je deo iste formulacije leka, obe se onda primenjuju uvek istovremeno.

b) Kao kombinacija dve jedinice, svaka sa jednom od njih daje mogućnost za istovremenu, uzastopnu ili

odvojenu primenu. U posebnoj realizaciji, jedinjenje formule (I) se nezavisno primenjuje od drugog leka

(na primer u dve jedinice), ali u isto vreme. U drugom posebnom izvođenju, jedinjenje formule (I) se primenjuje prvo, a zatim se drugi lek primenjuje odvojeno ili sekvencijalno. U još jednom posebnom

izvođenju, drugi lek se primenjuje prvi, i zatim se jedinjenje formule (I) primenjuje, odvojeno ili sekvencijalno, kako je definisano.

[0109]U kontekstu predmetnog pronalaska, korišćeni su sledeći akronimi i skraćenice, značenje je detaljnije u nastavku:

AcOEt Etil acetat

AcSDKP A^acetil-seril-aspartil-lizil-prolin

AD Alchajmerova bolest

BBB Krvno-moždana barijera

Boe terc-Butoksikarbonil

BSA Goveđi serumski albumin

DBU 1, 8-Diazabiciklo [5.4.0] undek-7-en

DCM Dihlorometan

DIEAN, N'-Diizopropiletilamin

DMF Dimetilformamid

DMSO Dimetilsulfoksid

DPPIV Dipeptidil peptidaza IV

EtOH Etanol

Fmoc 9-fluorenilmetoksikarbonil

FPLC Brza proteinska tečna hromatografija

HOAt l-Hidroksi-7-azabenzotriazol

IP3 Inozitol trifosfat

IPTG Izopropil P-D-l -tiogalaktopiranozid

LB Lizogeni bujon

MALDI-TOF Laserska desorpcija/jonizacija uz pomoć matriksa - time-of-flight MK-801 Dizocilpin (INN),

MS Multipla skleroza

OD Optička gustina

PAMPA Test permeabilnosti paralelne veštačke membrane

PBS Fosfatni puferovani slani rastvor

PK Fosfatdilholin

PE Fosfatidiletanolamin

pETMIO PlazmidpETMIO

PI Fosfatidilinozitol

POP Prolilna oligopeptidaza

hPOP humana Prolilna oligopeptidaza

PREP Prolilna endopeptidaza (imajte u vidu da su POP i PREP sinonimi) PS Fosfatidilserin

PyBOP (Benzotriazol-1 -iloksi) tripirolidinofosfonijum heksafluorofosfat RP-HPLC Visoko efikasna tečna hromatografija reverzne faze

SD Standardna devijacija

SDS-PAGE Natrijum dodecil sulfat poliakrilamid gel elektroforeza

TBTU 0-(Benzotriazol-1 -il)-N, N, N, N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborat

TFA Trifluorosirćetna kiselina

TF1F Tetrahidrofuran

TIS Triizopropilsilan

Tris Tris (hidroksimetil) aminometan

T04 Timozin beta-4 protein

Z-G-P-AMC (A^Benziloksikarbonil-Gli-Pro-metilkumarinil-7-amid)

[0110]Sledeći primeri su samo ilustrativni iz nekih od realizacija pronalaska i ne mogu se smatrati kao ograničavajući na bilo koji način.

PRIMERI

SPECIFIČNI SINTETIČKI USLOVI KORIŠĆENI ZA PRIPREME OPISANE U PRIMERIMA

Postupak A: Hidroliza estra formule (II) do karboksilne kiseline formule (VII)

[0111]Estar formule (II) (1 mmol) je rastvoren u 95% EtOH. NaOH (3,7 mmol) je dodat i reakcija je održavana na refluksu tokom približno 2 sata. Zatim je ostavljena da dostigne sobnu temperaturu. Reakciona smeša je koncentrovana do cea. 15-20 mL i zatim se ovaj rastvor lagano dodaje u rastvor 1 M HC1, dok se hladi u ledenom kupatilu. Taloži se beli čvrsti talog, koji je sakupljen filtracijom, ispran vodom i dobro osušen pre sledećeg sintetskog koraka. U slučaju da se ne pojavljuje talog, dobijeni rastvor je ekstrahovan sa AcOEt (3x), organska faza je osušena i uparena. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom, ako je potrebno.

Postupak B: Deprotekcija Boe zaštićenog amina formule (III) da se dobije amin formule (VI)

[0112]Boe zaštićeni amin formule (III) (1 mmol) se polako dodaje na 4M HCI u dioksanu (20 ml) na 0°C. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Rastvarač je zatim uparen do suva, da bi se dobila hidrohloridna so amina formule (VI).

Postupak C: Kuplovanje amina formule (VI) sa karboksilnom kiselinom formule (VII) preko formiranja hlorida karboksilne kiseline formule (VIII).

[0113]Oksalil hlorid (1,5 mmol) se dodaje u rastvor karboksilne kiseline formule (VII) (1 mmol) u toluenu (5 ml). Reakcija je mešana na 50°C tokom 1,5 sata kako bi se omogućilo formiranje hlorida karboksilne kiseline formule (VIII). Nakon isparavanja rastvarača, dobijeni sirovi proizvod je rastvoren u THF-u i dodat u vodeni NaOH rastvor amina formule (VI) (1,1 mmol) na 0°C. Reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 1,5 sata i na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Zatim, THF je uparen i preostala vodena frakcija je podešena na kiseli pH (3-4) dodavanjem 1 M rastvora HCI i ekstrahovana sa AcOEt. Organska faza je isprana slanom vodom, osušena, filtrirana i uparena. Sirovi proizvod formule (IX) je prečišćen fleš hromatografijom kada je to potrebno.

Postupak D: Kuplovanje proizvoda formule (IX) sa (S)-pirolidin-2-karbonitrilom formule (IV) u rastvoru

[0114] Proizvod formule (IX) (1,2 mmol) je rastvoren u DCM-u i dodat u N- cikloheksilkarbodiimid,N'-metil polistiren (3 mmol), zajedno sa DIEA (1 mmol). Nakon 5 min, dodaju se (S)-pirolidin-2-karbonitril formule (IV)

(1 mmol) i DIEA (1 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Zatim je reakciona smeša profiltrirana i preostali čvrsti ostatak je ispran sa DCM-om. Filtrat je uparen do suvog. Sirovi proizvod je zatim prečišćen preparativnom RP-HPLC.

Postupak E: Opšta procedura za sintezu na čvrstoj fazi:

[0115] Bubrenje/kondicioniranje smole: Sieber amidna smola formule (X) (1 ekv) je postavljena u špric opremljen sa polietilenskim poroznim diskom. Smola je nabubrila od ispiranja sa DCM-om i DMF-om. Uklanjanje fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) zaštitne grupe se postiže tretmanima sa rastvorom 20% piperidina u DMF-u.

[0116]Zatim je Fmoc-zaštićeni L-Prolin formule (V) (4 ekv) vezan za smolu korišćenjem TBTU (4 ekv) i DIEA (8 ek) u DMF-u. Smeša se povremeno meša ručno tokom 90 min. Nakon filtracije i ispiranja, stepen kuplovanja se prati korišćenjem Kajzerovog testa, ponovno kuplovanje se izvodi kada je to potrebno. Fmoc je uklonjen dajući proizvod formule (XI) pomoću tretmana sa 20% rastvorom piperidina u DMF-u, a zatim sa rastvorom piperidin/DBU/toluen/DMF-om (20 : 5 : 5 : 70). Fmoc uklanjanje se procenjuje korišćenjem testa /»-nitrofenil estra NF31 (opisanog u Madder, A. et al., Eur. J. Org. Chem. 1999;(11): 2787-91).

[0117]Proizvod formule (IX) (2 ekv) je kuplovan sa proizvodom formule (XI), dajući proizvod formule (XII) korišćenjem PyBOP (2 ekv), HOAt (6 ekv) i DIEA (6 ek) u DMF-u. Smeša se povremeno meša ručno tokom ukupnog reakcionog vremena, 90 min. Sistematsko re-kuplovanje se vrši korišćenjem istih količina i vremena. Stepen kuplovanja se prati korišćenjem testa p-nitrofenil estar NF31.

[0118] Alternativno, proizvod formule (XIII) (4 ekv) je kuplovan sa proizvodom formule (XI) korišćenjem PyBOP (4 ekv), HOAt (12 ekv) i DIEA (12 ekv) u DMF-u. Smeša se povremeno meša ručno tokom ukupnog reakcionog vremena, 90 min. Stepen kuplovanja se prati korišćenjem testa p-nitrofenil estar NF31, a re-kuplovanje se vrši po potrebi. Fmoc grupa je uklonjena pomoću tretmana sa 20% rastvorom piperidina u DMF-u i tretmanom sa piperidin/DBU/toluen/DMF (20: 5:5: 70) rastvorom. Nakon toga, proizvod formule (VII) (4 ekv) se inkorporira korišćenjem PyBOP (4 ekv), HOAt (12 ekv) i DIEA (12 ekv) u DMF-u, da se dobije proizvod formule (XII). Smeša se povremeno meša ručno tokom ukupnog reakcionog vremena, 90 min. Stepen kuplovanja se prati korišćenjem p-nitrofenil estar NF31 testa, a re-kuplovanje se vrši po potrebi.

[0119]Proizvod formule (XII), temeljno ispran sa DCM-om i osušen, prebačen je u bocu sa okruglim dnom i dodaju se anhidrid trifluorsirćetne kiseline (5 ekv) i piridin (10 ekv) u DCM-u (cea. 2 mL/100 mg). Smeša je održavana na sobnoj temperaturi preko noći. Zatim je reakciona smeša filtrirana i smola je isprana sa DCM-om. Filtrati su sakupljeni i rastvarač je uparen do suva. Rezultujući sirovi proizvod je rastvoren u AcOEt i ispran sa zasićenim rastvorom NaHC03i 5% vod. rastvorom KHSO4. Organska faza je osušena, filtrirana i uparena. Sirovi proizvod je preuzet u H20: CH3CN (1: 1) i liofiliziran da se dobije peptidni nitril formule (I).

[0120]Alternativno, peptidil-smola formule (XII) se može tretirati smešom TFA/H20/TIS (95: 2,5: 2,5, oko 2-5 ml/100 mg) tokom 1 -2 sata. Zatim je smola filtrirana i isprana sa TFA, filtrati su sakupljeni i rastvarač je uparen do suva. Sirovi proizvod je ponovo suspendovan u smeši H20: CH3CN (1: 1) i liofiliziran. Dobijeni sirovi peptidni amid je preuzet u DCM-u i dodaju se anhidrid trifluorosirćetne kiseline (5 ekv) i piridin (10 ek). Smeša je održavana na sobnoj temperaturi preko noći, rastvarač je uparen i ostatak je prenet u AcOEt. Organski rastvor je zatim ispran sa 5% vod. rastvorom KHSO4i 10% vod. rastvorom NaHC03. Sušenje i uparavanje organske faze daje peptidni nitril formule (I).

[0121]Sirovi proizvod je prečišćen pomoću RP-HPLC.

SINTEZA INTERMEDIJERNIH JEDINJENJA:

Intermedij er1:4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina

[0122]

[0123]Metil 3,5-dimetoksi-4-hidroksibenzoat (2,0 g, 9,4 mmol), kalijum karbonat (3,2 g, 22,6 mmol) i kalijum jodid (500 mg, 3,0 mmol) se uvode u bocu sa okruglim dnom. Dodaje se aceton (200 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Zatim je u reakcionu smešu dodat benzil hlorid (4,3 mL, 37,7 mmol) i mešanje je nastavljeno na refluksu tokom 8 sati. Nakon toga, reakcija je ostavljena da se hladi do sobne temperature. Dodata je voda i izvršene su tri ekstrakcije sa dietiletrom, organski ekstrakt je ispran sa slanim rastvorom, osušen i uparen. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom, dajući 1,7 g (5,7 mmol). Nakon toga, hidroliza metil estra je izvršena prema gore opisanoj proceduri A, dajući 4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoevu kiselinu (2,4 g, 7,9 mmol).

Intermedijer 2: (2S, 4R)-4-metoksipirolidin-2-karboksilna kiselina

[0124]

[0125]Polazeći od komercijalno dostupne (2S,4R)-l-(terc-butoksikarbonil)-4- metoksipirolidin-2-karboksilne kiseline (221 mg, 1,5 mmol), proizvod je dobijen u kvantitativnom prinosu kao hidrohloridna so prema proceduri B gore opisanoj i koristi se bez daljeg prečišćavanja.

Intermedijer 3: (S)-4,4-difluoropirolidin-2-karboksilna kiselina

[0126]

[0127]Polazeći od komercijalno dostupne (S)-l-(terc-butoksikarbonil)-4,4-difluoropirolidin-2-karboksilne kiseline (150 mg, 1 mmol), dobijen je proizvod u kvantitativnom prinosu kao hidrohloridna so praćenjem gore opisane procedure B i korišćen je bez daljeg prečišćavanja.

Intermedijer 4: (2S, 4S)-4-(metiltio) pirolidin-2-karboksilna kiselina

[0128]

[0129]Polazeći od komercijalno dostupne (2S,4S)-l-(terc-butoksikarbonil)-4-metiltio- pirolidin-2-karboksilne kiseline (310 mg, 1,93 mmol), dobijen je proizvod u kvantitativnom prinosu kao hidrohloridna so prema proceduri B gore opisanoj i koristi se bez daljeg prečišćavanja.

Intermedijer 5: (2S, 4S)-4-metilpirolidin-2-karboksilna kiselina

[0130]

[0131]Polazeći od komercijalno dostupne (2S,4S)-l-(terc-butoksikarbonil)-4-metilpirolidin-2-karboksilne kiseline (500 mg, 2,18 mmol), dobijen je proizvod u kvantitativnom prinosu kao hidrohloridna so prema proceduri B prethodno opisanoj i korišćen je bez daljeg prečišćavanja.

Intermedijer 6: (2S, 4R)-4-acetoksipirolidin-2-karboksilna kiselina

[0132]

[0133]Komercijalno dostupni ?ra«s-L-hidroksiprolin (500 mg, 3,81 mmol) je rastvoren u 6N hlorovodoničnoj kiselini (1 mL). Dodata je glacijalna sirćetna kiselina (1 mL) i rastvor je ohlađen na 0°C u ledenom kupatilu. Acetil hlorid (10 mL) je zatim dodat polako. Posle nekoliko minuta, proizvod je dobijen putem taloženja, koje je potpomognuto dodavanjem etra. Jedinjenje (626 mg, 2,98 mmol), u obliku hidrohloridne soli, izolovano je putem filtracije, isprano etrom, osušeno i direktno korišćeno u sledećem koraku.

Intermedijer 7: (2S, 4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-metoksi-pirolidin-2 karboksilna kiselina

[0134]

[0135]Pripremljen prema proceduri C gore opisanoj iz Intermedijera 1 (4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeve kiseline) (425 mg, 1,5 mmol) i intermedijera 2 ((2S, 4R)-4- metoksipirolidin-2-karboksilne kiseline) (1,5 mmol). Prečišćavanje pomoću fleš hromatografije daje željeni proizvod (428 mg, 1,0 mmol).

Intermedijer 8: (2S, 4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-fluoropirolidin-2-karboksilna kiselina

[0136]

[0137]Pripremljen praćenjem gore opisanog postupka C iz intermedijera 1 (4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeve kiseline) (714 mg, 2,5 mmol) i komercijalno raspoložive (2S, 4R)-4- fluoropirolidin-2-karboksilne kiseline (363 mg, 2,7 mmol). Prečišćavanje fleš hromatografijom daje željeni proizvod (670 mg, 1,7 mmol).

Intermedij er 9: (2S,4S)-l-(4-(benziloksi)-3,S-dimetoksibenzoil)-4-fenilpirolidin-2-karboksilna kiselina

[0138]

[0139]Pripremljen praćenjem gore opisanog postupka C iz Intermedijera 1 (4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeve kiseline) (700 mg, 2,4 mmol) i komercijalno dostupne (2S, 4S)-4- fenilpirolidin-2-karboksilne kiseline (608 mg, 2,7 mmol). Prečišćavanje fleš hromatografijom daje željeni proizvod (700 mg, 1,5 mmol).

Intermedij er 10: (S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karboksilna kiselina

[0140]

[0141]Pripremljen praćenjem gore opisanog postupka C iz Intermedijera 1 (4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeve kiseline) (260 mg, 0,9 mmol) i Intermedijera 3 ((S)-4,4 difluoropirolidin-2-karboksilne kiseline) (1. 0 mmol). Prečišćavanje fleš hromatografijom daje željeni proizvod (366 mg, 0,9 mmol).

Intermedijer11:(2S, 4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(metiltio)-pirolidin-2-karboksilna

kiselina

[0142]

[0143]Pripremljen praćenjem gore opisanog postupka C iz Intermedijera 1 (4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeve kiseline) (505 mg, 1,75 mmol) i Intermedijera 4 ((2S, 4S)-4-(metiltio) pirolidin-2-karboksilne kiseline) (1,93 mmol). Prečišćavanje fleš hromatografijom daje željeni proizvod (537 mg, 1,24 mmol).

Intermedijer 12: (2S, 4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-metilpirolidin-2-karboksilna kiselina

[0144]

[0145]Pripremljen prema proceduri C gore opisanoj iz Intermedijera 1 (4-benziloksi-3,5- dimetoksibenzoeve kiseline) (384 mg, 1,33 mmol) i Intermedijera 5 ((2S, 4S)-4- metilpirolidin-2-karboksilne kiseline) (1,47 mmol). Prečišćavanje pomoću fleš hromatografije daje željeni proizvod (342 mg, 0,85 mmol).

Intermedijer13: (2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-acetoksipirolidin-2-karboksilna kiselina

[0146]

[0147]Pripremljen praćenjem gore opisanog postupka C iz Intermedijera 1 (4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeve kiseline) (400 mg, 1,39 mmol) i Intermedijera 6 ((2S, 4R)-4- acetoksipirolidin-2-karboksilne kiseline) (1,53 mmol). Prečišćavanje fleš hromatografijom daje željeni proizvod (342 mg, 0,85 mmol).

Intermedijer 14: 4-acetoksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina

[0148]

[0149]4-Hidroksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina (300 mg, 1,51 mmol) je rastvorena u piridinu (732 uL, 9,08 mmol) na 0°C. Anhidrid sirćetne kiseline (214 uL, 2.27 mmol) je dodat u kapima dok se smeša mešala. Ledeno kupatilo se čuva 2h, nakon čega se smeša sipa u ledenu vodu. Smeša je ekstrahovana sa DCM-om (3x), organska faza je isprana sa 1 N rastvorom HCI (3x), sa vodom i sa slanim rastvorom, osušena preko natrijum sulfata, filtrirana i uparena, dajući 4-acetoksi-3,5-dimetoksibenzoevu kiselinu (266 mg, 1,10 mmol).

Intermedijer 15: 4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina

[0150]

[0151]4-Hidroksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina (300 mg, 1,51 mmol) je rastvorena u vodi (6 mL) i zatim je dodat izopropanol (2,5 ml), praćeno sa dodavanjem kalijum karbonata (523 mg, 3,78 mmol). Smeša je održavana pod argonom i ohlađena do 0 ° C. Zatim, benzoil hlorid (185 uL, 1,59 mmol) je dodat u kapima u snažno mešanu reakcionu smešu. Gusti beli talog nastaje tokom dodavanja. Smeša se meša tokom dodatnih 20 minuta pre nego što je suzbijena sa 6M HCI, održavajući reakcionu smešu hladnom. Čvrsti ostatak je sakupljen filtracijom, ispran hladnom vodom i osušen da se dobije 4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina kao bela čvrsta supstanca (401 mg, 1,33 mmol).

Intermedijer 16: 3,4-dibenziloksi-5-metoksi-benzoeva kiselina

[0152]

[0153]Metil 3,4-dihidroksi-5-metoksibenzoat (300 mg, 1,51 mmol), kalijum karbonat (1,0 g, 7,3 mmol) i kalijum jodid (161 mg, 0,97 mmol) se uvode u bocu okruglog dna. Dodat je aceton (60 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Zatim se dodaje benzil hlorid (1,39 mL, 12,1 mmol) u reakcionu smešu i mešanje je nastavljeno narefluksu tokom 8 sati. Nakon toga, reakcija se ostavi da se ohladi do sobne temperature. Dodata je voda i vrše se tri ekstrakcije sa dietiletrom, organski ekstrakt je ispran sa slanim rastvorom, osušen i uparen. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću fleš hromatografije, dajući 377 mg (1,0 mmol). Nakon toga, hidroliza metil estra je izvršena praćenjem gore opisanog postupka A, da se dobije 3,4-dibenziloksi-5-metoksibenzoeva kiselina (144 mg, 0,4 mmol).

Intermedijer 17: 3,4-dibenzoiloksi-5-metoksibenzoeva kiselina

[0154]

[0155]3,4-Dihidroksi-5-metoksibenzoeva kiselina (300 mg, 1,63 mmol) je rastvorena u vodi (6 mL) i zatim je dodat izopropanol (2,5 ml), praćen sa kalijum karbonatom (1,13 g, 8,15 mmol). Smeša je održavana pod argonom i ohlađena do 0°C. Zatim je benzoil hlorid (388 uL, 3,34 mmol) dodat u kapima u intenzivno mešanu reakcionu smešu. Smeša je mešana tokom dodatnih 20 minuta pre nego što je ugašena sa 6M HCI, održavajući reakcionu smešu ohlađenom. Zatim je razblažena sa AcOEt i faze su razdvojene. Organska faza je isprana sukcesivno sa 1 M rastvorom HCI i zasićenim rastvorom soli, osušena iznad natrijum sulfata, filtrirana i uparena. Prečišćavanje sirovog proizvoda fleš hromatografijom daje 3,4-dibenzoiloksi-5-metoksibenzoevu kiselinu u obliku bele čvrste supstance (548 mg, 1,40 mmol).

Intermedijer 18: 3-acetoksi-4,5-dimetoksibenzoeva kiselina

[0156]

[0157]3-Hidroksi-4,5-dimetoksibenzoeva kiselina (300 mg, 1,51 mmol) je rastvorena u piridinu (732 uL, 9,08 mmol) na 0°C. Anhidrid sirćetne kiseline (214 uL, 2,27 mmol) se dodaje u kapima dok se smeša meša. Ledeno kupatilo se čuva 2h, nakon čega je smeša sipana u ledenu vodu. Smeša je ekstrahovana sa DCM-om (3x), organska faza je isprana sa 1 N rastvorom HCI (3x), vodom (2x) i rastvorom soli (2x), osušena preko natrijum sulfata, filtrirana i isprana, da se dobije 3-acetoksi-4,5-dimetoksibenzoeva kiselina (277 mg, 1,15 mmol).

Intermedijer 19: 3-pivaloiloksi-4,5-dimetoksibenzoeva kiselina

[0158]

[0159]Rastvor 3-hidroksi-4,5-dimetoksibenzoeve kiseline (300 mg, 1,51 mmol) i piridina (244 uL, 3,02 mmol) u hloroformu (2 mL) je mešan tokom 30 min. Ovoj reakcionoj smeši se dodaje u kapima rastvor pivaloil hlorida (196 uL, 1,59 mmol) u hloroformu (2 mL) na sobnoj temperaturi, pa se reakcija meša do njenog završetka prema TLC (oko 3h). Zatim se reakciona smeša razblaži sa DCM-om, doda se 1 M rastvor HCI i faze su razdvojene. Organska faza je sukcesivno ispirana sa 1 M rastvorom HCI (2x), vodom i sa slanim rastvorom, osušena preko natrijum sulfata, filtrirana i uparena. Prečišćavanje fleš hromatografijom daje 4-pivaloiloksi-3,5-dimetoksibenzoevu kiselinu (321 mg, 1,14 mmol).

Intermedijer 20: 4-benziloksi-3-trilfuorometilbenzoeva kiselina

[0160]

[0161]4-hidroksi-3-trifluormetilbenzoeva kiselina (1,0 g, 4,9 mmol) i kalijum karbonat (1,6 g, 11,6 mmol) se uvode u bocu sa okruglim dnom. DMF (10 mL) je dodat i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 5 minuta. Zatim se dodaje benzil hlorid (2,2 mL, 19,4 mmol) u reakcionu smešu, koja je održavana na refluksu tokom 4 sata. Nakon toga, reakcija se ostavi da se ohladi do sobne temperature. Dodata je voda i vrše se tri ekstrakcije sa etilacetatom (3x50 mL), a organski ekstrakt je ispran sa slanim rastvorom, osušen i uparen. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom, dajući prinos 1,3 g (3,4 mmol). Nakon toga, hidroliza benzil estra je izvršena prema postupku A gore opisanom, da se dobije 4-benziloksi-3- trifluorometilbenzoeva kiselina (320 mg, 1,1 mmol).

Intermedijer 21: 4-benziloksi-3-fluorobenzoeva kiselina

[0162]

[0163]4-hidroksi-3-fluorobenzoeva kiselina (1,0 g, 6,4 mmol), kalijum karbonat (2,7 g, 19,2 mmol) i kalijum jodid (532 mg, 3,2 mmol) se uvode u bocu sa okruglim dnom. Aceton (140 mL) je dodat i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Zatim je dodat benzil bromid (3,8 mL, 32,0 mmol) u reakcionu smešu, koja se održava na refluksu tokom 12 sati. Nakon toga, reakcija se ostavi da se ohladi do sobne temperature. Dodata je voda i vrše se tri ekstrakcije sa etilacetatom (3x50 mL), a organski ekstrakt je ispran sa slanim rastvorom, osušen i uparen. Sirovi proizvod se prečisti fleš hromatografijom, dajući prinos 1,2 g (3,5 mmol). Nakon toga, hidroliza benzil estra je izvršena prema postupku A gore opisanom, da se dobije 4-benziloksi-3-fluorometilbenzoeva kiselina (612 mg, 2,5 mmol).

Primer 1:

(S)-l-((2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-metoksipirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0164]

[0165]Komercijalno dostupni (S)-pirolidin-2-karbonitril (58 mg, 0,4 mmol) i Intermedijer 7 ((2S, 4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-metoksipirolidin-2-karboksilna kiselina) (220 mg, 0,5 mmol) su kuplovani prema postupku D gore opisanom. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 10 mg (0,02 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 2:

(S)-l-((2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-fluorpirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0166]

[0167]Polazeći od komercijalno dostupne Sieber amidne smole (500 mg, 0,30 mmol, 1 ekv), komercijalno dostupnog Fmoc-zaštićenog L-Prolina (Fmoc-L-Pro-OFf) (400 mg, 1,2 mmol) i Intermedijera 8 ((2S, 4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-fluorpirolidin-2-karboksilne kiseline) (239 mg, 0,60 mmol), proizvod je pripremljen praćenjem postupka E gore opisanog. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 80 mg (0,17 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 3:

(S)-l-((2S,4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-fenilpirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0168]

[0169]Polazeći od komercijalno dostupne Sieber amidne smole (500 mg, 0,38 mmol, 1 ekv), komercijalno dostupnog Fmoc-zaštićenog L-Prolina (Fmoc-L-Pro-OFf) (516 mg, 1,53 mmol) i Intermedijera 9 ((2S,4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-fenilpirolidin-2-karboksilne kiseline) (351 mg, 0,76 mmol), proizvod je pripremljen praćenjem postupka E gore opisanog. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 16 mg (0,03 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 4:

(S)-l-((2S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0170]

[0171]Polazeći od komercijalno dostupne Sieber amidne smole (250 mg, 0,19 mmol, 1 ekv), komercijalno dostupnog Fmoc-zaštićenog L-Prolina (Fmoc-L-Pro-OH) (258 mg, 0,77 mmol) i Intermedijera 10 ((S)-l-(4-

(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karboksilne kiseline) (161 mg, 0,38 mmol), proizvod je pripremljen praćenjem postupka E gore opisanog. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 18 mg (0,036 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 5:

(S)-l-((2S,4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(metiltio)pirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-

karbonitril

[0172]

[0173]Polazeći od komercijalno dostupne Sieber amidne smole (500 mg, 0,38 mmol, 1 ekv), komercijalno dostupnog Fmoc-zaštićenog L-Prolina (Fmoc-L-Pro-OH) (516 mg, 1,53 mmol) i Intermedijera 11 ((2S, 4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(metiltio)pirolidin-2-karboksilne kiseline) (330 mg, 0,76 mmol), proizvod je pripremljen praćenjem gore opisanog postupka E. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 22 mg (0,043 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 6:

(S)-l-((2S,4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-metilpirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0174]

[0175]Polazeći od komercijalno dostupne Sieber amidne smole (300 mg, 0,18 mmol, 1 ekv), komercijalno dostupnog Fmoc-zaštićenog L-Prolina (Fmoc-L-Pro-OH) (247 mg, 0,73 mmol) i Intermedijera 12 ((2S,4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-metilpirolidin-2-karboksilne kiseline) (146 mg, 0,37 mmol), proizvod je pripremljen praćenjem gore opisanog postupka E. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 10 mg (0,02 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 7:

(S)-l-((2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-cijanopirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0176]

[0177]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (516 mg, 1,53 mmol) i Boc-trans-4-cijano-L-prolin (368 mg, 1,53 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (500 mg, 0,38 mmol, 1 ekv), postepenim kuplovanjem kao što je opisano u postupku E gore. Nakon cepanja dipeptida sa smole, Intermedijer 1 (4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina) (145 mg, 0,5 mmol) je kuplovan do dobijenog nitrilnog dipeptida praćenjem postupka C, preko formiranja hlorida karboksilne kiseline. Prečišćavanje sirovog proizvoda pomoću RP-HPLC daje 11 mg (0,03 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 8: (S)-l-((2S,4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(trifluorometil)-pirolidin-2-karbonil)pirolidin-2-

karbonitril

[0178]

[0179]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (135 mg, 0,40 mmol), (2S, 4S)-Fmoc-4-trifluorometil-pirolidin-2-karboksilna kiselina (162 mg, 0,40 mmol) i Intermedijer 1 (4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina) (115 mg, 0,40 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smoli (165 mg, 0,10 mmol, 1 ekv), postepenim kuplovanjem kako je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 13 mg (0,045 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 9:

(S)-l-((2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(terc-butoksi)pirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0180]

[0181]Komercijalno dostupan Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (135 mg, 0,40 mmol), Fmoc-4-terc-butoksi-L-prolin (164 mg, 0,40 mmol) i Intermedijer 1 (4-benziloksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina) (115 mg, 0,40 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (165 mg, 0,10 mmol, 1 ekv), postepenim kuplovanjem kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 22 mg (0,076 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 10:

(S)-l-((2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-acetoksipirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-

karbonitril

[0182]

[0183]Polazeći od komercijalno dostupne Sieber amidne smole (165 mg, 0,10 mmol, 1 ekv), komercijalno dostupnog Fmoc-zaštićenog L-Prolina (Fmoc-L-Pro-OH) (135 mg, 0,40 mmol) i Intermedijera 13 ((2S, 4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-acetoksipirolidin-2-karboksilne kiseline) (90 mg, 0,20 mmol), proizvod je dobijen praćenjem gore opisanog postupka E. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 6,2 mg (0,012 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 11:

(S)-l-((2S)-l-(4-acetoksi-3,S-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0184]

[0185]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (135 mg, 0,40 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (149 mg, 0,40 mmol) i Intermedijer 14 (4-acetoksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina) (96 mg, 0,40 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (165 mg, 0,10 mmol, 1 ekv), kroz postepeno kuplovanje kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 25 mg (0,054 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 12:

(S)-l-((2S)-l-(4-benzoiloksi-3,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0186]

[0187]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (135 mg, 0,4 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (149 mg, 0,4 mmol) i Intermedijer 15 (4-benzoiloksi-3,5-dimetoksibenzoeva kiselina) (121 mg, 0,4 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (165 mg, 0,1 mmol, 1 ekv), kroz postepeno kuplovanje kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 26 mg (0,051 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 13:

(S)-l-((2S)-l-(3,4-dibenziloksi-5-metoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0188]

[0189]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (135 mg, 0,4 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (149 mg, 0,4 mmol) i Intermedijer 16 (3,4-dibenziloksi-5-metoksibenzoeva kiselina) (146 mg, 0,4 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (165 mg, 0,1 mmol, 1 ekv), kroz postepeno kuplovanje kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 24 mg (0,041 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 14:

(S)-l-((2S)-l-(3,4-dibenzoiloksi-5-metoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0190]

[0191]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (135 mg, 0,4 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (149 mg, 0,4 mmol) i Intermedijer 17 (3,4-dibenzoiloksi-5-metoksibenzoeva kiselina) (157 mg, 0,4 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (165 mg, 0,1 mmol, 1 ekv), putem postepenog kuplovanja kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 31 mg (0,052 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 15:

(S)-l-((2S)-l-(3-acetoksi-4,5-dimetoksibenzoil)-4,4-di£luoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0192]

[0193]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (135 mg, 0,4 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (149 mg, 0,4 mmol) i Intermedijer 18 (3-acetoksi-4,5-dimetoksibenzoeva kiselina) (96 mg, 0,4 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (165 mg, 0,1 mmol, 1 ekv), kroz postepeno kuplovanje kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 22 mg (0,048 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 16:

(S)-l-((2S)-l-(3-pivaloiloksi-4,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitril

[0194]

[0195]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (135 mg, 0,4 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (149 mg, 0,4 mmol) i Intermedijer 19 (3-pivaloiloksi-4,5-dimetoksibenzoeva kiselina) (113 mg, 0,4 mmol) se sekvencijalno spajaju na komercijalno dostupnoj Sieber amidnoj smoli (165 mg, 0,1 mmol, 1 ekv), kroz postepeno kuplovanje kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 19 mg (0,040 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 17:

(S)-l-((S)-l-(4-(benziloksi)benzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil)pirolidin-2-karbonitril

[0196]

[0197]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (150 mg, 0,45 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (166 mg, 0,45 mmol) i 4-benziloksibenzoeva kiselina (101 mg, 0,45 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (200 mg, 0,15 mmol, 1 ekv), putem postepenog kuplovanja kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 17 mg (0,038 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 18:

(S)-l-((S)-l-(3-(benziloksi)benzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil)pirolidin-2-karbonitril

[0198]

[0199]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (150 mg, 0,45 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (166 mg, 0,45 mmol) i 3-bcnziloksibcnzocva kiselina (101 mg, 0,45 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (200 mg, 0,15 mmol, 1 ekv), postepenim kuplovanjem kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 8 mg (0,018 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 19:

(S)-l-((S)-l-(2-(benziloksi)benzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil)pirolidin-2-karbonitril

[0200]

[0201]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OFf) (150 mg, 0,45 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (166 mg, 0,45 mmol) i 2-benziloksibenzoeva kiselina (101 mg, 0,45 mmol) se sekvencijalno kupluju na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (200 mg, 0,15 mmol, 1 ekv), putem postepenog kuplovanja kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 5 mg (0,011 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 20:

(S)-l-((S)-l-(4-(benziloksi)-3-(trifluorometil)benzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-

karbonitril

[0202]

[0203]Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (150 mg, 0,45 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (166 mg, 0,45 mmol) i Intermedijer 20 (4-benziloksi-3-trifluormetilbenzoeva kiselina) (132 mg, 0,45 mmol) su sekvencijalno kuplovani na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (200 mg, 0,15 mmol, 1 ekv), postepenim kuplovanjem kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 32 mg (0,061 mmol) finalnog proizvoda.

Primer 21:

(S)-l-((S)-l-(4-(benziloksi)-3-fluorobenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil)pirolidin-2-karbonitril

[0204]

[0205] Komercijalno dostupni Fmoc-zaštićeni L-Prolin (Fmoc-L-Pro-OH) (150 mg, 0,45 mmol), Fmoc-4,4-difluoro-L-prolin (166 mg, 0,45 mmol) i Intermedijer 21 (4-benziloksi-3-fluorobenzoeva kiselina) (109 mg, 0,45 mmol) su sekvencijalno spojeni na komercijalno dostupnu Sieber amidnu smolu (200 mg, 0.15 mmol, 1 ekv), postepenim kuplovanjem kao što je opisano u postupku E gore. Prečišćavanje pomoću RP-HPLC daje 14 mg (0,030 mmol) finalnog proizvoda.

FARMAKOLOŠKI PODACI

ODREĐIVANJE INHIBU ORNIH EFEKATA NOVIH JEDINJENJA NA (HUMANU) PROLILNU OLIGOPEPTIDAZU

Ekspresija i prečišćavanje prolilne oligopeptidaze (POP)

[0206] POP je dobijen ekspresijom u E. coli i afinitetno prečišćavanje korišćenjem fuzije His repa prema postupku iz literature (Tarrago T et al., Chembiochem 2006; 7: 827- 3) je sumirano niže: hPOP ekspresija:E. coliBL21 kompetentne ćelije su transformisane sa pETMIO hPOP. Da indukuje ekspresiju, jedna pre-kultura podloge LB (50 mL) koji sadrži kanamicin (50 ug/mL) je inokulisana sa jednom kolonijom i rasla je tokom noći na 37°C. Sledećeg dana, dve kulture podloge LB (500 mL) su inokulisane sa kulturom ostavljenom preko noći (10 mL). Inokulisane kulture su gajene na 37°C i 220 rpm dok je OD595 bio 1,2 (2,5-3 sata). Zatim je dodat IPTG (finalna koncentracija 1 mM) i indukcija je izvršena preko noći na 25°C. Ćelije su sakupljene (3500 g, 15 min, 4°C) i tableta je suspendovana u suspenzionom puferu (50 mL) [Tris-HCI pH 8 (50 mM), NaCI (300 mM), imidazol (1 mM)] i sonifikovana korišćenjem četiri ciklusa (svaki se sastoji od 15 sekundi sonikacije i 15 sekundi odmora) pri intenzitetu od 50% i 0,5 impulsa, uzorak se čuva na ledu. Nakon obrade ultrazvukom, uzorak je centrifugiran (40 000 g, 30 min, 4°C) i supernatant je odmah korišćen za POP prečišćavanje. AKTA explorer FPLC sistem je korišćen za prečišćavanje. Supernatant je primenjen pri protoku od 1 mL/min do HiTrapQuelating kolone (5 mL) prethodno ekvilibrisane sa 5 zapremina kolone suspenzije pufera. Kolona je isprana suspenzionim puferom sve dok se apsorpcija na 280 nm nije vratila na bazalni nivo. Kolona je potom isprana sa 5 zapremina pufera za ispiranje (50 mM Tris-HCI, pH 8, 300 mM NaCI, 30 mM imidazola). Eluiranje je izvedeno sa 4 zapremine eluacionog pufera (50 mM Tris-HCI, pH 8, 300 mM NaCI, 500 mM imidazola). Frakcije (4 mL) su prikupljene tokom čitavog eluiranja. POP aktivnost je proverena u svim frakcijama i pozitivne su analizirane pomoću SDS-PAGE i obojene sa Biosafe Comassie Stain G-250. Pozitivne frakcije su sakupljene i odsoljene upotrebom HiPrep 26/10 desalinizacione kolone sa Tris-HCI (50 mM, pH 8) kao puferom. Rekombinantni hPOP je kvantifikovan sa ispitivanjem Bio-Rad Protein sa BSA kao standardom. Alikvoti rekombinantnog enzima su pripremljeni i odmah zamrznuti sa tečnim azotom i čuvani na -80 °C.

Eseji POP inhibicije

[0207]POP aktivnost je određena praćenjem postupka opisanog od strane Toideet al(Toide K et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995; 274: 1370-8), koristeći Z-G-P-AMC( N-benziloksikarbonil-Gli-Pro-metilkumarinil-7-amid) kao POP supstrat. Reakcije su izvedene u 96-bazenčića mikrotitarske ploče, koje dozvoljavaju istovremeno praćenje višestrukih reakcija. Za svaku reakciju, pufer aktivnosti (134 ul, 100 mM Na/K fosfatni pufer, pH 8,0) je prethodno inkubiran tokom 15 min na 37°C sa hPOP (u rasponu od 20 do 60 nM, u zavisnosti od aktivnosti hPOP serije) i odgovarajućim rastvorom novog jedinjenja (3 ul). Stok rastvor novog jedinjenja je pripremljen u DMSO (100 mM), a razblaženja su pripremljena od ovog matičnog rastvora sa DMSO. Alternativno, reakcije se obavljaju upotrebom drugog pufera aktivnosti (141 uL, 100 mM Tris-acetat, 10 mM BSA, 1 mM DTT, pH 7.3), pre-inkubiranjem sa hPOP (10 nM) i odgovarajućim rastvorom novog jedinjenja (3 ul ) (Uslovi B).

[0208]Nakon perioda prethodne inkubacije, Z-G-P-AMC (10 ul, 3 mM u 40% 1,4-dioksanu) je dodat (3ul, 1,5 mM u 40% 1,4-dioksanu, u uslovima B), a reakcija je inkubirana tokom 1 sata na 37°C. Reakcija je zaustavljena dodavanjem natrijum acetata (150 ul, IM, pH 4) i formiranje AMC je mereno fluorimetrijski. Ekscitacione i cmisionc talasnc dužine su bile 360/40 i 485/20 nm, rcspcktivno.

[0209]Nekoliko tačaka koncentracije (u rasponu od 25 pM do 400 uM) se meri za svako jedinjenje. Inhibitorna aktivnost na prolil oligopeptidazu je izračunata prema jednačini 1. Za svako novo jedinjenje, fluorescencija u prisustvu (a) i u odsustvu hPOP (b) je merena. Maksimalna fluorescencija (0% inhibitorna aktivnost) je dobijena iz uzorka hPOP u odsustvu inhibitornih jedinjenja. Da bi se procenila inhibitorna snaga novog jedinjenja, aktivnosti su ucrtane nasuprot log koncentracije jedinjenja, podešavanjem prema sigmoidnoj krivi korišćenjem GraphPad Prism softvera, i IC50vrednosti, definisane kao koncentracija jedinjenja potrebna da inhibira 50% POP aktivnosti, koja je bila određena iz dobijene krive.

pri čemu:

a odgovara intenzitetu fluorescencije u prisustvu supstrata + testiranog jedinjenja + hPOP

b odgovara intenziteta fluorescencije u prisustvu supstrata + testiranog jedinjenja c odgovara intenzitetu fluorescencije u prisustvu supstrata + hPOP

d odgovara intenziteta fluorescencije u prisustvu supstrata.

[0210]Nova jedinjenja ispoljavaju visoku moć inhibicije nasuprot humane prolilne oligopeptidaze. Rezultati su sumirani u Tabeli 1.

Inhibitorna aktivnost nasuprot povezanih prolin specifičnih proteaza

[0211]Testiran je inhibitorni efekat novih jedinjenja na aktivnost dipeptidil peptidaze IV (DPPIV). Gore opisana procedura za određivanje inhibitorne aktivnosti na prolil oligopeptidazu je praćena, korišćenjem G-P-AMC (H-Gli-Pro-metilkumarinil-7-amid) kao supstrata. Nakon prethodne inkubacije DPPIV sa puferom aktivnosti i odgovarajućim rastvorom jedinjenja, G-P-AMC (10 ul, 750 u.M u 40% 1,4- dioksanu) je dodat i reakcija je inkubirana tokom 20 minuta na 37°C. Reakcija je zaustavljena dodavanjem natrijum acetata (150 ul, IM, pH 4) i formiranje AMC je mereno fluorimetrijski. Nekoliko koncentracionih tačaka (u rasponu od 100 uM do 400 uM uM) je mereno za svako jedinjenje. Inhibitorna aktivnost na DPPIV je izračunata prema jednačini 1. Nijedno od novih jedinjenja ne pokazuje inhibitornu aktivnost protiv dipeptidil peptidaze IV (ICsovrednosti preko 400 uM), i stoga su specifični inhibitori POP.

[0212]Dodatno je testirana inhibitorna aktivnost novih jedinjenja nasuprot proteina aktivacije fibroblasta (FAP). Praćen je postupak A sličan onom gore opisanom za određivanje inhibitorne aktivnosti na POP. Z-G-P-AMC je korišćen kao supstrat, pri konačnoj koncentraciji od 100 uM. Pufer korišćen u testovima je bio 50 mM Tris, 1 M NaCI, 1 mg/ml BSA pH: 7,5. Rekombinantni humani FAP je korišćen pri pripravnoj koncentraciji od 2 u.g/mL u pufera aktivnosti, što dovodi do konačne koncentracije 0.1 u.g/mL u testu. Stok rastvori svakog novog jedinjenja su pripremljeni pri 20 mM u DMSO i razblaženi pogodno. Nakon prethodne inkubacije FAP-a sa puferom aktivnosti i odgovarajućim rastvorom novog jedinjenja na 37°C u trajanju od 15 min, dodat je supstrat (50 ul, 100 uM u pufera aktivnosti) i reakcija je inkubirana tokom 1 h na 37°C. Reakcija je zaustavljena dodavanjem natrijum acetata (150 ul, IM, pH 4) i formiranje AMC je mereno fluorimetrijski. Nekoliko tačaka koncentracije (u rasponu od 100 uM do 400 uM) je mereno za svako jedinjenje. Inhibitorna aktivnost na FAP je izračunata prema jednačini 1. Nijedno od novih jedinjenja ne pokazuje inhibitorno dejstvo protiv FAP (IC5ovrednosti preko 400 uM), i stoga su specifični inhibitori POP.

ODREĐIVANJESVOJSTAVAPERMEABILNOSTI JEDINJENJA

Esej permeabilnosti paralelne veštačke membrane (PAMPA)

[0213]Esej permeabilnosti paralelne veštačke membrane (PAMPA) opisan u Kansi M et al., J. Med. Chem. 1998; 41 (7): 1007-10 je korišćen za određivanje kapaciteta jedinjenja da prolaze krvno-moždanu barijeru (BBB) pasivnom difuzijom (Di L et al., Eur. J. Med. Chem. 2003; 38 (3): 223-32). Efikasna permeabilnost (Pe) jedinjenja je merena pri početnoj koncentraciji od 200 u.M. Rastvor pufera je pripremljen od jednog komercijalnog koncentrisanog sledeći instrukcije proizvođača. pH je podešen na 7,4 korišćenjem rastvora 0,5 M NaOH. Stok rastvor novog jedinjenja je pripremljen u DMSO-u i razblažen sa rastvorom pufera do konačne 200 uM koncentracije (0,5% sadržaj DMSO). Sendvič PAMPA je odvojen i svaki donatorski bazenčić je ispunjen sa 200 uL rastvora jedinjenja. Akceptorska ploča je postavljena u donorsku ploču, vodeći računa da je donja strana membrane u kontaktu sa puferom. 4 uL smeše fosfolipida (20 mg/mL) u dodekanu je dodata filteru svakog bazcnčića i 200 uL rastvora pufera je dodato u svaki akceptorski bazenčić. Ploča je pokrivena i inkubirana na sobnoj temperaturi, u zasićenoj vlažnoj atmosferi tokom 4 sata pod orbitalnim mešanjem na 100 rpm. Nakon 4 sata, sadržaji akceptorskih i donatorskih odeljaka su analizirani pomoću HPLC: 150 u.L iz svakog bazenčića donorske ploče i 150 uL iz svakog bazenčića akceptorske ploče su prebačeni u HPLC bočice, injektovanjem svakog uzorka u reverzno faznu Ci«kolonu (150 mm x 4,6 mm x 5 um, 100 A) (100 uL/injekciji iz akceptorskih bazenčića, 10 uL/injekciji iz donatorskih bazenčića i za toreference). Transport je takođe potvrđen pomoću MALDI-TOF spektrometrije.

[0214]Korišćena fosfolipidna smeša je svinjski polarni lipidni ekstrakt mozga, obezbeđen od Avanti polarnih lipida, sa sledećim sastavom: 12,6% fosfatidilholina (PC), 33,1% fosfatidiletanolamina (PE), 18,5% fosfatidilserina (PS), 4,1% fosfatidilinozitola (PI), 0,8% fosfatidne kiseline i 30,9% ostalih jedinjenja.

[0215]Efektivna permeabilnost (Pe) nakon 4 sata je izračunata korišćenjem jednačine 2 i procenat transporta je izračunat korišćenjem jednačine 3:

pri čemu:t jevreme (h)

Ca(t) je koncentracija jedinjenja u akceptorskom bazenčiću u vremenutiQj( to)je koncentracija jedinjenja u donorskom bazenčiću prit0.

Na osnovu indikativnih Pevrednosti prikazanih u Tabeli 2, nova jedinjenja pokazuju dobru permeabilnost kroz BBB (Tabela 3)

EFEKAT NOVIH JEDINJENJA NA UČENJE I PAMĆENJE U ŽIVOTINJSKOM MODELU

POIMANJA OŠTEĆENJA

[0216]Nova jedinjenja su procenjena na njihovu efikasnost kao kognitivni inhenseri u farmakološkom modelu za kognitivno oštećenje. Efekti novih jedinjenja su procenjeni kod netretiranih i MK-801-tretiranih glodara (miševa ili pacova). MK-801 je nekompetitivni antagonist V-Metil-D-aspartat (NMDA) receptora koji narušava performanse životinja u različitim paradigmama učenja i pamćenja (Castellano C et al., Curr. Drug Targets 2001; 2: 273-83.; Riedel G et al., Behav. Brain Res. 2003; 140:1-47). MK-801 takođe proizvodi različite efekte na ponašanje glodara, uključujući deficite u senzornoj obradi, hipermotilitet, stereotip i ataksiju. Fenotip ponašanja indukovan pomoću MK-801 tretmana je široko korišćen kao životinjski model kognitivnih deficita (Bardgett ME et al., Brain Res. Buli. 2003; 60:131-42; Van der Staay FJ et al., Behav. Brain Res. 2011; 220:215-29; Mutlu O et al., Pharmacol. BioChem. Behav. 2011; 99:557-65).

[0217]Kako bi se utvrdilo da li testirana jedinjenja deluju kao kognitivni poboljšivači, njihova sposobnost da ponovo uspostave normalno kognitivno ponašanje je testirana preko široko korišćenih testova, kao što su test prepoznavanja novog predmeta (Dere E et al., Neurosci. Biobehav. Rev 2007; 31:673-704; Boess FG et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007; 321:716-25); pasivno ili inhibitorno izbegavanje zadatka (Sarter M et al, Psychopharmacology (Beri) 1992; 107:144-59); Morrisov vodeni lavirint (D'Hooge R et al., Brain Res. Rev. 2001; 36:60-90); i zadatak alternacije T-lavirinta (Boess FG et al., Neuropharmacology 2004; 47:1081-92; Spowart-Manning L et al., Behav. Brain Res. 2004; 151:37-46).

[0218]Kao reprezentativni primer za procenu novih inhibitora POP, protokol praćen za svaki od testova ponašanja, kao i rezultati dobijeni u testu prepoznavanja predmeta i testu pasivnog izbegavanja su opisani.

Zadatak prepoznavanja novog objekta

[0219] Zadatak prepoznavanja novog objekta (NOR)je baziran na prirodnom prioritetu glodara da istražuju nove objekte (Ennaceur A et al., Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59). To je relevantan nenagradni test za proučavanje vizuelnog učenja i memorijskog deficita. Ukratko, postupak NOR zadatka se sastojao od tri ispitivanja: privikavanja, obuke i zadržavanja. Svaka životinja je naviknuta na kružnu arenu prečnika 40-cm tokom 10 minuta u odsustvu objekata (sesija privikavanja). Slcdcćcg dana, životinje su smeštene tokom 10 min u kružnoj areni za ispitivanje obuke i dva identična predmeta su postavljena u simetričnom položaju. Ovaj korak je urađen tokom dva uzastopna dana. Trećeg dana, jedan od predmeta je zamenjen drugim objektom. Objekat koji se ne koristi u postupku obuke je korišćen kao novi objekat u ispitivanju retencije. Životinjama je zatim dozvoljeno da slobodno istražuju tokom 10 minuta, a vreme provedeno u istraživanju svakog objekta je snimljeno. Očekivano je da životinja provodi više vremena za ispitivanje novog objekta, što je znak netaknute memorije prepoznavanja. Indeks diskriminacije je izračunat na sledeći način: vreme provedeno za istraživanje novog objekta minus vreme provedeno za istraživanje starog objekta, podeljeno sa ukupnim vremenom istraživanja oba objekta, i pomnoženo sa 100. Veći indeks diskriminacije se smatra da odražava veće zadržavanje memorije.

[0220]Odgovarajući testirani POP Inhibitor, sveže rastvoren u 5% Tween-u 80 u PBS-u, je primenjen subkutano (s.c.) u dozi od 5 mg/kg, u zapremini od 0,1 mL na 10 g telesne težine životinje. Petnaest minuta kasnije, MK-801 rastvoren u PBS puferu je injektovan intraperitonealno (i.p.) u dozi od 0,2 mg/kg, u zapremini od 0,1 mL na 10 g telesne težine životinje. Kontrolna grupa je primenjena i.p. sa MK-801 i s.c. sa istom zapreminom nosača (PBS sa 5% Tween 80). Druga kontrolna grupa je primila PBS i.p. i istu zapreminu nosača s.c. Doze leka su odabrane na osnovu ponašanja i neurohemijskih studija, pokazujući da lekovi imaju željeni efekat. Životinje su injektovane sa dva leka svakoga dana tokom perioda obuke, kao i pre sesije testiranja.

[0221]Dobijeni rezultati prilikom primene jedinjenja iz Primera 4, kao predstavnika jedinjenja iz pronalaska su prikazani na Slici 1.

[0222]Kao što je ilustrovano sa jedinjenjem iz Primera 4, jedinjenja prema pronalasku mogu da preokrenu MK-801 indukovano oštećenje pamćenja u NOR testu.

Pasivno izbegavanje zadatka

[0223]Za procenupasivnog izbegavanja zadatka,korišćena je kutija sa dva odeljka sa svetlim odeljkom i tamnim odeljkom istih dimenzija. Ova dva odeljka su razdvojena giljotina vratima koja se mogu podizati. Uređaj se koristi bilo u skladu sa standardnim procedurama za ovaj test. Jedna sesija udara i jedna sesija evaluacije su primenjene, odvojene intersesionim intervalima od 24 h. U šok sesiji, glodar je smešten u svetli odeljak. Nakon perioda smeštaja od 20 s, otvorena su giljotina vrata prema drugom odeljku i spuštena ponovo, kada je glodar je ušao u tamni odeljak. Zatim je primenjen kratak i slab udarac stopala. Glodar je uklonjen iz aparata 60 s nakon prestanka udarca i stavljen nazad u kavez. U sesiji evaluacije, mereno je vreme koje je potrebno da životinja uđe u tamni odeljak (u sekundama), kao znak zadržavanja memorije od primljenog udarca u tamnom odeljku tokom prethodne sesije. Druga sesija procene je izvršena nedelju dana nakon prvobitne sesije udarca. Odgovarajuće procenjeno jedinjenje je injektovano s.c. 35 min pre sesije udarca, a zatim 15 minuta kasnije i.p. injekcijom MK-801, ili PBS-a u slučaju kontrole, u istim dozama i zapremini kako je opisano u testu prepoznavanja predmeta. Životinje tretirane samo sa MK-801 su pokazale malo zadržavanje memorije od šok sesije, dok životinje koje su dodatno primile inhibitor POP su pokazale veće kašnjenje za ulazak u mračni odeljak, indikativno usled boljeg zadržavanja memorije.

[0224]Dobijeni rezultati prilikom primene jedinjenja iz Primera 4, kao predstavnika jedinjenja prema pronalasku su prikazani na Slici 2.

[0225]Kao što je ilustrovano sa jedinjenjem iz Primera 4, jedinjenja prema pronalasku mogu da preokrenu MK-801 indukovano oštećenje pamćenja u testu pasivnog izbegavanja.

Vodeni lavirint (Test Morrisovog bekstva)

[0226]Nastup Morrisovog vodenog bekstva je procenjen u vodenom rezervoaru, u skladu sa standardnim procedurama i dimenzijama za ovaj test, napunjenim sa vodom iz slavine obojenom sa lateksom na temperaturi od približno 22°C. Platforma bekstva se sastojala od sivog polietilenskog cilindra, potopljenenog 1,5 cm ispod površine vode. Odgovarajući procenjeni POP inhibitor je primenjen s.c. 35 min pre treninga i sesija testiranja, a zatim nakon 15 min i.p. injektiranjem MK-801, ili PBS-a u slučaju kontrole, u istoj dozi i zapremini kako je opisano u testu prepoznavanja predmeta. Životinjama je injektovano dva jedinjenja svakoga dana tokom sesija treninga, kao i kod evaluacionih sesija.

[0227]Glodari su primili dva seta sesionih treninga tokom tri uzastopna dana, sa intervalom od dve dana između dva seta. Svaki trening se sastojao od dva seta od tri ispitivanja, koja su pokrenuta bliskim redom. Ispitivanje je tako započeto smeštanjem glodara u bazen, okrenutom ka zidu rezervoara. Četiri početne pozicije (sever, istok, jug i zapad) su korišćene u nasumičnom redosledu. Platforma bekstva je uvek bila u istom kvadrantu. Ispitivanje je prekinuto čim se životinja popela na platformu bekstva ili kada je proteklo 60 s, zavisno od toga koji događaj se dogodio prvi. Kada su glodari dostigli platformu, bilo im je dozvoljeno da ostanu tokom 30 s kako bi im se omogućilo da povežu platformu bekstva sa specifičnim položajem na rezervoaru. Zatim je uzet iz platforme i sledeće ispitivanje je započeto. Ako životinja nije našla platformu u roku od 60 s, postavljena je na platformu od strane eksperimentatora i bilo joj je dozvoljeno da ostane tamo tokom 30 s. Tokom prvog treninga vizuelni znak je postavljen da obeleži položaj platforme. Ovaj znak je uklonjen za naredne sesije. Tokom sesija treninga zabeleženo je vreme čekanja da se dostigne platforma.

[0228]Dan nakon završetka drugog seta sesija treninga, izvršena je evaluacija: platforma je uklonjena, a vreme koje je glodar proveo u kvadrantu bazena gde je platforma pozicionirana u toku treninga (ciljni kvadrant) je mereno tokom 60 s. U probnom ispitivanju, sve životinje su puštene iz iste početne pozicije, nasuprot ciljnom kvadrantu. Životinje tretirane sa MK-801 nisu bile u stanju da efikasno uče i pamte gde je stajala platforma, kao što je prikazano dužim swum distancama i latencijom bekstva, kao i vremenom koje su ove životinje provele na ciljnom kvadrantu, koje je bilo oko prošeka u odnosu na druge kvadrante. Životinje koje su tretirane sa MK-801 i sa odgovarajućim inhibitorom POP su pokazale bolje performanse na testu, učenjem položaja platforme (kao što se vidi prema višem procentu vremena provedenom u ciljanom kvadrantu), stoga pokazuju da je efekat MK-801 efikasno promenjen. Životinje su ostavljene da se odmore za nedelju dana i obučene potom za još 4 dodatna dana. Petog dana platforma je uklonjena i druga procena je izvršena.

Zadatak alternacije T-lavirinta

[0229]Radna memorija je testirana korišćenjem zadatka alternacije T-lavirinta. Eksperimenti su izvedeni u T-lavirintu napravljenom od drveta i obojenom u crno, u skladu sa opštim dimenzijama i procedurom. Bočne staze su zatvorene od glavne staze pokretnim vratima. Nedelju dana pre privikavanja, sve životinje su bile delimično ograničene sa hranom i ostale tako tokom preostalog dela eksperimenta, da bi zadržali životinje na 85% od njihove telesne težine slobodnog-hranjenja. Video kamera je smeštena~1 m iznad T-lavirinta da snimi test sesiju. T-lavirint je očišćen između različitih životinja, ali ne između različitih ispitivanja. Pun eksperiment se sastojao od tri dela: navikavanja, obuke i testiranja. Tokom privikavanja, sve životinje su stavljene u T-lavirint dok su jele dva komada hrane ili kada je ptoteklo vreme 90 s. Ovo je ponovljeno tri puta dnevno tokom 5 d. Tokom treninga, sve životinje su primile šest ispitivanja dnevno po danu. Svako ispitivanje se sastojalo od dva trčanja: prisilnog trčanja i slobodnog trčanja. Prisilnom trkom, glodari su bili primorani da dobiju komad hrane iz jednog ciljnog dela T-lavirinta, sa drugim ciljnim delom blokiranim njegovim vratima. Životinje su zatim vraćene natrag u početni ogranak sa periodom kašnjenja 10 s. Na početku slobodne trke, životinjama je dozvoljeno da izaberu bilo koji ciljni ogranak. Ako su životinje izabrale ogranak suprotno sa onim na koji su bile primorane u toku prinudne trke, dobile su nagradu hrane. Ako su životinje izabrale isti ogranak na koji su bile primorane, nisu dobile nagradu hrane. Bilo je 5 min između intervala ispitivanja. Period obuke je završen nakon što su kontrolne životinje učinile> 70% ispravnih izbora u 2 uzastopna dana. Životinjama je trebalo 7-12 dana da stignu do kriterijuma. Životinje koje nisu dostigle kriterijum za 14 dana su odbačene iz studije. Glodari su onda testirani na njihovo ponašanje pri periodima kašnjenja 10 ili 40 s. Životinje su dobile tri 10 s kašnjenja i tri 40 s ispitivanja kašnjenja tokom dana testiranja. Za testiranje leka, glodari su dobili šest 10 s ispitivanja odlaganja 15 min nakon izlaganja leku. Redosled kašnjenja i lokacija hrane primoranim trčanjem (ili levo ili desno) su randomizovani svakoga dana, sve dok isto kašnjenje ili ista lokacija prinudnog-ogranka nije korišćena za tri ispitivanja za redom. Ciljni ulasci su definisani kao postavljanje četiri šape u ogranak.

[0230]Odgovarajući procenjeni POP inhibitor je injektovan s.c. 35 min pre test sesije, a zatim 15 minuta kasnije i.p. injekcijom MK-801, ili PBS-a u slučaju kontrole, u istim dozama i volumenu kako je opisano u testu prepoznavanja predmeta.

[0231]Kontrolne životinje su pokazale krive učenja sa performansama na nivou blizu šanse (oko 50% ispravnih ulaska u ogranak) između 1 i 4 dana treninga, i postepeno poboljšanje između 11 i 14 dana treninga do dostizanja platoa od 70% ispravnih ulaska ogranka. Njihov nastup je ostao stabilan pri 10 i 40 s ispitivanjima kašnjenja. Životinje tretirane sa MK-801 nisu bile u stanju da efikasno nauče zadatak alternacije i nastupale su ispod nivoa šanse u ispitivanjima kašnjenja. Životinje koje su tretirane sa MK-801 i sa odgovarajućim inhibitorom POP su pokazale bolje performanse na testu, sa sličnim krivama učenja kao kontrolne životinje i zadržavanjem memorije u ispitivanjima kašnjenja, stoga pokazujući daje efekat MK-801 bio suprotno efikasan.

Claims (13)

1. Jedinjenje formule (I) gde su R<1>,R2, R<3>i R<4>nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od Ci ^alkoksi, Ci^alMlkarboniloksi, benziloksi, fenilkarboniloksi, naftilkarboniloksi, hinolinilkarboniloksi, isohinolinilkarboniloksi, trifluorometila, halogena i vodonika; R<5>je izabran iz grupe koja se sastoji od halogena, nitrila, Ci^alkoksi, Ci^alkiltio, Ci^alkila, fenila, fenoksi, feniltiola i trifluorometila; R<ć>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, fluora i metila; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, enantiomer, dijastereoizomer, geometrijski izomer ili solvat.

2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da su R<2>i R<4>nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, trifluorometila i Ci^alkoksi.

3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, gde je R<2>odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika i metoksi i R<4>je izabran iz grupe koja se sastoji od fluora, trifluorometila i metoksi.

4. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde je R<3>benziloksi.

5. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde je R<5>fluor.

6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, gde je R<6>vodonik ili fluor.

7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, gde je pomenuto jedinjenje odabrano od: • (S)-l-((2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-metoksipirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitrila • (S)-l-((2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-fluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitrila • (S)-l -((2S,4S)-1 -(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-fenilpirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitrila • (S)-l-((2S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitrila • (S)-l-((2S,4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(metiltio)pirolidm-2-karbon pirolidin-2-karbonitrila • (S)-l -((2S,4S)-1 -(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-metilpirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitrila • (S)-l-((2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-cijanopirolidine-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitrila • (S)-l-((2S,4S)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(trifl^ 2-karbonitrila • (S)-l-((2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-(terc-butoksi)-pirolidm-2-karbonil)pirolidm 2-karbonitrila • (S)-l-((2S,4R)-l-(4-(benziloksi)-3,5-dimetoksibenzoil)-4-acetoksipirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitrila * (S)-l-((2S)-l-(4-acetoksi-3,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitrila • (S)-l-((2S)-l-(4-benzoiloksi-3,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitrila • (S)-l-((2S)-l-(3,4-dibenzoiloksi-5-metoksi-benzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2- karbonitrila (S)-l-((2S)-l-(3,4-dibenzoiloki-5-metoksi-benzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2- karbonitrila • (S)-l-((2S)-l-(3-acetoksi-4,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2 - karbonitrila • (S)-l-((2S)-l-(3-pivaloiloksi-4,5-dimetoksibenzoil)-4,4-difluoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2-karbonitrila • (S)-1 -((S)-1 -(4-(benziloksi)benzoil)-4,4-difluoropirolidm-2-karbonil)pirolidin-2-karbonitrila • (S)-l-((S)-l-(3-(benziloksi)benzoil)-4,4-difluoropirolidm-2-karbonil)pirolidm-2-karbonitrila • (S)-1-((S)-1 -(2-(benziloksi)benzoil)-4,4-difluoropirolidm-2-karbonil)pirolidm-2-karbonitrila • (S)-l-((S)-l-(4-(benziloksi)-3-(trifluorometil)benzoil)-4,4-dilfuoropirolidin-2-karbonil) pirolidin-2- karbonitrila (S)-l-((S)-l-(4-(benziloksi)-3-fluorobenzoil)-4,4-difluoropirolidm-2-karbonil)pirolidm-2-karbonifr ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, enantiomera, dijastereoizomera, geometrijskog izomera ili solvata.

8.Postupak za dobijanje jedinjenja formule (1) kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, enantiomera, dijastereoizomera, geometrijskog izomera ili solvata koji obuhvata a) reakciju jedinjenja formule (IX): u kome su R1,R2, R<3>,R4,R<5>i R<6>kao što je iznad definisano u formuli (I), sa jedinjenjem formule (XI): da se dobije jedinjenje formule (XII); b) hidroliza jedinjenja formule (XII) da se dobije jedinjenje formule (XTV) i c) podvrgavanje jedinjenja formule (XTV) prema uslovima koji su u stanju da transformišu karboksamidnu grupu u nitrilnu grupu da bi se dobilo jedinjenje formule (I); gde se koraci b) i c) mogu izvoditi odvojeno ili reakcijom u jednoj posudi.

9. Postupak za dobijanje jedinjenja formule (I) kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, enantiomera, dijastereoizomera, geometrijskog izomera ili solvata, koji obuhvata reakciju jedinjenja formule (IX): u kojoj su R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>i R<6>kao što je iznad definisano u formuli (I), sa jedinjenjem formule (IV)

10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedno jedinjenje formule (I) kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, enantiomer, dijastereoizomer, geometrijski izomer ili solvat i farmaceutski prihvatljiv nosač, adjuvans ili vehikulum.

11. Jedinjenje formule (I) kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 za upotrebu kao lek.

12. Jedinjenje formule (I) kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi kognitivnog poremećaja.

13. Jedinjenje za upotrebu kao što je definisano u patentnom zahtevu 12, naznačeno time da kognitivni poremećaj predstavlja kognitivni poremećaj povezan sa bolešću izabranom iz grupe koju čine šizofrenija, bipolarni afektivni poremećaj. Alchajmerova bolest i Parkinsonova bolest.