KR102144323B1 - 글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 s-옥사이드를 포함한 제약학적 조성물 - Google Patents

글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 s-옥사이드를 포함한 제약학적 조성물 Download PDF

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빅토르 게오르기비치 안토노프
올렉 알렉산드로비치 이그나텐코
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오브쉐스트보 에스 오그라니체노이 오트베츠트벤노스츄 ＂이바 파름＂
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Abstract

감염성 및 비감염성 질환의 치료에서 약물학적으로 활성인 화합물의 용량-관련 독성을 제거하고 치료적 활성을 증강시키기 위한 글루타티온 다이설파이드 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염 및 다음 구조의 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염을 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다:
Figure 112019123481890-pct00017

전형적으로, 조성물은 총 조성물의 0.01 내지 10 중량%의 양으로 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드를 포함하며, 추가적으로 Me-S-글루타티온 결합을 함유하는 배위 화합물(들)의 형태로 금속 (Me)을 포함하고, 상기 금속은 백금족으로부터 선택되며, 전형적으로 백금이다. 환자에게 투여되는 d-금속 배위 화합물의 양은 10-3 내지 10-15 mol/kg 체중이다. 조성물은 그것의 치료적 활성을 증가시키고 용량-관련 독성을 제거하기 위하여 항응고제, 인자 Xa 억제제, 항미생물제 또는 항바이러스제인 약물학적으로 활성인 화합물과 함께 사용될 수 있다.

Description

글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드를 포함한 제약학적 조성물
본 발명은 제약 산업 및 의학, 즉 의약의 제조 분야에 관한 것이고, 약물학, 의학 및 수의학에 사용될 수 있다.
약물학적 분자의 치료 효능을, 그것의 약동학 및/또는 약력학을 최적화함으로써, 및/또는 약물 분자의 화학적 변형 및/또는 또 다른 화학적 화합물 또는 화합물들과의 그것의 수반되는 사용을 통해 독성을 감소시킴으로써 증가시키는 것은 생리적으로 보다 최적의 용량으로 약물의 활성을 나타내는 새로운 세대 약물을 개발하기 위한 방향 중 하나이다.
현재, 글루타티온 트라이펩타이드, γ-글루타밀시스테이닐 글리신의 다이머이고, 상기 트라이펩타이드의 두 분자가 시스테인 잔기 사이의 공유 이황화 결합을 통해 서로에게 연결되어 있는 산화된 글루타티온 (산화된 글루타티온, 글루타티온 다이설파이드, GSSG)이라는 물질이 알려져 있다. 트라이펩타이드 글루타티온 (환원된 글루타티온, GSH) 및 이것의 다이머 GSSG는 둘 다 천연 대사산물이고 인간 및 동물의 조직 및 생물학적 유체에 존재한다 [Isabella Dalle-Donne et al. S-glutath이온ylat이온 in protein redox regulat이온/Free Radical Biology & Medicine, 2007, V. 43, pp. 883-898;
Figure 112019123481890-pct00001
Figure 112019123481890-pct00002
Figure 112019123481890-pct00003
Figure 112019123481890-pct00004
.
산화된 글루타티온 (GSSG)은 자체적으로 다양한 약물학적 활성을 가진 것으로 기술분야에 알려져 있다. 특히, 산화된 글루타티온이 항바이러스, 항박테리아, 항종양, 항섬유화 작용을 포함한, 신테의 복잡한 보호 반응을 제어하는 광범위한 사이토카인의 생성을 증강시키는 능력이 제시된다.
그러므로, 특허 RU 2089179 C1, publ. 10.09.1997] 및 특허 WO 9721444 A1, publ. 19.06.1997]은 종양학적, 감염성, 면역학적, 신생물 및 혈액학적 질환의 치료를 위해 사용되는 산화된 글루타티온 및 그것의 제약학적 조성물의 용도를 개시하며, 상기에서 사이토카인 및 조혈 인자의 내인성 생성의 자극은 적절하다.
특허 RU 2206334 C1, publ. 20.06.2003], 특허 RU 2208452 C1, publ. 20.07.2003], 및 특허 RU 2208453 C1, publ. 20.07.2003]은 각각 환경의 열적 효과, 호흡 가스 매체의 증가된 압력 및 멀미에 대한 신체의 저항 (내성)을 증가시키기 위한 산화된 글루타티온을 포함하는 제약학적 조성물의 용도를 개시한다.
산화된 글루타티온의 투여 형태는 사용에 대해 인증되며 면역조절 효과, 간보호 효과, 조혈 효과 뿐만 아니라, 신체에서 산화환원 과정을 조절하는 약물학적 효과를 나타낸다 [http://www.rlsnet.ru/tn_index_id_10764.htm].
또한 기술분야에는 사이토카인 및/또는 조혈 인자의 내인성 생성뿐만 아니라 정상 및 형질전환된 세포에서 대사, 증식, 분화 및 세포자멸사의 과정의 조절을 제공하며 암, 감염성, 면역학적, 혈액학적, 허혈성, 신경이영양성, 대사성 질환들의 치료에 사용되는, 산화된 글루타티온 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 염의 백금 또는 팔라듐 화합물과의 합성물 (특히 산화된 글루타티온의 2나트륨 염과 시스-다이아미노다이클로로백금과의 합성물)을 개발하는 것이 알려져 있다 [특허 RU 2144374 C1, 2000년 1월 20일 공개; 특허 RU 2153350 C1, 27.07.2000년 7월 20일 공개; 미국 특허 6,312,734 B1, 2001년 11월 6일 공개].
또한, 글루타티온 다이설파이드를 포함하는 조합된 작용제가 알려져 있다.
그러므로, 문서 [특허 출원 WO　1998030228　A1, 16.07.1998년 7월 16일 공개]는 인플루엔자 바이러스 감염의 치료를 위한 산화된 글루타티온 (GSSG) 단독의 또는 글루타티온의 환원된 형태 (GSH)와 조합된, 또는 아스코르베이트-2-포스페이트와 조합된, 또는 N-아세틸-L-시스테인과 조합된 산화된 글루타티온의 용도를 개시한다.
특허 RU 2482868 C1, 2013년 5월 27일 공개]은 저혈당 활성, 저콜레스테롤혈증 활성, 저지혈증 활성 및/또는 항산화 활성을 가진, 2나트륨 염의 형태의 글루타티온 다이설파이드 (GSSG)와 팔라듐, 구리 및 환원된 글루타티온 (GSH)에 의해 형성된 배위 화합물과의 조합을 기술한다.
가장 가까운 유사체는 특허 RU　2153351 C2 (2000년 7월 27일 공개)에 개시된 약물인 제약학적 조성물로, 연장제(prolongator)와 조합된 산화된 글루타티온 GSSG 및 이것의 제약학적으로 허용되는 염을 포함하며, 이 조성물은 사이토카인 및 조혈 인자의 내인성 생성을 조절한다. 아스코르브산, 다이메틸설폭사이드, 이노신 (하이포크산틴-9-D-리보푸라노사이드), 시스타민 (2,2'-다이티오비스[에틸아민]), 백금 화합물 (예를 들어, 백금 염화물)이 산화된 글루타티온의 작용의 연장제로서 사용된다.
상기 공지된 약물뿐만 아니라 모든 상기 언급된 작용제의 단점은 많은 요인으로 인한 의학에서의 제한된 사용이다. 특히, GSSG는 투여 후 5 내지 10초 범위의 매우 짧은 반감기를 가지며, 그것은 약물의 원하는 치료 효과를 얻기 위해 정확한 투여 장소를 결정하기 위해, 또는 투여의 용량 및 횟수를 증가시키기 위해 의료진의 약간의 훈련 및 적절한 자질을 필요로 한다. 상기 문제점은 RU 2153351에서 기술된 다수의 연장 화합물을 사용함으로써 부분적으로 해결되지만, 그것은 환자에 대한 작용제의 잠재적 위험을 증가시키며 GSSG와 연장제의 조합의 세심한 선택을 필요로 한다. 다른 약물과의 복잡한 치료법에서 GSSG와 연장제의 조합의 병용 사용 또는 순차적 사용은 추가적으로 투여된 치료법의 독성 프로파일의 부정적 변화의 부재 하에 예상된 치료 효과를 얻기 위해 약동학의 유사성을 고려할 것을 필요로 한다. GSSG와 임의의 연장제의 조합의 개발은 추가적인 가공 장비의 사용, 추가적인 단계 또는 단계들을 약물 물질 및 상응하는 투여 형태의 생성 과정에 포함시키는 것, 부형제 목록의 확대를 필요로 한다. 생물학적 활성, 치료법의 효능 및 안전성을 감소시키는, 약물의 치료 효능에 불리하게 영향을 미치는 병리 과정에서의 대사의 특징과 관련된 산화된 글루타티온-기반 약물의 사용에서 기존의 한계에도 불구하고, GSSG는 그것의 약물학적 해결책을 위한 의심의 여지가 없는 관심의 대상이다.
본 발명의 목적은 고효능을 가지며 다양한 약물치료제 그룹으로부터의 약물학적으로 활성인 분자를 향한 활성을 강화시키는 신규한 제약학적 조성물을 제공하는 것이다. 특히, 발명의 목적은 약력학, 궁극적으로 GSSG를 그것을 필요로 하는 환자에게 흡입에 의해, 장으로, 비경구로, 단독으로 및 단일 투여 형태의 다른 약물학적으로 활성인 물질과 조합되어 외부적으로 적용될 때 필요한 치료 효과를 얻기 위해 더 적은 용량으로 사용하는 것을 가능하게 만들기 위하여 GSSG의 약력학을 최적화하는 것이다. 약물학적으로 활성인 물질은 항미생물 및 항바이러스 약물, 항응고제, 인자 Xa 억제제; 세포막 이온 채널의 활성의 조절제; 그에 대한 약력학 및/또는 약동학의 최적화, 및/또는 독성의 감소가 이루어질 다른 의약품을 포함한, 임의의 약물치료제 그룹으로부터 선택될 수 있다.
제약학적 조성물 및 제약학적 조합물은 둘 다 추가적인 부형제를 포함하는 의약으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 기술적 결과는 단일 또는 과정 용량을 감소시키는 것, 그러므로, 약물학적으로 활성인 물질의 확립된 치료 용량에서 용량-관련 독성을 감소시키는 것; 다양한 약물치료제 그룹으로부터의 치료적 활성제의 효능을 증강시키는 것, 따라서 그것의 단일 또는 과정 용량을 감소시키고, 그로므로 용량-관련 독성을 감소시키는 것이다.
상기 기술적 결과는 치료적 유효량의 글루타티온 다이설파이드 (GSSG) 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염과 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 (GS(O)SG) 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염의 조합을, 제약학적으로 허용되는 부형제 및 임의의 약물치료제 그룹으로부터의 약물학적으로 활성인 분자와 함께 포함하는 약물인 신규한 제약학적 조성물을 제공함으로써 달성되며, 그에 대해 단일 또는 과정 용량을 감소시키는 것과, 따라서 용량-관련 독성의 감소가 확립되었다.
전형적으로, 약물학적으로 활성인 화합물은 다음의 약물치료제 그룹으로부터 선택된다:
- 항응고제, 인자 Xa 억제제, 특히 아미딘 염산염;
- 항미생물 및 항바이러스 약물, 특히 목시플록사신(moxifloxacin), 항광견병 백신의 항원성 물질, 인테페론 α;
- 세포막 칼슘 채널의 활성의 조절제, 특히 니페디핀(니페디핀); 이것에 대한 약력학 및/또는 약동학의 최적화, 및/또는 독성 감소가 이루어질 것이다.
보통, 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 양은 총 조성물의 0.01 내지 10 중량%이다.
또한, 조성물은 바람직하게는 백금 군, 보다 바람직하게는 백금으로부터의, Me-S-글루타티온 결합을 함유하는 배위 화합물(들)의 형태로 존재하는, d-금속 (Me)을 추가로 포함할 수 있다.
조성물에 배위 화합물로서 첨가된 d-금속의 양은 주어진 d-금속에 대한 생리적으로 헝요되는 값을 초과하지 않는다. 그러나, 이 값은 치료 효과를 이루기 위하여 다량의 금속이 배위 화합물 형태로 첨가되는 경우에 초과될 수 있다.
조성물 중의 d-금속의 양은 1 kg의 조성물당 1 x 10-10 mol 내지 1 x 10-3 mol로 달라지며, 바람직하게는 1 kg의 조성물당 1 x 10-5 mole이다.
제공된 조성물은 외부, 흡입, 장내 또는 비경구 투여를 위해 제조될 수 있다.
구성요소의 특징
글루타티온 다이설파이드 (또는 산화된 글루타티온, GSSG)는 트라이펩타이드 글루타티온, γ-글루타밀시스테이닐글리신의 다이머이며, 상기 트라이펩타이드의 두 분자는 시스테인 잔기 사이의 공유 이황화 결합을 통해 서로에게 연결되어 있다. 본 발명에 따르면, 알칼리 또는 알칼리 토금속과의 염 형태의 글루타티온 다이설파이드는 당업계의 임의의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 [특허 RU 2144374 C1, 20.01.2000년 1월 20일 공개].
글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 (또한 글루타티온 티오설피네이트 또는 GS(O)SG로 언급됨)는 다음의 구조를 가진다:
Figure 112019123481890-pct00005
글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드는 산화된 글루타티온에 유사한 약동학에 의해 특징지어지며, 따라서, 이것은 산화된 글루타티온 분해의 효소의 음성 조절제이며, 그러므로, GSSG에 대한 연장제로서 작용하고, 그것의 약동학을 최적화하는 것은 산화된 글루타티온의 생물학적 효과를 강화하고, 그것은 GSSG의 약력학을 최적화하며 원하는 치료 효과를 얻기 위해 더 적은 용량의 GSSG의 사용을 허용한다. 더 적은 양으로의 이행은 약물의 활성 원리의 독성을 감소시키기 위한 핵심 조건 중 하나이다. 그러므로, 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드는 약동학, 약력학을 최적화하고, GSSG 사용의 안전성을 증가시키며, 이들은 모두 GSSG와 비교하여 치료 실제에서 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 GSSG의 병용 사용을 위한 약물경제학적 기준 최적화를 위한 조건이다.
글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 분자는 약한 분자간 상호작용, 예컨대 반 데르 발스 상호작용을 형성할 수 있고, 이때 약물의 활성 원리는 약동학 및/또는 약력학, 및/또는 독성에 영향을 미침으로써 치료 특성을 최적화한다.
"배위 화합물"은 착화제로 불리는 중심 원자 (이온) 주변에 특정 순서로 배치된 (배위된) 이온 또는 리간드로 불리는 중성 분자의 기를 함유하는 화합물을 나타낸다.
"d-금속", "전이 금속" 및 "전이 원소"는 동일하며, 주기율표의 화학적 원소를 나타내고, 이때 전자는 d-부준위(sublevel)를 채운다.
"제약학적으로 허용되는 부형제"는 당업자에게 알려져 있고 외부의, 흡입, 장내, 비경구 투여 또는 다른 투여 방법에 대한 본 발명의 조성물을 포함하는 의약을 얻기에 적합한 물질이다. 예를 들어, 임의의 공지된 제약학적으로 허용되는 무기 또는 유기 담체, 보존제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 삼투압을 조절하기 위한 염, 완충제, 차폐제 또는 항산화제 및 다른 필요한 구성요소가 부형제로서 사용될 수 있다.
"제약학적으로 허용되는"은 환자에게 투여되었을 때 독성 또는 다른 바람직하지 못한 효과를 유발하지 않는 화합물을 의미한다.
"치료적으로 유효한 작용제"는 치료 목적을 위해 사용되는 임의의 물질을 의미한다.
"환자"는 인간 또는 다른 포유류, 조류, 양서류 또는 어류를 나타내며, 그 신체에 조성물 또는 공지된 약물학적으로 활성인 화합물과의 조합, 특히, 인자 Xa-억제제 아미딘 염산염; 항미생물제 목시플록사신, 항바이러스 항-광견병 백신의 항원성 물질, 항바이러스제 인터페론 α; 칼슘 채널 억제제 니페디핀과의 조합이 한 방법 또는 다른 방법으로 투여된다.
도 1은 37℃의 온도에서 보관된 다양한 용액에 용해된 단클론성 항체의 제제의 전기영동을 도시한다. 레인 1 - 크기 표준 (Fermentas PageRulerTM 사전염색된 단백질 사다리); 레인 2 ― 샘플 2; 레인 3 ― 샘플 3, 레인 4 ― 샘플 4, 레인 5 ― 샘플 1.
도 2는 생리적 조건을 시뮬레이션한 조건 하에서 혈청 샘플 중의 보관으로부터 발생되는 단클론성 항체의 구조적 중간체에 대한 HPLC 데이터를 도시한다 ((1) ― 샘플 1; (2) ― 샘플 2; (3) ― 샘플 3; (4) ― 샘플 4).
도 3은 평균 INR을 도시한다: (1)　― 표 1로부터 얻어진 아미딘 염산염 물질의 경우, 및 (2) ― 아미딘 염산염 물질 및 표 2로부터 얻어진 보조제의 혼합물의 경우 (보조제는 글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 조합을 포함하는 조성물임).
도 4는 Ca2+ 이온을 함유한 배지에서 (1), (2) 및 칼슘-유리 배지에서 (3), (4) 복강의 대식세포에서, ATP에 의해 (1), (3) 및 탑시가르긴(thapsigargin)에 의해 (2), (4) 유도된 Ca2+-신호를 도시한다. 수직　―　시토졸 중의 Ca2+의 농도, nM. 수평　―　시간, 분.
도 5는 생리 식염수에서 (1) 또는 명목상 칼슘-유리 배지에서 (2), (3) 대식세포에서 휴식기의 [Ca2+]i 및 200　μM ATP에 의해 유도된 (1, 2) 및 0.5 μM의 탑시가르긴 (TG)에 의해 유도된 (3) Ca2+-신호에 미치는 글루타티온 다이설파이드의 영향을 도시한다.
도 6은 휴식 시의 세포내 칼슘 농도 [Ca2+]i 및 ATP에 의해 유발된 Ca2+-신호에 미치는 실시예 3의 조성물 (제제)의 영향을 도시한다. 제제는 선택적 칼슘 채널 억제제 니페디핀의 억제 효과를 무효화하며 (1), 이때 약물 자체의 효과는 환원제 다이티오트레이톨 (DTT)에 의해 억제된다 (2).
본 발명은 성질상 예시적이고 청구되는 청구항의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하지 않는 발명의 특정 구체예에 의해 예시된다.
약어:
GSH ― 글루타티온 (환원된 글루타티온),
GSSG ― 산화된 글루타티온 (글루타티온 다이설파이드),
GSO3H ― 글루타티온설폰산,
GS(O)SG ― 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 또는 설폭사이드;
GS(O2)SG ― 글루타티온 다이설파이드 S-다이옥사이드;
HPLC ― 고성능 액체 크로마토그래피;
PAAG ― 폴리아크릴아미드 겔;
SDS ― 도데실 황산 나트륨.
조성물의 제조 방법
방법 A
L-글루타티온으로부터 유래된 글루타티온 다이설파이드의 나트륨 염 (실시예　2)의 용액에, 과정에 따라 합성된 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 (실시예　1)가 첨가되었다. 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 양은 총 조성물의 0.1 내지 10 중량%일 수 있다. 실시 구체예에서, 특히 실시예 3 및 4에서, 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 양은 총 조성물의 중량을 기준으로 각각, 2% 및 4%였다. 제공된 방법은 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 함량을 매우 정확하게 제어하는 것을 가능하게 만든다.
방법 B
수산화 나트륨의 수용액 중의 글루타티온 다이설파이드 나트륨 염의 얻어진 용액에 과잉량의 수산화 수소가 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드를 제자리에서 생성하기 위하여 저온, 보통 0 내지 5℃에서 첨가되었다. 한 구체예 (실시예 5)에서, 127 g의 6% 과산화수소가 +3℃ 이하의 온도에서 첨가되었다. 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 양은 총 조성물의 5 중량%였다.
방법 A 또는 B에 의해 얻어진 조성물은 단백질의 천연 형태, 즉 단백질이 기능적 활성을 가지는 형태, 특히 이황화 결합을 통해 치료 활성을 가지는 기능적으로 활성인 분자로 연결된 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄 펩타이드 사슬로 구성되는 단클론성 항체인 단백질 생성물로 표시되는 약물의 형태를 형성하고 안정화시키는 것을 허용하는 것인, 단백질의 이황화 결합의 형성 및 안정성 (실시예 5 및 12), 및 그러므로 단백질의 접힘에 영향을 미치는 능력에 의해 특징지어진다(실시예 5).
방법 A 또는 B에 의해 얻어진 조성물은 생체이물 해독의 제2 단계의 효소의 발현을 증가시키는 능력에 의해 특징지어지는데 (실시예 13), 그런 능력은 그것을 독성조정제, 즉 투여된 약물병용치료제의 용량-의존성 부작용의 합병증을 포함한, 다양한 화학적 분자의 독성 영향을 감소시키는 작용제로서 단독으로 사용하는 것을 가능하게 만든다.
방법 A 또는 B에 의해 얻어진 조성물은 다른 공지된 약물학적으로 활성인 작용제 및 광범위하게 사용된 치료 분자: 특히, 항응고제, 인자 Xa 억제제 아미딘 염산염 (실시예 8); 항생물질 목시플록사신; 항바이러스제, 항-광견병 백신의 항원성 α물질 및 인터페론 (실시예 9, 10, 14); 칼슘 채널 억제제 니페디핀 (실시예 11)과 함께 의약의 제조를 위해 조합하여 사용될 수 있고, 이것들에 대해 용량 감소 및, 따라서 용량-관련 독성의 감소가 확립되어 있다.
실시예 1. 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 (GS(O)SG)의 제조 방법.
100 ml의 물 중의 100 g의 환원된 L-글루타티온 물질 (GSH)의 용액에, 아세트산을 0 내지 5℃의 온도에서 30 내지 40분 동안 교반하면서 한 방울씩 첨가하였다. 한 방울씩의 첨가 후에, 반응물을 5℃ 이하의 온도에서 1시간 동안 교반하였고, 그런 후에 반응물을 24시간 동안 냉동 및 동결건조시켰다. 110 g의 물질을 백색 발포체로서 얻었고, 그것은 HPLC 분석에 따르면 구성요소의 혼합물을 함유한다 (40% GSO3H, 55% GS(O)SG, 5% GS(O2)SG).
동결건조물을 400 ml의 물에 용해시키고 예비용 HPLC (칼럼 YMC-Actus Triart Prep C18-S 50x250 mm, 용출액으로서 물을 사용함)를 사용하여 정제하였고, 95%를 넘는 순도를 가지는 표제 화합물을 함유한 분획을 조합하여, 700 ml의 부피로 증발시키고, 동결건조시켰다. 95+% (HPLC)의 순도를 가지는, 42 g의 원하는 화합물 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드를 얻었다 (부분입체 이성질체의 혼합물임).
실시예 2. 산화된 글루타티온 (글루타티온 다이설파이드)의 제조.
7 L의 물 중의 2760 g의 환원된 L-글루타티온의 현탁액에, 2245 g의 수산화 나트륨의 16% 용애을 17℃ 이하의 온도에서 교반하면서 첨가하였다. 글루타티온의 완전한 용해 후에, 혼합물을 냉각시키고 2546 g의 6% 과산화수소를 30 내지 50 ml/분의 속도로 +15℃ 이하의 온도에서 교반하면서 첨가하였다. 과산화물 첨가 후에, 결과적으로 얻어진 용액을 예정된 온도에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후에 (HPLC 대조군), 11.5 L의 물 중의 2.95 kg의 글루타티온 다이설파이드의 2나트륨 염을 함유한 용액을 얻었고, 그것을 3℃로 냉각시켰다. 생성물, 글루타티온 다이설파이드의 2나트륨 염의 화학적 순도는 98.5% 이상 (HPLC 대조군)이었고, 그것은 생성물 분리를 위한 추가의 과정을 필요로 하지 않는다.
실시예 3. 주어진 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 함량을 가진 글루타티온 다이설파이드의 조성물 (약물)의 제조.
실시예 2에서 제조된 글루타티온 다이설파이드 2나트륨 염 (11.5 L의 물 중의 2.95 kg)에, 실시예 1에 따라 얻어진 60 g의 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드를 3 내지 5 C의 온도에서, 5분 동안 철저하게 혼합하면서 첨가하였고, 그 용액을 120분 동안 5℃의 온도에서 방치하였으며, 그런 후에 동결건조하였다.
실시예 4. 주어진 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 함량을 가지는 글루타티온 다이설파이드의 조성물 (약물)의 제조.
실시예 1에 따라 제조한 120 g의 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드를 실시예 2에서 제조한 글루타티온 다이설파이드 2나트륨 염 (11.5 L의 물 중의 2.95 kg)에 5분 동안 철저하게 혼합하면서 첨가하고, 그 용액을 120분 동안 5 C의 온도에서 방치하였고, 그런 후에 동결건조시켰다.
실시예 5. 주어진 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 함량을 가지는 글루타티온 다이설파이드 2나트륨 염의 조성물의 제조.
7 L의 물 중의 2760 g의 환원된 L-글루타티온의 현탁액에, 2245 g의 16% 수산화 나트륨 용액을 17℃ 이하의 온도에서 교반하면서 첨가하였다. 글루타티온의 완전한 용해 후에, 혼합물을 냉각시키고 2546 g의 6% 과산화수소를 30 내지 ml/분의 속도로 교반하면서 +15℃ 이하의 반응물 온도에서 첨가하였다. 과산화물 첨가 후에, 결과적으로 얻어진 용액을 예정된 온도에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후에 (HPLC 대조군), 반응물을 3℃로 냉각시켰다. 생성물, 글루타티온 다이설파이드 2나트륨 염의 화학적 순도는 98.5% 이상 (HPLC 대조군)이었다.
그런 후 추가적인 127 g의 6% 과산화수소를 30 내지 50 ml/분의 속도로 + 3℃ 이하의 온도에서 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 +3℃에서 방치하였고 그런 후 동결건조하였다.
결과적으로 얻어진 조성물은 95%의글루타티온 다이설파이드 2나트륨 염 및 4.5 내지 5.0%의 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 2나트륨 염 (HPLC 대조군)을 함유하며, 이것은 생성물의 추가의 정제 과정을 필요로 하지 않는다.
실시예 6. 주어진 함량의 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 및 Pt-S를 포함하는 글루타티온 다이설파이드의 조성물의 제조.
7 L의 물 중의 2760 g의 환원된 L-글루타티온의 현탁액에, 2245 g의 16% 수산화 나트륨 용액을 17℃ 이하의 온도에서 첨가하였다. 글루타티온의 완전한 용해 후에, 혼합물을 냉각시키고, 0.5 g의 시스-백금을 첨가하고 2546 g의 6% 과산화수소를 30 내지 50 ml/분의 속도로, 교반하면서 + 15℃ 이하의 반응물의 온도에서 첨가하였다. 과산화물 첨가가 끝났을 때, 결과적으로 얻어진 용액을 예정된 온도에서 추가적으로 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완료 후에 (HPLC 대조군), 11.5 L의 물에 2.95 kg의 글루타티온 다이설파이드 2나트륨 염을 함유한 용액을 얻었고, 이것을 3℃로 냉각시킨다. 생성물, 글루타티온 다이설파이드 2나트륨 염의 화학적 순도는 98.5% 이상 (HPLC 대조군)이었고, 이것은 생성물 분리를 위한 추가의 과정을 필요로 하지 않는다. 용액을 3℃로 냉각시키고 60 g의 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드를 첨가하고, 철저하게 5분 동안 혼합시킨 후, 용액을 120분 동안 5℃에서 방치하였고, 그런 후 동결건조하였다.
실시예 7. 실시예 5에서 얻어진 조성물의 접힘 활성의 분석.
단클론성 항체 제제의 조성:
단클론성 항체　―　10 mg/ml;
글리신　―　2 mg/ml;
폴리소르베이트 80　―　0.05 mg/ml;
염화나트륨 ―　7 mg/ml;
시트르산 단일수화물　―　2.101 mg/ml;
주입용 물.
생리적 조건을 재생하기 위하여, 인간 혈청을 자발적 서면 동의로 얻었다. 혈청의 저장 은행의 혈청 번호는 O-17-1002이다.
재접힘 실험에서, 다음을 사용하였다:
샘플　1　―　50 μl의 양의 단클론성 항체의 제제 + 1 ml의 혈청 O-17-1002의 조성물.
샘플　2　―　단클론성 항체 + 50 μl의 양의 실시예 3에서 얻어진 0.2 mM의 조성물의 제제 + 1 ml의 혈청 O-17-1002의 조성물.
샘플　3　―　단클론성 항체 + 50 μl의 양의 실시예 4에서 얻어진 0.2 mM의 조성물의 제제 + 1 ml의 혈청 O-17-1002의 조성물.
샘플　4　―　단클론성 항체 + 50 μl의 양의 실시예 5에서 얻어진 0.2 mM의 조성물의 제제 + 1 ml의 혈청 O-17-1002의 조성물.
샘플 1 및 2가 들어있는 바이알을 37℃에서 저장하였다. 24시간 후에, 바이알을 온도조절잘치에서 제거하여 저장 중의 단클론성 항체의 안정성에 대해 인체의 생리적 환경의 시뮬레이션 조건 하에서 상이한 온도에서 분석하였다.
안정성 연구의 결과를 먼저 환원 조건 하의 폴리아크릴아미드 겔 (PAAG)에서의 전기영동 분리에 의해 분석하였다.
전기영동을 비-균일성 (단계식) 완충 시스템 (디스크-전기영동)에서 변성 조건에서 15% PAAG에서 샘플 농축화 단계에서 등속영동(ITP) 메커니즘을 사용하여 수행하였다. 샘플을 다음 방법에 의해 준비하였다: 세포를 원심분리에 의해 침전시키고 200 μL의 완충액 (0.2 M Tris-HCl pH 7.5; 0.2 M NaCl; 0.01 M 아세트산 나트륨; 0.01 M b-머캡토에탄올 및 5% 글리세롤)에 재현탁한 후 2분 동안 끓였다.
전기영동을 수행하기 위하여, 여러 완충제 용액의 시스템을 사용하였다: 양극 완충제는 Tris 염기 0.1 M; 트리신 0.1 M; SDS 0.1% (말단 음이온　―　트리신)였고; 음극 완충제는 Tris 염기 0.2 M pH 8.9 (납 음이온 ― Cl-)였다. 농축화 겔 T = 2.5 내지 3%, 분리 겔 T = 5 내지 15% 및 C = 2 내지 5% (여기서 T는 겔 중의 단량체의 상대적인 함량이고, C는 단량체 합 중의 가교결합제의 함량임). 세포 용해물의 전기영동을 2% SDS에서 변성 조건 하에 수행하였다.
단백질 조제물의 전기영동도 (도　1)를 ImageJ 프로그램을 사용하여 분석하였다. 이 프로그램은 다양한 실험으로부터의 데이터의 밀도측정 분석을 위해 설계된다. 레인을 수동 모드로 표시한 후, 단백질에 상응하는 밴드를 각 레인 내에서 표시한다. 프로그램은 각 밴드의 밀도를 평가하고, 바탕값을 뺌으로써, 표적 단백질의 순도를 계산하는 것을 가능하게 한다.
시뮬레이션된 생리적 조건 하에서의 저장으로부터 발생한 단클론성 항체의 구조적 중간체를 연구하기 위한 HPLC 조건.
크로마토그래프 Shimadzu LC-20 "Prominence"
칼럼 Phenomenex "Jupiter" C18, 5 mm, 300A, 250x4.6
감지 파장 = 210 nm
주입 부피 = 25 μl
유량 = 1.0 ml/분
칼럼 온도 = 35℃
세포 감지기 온도 = 35℃
이동상:
유출액 A. 물 중의 30% 아세토니트릴 + 0.1% 트라이플루오로아세트산
유출액 B. 물 중의 70 % 아세토니트릴 + 0.1% 트라이플루오로아세트산
작동 시간 = 47분
구배 프로그램:
0 내지 1분 44% 아세토니트릴
1 내지 5분 48% 아세토니트릴
5 내지 20분 50% 아세토니트릴
20 내지 30분 53.4% 아세토니트릴
30 내지 35분 60% 아세토니트릴
35 내지 37분 60% 아세토니트릴
37 내지 40분 44% 아세토니트릴
40 내지 47분 44% 아세토니트릴
얻어진 데이터를 도　2에 도시하는데, 도면은 항원을 인식할 수 없는 손상된 구조를 가진 단클론성 항체의 분획이 실시예 3, 4, 5에 따라 얻어진 조성물을 함유한 혈청 샘플에서는 부재하였음 (각각 도 2 (2), 도　2 (3), 도　2 (4))을 시사하고, 이것은 상기 조성물을 함유하지 않은 샘플 (도　2 (1))과 대조적이다.
실시예 8. 항응고제, 인자 Xa 억제제 아미딘 염산염과 조합하여 글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드를 포함하는 조성물의 조합된 사용.
본 출원의 실시예 3에 따라 얻어진 조성물을 항응고제, 인자 Xa 억제제인 약물학적으로 활성인 작용제 아미딘 염산염의 치료 효능을 증가시키는 능력에 대해 연구하였다. 테스트 물질 아미딘 염산염 (예를 들어, 특허 EA 015918 B1, publ. 30.12.2011의 실시예　2에 따라 얻어짐) 또는 아미딘 염산염 물질과 보조제 (보조제는 본 출원의 실시예 3에서 얻어진 조성물임)와의 혼합물을, 30 G 바늘이 장착된 인슐린 주사기 1 ml과 함께 정맥내로 꼬리 기부에 1/3 더 가까운 구역에 측면 꼬리 정맥에 투여하였다. 각 동물에 대한 개별적인 용량 부피를 체중을 기준으로 계산하였고 각각의 중량측정 후 보정하였다. 물질의 투여는 한 번이었다. 상기 혼합물을 아민딘 염산염 물질과 보조제와의 혼합물의 동물에 대한 정맥내 투여를 위해 준비하였다. 이 목적에 대해, 아미딘 염산염 물질과 보조제를 별도로 증류수에 용해시킨 후, 용액을 혼합하였다. 용액을 동물에게 투여하기 직전에 제조하였고 제조 후 10분 이내에 주사하였다. 래트에 대한 용량 부피는 0.31 내지 0.42　ml이었다.
혈액 샘플화를 마취 없이 정맥내 투여 부위 위의 (꼬리 길이이 1/3 내지 2/3) 측면 꼬리 정맥으로부터 수행하였고, 이때 래트의 꼬리를 적어도 15분 동안 43℃의 물이 들어 있는 수조에서 예열하였다. 0.36 ml의 혈액 부피를 0.04 ml의 0.11 M 시트르산 나트륨 용액을 함유하고 있는 플라스틱 튜브 (예컨대 에펜도르프 튜브)에 23G 바늘을 사용하여 0.4 ml의 부피가 되게 취하여서, 시트르산 나트륨 용액 대 혈액의 비율이 1:9가 되게 하였다. 샘플화 후 30분 이내에, 혈액을 10분 동안 8000 rpm (7000 g)에서 원심분리하고, 혈장을 또 다른 튜브에 옮긴 후 12000 rpm (15000g)에서 20℃에서 10분 동안 원심분리하여 혈소판-결핍 혈장을 얻었다. 결과적으로 얻어진 110 μl의 부피의 혈장을 플라스틱 튜브 (예컨대 에펜도르프 튜브)에 붓고 -20℃에서 냉동시켰다. 샘플화를 각 래트에서 6회 수행하였다.
국제 민감도 지수 (ISI)에 따라 인증된, 칼슘 이온이 첨가된, 수용성, 냉동-탈수된 트롬보플라스틴인 레남플라스틴 (NPO "RENAM")을 실험에 사용하였다.
방법의 원리: 과잉의 조직 트롬보플라스틴 및 칼슘 이온이 시트레이트 혈장에 첨가될 때, 피브린 응고의 형성 시간은 오직 외부 및 일반적인 응고 경로의 인자들: 인자 I, II, V, VII, X의 활성에만 좌우된다. 칼슘과 함께 트롬보플라스틴의 첨가 순간으로부터 혈장에서 피브린 응고 형성까지의 시간을 측정한다.
검정: 8 ml의 증류수를 동결건조된 레남플라스틴이 들어 있는 바이알에 첨가하고 흔들면서 용해시켰다. 검정 전에, 시약을 37℃에서 30분 동안 가열한다. 50 μL의 시트레이트 혈자을 분석기의 큐벳에 첨가하고, 37℃에서 정확하게 1 내지 2분 동안 인큐베이션한다. 그런 후, 100 μL의 레남플라스틴을 첨가하고 초로 표시되는 응고 시간을 ABW Medizin und Technik GmbH의 Merlin MC 1 코아귤로그램(Coagulogram0 분석기 상에 기록한다.
얻어진 결과를 국제 표준화 비율 (INR)로서 표시한다:
INR = PRISI,
여기서 ISI는 레남플라스틴의 국제 민감도 지수로, 첨부된 패스포트로 표시되어야 한다. PR　―　프로트롬빈 비율:
PR = PTB/PT100%,
여기서 PTB는 초로 표시되는 테스트 샘플의 혈장의 프로트롬빈 시간이고, PT100%는 물질 투여 전 주어진 동물에 대해 얻어진 샘플에 대한 평균 프로트롬빈 시간이다.
연구 파라미터를 측정한 결과를 실험 그룹에 대해 평균화하고 M ± m으로서 나타내는데, 여기서 M은 그룹 평균이고, m은 표준 편차이다. 그룹간 차이의 유의미성은 정상 샘플 분포의 경우 p < 0.05에 대한 학생 모수적 t-검정을 사용하여 결정하고 비정상 분포의 경우 p < 0.05에 대한 비모수적 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 결정한다.
얻어진 결과를 표 1 및 2, 및 도 3에 나타낸다. 표 1 및 도 3 (1) 은 아미딘 염산염 물질 단독에 대해 얻어진 데이터를 보여주고, 표 2 및 도　3 (2) 는 아미딘 염산염 물질과 보조제의 혼합물에 대해 얻어진 데이터를 보여준다.
아미딘 염산염의 투여로 INR 분석한 결과
주사 후 시간, 초 0 5 10 20 40 60
INR 1 1.46 1.33 1 0.94
1 4.18 3.72 3.45 3.16
1 6.45 2.42 1.93 0.96
1 3.22 2.51 1.9 1.25
1 2.71 2.76 1.53 2.04
1 5.88 2.08 1.59 1.83 0.79
1 9.82 1.18 2.94 1.74 1.63
1 2.05 5.01 1.57 1.3 0.98
1 2.42 5.53 1.85 1.8 1.43
1 2.62 1.78 1.41 1.61 1.75
1 2.13 2.15 1.68 1.05 1.24
1 2.46 1.85 1.45 1.35 1.52
1 2.3 2.21 2 1.44 1.65
1 6.32 2.12 1.21 1.33 1.55
1 4.85 2.23 1.75 1.48 1.38
1 5.46 2.11 1.54 0.93 0.9
1 2.63 2.23 1.79 1.31 1.24
1 1.72 1.61 1.21 0.96
1 1.15 1.07
아미딘 염산염고 보조제의 조합된 사용에 대한 INR 값의 분석 결과
주사 후 시간, 초 0 5 10 20 40 60
INR 1 9.64 6.77 4.96 2.68 2.47
1 10.38 5.21 4.26 2.38 1.92
1 11.38 3.64 3.02 2.94 2.73
1 4.53 4 2.44 1.63 1.84
1 4.35 3.69 2.59 4.84 4.45
1 6.84 3.9 2.09 2.28 1.59
1 6.97 3.71 2.7 1.72 2.05
1 4.69 4.17 2.29 1.72 1.96
얻어진 결과는 본 발명의 조성물의 다른 치료적으로 활성인 작용제의 효능을 증강시키는 능력을 증명한다.
실시예 9: 글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 조성물과 조합된 목시플록사신을 포함하는 조합의 항미생물 활성의 연구.
본 출원의 실시예 3, 4 및 5에 따라 얻어진 제제를 연구하였다.
제제의 항미생물 활성을 다음의 그람-음성균: 대장균(Escherichia coli) ATCC 25923, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27853, 임상 분리물 악시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii) 및 그람-양성균: 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) EGD (ATCC BAA-679), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 25922, 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인 MRSA ATCC 33591에 대해 연구하였다.
미생물을 밤새 (16 내지 18시간) 2.1% Mueller-Hinton 브로스(broth) M391 (Oxoid, Germany)에서 37℃에서 진동기에서 연속적으로 흔들어주면서 배양하였다. 이후에, 박테리아 현탁액의 부분표본을 밤새 배양으로부터 제거하여 15 ml의 새로운 멸균된 2.1% Mueller-Hinton 브로스에 옮긴 후, 37℃에서 진동기에서 2.5 내지 3시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, 결과적으로 얻어진 현탁액의 광학 밀도 (OD)를 DU-50 분광계 (Beckman, USA) 상에서 620 nm의 파장에서 2.1% Mueller-Hinton 브로스에 대해 측정하고 ml당 콜로니 형성 유닛 (CFU)의 수를 식: 1 x OD620 = 2.5 x 108 cfu/ml에 의해 결정하였다 [Protocols in antimicrobial peptides. W. Shafer Ed. Springer-Verlag New York, LLC, 7/8/1997]. 이 계산을 기반으로, 박테리아 현탁액을 멸균된 2.1% Mueller-Hinton 브로스로 1 x 105 cfu/ml의 농도로 희석하였다.
96-웰의 멸균된 U-자형 바닥 플레이트를 사용하였다 (Sarstedt, Germany). 테스트 제제의 2배 연속 희석을 Muller-Hinton 배지에서 제제하였다. (각 제제에 대해 50 μl/샘플의 부피로 8 희석). 추가로, 50 μL의 박테리아 현탁액을 플레이트의 웰에 첨가하였다 (샘플 중의 박테리아의 최종 농도는 0.5 Х 105 cfu/ml이었다). 5개의 복제물을 제제의 각 희석에 대해 제조하였다.
샘플이 들어있는 플레이트를 온도조절장치에서 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다.
그 결과를 다음날 기록하였다. 플레이트의 상응하는 웰에서의 미생물 성장이 시각적으로 관찰되지 않는 (완전히 억제된), 얻어진 물질의 최저 농도를 최소 억제 농도 (MIC)로서 수락하였다. 최종 결과를 5개의 독립적인 실험으로부터의 데이터를 근거로 계산하였고, 테스트한 샘플 각각의 각 희석에 대해 5개의 복제물을 만들었다.
제제의 항미생물 활성 (AMA)을 또한 미국 로스앤젤레스 대학교의 Lehrer 교수에 의해 개발된 테스트 미생물을 함유한 아가로오스 겔에서의 방사상 확산에 의해 측정하였다 [Lehrer R.I. et al. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial poly-peptides / JournaL of Immunological Methods, 1991, V.137, pp. 167-173]. 미생물을 16시간 동안 대두 트립신 가수분해물의 3% 용액을 나타내는 배지에서 37℃에서 사전 배양하였다. 그런 후 미생물이 포함된 배지의 부분표본을 별도로 새롭게 제조한 배지에 옮기고 37℃에서 2.5시간 동안 인큐베이션하여 로가리즘 성장 단계의 중간에 있는 미생물을 얻었다. 각 미생물의 세포 수를 분광계 상의 현탁액의 광학 밀도를 620 nm에서 측정함으로써 평가하였다. 4 x 106 세포의 미생물 세포를 함유한 현탁액의 부분표본을 0.15 M NaCl을 함유한 10 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 7.4에서 10 ml의 멸균된 1% 아가로오스 용액과 42℃의 온도에서 혼합하였다. 결과적으로 얻어진 혼합물을 직경이 90 mm인 멸균된 플라스틱 페트리 접시에 붓고 고체화될 때까지 실온에 놓아두었다. 10 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 7.4에 5 μl의 부피로 제제의 연속적인 희석을 나타내는 분석된 샘플을 어플리케이터에 의해 만들어진 웰 (직경 3 mm)에 첨가하고 공기 온도조절장치에서 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그런 후 6% TGS를 함유한 1% 아가로오스를 플레이트에 붓고 18시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 성장 억제 지대 (웰 주변의 지대, 미생물이 없음)의 직경을 0.1 mm의 항미생물 활성의 종래 단위를 1로 하고 웰 자체의 직경에 상응하는 측정된 값 30 종래 단위로부터 뺌으로써 측정한다. 사용한 제제의 농도는 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml, 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml이었다.
제제의 미생물의 성장을 억제하는 최소 농도 (MIC) 를 펩타이드의 농도에 대한 항미생물 활성과 관계없이 선형 퇴행을 구축함으로써 결정한다: y = a + bx, 여기서 y는 항미생물 활성 (c.u.)이고, x는 제제의 농도이다. MIC를 y에 대한 x의 값이 0인 것으로 여겼고, 즉 MIC = - a/b이다.
대장균 ATCC 25922#에 대한, μg/ml로 표시된, 펩타이드의 최소 억제 농도 (액체 배양 배지에서 연속 희석 방법)
박테리아
제제		 MIC, μg/ml
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Exp. 5 평균 ± SE
No. 1
(실시예 3에 따름)		 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.5; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.5; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.5; 0.25 0.5; 0.5; 0.5; 0.5; 0.5 0.33 ± 0.02
No. 2
(실시예 4에 따름)		 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.5 0.5; 0.5; 0.5; 0.5; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.5; 0.5; 0.5; 0.5; 0.5 0.35 ± 0.03
No. 3
(실시예 5에 따름)		 0.25; 0.5; 0.5; 0.5; 0.5 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.5; 0.5 0.31 ± 0.02
#표시된 값은 각각 평균 ± 평균의 표준 오차이다 (n = 25).
스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 25923#에 대한, μg/ml로 표시된, 펩타이드의 최소 억제 농도 (액체 배양 배지 중의 연속 희석 방법)
박테리아
제제		 MIC, μg/ml
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Exp. 5 평균 ± SE
No. 1
(실시예 3에 따름)		 0.5; 0.5; 0.5; 0.5; 0.5 0.5; 0.5; 0.5; 0.5; 0.5 0.25; 0.25; 0.25; 0.5; 0.25 0.5; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.5; 0.25 0.38 ± 0.03
No. 2
(실시예 4에 따름)		 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.5; 0.5; 0.5; 0.5; 0.5 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.5 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.31 ± 0.02
No. 3
(실시예 5에 따름)		 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.5; 0.5; 0.5; 0.5; 0.5 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.25; 0.25 0.25; 0.25; 0.25; 0.5; 0.5 0.32 ± 0.22
#표시된 값은 각각 평균 ± 평균의 표준 오차이다 (n = 25).
* 목시플록사신 MIC (No. 13)에 대한 유의한 차이, 학생 t-검정.
수행된 연구는 본 발며의 조성물의 그람-음성균 및 그람-양성균 둘 다에 대한 높은 항미생물 효과를 증명한다.
실시예 10. 백신 제제에서 보조제로서 글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드를 함유한 실시예 3에서 얻어진 조성물의 용도.
건조 농축된 정제된 비활성화된 세포-유래 항-광견병 백신과 본 출원의 실시예 3에 따르는 조성물의 조합의 제조.
PBS 중의 0.5 mg/ml의 수산화 알루미늄 용액을 제조하였다. 본 출원의 실시예 3에 따라 얻어진 12 g의 조성물을 60 ml의 그 결과의 용액에 첨가하였다. 결과적으로 얻어진 용액을 기공 직경이 0.44 μm인 필터를 통해 통과시킴으로써 멸균하였다. PBS 중의 20 mg/ml, 10 mg/ml, 5 mg/ml, 1　mg/ml의 농도의 희석된 용액 (AD)으로 0.5 mg/ml 농도의 수산화 알루미늄을 결과적으로 얻어진 용액으로부터 제조하였다.
얻어진 용액을, 0.5 mg/ml의 수산화 알루미늄을 포함한 PBS 중의 실시예 3에 따르를 물질의 예정된 농도로, 용액 중의 1:200 (마우스의 50% 보호로 계산됨) 및 1:1200 (마우스의 20% 보호로 계산됨) 희석을 가진 백신의 제조를 위해 사용하였다. 결과적으로 얻어진 용액을 4℃에서 1시간 동안 진동기에서 (약 150 rpm), 발포를 허용하지 않으면서 인큐베이션하였다.
1:200 및 1:1200의 희석의, 건조 농축된 정제된 비활성화된 세포-유래 항-광견병 백신을 참조 샘플로서 사용하였다.
1회 공급에서 13 내지 15 g의 체중인 BALB/s 마우스를 연구 대상체로서 사용하였다.
0.03 ml에서 20 내지 100 LD50을 함유하는 작업 희석을, 광견병 바이러스의 CVS 테스트 균주 (광견병 바이러스로 감염된 마우스의 10% 뇌 현탁액)의 적정 결과를 기반으로 계산하였다.
마우스의 제1 면역화를 조성물의 각 희석에 대해 10 헤드의 계산으로부터 0.5 ml에 의해 복강내로 수행하였다.
마우스의 제2 면역화를 조성물의 각 희석에 대해 10 헤드의 계산으로부터 0.5 ml로 복강내로 7일 후에 수행하였다.
실험에서 취한 바이러스의 실제 용량을 측정하기 위한, 56℃에서 30분 동안 비활성화된 2% 말 혈청의 첨가가 포함된, 바이러스의 작업 (허용되는) 희석 및 주사용 물 중의 3회의 연속적인 10배 희석의 제조.
0.03 ml 및 그것의 십진 희석의 허용 용량을 희석당 6마리의 마우스를 사용하여 면역화된 마우스와 동시에 대조군 그룹의 마우스에게 뇌내로 투여하였다.
동물의 후속 기간은 14일이었다. 실험 결과의 평가는 5일 내지 14일에 병들거나 죽은 마우스를 고려한다.
결과의 수학적 처리는 Reed-Muench 방법에 의한다.
얻어진 결과를 표 5에 요약한다.
백신 제제의 효능에 미치는 보조제의 영향의 결과
투여된 물질의
명칭		 백신 (1:200) 백신 (1:1200) MLT
생존 보호 % 생존 보호 %
AD 1 mg/ml이 첨가된 백신 (1:70) 10/10 100% 6/10 60% 12.8일
AD 5 mg/ml이 첨가된 백신 (1:200) 10/10 100% 1/10 10% 12.8일
AD 10 mg/ml이 첨가된 백신 (1:70) 8/10 80% 5/10 50% 10.7일
AD 20 mg/ml이 첨가된 백신 (1:200) 10/10 100% 2/10 20% 11.2일
AD가 없는 백신 7/10 70% 3/10 30% 12.8일
St. CVS ― ― ― ― 5.5일
표시된 데이터는 글루타티온 다이설파이드와 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 조합을 함유한 백신을 투여할 때 동물에 대한 높은 생존율을 나타낸다. 이들 값은 비슷하고, 대부분의 경우에는 참조 샘플의 값보다 더 높기까지 하다 (세포-유래 항-광견병 백신에 대해).
실시예　11. 실시예 3에 따라 얻어진 글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드를 포함한 조성물의 칼슘 채널 억제제의 활성에 미치는 영향.
연구의 목적은 본 출원의 실시예 3에서 얻어진 조성물의 세포막 이온 채널의 활성 및 칼슘 채널 억제제의 활성에 미치는 영향을 테스트하는 것이다.
다음의 화합물을 테스트 화합물로서 사용하였다: 선택적 칼슘 채널 억제제 니페디핀, 글루타티온 다이설파이드 (본 출원의 실시예 2에서 제조됨), 및 본 출원의 실시예 3에 따르는 조성물 (글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 함께 글루타티온 다이설파이드를 포함함).
연구용 제제의 제조:
시험 화합물 및 조성물을 +4℃에서 저장하였다; 물질을 실험을 시작하기 직전에 탈이온수에 용해시켰다 (수퍼 Q). 제조한 용액을 +4℃에서 5시간 이하 동안 저장하였다. 화합물을 세포 배양 배지에 연구할 최종 농도로 첨가하였다.
제제를 지정된 기간 동안 한 번 세포에 첨가하였다.
사용된 세포주, 배양 조건:
실험을 배양된 상주하는 복강의 래트 대식세포에 대해 수행하였다. 상주하는 대식세포를 체중이 200 내지 300 g인 래트의 복강으로부터 앞서 문헌에서 기술된 방법에 의해 분리하였다 [Conrad R.E. Induction and collection of peritoneal exudate macrophages. ManuaL of macrophages methodology / New York: Marcell Dekker. - pp.5-11; Randriamampita C. et al. ionic channels in murine mAacrophages / Cell Biology, 1987, V.105, pp.761-769]. 분리 직후, 세포는 구형 형상 및 10 내지 20 μm의 직경을 가졌다. 세포 현탁액을 10 x 10 mm의 석영 유리를 갖고 있는 배양 접시에 놓았다. 유리 위의 세포를 20% 소 혈청, 글루타민 용액 (3%), 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 mg/ml)이 첨가된 배지 199 (pH 7.2)에서 1 내지 3일 동안 37℃에서 배양하였다. α-나프틸 아세테이트 에스테라제 염색 [Monahan R.A. et al. Ultrastructural localization of nonspecific esterase activity in guinea pig and human monocytes, macrophages and lymphocytes / Blood, 1981, V.58, pp. 1089-1099]은 단핵층의 세포의 적어도 98%가 대식세포인 것을 밝혀주었다. 실험을 20 내지 22℃의 실온에서 세포 배양의 2 내지 3일째에 수행하였다.
세포를 포함한 석영 유리를 다음의 이온 조성 (mM)의 생리 용액이 채워져 있는 실험 챔버에 넣었다: NaCl　―　140, KCl　―　5, CaCl2　―　1, MgCl2　―　1, HEPES-NaOH　―　5; pH 7.3 내지 7.4 (Alonso-Torre, Trautmann, 1993). 칼슘-유리 배지는 0 mM CaCl2 및 1 mM EGTA를 함유하였다.
Sigma사로부터의 시약을 실험에 사용하였다. 탑시가르긴 (500 μM), 니페디핀 (20 mM)의 스톡 용액을 다이메틸설폭사이드에 제조하였다. 글루타티온 다이설파이드 및 실시예 3에 따르는 조성물 (0.45 μmol/ml), ATP (100 mM)의 스톡 용액을 물에 제조하였다.
실험 모드:
세포내 칼슘 농도 ([Ca2+]i)를 측정하기 위하여, Fura-2AM 형광 프로브를 사용하였다. 대식세포를 45분 동안 2 μM Fura-2AM을 함유한 식염수에서 실온에서 (37℃에서 발생하는 Fura-2AM 미셸의 세포내이입을 방지하기 위함) 인큐베이션하였다 [Alonso-Torre S.R. et al. Calcium responses elicited by nucleotides in macrophages. Interaction between two receptor subtypes / The Journal of Biological Chemistry, 1993, V.268, pp.18640-18647].
착색된 세포를 가진 유리를 식염수로 세척하고 발광 현미경
Figure 112019123481890-pct00006
의 테이블 위에 위치한 실험 챔버로 옮겼다. Fura-2의 형광을 질소 레이저
Figure 112019123481890-pct00007
으로 337 nm에서 여기시켰다. 레이저를 실험 챔버에 대해 30°각에서 현미경과 나란히 배치하였고, 이것은 레이저빔이 직접 대상체로 향하는 것을 허용한다. 형광의 세기를 분광광헤더 CΦH-10을 사용하여 510 nm에서 기록하였다.
Figure 112019123481890-pct00008
로부터의 신호를 특수 설계된 증폭기를 사용하여 증폭시키고 컴퓨터 IBM PC 상에 원래의 소프트웨어를 사용하여 기록하였다. 10X0.40 렌즈를 실험에 사용하였다. 주어진 배율에서, 40 내지 50개 세포가 광도 영역에 들어간다. 광-버닝(photo-burning)을 피하기 위하여, 대상체를 2.5초 조사(irradiation)하면서 측정값을 20초마다 취하였다. ATP 및 UTP가 첨가될 때, 최대 형광에 도달할 때까지 세포를 연속적으로 조사한다. [Ca2+]i의 값을 Grynkiewicz 방정식으로부터 계산한다 [Grynkiewicz G. et al. A new generation of Ca 2+ indicators with greatly improved fluorescence properties / The Journal of Biological Chemistry, 1985, V.260, pp.3440-3450]:
[Ca2+]i = Kd x (F - Fmin)/(Fmax - F),
식에서 F는 관찰된 형광 세기이고; Fmax는 Ca2+로 포화된 염료의 형광이며; Fmin은 Ca2+가 없는 염료의 형광이다 (칼슘-유리 배지에서).
Fura-2AM:Ca2+ 착체의 해리 상수, Kd는 20℃ 및 pH 7.1 내지 7.2에서 135 nM이고, Fmax는 10 μM의 이오노마이신 또는 25 μM의 디기토닌을 Ca2+를 함유한 배지 중의 세포에 첨가한 후에 측정하였다. 디기토닌으로의 세포의 처리는, 미토콘드리아 막 및 소포체의 투과도에 영향을 주지 않으면서, Ca2+ 이온이 원형질 막을 통해 자유롭게 침투하는 것을 허용한다. 신호를 안정화시킨 후에, 5 mM EGTA를 첨가하고 염료의 형광을 명목상 칼슘-유리 배지에서 측정한다 (Fmin). 고유한 형광의 수준을 MnCl2 (100 μM) 용액을 대식세포에 첨가한 후에 뺀다. Mn2+는 착체로부터의 Ca2+를 Fura-2로 대체하고, Mn2+와의 염료 착체의 형광은 Ca2+와의 Fura-2 착체의 형광보다 100배 더 낮다. Fura-2의 경우, Fmin = Fmax/3이다.
2가지 실험 접근법을 연구에 사용하였다. 첫 번째에서는, 생리 식염수에서 대식세포의 ATP, UTP, 탑시가르긴, 또는 사이클로피아손산 (CPC)에 의해 유발된 Ca2+ 반응에 대한 약물학적 작용제의 효과를 조사하였다. 작용제를, 외부 배지로부터 Ca2+의 유입을 반영하는 Ca2+-신호의 고원 단계 중에, 작용물질의 작용 전, 또는 후에 투여하였다. 두 번째 실험의 변형에서는, 다음의 실험 계획 (Ca2+-유리/Ca2+-재도입 프로토콜)을 사용하여 Ca2+의 세포로의 유입을 감지하고 증강시켰다. 대식세포를 명목상 칼슘-유리 배지에서 인큐베이션한 후, 작용물질 중 하나에 노출시켜서, 세포내 저장소로부터 Ca2+의 이동을 유발시켰다. 2 mM Ca2+의 외부 배지로의 첨가 및 Ca2+ 농도의 생리적 구배의 복구 후에, Ca2+의 세포로의 유입을 반영하는 것인, [Ca2+]i의 급격한 상승이 관찰되었다. 추가로, 작용물질의 투여 전에 첨가된 약물학적 작용제의 영향을 Ca2+의 투여 전에 또는 실험 환경으로부터 Ca2+의 유입을 개발하는 중에 조사하였다.
래트 대식세포에서 ATP 및 탑시가르긴에 의해 유도된 Ca 2+ 및 Ca 2+ -신호 의 세포 농도에 미치는 테스트 화합물의 영향의 결과:
200 μM ATP의 래트 복강 대식세포의 인큐베이션 배지에의 첨가는 주로 P2u 수용체 활성화에 의해 유발된 저장소로부터의 Ca2+의 이동과 결부된 초기 단기 피크 및 현저한 연장된 "고원" 단계로 구성되는 2-단계 Ca2+ 신호를 유발한다. 이런 고원 단계는 외부 배지로부터 Ca2+의 유입에 의해 유발되고 아마도 P2u 및 P2z 수용체의 동시발생적인 활성화를 반영한다. 도　4 (1)은 생리 식염수에서 40 내지 50개의 대식세포 집단에서 세포외 ATP (200 μM)에 의해 유도된 특징적인 Ca2+-신호를 보여준다.
세포외 ATP의 첨가에 대한 반응으로 [Ca2+]i는 75 ± 18 nM의 기저 수준으로부터 피크 820 ± 105 nM으로 증가한다. 그런 후 고원의 느린 감소 단계가 이어지며, 그 동안 평균 [Ca2+]i는 ATP의 첨가 후 4분 후에 460 ± 115 nM이다.
소포체의 Ca2+-ATPase의 특정 억제제인 탑시가르긴 (0.5 μM) 또한 2-단계 Ca2+-신호를 유발한다: 꽤 빠른, 저장소로부터의 Ca2+의 이동과 결부된 피크, 및 외부 환경으로부터의 Ca2+의 저장소-의존성 유입을 반영하는 긴 단계. 도　4 (2)는 생리 식염수에서 대식세포에서 탑시가르긴에 의해 유도된 전형적인 Ca2+-신호를 나타낸다.
칼슘-유리 배지를 사용하는 실험을 세포로의 Ca2+ 유입의 단계를 확인 및 증강시키기 위하여 수행하였다. 명목상 칼슘-유리 배지 (0 mM CaCl2 및 1 mM EGTA)에서 200 μM ATP (도　4 (3)) 또는 0.5 μM 탑시가르긴 (도　4 (4))으로의 대식세포의 자극 후에, 2 mM Ca2+를 외부 환경에 첨가함으로써 Ca2+ 유입을 유도하였다.
도 5는 생리 식염수에서 (1) 또는 명목상 칼슘-유리 배지에서 (2), (3).휴식기에 [Ca2+]i 및 200 μM ATP에 의해 유도된 및 0.5 μM의 탑시가르긴 (TG)에 의해 유도된 Ca2+-신호에 미치는 글루타티온 다이설파이드의 영향을 보여준다.
얻어진 데이터는 세포내 저장소로부터 칼슘의 이동으로 인하여 [Ca2+]i를 180 ± 19 nM까지 증가시키는 글루타티온 다이설파이드의 능력을 나타낸다. 세포내 칼슘 저장소의 파괴는 ATP의 영향을 감소시킨다. 탑시가르긴은 저장소로부터 칼슘을 이동시키는 글루타티온 다이설파이드의 능력의 영향을 완전히 반전시킨다.
도 6은 휴식 시의 세포내 칼슘 농도 [Ca2+]i 및 ATP에 의해 유도된 Ca2+-신호에 미치는 본 출원의 실시예 3에 따르는 조성물 (제제)의 영향을 보여준다. 제제는 선택적 칼슘 채널 억제제 니페디핀의 억제 효과를 무효화하며 (1), 이때 약물 자체의 효과는 환원제 다이티오트레이톨 (DTT)에 의해 억제된다 (2).
얻어진 데이터는 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 함께 세포내 저장소로부터 칼슘의 이동으로 인해 [Ca2+]i를 최대 240 ± 28 nM로 증가시키는 글루타티온 다이설파이드의 능력을 나타낸다. 세포내 칼슘 저장소의 파괴는 ATP의 영향을 감소시킨다. 글루타티온 다이설파이드는 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 함께 배지로부터 세포로의 칼슘 공급 과정을 안정화시키는데, 그것은 이 과정에 대한 칼슘 채널 억제제 니페디핀의 영향의 억압으로서 나타난다. 다티티오트레이톨은 칼슘 채널의 수행에 대한 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 함께 글루타티온 다이설파이드의 안정화 효과를 무효화하였다.
그러므로, 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드는 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드가 협력제로서 작용한 것과 관련하여 글루타티온 다이설파이드가 수행된 실험에서, 세포에 대한 특정 화합물의 영향을 증강시킬 수 있다. 글루타티온 다이설파이드와 함께 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드는 다른 화합물의 효과를 감소 또는 억제할 수 있고 (니페디핀으로 수행한 실험에서), 조성물이 니페디핀의 길항물질로서 및 독성을 중화시키는 치료제로서 작용하는 쪽으로 향한다.
제시된 실시예들의 결과는 글루타티온 다이설파이드가 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 함께, 칼슘 이동 활성에서 30 내지 50%의 증가로서 나타난, 높은 생물학적 활성을 나타내는 것을 보여준다. 표면 세포 수용체 및 이온 채널의 활성을 조절하는 글루타티온 다이설파이드의 능력을 고려하면, 그것은 세포외 및 세포내 숭요체, 세포질 및 세포내 막의 담체 단백질, 펩타이드 성질을 가진 세포외 조절 및 수송 분자, 세포골격 단백질, 자가면역 반응; 항원 결합 및 인식, 엑소사이토시스 및 세포내이입의 과정, 화학주성, 케모카인시스(chemokinesis), 세포질분열(cytokinesis); 세포간, 기질 세포 및 호르몬 세포 상호작용에 영향을 미치는 능력을 가리키고; 다이설파이드 S-옥사이드가 글루타티온 다이설파이드의 이들 효과에서 협력제로서 작용할 것이며, 새로운 약물의 개발, 치료 효능의 손실 없이 더 적은 용량으로 사용될 수 있는 가능성, 및 다양한 용량-의존성 독성 및 부작용의 감소에 사용될 수 있는 것으로 가정될 수 있다.
실시예 12. 이황화 결합의 형성 속도에 의한 실시예 5에서 얻어진 조성물의 영향.
실시예 5에 따라 얻어진 1 g의 샘플 (글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 함량 5%)을 물 (9 ml)에 용해시켰다. 결과적으로 얻어진 용액에, 1 ml의 환원된 L-글루타티온의 나트륨 염 (2.5 mg/ml)의 용액을 교반하면서 첨가하였다. 반응물을 5분 동안 교반하고 HPLC에 의해 분석하였다. 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드는 그 결과 얻어진 용액에서 검출되지 않았다.
실시예 13. 실시예 6에 따라 얻어진, 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 with 글루타티온 다이설파이드 및 금속, 백금 화합물 Pt-S 시스플라틴을 포함하는 조성물의 생체이물 해독의 제2 단계 효소의 발현에 미치는 영향.
테스트 화합물로서 다음을 사용한다:
1　―　글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 (실시예 1에서 얻어진 화합물);
2　―　글루타티온 다이설파이드 (실시예 2에서 얻어진 화합물);
3　―　글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 글루타티온 다이설파이드와의 조성물 (실시예 5에서 얻어진 조성물);
4　―　글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 글루타티온 다이설파이드 및 금속, 백금 화합물 Pt-S 시스플라틴과의 조성물 (실시예 6에서 얻어진 조성물).
연구를 10일 동안 식염수 중의 20 mg/kg s.c. 용량으로 사이클로포스판 (CP)을 매일 투여함으로써 간독성이 유발되어 있는 사육장 RAMS "Rappolovo"로부터의, 체중이 140 내지 160 g인 무작위로 사육된 백색 수컷 래트에 대해 수행하였다.
실험 동물의 6개 그룹을 형성하였다.
No.　1　―　연구된 화합물의 용매 (식염수)를 받은 온전한 동물 (용매 대조군);
No.　2　―　CP를 받은 후 치료제로서 식염수를 받은 동물 (대조군);
실험 그룹:
No.　3　―　10일 동안 독성제 CP를 투여받은 후 30분 후에 10 mg/kg의 용량으로 복강내로 식염수 중의 테스트 화합물 1을 받은 동물;
No.　4　―　10일 동안 독성제 CP를 투여받은 후 30분 후에 0.1 mg/kg의 용량으로 복강내로 식염수 중의 테스트 화합물 2를 받은 동물;
No.　5　―　10일 동안 독성제 CP를 투여받은 후 30분 후에 10 mg/kg의 용량으로 복강내로 식염수 중의 테스트 화합물 3을 받은 동물;
No.　6　―　10일 동안 독성제 CP를 투여받은 후 30분 후에 10 mg/kg의 용량으로 복강내로 식염수 중의 테스트 화합물 4를 받은 동물.
간 세포의 시토졸 분획에서의 생체이물 해독의 제2 단계의 효소: 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (XE 2.5.1.18), 글루타티온 과산화효소 (XE 1.11.1.9), 글루타티온 환원효소 (XE 1.6.4.2) 글루코오스-6-포스페이트 탈수효소 (XE 1.1.1.49).
연구 결과
독성 물질의 작용에 대한 내성을 제공하는 분자 반응의 착체의 연구 결과는 생체이물 해독의 제2 단계의 효소: 글루타티온 환원효소 (XE 1.6.4.2), 글루타티온 과산화효소 (XE 1.11.1.9), 글루타티온-S-트란스퍼라제 (XE 2.5.1.18)의 활성 및 이들과 결부된 환원된 글루타티온의 교환을 유도하는 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 (1), 글루타티온 다이설파이드 (2), 및 이것들의 조성물 (3 및 4)의 능력을 나타낸다 (표 6).
테스트 물질: 1　―　글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드; 2　―　글루타티온 다이설파이드; 3 ― 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 글루타티온 다이설파이드와의 조성물 (실시예 5에서 얻어진 조성물); 4　―　글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 글루타티온 다이설파이드 및 금속, 백금 화합물 Pt-S 시스플라틴과의 조성물 (실시예 6에서 얻어진 조성물)의 작용 하에 10일 동안 20 mg/kg의 용량으로 사이클로포스판의 반복된 투여시 무작위로 사육된 백색 래트의 간 세포에서 생체이물 해독의 제2 단계의 효소들의 활성의 변화 (효소 활성은 μmol/(분 x g 단백질, 환원된 글루타티온 - μmol/g 단백질)로 표시됨)
연구 그룹 분석된 파라미터 값
GR GP GST G-6-PDG GSH
대조군 371.3 ± 15.8 71.2 ± 0.4 2　281 ± 187 181.6 ± 12.9 23.68 ± 0.62
무보정 95.3 ±11.7* 13.8 ± 0.2 1727 ± 86* 86.2 ± 7.7* 9.61 ± 0.02*
No. 1 (GS(O)SG, 실시예 1에 따른 화합물) 117.8 ±12.6** 27.9 ± 2.2** 1857 ±120** 98.1 ± 13.3** 11.21 ± 0.56**
No. 2 - (GSSG, 실시예 2에 따른 화합물) 125.6±11.2** 24.5 ± 3.1** 1794 ±165** 96.9 ± 18.7** 12.93 ± 1.15**
No. 3 (GSSG + GS(O)SG, 실시예 5에 따른 조성물) 237.4±23.1** 48.3 ± 5.9** 2117 ±223** 133.1 ± 21.2** 17.87 ± 2.12**
No.4- (GSSG + GS(O)SG + Pt-S, 실시예 6에 따른 조성물) 394.7±37.4** 83.9 ± 7.1** 2310 ±343** 189.7 ± 29.3** 36.12 ± 5.07**
* - 대조군 그룹 대비 차이 p < 0.05의 신뢰도;
** - 중독된 동물 그룹 대비 차이 p < 0.05의 신뢰도, 무보정;
GR　―　글루타티온 환원효소 (XE 1.6.4.2);
GP　―　글루타티온 과산화효소 (XE 1.11.1.9);
GST　―　글루타티온-S-트란스퍼라제 (XE 2.5.1.18);
G6PDG　―　글루코오스-6-포스페이트 탈수효소 (XE 1.1.1.49);
GSH　―　환원된 글루타티온
금속 화합물, 특히 백금 Pt-S의 화합물을 조성물에 첨가하는 것은, 글루타티온 다이설파이드 및 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 조성물의 생체이물 해독의 제2 단계의 효소의 활성을 유도하는 능력을 증강시켰고, 이들과 결부된 환원된 글루타티온의 핵심 대사산물의 교환의 강도를 증가시켰다.
그러므로, 생체이물 해독의 제2 단계의 효소의 활성을 유도하는 능력을 가지는 금속 화합물, 특히 백금 Pt의 화합물은 그것의 독소변형(toxicomodifying) 효과, 및 따라서, 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 및 글루타티온 다이설파이드의 조성물에 의한 생체이물 해독의 제2 단계의 효소를 유도함으로 인해 세포보호 효과를 증가시킨다.
실시예 14. 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 및 그것의 조성물이 인터페론 a의 항바이러스 효능에 미치는 영향
인터페론의 항바이러스 활성에 미치는 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 및 그것의 조성물 (실시예 1, 2, 5, 6)의 영향의 연구를 감염된 세포의 배양물에 대해 수행한다.
인터페론의 항바이러스 활성을 평가하는 방법은 바이러스의 세포 병변 작용으로부터
Figure 112019123481890-pct00009
라인의 세포를 보호하는 최소량의 결정을 기반으로 한다. 조성물을 인터페론 첨가 전에, 인터페론과 함께, 및 인터페론 첨가 후 60분 후에, 0.0015 μmol/ml, 0.015 μmol/ml, 및 0.15 μmol/ml의 농도로 세포 인큐베이션 배지에 첨가한다. 실험의 인터페론 역가는 4 x 10-4 U/ml, 8 x 10-4 U/ml, 1.6 x 10-5 U/ml, 3.2 x 10-5 U/ml, 6.4 x 10-5 U/ml, 1.28 x 10-6 U/ml, 2.56 x 10-6 U/ml, 5.12 x 10-6 U/ml이었다. 제제의 항바이러스 활성을 크리스탈 바이올렛을 흡수하는 살아있는 세포의 능력에 의해 평가하였다. 살아있는 세포 분획의 분리 및 메탄올로의 염료의 추출 후에, 흡수된 크리스탈 바이올렛의 양을 595 nm에서 광도계로 결정하였다. 흡수된 염료의 양은 살아있는 세포의 수에 비례하였고 광학 밀도로 표시한다.
실험을 위해
Figure 112019123481890-pct00010
세포주를 준비한다.
Figure 112019123481890-pct00011
세포주는 종양학적 질환, 성병, 간염, 결핵, 유전적 및 선천성 기형이 없는 28세 여성으로부터 유산된 11주령의 인간 배아의 폐 세포로부터 러시아 의학 과학 아카데미 (RAMS)의 모스크바 바이러스 제조 연구소 (MRIVP)로부터 얻어진 인간 배아 폐의 이배체 세포의 스트레인이다.
이배체 세포
Figure 112019123481890-pct00012
의 스트레인의 종자 은행은 L.A Tarasevich (SISC)의 이름을 따라 명명된 의학 생물학 조제물의 표준화 및 제어를 위한 국립 과학 연구소와 함께 MRIVP RAMS에서의 면역생물학적 조제물의 제조를 위해 인증된다.
Figure 112019123481890-pct00013
라인의 세포를 완전 성장 배지 I에서 37℃에서 배양하였다. 배양을 250 ml의 플라스틱 바이알 ("Costar"형)에서 수행한다. 세포는 바이알의 바닥을 덮고, 이배체 섬유모세포에 전형적인 형태를 가진 단분자층을 형성한다. 평평한 세포를 0.02% 베르센 용액과 0.25% 트립신 용액의 동등한 부분으로 이루어진 특수 배지를 사용하여 현탁하였다. 이렇게 하기 위하여, 완전 성장 배지를 형성된 세포 단분자층이 있는 바이알로부터 빼내고, 단분자층을 특수 배지 (트립신이 포함된 베르센 용액)로 2회 세척하고 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 동안, 섬유모세포의 단분자층은 플라스틱으로부터 탈착되었다. 탈착된 세포를 완전 성장 배지로 희석하고, 여러번 피펫팅함으로써 세포 덩어리를 파괴하였다. 세포를 멸균된 원심분리 튜브로 옮기고 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 빼내고 세포를 완전 성장 배지로 옮겼다. 그런 후 세포를 Gorjaev 챔버에서 계수하고 실험에 사용하였다.
적어도 20회 및 30회 미만으로 계대된 세포 배양물을 활성 및 독성을 결정하기 위해 사용하였다.
수포성 구내염 바이러스의 제조.
실험을 위해, 멸균된 조건 하에서 밀봉된 유리 앰풀에 포장된, 냉동-건조된 수포성 구내염 바이러스 (VSV)를 사용하였다.
바이러스를 L-929 세포주에서 성장시켰다. 이렇게 하기 위하여, 사전 적정된 용량의 바이러스를 완전 성장 배지 중에 세포의 형성된 단분자층이 있는 바이알에 첨가하였다 (VSV의 역가는 바이러스의 최대 희석이었고, 그것은 37℃에서 1일 중에 세포의 단분자층의 완전한 파괴를 유발하였다). 바이알의 내용물을 37℃에서 1일 동안 배양하였고, 그런 후에 배양 배지를 멸균된 50 ml 튜브로 빼내고 2000 rpm에서 원심분리하였다. 추가로, 수포성 구내염 바이러스를 함유한 1 ml의 부분표본 상층액을 얻었고, 그것을 멸균된 조건 하에 앰풀로 분배하여 동결건조하였다.
바이러스의 감염 역가 결정.
0.2 ml 부피에 5 x 104 세포/웰의 농도로 완전 배양 배지 I에 현탁된
Figure 112019123481890-pct00014
라인의 준비된 세포를 96-웰 플레이트 ("Costar"형)에 첨가하였다. 이런 후에, 플레이트를 1일 동안 37C에서 5% CO2를 함유한 대기가 포함된 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 이 시간 동안, 세포는 웰을 덮고, 연속적인 단분자층을 형성한다. 1일 후에, 배양 배지를 멸균된 조건 하에서 따라버리고, 앞서 제조한 2배 희석된 바이러스를 4개 한 벌의 플레이트의 웰에 첨가하였다. VSV 바이러스를 완전 배양 배지에 0.2 ml의 부피로 첨가하였다. 그런 후 플레이트를 상기 기술된 조건 하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝났을 때 (1일 후), 배양 배지를 따라버리고 20% 메탄올 중의 0.05 ml의 0.2% 크리스탈 바이올렛 용액을 웰에 첨가하였다. 10분 후에, 염료를 제거하고, 플레이트를 흐르는 물로 세척하고 건조시켰다. 추가로, 염료를 용액으로 용출하기 위하여 0.1 ml의 용해 완충액을 플레이트에 첨가하였다. 염색의 세기를 595 nm에서 미세플레이트 판독기 상에 기록하였다.
이들 조건 하에서 1일 이내에 웰에서 세포의 단분자층의 완전한 파괴를 유발하는 바이러스의 최대 희석을 바이러스의 감염 역가로서 취한다. 이들 웰에서 용액의 광학 밀도는 최소일 것이고 바탕값에 가까울 것이다.
활성의 결정.
완전 성장 배지에서, 표준 활성 샘플의 이중 희석 (예상 역가보다 위와 아래)을 준비하였고 (42-28-119-96P; L.A. Tarasevich를 따라 SISC), 그것의 활성을 국제 단위 IU로 표시하였다. 표준의 희석을 0.1 ml의 부피로 96-웰 플레이트 ("Costar"형)에서 수행하였고, 각 희석에 대해 적어도 4개 웰을 사용하였다. 플레이트의 한 줄은 배양 배지를 대조하기 위하여 (4개 웰) 및 VSV 바이러스의 용량을 대조하기 위하여 (4개 웰) 남겨두었다. 0.1 ml을 이들 웰에 첨가하였다. 표준의 희석 후에, 0.1 ml 부피에 5-104 세포/웰의 농도로 완전 배양 배지 I에 현탁된
Figure 112019123481890-pct00015
라인의 준비된 세포를 플레이트에 첨가하였다. 이런 후에, 연구된 분획을 희석된 표준이 들어 있는 줄의 부분에 일정 시간 간격으로 0.0015 μmol/ml, 0.015 μmol/ml 및 0.15 μmol/ml의 농도로 첨가하였다:
1　―　글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 (실시예 1에서 얻어진 화합물);
2　―　글루타티온 다이설파이드 (실시예 2에서 얻어진 화합물);
3　―　글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 글루타티온 다이설파이드의 조성물 (실시예 5에서 얻어진 조성물);
4　―　글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드와 다이설파이드 글루타티온 및 금속, 백금 화합물 Pt-S 시스플라틴과의 조성물 (실시예 6에서 얻어진 조성물)
다음에, 각 플레이트를 1일 동안 37℃에서 5% CO2를 함유한 대기가 포함된 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 이 시간 동안, 세포는 웰을 덮고, 연속적인 단분자층을 형성한다. 1일 후에, 전체 성장 배양 배지를 멸균된 조건에서 따라버리고, 사전 결정된 감염 역가를 가진 VSV 바이러스를 각 플레이트의 웰에 첨가하였다. VSV 바이러스를 완전 배앵 배지에 0.2 ml의 부피로 첨가하였다. VSV 바이러스가 없는 0.2 ml의 동일한 배지를 웰에 배지 대조군으로서 첨가하였다. 이런 후에, 각 플레이트를 상기 기술된 조건 하에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝났을 때 (1일 후), 배양 배지를 따라버리고 20% 메탄올 중의 0.05 ml의 0.2% 크리스탈 바이올렛 용액을 웰에 첨가하였다. 10분 후에, 염료를 제거하고, 접시를 흐르는 물 하에서 세척하고 건조시켰다. 배지 대조군 웰에서, 착색된 단분자층은 파괴 징후가 없어야 한다. 추가로, 염료를 용액으로 용출하기 위하여 0.1 ml의 용해 완충액을 플레이트에 첨가하였다. 염색의 세기를 595 nm에서 미세플레이트 판독기 상에 기록하였다.
웰의 50%에서 바이러스의 세포병변 효과로부터 세포 배양을 완전하게 보호하는 조제물의 희석의 역수를 인터페론 역가로서 취한다.
실험 결과.
세포와 각 테스트 화합물과의 사전 인큐베이션이 인터페론의 항바이러스 활성에 어떠한 영향도 나타내지 않은 것이 실험적으로 확립되었다.
각 조성물이 인터페론 후에 첨가된 실험의 결과는, 만약 조성물이 인터페론에 대한 세포 노출 후 30분이 지난 후에 첨가되었다면 실제로 모든 테스트 물질의 인터페론 효능을 증가시키는 능력을 가리킨다.
테스트 물질은 6.4 x 10-5에서 1.28 x 10-6로 감염 역가 정도를 다르게 할 때 효능을 증가시켰고, 이것은 인터페론만이 작용한 실험에 대비하여 인터페론이 하나 또는 또 다른 물질과 함께 작용한 실험에서 광학 밀도의 더 큰 증가로서 나타났다.
하나 또는 또 다른 조성물과 인터페론의 효능의 증가의 보다 믿을만한 값을 결정하기 위하여, 활성이 주지된, 인터페론의 희석에 대한 대다수의 실험 데이터를 얻기 위한 실험을 수행하였다 (표 7).
인터페론 효능이 증가하는 정량적 값 (광학 밀도 단위로서 표시됨)
인터페론 α의 희석 배지
대조군		 인터페론 α 표준 인터페론 α 표준 + 실시예 1에 따른 물질 인터페론 α 표준 + 실시예 2에 따른 물질 인터페론 α 표준 + 실시예 5에 따른 물질 인터페론 α 표준 + 실시예 6에 따른 물질 관찰 횟수
0,64 x 10-6 2,703 ± 0,089* 1,59 ± 0,131* 1,73 ± 0,076* 1,79 ± 0,079* 1,91 ± 0,096* 2,57 ± 0,098* n = 21
1,28 x 10-6 2,728 ± 0,172** 0,905 ± 0,088** 1,03 ± 0,097** 1,01 ± 0,137** 1,72 ± 0,133** 2,34 ± 0,118** n = 19
* P < 0.1
** P < 0.05
얻어진 결과는 모든 테스트 조성물이 그것이 인터페론 α 후에 첨가된다면 특정 범위의 농도에서 인터페론 α의 항바이러스 활성을 증가시킨 것을 나타낸다. 조성물의 효과의 유사한 성질은 조성물이 인터페론 전에 투여되거나 동시에 투여될 때 배양 배지에서 산화제가 없거나 상대적으로 불충분한 양의 산화제로 인한 것이다. 배양 배지의 복잡한 조성은 배양 배지로부터 세포내 공간을 향한 소량의 유효 성분의 상대적으로 빠른 소멸로 이어진다. 향성 세포(tropic cell)에 대한 인터페론의 작용에는 산화제의 생성이 수반되지만, 충분한 양으로 그것의 생성 시간은 시간을 초과하며, 그 금속 배위 화합물은 배양 배지에서 소비된다. 인터페론의 예비 추가 및 향성 세포에 대한 그것의 영향은 이들 세포에 의한 산화제의 생성을 촉진하며, 그것은 계속해서, 다른 것들 중에서도, 궁극적으로 인터페론과 상호작용하는 세포의 수를 증가시키는 데 기여하고, 이것은 결국 항바이러스 효과의 증강을 졀정하는, 인터페론 수용체를 포함한 다양한 수용체의 설프하이드릴 기에 대한 촉매 작용에 사용된다.
그러므로, 모든 테스트 물질은 인터페론 α의 작용의 효능을 증가시킬 수 있지만, 조성물의 제제에서 금속 배위 화합물은 그것의 활성을 유의하게 강화하여, 인터페론 α와 수용체-매개된 상호작용을 할 수 있는 세포의 수를 증가시킨다. 여기서, 실시예 1 및 2에 따라 얻어진 물질로의 인터페론 α의 항바이러스 효과의 강화가 실제로 일치하고 상이한 희석에서는 9 내지 10%인 것이 주지되어야 한다. 실시예 5에 따른 조성물의 형태의 실시예 1 및 2에 따른 물질의 조합된 작용은 더 낮은 희석에서 (최대 18%) 인터페론 α의 항바이러스 효과의 추가적인 증강 및 인터페론 α의 큰 희석, 즉 더 적은 용량의 인터페론 α에서 거의 이중 증폭을 얻는 것을 가능하게 만든다. 유사한 패턴이 실시예 6에 따른 조성물을 사용할 때 발견되었다: 인터페론 α의 항바이러스 효과는 낮은 희석에서보다 뚜렷하였고, 특히 50% 증가하였으며 심층 희서에서는 2.5배였다. 치료적 용량에서 인터페론 α의 항바이러스 효과는 인터페론 α의 제제를 받는 환자의 72%에서 용량-의존성 부작용 및 독성 효과의 발생과 관련된다. 투여된 치료법의 부정적인 표시 중에서 독감-유사 증후군, 위장관 및 심인성 장애의 증상, 골수 억제의 징후, 갑상선 및 부갑상선 기능의 장애, 환자의 내인성 인터페론 α에 대한 자가항체 풀의 형성이 가장 자주 보고된다. 인터페론 α를 실시예 5 또는 6에 따른 조성물과 함께 더 낮은 치료 용량에서 사용할 가능성은 인터페론 α에 대한 다양한 부작용 및 독성 용량-의존성 반응을 유의하게 감소시키는 것을 허용한다.

Claims (23)

  1. 감염성 및 비감염성 질환의 치료에서 약물학적으로 활성인 화합물의 용량-관련 독성을 제거하고 치료적 활성을 증강시키기 위한 제약학적 조성물로서, 글루타티온 다이설파이드 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염 및 다음 구조:
    Figure 112020005432460-pct00024

    의 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염을 포함하며,
    상기 조성물은 추가로 Me-S-글루타티온 결합을 함유하는 배위 화합물(들)로서 표시된 금속 (Me)을 포함하는 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 글루타티온 다이설파이드 S-옥사이드의 양은 총 조성물의 0.01 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 금속은 백금 족으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 금속은 백금인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 조성물 중의 d-금속의 양은 1 kg의 조성물 당 1 x 10-10 moles 내지 1 x 10-3 moles의 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 조성물 중의 d-금속의 양은 1 kg의 조성물 당 1 x 10-5 moles인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 환자에게 투여되는 d-금속 배위 화합물의 양은 10-3 내지 10-15 mol/kg 체중인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 감염성 및 비감염성 질환의 치료에서 약물학적으로 활성인 화합물의 용량-관련 독성을 제거하고 치료적 활성을 증강시키기 위한 약물학적 조합물로서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물 및 항응고제, 인자 Xa 억제제, 항미생물제, 항바이러스제 및 칼슘 채널 억제제의 군으로부터 선택된 약물학적으로 활성인 화합물을 포함하는, 조합물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조합물은 혈전증의 치료에 사용될 수 있고, 여기서 약물학적으로 활성인 화합물은 항응고제, 인자 Xa 억제제 또는 아미딘 염산염인 것을 특징으로 하는 조합물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 조합물은 대장균, 슈도모나스 아에루기노사 또는 악시네토박터 바우만니이, 및 리스테리아 모노사이토게네스 EGD, 스타필로코쿠스 아우레우스, 또는 MRSA - 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스를 포함한 그람-음성균 및 그람-양성균에 의해 유발된 감염성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있고, 약물학적으로 활성인 화합물은 항미생물제 목시플록사신인 것을 특징으로 하는 조합물.
  11. 제8항에 있어서, 약물학적으로 활성인 화합물은 광역 스펙트럼의 항바이러스 작용을 하는 항바이러스제인 인터페론 알파인 것을 특징으로 하는, 바이러스 질환의 치료를 위한 조합물.
  12. 제8항에 있어서, 약물학적으로 활성인 화합물은 항-광견병 백신의 항원성 물질인 것을 특징으로 하는 조합물.
  13. 감염성 및 비감염성 질환의 치료에서 약물학적으로 활성인 화합물의 용량-관련 독성을 제거하고 치료적 활성을 증강시키기 위한 의약으로서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따르는 적어도 하나의 조성물을 제약학적으로 허용되는 부형제와 함께 치료적으로 효과적인 양으로 포함하는, 의약.
  14. 감염성 및 비감염성 질환의 치료에서 약물학적으로 활성인 화합물의 용량-관련 독성을 제거하고 치료적 활성을 증강시키기 위한 의약으로서, 제8항에 따르는 적어도 하나의 조합물을 제약학적으로 허용되는 부형제와 함께 치료적으로 효과적인 양으로 포함하는, 의약.
  15. 제13항에 있어서, 상기 의약은 외부, 흡입, 장내 또는 비경구 투여를 위해 제조될 수 있는 것을 특징으로 하는, 감염성 및 비감염성 질환의 치료에서 약물학적으로 활성인 화합물의 용량-관련 독성을 제거하고 치료적 활성을 증강시키기 위한 의약.
  16. 제14항에 있어서, 상기 의약은 외부, 흡입, 장내 또는 비경구 투여를 위해 제조될 수 있는 것을 특징으로 하는, 감염성 및 비감염성 질환의 치료에서 약물학적으로 활성인 화합물의 용량-관련 독성을 제거하고 치료적 활성을 증강시키기 위한 의약.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2720134C1 (ru) * 2019-11-28 2020-04-24 Общество с ограниченной ответственностью "Ай Кью Витаминная студия" Фармацевтическая композиция для парентерального капельного введения
WO2021235494A1 (ja) * 2020-05-20 2021-11-25 孝章 赤池 活性硫黄化合物を主成分とする薬剤
CN111840535B (zh) * 2020-08-07 2021-08-03 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 利用无血清Vero细胞和狂犬病病毒rPV-2061制备狂犬病疫苗的工艺
CN112195149B (zh) * 2020-10-20 2022-05-17 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 一种制备人用狂犬病疫苗的方法
RU2747890C1 (ru) * 2021-03-24 2021-05-17 Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" Средство для снижения риска и облегчения симптомов заражения бета-коронавирусной инфекцией
CN113189232B (zh) * 2021-04-28 2022-12-27 玉林市食品药品检验检测中心 测定护肝类中成药中的谷胱甘肽、硫普罗宁、肌苷的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050054580A1 (en) 1998-11-23 2005-03-10 Novelos Therapeutics, Inc. Methods for production of the oxidized glutathione composite with cis-diamminedichloroplatinum and pharmaceutical compositions based thereof regulating metabolism, proliferation, differentiation and apoptotic mechanisms for normal and transformed cells

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2153351C2 (ru) * 1995-12-14 2000-07-27 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Средство для регулирования эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов (варианты) и способ его использования
RU2089179C1 (ru) 1995-12-14 1997-09-10 Закрытое акционерное общество "ВАМ" Стимулятор эндогенной продукции цитокинов и гепопоэтических факторов и способ его использования
CA2239874A1 (en) 1995-12-14 1997-06-19 Mark Borisovich Balazovsky Cytokine and hemopoietic factor endogenous production enhancer and methods of use thereof
ATE444760T1 (de) 1997-01-13 2009-10-15 Univ Emory Glutathion zur behandlung von influenzainfektionen
US6312734B1 (en) 1998-11-23 2001-11-06 Novelos Therapeutics, Inc. Methods for production of the oxidized glutathione composite with cis-diamminedichloroplatinum and pharmaceutical compositions based thereof regulating metabolism, proliferation, differentiation and apoptotic mechanisms for normal and transformed cells
US20020002136A1 (en) * 2000-06-28 2002-01-03 Hebert Rolland F. Salts of glutathione
US20030073618A1 (en) * 2001-02-08 2003-04-17 Kozhemyakin Leonid A. Compounds comprising disulfide-containing peptides and nitrogenous bases, and medical uses thereof
RU2206334C1 (ru) 2002-02-11 2003-06-20 Жуковский Юрий Георгиевич Способ повышения резистентности организма к тепловому воздействию
RU2208452C1 (ru) 2002-02-11 2003-07-20 Жуковский Юрий Георгиевич Способ повышения устойчивости организма к повышенному давлению дыхательной газовой среды
RU2208453C1 (ru) 2002-02-11 2003-07-20 Жуковский Юрий Георгиевич Способ увеличения резистентности организма к укачиванию
EA015918B1 (ru) 2010-03-03 2011-12-30 Дмитрий Геннадьевич ТОВБИН УРЕТАНЫ, МОЧЕВИНЫ, АМИДЫ И РОДСТВЕННЫЕ ИНГИБИТОРЫ ФАКТОРА Xa
IT1401504B1 (it) * 2010-08-02 2013-07-26 Cattarini Mastelli Composizione comprendente glutatione reduttasi e glutatione ossidato
RU2451010C1 (ru) * 2011-01-11 2012-05-20 Закрытое Акционерное Общество "Ива Фарм" Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп, комбинация и композиция на их основе и способ терапевтического воздействия
RU2482868C1 (ru) 2011-12-30 2013-05-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Ива Фарм" Средство для лечения диабета, фармацевтическая композиция и способ лечения заболеваний
CN103441739B (zh) * 2013-08-21 2015-04-22 昂宝电子（上海）有限公司 具有一个或多个通道的放大系统和方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050054580A1 (en) 1998-11-23 2005-03-10 Novelos Therapeutics, Inc. Methods for production of the oxidized glutathione composite with cis-diamminedichloroplatinum and pharmaceutical compositions based thereof regulating metabolism, proliferation, differentiation and apoptotic mechanisms for normal and transformed cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Biological Chemistry. 제276권 제5호 제3098-3105면

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