ES2302473B1

ES2302473B1 - Agente terapeutico para el tratamiento del desorden afectivo bipolar en mamiferos.

Info

Publication number: ES2302473B1
Application number: ES200700020A
Authority: ES
Inventors: Ernest Giralt Lledo; Maria Teresa Tarrago Clua
Original assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB
Current assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2009-06-12
Anticipated expiration: 2026-12-22
Also published as: ES2302473A1; WO2008077978A1

Abstract

Agente terapéutico para el tratamiento del desorden afectivo bipolar en mamíferos.

Berberina (5,6-dihidro-9,10-dimetoxibenzo[g]-1,3-benzo-
dioxolo[5,6-a]quinolizinio), un alcaloide que se encuentra en la naturaleza, inhibe la actividad de la prolil oligopeptidasa (POP) de una manera dosis-dependiente. La berberina es capaz de alcanzar el Sistema Nervioso Central donde principalmente se localiza la POP. Los pacientes con desorden afectivo bipolar presentan niveles incrementados de actividad POP en suero. Por lo tanto, la berberina, en cualquiera de sus sales ácidas farmacéuticamente aceptables, es útil para el tratamiento del desor-
den afectivo bipolar en mamíferos, incluyendo humanos.

Description

Esta invención se relaciona con una segunda indicación médica de un agente terapéutico conocido.

Estado de la técnica anterior

El desorden afectivo bipolar, también conocido como enfermedad maníaco-depresiva, es una de las enfermedades mentales más comunes, severas y persistentes y tiene un elevado impacto social. El desorden afectivo bipolar se caracteriza por períodos de depresión honda, prolongada y profunda que se alternan con períodos de humor excesivamente elevado y/o irritable conocidos como manía. Los síntomas de la manía incluyen una disminución de la necesidad de dormir, habla presionada, incremento de la libido, conducta temeraria sin considerar las consecuencias, grandeza, y alteraciones severas de los pensamientos, los cuales pueden incluir psicosis. Entre estos altos y bajos, los pacientes normalmente experimentan períodos de funcionalidad elevada y pueden llevar una vida productiva.

Existen numerosos factores que contribuyen al desorden afectivo bipolar, incluyendo elementos genéticos, bioquímicos, psicodinámicos y ambientales. La etiología y la patofisiología del desorden afectivo bipolar no se han determinado, y no existen marcadores biológicos objetivos que correspondan definitivamente con el estado de la enfermedad. Sin embargo, estudios de gemelos, de familias y de adopciones indican contundentemente que el desorden afectivo bipolar tiene un componente genético. De hecho, la probabilidad de que parientes de primer grado de una persona con desorden afectivo bipolar desarrollen el desorden afectivo bipolar es siete veces más elevada que en el resto de la población.

Una aproximación para trazar la patofisiología del desorden afectivo bipolar implica estudiar los cambios en la expresión génica inducida en cerebros de roedores después de la administración de agentes farmacológicos usados para el tratamiento del desorden afectivo bipolar. Por ejemplo, se sabe que el litio y el ácido valproico, dos fármacos no relacionados químicamente y usados para el tratamiento del desorden afectivo bipolar, regulan la sobreexpresión de la proteína crioprotectora Bcl-2 en la corteza frontal y en el hipocampo de cerebros de rata. Estudios de neuroimagen en individuos con desorden afectivo bipolar u otros desórdenes del humor también muestran una pérdida de células o atrofia en las mismas regiones del cerebro. Otra causa sugerida del desorden afectivo bipolar es el daño en las células de la región crítica del cerebro que regula la emoción. De acuerdo con esta hipótesis, los estabilizadores del humor y los antidepresivos se cree que alteran el humor estimulando las vías de supervivencia celular e incrementando los niveles de factores neurotróficos para incrementar la plasticidad celular. La carbamazepina es un estabilizador del humor que ha demostrado ser útil en la prevención de los altos y bajos del desorden afectivo bipolar.

En estudios clínicos, los pacientes con desorden afectivo bipolar presentan niveles elevados de actividad de la prolil oligopeptidasa (POP; EC 3.4.21.26) en el suero. La POP es una serín proteasa citosólica que hidroliza péptidos que contengan prolina en el extremo carboxi-terminal de los residuos de prolina. Durante los últimos años, la POP ha ganado importancia como una diana para el tratamiento de esta enfermedad, especialmente debido a su implicación en el metabolismo del inositol-1,4,5-P3 (IP3). El IP3 es una molécula clave en la transducción de la señal de la cascada de los neuropéptidos. Mediante la unión a sus receptores específicos, los neuropéptidos inducen un aumento del IP3, el cual se une a su receptor en la membrana del retículo endoplasmático e induce la liberación de Ca2+, el cual se cree que juega un papel crucial en el aprendizaje y la memoria. Descubrimientos recientes han demostrado que la POP modula la concentración del IP3. Así, se sabe que una disrupción del gen de la POP en el eucariota inferior Dictyostelium discoideum induce resistencia al litio vía elevación del IP3, y también que la actividad proteolítica reducida de la POP es la responsable de la concentración elevada de IP3 en células de glioma humanas antisentido para la POP. Este efecto se observa también cuando estas células se tratan con inhibidores específicos de la POP. La vía de señalización del IP3 está involucrada en la acción terapéutica de varios fármacos estabilizadores del humor (litio, carbamazepina y ácido valproico) y defectos en los mecanismos que regulan la señalización del IP3 pueden provocar el desorden afectivo bipolar. Además, el fármaco estabilizador del humor que se utiliza habitualmente para el tratamiento del desorden afectivo bipolar, el ácido valproico, inhibe directamente la actividad de la POP recombinante (cf. L. Cheng et al., Mol. Cell. Neurosci. 2005, vol. 29, pp. 155-161). En resumen, hay pruebas sólidas que indican que los inhibidores de la POP son útiles en la prevención y/o el tratamiento del desorden afectivo bipolar en mamíferos. Así, el proporcionar nuevos inhibidores de la POP es interesante en la terapia de este trastorno o enfermedad.

Explicación de la invención

Berberina es el nombre usado comúnmente para el catión 5,6-dihidro-9,10-dimetoxibenzo[g]-1,3-benzod ioxolo[5,6-a]quinolizinio, teniendo el CAS RN 2086-83-1, y la fórmula (I) o tautómeros de la misma. Como es un catión, la berberina aislada está siempre en forma de sal ácida, p.ej. hidrocloruro, sulfato y sulfato ácido. Frecuentemente la sal cristaliza como un solvato, p.ej. como hidrato.

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Esta molécula tiene una gran variedad de efectos farmacológicos, incluyendo actividades antidiarreicas, antibacterianas, antimalaria, y anti-arrítmicas. La berberina es uno de los componentes principales de Huang Lian Jie Du Tang (Oren-gedoku-to), una prescripción tradicional de hierbas. Aparentemente, protege frente a la muerte neuronal y las alteraciones del aprendizaje y la memoria, inducidas por la isquemia cerebral en ratones. Sin embargo, no hay estudios que aclaren ni el efecto exacto de los componentes, ni de los mecanismos de acción del Huang Lian Jie Du Tang en el tratamiento de las enfermedades cerebrales.

Los inventores han encontrado sorprendentemente que el alcaloide berberina inhibe la actividad de la prolil oligopeptidasa (POP) de una manera dosis-dependiente. Tal y como se muestra en los ejemplos, la berberina no inhibe ni la proteasa HIV-1 ni la tripsina a la misma concentración de trabajo utilizada para inhibir a la POP. Estos resultados muestran la especificidad de la berberina frente a la POP, lo que indica que la berberina es útil para el tratamiento del desorden afectivo bipolar en mamíferos, incluyendo humanos.

Así, la presente invención se relaciona con el uso de sales farmacológicamente aceptables de la berberina de fórmula (I), o solvatos de la misma, incluyendo hidratos, para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del desorden afectivo bipolar en un mamífero, incluyendo un humano. Por lo tanto, la invención se relaciona con un método para el tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo un humano, padeciendo o siendo susceptible de padecer desorden afectivo bipolar. El método comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de una sal farmacológicamente aceptable de un catión de fórmula (I), o solvatos de la misma, incluyendo hidratos, junto con transportadores o diluyentes farmacológicamente aceptables. En una realización particular, el mamífero es un humano. En una realización preferida, la sal farmacológicamente aceptable es el hidrocloruro.

Desde tiempos remotos en medicina tradicional china la berberina ha sido administrada de manera segura en humanos. Recientemente se han publicado dos ensayos clínicos involucrando la administración de berberina a humanos. Uno estaba dirigido a la eficacia y la seguridad de la berberina para la insuficiencia cardíaca congestiva y mostró que la molécula aumentaba la calidad de vida y disminuía la mortalidad en pacientes (cf. X.-H. Zeng et al., Am. J. Cardiol. 2003, vol. 92, pp.173-176). En el segundo, la berberina fue administrada oralmente a 32 pacientes hipercolesterolémicos durante tres meses y demostró ser un fármaco que reduce el colesterol (cf. W. Kong et al., Nature Med. 2004, vol. 10, pp. 1344-1351). En ambos ensayos se encontró que la berberina es un compuesto seguro y no se observaron efectos secundarios. Como la berberina ya ha sido administrada en humanos con seguridad, la iniciación de ensayos clínicos en pacientes con desorden afectivo bipolar se puede acelerar. También se ha observado que la berberina cruza la barrera hematoencefálica y alcanza el hipocampo de la rata después de una administración intravenosa de un extracto de Rhizoma coptidis. Esta observación indica que la berberina puede tener un efecto directo en la neurona y puede acumularse en el hipocampo. La berberina también es capaz de alcanzar el Sistema Nervioso Central donde la POP está principalmente localizada.

Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud, se incorpora aquí como referencia. Los siguientes ejemplos y esquemas se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Exposición detallada de modos de realización

El cálculo de la curva de la IC50 de la berberina se realizó utilizando benziloxicarbonil glicina prolina 7-amino-4-metil cumarina (ZPG-AMC) como sustrato. Los resultados son la media \pm desviación estándar de tres experimentos independientes. Los resultados fueron ajustados a una curva logarítmica. I% significa la tasa de inhibición y [BBR] significa la concentración de cloruro de berberina en el ensayo.

Materiales

La ZGP-AMC se obtuvo de Bachem (Bubendorf, Switzerland). La tripsina bovina se compró a Roche (Mannheim, Germany). Otros reactivos se compraron a Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany). La berberina se compró a Sigma-Aldrich (Deisenholfen, Germany). La POP se obtuvo tal y como se describe en T. Tarrago et al., Chem. Biochem 2006, vol. 7, pp. 827-833.

Ensayos de actividad de la POP. Experimentos usando ZGP-AMC

La actividad de la POP se determinó siguiendo el método descrito por K. Toide (cf. K. Toide et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995, vol. 274, pp. 1370-1378). Las reacciones se realizaron en placas micro titer de 96 pocillos, las cuales permitieron la monitorización simultánea de múltiples reacciones. Para cada reacción, el tampón de actividad (131 \mul, 100 mM de Na/K tampón fosfato, pH 8.0) se preincubó durante 15 min a 37°C con la POP (7 nM) y con la correspondiente disolución de berberina (3 \mul). La disolución de partida de berberina se preparó en DMSO (100 mM), las diluciones se prepararon con DMSO. Se realizó un control con la misma concentración de DMSO. Después de la pre-incubación, se añadió ZGP-AMC (10 \mul, 3 mM en 40% de 1,4-dioxano) y la reacción se incubó durante 1 h a 37°C. La reacción se paró con acetato de sodio (150 \mul, 1 M, pH 4) y la formación de AMC se midió fluorimétricamente utilizando un lector de fluorescencia de placas Bio-Tek FL600. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron 360/40 y 485/20 nm, respectivamente. El valor de la IC_{50} se definió como la concentración de inhibidor que se requería para inhibir el 50% de la actividad de la POP. Los resultados experimentales se muestran en la
Tabla 1.

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TABLA 1 Porcentajes de inhibición de la POP mostrados por la berberina (BBR)

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Tal y como se muestra en la Tabla 1, la berberina inhibe a la POP de una manera dosis-dependiente. La concentración requerida para la mitad de la inhibición máxima (IC_{50}) fue 145 \pm 19 \muM.

Ensayo comparativo para determinar la especificidad de la berberina frente a la POP

Para determinar la especificidad de la berberina frente a la POP, se realizaron los siguientes ensayos de actividad utilizando otras proteasas.

(a) Ensayo de inhibición de la tripsina

El ensayo de inhibición de la tripsina se realizó en placas micro titer de 96 pocillos. La tripsina bovina (10 \mul de una disolución de partida de berberina a 10 ng/\mul) se pre-incubó durante 15 min a 37°C con la correspondiente disolución de berberina (3 \mul) en tampón de actividad (125 \mul, 20 mM de Tris-HCl pH 8.0). La disolución de partida de berberina se preparó en DMSO (100 mM), las diluciones se prepararon a partir de la disolución de partida de berberina con DMSO y se añadieron a las concentraciones finales de 10 \muM, 40 \muM, 100 \muM, 150 \muM, 200 \muM y 2000 \muM. Después de la pre-incubación, se añadió Bz-Arg-AMC-HCl (10 \mul, 3 mM en 40% de 1,4-dioxano) ala reacción y se incubó durante 1 h a 37°C. La reacción se paró con acetato de sodio (150 \mul, 1M, pH 4) y la formación de AMC se midió fluorimétricamente utilizando un lector de placas Bio-Tek FL600 (Bio-Tek Instruments, Vermont, USA). Los resultados se muestran en la Tabla 2, e indican que la berberina no inhibe la tripsina a las mismas concentraciones de trabajo utilizadas para inhibir la POP.

TABLA 2 Porcentajes de la inhibición de la tripsina mostrados por la berberina a diferentes concentraciones

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(b) Ensayo comparativo de la inhibición de la proteasa HIV-1 y la POP por parte de un extracto de Rhizoma coptidis

Este ensayo se realizó con extracto de Rhizoma coptidis, que contiene berberina. La actividad inhibitoria de este extracto se evaluó frente la POP y la HIV-1 proteasa, una aspartil proteasa.

Inhibición de la POP por Rhizoma coptidis : El ensayo enzimático se realizó con 700 \mul de volumen de muestra en tubos Eppendorf a 30°C. La mezcla de reacción contenía 7 nM de hPOP, 100 \muM de sustrato (ZGPF-CF3) y tampón fosfato Na/K 100 mM pH 8 preparado con D_{2}O. La concentración final del extracto de Rhizoma coptidis en el tampón de ensayo era de 100 \mug/ml. La reacción se paró después de 1 h mediante la adición de 5 \mul de HCl 37%. Los espectros de RMN de ^{19}F se registraron a 25°C con un espectrómetro de RMN Varian 400 operando a una frecuencia Larmor de ^{19}F de 376.5 MHz y utilizando una sonda de ^{19}F de 5 mm. Los datos se adquirieron mediante desacoplamiento de proton con un tiempo de adquisición de 0.6 segundos, y un tiempo de espera de 1.5 segundos con un total de 64 escans.

Se lavaron 30 g de planta de Rhizoma coptidis seca con H_{2}O doblemente destilada (dd) y se molieron. El polvo resultante se extrajo con 100 mL H_{2}O dd bajo reflujo durante 5 h usando un aparato Soxhlet. El extracto acuoso fue entonces liofilizado bajo vacío. Se evaluó la actividad inhibitoria de la POP del extracto acuoso de Rhizoma coptidis. La concentración final del extracto en el tampón del ensayo fue de 100 \mug/mL.

Ensayo de inhibición de la proteasa del HIV-1 por un extracto de Rhizoma, coptidis : El ensayo enzimático de realizó con 700 \muL de volumen a 30°C. El tampón de reacción contenía 30 nM de proteasa HIV-1, 200 \muM de sustrato (SQNPF-CF3), 50 mM ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico, 200 mM NaCl, y 1 mM EDTA, pH 6.0. El sustrato se disolvió en DMSO hexadeuterado antes de añadir el tampón. La concentración final del extracto de Rhizoma coptidis en el ensayo de actividad fue de 100 \mug/ml. La reacción se paró después de 30 min mediante la adición de 20 pL de HCl. El resultado se analizó mediante RMN de ^{19}F. El espectro de RMN de ^{19}F se obtuvo a 25°C con un espectrómetro de RMN Varian 400. Se lavaron 30 g de planta de Rhizoma coptidis seca con H_{2}O doblemente destilada y se molieron. El polvo resultante se extrajo con 100 mL dd H_{2}O bajo reflujo durante 5 h usando un aparato Soxhlet. El extracto acuoso fue entonces liofilizado bajo vacío. El extracto acuoso de Rhizoma coptidis se evaluó por su actividad inhibitoria de la proteasa HIV-1. La concentración final del extracto en el tampón de ensayo fue de 100 \mug/mL.

El extracto de Rhizoma coptidis, que contiene berberina, no inhibe la proteasa HIV-1 a las mismas concentraciones de trabajo utilizadas para inhibir la POP, mientras que muestra un 100% de inhibición de la POP.

Claims

1. Uso de una sal farmacológicamente aceptable de la berberina, o un solvato de la misma, incluyendo un hidrato, para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del desorden afectivo bipolar en un mamífero.

2. Uso según la reivindicación 1, donde el mamífero es un humano.

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la sal farmacéuticamente aceptable es el hidrocloruro.