WO2011134098A1 - Método para inhibir la agregación de proteína tau y tratamiento de la enfermedad de alzheimer con un compuesto derivado de quinolina. - Google Patents

Método para inhibir la agregación de proteína tau y tratamiento de la enfermedad de alzheimer con un compuesto derivado de quinolina. Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to specific quinoline molecules, polymerized tau binding ligands, as potential blockers of tau aggregation before the formation of NFTs.
  • Said quinolines preferably have an amino group or a methyl group at the meta position of the nitrogenous ring, and which show the highest disaggregation activity of tau polymers, and are therefore useful in the treatment of Alzheimer's disease.
  • the present invention provides quinoline compounds that inhibit formation and at the same time disaggregate NFTs, and therefore, would be useful in the treatment and prophylaxis of Alzheimer's disease.
  • AD Alzheimer's Disease
  • MIRAGE Study Group Risk of dementia among white and African American relatives of patients with Alzheimer disease.
  • AD Alzheimer's disease and mild cognitive impairment. Current Alzheimer Research. 1: 307-314; Maccioni RB Farias GA Red LE, Sekler Kuljis MA and RO (2008) What have we Learned from the tau hypothesis in:... Hypotheses and Research Milestones in Alzheimer 's Disease (RB & G. Perry Maccioni, eds.) Springer. -Verlag, New York-Heidelberg). AD is also one of the biggest public health problems because it is one of the diseases that has the most economic impact on modern society (Wimp A., Winblad B. (2001).
  • Alzheimer disease and ts Health economical aspects of Alzheimer disease and ts) treatment.
  • AD Alzheimer's disease
  • This consists of histologically analyzing brain tissue sections that must have a sufficient number of PS and NFTs coexisting in certain areas of the brain such as the hippocampus and Meynert nuclei.
  • the diagnosis is based on clinical criteria and neuropsychological examinations, identification of typical symptoms of the disease and the exclusion of other causes of dementia (Dubois B., Feldman H., Jacova C. (2007). Research criteria for the diagnosis of Alzheimer's disease : revising the NINCDS- ADRDA criteria. Lancet Neurol. 6: 734-46). In this sense it should be noted that the lack of A highly reliable biomarker of certainty has delayed investigations of AD on the one hand, and made the early diagnosis of this pathology more difficult.
  • AD is characterized by progressive deterioration and a decrease in cognitive functions, such as memory language and visual space orientation.
  • AD is also characterized by a gradual loss of memory, decreased ability to perform routine tasks, spatial and temporal disorientation, learning difficulties, loss of linguistic ability, deterioration of reasoning, rapid changes in state of mood and personality disorders (Katzman R. (2004). Luigi Amaducci memorial award winner's paper 2003. A neurologist's view of Alzheimer's disease and dementia. Int Psychogeriatr. 16 (3): 259-73).
  • AD Alzheimer's disease
  • the PS are mainly formed by the variant ( ⁇ (1-42) (Mattson M. (2004). Pathways towards and away from Alzheimer disease. Nature. 430 (7000): 631-9).
  • NFTs they consist of a protein associated with the neuronal cytoskeleton called tau, which is hyperphosphorylated in the brains of patients with AD. (Kurt MA, Davies DC, Kidd M. (1997). Paired helical filament morphology var ⁇ es with intracellular location in Alzheimer's disease brain. Neuros Lett.
  • AD neurodegenerative disease
  • PS senile plaques
  • NFTs and senile plaques are not the triggering events of its pathogenesis, but the late result of processes that occur over many years.
  • Different theories about AD have been postulated, but recently the unifying hypothesis of AD has found greater acceptance (Fernández JA, Rojo L, Kuljis R. and Maccioni RB (2008).
  • the damage signifies hypothesis of Alzheimer's disease pathogenesis", J. Alzheimer Dis. 14: 329-33; Maccioni RB, Rojo L, Fernández J. and Kuljis RO (2008).
  • Neuroimmunomodulation in Alzheimer ' s disease Ann NY Acad.
  • these signals could trigger alarm mechanisms in the innate immunity system, resulting in an increase in NFK-B levels, a transcription factor that would increase the expression of proinflammatory cytokine genes (TNF-a, IL- ⁇ ⁇ , IL-6) released by microglia and promoting erroneous signaling cascades in the affected neurons (Rojo LE, Fernández JA, Maccioni AA, Jiménez JM, Maccioni RB (2008). Neuroinflammation: implications for the pathogenesis and molecular diagnosis of Alzheimer's disease Arch. Med. Res. 39 (1): 1-16).
  • the levels of these cytokines are increased in the spinal fluid (CSF).
  • Senile plaques are structures located in the extracellular space where nerve endings move and correspond to deposits of amorphous fibrils and aggregates of ⁇ -amyloid ( ⁇ ) (Liu WK, Ksiezak-Reding H., Yen SH (1991) Abnormal tau proteins from Alzheimer's disease brains. Purification and amino acid analysis. J Biol Chem. 266 (32): 21723-7). These are annular conglomerates of degenerated neuronal bodies and extensions around a central deposit of the ⁇ peptide, which has a variable length of 39-43 amino acids.
  • This peptide is derived from the proteolytic processing of the amyloid precursor protein (APP) (Glenner GG, Wong CW, Quaranta V., Eanes ED (1984).
  • APP amyloid precursor protein
  • the APP can be fragmented by joint action of ⁇ -secretase, followed by the action of ⁇ -secretase, generating different soluble fragments of APP.
  • ⁇ -secretase acts on the APP first followed by the action of the ⁇ -secretase, the fragments of ⁇ -1-40 and ⁇ 1-42 are released, the amyloidogenic pathway being launched, this being The last fragment has the greatest capacity for self-aggregation (Hardy J. (1997). Amyloid, the presenilins and Alzheimer's disease. Trends Neurosci. 20 (4): 154-9).
  • ⁇ extracellular plaques is a central fact in the neuropathology of AD.
  • the ⁇ -amyloid theory (Cummings JL (2004). Alzheimer's disease. N Engl J Med. 351 (1): 56-67), is based on the fact that the aggregates of agreg ⁇ are the triggering factor of a multitude of neurotoxic pathways between which may include exitotoxicity, alterations in calcium homeostasis, mass production of free radicals and neuroinflammatory processes.
  • amyloid components is common in normal aging, and thus ⁇ possibly precedes the formation of NFTs; but the presence of both key cellular events in AD is necessary, to lead in a complementary way to the loss of the activity of affected neurons (Maccioni, RB, Barbeito L., and Mu ⁇ oz JP (2001). The molecular basis of Alzheimer 's disease and other neurodegenerative disorders. Arch. Medical Research. 32: 367-381).
  • the tau protein is a protein that is normally associated with microtubules and plays an important role in the assembly of these, such as the stabilization of microtubules against dynamic instability and the union of microtubules with other cytoskeleton filaments (Maccioni RB and Cambiazo V. (1995). Role of microtubule-associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiol Rev. 75 (4): 835-864; Maccioni, RB, Barbeito L, and Mu ⁇ oz JP (2001). bases of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Arch. Medical Research. 32: 367-381).
  • the tau protein belongs to the family of MAPs or Microtubule Associated Proteins.
  • the N-terminal region of the tau protein is of variable length, depending on whether or not the isoform is present, exons 2 and / or 3. This region is known as the projection domain, because once the tau protein interacts with the microtubules, it is projected from them to the outside. Through this projection tau is able to interact with other elements of the cytoskeleton such as actin or spectrin filaments (Cross D., Vial C. and Maccioni RB (1993). A iau-like protein interacts with stress fibers and microtubules inhuman and rodent cell lines J. Cell Sci.
  • a discrete repeated sequence defines a tubulin binding domain on microtubule-associated protein tau Arch Biochem Biophys. 275 (2): 568-79).
  • This binding domain (Maccioni RB, Rivas CI, Vera JC (1988).
  • Differential interaction of synthetic peptides from the carboxy-terminal regulatory domain of tubulin with microtubule-associated proteins. EMBO J. 7 (7): 1957-63) is the person in charge of the assembly and stabilization of the microtubules (Mandelkow EM, Biernat J., Drewes G., Gustke N., Trinczek B., Mandelkow E. (1995). Tau domains, phosphorylation, and interactions with microtubules. Neurobiol Aging.
  • tau protein Although the tau protein is capable of undergoing a series of post-translational modifications (Pevalova M., Filipcik P., Novak M., Avila J., Iqbal K. (2006). Post-translational modifications of tau protein. Bratisl Lek Listy. 107 (9-10): 346-53), this phosphorylation plays a particularly important role in the regulation of its activity.
  • the major isoform of tau has 79 serines or threonines that act as potential phosphorylation sites (Lovestone S., Reynolds CH (1997). The phosphorylation of tau: a critical stage in neurodevelopment and neurodegenerative process. Neuroso. 78: 309-324 ).
  • important changes in this regulation can modify its ability to bind to microtubules or other elements of the cytoskeleton, or contribute to generating pathological conditions such as tau hyperphosphorylations, and self-aggregation that make it a protein with neurotoxic actions, such as observed in the degeneration of the Alzheimer type (Sánchez MP, ⁇ lvarez-Tallada V., ⁇ vila J. (2001).
  • the tau protein in neurodegenerative diseases. Taupat ⁇ as. Revista de Neurolog ⁇ a. 33 (2): 169-177).
  • the tau protein is resistant to temperature and acidic conditions, this allows the process of separation of MAPs and other thermolabile proteins such as tubulin to be carried out.
  • tau begins to irreversibly hyperphosphorylate at multiple sites (Garc ⁇ a T., Jay D. Phosphorylation of tau and Alzheimer disease. (2004). Gad Med Mex. 3: 329-33, specifically table 1) , and is integrated into filamentous anomalous structures called paired helical filaments (PHFs), to finally give rise to NFTs, thus losing their key physiological functions such as the definition of neuronal polarity and the control of microtubule-mediated axonal transport (Maccioni RB and Cambiazo V. (1995) Role of microtubule-associated proteins in the control of microtubule assembly Physiol Rev. 75 (4): 835-864).
  • PHFs paired helical filaments
  • the hyperphosphorylation of tau is the result of the imbalance of the action of different kinases and phosphatases, resulting in a hyperphosphorylated protein that has compromised its normal function and results in neuronal damage (Buée L, Bassiére T., Buée-Scherrer V. (2000). Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res. 33: 95-130).
  • ⁇ oligomers would be, among others, a trigger factor for changes that lead to altering neuronal signaling mechanisms (Roher AE, Chaney MO, Kuo YM, Webster SD, Stine WB, Haverkamp LJ , Woods AS, Cotter RJ, Tuohy JM, Krafft GA, Bonnell BS, Emmerling MR (1996) .orphology and toxicity of Abeta- (1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. J. Biol.
  • the cytoskeleton of eukaryotic cells is the cellular structure responsible for neuronal morphology. It is composed of microtubules, actin microfilaments and intermediate filaments (Maccioni RB and Cambiazo V. (1995). Role of microtubule-associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiol Rev. 75 (4): 835-864; ⁇ vila J. , Lucas JJ, Pérez M. and Hernández F. (2004). Role of Tau Protein Both Physiological and Pathological Conditions. Rev. Physiol. 84: 361-384).
  • Microtubules are essential components of the cytoskeleton, responsible for the formation and maintenance of axons, dendrites and specific contacts.
  • MAP proteins contribute to the dynamism and stability of microtubules. Among them is the MAP1A, MAP1 B, MAP2 protein and finally the tau protein (Maccioni RB and Cambiazo V. (1995). Role of microtubule-associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiol Rev. 75 (4): 835- 864; ⁇ vila J., Lucas JJ, Pérez M. and Hernández F. (2004). Role of Tau Protein Both Physiological and Pathological Conditions. Rev. Physiol.
  • tau protein is important in the maintenance of neuron polarity! and in the stabilization of a certain architecture in the differentiated neuron.
  • tau activity is key to the morphogenesis of growth cones in brain neurons, whose structure also involves local actin filament networks (Paglini G., Pigino G., Kunda P., Morfini G., Maccioni R., Quiroga S., Ferreira A., Cáceres A. (1998). Evidence for the participation of the neuron-specific CDK5 activator P35 during laminin-enhanced axonal growth. J. Neurosci. 18 (23): 9858-9869).
  • Quinolines are heterocyclic aromatic organic compounds, which consist of 2 bonded benzene rings, where it is replaced by an atom of N. Quinolines They have applications both industrially and clinically. It should be noted that mainly at the clinical level some quinoline derivatives have been found that are active as anesthetic, antitumor and antimalarial drugs (Campbell SF, Hardstone JD, Palmer MJ (1988). 2, 4-Diamino-6,7-dimethoxyquinoline derivatives as alpha 1- adrenoceptor antagonists and antihypertensive agents. J Med Chem. 31 (5): 1031-5).
  • quinine a substance used as an antipyretic for hundreds of years.
  • Quinine has drawbacks associated with its toxicity and its administration, so related substances such as chloroquine have been synthesized, which is a quinoline that was developed during World War II and is now the weapon principal used against human malaria (Ridley R. (2002). Medical need, scientific opportunity and the drive for antimalarial drugs. Nature 415: 686-93).
  • antimalarials of the quinoline type are classified as "erythrocyte schizonticides", which act in the asexual erythrocyte stages of the parasites interrupting erythrocyte schizogonia, ending thus with the infection and finally eliminating parasites from the body (Baird JK, Basri H., Subianto B., Fryauff DJ, McEIroy PD, Leksana B., Richie TL, Masbar S., Wignall FS, Hoffman SL (1995). of chloroquine resistant Plasmodium vivax with chloroquine and primaquine of halofantrine. J Infeci Dis. 171: 1678-82). Due to these uses of quinolines, preclinical and clinical phase studies have been accepted, so their use in humans is approved.
  • WO 2008/049047 discloses quinoline derivatives useful in the treatment of diseases related to the liver X receptor, such as acute coronary syndrome, Alzheimer's, diabetes and atherosclerosis.
  • the radical R1 of said document always corresponds to an alkyl derivative, however in the present invention the corresponding radical R2 is a phenyl radical.
  • EP 1574500 (A1) discloses structurally different quinoline derivatives to the quinoline compounds of the present invention, which can also be used for diagnostic images of diseases in which tau protein accumulates and compositions and kits comprising them. In addition, it teaches a method for staining neurofibrillar tangles in brain samples and a pharmaceutical composition for the treatment and / or prophylaxis of a disease in which the beta sheet structure is the cause or possible cause of the disease.
  • WO 2009/097401 and WO 2009/097278 disclose compounds derived from 2-amino-quinoline and 6-substituted-thio-2-amino-quinoline, structurally different from the quinoline compounds of the present invention, those that inhibit ⁇ - secretase, known as the ⁇ -site amyloid cleavage enzyme, BACE, BACE 1, Asp2 or mempasin2, pharmaceutical compositions containing them and their use in the treatment of Alzheimer's disease, senility, dementia and mild cognitive deterioration.
  • ⁇ -secretase known as the ⁇ -site amyloid cleavage enzyme, BACE, BACE 1, Asp2 or mempasin2
  • WO 2009/133692 discloses quinoline-derived compounds, structurally different from the quinoline compounds of the present invention, useful in the treatment and / or prophylaxis of atherosclerosis such as atherosclerosis and arteriosclerosis associated with diabetes, dyslipidemia, hypercholesterolemia, lipid-related diseases , inflammatory diseases induced by an inflammatory cytokine, skin diseases such as allergic skin diseases, diabetes or Alzheimer's disease, senility, dementia and mild cognitive deterioration.
  • atherosclerosis such as atherosclerosis and arteriosclerosis associated with diabetes, dyslipidemia, hypercholesterolemia, lipid-related diseases , inflammatory diseases induced by an inflammatory cytokine, skin diseases such as allergic skin diseases, diabetes or Alzheimer's disease, senility, dementia and mild cognitive deterioration.
  • the present invention provides quinoline compounds that inhibit formation and at the same time disaggregate NFTs, and therefore, would be useful in the treatment and prophylaxis of Alzheimer's disease.
  • Fig. 1 Illustrates the tau purification procedure developed in the invention. Particularly it is a synthesis of the main stages in the purification, the precipitation of the supernatant after the 3rd centrifugation is carried out with ammonium sulfate at 75% saturation.
  • Fig. 2 Illustrates the structure of astemizole, benzimidazole used in binding and displacement assays and its 3 H-AST radioactive isotope, to evaluate the interaction of quinolines with the tau protein system.
  • Fig. 3 Schematic illustration of the procedure used for Scatchard assays and displacement of 3 H-AST with quinolines in vitro, where the tubes are incubated for 4 hours at 25 ° C with slight agitation, drying is carried out on filter paper and it is added in vials with 1 ml_ of scintillation liquid, and the last incubation is performed for 10 minutes in the dark.
  • Fig. 4a Illustrates the fluorescence pattern for THQ 55 (see table 1 below) excited at 290 nm and emission at 380 and 480 nm with a 2.0 slit.
  • Fig. 4b Illustrates the fluorescence pattern for THQ 55 (see table 1 below) excited at 290 nm and emission at 380 and 480 nm, with a "slit" of 5.0.
  • Fig. 5 Illustrates the "Dotblots" of bovine brain tau. Characterization of the purity of the tau protein. The upper part of the figure corresponds to the supernatant obtained from the precipitation with ammonium sulfate and the lower part to the precipitate of the precipitation with ammonium sulfate.
  • Fig. 6 Illustrates the purification procedure of tau protein.
  • Fig. 7 Illustrates studies of the morphology of tau filaments in the presence and absence of quinolines.
  • D Electron micrograph of the incubation of tau with heparin and THQ 4S (see table 1 below).
  • Fig. 8 Illustrates that quinolines change the structure of the filaments product of the tau aggregate.
  • Fig. 9 Illustrates the aggregation of the amyloid peptide in the presence and absence of quinolines.
  • Fig. 10 Illustrates that quinolines slightly change the structure of the filaments of ⁇ 1- 42.
  • Fig. 11 Illustrates the turbidimetric study for the aggregation of tau in the absence and presence of quinolines at different concentrations.
  • the curves are colored for different situations: control + (green); control - (red); sample under study plus THQ55 (see table 1 below) at the concentration of 1.0 ⁇ (q1 in yellow); sample under study plus THQ55 (see table 1 below) at the concentration of 10 ⁇ (q10 in blue); sample of study plus THQ55 (see table 1 below) at the concentration of 50 ⁇ (q50 in light blue); shows in study more Astemizole at the concentration of 10 ⁇ (Ast 10 in coffee).
  • Fig. 13 Illustrates the structure of the MN423 monoclonal antibody (light blue ribbon) with the structural core of the tau C-terminal involved in the assembly of the PHFs, corresponding to the pentapeptide 387 DHGAE 391 (colored spheres).
  • Figure 14 Illustrates the predictive bioinformatic analysis for 6 of the preferential configurations of the interaction of a pentapeptide corresponding to the C-terminal of PHFtau, with the THQ 4S (see table 1 below), modeled by the Autodock ® program.
  • the white arrows indicate the position of the quinoline N.
  • the inventors directed a search for ligand molecules binding to the tau protein, and especially to the polymerized tau of the Alzheimer type, as potential blockers of hyperphosphorylated tau aggregation before the formation of the NFTs, assessing the ability of a family of quinolines of clinical relevance and its derivatives (THQs) (see Table 1 below), to inhibit the aggregation of tau protein in the form of PHFs produced in vitro, in a possible therapeutic route of AD.
  • THQs quinolines of clinical relevance and its derivatives
  • cerebral tau and tau protein from paired helical filaments were isolated and characterized from human brains and bovine brain tau which were induced to polymerize with heparin (Mandelkow EM, andelkow E (1993) Tau as a marker for Alzheimer's disease Trends Biochem Sci. 18 (12): 480-3):
  • the octanol / water partition coefficient was determined and experimentally correlated liposolubility with the ability of the quinolines to cross the blood-brain barrier (BHE);
  • Helical filaments of the tau protein were produced and characterized from the isolated and recombinant protein.
  • amyloid aggregates were produced and characterized, from the recombinant peptide ⁇ 1-42;
  • Human PHFs were obtained, which were purified from human brains through affinity columns.
  • Quinoline samples were prepared at a concentration of 1.0 mg / mL in methanol and serial dilutions were made at different concentrations, at which their fluorescence was determined with an excitation wavelength at 290 nm and one emission between 260 and 500 nm.
  • the partition coefficient (log P 0 / w) was determined as described by Takacs-Novak K., Nagy P., Jozan M., Orfi L., Dunn WJ 3rd, Szasz G. (1992). Relationship between partitioning properties and (calculated) molecular surface. SPR investigation of midazoquinazoloneb derivatives. Pharm Hung Act. 62 (1 -2): 55-64, in which 2 phases are used, an aqueous phase corresponding to a PBS buffer solution 0.1X pH 7.4, which is saturated with an n-octanol solution and corresponds to the organic phase.
  • Equation 2 determines the concentrations for initial THQ:
  • bovine brains and / or post-mortem human brains stored at -80 ° C were cleaned of meninges, blood vessels and superficial blood; and are processed according to the protocol of repetitive cycles of assembly and disassembly, dependent on temperature.
  • the homogenate was centrifuged at 42,000g (19,450 rpm using the T647.5 rotor) for 30 min. at 4 ° C; stage in which the supernatant is collected. Then to this supernatant, the necessary components for the polymerization of MT (solution B) were added. This solution was incubated for 1 h at 37 ° C with mild agitation. The most viscous liquid obtained is divided into the centrifuge tubes. Subsequently, the microtubules formed were rescued from the pellet formed by centrifugation at 42,000g for 30 min at 37 ° C. This microtubule pellet was subsequently treated with the microtubule homogenization buffer (solution C).
  • the volume to be prepared is approximately 60 mL (3 volumes of solution for each volume of pellet).
  • Protein concentration was determined by the Bradford method (Bradford MM (1976). A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Princie of Protein Dye Binding. Analytical Biochem. 72: 248-254) using albumin of bovine serum for the calibration curve.
  • the following primary antibodies were used for immunodetection: to study the phosphorylation states of the tau protein, the AT8 antibody that recognizes the phosphorylated epitopes Ser 02 and Thr 205 in the tau protein was used; Tau 5 that recognizes epitopes, of the tau protein, independent of its phosphorylation status; and RBX anti ⁇ -amyloid 1-42, which recognizes the amyloid peptide 42 amino acids in length. All these antibodies were used according to the manufacturers instructions.
  • the aggregates thus formed were visualized through electron microscopy by negative staining with 2% uranyl acetate. Finally, a count was made of the number of filaments per field, and the measurement of their length and width, observing an average of 25 fields.
  • TAU PROTEIN AGGREGATION STUDIES As a positive control, a solution containing tau and heparin (without quinoline) was used, and as a negative control tau and water; while the samples under study contained tau, heparin and the quinolines THQ 4S or THQ 55 (see table 1 above) at concentrations of 10 ⁇ . The "x" indicates presence and the "-" absence.
  • the ⁇ 1-42 peptide was dissolved in sterile and filtered 1X pH 7.4 buffer, obtaining a final concentration solution 1.0 mg / mL in a final volume of 100 pL. In order to have a comparison parameter with the tau protein, the ⁇ 1- 42 peptide was induced to polymerize in the form of r ⁇ fibrils and aggregates.
  • the aggregates thus formed were visualized through electron microscopy, by negative staining with 2% uranyl acetate. Finally, a count of fibers per field and length measurement of these, observing an average of 25 fields.
  • the tau protein had a treatment prior to this test, where it was incubated at 37 ° C under mild agitation for 7 days. Subsequently the Tau protein and 3 H-AST were incubated for 4 h at 25 ° C with mild agitation. This solution was then filtered under vacuum for 10 minutes and the filter papers are dried at room temperature, and transferred to a vial with 1.0 mL of scintillation liquid. This is left in darkness and finally the counts per minute (cpm) were measured in a scintillation counter device.
  • the cold ligand (THQ 4S and THQ55 (see table 1 above, separately) was used in varying concentrations between 10 nM and 10 ⁇ .
  • 3 H-AST and tau protein were used in fixed concentrations of 52 nM and 230 nM respectively.
  • DESVEST OBSERVATIONS starts from the hypothesis that the arguments represent the sample of a population. If your data represents the total population, DESVESTP is used to calculate the standard deviation.
  • quinoline THQ 55 (see table 1 above), was the compound that yielded the best results.
  • This quinoline was at a concentration of 1.0 mg / mL and was excited at ⁇ 290 nm, showed an emission at ⁇ 350 and 480 nm.
  • the Fluorescence intensity was 80 and 30 of a maximum of 1000 in the first test, and 30 and 478 of a maximum of 1000, in the latter case increasing the "slip'O light opening of the equipment. Fluorescence tests were performed also for the quinolines THQ 4S and THS 12S (see table 1 above) but the fluorescence intensity was very low (less than 10 with a maximum of 1000) even when increasing the opening of the "slip".
  • FIGS 4a) and 4b) show the results obtained in the determination of fluorescence for THQ 55 (see table 1 above).
  • the first step was to determine the liposolubility expressed as Log P.
  • the physicochemical and pharmacokinetic characteristics of these drugs (Table 6) indicate that their liposolubility (expressed as Log P) is relatively high.
  • Inhibition of tau protein aggregation is an important aspect of a potential therapeutic compound for the treatment of AD.
  • the quinoline THQ 55 (see table 1 above) was used for this purpose. This drug showed a great capacity to inhibit tau aggregation, which was verified by measuring Absorbance at ⁇ 340 ( Figure 11), in where it is observed that at very low concentrations the drug has a potential effect on aggregation.
  • tau is a very fibrous protein with a large domain structured as a statistical ball ("random coiled") (Von Bergen M., Barghorn S., Biernat J., Mandelkow EM, Mandelkow E. (2005). Tau aggregation is driven by a transition from random coil to beta sheet structure Biochimica et Biophysica Acta. 1739: 158-166) a complete crystallization of this protein has not been achieved, only segments of it.Tau is not a protein with a regular structure in its entirety Therefore, to date the crystal structure of the whole protein is not known and only the study by Novak M., Wischik CM, Edwards P., Pannell R., Milstein C. (1989).
  • Table 10 summarizes the results obtained from the bioinformatic "docking" analysis for THQ 4S (see table 1 above) and the pronase resistant fragment PHF-teu- 387 DHGAE 391 of which its crystalline structure is well known.
  • the binding energies described in this table are compared with those obtained by the same program for drugs with high affinity such as the metabotropic glutamate receptor (mGluR) (Yanamala N., Tirupula KC and Klein-Seetharaman J. (2008) Preferential binding of allosteric modulators to active and inactive conformational states of metabotropic glutamate receptors.
  • mGluR metabotropic glutamate receptor
  • binding energies appear to be more thermodynamically favorable if they are related in terms of free energy (AG), indicating that this quinoline is akin to fragment 387 DHGAE 391 of tau, suggesting that this fragment might be involved in its union and antiaggregant activity.
  • FLUORESCENCE TESTS This study was aimed at determining the affinity of quinolines for the tau protein and its aggregates and corroborate what was previously stated by other authors (Rojo L, Avila M., Chandia M., and Maccioni RB (2007). 18 F Lansoprazole as PET Radiotracer Chemical and biological studies towards the development of a New PET Radiotracer. International Conference on Clinical PET and Molecular Nuclear Medicine 10-14 November.
  • these compounds must meet certain requirements to be of interest in a potential pharmacological application at the neural level: (1) They must be highly lipophilic and have the ability to cross the blood brain barrier (BHE); (2) Act at low concentration and remain short in brain tissue; (3) Interact with the tau protein and its aggregates; (4) Have a very low nonspecific union.
  • BHE blood brain barrier
  • these drugs could have a direct effect on brain regions in people suffering from AD.
  • the quinolines described here fully comply with these requirements, namely they have the property of being highly lipophilic, interact with tau and exert their action in blocking their self-aggregation in pathological polymers, such as PHFs. We believe that this is a remarkable finding, since until today no molecules have been described that meet these properties.
  • the permeability of the neuronal membrane also represents an important factor for obtaining images of intracellular aggregates of tau (Small GW, Agdeppa ED, Kepe V., Satyamurthy N., Huang SC, Barrio IR (2002). In vivo brain imaging of tangle burden in humans J. Mol. Neurosci. 19: 323-327), where the high liposolubility of these compounds is an advantage.
  • tau protein As for the purification of the tau protein, this protein is resistant to acidic conditions, so tau was usually purified by precipitation with perchloric acid (Far ⁇ as GA, Vial C, and Maccioni RB (1992). Specific macromolecular interactions between tau and the microtubule system, Molecule and Cellular Biochemistry 112: 81-88) in one of the last steps of purification. Subsequently, based on the disclosures of Farias GA, Mu ⁇ oz JP, Garrido J., Maccioni RB Tubulin, actin, and tau protein interactions and the study of their macromolecular assemblies. (2002) J. Cell Biochem.
  • PROTEIN AGGREGATION STUDIES One of the most important trials was to visualize how these drugs block polymerization of the tau protein. The results show a clear inhibition of the tau protein in its aggregate form of PHFs, because the incubation of the quinolines with the protein decreased both the number of filaments per field, and the length and width of these filamentous structures.
  • the same assay was performed with the human recombinant tau protein, obtaining the same results, but in this protein the number of aggregates was always lower, because the recombinant protein is not phosphorylated and the number of PHFs when incubated With heparin is decreased.
  • the quinolines decreased 5 times the length and 10 times the width of the tau filaments formed in vitro.
  • this sequence is in an area that is highly conserved within tau, corresponding to the repetitive regions of the C-terminal.
  • the "docking" studies were carried out, which represent the first approach based on mathematical models between the interaction of quinolines and tau. Through these tests it was determined that these quinolines, specifically THQ 4S (see table 1 above) have docking energies favorable for the interaction between these compounds and a fragment of the tau protein. THQ 4S (see table 1 above) was chosen for this test due to the advantages of its molecular properties and being more lipophilic compared to THQ 55 (see table 1 above).
  • THQ 55 (see table 1 above) with this tau fragment is an aspect that remains to be investigated, although possibly the interaction energies of THQ 55 (see table 1 above) are more negative than those of THQ 4S (see table 1 above), because THQ 55 (see table 1 above) presents electron donor groups in the substituents, which could influence the resonance of the quinoline aromatic rings and delocalize the electrons leaving the N more negative and favoring the interaction with a cationic protein such as tau.
  • the objectives of this invention were mainly focused on the search for polymerized tau binding ligand molecules, as potential blockers of tau aggregation before the formation of NFTs. Fine microscopy studies, sedimentation and turbidimetric tests allowed directly checking the ability of these drugs to inhibit tau aggregation.
  • these molecules have a relatively high fat solubility, and have similar molecular properties to other drugs that cross the BHE, whereby they can eventually exert an action at the brain level. From these results it is concluded that these quinolines and their derivatives can be used as potential tau aggregation inhibitor drugs, in a possible therapeutic route for the treatment of AD.

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Abstract

Método para inhibir la agregación de proteína tau y tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, administrando un derivado de quinolina de formula (I), donde R2 es 2-(4-aminofenilo) o 2-(4-metilfenilo) y R6 es metilo como inhibidor de la agregación de proteína tau.

Description

MÉTODO PARA INHIBIR LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNA TAU Y TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. CON UN COMPUESTO DERIVADO DE QUINOLINA. CAMPO DEL INVENTO
La presente invención se refiere a moléculas específicas de quinolina, ligandos de unión a tau polimerizada, como potenciales bloqueadores de la agregación de tau antes de la formación de NFTs. Dichas quinolinas preferentemente presentan un grupo amino o un grupo metilo en posición meta del anillo nitrogenado, y que muestran la mayor actividad desagregante de polímeros de tau, y por ello, son útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. la presente invención proporciona compuestos de quinolinas que inhiben la formación y a la vez desagregan los NFTs, y por ello, serían útiles en el tratamiento y profilaxis de la enfermedad de Alzheimer.
ARTE PREVIO
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa, de evolución lenta y la causa más común de demencia, afectando principalmente a un 2% de la población menor a 65 años y casi un 50% mayor a 85 años. Por lo que se hace imperativo disponer de un tratamiento, y así evitar un eventual y serio proceso epidemiológico que se podría desencadenar dentro de la próxima década por no disponer de dicho tratamiento (Green R.C., Cupples L.A., Go R., Benke K.S., Edekí T., Griffith P.A., Williams M., Hipps Y., Graff- Radford N., Bachman D., Farrer L.A. (2002). MIRAGE Study Group. Risk of dementia among white and African American relatives of patients with Alzheimer disease. JAMA,. 287 (3): 329- 36; Maccioni R.B., Lavados M., Maccioni C.B. y Mendoza A. (2004). Biological markers of Alzheimer's disease and mild cognitive impairment. Current Alzheimer Research. 1 : 307- 314; Maccioni R.B., Farias G.A., Rojo LE., Sekler M.A. y Kuljis R.O. (2008). What have we learned from the tau hypothesis. In: Hypotheses and Research Milestones in Alzheimer's Disease (R.B. Maccioni & G. Perry, eds.). Springer-Verlag, New York-Heidelberg). La EA es también uno de los mayores problemas de salud pública debido a que es una de las enfermedades que más impacto económico conlleva en la sociedad moderna (Wimp A., Winblad B. (2001). Health economical aspects of Alzheimer disease and ¡ts treatment. Psychogeriatrics. 1 : 189-93; Winblad B. (2001). Maintaining functional and behavioral abilities ¡n Alzheimer disease. Alzheimer Dis Assoc Disord. 1 : S34-40). Es considerada como una entidad clínico-patológica consistente en la asociación de una demencia lentamente progresiva, de comienzo en la edad adulta, y la observación en el córtex de la pérdida neuronal y presencia de placas seniles o neuríticas (PS) y ovillos neurofibrilares (NFTs), en concentraciones que superan claramente lo esperado por un efecto del envejecimiento fisiológico (Maccioni, R.B., Barbeito L, and Muñoz J.P. (2001). The molecular bases of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Arch. Medical Research. 32: 367-381 ; Rojo LE., Fernández J.A., Maccioni A.A., Jiménez J.M., Maccioni R.B. (2008). Neuroinflammation: implications for the pathogenesis and molecular diagnosis of Alzheimer's disease. Arch Med Res. 39(1): 1-16). Como resultado de la degeneración de las sinapsis y muerte neuronal, regiones del cerebro tales como el lóbulo frontal y el temporal, éste último involucrado en procesos de aprendizaje y memoria, se ven afectadas y presentan un tamaño reducido en pacientes con EA como se muestra claramente en Mattson M. (2004). Pathways towards and away from Alzheimer disease. Nature. 430 (7000): 631-9. Debido a que existen otros tipos de demencias de distintas etiologías como por ejemplo las de origen vascular, por el déficit de vitamina B 2, neurodegenerativas (tales como demencia frontotemporal) e infecciosas (que incluyen sífilis, demencia asociada a HIV y Creutzfeld-Jakob), entre otras (Me Khann G.M. (1991). The future of child neurology, J. Child Neurol. 6 (2): 167-72), el diagnóstico diferencial y de certeza de la EA aún requiere de un examen neuropatológico post-mortem (Kuljis R.O., Darvesh S., Greig N.H., Geula C. (2006). Tomographic visualization of cholinesterase. Ann. Neurol. 60(6): 745-6). Este consiste en analizar histológicamente cortes tejido cerebral que deben presentar un número suficiente de PS y NFTs coexistiendo en determinadas zonas del cerebro como el hipocampo y los núcleos de Meynert. El diagnóstico está basado en criterios clínicos y exámenes neuropsicológicos, identificación de síntomas típicos de la enfermedad y la exclusión de otras causas de demencia (Dubois B., Feldman H., Jacova C. (2007). Research criteria for the diagnosis of Alzheimer's disease: revising the NINCDS- ADRDA criteria. Lancet Neurol. 6: 734-46). En este sentido cabe destacar que la carencia de un biomarcador de certeza altamente confiable ha retardado las investigaciones sobre la EA por una parte, y han hecho más difícil el diagnóstico temprano de esta patología.
Clínicamente, la EA está caracterizada por un deterioro progresivo y una disminución de las funciones cognitivas, tales como memoria lenguaje y orientación espacio visual. La EA se caracteriza además por una pérdida gradual de memoria, la disminución de la capacidad para realizar tareas rutinarias, la desorientación espacial y temporal, las dificultades de aprendizaje, la pérdida de la capacidad lingüística, el deterioro del razonamiento, los cambios rápidos del estado de ánimo y las alteraciones de la personalidad (Katzman R. (2004). Luigi Amaducci memorial award winner's paper 2003. A neurologist's view of Alzheimer's disease and dementia. Int Psychogeriatr.16 (3): 259-73). En su fase inicial no se observa una pérdida de neuronas, sino más bien una disfunción de éstas, la cual aumenta gradualmente hasta estados más severos en los cuales se aprecia un deterioro cognitivo severo asociado a perdida neuronal en áreas del hipocampo, la corteza entorrinal y luego en la corteza prefrontal y temporal como se muestra claramente en Mattson M. (2004), Pathways towards and away from Alzheimer disease, Nature, 430 (7000): 631-9.
La EA está relacionada con una amplia y gradual pérdida neuronal, pero el principal evento neuropatológico consiste en la deposición de PS y NTFs. Las PS están formadas principalmente por la variante Αβ(1-42) (Mattson M. (2004). Pathways towards and away from Alzheimer disease. Nature. 430 (7000): 631-9). En el caso de los NFTs están constituidos por una proteína asociada al citoesqueleto neuronal denominada tau, la cual se encuentra hiperfosforilada en los cerebros de pacientes con EA. (Kurt M.A., Davies D.C., Kidd M. (1997). Paired helical filament morphology varíes with intracellular location in Alzheimer's disease brain. Neuros Lett. 239 (1 ): 41-4; Maccioni, R.B., Barbeito L., y Muñoz J.P. (2001). The molecular bases of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Arch. Medical Research. 32: 367-381 ; Maccioni R.B., Lavados M., Maccioni C.B. y Mendoza A. (2004). Biological markers of Alzheimer's disease and mild cognitive impairment. Current Alzheimer Research. 1 : 307-314). Mediante mecanismos desconocidos, tau sufre modificaciones importantes, como son la fosforilación anormal debida a la actividad desregulada de diversas quinasas y fosfatasas las cuales afectan su función biológica normal (Zambrano C.A., Egaña J.T., Núñez M.T., Maccioni R.B., González-Billault C. (2004). Oxidative stress promotes tau dephosphorylation in neuronal cells: the roles of cdk5 and PP1. Free Radie Biol Med. 36 (11): 1393-402). Bajo estas circunstancias tau comienza a agregarse originando los NTFs, estructuras que constituyen un marcador histopatológicos característico de la EA junto con las PS (Maccioni C, Arzola M.E., Mujica L. y Maccioni R.B. (2003). Nuevos paradigmas en el estudio de la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. Rev Chil Neuro-Psiquiatr. 41 (2): 33-46). PS y NTFs están presentes principalmente en regiones del cerebro envueltas en aprendizaje, memoria y conductas emocionales, tales como el hipocampo, corteza cerebral y la amígdala.
En cuanto a su patogénesis, está claro que las lesiones características de la EA, es decir, los NFTs y las placas seniles (PS), no son los eventos gatillantes de su patogénesis, sino el resultado tardío de procesos que ocurren durante muchos años. Se han postulado distintas teorías sobre la EA, pero recientemente ha encontrado una mayor aceptación la hipótesis unificadora de la EA (Fernández J.A., Rojo L, Kuljis R. y Maccioni R.B. (2008). "The damage signáis hypothesis of Alzheimer's disease pathogenesis", J. Alzheimer Dis. 14: 329-33; Maccioni R.B., Rojo L, Fernández J. y Kuljis R.O. (2008). "Neuroimmunomodulation in Alzheimer's disease". Ann N.Y. Acad. Sci.), la cual plantea que existen una serie de señales de daño-alarma en el sistema de inmunidad innata, en las etapas tempranas de la patogénesis de la EA. Señales de daño endógeno tales como oligómeros de Αβ, LDL oxidasa, radicales libres, daño mecánico y productos de glicosilación avanzada (AGEs), producidos por factores externos como los traumatismos, alta ingesta de grasa, deficiencia de vitamina B, infecciones y sobrecarga de hierro entre otros, activan la microglía a través de receptores AGEs. Separadamente LDL-oxidasas activan receptores tipo toll (TLRs), en particular TLR4. Señales de daño adicionales tales como traumatismos y radicales libres posiblemente actúan en receptores separados tal como se describe en Fernández JA, Rojo L., Kuljis R. and Maccioni R.B. (2008). "The damage signáis hypothesis of Alzheimer's disease pathogenesis", J. Alzheimer Dis. 14: 329-33; Maccioni R.B., Farias G.A., Rojo L.E., Sekler M.A. y Kuljis R.O. (2008). What have we learned from the tau hypothesis. In: Hypotheses and Research Milestones ¡n Alzheimer's Disease (R.B. Maccioni & G. Perry, Eds.). Springer-Verlag, New York-Heidelberg. Separadamente y en varias combinaciones, estas señales podrían gatillar mecanismos de alarma en el sistema de inmunidad innata, resultando en un aumento en los niveles de NFK-B, factor de transcripción que aumentaría la expresión de los genes de citoquinas proinflamatorias (TNF-a, IL-Ι β, IL-6) liberados por la microglía y que promueven cascadas erróneas de señalización en las neuronas afectadas (Rojo L.E., Fernández J.A., Maccioni A.A., Jiménez J.M., Maccioni R.B. (2008). Neuroinflammation: implications for the pathogenesis and molecular diagnosis of Alzheimer's disease. Arch. Med. Res. 39 (1): 1-16). Así, los niveles de estas citoquinas se ven aumentados en el líquido céfalo raquídeo (LCR). Estas señales estarían directamente relacionadas con el daño neuronal, debido a que se activarían enzimas del ciclo celular tales como la cdk-5, lo cual se ve reflejado en alteraciones como la hiperfosforilación de la proteína tau y la formación de filamentos helicoidales pareados (PHFs), procesos que resultan en una degeneración neuronal y progresivamente manifestaciones clínicas severas que afectan procesos cognitivos y conductuales (Fernández J.A., Rojo L, Kuljis R. and Maccioni R.B. (2008). "The damage signáis hypothesis of Alzheimer's disease pathogenesis", J. Alzheimer Dis. 14: 329-33).
Las placas seniles (PS) son estructuras localizadas en el espacio extracelular donde se desplazan las terminaciones nerviosas y corresponden a depósitos de fibrillas y agregados amorfos de β-amiloide (Αβ) (Liu W.K., Ksiezak-Reding H., Yen S.H. (1991 ). Abnormal tau proteins from Alzheimer's disease brains. Purification and amino acid analysis. J Biol Chem. 266 (32): 21723-7). Se trata de conglomerados anulares de cuerpos y prolongaciones neuronales degeneradas en torno a un depósito central del péptido Αβ, el cual posee una longitud variable de 39-43 aminoácidos. Este péptido, deriva del procesamiento proteolítico de la proteína precursora del amiloide (APP) (Glenner G.G., Wong C.W., Quaranta V., Eanes E.D. (1984). The amyloid deposits in Alzheimer's disease: their nature and pathogenesis. Appl Pathol. 2 (6): 357-69).
Tres enzimas son las responsables de este proceso. El APP puede fragmentarse por acción conjunta de la α-secretasa, seguida de la acción de la γ-secretasa, generando diferentes fragmentos solubles del APP. Sin embargo, cuando sobre el APP actúa en primer lugar la β-secretasa seguido de la acción de la γ-secretasa, se liberan los fragmentos de Αβ-1-40 y Αβ 1-42, poniéndose en marcha la ruta amiloidogénica, siendo este último fragmento el que tiene la mayor capacidad de autoagregación (Hardy J. (1997). Amyloid, the presenilins and Alzheimer's disease. Trends Neurosci. 20 (4): 154-9).
La presencia de placas extracelulares de Αβ es un hecho central en la neuropatología de la EA. La teoría del β-amiloide (Cummings J.L. (2004). Alzheimer's disease. N Engl J Med. 351 (1): 56-67), se fundamenta en que los agregados de Αβ son el factor desencadenante de una multitud de vías neurotóxicas entre las que se pueden incluir exitotoxicidad, alteraciones en la homeostasis de calcio, producción masiva de radicales libres y procesos neuroinflamatorios. Por otro lado, existen diversos estudios que sugieren que pequeños oligómeros del péptido pueden ser la forma tóxica (Roher A.E., Chaney M.O., Kuo Y.M., Webster S.D., Stine W.B., Haverkamp L.J., Woods A.S., Cotter R.J., Tuohy J. ., Krafft G.A., Bonnell B.S., Emmerling M.R. (1996). Morphology and toxicity of Abeta-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. J. Biol. Chem. 271 (34): 20631-5; Lambert J.C., Pasquier F., Cottel D., Frigard B., Amouyel P., Chartier-Harlin M.C. (1998). A new polymorphism in the APOE promoter associated with risk of developing Alzheimer's disease. Hum. Mol. Genet. 7 (3): 533-40).
Diversos estudios han demostrado que las PS se encuentran tanto en cerebros con EA, como en controles seniles normales siempre que se tratara de ancianos, lo que sugiere que tales placas podrían ser marcadores de senilidad más que de demencia (Maccioni R.B., Farias G.A., Rojo L.E., Sekler M.A. and Kuljis R.O. (2008). What have we learned from the tau hypothesis In: Hypotheses and Research Milestones in Alzheimer's Disease (R.B. Maccioni & G. Perry, Eds.). Springer-Verlag, New York-Heidelberg). De acuerdo con esto, la formación de componentes del amiloide es común en el envejecimiento normal, y de esta forma el Αβ posiblemente precede a la formación de NFTs; pero es necesaria la presencia de ambos eventos celulares claves en la EA, para llevar en forma complementaria a la pérdida de la actividad de neuronas afectadas (Maccioni, R.B., Barbeito L., and Muñoz J.P. (2001). The molecular bases of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Arch. Medical Research. 32: 367-381).
La proteína tau, es una proteína que se encuentra normalmente asociada a microtúbulos y cumple una función importante en el ensamble de estos, como lo son la estabilización de los microtúbulos contra la inestabilidad dinámica y la unión de los microtúbulos con otros filamentos del citoesqueleto (Maccioni R.B. and Cambiazo V. (1995). Role of microtubule- associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiol Rev. 75 (4): 835-864; Maccioni, R.B., Barbeito L, and Muñoz J.P. (2001). The molecular bases of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Arch. Medical Research. 32: 367-381). La proteína tau pertenece a la familia de las MAPs o Proteínas Asociadas a los Microtúbulos. En humanos, esta se encuentra casi exclusivamente en las neuronas (Maccioni R.B. and Arechaga J. (1987). "The Cytoskeleton in Cell Differentiation and Development". Oxford University Press, U.K. 367 pp; Maccioni R.B. and Cambiazo V. (1995). Role of microtubule- associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiol Rev. 75 (4): 835-864) y se presenta en 6 isoformas, las que derivan de la expresión de un solo gen. Este gen se encuentra en el brazo largo del cromosoma 17, en la posición 21 (17q21) y contiene 13 exones, los cuales por un proceso de corte y empalme alternativo generan 6 isoformas moleculares, las cuales tienen entre 352 y 441 aminoácidos (Goedert M. (2004). Tau protein and neurodegeneration. Seminars in Cell & Developmental Biology. 15:45-49).
El esquema propuesto en Goedert M. (2004). Tau protein and neurodegeneration. Seminars in Cell & Developmental Biology. 15: 45-49, sintetiza la información sobre la estructura del gen de tau, y su expresión mediante empalme alternativo en seis isoformas del cerebro humano. Producto de este proceso, se generan 6 isoformas que van desde los 45 kDa hasta los 65 kDa, las cuales se expresan diferencialmente durante el desarrollo y pueden, además encontrarse distribuidas en diferentes subpoblaciones neuronales (Kosik K.S., Orecchio L.D., Bakalis S., Nevé R.L. (1989). Developmentally regulated expression of specific tau sequences. Neuron. 2 (4): 1389-97).
La región N-terminal de la proteína tau es de longitud variable, dependiendo si la isoforma presenta o no, los exones 2 y/o 3. Esta región se conoce como dominio de proyección, debido a que una vez que la proteína tau interactúa con los microtúbulos se proyecta desde éstos hacia el exterior. A través de esta proyección tau es capaz de interactuar con otros elementos del citoesqueleto como filamentos de actina o espectrina (Cross D., Vial C. and Maccioni R.B. (1993). A íau-like protein interacts with stress fibers and microtubules inhuman and rodent cell lines. J. Cell Sci. 105: 51-60; Farias G.A., Muñoz J.P., Garrido J., Maccioni R.B. Tubulin, actin, and tau protein interactions and the study of their macromolecular assemblies. (2002) J. Cell Biochem. 85: 315-324; Carlier M.F., Simón C, Cassoly R., Pradel L.A. (1984). Interaction between microtubule-associated protein tau and spectrin. Biochimie. 66: 305-311) o interactuar con la membrana plasmática (Brandt R., Leger J., Lee G. (1995). Interaction of tau with neural plasma membrane mediated by tau's aminoterminal projection domain. J Cell Biol. 131 : 1327-1340; Hernández P., Lee G., Sjoberg M. and Maccioni R.B. (2008). "Tau phosphorylation by cdk5 and Fyn in response to amyloid peptide Αβ25-35: involvement of lipid rafts". J. Alz. Dis. (In press)
Por otro lado, en el dominio C-terminal, se ubican los dominios de las secuencias repetitivas en "tándem", involucrados en la unión a microtúbulos (Maccioni R.B. and Arechaga J. (1987). "The Cytoskeleton in Cell Differentiation and Development". Oxford University Press, U.K. 367 pp; Maccioni R.B. and Cambiazo V. (1995). Role of microtubule-associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiol Rev. 75 (4): 835-864). Éstos presentan 3 ó 4 segmentos de 18 aminoácidos cada uno, altamente conservados, los que se encuentran separados por regiones de alrededor de 13 aminoácidos (Maccioni R.B., Vera J.C., Dominguez J., Ávila J. (1989). A discrete repeated sequence defines a tubulin binding domain on microtubule-associated protein tau. Arch Biochem Biophys. 275 (2): 568-79). Este dominio de unión (Maccioni R.B., Rivas C.I., Vera J.C. (1988). Differential interaction of synthetic peptides from the carboxyl-terminal regulatory domain of tubulin with microtubule- associated proteins. EMBO J. 7 (7): 1957-63) es el encargado del ensamblaje y estabilización de los microtúbulos (Mandelkow E.M., Biernat J., Drewes G., Gustke N., Trinczek B., Mandelkow E. (1995). Tau domains, phosphorylation, and interactions with microtubules. Neurobiol Aging. 16: 355-362). Además, se ha demostrado su asociación con otras proteínas como G-actina. Maccioni et al., 1989 esquematiza la estructura general de la isoforma mayor de la proteína tau, h 67 (2N4R) de 441 aminoácidos.
A pesar de que la proteína tau es capaz de sufrir una serie de modificaciones post- traduccionales (Pevalova M., Filipcik P., Novak M., Avila J., Iqbal K. (2006). Post- translational modifications of tau protein. Bratisl Lek Listy. 107 (9-10): 346-53), las fosforilaciones de ésta, juega un papel particularmente, importante en la regulación de su actividad. La isoforma mayor de tau, presenta 79 serinas o treoninas que actúan como potenciales sitios de fosforilación (Lovestone S., Reynolds C.H. (1997). The phosphorylation of tau: a critical stage in neurodevelopment and neurodegenerative process. Neuroso. 78: 309-324). Debido a ello, la actividad combinada de diferentes proteínas quinasas y fosfatasa, que pueden actuar sobre las distintas isoformas de tau, pueden generar un alto número de estados estructurales en esta proteína conteniendo diferentes niveles de fosforilación en cada uno de estos residuos y en cada isoforma. Así, el equilibrio entre los mecanismos de fosforilación por proteínas quinasas, y de desfosforilación por proteínas fosfatasas, modulan finalmente un estado estructural de tau que en suma define su nivel de actividad (Mandelkow E.M., Biernat J., Drewes G., Gustke N., Trinczek B., Mandelkow E. (1995). Tau domains, phosphorylation, and interactions with microtubules. Neurobiol Aging. 16: 355-362; Lovestone S., Reynolds C.H. (1997). The phosphorylation of tau: a critical stage in neurodevelopment and neurodegenerative process. Neurosc. 78: 309-324). Entre las proteínas quinasas que fosforilan a tau a nivel celular se encuentran la calmodulina quinasa, la proteína p38, y las enzimas Gsk3b (Rankin C.A., Sun Q. and Gamblin T.C. (2007). Tau phosphorilation by GSK3P promotes tangles-like filament morphology. Molecular Neurodegeneration. 2:12) y cdk5 (también denominada TPK II), estas últimas involucradas en el control de procesos de la neurogénesis comandados por la actividad de tau (ver Tabla 1) (Maccioni, R.B., Barbeito L, and Muñoz J.P. (2001). The molecular bases of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Arch. Medical Research. 32: 367-381 ; Reynolds C.H., Betts J.C., Blackstock W.P., Nebreda A.R., Andenson B.H. (2000). Phosphorylation sites on tau identifies by nanoelectrospay mass spectrometry. Differences in vitro between the Mitogen Activated Protein Kinase ERK2. c-Jun N Terminal Kinase and p-38, and Glycogen Synthase Kinase-3b. J. Neuroch. 74: 1587-1595).
Es interesante notar que una proteína como tau, tan crucial para definir la polaridad de las neuronas y los procesos de transporte, generación de conos de crecimiento en el desarrollo axonal, etc. (Kosik K.S., Orecchio L.D., Bakalis S., Nevé R.L. (1989). Developmentally regulated expression of specific tau sequences. Neuron. 2 (4): 1389-97; Ferreira A., Cáceres A. (1991). Estrogen-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of Tau and stable microtubules. J. Neurosci. 11 (2): 392-400) requiere ser modulada por mecanismos muy finos para que ésta cumpla de manera controlada su función. Así, cambios importantes en esta regulación pueden modificar su capacidad para unirse a microtúbulos o a otros elementos del citoesqueleto, o contribuir a generar condiciones patológicas como las hiperfosforilaciones de tau, y de auto-agregación que hacen de ésta una proteína con acciones neurotóxicas, como las observadas en la degeneración del tipo Alzheimer (Sánchez M.P., Álvarez-Tallada V., Ávila J. (2001). La proteína tau en enfermedades neurodegenerativas. Taupatías. Revista de Neurología. 33 (2): 169-177). A diferencia de otras proteínas, la proteína tau es resistente a la temperatura y a condiciones ácidas, esto permite que se lleve a cabo el proceso de separación de las MAPs y otras proteínas termolábiles como la tubulina. También es posible separarla de aquellas que se denaturan en presencia de ácidos (Farias G.A., Muñoz J.P., Garrido J., Maccioni R.B. Tubulin, actin, and tau protein interactions and the study of their macromolecular assemblies. (2002). J. Cell Biochem. 85: 315-324).
García T., Jay D. phosphorylation of tau and Alzheimer disease. (2004). Gad Med Méx. 3: 329-33, específicamente en la tabla 1 , muestra los sitios de fosforilación de tau, y las enzimas involucradas en estos procesos, de donde se puede concluir que diversas quinasas afectan la fosforilación de tau en múltiples sitios, la mayoría ubicados hacia el extremo C- terminal.
Durante el proceso de patogénesis de la EA, tau comienza a hiperfosforilarse irreversiblemente en múltiples sitios (García T., Jay D. Phosphorylation of tau and Alzheimer disease. (2004). Gad Med Méx. 3: 329-33, específicamente tabla 1), y se integra en estructuras anómalas filamentosas denominadas filamentos helicoidales pareados (PHFs), para dar lugar finalmente a los NFTs, perdiendo así sus funciones fisiológicas claves como la definición de polaridad neuronal y el control del transporte axonal mediados por microtúbulos (Maccioni R.B. and Cambiazo V. (1995). Role of microtubule- associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiol Rev. 75 (4): 835-864). La hiperfosforilación de tau es el resultado del desequilibrio de la acción de diferentes quinasas y fosfatasas, dando como resultado una proteína hiperfosforilada que tiene comprometida su función normal y trae como consecuencia el daño neuronal (Buée L, Bassiére T., Buée- Scherrer V. (2000). Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res. 33: 95-130). Aunque aún en estudio, se acepta actualmente que los oligómeros de Αβ serían, entre otros un factor gatillante de los cambios que llevan a alterar los mecanismos de señalización neuronal (Roher A.E., Chaney M.O., Kuo Y.M., Webster S.D., Stine W.B., Haverkamp L.J., Woods A.S., Cotter R.J., Tuohy J.M., Krafft G.A., Bonnell B.S., Emmerling M.R. (1996). orphology and toxicity of Abeta-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. J. Biol. Chem. 271 (34): 20631-5; Lambert J.C., Pasquier F., Cottel D., Frigard B., Amouyel P., Chartier-Harlin M.C. (1998). A new polymorphism in the APOE promoter associated with risk of developing Alzheimer's disease. Hum. Mol. Genet. 7 (3): 533-40) y que conducen a las hiperfosforilaciones de tau. Este sería así, un evento temprano en la progresión hacia la patogénesis de la EA, sin embargo la única correlación establecida entre la intensidad de la enfermedad y las lesiones patológicas se presenta con los ovillos neurofibrilares (Maccioni, R.B., Barbeito L, and Muñoz J.P. (2001). The molecular bases of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Arch. Medical Research. 32: 367-381).
El citoesqueleto de las células eucarióticas es la estructura celular responsable de la morfología neuronal. Está compuesto por microtúbulos, microfilamentos de actina y filamentos intermedios (Maccioni R.B. and Cambiazo V. (1995). Role of microtubule- associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiol Rev. 75 (4): 835-864; Ávila J., Lucas J.J., Pérez M. and Hernández F. (2004). Role of Tau Protein Both Physiological and Pathological Conditions. Rev. Physiol. 84: 361-384). Estos polímeros coexisten en forma entrelazada a través de una suerte de interacciones macromoleculares dinámicas, que determinan la organización de esta red, la cual se extiende en el amplio dominio del citoplasma hasta interactuar con la membrana celular, el núcleo y organelos celulares como centrosomas, mitocondrias, lisosomas, etc. (Maccioni R.B. and Arechaga J. (1987). "The Cytoskeleton in Cell Differentiation and Development". Oxford University Press, U.K. 367 pp; Maccioni R.B. and Cambiazo V. (1995). Role of microtubule-associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiol Rev. 75 (4): 835-864).
Los microtúbulos son componentes esenciales del citoesqueleto, responsables de la formación y mantenimiento de los axones, dendritas y contactos específicos. Las proteínas MAPs contribuyen a dar dinamismo y estabilidad a los microtúbulos. Entre ellas está la proteína MAP1A, MAP1 B, MAP2 y finalmente la proteína tau (Maccioni R.B. and Cambiazo V. (1995). Role of microtubule-associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiol Rev. 75 (4): 835-864; Ávila J., Lucas J.J., Pérez M. and Hernández F. (2004). Role of Tau Protein Both Physiological and Pathological Conditions. Rev. Physiol. 84: 361-384) La proteína tau es importante en la mantención de la polaridad neurona! y en la estabilización de una determinada arquitectura en la neurona diferenciada. Además, se ha demostrado que la actividad de tau es clave para la morfogénesis de los conos de crecimiento en las neuronas cerebrales, en cuya estructura participan también redes locales de filamentos de actina (Paglini G., Pigino G., Kunda P., Morfini G., Maccioni R., Quiroga S., Ferreira A., Cáceres A. (1998). Evidence for the participation of the neuron-specific CDK5 activator P35 during laminin-enhanced axonal growth. J. Neurosci. 18 (23): 9858-9869). Además se plantea un papel determinante en promover el crecimiento axonal (Black M.M., Slaughter T., Moshiach S., Obrocka M. and Fischer I. (1996). Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal región of growing axons. J. Neuroscience. 16: 3601-3619). Por otra parte, MAP-2 estaría relacionada más bien con la generación de procesos cortos en la neurona.
Las quinolinas son compuestos orgánicos aromáticos heterocíclicos, que consisten en 2 anillos bencénicos unidos, en donde el está sustituido por un átomo de N. Las quinolinas tienen aplicaciones tanto a nivel industrial como en clínica. Cabe destacar que principalmente a nivel clínico se han encontrado algunos derivados de quinolinas que son activos como drogas anestésicas, antitumorales y antimaláricas (Campbell S.F., Hardstone J.D., Palmer M.J. (1988). 2, 4-Diamino-6,7-dimethoxyquinoline derivatives as alpha 1- adrenoceptor antagonists and antihypertensive agents. J Med Chem. 31 (5): 1031-5).
Especialmente, las quinolinas utilizadas como antimaláricos deben su origen a la quinina, sustancia utilizada como antipirético por cientos de años. La quinina, no obstante, tiene inconvenientes asociados con su toxicidad y su administración, por lo que se han sintetizado sustancias relacionadas, tales como la cloroquina, que es una quinolina que fue desarrollada durante la segunda guerra mundial y que es hoy en día el arma principal usada contra el paludismo humano (Ridley R. (2002). Medical need, scientific opportunity and the drive for antimalarial drugs. Nature 415: 686-93). De acuerdo con su eficacia frente a las diversas etapas por las que transcurre el ciclo vital del plasmodio, los antimaláricos del tipo quinolinas se clasifican como "esquizonticidas eritrocitarios", los cuales actúan en las etapas eritrocíticas asexuadas de los parásitos interrumpiendo la esquizogonia eritrocítica, terminando así con la infección y finalmente eliminando los parásitos del cuerpo (Baird J.K., Basri H., Subianto B., Fryauff D.J., McEIroy P.D., Leksana B., Richie T.L., Masbar S., Wignall F.S., Hoffman S.L. (1995). Treatment of chloroquine resistant Plasmodium vivax with chloroquine and primaquine of halofantrine. J Infecí Dis. 171 : 1678-82). Debido a estos usos de las quinolinas, los estudios de fase preclínica y clínica han sido aceptados, por lo que su uso en seres humanos está aprobado.
Particularmente, la patente USNo.7.117.830 y la publicación USNo.2005//009865 proponen el uso de ciertos derivados de quinolina en el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la acumulación de la proteína tau. Particularmente, estos documentos divulgan los compuestos: a) 4-[2-(2-bencoimidazolil)etenil]-N,N-dietilbenzenamina (BF-126), 2-[(4- metilamino)fenil]quinolina (BF-158) y 2-(4-aminofenil)quinolina (BF-170) y otros compuestos fenil derivaodos de quinolina, los que se usan como imanología in vivo para patlogía tau en la enfermedad de Alzheimer. Además, demuestran la baja afinidad por fibras beta-amiloides y alta afinidad por obillos neurofibrilares de tau, así como también otros efectos característicos de la enfermedad de Alzheimer.
La publicación WO 2008/049047, divulga derivados de quinolina útiles en el tratamiento de enfermedades relacionados con el receptor X del hígado, tales como síndrome coronario agudo, alzheimer, diabetes y aterosclerosis. Sin embargo, el radical R1 de dicho documento siempre corresponde a un derivado alquílico, en cambio en la presente invención el radical R2 correspondiente es un radical fenílico.
EP 1574500 (A1) divulga derivados de quinolina estructuralmente diferentes a los compuestos de quinolina de la presente invención, los que pueden ser también usados para imágenes de diagnóstico de enfermedades en que la proteína tau se acumula y composiciones y kits que los comprenden. Además, enseña un método para teñir marañas neurofibrilares en muestras cerebrales y una composición farmacéutica para el tratamiento y/o profilaxis de una enfermedad en que la estructura de lámina beta es la causa o posible causa de la enfermedad.
WO 2009/097401 y WO 2009/097278 divulgan compuestos derivados de 2-amino-quinolina y de 6-sustituidos-tio-2-amino-quinolina, estructuralmente diferentes a los compuestos de quinolina de la presente invención, los que inhiben la β-secretasa, conocida como la enzima de clivaje amiloide de sitio β, BACE, BACE 1 , Asp2 o mempasin2, composiciones farmacéuticas que los contienen y su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, senilidad, demencia y desmejoramiento cognitivo suave.
WO 2009/133692 divulga compuestos derivados de quinolina, estructuralmente diferentes a los compuestos de quinolina de la presente invención, útiles en el tratamiento y/o profilaxis de arterioesclerosis tales como ateroesclerosis y arterieesclerosis asociada con diabetes, dislipidemia, hipercolesterolemia, enfermedades relacionadas con los lípidos, enfermedades inflamatorias inducidas por una citoquina inflamatoria, enfermedades a la piel tales como enfermedades cutáneas alérgicas, diabetes o enfermedad de Alzheimer, senilidad, demencia y desmejoramiento cognitivo suave.
Así, luego de fallidos intentos con drogas que desensamblan las placas seniles del amiloide, gran parte de los esfuerzos a nivel mundial están siendo dirigidos hacia agregados menores de tau y los mismos ovillos neurofibrilares (NFTs), la presente invención proporciona compuestos de quinolinas que inhiben la formación y a la vez desagregan los NFTs, y por ello, serían útiles en el tratamiento y profilaxis de la enfermedad de Alzheimer.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1 : Ilustra el procedimiento de purificación de tau desarrollado en la invención. Particularmente es una síntesis de las principales etapas en la purificación, la precipitación del sobrenadante después de la 3era centrifugación se realiza con sulfato de amonio al 75% de saturación.
Fig. 2: Ilustra la estructura del astemizol, benzimidazol utilizado en los ensayos de unión y desplazamiento y su isótopo radiactivo 3H-AST, para evaluar la interacción de las quinolinas con el sistema de la proteína tau.
Fig. 3: Ilustración esquemática del procedimiento utilizado para los ensayos de Scatchard y desplazamiento de 3H-AST con quinolinas in vitro, donde los tubos se incuban por 4 horas a 25°C con agitación leve, el secado se realiza en papel filtro y se agrega en viales con 1 ml_ de líquido de centelleo, y la última incubación se realiza por 10 minutos en oscuridad.
Fig. 4a: Ilustra el patrón de fluorescencia para THQ 55 (ver tabla 1 de más abajo) excitado a 290 nm y emisión a 380 y 480 nm con un "slit" 2.0.
Fig. 4b: Ilustra el patrón de fluorescencia para THQ 55 (ver tabla 1 de más abajo) excitado a 290 nm y emisión a 380 y 480 nm, con un "slit" de 5.0.
Fig. 5: Ilustra el "Dotblots" de tau de cerebro bovino. Caracterización de la pureza de la proteína tau. La parte superior de la figura corresponde al sobrenadante obtenido de la precipitación con sulfato de amonio y la parte inferior al precipitado de la precipitación con sulfato de amonio. A) dotbiot para hTau. B) dotbiot para bTau, donde el sobrenadante 1 es el sobrenadante de la precipitación con sulfato de amonio, y el precipitado 1 es precipitado dializado de la saturación con sulfato de amonio.
Fig. 6: Ilustra el procedimiento de Purificación de la proteína tau. A) SDS-PAGE. Muestra la caracterización de la proteína tau bovina (bTau) obtenida de la purificación con sulfato de amonio. Carril 1 : Estándar de peso molecular All Blue (catalog #161-0373 BIO-RAD); Carriles 2 y 3: 6,0 μί de sobrenadante de la precipitación con sulfato de amonio; Carriles 4 y 5: 6,0 μΙ_ tau bovina (bTau) 3,36 mg/mL (utilizada como control positivo); Carriles 6 y 7: 6,0 μΙ_ bTau 10,0 mg/mL. B) Western blot Muestra las distintas isoformas de tau obtenidas en la purificación de esta proteína. Se determinó la presencia las isoformas de la proteína, que se encuentran entre 55 kDa y 65 kDa, tanto en la purificación de bTau (carriles 2 y 3) como en bTau (carriles 6 y 7). Carril 1 : Estándar de peso molecular All Blue (catalog #161-0373 BIO-RAD); Carriles 2 y 3: 6,0 μΙ_ de tau bovina (bTau) 10,0 mg/mL; Carriles 4 y 5: 6,0 pL tau bovina (bTau) 3,36 mg/mL; Carril 6: 6,0 pL bTau 1 ,3 mg/mL; Carril 7: 6,0 pL bTau 0,65 mg/mL.
Fig. 7: Ilustra los estudios de la morfología de los filamentos de tau en presencia y ausencia de quinolinas. A) Micrografía electrónica de los controles negativos (tau sin heparina y sin quinolinas). B) Micrografía de filamentos de tau obtenidos con heparina 200 pg/mL, sin tratamiento con quinolinas (control positivo). El inserto corresponde a una magnificación de 30.000X. C) Micrografía electrónica de la incubación de tau con heparina y THQ 55 (ver tabla 1 de más abajo). D) Micrografía electrónica de la incubación de tau con heparina y THQ 4S (ver tabla 1 de más abajo). E) Micrografía electrónica de los PHFs purificados desde cerebros humanos a través de columnas de afinidad. F) PHFs incubados con THQ 55 (ver tabla 1 de más abajo).
Fig. 8: Ilustra que las quinolinas cambian la estructura de los filamentos producto del agregado de tau. A) Se gráfica el número de filamentos por campo luego del tratamiento con las quinolinas THQ4S y THQ55 (ver tabla 1 de más abajo); B) Largo de los Filamentos (pm) luego de estos tratamientos; y C) Ancho de los filamentos obtenidos (nm). Estudios de agregación mostraron que estas quinolinas se unen a la región regulatoria del C-terminal de tau e impiden su polimerización y afectan la estructura, (barra 1 : control de polimerización; barra 2 THQ 4S (ver tabla 1 de más abajo); barra 3 THQ 55 (ver tabla 1 de más abajo)). Fig. 9: Ilustra la agregación del péptido amiloide en presencia y ausencia de quinolinas. A) Micrografía electrónica de los controles obtenidos para agregados de Αβ 1-42 (Control negativo). B) Polimerización de Αβ-42 mediante agitación a 37°C durante 7 días (control positivo). C) Micrografía electrónica de la incubación de Αβ 1-42 en presencia de THQ 4S (ver tabla 1 de más abajo). D) Micrografía electrónica de la incubación de Αβ 1-42 en presencia de THQ 55 (ver tabla 1 de más abajo).Todas las muestras fueron visualizadas a una amplificación de 15.000X.
Fig. 10: Ilustra que las quinolinas cambian levemente la estructura de los filamentos de Αβ 1- 42. A) Largo de los filamentos (μηι) luego de los tratamientos con las quinolinas THQ4S (ver tabla 1 de más abajo) y THQ55 (barras 2 y 3) (ver tabla 1 de más abajo); La barra 1 indica la polimerización del control sin quinolina. B) Número de filamentos por campo luego del tratamiento con las quinolinas THQ4S (ver tabla 1 de más abajo) y THQ55 (barras 2 y 3) (ver tabla 1 de más abajo); La barra 1 indica la polimerización del control sin quinolina.
Fig. 11. Ilustra el estudio turbidimétrico para la agregación de tau en ausencia y presencia de quinolinas a diferentes concentraciones. Las curvas se muestran coloreadas para las diferentes situaciones: control + (verde); control - (rojo); muestra en estudio más THQ55 (ver tabla 1 de más abajo) a la concentración de 1 ,0 μΜ (q1 en amarillo); muestra en estudio más THQ55 (ver tabla 1 de más abajo) a la concentración de 10 μΜ (q10 en azul); muestra de en estudio más THQ55 (ver tabla 1 de más abajo) a la concentración de 50 μΜ (q50 en celeste); muestra en estudio más Astemizol a la concentración de 10 μΜ (Ast 10 en café).
Fig. 12. Gráfico de Scatchard para 3H-AST. Estos ensayos de saturación realizados con filamentos de tau inducidos con heparina indican, que 3H-AST se une con gran afinidad a tau.
Fig. 13: Ilustra la estructura del anticuerpo monoclonal MN423 (cinta de color celeste) con el núcleo estructural del C-terminal de tau involucrado en el ensamble de los PHFs, correspondiente al pentapéptido 387DHGAE391 (esferas de colores).
Figura 14. Ilustra el análisis bioinformático predictivo para 6 de las configuraciones preferenciales de la interacción de un pentapéptido correspondiente al C-terminal de PHF- tau, con la THQ 4S (ver tabla 1 de más abajo), modelados por el programa Autodock ®. Las flechas blancas indican la posición del N de la quinolina.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
De acuerdo a los datos entregados anteriormente, y en el contexto de que los depósitos de NFTs en las neuronas pueden llevar a un proceso neurodegenerativo gradual y sobre la base de que estas quinolinas tienen cierta afinidad por la proteína tau (Okamura N., Suemoto T., Furumoto S., Suzuki M., Shimadzu H., Akatsu H., Yamamoto T., Fujiwara H., Nemoto M., Maruyama M., Arai H., Yanai K., Sawada T., Kudo Y. (2005). Quinoline and bencimidazole derivatives: candidate probes for in vivo imaging of tau pathology in Alzheimer's disease. J. Neurosci. 25: 10857-10862), los inventores dirigieron una búsqueda de moléculas ligandos de unión a la proteína tau, y especialmente a la tau polimerizada del tipo Alzheimer, como potenciales bloqueadores de la agregación de tau hiperfosforilada antes de la formación de los NFTs, evaluando la capacidad una familia de quinolinas de relevancia clínica y sus derivados (THQs) (ver Tabla 1 de más abajo), para inhibir la agregación de la proteína tau en forma de PHFs producidos in vitro, en una posible vía terapéutica de la EA.
Tabla 1 : Derivados de quinolinas utilizados para evaluación en la desagregación de la proteína tau:
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1) 2-(4-metilfenil),6-(0-metil)quinolina (THQ-3S)
2) 2-(4metilfenil),6-(metil)quinolina (THQ-4S);
3) 2-(4-aminofenil),6-(metil)quinolina (THQ-55)
4) 2-(4-aminofenil)quinolina (THQ-56); 5) 2-(4-metilfenil),8-(bromo)quinolina (THQ-9S); y
6) 2-(5-metilfenil),6-(metil)quinolina (THQ-12S)
Se evaluaron las moléculas ligandos antes mencionadas que interactúan con la proteína tau cerebral, y que pueden afectar los procesos de autoagregación de esta proteína hiperfosforilada en condiciones patológicas, con miras hacia aplicaciones biomédicas en el dominio de la investigación sobre la enfermedad de Alzheimer.
Para llevar a cabo el objetivo antes propuesto se aisló y caracterizó la proteína tau cerebral y tau de los filamentos helicoidales pareados (PHFs) desde cerebros humanos y la tau de cerebro de bovino las cuales fueron inducidas a polimerizar con heparina (Mandelkow E.M., andelkow E. (1993). Tau as a marker for Alzheimer's disease. Trends Biochem Sci. 18 (12): 480-3):
Se determinó el coeficiente de partición octanol/agua y correlacionó experimental-mente la liposolubilidad con la capacidad de las quinolinas de atravesar la barrera hematoencefalica (BHE);
Se produjeron y caracterizaron filamentos helicoidales de la proteína tau a partir de la proteína aislada y recombinante. Alternativamente, se produjeron y caracterizaron agregados de amiloide, a partir del péptido recombinante Αβ 1-42;
Se estudió y caracterizó la interacción de las quinolinas seleccionadas con la proteína tau y sus formas agregadas;
Se realizaron estudios teóricos de "docking" computacional para determinar posibles sitios de interacción de los compuestos ensayados dentro de la estructura de la proteína.
Para el desarrollo de las relaciones antes indicadas, se utilizaron cerebros bovinos recientemente sacrificados y/o cerebros humanos post-mortem almacenados a -80°C, provenientes de pacientes Alzheimer.
Se obtuvieron PHFs Humanos, los cuales fueron purificados desde cerebros humanos a través de columnas de afinidad.
Las quinolinas de importancia biomédica en el contexto de esta invención orientada al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, según se describieron en la Tabla 1 anterior, fueron obtenidas mediante síntesis orgánica. Las muestras de quinolinas fueron preparadas a una concentración de 1 ,0 mg/mL en metanol y se realizaron diluciones seriadas a distintas concentraciones, a las cuales se les determinó su fluorescencia con una longitud de onda de excitación a 290 nm y uno de emisión entre 260 y 500 nm.
El coeficiente de partición (log P0/w) se determinó según lo descrito por Takacs-Novak K., Nagy P., Jozan M., Orfi L., Dunn W.J. 3rd, Szasz G. (1992). Relationship between partitioning properties and (calculated) molecular surface. SPR investigation of midazoquinazoloneb derivatives. Acta Pharm Hung. 62 (1 -2): 55-64, en el cual se utilizan 2 fases, una fase acuosa que corresponde a una solución tampón PBS 0, 1X pH 7,4, la que es saturada con una solución de n-octanol y corresponde a la fase orgánica.
Se prepararon soluciones stock de 1 ,0 mg/mL de cada quinolina en estudio en tampón PBS 0, 1X pH 7,4 saturado en octanol. (Muestras de quinolinas THQ 9S y THQ 12S (ver tabla 1 anterior) fueron sometidas a sonicación por un tiempo no mayor a 30 segundos, debido a su naturaleza viscosa). A partir de estas soluciones se realizaron las diluciones para un rango de concentración de 1 ,0 mg/mL y 100 μg/mL para determinar su absorbancia máxima en la región UV-Visible.
Luego las quinolinas testeadas fueron disueltas en PBS 0, 1 X pH 7,4 saturado en n- octanol y agitadas durante 30 min. a temperatura ambiente. Posteriormente, esta emulsión se dejó reposar durante 48 h y se le realizó una centrifugación a 3.000 rpm durante 10 minutos para separar ambas fases. Tanto el coeficiente de partición octanol/agua como Log P fueron determinados por diferencia de absorbancia en la región UV-Visible de cada compuesto mediante la ecuación 1 :
Ec. 1 : [ THQ en octanol ] = [ THQ inicial ] - [ THQ tampón ]
En donde:
[THQ tampón] = concentración determinada por la absorbancia de cada muestra
La ecuación 2 determina las concentraciones para THQ inicial:
Ec. 2: [ THQ inicial ] = 100 uL x [concentración THQ en metanoll
10.000 ML Posteriormente, se determinó el cuociente P entre ambas fases según lo descrito en la ecuación 3:
Ec. 3: P = í THQ en octanol 1
[ THQ tampón ]
Finalmente el coeficiente de partición fue determinado mediante Log P.
Para este ensayo se utilizaron 2 controles, Bromuro de clidinio que corresponde a una amina cuaternaria que no es liposoluble, y el tiopental sódico, que corresponde a un anestésico barbitúrico muy liposoluble. Cada punto del ensayo fue realizado por triplicado. La proteína tau fue obtenida esencialmente siguiendo el método de Farías (Farías G.A., Vial C, and Maccioni R.B. (1992). Specific macromolecular interactions between tau and the microtubule system. Molécula and Cellular Biochemistry. 112: 81-88) con modificaciones menores. Cerebros bovinos recientemente sacrificados y/o cerebros humanos post-mortem almacenados a -80°C, fueron limpiados de meninges, vasos sanguíneos y sangre superficial; y son procesados según el protocolo de ciclos repetitivos de ensamblaje y desensamblaje, dependientes de temperatura.
Regiones del cerebro tales como el lóbulo temporal y frontal, las cuales se encuentran afectadas en la EA, fueron homogeneizados a 4°C en tampón de homogenización (solución A). El homogenizado se centrifugó a 42.000g (19.450 rpm utilizando el rotor T647.5) por 30 min. a 4°C; etapa en la que es recolectado el sobrenadante. Luego a este sobrenadante, se le agregaron los componentes necesarios para la polimerización de MT (solución B). Esta solución fue incubada por 1 h a 37°C con agitación leve. El líquido más viscoso obtenido se divide en los tubos de centrífuga. Posteriormente, los microtúbulos formados se rescataron del pellet formado por una centrifugación a 42.000g durante 30 min a 37°C. Este pellet de microtúbulos fue posteriormente tratado con el tampón de homogenización de microtúbulos (solución C). El volumen a preparar es de aproximadamente 60 mL (3 volúmenes de solución por cada volumen de pellet).
Luego se homogenizó sobre hielo con homogenizador "dounce" durante 15 min. Este paso es crítico en el rendimiento de tau. La suspensión obtenida fue sometida a baño maría a 100°C por 5 min. para precipitar la tubulina y otros contaminantes que son termolábiles. Posteriormente, esta suspensión fue centrifugada a 42.000g durante 30 min. a 4°C, etapa en la cual se rescató el sobrenadante, que fue tratado con sulfato de amonio a una saturación del 75% toda la noche a 4°C, para precipitar la proteína tau (Farias G.A., Muñoz J.P., Garrido J., Maccioni R.B. Tubulin, actin, and tau protein interactions and the study of their macromolecular assemblies. (2002) J. Cell Biochem. 85: 315-324). Posteriormente, se centrifugó a 42.000g por 30 min. a 4°C en donde el precipitado es resuspendido con la solución D y dializado para eliminar las sales. La diálisis se realizó en membranas de diálisis de poro conocido (12 kDa de tamaño) a 4°C y en agitación por 24 h con tres cambios de tampón Tris-HCI 2,5 mM durante las 24 h. La solución obtenida se concentró mediante un sistema de "ultrafiltración Centricon" en una centrifugación a 2.000g por 30 min. a 4°C. La Figura 1 resume las etapas realizadas en la purificación de tau.
La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford (Bradford M.M. (1976). A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principie of Protein Dye Binding. Analytical Biochem. 72: 248-254) utilizando albúmina de suero de bovino para la curva de calibración.
Después de la purificar la proteína tau y determinar su concentración, cantidades iguales de proteínas fueron cargadas en geles denaturantes de poliacrilamida al 10% (Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259): 680-5); luego fueron transferidos a una membrana de nitrocelulosa y esta fue bloqueada con leche descremada al 5% en tampón PBS. Posteriormente, las membranas fueron incubadas con un anticuerpo primario (dilución 1 :1000 en leche descremada al 1% en PBS 1X) toda la noche a 4°C. Después de tres lavados con PBS- Tween (0.05%) las membranas fueron incubadas con un anticuerpo secundario (dilución 1 :1000 en leche descremada al 1% en PBS 1X) asociado a peroxidasa. Finalmente, la detección se realizó utilizando un sistema de luminiscencia y las muestras fueron analizadas en placas fotográficas.
Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios para la inmunodeteccion: para estudiar los estados de fosforilación de la proteína tau se utilizó el anticuerpo AT8 que reconoce los epítopes fosforilados Ser 02 y Thr 205 en la proteína tau; Tau 5 que reconoce epítopes, de la proteína tau, independientes de su estado de fosforilación; y RBX anti β-amiloide 1 -42, que reconoce el péptido amiloide de 42 amino áciods de longitud. Todos estos anticuerpos fueron utilizados de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
ESTUDIOS DE AGREGACIÓN PROTEICOS.
EFECTO DE LAS QUINOLINAS EN LA AGREGACIÓN DE TAU. ESTUDIOS DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA (ME). La proteína tau purificada y altamente concentrada, fue inducida a polimerizar en forma de PHFs en presencia de polianiones (heparina a una concentración de 200 μο/mL) en un volumen final de 10 μΙ_. Esta mezcla fue incubada a 37°C y mantenida en agitación leve durante 7 días. Al mismo tiempo, se incubaron de igual manera, otra muestra que contiene la proteína tau, heparina (200 μg/mL) y las distintas quinolinas en estudio (THQ 4S y THQ 55 (ver tabla 1 anterior)) a una concentración de 10 μΜ y volumen final de 10 μΙ_, verificando de esta manera el efecto que tienen las quinolinas en la polimerización de esta proteína. En forma paralela se realizó también un estudio utilizando proteína tau recombinante a una concentración de 2,0 mg/mL preparada en agua destilada. La Tabla 2, resume las condiciones de este experimento.
Los agregados así formados fueron visualizados a través de microscopía electrónica mediante tinción negativa con acetato de uranilo al 2%. Se realizó finalmente un conteo del número de filamentos por campo, y la medición del largo y ancho de estos, observando un promedio de 25 campos.
TABLA 2: ESTUDIOS DE AGREGACIÓN DE LA PROTEÍNA TAU. Como control positivo se utilizó una solución que contiene tau y heparina (sin la quinolina), y como control negativo tau y agua; en tanto que las muestras en estudio contenían tau, heparina y la quinolinas THQ 4S ó THQ 55 (ver tabla 1 anterior) a concentraciones de 10 μΜ. Las "x" indican presencia y las "-" ausencia.
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EFECTO DE LAS QUINOLINAS EN EL DESENSAMBLE DE LOS PHFS. ESTUDIOS DE
ME. Los PHFs de concentración 400 Mg/mL, fueron incubados con las quinolinas en estudio a una concentración final de 10 μΜ en un volumen de 10 \iL a 37°C en agitación leve durante 7 días. Los resultados fueron visualizados a través de microscopía electrónica, mediante tinción negativa con acetato de uranilo al 2%.
EFECTO DE LAS QUINOLINAS EN LA AGREGACIÓN DEL PÉPTIDO Αβ 1-42. ESTUDIOS DE ME. El péptido Αβ 1-42 fue disuelto en tampón PBS 1X pH 7,4 esterilizado y filtrado, obteniendo una solución de concentración final 1 ,0 mg/mL en un volumen final de 100 pL. A modo de tener un parámetro de comparación con la proteína tau, el péptido Αβ 1- 42 fue inducido a polimerizar en forma de fibrillas y agregados de Αβ. Esta solución fue incubada a 37°C y mantenida en agitación leve durante 7 días (Ward R.V., Jennings K.H., Jepras R., Neville W., Owen D.E., Hawkins J., Christie G., Davis J.B., George A., Karran E.H., and Howlett D.R. (2000). Fractionation and characterization of oligomeric, protofibrillar and fibrillar forms of beta-amyloid peptide. Biochem J. 348: 137-144). Al mismo tiempo, se incubaron de igual manera, otra muestra que contiene el péptido Αβ 1-42 y las distintas quinolinas en estudio (THQ 4S y THQ 55 (ver tabla 1 anterior)) a una concentración de 10 μΜ en un volumen final de 100 μί, verificando de esta manera el efecto que tienen las quinolinas en la agregación del péptido Αβ 1-42. La Tabla 3 resume las condiciones de este experimento.
Los agregados así formados fueron visualizados a través de microscopía electrónica, mediante tinción negativa con acetato de uranilo al 2%. Se realizó finalmente un conteo de fibras por campo y medición del largo de estas, observando un promedio de 25 campos.
TABLA 3: ESTUDIOS DE AGREGACIÓN DEL PÉPTIDO Αβ 1-42. Como control positivo se utilizó una solución que contiene el péptido β-amiloide a una concentración de 1 ,0 mg/mL en agitación a 37°C, a diferencia del control negativo que contiene también el péptido β- amiloide, pero es almacenado a -80°C quedando sin polimerizar; en tanto que las muestras en estudio contenían el péptido β-amiloide y las quinolinas THQ 4S y THQ 55 (ver tabla 1 anterior) a
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concentraciones de 10 μΜ. Las "x" indican presencia y las "-" ausencia.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA. Los agregados proteicos de tau, Αβ1-42 y PHFs, fueron visualizados a través de microscopía electrónica mediante tinción negativa con acetato de uranilo. Para ello se tomaron 6,0 μί de muestra (agregados de tau, PHFs o Αβ 1-42), fueron depositadas en una grilla de cobre (pretratada con parlodeón y vapor de carbono) y adsorbidas durante 1 minuto a temperatura ambiente. El exceso de muestra fue removido con papel filtro. Posteriormente, 6,0 pL de acetato de uranilo al 2% preparado en agua bidestilada, fueron depositados sobre la grilla, los cuales se dejan secar durante 30 segundos y son utilizados para la tinción negativa. Finalmente, las grillas son examinadas en el microscopio.
EFECTO DE LAS QUINOLINAS EN LA AGREGACIÓN DE TAU. ESTUDIOS DE TURBIDIMETRÍA. La agregación de tau fue monitoreada a través de su absorbancia a λ 340 nm mediante espectrofotometría UV. La proteína tau purificada desde cerebro bovino y altamente concentrada (2,0 mg/mL) fue resuspendida en tampón MES 0,1M pH 7,2 y fue inducida a polimerizar en forma de PHFs en presencia de polianiones (heparina a una concentración de 200 μg/mL) en un volumen final de 1 ,0 ml_. Esta mezcla fue incubada a 37°C y mantenida en agitación leve durante 7 días. Al mismo tiempo, se incubó de igual manera, otra muestra que contenía la proteína tau, heparina (200 μg/mL) y la quinolina seleccionada a diferentes concentraciones desde 1 ,0 a 50 μΜ y un volumen final de 1 ,0 mL, verificando de esta manera el efecto que tienen las quinolinas en la agregación de tau. La Tabla 4, resume las condiciones de este experimento. Se sabe que algunos derivados de benzimidazoles no impiden la agregación de tau; en este contexto se utilizó un control que contenía tau (2,0 mg/mL), heparina (200 μg/mL) y Astemizol a una concentración de 10 μΜ. Como control adicional la proteína tau fue reemplazada con agua para medir la absorbancia de estas Quinolinas. Cada muestra fue realizada por triplicado.
TABLA 4: ESTUDIO TURBIDIMETRICO DE LA AGREGACIÓN DE TAU EN PRESENCIA Y AUSENCIA DE QUINOLINAS. Como control positivo se utilizó una solución que contiene tau, y heparina, y como control negativo tau y agua; en tanto que las muestras en estudio contenían tau, heparina y la quinolina THQ 55 (ver tabla 1 anterior) a diferentes concentraciones entre 1 ,0 y 50 μΜ. El otro control de agregación contiene tau, heparina y Astemizol (AST) a una concentración de 10 μΜ. Las "x" indican presencia y las "-" ausencia.
Tau + THQ Tau + THQ Tau + THQ Tau + AST
Control + Control - 55* 1.0 mM 55* 10 mM 55* 50 mM 10 mM
Proteína tau
(2,0 mg/mL) X X X X X X
Heparina (200
μ9/πιί) X - X X X X
MES (0.1 M) X X X X X X
THQ 55* - - X X X -
AST - - - - - X
Agua
Destilada - X - - - - * ver tabla 1 anterior
EFECTO DE LAS QUINOLINAS EN LA AGREGACIÓN DE TAU. ESTUDIOS DE SEDIMENTACIÓN. Después de 7 días de incubación a 37°C en agitación leve, se realizó la sedimentación de los agregados de tau en presencia y ausencia de quinolinas. Para este propósito se tomaron 400 μ- de cada una de las muestras preparadas para el análisis turbidimétrico y se les realizó una centrifugación a 42.000g (18.000 rpm utilizando el rotor AH-650) a 37°C durante 25 min. El pellet de cada muestra obtenido de esta centrifugación fue resuspendido en 50 μL· de tampón MES 0,1 M levemente alcalinizado (pH 7,2) y se determinó la concentración de proteínas en cada uno. En este procedimiento y debido a que el volumen de muestra es muy pequeño se utilizó un nanofotómetro midiéndose la concentración de proteína sedimentada y resuspendida a un λ280 nm.
INTERACCIÓN DE QUINOLINAS CON TAU Y ENSAYOS DE DESPLAZAMIENTO CON
H3-AST IN VITRO. En ensayos previos de nuestro laboratorio y también de otros autores (Okamura N., Suemoto T., Furumoto S., Suzuki M., Shimadzu H., Akatsu H., Yamamoto T., Fujiwara H., Nemoto M., Maruyama M., Arai H., Yanai K., Sawada T., Kudo Y. (2005). Quinoline and bencimidazole derivatives: candidate probes for in vivo imaging of tau pathology in Alzheimer's disease. J. Neurosci. 25: 10857-10862; Rojo L., Avila M., Chandia M., and Maccioni R.B. (2007). 18F Lansoprazole as PET radiotracer. Chemical and biological studies towards the development of a New PET Radiotracer. International Conference on Clinical PET and Molecular Nuclear Medicine 10-14 Noviembre. Bangkok) se determinaron las Kd y máximos de unión específicos para algunos bencimidazoles de uso clínico, entre ellos [0-metil-3H]-astemizol (Figura 2) a través de la interacción establecida con la proteína tau. Con estos antecedentes se realizaron ensayos de Scatchard y desplazamiento con las quinolinas antes mencionadas.
El esquema de la Figura 3 resume el procedimiento utilizado en ambos experimentos.
• Para el ensayo de Scatchard se utilizó una concentración fija de proteína tau (230 nM) y concentraciones variables de 3H-AST entre 10 y 120 nM llevando a un volumen final de 20 con etanol 8% (EtOH 8%). La proteína tau tuvo un tratamiento previo a este ensayo, en donde fue incubada a 37°C en agitación leve durante 7 días. Posteriormente la proteína tau y 3H-AST, fueron incubados durante 4 h a 25°C en agitación leve. Luego esta solución fue filtrada al vacío durante 10 minutos y los papeles filtros son secados a temperatura ambiente, y transferidos a un vial con 1 ,0 mL de líquido de centelleo. Esto es dejado en oscuridad y finalmente los conteos por minuto (cpm) fueron medidas en un equipo contador de centelleo.
• En el ensayo de desplazamiento de la droga, se utilizó el mismo procedimiento mencionado anteriormente, salvo que se empleó una concentración fija de proteína Tau y de 3H-AST (230 nM y 52 nM respectivamente), y concentraciones variables del ligando frió (THQ 4S y THQ 55 (ver tabla 1 anterior, por separado) entre 10 nM y 10 μΜ (tal como se indica en la Tabla 6) llevando a un volumen final de 20 μί EtOH 8%. Posteriormente la proteína tau, 3H-AST y las quinolinas, fueron incubadas durante 4 horas a 25°C en agitación leve y se continúa con el procedimiento de la Figura 3.
TABLA 5: CONCENTRACIONES DE QUINOLINAS THQ 4S Y THQ55 UTILIZADAS EN EL ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO. El ligando frió (THQ 4S y THQ55 (ver tabla 1 anterior, por separado) fue utilizado en concentraciones variables entre 10 nM y 10 μΜ. 3H-AST y proteína tau fueron utilizados en concentraciones fijas de 52 nM y 230 nM respectivamente.
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estructura cristalizada de un fragmento de la proteína tau. De la base de datos pública del "Protein Data Bank" (PDB) se encontró la estructura de un pentapéptido que consiste en un núcleo estructural de los PHFs ubicado en el C-terminal. 2V17:A, corresponde al código PDB de 387DHGAE391. Con este pequeño fragmento se realizaron los estudios de "Docking", para obtener una aproximación de los algoritmos que permiten predecir el tipo de interacción que se produce entre las quinolinas y la proteína tau. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS: Los cálculos de desviación estándar fueron realizados en la planilla de cálculos de excel (Microsoft Office XP), la cual realiza una medida de la dispersión de los valores respecto a la media (valor promedio).
OBSERVACIONES DESVEST parte de la hipótesis de que los argumentos representan la muestra de una población. Si sus datos representan a la población total, se utiliza DESVESTP para calcular la desviación estándar.
• La desviación estándar se calcula utilizando los métodos "no sesgada" o "n-1 ".
• DESVEST utiliza la siguiente fórmula:
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Se pasan por alto los valores lógicos como VERDADERO y FALSO y el texto.
ENSAYOS DE FLUORESCENCIA.
Para determinar la interacción de estas quinolinas con la proteína tau, y obtener un patrón de fluorescencia de ambas moléculas (Friedhoff P., Schneider A., Mandelkow E.M., and
Mandelkow E. (1998). Rapid Assembly of Alzheimer-like Paired Helical Filaments from
Microtubule-Associated Protein Tau Monitored by Fluorescence in Solution. Biochemistry.
37: 10223-10230), se realizó este ensayo, en donde se encontró que estos compuestos generan una baja fluorescencia y en una alta concentración (mayores a 1 ,0 mg/mL), lo cual implica utilizar una mayor cantidad de proteína, aspecto limitante por los niveles de su producción, al momento de realizar los ensayos de unión y determinar constantes como Kd,
Ki y Bmáx.
De esta manera, se encontró que la quinolina THQ 55 (ver tabla 1 anterior), fue el compuesto que mejores resultados arrojó. Esta quinolina se encontraba a una concentración de 1 ,0 mg/mL y fue excitada a λ 290 nm, mostraba una emisión a λ 350 y 480 nm. La intensidad de fluorescencia fue de 80 y 30 de un máximo de 1000 en el primer ensayo, y de 30 y 478 de un máximo de 1000, en este último caso aumentando el "slip'O apertura de luz del equipo. Ensayos de fluorescencia fueron realizados también para las quinolinas THQ 4S y THS 12S (ver tabla 1 anterior) pero la intensidad de fluorescencia fue muy baja (menor a 10 con un máximo de 1000) aún al aumentar la apertura del "slip".
Las Figuras 4a) y 4b) muestran los resultados obtenidos en la determinación de fluorescencia para THQ 55 (ver tabla 1 anterior).
DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE PARTICIÓN OCTANOL/AGUA LOG P.
De acuerdo con la hipótesis de trabajo, lo que hemos buscado en estas moléculas es evaluar si pueden llegar al cerebro y ejercer su efecto sobre las zonas afectadas en personas que padecen de la EA. En este contexto, el primer paso, fue determinar la liposolubilidad expresada como Log P. Las características físico-químicas y farmacocinéticas de estos fármacos (Tabla 6) indican que su liposolubilidad (expresada como Log P) es relativamente alta.
TABLA 6: PROPIEDADES MOLECULARES DE LA FAMILIA DE DERIVADOS DE QUINOLINAS UTILIZADOS. Coeficiente de partición octanol/tampón PBS expresado como Log P; TPSA: superficie total de áreas polares; VM: volumen molecular; PM: peso molecular; n ON: átomos aceptores de hidrógenos; n OH NH: átomos donantes de hidrógeno.
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El cálculo de áreas totales de superficie polar (TPSA) hecho en base a la contribución individual de cada uno de los grupos polares de estos compuestos (según el método de Ertl P., Rohde B., Selzer P. (2000). Fast calculation of molecular polar surface area as a sum of fragment-based contributions and its application to the prediction of drug transport properties. J.Med.Chem. 43: 3714-3717) indica que estas drogas poseen valores de TPSA similares a otros fármacos que poseen buena absorción y penetración de la BHE. El análisis de propiedades moleculares, según la "Regla de los Cinco 5" de Lipinski C.A., Lombardo L., Bominy B.W., Feeney P.J. (1997). Experimental and computational approaches to estímate solubility and permeability in drug díscovery and development settings. Adv Drug Delívery Rev. 23: 4-25, los que indica que estos fármacos poseen estructuras que favorecerían la penetración de la BHE en el ser humano.
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA TAU. Para determinar la pureza de la proteína tau, esta fue caracterizada a través de "dotbiots" luego de su precipitación con sales de sulfato de amonio y posterior a la diálisis. Para los "dotbiots", se utilizó Tau-5 como anticuerpo 1no y antilgG de ratón desarrollado en cabra conjugado con peroxidasa como anticuerpo 2r'° (Figura 5).
A través de esta técnica, se determinó que el total de la proteína tau se obtenía en el precipitado con sales de sulfato de amonio y no en el sobrenadante. Mediante SDS-PAGE y Western Blots, se determinaron los patrones de las isoformas de tau presentes en el precipitado obtenido de la purificación (Figura 6).
A través de la técnica de MicroBradford se determinaron las concentraciones tanto de bTau como de Tau, obtenidas en la purificación. Posteriormente se realizó una liofilización, para concentrar cada una de las muestras tanto de hTau y bTau, de las cuales se obtuvieron concentraciones que fueron las adecuadas para los ensayos posteriores, con un 12% a un 14% de rendimiento para la purificación de tau, lo cual está de acuerdo con el método descrito por (Farías G.A., Vial C, and Maccioni R.B. (1992). Specific macromolecular interactions between tau and the microtubule system. Molécula and Cellular Biochemistry. 112: 81-88; Farias G.A., Muñoz J.P., Garrido J., Maccioni R.B. Tubulin, actin, and tau protein interactions and the study of their macromolecular assemblies. (2002) J. Cell Biochem. 85: 315-324). La Tabla 7 indica la cantidad total de proteína obtenida en ambos procesos. TABLA 7: CONCENTRACIONES DE LA PROTEÍNA TAU OBTENIDAS EN EL PROCESO DE PURIFICACIÓN. Las concentraciones fueron determinadas mediante la técnica de "microbradford". Posterior a la purificación las muestras fueron liofilizadas para obtener las concentraciones adecuadas para los ensayos posteriores
ESTUDIOS DE AGREGACIÓN
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PROTEICOS:
EFECTO DE LAS QUINOLINAS EN LA AGREGACIÓN DE TAU HUMANA. ESTUDIOS DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA. Después de 7 días de incubación de la proteína a 37°C con agitación leve, se observaron agregados de tau con características morfológicas similares a los PHFs. Esto se obtuvo tanto con la tau aislada de cerebros bovinos como la aislada de cerebros humanos (Figuras 7a) y 7b)).
Basado en evidencias que muestran que la tau mutada con una deleción, y sin su dominio C-terminal no genera estructuras del tipo PHFs (Jakes R, Novak M., Davison M., and Wischik M. (1991). Identification of 3 and 4 repeat tau isoformas within the PHF in Alzheimer's Disease. EMBO J. 10: 2725-2729, los estudios de agregación que evidencian formación de PHFs, indican que las diferentes quinolinas se unirían a la región regulatoria del C-terminal de tau. Así, las quinolinas impedirían su polimerización, afectando además la estructura de los filamentos (Figura 7c) y 7d)). Los resultados también mostraron una disminución tanto en el número de filamentos por campo, como en el largo y el ancho en cada una de las estructuras filamentosas (Figura 8). Cuando estas quinolinas (a una concentración final de 10 μΜ) fueron también incubadas junto con los PHFs purificados desde cerebros humanos, se observó una disminución en el número de agregados que presentaban los controles. Esto resultado indicaría que además de impedir la polimerización, estas quinolinas desagregarían las estructuras de PHFs formadas en pacientes afectados por la EA (Figuras 7e) y 7f)).
EFECTO DE LAS QUINOLINAS EN LA AGREGACIÓN DEL PÉPTIDO Αβ 1-42. ESTUDIOS DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA (ME). Después de 7 días de incubación a 37°C con agitación leve, se lograron agregados de este péptido en forma de fibras de amiloide (Figura 9).
Estos estudios de agregación mostraron que las quinolinas, al igual que en la agregación de tau, impiden ia polimerización del péptido Αβ1-42 y afectan además la estructura de los filamentos. Los resultados mostraron una disminución en el número de filamentos por campo, pero un aumento en el largo de las fibras (Figura 10). Esta es una observación de interés que es importante destacar pues diferencia los efectos de quinolinas sobre los agregados de tau y los de Αβ 1-42. Este ensayo de sedimentación (Maccioni R.B. and Seeds N.W. (1978). Enhancent of tubulin assembly as monitored by a rapid filtration assay. Arch Biochem Biophys. 185 (1): 262-71) indica además que la masa total de amiloide agregado no disminuiría sustancialmente, a diferencia de los polímeros de tau, en que aparentemente hay una disminución en la cantidad de monómeros de tau que se agregan. Además de analizar los cambios estructurales de los filamentos de tau obtenidos en presencia y ausencia que quinolinas, fue de interés cuantificar el efecto de estas moléculas en dichos agregados. Para ello, se realizaron ensayos de sedimentación (Maccioni R.B., Vera J.C., Dominguez J., Ávila J. (1989). A discrete repeated sequence defines a tubulin binding domain on microtubule-associated protein tau. Arch Biochem Biophys. 275 (2): 568- 79) y de turbidimetría de los polímeros de tau en ausencia y presencia de quinolinas, analizándose la cuantía de tau polimerizada a diferentes concentraciones de la droga.
EFECTO DE LAS QUINOLINAS EN LA AGREGACIÓN DE TAU. ESTUDIOS DE TURBIDIMETRÍA.
La inhibición de la agregación de la proteína tau, es un importante aspecto de un potencial compuesto terapéutico para el tratamiento de la EA. Se utilizó la quinolina THQ 55 (ver tabla 1 anterior) para este propósito. Esta droga mostró una gran capacidad de inhibir la agregación de tau, lo que fue verificado midiendo la Absorbancia a λ 340 (Figura 11 ), en donde se observa que a muy bajas concentraciones la droga tiene un potencial efecto en la agregación.
EFECTO DE LAS QUINOLINAS EN LA AGREGACIÓN DE TAU. ESTUDIOS DE SEDIMENTACIÓN:
Después de 7 días de incubación a 37°C en agitación leve, la concentración de proteína sedimentada en presencia y ausencia de quinolinas y medida a λ280 nm mostró como resultado un marcado efecto inhibitorio de THQ 55 (ver tabla 1 anterior) sobre la autoagregación de la proteína tau en ensayos in vitro. Este efecto inhibitorio fue aún más marcado a concentraciones de THQ 55 (ver tabla 1 anterior) superiores a 10 μ . En la Tabla 8 se indican las concentraciones de los polímeros de tau obtenidos en la sedimentación.
TABLA 8: ESTUDIO DE SEDIMENTACIÓN PARA LA AGREGACIÓN DE TAU EN AUSENCIA Y PRESENCIA DE QUINOLINAS. Como control positivo se utilizó una solución que contiene tau, y heparina, y como control negativo sólo tau y agua; en tanto que las muestras en estudio contenían la proteina tau, heparina y la quinolina THQ 55 (ver tabla 1 anterior) a diferentes concentraciones entre 1 ,0 y 50 μΜ. El otro control de agregación contiene tau, heparina y Astemizol (AST) a una concentración de 10 μΜ.
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INTERACCIÓN DE QUINOLINAS CON TAU Y ENSAYOS DE DESPLAZAMIENTO CON
3H-AST IN VITRO. Sobre la base de la caracterización del sistema íat/-bencimidazoles, se estudiaron los parámetros de interacción proteína-ligando. Los resultados se muestran en la Figura 12 y Tabla 9 e indican que Astemizol se une con gran afinidad a filamentos de tau. Este fenómeno se repite al comparar la afinidad por filamentos de tau inducidos in vitro y por filamentos aislados de cerebros con EA (Rojo L, Avila M., Chandia M., and Maccioni R.B. (2007). 18F Lansoprazole as PET radiotracer. Chemical and biological studies towards the development of a New PET Radiotracer. International Conference on Clinical PET and Molecular Nuclear Medicine 10-14 Noviembre. Bangkok).
En este contexto se realizó un ensayo de desplazamiento de 3H-AST con las quinolinas, para determinar su afinidad con tau. Los resultados mostrados en la Figura 13, dan cuenta de la afinidad de las quinolinas por agregados de tau. Se observa que los compuestos THQ 4S y THQ 55 (ver tabla 1 anterior), presentan valores de Ki muy altos siendo superiores a 10 μΜ, indicando que estas drogas no desplazan al radioligando.
TABLA 9: ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS DATOS DE SATURACIÓN. Kd, Bmáx, y Kb/Bmáx para 3H-AST y formas agregadas de tau.
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ENSAYOS DE "DOCKING". Puesto que tau es una proteína muy fibrosa con un gran dominio desestructurado como ovillo estadístico ("random coiled') (Von Bergen M., Barghorn S., Biernat J., Mandelkow E.M., Mandelkow E. (2005). Tau aggregation is driven by a transition from random coil to beta sheet structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1739: 158-166) no se ha logrado una cristalización completa de esta proteína, sólo de segmentos de ella. Tau no es una proteína con estructura regular en su totalidad. Por lo tanto, hasta la fecha no se conoce la estructura cristalina de toda la proteína y sólo el estudio realizado por Novak M., Wischik C.M., Edwards P., Pannell R., Milstein C. (1989). Characterization of the first monoclonal antibody against the pronase resistant core of Alzheimer PHF. Prg Clin Biol Res. 317: 755-61 , describe el único fragmento conocido, el cual consiste en un pentapéptido 387DHGAE391 ubicado en el dominio C-terminal y que está involucrado en una región regulatoria del ensamble de tau para formar los PHFs. Esta región contribuye a la reactividad del anticuerpo monoclonal MN423 (Figura 13) (Sevcik J., Skrabana R., Dvorsky R., Csokova N., Iqbal K., Novak M. (2007). X-ray structure of the PHF core C-terminus: insight into the folding of the intrinsically disordered protein tau in Alzheimer's disease. FEBS Lett. 581 (30): 5872-5878). Se realizó así, sobre esta base, la modelación con este fragmento de tau debido a que se encuentra expuesto en los filamentos pareados de la proteína como lo describe Novak M., Wischik C.M., Edwards P., Pannell R., Milstein C. (1989). Characterization of the first monoclonal antibody against the pronase resistant core of Alzheimer PHF. Prg Clin Biol Res. 317: 755-61 y Skrabana R., Skrabanova M., Csokova N., Sevcik J., Novak M. (2006). Intrinsically disordered tau protein in Alzheimer's tangles: a coincidence or a rule? Bratisl Lek Listy. 107 (9-10): 354-8.
Para complementar este análisis se realizaron estudios computacionales de "docking" con el programa Autodock III® utilizando esta estructura cristalográfica conocida hasta la fecha para la proteína tau o fragmentos de ésta. Se realizaron los estudios de "docking", obteniéndose una aproximación de los algoritmos que permiten predecir el tipo de interacción más estable producido entre las quinolinas y la proteína tau. El "docking" entre este pentapéptido y la quinolina THQ 4S (ver tabla 1 anterior), mostró como resultado las interacciones más probables (Figura 14) con sus respectivas energías de "docking" que van desde -4,5 a -4,47 Kcal/mol.
La Tabla 10 resume los resultados obtenidos del análisis bioinformático de "docking" para THQ 4S (ver tabla 1 anterior) y el fragmento resistente a pronasa PHF-teu-387DHGAE391 del cual se conoce perfectamente su estructura cristalina. Así, las energías de unión descritas en esta tabla son comparadas con aquellas obtenidas por el mismo programa para fármacos con alta afinidad como es el receptor metabotropico de glutamato (mGluR) (Yanamala N., Tirupula K.C. and Klein-Seetharaman J. (2008). Preferential binding of allosteric modulators to active and inactive conformational states of metabotropic glutamate receptors. BMC Bioinformatics. 9 (Suppl 1 ): S16). Los valores más negativos de energías de unión parecen ser más favorables termodinámicamente si se relacionan en términos de energía libre (AG), indicando que esta quinolina es afín al fragmento 387DHGAE391 de tau, lo que sugiere que este fragmento podría estar involucrado en su unión y actividad antiagregante.
TABLA 10: COMPARACIÓN DE LAS ENERGÍAS DE "DOCKING". Energías obtenidas para la quinolina THQ 4S, comparadas con las energías de docking obtenidas para un receptor de alta afinidad. Energías de
"Docking"
Receptor Especies Ligando (Kcal/mol) Fuente
Fragmento THQ 4S
de tau Humano (ver tabla 1) -4,5 a -4,47 Comunicación Oral ( '
Yanamala N., Tirupula K.C. and Klein- Seetharaman J. (2008). Preferential binding of allosteric modulators to active and ¡nactive conformational states of metabotropic glutamate receptors. BMC Bioinformatics. 9 mGluR 1 Humano R214127 -7,34 (Suppl 1): S16
Yanamala N., Tirupula K.C. and Klein- Seetharaman J. (2008). Preferential binding of allosteric modulators to active and ¡nactive conformational states of metabotropic glutamate receptors. BMC Bioinformatics. 9 mGluR 5 Humano PEP -7,77 (Suppl 1): S16
Según se mencionó antes los objetivos de esta invención estuvieron enfocados hacia la búsqueda de moléculas ligandos de unión a la proteína tau polimerizada, como potenciales bloqueadores de la agregación de tau antes de la formación de NFTs. Es así como se logró determinar la manera en que una familia de distintas quinolinas interactúan con la proteína tau, y de esta forma, obtener una proyección biomédica dentro de la EA. Este sería el primer hallazgo descrito hasta ahora, que logra identificar una nueva familia de moléculas que se unen a la tau a la vez de lograr interferir con su autoensamblaje patológico en la vía hacia la neurodegeneración. El estudio fue realizado esencialmente en modelos in vitro, y de acuerdo a los resultados obtenidos, se puede concluir que estas quinolinas serían serios candidatos bloqueadores de la agregación de tau en su forma polimerizada de PHFs.
ENSAYOS DE FLUORESCENCIA. Este estudio estuvo orientado a determinar la afinidad de las quinolinas por la proteína tau y sus agregados y corroborar lo planteado anteriormente por otros autores (Rojo L, Avila M., Chandia M., and Maccioni R.B. (2007). 18F Lansoprazole as PET radiotracer. Chemical and biological studies towards the development of a New PET Radiotracer. International Conference on Clinical PET and Molecular Nuclear Medicine 10-14 Noviembre. Bangkok; Okamura N., Suemoto T., Furumoto S., Suzuki M., Shimadzu H., Akatsu H., Yamamoto T., Fujiwara H., Nemoto M., Maruyama M., Arai H., Yanai K., Sawada T., Kudo Y. (2005). Quinoline and bencimidazole derivatives: candidate probes for in vivo imaging of tau pathology in Alzheimer's disease. J. Neurosci. 25: 10857-10862). Para este propósito se realizaron ensayos de fluorescencia, pero se encontró que el patrón de emisión de estos compuestos fue muy bajo y era necesario utilizar concentraciones de droga muy altas para obtener una señal. De esta manera, y de acuerdo a las cantidades de quinolina necesarias para obtener una señal, este ensayo de unión no pudo ser considerado, debido a que la cantidad de proteína a utilizar para la unión con la quinolina era demasiado alta.
DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE PARTICIÓN OCTANOL/AGUA LOGP. De acuerdo con el desarrollo de esta invención, una de las primeras propiedades analizadas fue el si estas moléculas, las quinolinas, lograban atravesar la barrera hematoencefálica y llegar al cerebro. Estas presentaron una liposolubilidad relativamente alta. La correlación entre la liposolubilidad de las quinolinas con la capacidad de atravesar la barrera hematoencefalica (BHE), fue óptima para 3 de los 6 compuestos. El análisis de las propiedades moleculares, encontró que las quinolinas poseen propiedades similares a otros fármacos que atraviesan la BHE. El resultado fue positivo como se muestra a lo largo de esta descripción y sugiere que estas moléculas podrían atravesar la BHE de acuerdo con estudios de modelos in vitro. En este contexto, estos compuestos deben cumplir con ciertos requerimientos para ser de interés en una potencial aplicación farmacológica a nivel neural: (1) Deben ser altamente lipofílicos y tener la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE); (2) Actuar a baja concentración y permanecer poco tiempo en el tejido cerebral; (3) Interactuar con la proteína tau y sus agregados; (4) Tener una muy baja unión inespecífica. Así, estas drogas podrían llegar a ejercer un efecto directo sobre las regiones cerebrales en personas que padecen de la EA. Las quinolinas aquí descritas cumplen plenamente con estos requisitos, a saber presentan la propiedad de ser altamente lipofílicos, interactúan con tau y ejercen su acción en bloquear su autoagregación en polímeros patológicos, como son los PHFs. Consideramos que este es un hallazgo notable, puesto que hasta hoy no se han descrito moléculas que cumplan con estas propiedades.
Uno de los primeros ensayos fue determinar la liposolubilidad expresada como Log P. Nuestros resultados muestran que la liposolubilidad de los compuestos THQ 4S, THQ 55 y THQ 12S (ver tabla 1 anterior) es óptima y los hacen serios candidatos a atravesar la BHE. De acuerdo a otras características físico-químicas y farmacocinéticas mostradas en la Tabla 2, se muestra que estas quinolinas poseen valores de TPSA similares a otros fármacos que poseen buena absorción y penetración de la barrera hematoencefálica. El análisis de las propiedades moleculares, según la "Regla de los Cinco 5" de Lipinski C.A., Lombardo L, Bominy B.W., Feeney P.J. (1997). Experimental and computational approaches to estímate solubilíty and permeabilíty in drug díscovery and development settings. Adv Drug Delivery Rev. 23: 4-25, indica que estos fármacos poseen estructuras que favorecerían la penetración de la BHE en el ser humano y podrían ejercer su acción a nivel cerebral. Un dato importante es que muchos fármacos de uso clínico utilizados como antimaláricos poseen en su estructura el núcleo de las quinolinas. En este contexto su uso en seres humanos está aprobado y para su evaluación farmacológica se evitarían los estudios de fase preclínica. En base a lo anterior, y de acuerdo a sus propiedades moleculares, se utilizó THQ 4S y THQ 55 (ver tabla 1 anterior) para los ensayos biológicos. Como dato anexo se sabe que la permeabilidad de la membrana neuronal además, representa un factor importante para obtener imágenes de agregados intracelulares de tau (Small G.W., Agdeppa E.D., Kepe V., Satyamurthy N., Huang S.C., Barrio I.R. (2002). In vivo brain imaging of tangle burden in humans. J. Mol. Neurosci. 19: 323-327), en donde la alta liposolubilidad de estos compuestos es una ventaja.
PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA TAU. En cuanto a la purificación de la proteína tau, esta proteína es resistente a las condiciones ácidas, por lo que usualmente la tau se purificó mediante precipitación con ácido perclórico (Farías G.A., Vial C, and Maccioni R.B. (1992). Specific macromolecular interactions between tau and the microtubule system. Molécula and Cellular Biochemistry. 112: 81-88) en uno de los últimos pasos de la purificación. Posteriormente, en base a la divulgaciones de Farias G.A., Muñoz J.P., Garrido J., Maccioni R.B. Tubulin, actin, and tau protein interactions and the study of their macromolecular assemblies. (2002) J. Cell Biochem. 85: 315-324, se introdujo como variante el utilizar sulfato de amonio, lo que permitía concentrar la tau con un leve incremento en su pureza. Vale hacer notar que la etapa crítica en la purificación de tau reside en una correcta utilización de los ciclos de polimerización y despolimerización según lo descrito por este laboratorio originalmente (Maccioni R.B., Rivas C.I., Vera J.C. (1988). Differential interaction of synthetic peptides from the carboxyl-terminal regulatory domain of tubulin with microtubule-associated proteins. EMBO J. 7 (7): 1957-63).
ESTUDIOS DE AGREGACIÓN PROTEICA. Uno de los ensayos más importantes fue visualizar de que manera estas drogas bloquean la polimerización de la proteína tau. Los resultados muestran una clara inhibición de la proteína tau en su forma agregada de PHFs, debido a que la incubación de las quinolinas con la proteína disminuyó tanto el número de filamentos por campo, como el largo y ancho de estas estructuras filamentosas. A modo de comparación se realizó el mismo ensayo con la proteína tau recombinante humana, obteniéndose los mismos resultados, pero en esta proteína siempre el número de agregados fue menor, debido a que la proteína recombinante no se encuentra fosforilada y el número de PHFs al incubar con heparina está disminuido. Las quinolinas disminuyeron 5 veces el largo y 10 veces el ancho de los filamentos de tau formados in vitro. Para comprobar que estas drogas tienen mayor afinidad por la proteína tau que por los agregados de Αβ se realizaron los mismos ensayos anteriores, encontrando que las quinolinas disminuían el número de agregados de amiloide, pero aumentaban el largo de las fibras. Las quinolinas disminuyeron el número de fibras pero aumentan el largo de éstas, lo que sugiere que estaría relacionado con una redistribución de masas y no un impedimento en la agregación. Esta es una observación de interés que es importante destacar pues diferencia los efectos de quinolinas sobre los agregados de tau y los de Αβ 1-42, indicando que la masa total de amiloide agregado no disminuiría sustancialmente, sino que se redistribuiría a diferencia de los polímeros de tau, en que hay una disminución en la cantidad de monómeros de tau que se agregan, como se describe a continuación: ENSAYOS DE TURBIDIMETRÍA Y SEDIMENTACIÓN. Los datos de Microscopía Electrónica fueron corroborados mediante ensayos de sedimentación así como ensayos turbidimétricos, observándose un marcado efecto inhibitorio de THQ 55 (ver tabla 1 ) sobre la autoagregación de la proteína tau en ensayos in vitro. Una sólida demostración de la capacidad de estas quinolinas de afectar la autoagregación de tau se obtuvo mediante estudios turbidimétricos, seguido por ensayos de sedimentación de los polímeros de tau en presencia de concentraciones crecientes de la quinolina (THQ55, ver tabla 1). De esta manera, en forma complementaria a los estudios de microscopía fina, los ensayos de sedimentación y turbidimétricos, permitieron comprobar directamente la capacidad de estas drogas de inhibir la agregación de tau. Este efecto inhibitorio fue aún más marcado a concentraciones de THQ 55 (ver tabla 1) superiores a 10 μΜ (ver Figura 10 y Tabla 8). Estos resultados sugieren que esta quinolina aparece como un potencial candidato a ser un antiagregante de tau, lo cual tendría una enorme relevancia como enfoque terapéutico hacia el control de los ovillos neurofibrilares en la Enfermedad de Alzheimer.
Por otra parte, cabe destacar que muchas moléculas pequeñas que han sido utilizadas como inhibidores de la polimerización del amiloide in vitro contienen anillos aromáticos en su estructura. Estos inhibidores incluyen Rojo Congo para pamiloide, y antraquinona, y porfirinas para tau (Pickhardt M., Gazova Z., von Bergen M., Khilistunova I., Wang Y., Hascher A., Mandelkow E.M., Biernat J. and Mandelkow E. (2005). Anthraquinones inhibit tau aggregation and disssolve paired helical filaments in vitro and in cells J. Biol. Chem. 280: 3628-3635; Inouye H., Sharma D., Goux W.J. and Kirschner D.A. (2006). Structure of core domain of fibril-forming PHF/tau fragment Biophys J. 90: 1774-1789). A diferencia de las antraquinonas y porfirinas, las quinolinas son serias candidatas hacia una terapia antiagregante de tau, debido a que estas atraviesan la BHE además de bloquear la agregación de tau a baja concentración y además su uso en pacientes ya ha sido aprobado a diferencia de porfirinas y antraquinonas. Estudios previos de microscopía electrónica y difracción de rayos X aplicados a análogos de la proteína tau, demostraron que sólo 3 residuos que conforman una lámina β podrían estar involucrados en su polimerización en formas filamentosas de PHFs (Inouye H., Sharma D., Goux W.J. and Kirschner D.A. (2006). Structure of core domain of fibril-forming PHF/tau fragment Biophys J. 90: 1774- 1789). Esto de acuerdo con otros estudios que indican que estas interacciones se establecen a través de puentes de H o residuos aromáticos entre péptidos pequeños (Gazit E. (2002). A possible role for π-stacking in the self-assembly of amyloids fibrils. FASEB J. 16: 77-83; Makin O.S., Atkins E., Sirkoski P., Johanson J. and Serpell L.C. (2005). Molecular basis for amyloid fibril formation and stability. Proc Nati Acad Sci USA. 102: 315-320). Este tipo de interacciones podría ser utilizado como un blanco razonable para interferir con la formación de fibras o destruir la fibra una vez formada. Dichos estudios se corroboran con los resultados obtenidos en nuestros experimentos, dado que las quinolinas corresponden a 2 anillos aromáticos, muy similares al naftaleno, pero con un N en posición 1. Otro estudio realizado por Inouye H., y Kischner D.A. (1991). Folding and function of the myelin proteins from primary sequence data. J. Neurosc. Res. 28: 1-17 a un dominio de tau ubicado en extremo C-terminal, que consiste en un pequeño péptido involucrado en la nucleacion y polimerización en PHFs, indica una posible interacción entre tirosinas, lo que sugiere que inhibidores podrían unirse a los residuos aromáticos mediante interacciones Hunter C.A., Sanders J.K.M. (1990). The nature of n-dnteractions. J. Am. Chem. Soc. 1 12: 5525-5534). ENSAYOS DE DESPLAZAMIENTO CON 3H-AST IN VITRO. Sobre la base de los hallazgos en nuestro laboratorio y por otros autores que derivados de bencimidazoles se unen específicamente y con gran afinidad a la proteína tau y a los NFTs (Rojo L, Avila M., Chandia M., and Maccioni R.B. (2007). 18F Lansoprazole as PET radiotracer. Chemical and biological studies towards the development of a New PET Radiotracer. International Conference on Clinical PET and Molecular Nuclear Medicine 10-14 Noviembre. Bangkok; Okamura N., Suemoto T., Furumoto S., Suzuki M., Shimadzu H., Akatsu H., Yamamoto T., Fujiwara H., Nemoto M., Maruyama M., Arai H., Yanai K., Sawada T., Kudo Y. (2005). Quinoline and bencimidazole derivatives: candidate probes for in vivo imaging of tau pathology in Alzheimer's disease. J. Neurosci. 25: 10857-10862), se planteó la posibilidad de que las quinolinas pudiesen desplazar esta interacción. Ello sobre la base de su estructura similar en el núcleo del anillo bencénico y el N en posición 1 del anillo del bencimidazol, así podría desplazar al bencimidazol y unirse a los agregados de la proteína tau \n vitro. Para este propósito se utilizó H3-AST, y los resultados muestran que las constantes de inhibición (Ki) obtenidas fueron muy altas (superiores a 10 μΜ), indicando que estas drogas no desplazan al radioligando, por lo que la única opción para obtener la afinidad de estos compuestos por la proteína sería el utilizar una quinolina radiomarcada, lo que no fue posible obtener comercialmente. En suma, este experimento mostró que las dos quinolinas no tienen la capacidad de desplazar a los bencimidazoles usados, lo que sugiere que debido a que estas quinolinas poseen una Ki muy alta, poseen una afinidad por tau menor que el bencimidazol o bien que los sitios de interacción de ambas moléculas con la proteína tau son distintos, un aspecto que se debe investigar.
ENSAYOS DE "DOCKING". En este contexto, también se realizaron ensayos de "docking", para predecir la forma en interactúan las quinolinas con la proteína tau. Para realizar dichos estudios fue necesario obtener un fragmento de la proteína tau cristalizada. Este punto es clave, debido a que si no existe la estructura cristalizada de la proteína, no es posible realizar el "docking". Estudios realizados por Glabe C.G. (2004). Conformation dependent antibodies target diseases of protein misfolding. Trends Biochem Sci. 29: 542-547, indican que la estructura terciaria de anticuerpos monoclonales es una herramienta esencial para la investigación de los mecanismos de ensamble patológicos de proteínas intrínsicamente desordenadas (IDPs), como es el caso de tau. Estudios previos realizados por Csokova (Csóková N, Skrabana R, Urbániková L, Kovácech B, Popov A, Sevcík J, Novák M. (2006).Preparation, crystallization and preliminary X-ray analysis of the Fab fragment of monoclonal antibody MN423, revealing the structural aspects of Alzheimer's paired helical filaments. Protein Pept Lett. 13:941-4) encontraron que el Anticuerpo monoclonal MN-423 se une específicamente a un núcleo estructural de PHF/tau, que corresponde a una secuencia de 93-95 aminoácidos del C-terminal de tau resistente a pronasa. Utilizando esta secuencia de tau (aminoácidos 306-391), los inventores realizaron la cristalización de la proteína durante 3 meses, donde el análisis detallado mostró que un pentapéptido 387DHGAE391 que contribuye a la reactividad del anticuerpo, está involucrado en el ensamble de la proteína tau en estructuras de PHFs, convirtiendo la secuencia conocida en estructura beta durante el ensamble de los filamentos (Sevcik J., Skrabana R., Dvorsky R., Csokova N., Iqbal K., Novak M. (2007). X-ray structure of the PHF core C-terminus: insight into the folding of the intrinsically disordered protein tau in Alzheimer's disease. FEBS Lett. 581 (30): 5872- 5878). Además es importante agregar que esta secuencia se encuentra en una zona que es altamente conservada dentro de tau, correspondiente a las regiones repetitivas del C- terminal. Basados en la información anterior y utilizando esta secuencia, se realizaron los estudios de "docking", los cuales representan la primera aproximación en base a modelos matemáticos entre la interacción de quinolinas y tau. A través de estos ensayos se determinó que estas quinolinas, específicamente THQ 4S (ver tabla 1 anterior) tienen energías de "docking" favorables para la interacción entre estos compuestos y un fragmento de la proteína tau. THQ 4S (ver tabla 1 anterior) fue elegida para este ensayo debido a las ventajas de sus propiedades moleculares y de ser más lipofílico frente a THQ 55 (ver tabla 1 anterior). El "docking" de THQ 55 (ver tabla 1 anterior) con este fragmento de tau es un aspecto que aún queda por investigar, aunque posiblemente las energías de interacción de THQ 55 (ver tabla 1 anterior) sean más negativas que las de THQ 4S (ver tabla 1 anterior), debido a que THQ 55 (ver tabla 1 anterior) presenta grupos donantes de electrones en los sustituyentes, los cuales podrían influir en la resonancia de los anillos aromáticos de la quinolina y deslocalizar los electrones dejando así el N más negativo y favoreciendo la interacción con una proteína catiónica como es el caso de tau. Esto además se corrobora con un dato importante obtenido de esta aproximación, en que este N de la quinolina (Figura 22, indicado con flechas blancas) interacciona con un O que sobresale en el extremo final del péptido, correspondiente a una pequeña cavidad que se forma entre la Ala y Glu (estructuras "pocket"). Este nitrógeno podría estar reemplazando a un N de la Arg 106 del Αβ específico MN-423. A pesar de que los resultados obtenidos son relevantes, no se puede determinar con exactitud el dominio de unión, debido a que el péptido es muy pequeño y sólo nos da una aproximación de una posible interacción entre tau y las quinolinas.
Así, los objetivos de esta invención estuvieron enfocados principalmente hacia la búsqueda de moléculas ligandos de unión a tau polimerizada, como potenciales bloqueadores de la agregación de tau antes de la formación de NFTs. Los estudios de microscopía fina, ensayos de sedimentación y turbidimétricos, permitieron comprobar directamente la capacidad de estas drogas de inhibir la agregación de tau.
Por otra parte, estas moléculas presentan una liposolubilidad relativamente alta, y poseen propiedades moleculares similares a otros fármacos que atraviesan la BHE, con lo cual pueden ejercer eventualmente una acción a nivel cerebral. De estos resultados se concluye que estas quinolinas y sus derivados pueden ser usados como potenciales fármacos inhibidores de la agregación de tau, en una posible vía terapéutica para el tratamiento de la EA.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Derivado de quinolina de formula
Figure imgf000047_0001
, donde R2 es 2-(4-aminofenilo) o 2-(4-metilfenilo) y R6 es metilo, útiles como inhibidores de la agregación de la proteína tau.
2. El derivado de quinolina de la reivindicación 1 , en donde R2 es 2-(4-aminofenilo) y R6 es metilo.
3. El derivado de quinolina de la reivindicación 1 ó 2, útil para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA).
4. Uso de un derivado de quinolina de formula
Figure imgf000047_0002
donde R2 es 2-(4-aminofenilo) o 2-(4-metilfenilo) y R6 es metilo, para preparar un medicamento útil para inhibir la agregación de la proteína tau.
5. El uso de la reivindicación 4, en donde R2 es 2-(4-aminofenilo) y R6 es metilo.
6. El uso de la reivindicación 4 ó 5, para preparar un medicamento útil para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
7. Método para inhibir la agregación la proteina tau, que comprende administrar un derivado de quinolina de formula
Figure imgf000047_0003
, donde R2 es 2-(4-aminofenilo) o 2-(4-metilfenilo) y
R6 es metilo.
8. El método de la reivindicación 8, en donde R2 es 2-(4-aminofenilo) y R6 es metilo.
9. Método para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, que comprende administrar un derivado de quinolina de formula
Figure imgf000048_0001
, donde R2 es 2-(4-aminofenilo) o 2-(4-metilfenilo) y
R6 es metilo.
10. El método de la reivindicación 9, en donde R2 es 2-(4-aminofenilo) y R6 es metilo.
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