KR102143384B1 - 변형 올리고뉴클레오타이드 및 이의 합성방법 - Google Patents

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Abstract

인에 치환된 하나 이상의 포스페이트 기를 함유하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 이의 합성 방법이 개시되어 있다.

Description

변형 올리고뉴클레오타이드 및 이의 합성방법{MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES AND METHODS FOR THEIR SYNTHESIS}
본 발명은 변형된 포스페이트기(modified phosphate group)를 갖는 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드, 및 그들의 합성 방법에 관한 것이다.
다양한 추가 관능기들을 갖는 올리고뉴클레오타이드와 같은 핵산 유도체들은 생명과학 분야에서 연구 수단(tools)으로서 널리 사용되고 있고, 특히 그들은 유망한 치료제[1]로서, 그리고 분자 진단학을 위한 민감성 프로브[2]로서 간주되고 있다. 여러 올리고뉴클레오타이드 치료제들이 FDA에 의해 임상 실험에 대한 승인을 받았다. 그 예들에는, 항바이러스제 Vitravene (Fomivirsen, ISIS 2922)[3], 혈관형성 억제성 앱타머(anti-angiogenic aptamer) Macugen (Pegaptanib sodium) [4] 및 항콜레스테롤 갭타머(gapmer) Mipomersen (Kynamro, ISIS 301012)[5]이 포함된다. 현재, siRNA, DNA 효소(DNAzymes) 및 안티센스 모르폴리노 유사체들(PMO)과 같은 많은 다른 올리고뉴클레오타이드 후보군들이 임상 실험의 다양한 임상 단계들(pahses)에서 시험되고 있다.
1. 충분한 안정성, 및 그들의 생물학적 타겟(왜로, 세포 RNA임)에 대한 상보적 복합체의 서열 특이성.
2. 혈청과 같은 생물학적 매질에서의 증가된 내성.
3. 수성 용해도 및 화학적 안정성과 같은 유리한 물리화학적 성능들.
4. 비용-효율적인 합성 및 적당한 가격.
5. 효율적인 세포 포획(uptake) 및 바람직하게는 외부 형질주입제의 부재하에서의 생체내 전달.
작용 메카니즘에 따르면, 올리고뉴클레오타이드 유사체들(analogues)은 실제적으로 유전자 정보 전달의 어느 단계, 즉 DNA로부터 RNA로 (전사) 또는 RNA로부터 단백질로 (번역)의 단계와 경쟁할 수 있다. 전사의 억제는, 삼합체(triplex)를 형성하는 올리고뉴클레오타이드들(TFOs)[6], 특히 펩타이드 핵산들(PNAs)[7]에 의한 게놈 DNA와의 결합에 의해 수행된다. 번역의 억제(안티센스 메카니즘)는, mRNA 차단을 통해 실현된다[8]. 지금까지 알려진 대부분의 올리고뉴클레오타이드 유사체들은 안티센스 메카니즘에 의해 작용한다. 그들은 소간섭 RNA(siRNAs)[9], 핵산 효소들(리보자임 또는 DNA 효소들)[10], 및 대부분의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드 유사체들[11]이다. 앱타머와 같은 특정의 올리고뉴클레오타이드 유도체들은 단백질 또는 소분자 공동 인자들(co-factors)에 대한 직접 결합에 의해 단백질 기능을 차단할 수도 있다[12].
대부분의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 유사체들은 mRNA에 결합하여, 입체 장애를 통해 번역을 억제한다[13]. 이들은 2'-플루오로 [14], 2'-0-메틸 [15], 2'-0-3-메톡시에틸(2 -MOE)[16]과 같은 당(sugar)에서의 변형을 갖는 대부분의 유사체들 또는 잠금(locked) 핵산(LNA)[17] 유도체들을 포함한다. 비하전 기(uncharged group)가 메틸포스포네이트[18], 포스포트리에스테르[19] 또는 포스포아미데이트[20]와 같은 음이온성 인터뉴클레오사이드(internucleoside) 포스페이트기로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유사체들도 입체 장애를 통해 작용한다. 동일한 안티센스 메카니즘이 PNAs[21] 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(PMO) [22]와 같은 핵산 유사체들(mimics)의 작용에도 관여한다.
예를 들어, 2'-데옥시 포스포로티오에이트(2'-deoxy phosphorothioates) [23], 아라-2'-플루오로 유도체들 (ara-2'-fluoro derivatives)(2'-FANA)[24] 또는 갭타머[24]에 의해 세포 효소 RNase H를 구성함으로써, RNA의 가수분해적 분해를 촉매화하여 RNA를 비가역적으로 비활성화시킬 수 있는 그러한 유사체들에 대한 추가적 관심이 모아지고 있다. SiRNAs는 리보뉴클레아제 활성[25]을 갖는 RISC 복합체를 활성화시킴으로써 mRNA의 촉매적 분해를 유도하는 반면, 핵산 효소들(리보자임 또는 DNA 효소들)은 그들의 촉매적 RNA 분해 작용을 위해 단백질이 요구되지 않는다[27].
많은 올리고뉴클레오타이드 유사체들은 변형된 인터뉴클레오사이드 포스페이트기를 갖는다. 이들 중 포스포로티오에이트[28], 포스포로디티오에이트[29] 및 보라포스페이트[30]를 들 수 있다. 이들 유도체들의 유리한 특징은 천연 2'-데옥시리보뉴클레오타이드 및 매우 효과적인 고체상 DNA 포스포르아미다이트 화학물[31]의 사용에 따른 저렴한 비용이다. 포스페이트-변형 유사체들은 비대칭 인(phosphorous) 원자(들)을 포함하고, 통상적으로 다량체(n-mer) 올리고뉴클레오타이드에 대한 2n-1 부분입체이성질체들(diastereomers)의 혼합물로서 수득된다. 서로 다른 부분입체이성질체들은 종종 안티센스 작용의 가능성을 위해 중요한 요소들인 RNA에 대한 친화도 및 효소 내성도 다르다.
현재, 특히 중요한 과제는, 효율적인 세포 포획 및 바람직하게는 양이온성 지질, 폴리머 또는 나노입자들과 같은 외부 형질주입제의 부재하에서의 생체내 전달 능력을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체들을 개발하는 것이다. 감소된 또는 완전히 배제된 음 전하를 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체들이 특히 관심의 대상이 될 수 있다[32]. 이들이 예로는, 중성 전하(charge neutral)의 포스포르아미데이트 기(phosphoramidate group)를 음이온 포스페이트로 치환하는 올리고뉴클레오사이드 포스포르아미데이트가 있다. 포스포르아미데이트의 화학적 합성은 비교적 간단하다. 그러나, 그러한 유사체들은 RNA에 대한 감소된 친화도를 나타내고[33], 산성 조건하에서의 가수분해에 대해 민감하다[34]. N3' → P5' 포스포르아미데이트는 향상된 RNA 결합능을 가지지만, 합성하기가 어렵다[35]. 측쇄에 양으로 하전된 기를 가지는 대표적인 것들이 더욱 사용이 용이하고, 효소적 안정성이 우수하지만, 그들은 RNA에 대한 친화도가 낮다[36]. 동시에, 모르폴린(PMOs)과 같은 유용한 안티센스제를 포함하는 대부분의 알려진 포스포르아미데이트 유도체들은 산성 pH에서 어느 정도 불안정성을 나타낸다. 향상된 산 안정성은 엔도솜 내에서의 올리고뉴클레오타이드 유사체들의 분해를 방지하기 위해 요구될 것이다.
지난 십여년 동안, 이온화가능한 포스포네이트 기를 천연 포스페이트로 치환한 새로운 포스포네이트 올리고뉴클레오타이드 유사체들이 개발되었다. 이들의 예로는, 포스포노아세테이트 및 티오포스포노아세테이트[38], 포스포노포르메이트[39], 및 1,2,3-트리아졸-4-일포스포네이트[40]가 있다. 이러한 화합물들은 증가된 생물학적 내성 및 적합한 RNA 결합능을 나타내고, 추가적으로 이들은 RNase H 분해를 지지하고, 형질주입제의 부재하에서도 향상된 세포 포획능을 갖는다. 그러나, 이들의 화학적 합성은 어렵고, 비용이 든다.
적어도 하나의 P=N-Acc 구조(여기서, Acc는 전자 수용체이다)를 포함하는 변형된 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드도 알려져 있다[41]. Acc로서 적합한 종류는 -CN, -SO2R, 및 적어도 하나의 질소가 알킬화되어 오르쏘 또는 파라 위치에 존재하는 전자-부족(electron-deficient) 6원 N+ 헤테로고리이다.
현재, 안티센스 제제로 알려져 있는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드들(PMOs)[42]에 대해 상당한 관심이 모아지고 있다. 이들은 GeneTools LLC.로부터 상업적으로 입수가능하다. PMOs는 가능성있는 치료제로서 Sarepta Therapeutics사(2012년까지는 AVI Biopharma 였음)에 의해 적극적으로 개발되었다. 2013년에, 상기 회사는, 디스트로핀(dystrophin) 프리-mRNA[43]의 비정상적인 스플라이싱을 바로잡는 PMO 약물인 에터플리젠(Eteplirsen)(AVI-4658)을 이용한 듀켄씨근이영양증(DMD; Duchenne muscular dystrophy)에 대한 Ⅲ상 임상 실험을 성공적으로 완료했음을 발표하였다. 2014년 초에, Sarepta Therapeutics사는 그들의 모르폴리노 약물 후보군인 AVI-7288이 RNA-함유 바이러스[44]에 의해 야기된 치명적인 마르부르크 출혈열(Marburg hemorrhagic fever)에 대한 Ⅰ상 임상실험을 성공적으로 통과하였음을 발표하였다.
그러나, 모르폴리노류는 다른 포스포르아미데이트들과 마찬가지로 산에 민감하다[45]. 더구나, 그들의 합성은 P(V) 화학법에 근거한다[46]. 상기 화학법은 구아닌의 O6의 변형과 같은 부반응들을 일으킬 수 있다[47]. 이는 O6 위치에 대한 보호기에 의해 방지될 수 있으나, 이를 위해서는 특정의 G 모노머가 요구되므로, PMO 합성 비용이 증가하게 된다. 상기 화학법의 다른 결점은, 통상의 포스포르아미데이트 방법과 호환성이 없고, Glen Research, Inc.와 같은 일반적인 공급사로부터 입수가능한 변형제 및 라벨링제들을 사용할 수 없다는 것이다.
PMOs의 다른 심각한 문제점은 구조-활성 연구를 위한 다양한 유도체들을 얻기 위해 그들을 화학적으로 변형시키기가 어렵다는 것이다. PMO의 세포 포획능 및 치료 효율을 향상시키는 것으로 주장된, PMO에 대한 단지 몇개의 측쇄 변형이 제안되어 있을 뿐이다[49].
모르폴리노류는 종종 세포 포획에 대해 상대적으로 뒤떨어지는 효율을 나타내고, 따라서 양호한 치료 효과를 나타내기 위해서는 매우 여러번의 반복 투여가 요구된다. PMO-펩타이드 결합체(conjugates)의 세포 포획능은 순수 PMO 보다 훨씬 더 높아서, 생체내 요구 투여량이 훨씬 더 낮다[50]. 전달제의 부재하에서 더 높은 수준의 세포 및 조직 전달능 및 향상된 치료 효율을 나타낼 수 있는 더 우수한 올리고뉴클레오타이드 유사체들이 요구된다.
따라서, 새로운 올리고뉴클레오타이드 유사체들의 개발은 중요한 과제로 남아있다.
본 발명은 향상된 세포 포획능을 갖는 올리고뉴클레오타이드 치료제들을 위한 유망한 후보군들에 대한 본 발명자들의 식견에 기초한다. 구체적으로, 본 발명은 그러한 새로운 올리고뉴클레오타이드 치료제들에 대한 적합한 접근법/특성화를 위한 다음의 아이디어들에 기초한다:
1. 중성 전하 또는 양 전하로 하전된 기들을 천연 음이온성 포스페이트로 치환함.
2. 상기에서 개략적으로 서술된 올리고뉴클레오타이드 치료제들에 대한 요건들을 충족함.
3. 바람직하게는, 통상의 뉴클레오타이드 주쇄(backbone)를 유지함.
4. 충분한 화학적 안정성을 나타냄.
5. 다양한 측쇄 기들의 통합을 가능하게 하는 구조적 유연성을 가짐.
6. 낮은 독성을 가짐.
본 명세서에서는, 상기 요건들에 해당하고, 잠재적으로 향상된 세포 포획능을 나타내는 새로운 올리고뉴클레오타이드 유사체들이 개시된다. 개략적으로 서술하면, 그러한 올리고뉴클레오타이드 유사체들은 포스포릴 이민(phosphoryl imines) 및 그들의 유사체들로 분류되며, 예를 들어 포스포릴 구아니딘, 포스포릴 아미딘, 포스포릴 이소우레아, 포스포릴 이소티오우레아, 포스포릴 이미데이트, 포스포릴 이미도티오에이트 및 그들의 유사체들이다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 포스포릴 구아니딘 (FⅠ), 포스포릴 아미딘(FⅡ), 포스포릴 이소우레아 (FⅢ), 포스포릴 이소티오우레아 (FⅣ), 포스포릴 이미데이트 (FⅤ) 또는 포스포릴 이미도티오에이트 (FⅥ), 예를 들어, 포스포릴 구아니딘 (FⅠ), 포스포릴 아미딘(FⅡ), 포스포릴 이소우레아 (FⅢ), 포스포릴 이소티오우레아 (FⅣ)를 포함하는 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
예를 들어, 본 발명은, 특히, 다음의 모티프들(motifs) 중 하나 이상을 포함하는 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 및 이들의 유사체들에 관한 것이다:
Figure 112017020126395-pct00001
FⅠ FⅡ
Figure 112017020126395-pct00002
FⅢ FⅣ
Figure 112017020126395-pct00003
FⅤ FⅥ
여기에서, ……는 치환기의 부착 위치를 나타낸다.
상기 변형 포스페이트 기들은 그들의 물리-화학적 성능들때문에 상당한 관심을 받고있다. 어느 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 이들 모이어티들(moieties)은 생리학적 pH에서 중성 전하, 음 전하 또는 양 전하로 하전될 수 있고, 이에 의해 그들은 치료용, 진단용 및 연구용으로 유용한 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드의 합성을 위해 중요한 관심의 대상이 된다.
또한, 본 발명자들은 이들 변형된 포스페이트 기들은 본 명세서에서 기재된 방법들을 이용하여 편리하게 올리고뉴클레오타이드의 구조 내로 도입될 수 있고, 생물학적으로 관심 대상이 되는 변형 및/또는 라벨링된 공지의 많은 올리고뉴클레오타이드 모티프들 및 서열들과 호환가능하다는 것을 밝혀내었다.
예를 들어, 상기 모티프는 다음의 화학식으로 표시될 수 있다:
Figure 112017020126395-pct00004
FⅦ
여기서:
R1은 -NR1AR1B, -OR3, -SR3, -H, -S(0)H, -S(0)R3, -S(0)2H, -S(0)2R3, -S(0)2NH2, -S(0)2NHR3, -S(0)2NR3 2, -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴로부터 선택된다;
R2는 -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, 할로겐, -CN, -S(0)H, -S(0)R3, -S(0)2H, -S(0)2R3, -S(0)2NH2, -S(0)2NHR3, -S(0)2NR3 2, -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴로부터 선택된다;
상기에서, 각각의 R1A, R1B, R2A, 및 R2B 는 독립적으로 -H, -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴로부터 선택된다;
선택적으로, R1A 및 R2A는 함께 2~4개 원자 길이의 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 사슬을 형성한다;
선택적으로, R1A 및 R1B는 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 5~8원 헤테로고리를 형성한다;
선택적으로, R2A 및 R2B는 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 5~8원 헤테로고리를 형성한다;
R3는 -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴로부터 선택된다;
상기에서, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌은 선택적으로 치환되어 있다.
따라서, 첫번째 측면에서, 본 발명은 다음의 화학식 (Ⅰ)의 화합물을 제공할 수 있다:
Figure 112017020126395-pct00005
(Ⅰ)
여기서, Z는 -O-, -S-, -Se-, -N-RN, 또는 -BH3 -로부터 선택되고, 상기 RN은 H, -C1-4 알킬, 또는 보호기이다;
X는 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체의 5' 말단으로부터 선택되고, Y는 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체의 3' 말단; -H, -OH, -SH, NHRN, -O-PG, 또는 S-PG (여기서, PG는 보호기이다); 연결기(linker), 모노포스페이트 또는 디포스페이트, 또는 라벨(label) 또는 퀀처(quencher)로부터 선택된다; 또는
Y는 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체의 3' 말단으로부터 선택되고, X는 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체의 5' 말단; -H, -OH, -SH, NHRN, -O-PG, 또는 S-PG (여기서, PG는 보호기이다); 연결기, 모노포스페이트 또는 디포스페이트, 또는 라벨(label) 또는 퀀처(quencher)로부터 선택된다;
R1은 -NR1AR1B, -OR3, -SR3, -H, -S(0)H, -S(0)R3, -S(0)2H, -S(0)2R3, -S(0)2NH2, -S(0)2NHR3, -S(0)2NR3 2, -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴로부터 선택된다;
R2는 -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, 할로겐, -CN, -S(0)H, -S(0)R3, -S(0)2H, -S(0)2R3, -S(0)2NH2, -S(0)2NHR3, -S(0)2NR3 2, -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴로부터 선택된다;
여기서, 각각의 R1A, R1B, R2A, 및 R2B는 독립적으로 -H, -C1 -10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴로부터 선택된다;
선택적으로, R1A 및 R2A는 함께 2~4개 원자 길이의 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 사슬을 형성한다;
선택적으로, R1A 및 R1B는 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 5~8원 헤테로고리를 형성한다;
선택적으로, R2A 및 R2B는 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 5~8원 헤테로고리를 형성한다;
R3는 -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴로부터 선택된다;
상기에서, 각각의 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌은 선택적으로 치환되어 있다.
일부 구체예에서, R1은 -NR1AR1B, -OR3, 및 -SR3로부터 선택된다. 일부 구체예에서, R1은 -NR1AR1B이다.
따라서, 상기 화합물은 다음의 화학식 (Ⅰa)일 수 있고, 여기서 X, Y, Z, R1A, R1B 및 R2는 상기에서 정의된 바와 같다.
Figure 112017020126395-pct00006
(Ⅰa)
상기 화합물은 "변형된" 뉴클레오타이드, "변형된" 올리고뉴클레오타이드, 또는 "변형된" 뉴클레오사이드 트리포스페이트일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 용어 "변형된(modified)"은 화학식 (Ⅰ)에 나타낸 변형된 포스페이트 모이어티, 즉 화학식 (FⅦ)에 나타낸 모티프를 포함하는 포스페이트의 도입을 의미한다는 것이 이해될 것이다.
뉴클레오사이드 트리포스페이트는 3개의 포스페이트 기들에 결합된 뉴클레오사이드를 포함하는 분자이다. 본 명세서에서, 상기 용어 "포스페이트"는 본 명세서에서 정의된 변형된 포스페이트를 포함한다는 것이 이해될 것이다. 적절하게는, 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 일렬로 함께 연결된 3개의 포스페이트들인 트리포스페이트 기를 갖는다; 즉, 상기 분자는 dNTP 또는 그와 유사한 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 뉴클레오사이드는 5' 및 3' 위치 모두에 포스페이트를 가질 수 있는데, 예를 들어, 5' 위치에 단일 포스페이트 기를 갖고, 3' 위치에 디포스페이트 기(함께 연결된 2개의 포스페이트)를 가질 수 있다. 이들 포스페이트 기들 중 어느 기 또는 모든 기들은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 변형될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
상기 화합물이 올리고뉴클레오타이드인 경우, 각각의 추가 뉴클레오사이드 자체는 독립적으로 뉴클레오사이드 유사체일 수 있고, 그리고 추가적으로 또는 대안적으로 각각의 추가 포스페이트 기(만약 존재하는 경우) 자체는 변형될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
일부 구체예에서, R2는 -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, -S(0)H, -S(0)R3, -S(0)2H, -S(0)2R3, -S(0)2NH2, -S(0)2NHR3, -S(0)2NR3 2, -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴로부터 선택되고; 여기서 각각의 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌은 선택적으로 치환된다.
일부 구체예에서, R2는 -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴로부터 선택되고; 여기서, 각각의 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌은 선택적으로 치환된다.
일부 구체예에서, R2는 -H, -NR2AR2B 또는 -OR3이다. 예를 들어, 상기 화합물은 포스포릴 포름아미딘 (P-N=CHNR1AR1B) 기, 포스포릴 구아니딘 (P-N=C(NR1AR1B) (NR2AR2B)), 또는 포스포릴 이소우레아 (P-N=C(NR1AR1B)OR3) 기를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, R3는 C1-4 알킬, 바람직하게는 메틸이다.
일부 구체예에서, R1A는 독립적으로 -H, 및 -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -C1-4 알콕시, -NH2, -NH(C1-4 알킬) 및 -N(C1-4 알킬)2 로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 -C1-4 알킬로부터 선택되고; 바람직하게는 -H 및 C1-4 알킬, 더욱 바람직하게는 -H 및 메틸로부터 선택된다.
일부 구체예에서, R1B는 독립적으로 -H, 및 -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -C1-4 알콕시, -NH2, -NH(C1-4 알킬) 및 -N(C1-4 알킬)2 로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 -C1-4 알킬로부터 선택되고; 바람직하게는 -H 및 C1-4 알킬, 더욱 바람직하게는 -H 및 메틸로부터 선택된다.
일부 구체예에서, R2A는 독립적으로 -H, 및 -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -C1-4 알콕시, -NH2, -NH(C1-4 알킬) 및 -N(C1-4 알킬)2 로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 -C1-4 알킬로부터 선택되고; 바람직하게는 -H 및 C1-4 알킬, 더욱 바람직하게는 -H 및 메틸로부터 선택된다.
일부 구체예에서, R2B는 독립적으로 -H, 및 -F, -Cl, -OH, -C1-4 알콕시, -NH2, -NH(C1-4 알킬) 및 -N(C1-4 알킬)2 로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 -C1-4 알킬로부터 선택되고; 바람직하게는 -H 및 C1-4 알킬, 더욱 바람직하게는 -H 및 메틸로부터 선택된다.
일부 구체예에서, R1A, R1B, R2A, 및 R2B 각각은 독립적으로 -H, 및 -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -C1-4 알콕시, -NH2, -NH(C1-4 알킬) 및 -N(C1-4 알킬)2 로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 -C1-4 알킬로부터 선택되고; 바람직하게는 -H, 및 -F, -Cl, -OH, 및 -NH2로부터 선택되는 하나 내지 세개의 치환기로 선택적으로 치환된 C1-4 알킬로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 -H 및 C1-4 알킬, 더욱 바람직하게는 -H 및 메틸로부터 선택된다.
일부 구체예에서, R2는 -NR2AR2B, 바람직하게는 -NMe2 이다.
일부 구체예에서, R1은 -NH2 또는 -NMe2 이다.
일부 구체예에서, R1A 및 R2A는 함께 2~4개 원자 길이의 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 사슬을 형성하고, R1B 및 R2B는 각각 독립적으로 -H 및 -C1-4 알킬로부터 선택된다. 일부 구체예에서, R1A 및 R2A는 함께 -CH2-CH2-를 형성한다. 일부 구체예에서, R1A 및 R2A는 함께 -CH2-CH2-를 형성하고, R1B 및 R2B는 -H 또는 메틸이다.
일부 구체예에서, R1A 및 R1B는 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 5~8원 헤테로고리, 바람직하게는 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진 또는 모르폴린을 형성한다. 적절하게는, 그들은 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 5~8원 헤테로고리, 바람직하게는 피롤리딘을 형성한다.
일부 구체예에서, R2A 및 R2B는 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 5~8원 헤테로고리, 바람직하게는 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진 또는 모르폴린을 형성한다. 적절하게는, 그들은 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 5~8원 헤테로고리, 바람직하게는 피롤리딘을 형성한다.
본 명세서에서 기재된 Z는 -O-, -S-, -Se_, -N-RN, 또는 -BH3 -로부터 선택될 수 있고, 여기서 RN은 -H, -C1-4 알킬, 또는 보호기이다. 바람직하게는, Z는 -O- 또는 -S- 이고, 가장 바람직하게는 -O- 이다. -P+-O-는 -P=0의 공명 구조임이 인식될 것이다.
임의의 바람직한 화합물들은 다음의 화학식들의 화합물들이다:
Figure 112017020126395-pct00007
Figure 112017020126395-pct00008
다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 하기 화학식 FⅦ의 변형된 포스페이트 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다:
Figure 112017020126395-pct00009
FⅦ
여기서, R1 및 R2는 상기에서 정의된 바와 같다.
다른 측면에서, 본 발명은, 포스페이트-연결 인접(phosphate linking adjacent) 뉴클레오사이드/뉴클레오사이드 유사체가 포스포릴 구아니딘, 포스포릴 아미딘, 포스포릴 이소우레아, 포스포릴 이소티오우레아, 포스포릴 이미데이트 또는 포스포릴 이미도티오에이트를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 화학식 FⅦ의 모티프를 포함하는 화합물의 합성 방법을 제공한다:
Figure 112017020126395-pct00010
FⅦ
하나의 측면에서, 상기 방법은, 산화제 및 선택적으로 실릴화제 및/또는 염기의 존재하에, 인산 유도체와 이미노 유도체 HN=CR1R2 또는 N-실릴화 이미노 유도체 RSi 3SiN=CR1R2의 반응을 포함하고(공정 A), 여기에서 RSi는 알킬기 또는 아릴기이다. 예를 들어, 상기 인산 유도체는 포스파이트 또는 H-포스포네이트일 수 있다.
상기 공정 A를 위한 이미노 유도체들의 예로는, 제한없이, 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(TMG), 구아니딘 하이드로클로라이드, 1,1-디메틸구아니딘 설페이트, 1,3-디페닐구아니딘, 포름아미딘 하이드로클로라이드, 아세트아미딘 하이드로클로라이드, 1H-피라졸-1-카르복스아미딘 하이드로클로라이드, N-Boc-1H-피라졸-1-카르복스아미딘, 에틸포름이미데이트 하이드로클로라이드, 에틸아세트이미데이트 하이드로클로라이드, O-메틸이소우레아 하이드로겐 설페이트, S-메틸이소티오우레아 하이드로겐 설페이트, S-벤질이소티오우레아 하이드로클로라이드 등을 포함한다.
이미노 유도체는, 본 명세서에 기재된 바와 같이 자유 염기의 형태 또는 염의 형태일 수 있다는 것이 인식될 것이다. 만약, 이미노 유도체가 염인 경우, 이미노 유도체의 자유 염기를 만들기 위해 염기가 첨가될 수 있고, 그리고/또는 이미노 화합물의 N-실릴화 유도체를 생성하기 위해 실릴화제가 적용될 수 있다.
상기 산화제는 요오드 I2, 브로민 Br2, 염소 Cl2, 요오드 클로라이드 ICl, N-브로모숙신이미드, N-클로로숙신이미드, N-요오도숙신이미드, 카본 테트라클로라이드 CCl4, 브로모트리클로로메탄 CCl3Br, 테트라브로모메탄 CBr4, 테트라요오도메탄 CI4, 요오도포름 CHI3, 헥사클로로에탄 C2Cl6, 헥사클로로아세톤(CCl3)2CO 등을 포함한다. 바람직한 산화제는 요오드 I2 이다.
다른 측면에서, 상기 방법은, 선택적으로 실릴화제 및/또는 염기의 존재하에, 인산 유도체와 유기 아자이드(azide)의 반응을 포함한다(공정 B).
예를 들어, 상기 유기 아자이드는 비스(이치환 아미노)-1-아지도카르베늄 염, 1-(이치환 아미노)-1-아지도카르바미디늄 염, 1-(이치환 아미노)-1-아지도-에탄, N-치환-1-아지도카르바미딘 등으로부터 선택될 수 있다.
상기 공정 A 및 공정 B의 반응들에서, 상기 반응은 실릴화제, 예를 들어 N,0-비스(트리메틸실릴)아세트아미드(BSA), N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(BSTFA), 클로로트리메틸실란, 브로모트리메틸실란, 요오도트리메틸실란, 트리에틸실릴 클로라이드, 트리페닐실릴 클로라이드, 헥사메틸디실라잔, 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf), 디메틸이소프로필실릴 클로라이드, 디에틸이소프로필실릴 클로라이드, 터셔리-부틸디메틸실릴 클로라이드, 터셔리-부틸디페닐실릴 클로라이드, 트리이소프로필실릴 클로라이드, 디메틸디클로로실란, 디페닐디클로로실란 등의 존재하에 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 반응은 N,0-비스(트리메틸실릴)아세트아미드(BSA), N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(BSTFA), 및 클로로트리메틸실란으로부터 선택되는 실릴화제의 존재하에 수행될 수 있다.
상기 공정 A 및 공정 B의 반응들에 있어서, 상기 반응은 염기, 예를 들어 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA), N-메틸모르폴린, N-에틸모르폴린, 트리부틸아민, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄(DABCO), N-메틸이미다졸(NMI), 피리딘, 2,6-루티딘, 2,4,6-콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌("프로톤 스폰지"), 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU), 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5엔(DBN), 1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔(TBD), 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔(MTBD), 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(TMG), 2-터셔리-부틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2,8,9-트리메틸2,5,8,9-테트라아자-1-포스파비시클로[3.3.3]운데칸, 포스파젠 염기 등의 존재하에 수행될 수 있다.
상기 공정 A를 위한 용매의 예는, 제한없이, 피리딘, 2-피콜린, 3-피콜린, 4-ㅍ피콜린, 퀴놀린, 테트라히드로푸란(THF), 1,4-디옥산, 1,2-디메톡시에탄(DME), 디에틸렌글리콜 디메틸에테르(diglym), 디에틸에테르, 아세토니트릴 등을 포함한다.
상기 공정 B를 위한 용매의 예는, 제한없이, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드(DMF), N,N-디메틸아세트아미드(DMA), N-메틸피롤리돈(NMP), 테트라메틸 우레아, 1,3-디메틸이미다졸리딘-2-온, 설포란, 헥사메틸포스포르트리아미드(HMPT), 1,4-디옥산, 테트라히드로푸란(THF), 아세톤, 에틸아세테이트 등을 포함한다.
이들 공정에 대한 추가의 상세 내용은 하기에 제공된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 변형된 포스페이트 모이어티의 특별한 장점은 본 발명자들에 의해 입증된 바와 같이 이들 모이어티들의 편리한 도입이다. 예를 들어, 화학식 FⅦ의 변형된 포스페이트 모이어티는 H-포스포네이트 또는 포스포르아미다이트 화학법에 기초한 연속적 올리고뉴클레오타이드 합성 반응 동안 올리고뉴클레오타이드 내로 쉽게 도입될 수 있다. 추가의 상세 내용은 하기에 제공된다.
본 발명의 임의의 하나 이상의 측면은 본 발명의 하나 이상의 다른 측면과 조합될 수 있다. 유사하게, 상기 측면들 중 어느 측면의 하나 이상의 특징들 및 선택적 특징들은 다른 측면들의 어느 하나에 적용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서의 개시내용 및 바람직한 특징들은 일부 측면들 또는 모든 측면들에 적용될 수 있다. 특히, 상기 화합물들, 모티프들 및 중간물들, 상기 화합물들의 제조방법들 및 상기 화합물들의 사용방법들 등과 관련된 선택적 특징들 및 바람직한 특징들은 다른 모든 측면들에 적용된다. 예를 들어, 상기 화합물들에 대한 치환기들의 선호도는 아자이드/이미노 유도체들에도 적용되고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 또한, 방법 또는 사용과 관련된 선택적 특징들 및 바람직한 특징들은 생성물에도 적용될 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하다.
본 발명은, 제한없이, 다음의 도면들을 참조하여 더 설명된다:
도 1. N,N,N',N'-테트라메틸-N"-포스포릴구아니딘 기들로 변형된 올리고뉴클레오타이드들인 5'-d(GCGCCAAACpA) (얇은 검정색 선), 5'-d(GCGCCAAApCpA) (회색 선) 및 5'-d(GCGCCAApApCpA) (진한 검정색 선)의 RP-HPLC; 여기서 및 이하에서, p는 변형기의 위치를 표시한다.
도 2. N-포스포릴구아니딘 기로 변형된 올리고뉴클레오타이드인 5'-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTpT)의 RP-HPLC.
도 3. N,N,N',N'-테트라메틸-N"-포스포릴구아니딘 기들로 변형된, LNA 뉴클레오타이드를 갖는 올리고데옥시리보클레오타이드들인 5'-d(TTTT)tdT (얇은 검정색 선), 5'-d(TTTT)tpdT (회색 선) 및 5'-tpd(TTTTT) (파선; dashed line)의 RP-HPLC; t는 LNA 뉴클레오타이드의 위치를 표시한다.
도 4. N,N'-비스(테트라메틸렌)-N"-포스포릴구아니딘 기로 변형된 올리고-2'-0-메틸리보뉴클레오타이드인 5'-UUUUUp*U (진한 검정색 선), N,N'-디메틸-N"-ㅍ포스포릴이미노-2-이미다졸리딘 기로 변형된 올리고-2'-0-메틸리보뉴클레오타이드인 5'-UUUUUpU (회색 선), 및 변형되지않은 올리고-2'-0-메틸리보뉴클레오타이드인 5'-UUUUUU (굵은 검정색 선)의 RP-HPLC.
도 5. N-시아노이미노포스페이트 기로 변형된 올리고뉴클레오타이드인 5'-d(TpTTTTT)의 RP-UPLC.
도 6. N,N'-비스(테트라메틸렌)-N"-구아니디노포스페이트 기로 변형된 올리고뉴클레오타이드들인 5'-d(TTTTTT)p (진한 검정색 선), 5'-DMTr-Flu pd(TTTTTT) (얇은 검정색 선) 및 뉴클레오타이드 5'-DMTr-Flu pdT(회색 선)의 RP-HPLC.
도 7. N,N'-디메틸-N"-포스포릴이미노-2-이미다졸리딘 기들로 변형된 올리고뉴클레오타이드들인 5'-d(TTTTTpT), 5'-d(TTTTpTpT), 5'-d(TTTpTpTpT), 5'-d(TTpTpTpTpT) 및 5'-d(TpTpTpTpTpT)의 RP-HPLC; p는 변형기의 위치를 표시한다.
도 8. 모든 인터뉴클레오사이드 위치들에서 N,N'-디메틸-N"-포스포릴이미노-2-이미다졸리딘 기들로 완전히 변형된 올리고뉴클레오타이드인 5'-d(GpCpGpCpCpApApApCpA)의 RP-HPLC.
약어 및 부호 표기
p - 기재된 바와 같은 변형 포스페이트기의 위치
t - LNA-T 뉴클레오타이드의 위치
a - LNA-A 뉴클레오타이드의 위치
c - LNA-5-Me-C 뉴클레오타이드의 위치
g - LNA-G 뉴클레오타이드의 위치
F - 2-히드록시메틸-3-히드록시테트라히드로푸란(아푸린(apurinic)/아피리미 딘(apyrimidinic) 위치) 포스페이트
BHQ - BlackHole QuencherTM
DD - 1,12-도데칸디올 포스페이트
Flu - 5(6)-카르복시플루오레세인 표지(label)
Ns - 뉴클레오타이드 "N"의 포스포로티오에이트 잔기
BSA - N,0-비스(트리메틸실릴)아세트아미드
BSTFA - N,0-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드
DIEA - N,N-디이소프로필에틸아민
N I - N-메틸이미다졸
DMAP - 4-디메틸아미노피리딘
DBU - 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔
T G - 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘
포스포릴구아니딘은 자연에서 크레아틴 포스페이트 및 포스포아르기닌과 같은 화합물들로 대표된다. 저분자량의 합성 포스포릴 구아니딘이 적어도 1960년대 부터 알려져 있었다[52]. 소분자 포스포릴구아니딘은 살충제[53], 난연제[54] 및 치료제[55]로서의 제한된 용도를 갖는 것이 밝혀져 있다. 포스포릴구아니딘 디에스테르는 구아니딘의 질소를 통해 금속이온들과 착물(complex)을 형성한다[56]. O,O'-디이소프로필포스포릴구아니딘의 X-레이 분석 결과, 결정 구조 내에 포스포릴이미노기 >P(=0)-N=C< 를 갖는 호변이성질체(tautomer)의 존재만 확인되었다.
그러나, 지금까지 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유도체들에 대해서는 개시되지 않았고, 그들의 특성들은 여전히 알려져 있지 않다. 본 발명자들은, 우선, 일차 아민에 대해 이미 알려져 있는 방법론[57]과 유사한 방법론을 사용하여, 피리딘 중의 N,N,N',N'-테트라메틸구아니딘(TMG)의 존재하에 디티미딘 β-시아노에틸포스파이트의 요오드 산화에 의해 올리고뉴클레오사이드 포스포릴구아니딘 을 제조하였다.
본 발명자들은 β-시아노에틸포스파이트 방법[58]에 따른 고체상 DNA 합성 반응에서의 공통 중간체인 CPG-결합 3',5'-디티미딘 β-시아노에틸포스파이트의 산화에 대해 연구하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 1M TMG 및 20% N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드의 존재하에, 무수 피리딘 중의 0.1M 요오드 용액에 의한 상기 포스파이트의 산화에 의해 3',5'-디티미딘-N,N,N',N'-테트라메틸포스포릴구아니딘이 주생성물로서 생성되었다. 주위온도에서 1시간 동안 수성 농축 암모니아로 처리하여, 두개의 부분입체이성질체의 혼합물로서 올리고뉴클레오타이드 5'-d(TTTTTpT)(여기서, p는 변형 포스페이트기의 위치를 나타냄)가 분리되었다( 1.1). 분리된 유일한 부생성물은 dT6 이었고, 이는 흔적량의 수분에 의한 반응성 요오도포스포늄 중간체의 동시적 가수분해의 결과물인 것으로 여겨진다. 본 발명자들은 포스포릴구아니딘 기는 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 과정 및 pH 11에서의 암모니아 탈보호 과정 동안 안정하다고 결론지었다.
올리고티미딘 모노포스포릴구아니딘의 완전성은 MALDI-TOF MS에 의해 확인되었다. 20% 폴리아크릴아미드 겔에서의 겔 전기영동 동안의 그의 유동성(mobility)은 dT6 보다 낮았고, 이는 pH 7.4에서 테트라메틸포스포릴구아니딘 기의 중성 전하 특성을 보여주는 것이며, 이는 저분자량 포스포릴구아니딘에 관한 문헌[59]에서의 결과에 상응하는 것이다.
본 발명자들은, 하나의 테트라메틸포스포릴구아니딘 기를 갖는 20량체(20-mer) 올리고티미딜레이트의 합성을 통하여, 지지체로부터 5'-d(T18TpT) ＞ 5'-d(T10TpT9) ＞ 5'-d(TTpT18)의 순서로 증가할수록 수율은 점점 더 나빠진다는 것에 주목하였다. 미변형 dT20과 비교하여, 단일의 테트라메틸포스포릴구아니딘 기가 올리고뉴클레오타이드 5'-d(C2A20C2)를 갖는 상보적 듀플렉스(duplex)의 열적 안정성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 수득된 올리고티미딜레이트들을 사용하였다.
또한, 본 발명자들은 비치환 포스포릴구아니딘 기를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 성공적으로 수득하였다. 0.5M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.5M 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU) 및 20% BSA의 존재하에, 피리딘 중의 0.1M 요오드 용액에 의한 CPG-결합 3',5'-디티미딘 β-시아노에틸포스파이트의 산화에 이어서 올리고뉴클레오타이드를 합성한 결과, dT6 가수분해 생성물과 함께 주생성물로서 포스포릴구아니딘 기를 갖는 헥사티미딜레이트들이 생성되었다( 5).
유사하게, 피리딘 중의 포름아미딘 하이드로클로라이드, DBU 및 BSA의 존재하에 디티미딘포스파이트의 요오드 산화 후, 올리고뉴클레오타이드의 합성에 의해, 포스포릴이미노 화합물의 다른 군의 대표적 화합물인 헥사티미딘 포스포릴포름아미딘이 생성되었다( 39).
0.5M O-메틸이소우레아 하이드로겐 설페이트, 1M DBU 및 20% BSA의 존재하에, 피리딘 중의 0.1M 요오드 용액에 의한 CPG-결합 3',5'-디티미딘 β-시아노에틸포스파이트의 산화 후, 이어서 올리고뉴클레오타이드 합성 및 주위온도에서 1시간 동안 수성 농축 암모니아에 의한 탈보호에 의해, dT6, 올리고뉴클레오사이드 O-메틸포스포릴이소우레아 및 포스포릴구아니딘을 포함하는 생성물들의 혼합물이 수득되었음이 MALDI-TOF MS로 확인되었다( 7). 상기 포스포릴구아니딘은 포스포릴이소우레아의 메톡시기가 암모니아로 치환됨으로써 생성된 것으로 여겨진다. 55℃에서 16시간 동안의 추가 암모니아 처리에 의해, 포스포릴구아니딘의 양이 증가하였고, O-메틸포스포릴이소우레아의 양은 감소하였다. 마찬가지로, 상기 혼합물을 에탄올 중의 에틸렌디아민(1:1 v/v)으로 55℃에서 16시간 동안 처리한 결과, O-메틸포스포릴이소우레아가 사라졌고, 주생성물로서 N-β아미노에틸포스포릴구아니딘이 생성되었다( 8). 이는, N-β아미노에틸포스포릴구아니딘이 생리학적 pH에서 양으로 하전되므로, 양으로 하전된 기들을 음으로 하전된 포스페이트들로 치환하는 방법을 제시해준다. 양이온성 올리고뉴클레오사이드 포스포릴구아니딘은 외부 형질주입제의 부재하에서도 향상된 세포 포획 및 생체내 전달능을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 단일의 비치환 포스포릴구아니딘 기를 갖는 20량체 올리고티미딜레이트들을 수득하였다(도 2). 그의 수율은 올리고뉴클레오타이드의 길이에 따라 d(T18TpT) ＞ d(T10TpT9) ＞ d(TTpT18)의 순서로 감소하였다. 2개 및 3개의 포스포릴구아니딘 기들을 갖는 올리고뉴클레오타이드 또한 제조되었다; 그러나, 해당 반응들의 경우, 분리하기 어려운 생성물들의 혼합물들이 생성되었고, 이에 본 발명자들은 요오드 산화법은 단일치환된 올리고뉴클레오타이드들의 제조에 가장 효과적이라고 결론지었다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, H-포스포네이트 화학법은 2개 및 3개의 변형기들을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 제조에 사용될 수 있다[63]. CPG-지지 3',5'-디티미딘-H-포스포네이트는, BSA의 존재 또는 부재하에서, 피리딘 중의 0.1M 요오드 및 20부피% TMG에 의해( 1.2 및 1.3), 또는 피리딘 중의 CCl4 또는 CCl3Br 및 20부피% TMG에 의해( 1.4 및 1.5), N,N,N',N'-테트라메틸포스포릴구아니딘으로 산화될 수 있다[64]. 요오드(70~75%)를 사용한 경우, CCl4 또는 CCl3Br(10~20%)을 사용한 경우 보다 전환율이 더 높았다. BSA의 존재하에서, 전환율은 80~85%로 증가하였다. 포스포르아미다이트 방법을 이용한 고체상 합성 후에, 부산물인 dT5 및 dT6와 함께, 테트라메틸포스포릴구아니딘 기를 갖는 헥사티미딜레이트 5'-d(TTTTTpT)가 높은 수율로 수득되었다( 1.3). 본 발명자들은, 요오드/TMG/BSA 산화를 통해, 2치환 및 3치환 포스포릴구아니딘들인 5'-d(TTTTpTpT)( 3.1) 및 5'-d(TTTpTpTpT)( 4.1)를 성공적으로 수득하였으나, 후자의 경우 수율이 낮았다.
올리고뉴클레오사이드 포스포릴 구아니딘의 수율을 향상시키기 위하여, 본 발명자들은, BSA의 존재 또는 부재하에서, N,N-디메틸포름아미드 또는 아세토니트릴 중에서 CPG-결합 디뉴클레오사이드 β-시아노에틸포스파이트와 테트라알킬 아지도카르베늄 염들 간의 신규한 반응을 개발하였다. 상기 반응은 주위 온도 또는 40~45℃에서 수행될 수 있다. BSA뿐 아니라 5% 트리에틸아민의 첨가에 의해 수율이 증가하였다. 이 방법은 복수의 테트라알킬포스포릴구아니딘 기들을 갖는 올리고뉴클레오타이드들의 제조에 효과적임이 판명되었다(도 1). 완전히 변형된 올리고뉴클레오사이드 포스포릴구아니딘의 제조를 위해, DNA 합성기에서 상기 방법의 자동화 버젼이 사용되었다( 47).
중성 전하 또는 양이온성 포스포릴구아니딘과 함께, 본 발명자들은 또한 이온화가능한 N-시아노이미노포스페이트기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드들도 제조하였다. 이 경우, 주위 온도에서, CPG-결합 디뉴클레오사이드 포스파이트를 아세토니트릴 중의 0.25M 시아노겐 아자이드 용액과 반응시켰다. 그 결과는, 올리고뉴클레오타이드의 수율은 사용된 탈보호 방법에 따라 달라진다는 것을 보여준다. N-시아노이미노포스페이트 기를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하기 위하여, 70℃에서 1시간 동안, 수성 암모니아 대신 에틸렌디아민 및 에탄올의 혼합물(1;1 v/v)을 사용한 경우, 우수한 결과가 얻어졌다( 40 및 41).
수득된 N-시아노이미노헥사티미딜레이트들인 5'-d(TTTTTpT) 및 5'-d(TpTTTTT)의 전기영동 이동성은 dT6와 매우 유사하였고, 이는 N-시아노이미노기가 생리학적 pH에서 음 전하를 갖는다는 것을 시사한다. 상기 올리고뉴클레오타이드들은 비변형 헥사티미딜레이트 보다 단지 약간 소수성이었다. RP-HPLC에 의해 2개의 부분입체이성질체들이 관찰되었다(도 5).
일군의 변형된 올리고뉴클레오타이드들은 포스포릴구아니딘 변형체들, 특히 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드들(도 4), LNA(도 3) 및 RNA 자체( 46)와 같은 리보뉴클레오타이드 유도체들과 호환성이 있는 것으로 판명되었다. 포스포로티오에이트 기들은 포스포릴구아니딘 기들과 함께 올리고뉴클레오타이드 내로 성공적으로 도입될 수 있다( 32~35). 플루오레세인, 아바신 부위, 비-뉴클레오사이드 삽입체 또는 BlackHole 퀀처와 같은 다른 일군의 변형체들도 허용가능하였다. 3'- 또는 5'-포스포릴구아니딘 기들을 갖는 모노뉴클레오타이드들도 제조되었다(실시예 42 및 44, 도 6).
정의(Definitions)
용어 "뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드 또는 변형된 뉴클레오사이드, 및 공유결합으로 연결된 적어도 하나의 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기를 포함하는 화합물을 의미한다. 공유결합의 예로는, 제한없이, 뉴클레오사이드의 3', 2' 또는 5' 히드록실기 및 포스페이트기 사이의 에스테르 결합을 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는 폴리머 사슬 내에 함께 결합된 둘 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 의미한다. 올리고뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드의 경우, 하나의 가닥 또는 두 가닥모두 에 본 발명에 따른 변형된 포스페이트를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 둘 이상의 뉴클레오타이드들로 이루어진 폴리머일 수 있으나, 임의의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 뉴클레오타이드들 중 어느 하나의 최소 길이를 가질 수 있다. 선택적으로, 올리고뉴클레오타이드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 또는 500개 뉴클레오타이드들 중 어느 하나의 최대 길이를 가질 수 있으나, 일부 구체예에서는 이보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드들 또한 제공된다. 순전히 예시로서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 뉴클레오타이드들 중 하나를 갖는 올리고뉴클레오타이드들이 제공된다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드들에 있어서, 1개, 여러개(예로서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상), 또는 각각의 뉴클레오타이드는 본 발명에 따른 변형된 포스페이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드는 핵산의 당(sugar) 위치, 포스페이트 위치 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환과 같은, 본 명세서에 기재된 화학적 변형들을 포함할 수 있는데, 상기 화학적 변형들은, 예를 들어 변형된 뉴클레오타이드의 도입(incorporation), 캡핑 모이어티의 도입(예로서, 3' 캡핑), 고분자량의 비-면역성 화합물(예로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG))의 결합(conjugation), 저분자량 화합물(예로서, 콜레스테롤)의 결합, 펩타이드(예로서, 세포 침투성 펩타이드)의 결합, 포스페이트기(예로서, 포스포로티오에이트)에서의 치환을 포함한다. 염기 변형은 5-위치 피리미딘 변형, 엑소시클릭 아민에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모- 또는 5-요오도-우라실의 치환, 주쇄 변형들을 포함한다. 당(sugar) 변형은 2'-아미노 뉴클레오타이드(2'-NH2), 2'-플루오로 뉴클레오타이드(2'-F), 2'-O-메틸(2'-OMe) 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴 뉴클레오타이드, 2'-O-β-메톡시에틸 뉴클레오타이드, "잠금" 뉴클레오타이드(예로서, LNA) 또는 트리시클로-DNA 뉴클레오타이드를 포함한다. 포스페이트의 중심 인 원자와 각각의 뉴클레오사이드 사이의 결합들은 적절하게는 산소를 통하여 결합되고, 이 경우 뉴클레오사이드의 3' 및 5' 말단은 알코올이다. 그러나, 뉴클레오사이드의 3' 및 5' 말단이 알코올이 아니고 다른 적당한 유사체인 뉴클레오사이드 유사체들 또한 고려된다. 예를 들어, 뉴클레오사이드의 3' 말단 및/또는 5' 말단은 티올, 셀레놀, 또는 아민일 수 있다.
본 발명에 따른 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드는 분리된 형태 또는 정제된 형태로 제공될 수 있다.
용어 "뉴클레오사이드"는 당 부분 및 핵염기를 포함하는 화합물을 의미한다. 상기 당의 예로는, 제한없이, 리보오스, 2-데옥시리보오스, 아라비노오스 등을 포함한다. 예시적인 핵염기로는, 제한없이, 티민, 우라실, 시토신,아데닌, 구아닌, 푸린, 하이포잔틴, 잔틴, 2-아미노푸린, 2.6-디아미노푸린, 5-메틸시토신, 4-플루오로우라실, 5-클로로우라실, 5-브로모우라실, 5-요오도우라실, 5-프리플루오로메틸우라실, 5-플루오로시토신, 5-클로로시토신, 5-브로모시토신, 5-요오도시토신, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신, 7-데아자데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자-8-아자데닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 이소시토신, 이소구아닌 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "뉴클레오사이드 유사체"는 당 부분이 다른 시클릭 또는 비시클릭 구조로 치환된 변형 뉴클레오사이드를 의미한다. 당 부분이 다른 시클릭 구조로 치환된 예시적인 뉴클레오사이드 유사체들은, 제한없이, 모르폴린의 단량체 단위(PMO) 및 트리시클로-DNA를 포함한다. 당 부분이 비시클릭 구조로 치환된 예시적인 뉴클레오사이드 유사체들은, 제한없이, 펩타이드 핵산의 단량체 단위(PNA) 및 글리세롤 핵산(GNA)을 포함한다.
용어 "뉴클레오사이드 유사체"는 추가적으로 그의 어느 부분이 임의의 천연의 화학적 기로 치환된 뉴클레오사이드를 의미한다. 그러한 뉴클레오사이드 유사체의 예로는, 제한없이, 2'-플루오로, 2-데옥시, 2'-0-메틸, 2'-0-β-메톡시에틸, 2'-0-알릴리보리보뉴클레오사이드, 2'-아미노, 잠금 핵산(LNA) 단량체들 등을 포함한다.
적합하게는, 뉴클레오사이드 유사체들은 당 부분이 하기에 표시된 모르폴린으로 치환된 뉴클레오사이드 유사체들을 포함할 수 있다.
Figure 112017020126395-pct00011
이러한 타입의 구조에서, 3' 및 5'에서의 표지는 통상의 당 화학에 적용된 바와 유사하게 적용된다. 즉, 도시된 구조에서, 고리 상의 히드록실메틸 치환기는 5' 말단에 고려되고, 반면에 3가 질소는 3' 말단에 고려된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드 유사체"는 그의 포스페이트기에서 화학적으로 변형되거나 또는 그의 뉴클레오사이드가 뉴클레오사이드 유사체들에 의해 치환된 변형된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 예지적인 올리고뉴클레오타이드 유사체는, 제한없이, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드(PS), 포스포로디아미에이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(모르폴리노스, PMO), 트리시클로-DNA 및 펩타이드 핵산(PNA)를 포함한다.
용어 "펩타이드 핵산"은 일반적으로 펩타이드 결합이 포스페이트기로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유사체들을 의미한다. 그러나, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 본 발명에 따라 변형된 포스페이트 기들을 포함할 수 있는 화합물들을 포함한다. 이러한 화합물들 또한 본 출원의 범위 내에 속한다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "포스페이트기(phosphate group)"는 인산 H3PO4을 의미하며, 이의 임의의 수소 원자들은 1개, 2개, 또는 3개의 유기 라디칼들로 치환되어, 각각 포스포에스테르, 포스포디에스테르, 또는 포스포트리에스테르를 제공할 수 있다.
용어 "변형된 포스페이트기"는 포스페이트기의 인 원자에 연결된 임의의 산소 원자들이 임의의 화학적 기로 치환된 포스페이트기를 의미한다. 적합한 치환기들은 황, 셀레늄, 이미노(NR) 및 보란(-BH3 -)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 기는 포스포로티오에이트기, 포스포로셀레노에이트기 또는 보라노포스페이트기일 수 있다. 바람직하게는, 용어 "변형된 포스페이트기"는 포스포로티오에이트기이다.
본 명세서에 기재된 포스페이트 및 변형된 포스페이트는 그들의 치환기에 따라서, 키랄(chiral)일 수 있다. 입체화학이 명시되어 있지 않는 경우, 해당 구조는 Rp 및 Sp 구조 모두를 각각 분리된 상태 및 혼합물(예로서, 라세미 혼합물)로서 포함한다. 예를 들어, 제한없이, 하기 구조는,
Figure 112017020126395-pct00012
다음의 구조들을 포함한다는 것이 인식될 것이다.
Figure 112017020126395-pct00013
본 명세서에서 기재된 화합물들은 하나 이상의 키랄 중심을 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 다르게 명시한 경우를 제외하고는, 모든 거울상이성질체들 및 부분입체이성질체들이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보호된 올리고뉴클레오타이드"는 하나 이상의 보호기가 도입된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "탈보호된 올리고뉴클레오타이드"는 그로부터 하나 이상의 보호기가 제거된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드는 그들의 보호된 형태를 포함하는 것을 의미한다는 것이 인식될 것이다.
용어 "보호기(protecting group)"는 화합물의 반응성 부위를 일시적으로 차단하기 위해 사용되는 화학기를 의미한다. 보호기는 특정 조건하에서 제거된다. 예시적인 보호기들은, 제한없이, 아세틸(Ac), 벤조일(Bz), 이소부티릴(Ibu), 터셔리-부틸페녹시아세틸(Tac), 레불리닐(levulinyl; Lev), 메틸(Me), 2-시아노에틸(CE), 알릴(All), 2-클로로페닐(o-ClPh), 4,4'-디메톡시트리틸(DMTr), 4-메톡시트리틸 (MMTr), 터셔리-부틸디메틸실릴(TBDMS), 트리이소프로필실릴옥시메틸(TOM) 등을 ㅍ포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "연결기(linker)"는 화합물을 지지체에 연결하고, 특정 조건하에서 상기 지지체로부터 상기 화합물을 분리하기 위해 절단될 수 있는 화학기를 의미한다. 고체상 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용되는 예시적인 연결기는, 제한없이, 숙시닐, 디글리콜일, 옥살릴, 하이드로퀴논-O,O'-디아세틸(Q-linker), 프탈로일, 4,5-디클로로프탈로일, 말로닐, 글루타릴, 디이소프로필실릴, 1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일 등을 포함한다.
다른 연결기들은 올리고뉴클레오타이드 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드 내로 삽입된 비(non)-뉴클레오타이드 화학기("인터뉴클레오사이드/인터뉴클레오타이드 연결기"), 또는 뉴클레오타이드와 예를 들어 표지(label) 또는 퀀쳐(quencher)와 같은 다른 화학 모이어티 사이에 연결을 형성하는 비-뉴클레오타이드 화학기들을 포함할 수 있다. 적합한 연결기들은 당분야에 알려져 있고, 1,12-도데칸디올 포스페이트(DD)를 포함한다.
용어 "고체 지지체"는 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성에 사용되는 폴리머성 지지체를 의미한다. 예시적인 고체 지지체는, 제한없이, 기공 조절된 유리(CPG), 폴리스티렌 수지, TentaGel® 수지, TSK Gel® Toyopearl® 수지, 폴리(비닐알코올) 수지 등을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "고체 지지체"는 또한, 예를 들어, 제한없이, 필터 디스크, 멀티핀 시스템, 멀티웰 플레이트 등을 포함하는 다중 올리고뉴클레오타이드 합성에 사용되는 비수지형 고체 지지체들도 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유기 라디칼"은 임의의 다른 원자들에 연결된 하나 이상의 탄소 원자들을 포함하고, 탄소에서 유리 원자가(free valency)를 갖는 화학기를 의미한다. 상기 다른 원자들의 예는, 제한없이, 수소, 질소, 산소, 불소, 실리콘, 인, 황, 염소, 브로민 및 요오드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알킬"은 직쇄 및 가지쇄의 시클릭 및 비시클릭 형태를 모두 의미한다. 용어 "알킬"은 일가의 직쇄 또는 가지쇄 포화 비시클릭 하이드로카르빌 기들을 포함한다. C1-4 알킬기들은, 제한없이, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필 또는 t-부틸기들을 포함한다.
용어 "알케닐"은, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 갖고, 일부 구체예에서는 탄소-탄소 삼중 결합을 갖지 않는, 일가의 직쇄 또는 가지쇄 불포화 비시클릭 하이드로카르빌 기들을 포함한다. 일부 구체예에서, 알케닐은 C2-10 알케닐이고, 일부 구체예에서는 C2-6 알케닐이며, 일부 구체예에서는 C2-4 알케닐이다.
용어 "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합을 갖고, 일부 구체예에서는 탄소-탄소 이중 결합을 갖지 않는, 일가의 직쇄 또는 가지쇄 불포화 비시클릭 하이드로카르빌 기들을 포함한다. 일부 구체예에서, 알키닐은 C2-10 알키닐이고, 일부 구체예에서는 C2-6 알키닐이며, 일부 구체예에서는 C2-4 알키닐이다.
용어 "헤테로시클릭 화합물"은 헤테로시클릭 기를 포함하는 화합물을 의미한다. 용어 "헤테로시클릭 기"는, O, S(O)t (여기서, t는 0, 1 또는 2) 또는 N으로부터 선택되는 하나 이상(예로서, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 고리 헤테로원자를 포함하는 포화 또는 부분 불포화 또는 불포화(예로서, 방향족) 모노시클릭 또는 바이시클릭 기를 의미하고, 이는 비치환된 기 및 하나 이상의 치환기(예로서, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기)로 치환된 기를 포함하며, 선택적으로 상기 하나 이상의 치환기는 함께 추가의 고리 시스템을 형성한다. 다르게 명시되지 않는 한, 헤테로시클릭기가 다른 기에 결합된 경우, 상기 헤테로시클릭 기는 C-연결 또는 N-연결될 수 있고, 즉, 고리 탄소원자 또는 고리 질소원자(즉, 고리내 질소원자)를 통해 분자의 나머지에 연결될 수 있다. 따라서 상기 용어 "헤테로시클릭 기"는, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 선택적으로 치환된 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알케닐 및 헤테로아릴 기들을 포함한다.
용어 "아릴"은 페닐 또는 나프틸(예로서, 1-나프틸 또는 2-나프틸)과 같은 일가의 방향족 시클릭 하이드로카르빌 기들을 포함한다. 일반적으로, 아릴기는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 융합 고리 방향족 기들일 수 있다.
용어 "헤테로아릴"은, 하나 이상의 탄소원자가 O, S, N 및 NRN(여기서, RN은 본 명세서에서 정의된 바와 같다)으로부터 독립적으로 선택되는 헤테로원자들에 의해 각각 치환된 아릴기들을 포함한다.
용어 "할로겐"은 -F, -Cl, -Br, 및 -I를 의미한다. 일부 구체예에서, 상기 할로겐은 -F, -Cl, 또는 -Br이다. 일부 구체예에서, 상기 할로겐은 -F 또는 -Cl, 예를 들어, -Cl이다.
일반적으로, 헤테로아릴기들은 모노시클릭 또는 폴리시클릭(예로서, 바이시클릭) 융합 고리 헤테로원자 함유 기들일 수 있다. 전형적으로, 헤테로아릴기들은 5~10원 구조이고, 여기서 1, 2, 3 또는 4개의 고리원들은 O, S, N 및 NRN으로부터 독립적으로 선택된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "선택적으로 치환된"은 하나 이상(치환체의 유리 원자가의 최대 수까지)의 치환기들로 치환될 수 있는 치환체를 의미한다. 상기 치환기들은 다음으로부터 선택될 수 있다:
-C1-4 알킬,
-F, -Cl, -Br, -I,
-CF3, -OCF3, -SCF3,
-OH, -L-OH, -O-L-OH, -NH-L-OH, -NR30-L-OH,
-OC1-4 알킬, -L-OC1-4 알킬, -O-L-0C1 -4 알킬, -NH-L-OC1-4 알킬, -NR30-L-OC1-4 알킬,
-SH, -SC1-4 알킬,
-CN,
-NH2, -NHC1 -4 알킬, -N(C1-4 알킬)2,
-L-NH2, -L-NHC1 -4 알킬, -L-N(C1-4 알킬)2,
-OC(0)C1 -4 알킬,
-C(0)OH, -C(0)OC1 -4 알킬,
-C(0)C1-4 알킬,
-C(0)NH2, -C(0)NHC1 -4 알킬, -C(0)N(C1-4 알킬)2,
-NHC(0)C1 -4 알킬, -N(C1-4 알킬)C(0)C1 -4 알킬, 및
=0;
여기서, 각각의 -L-은 결합 또는 C1-4 알킬렌이고, R30은 -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴이다.
일부 구체예에서, 상깃 선택적 치환기들은 -C1-4 알킬, -F, -Cl, -CF3, -OH, -OC1-4 알킬, -NH2, -NHC1-4 알킬, 및 -N(C1-4 알킬)2로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "주위 온도(ambient temperature)"는 15~29℃, 바람직하게는 20~25℃의 범위 내의 온도를 의미한다.
반응들
본 명세서에서 기재된 바와 같은 본 발명의 변형된 포스페이트 모이어티들의 특별한 이점은 본 발명자들에 의해 입증된 바와 같이, 이들 모이어티들의 편리한 도입이다. 예를 들어, 화학식 Ⅵ의 변형된 포스페이트 모이어티는 H-포스포네이트 화학법 또는 포스포르아미다이트 화학법에 따른 연속적 올리고뉴클레오타이드 합성과정 동안에 올리고뉴클레오타이드 내로 쉽게 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 화합물들의 합성 방법들을 제공한다. 이들 방법은 고체-지지 시약들을 사용할 수 있고, DNA 합성기에서 수행될 수 있다.
포스포릴이소우레아, 포스포릴이소티오우레아, 포스포릴이미데이트 및 포스포릴이미도티오에이트들은 특히 반응성 중간체들이고, 이들은 일차 아민 또는 이차 아민을 이용한 반응에 따라, 본 명세서에서 기재한 포스포릴구아니딘 또는 포스포릴아미딘으로 전환될 수 있다(예를 들어, 실시예 7 및 8 참조)는 것이 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 포스포릴구아니딘 또는 포스포릴아미딘 기를 갖는 화합물의 합성 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 포스포릴이소우레아, 포스포릴이소티오우레아, 포스포릴이미데이트 또는 포스포릴이미도티오에이트 기를 갖는 화합물을 일차 아민 또는 이차 아민과 반응시키는 것을 포함한다.
H- 포스포네이트 화학법
H-포스포네이트 화학법은 화학적 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 편리하고 확립된 방법이다. 적합하게는, 연결기를 통해 고체 지지체에 고정된 5'-DMT-보호된 뉴클레오타이드를 연속적 탈보호 반응을 시킨 다음, H-포스포네이트 모노에스테르와의 커플링 반응에 의해 H-포스포네이트 디에스테르를 형성한다. 추가의 뉴클레오사이드 단위들이 서열에 첨가될 수 있고, 이어서 디트리틸화(detritylation) 반응 후 커플링 반응을 수행하고, 공정의 말기에, 산화제, 전형적으로는 요오드를 사용하여, 인터뉴클레오사이드 H-포스포네이트 디에스테르 결합을 포스포디에스테르 결합으로 산화시킨다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은, 본 발명의 변형된 포스페이트 기들은 H-포스포네이트 화학법을 사용하여 조립된 올리고뉴클레오타이드 내로 쉽게 도입될 수 있다는 것을 증명하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 변형된 포스페이트를 도입하기 위하여, 유기 염기 또는 염의 형태, 예를 들어 염산염 또는 다른 염 형태로 존재할 수 있는 적합한 구아니딘, 아미딘, 이소우레아, 이소티오우레아, 이미데이트 또는 이미도티오에이트의 존재하에, 적절한 산화제를 사용하여 산화 반응이 수행될 수 있다. 적절한 산화제는 요오드 I2, 브로민 Br2, 염소 Cl2, 요오드클로라이드 ICl, N-브로모숙신이미드, N-클로로숙신이미드, N-요오도숙신이미드, 카본 테트라클로라이드 CCl4, 브로모트리클로로메탄 CCl3Br, 테트라브로모메탄 CBr4, 테트라요오도메탄 CI4, 요오도포름 CHI3, 헥사클로로에탄 C2Cl6, 헥사클로로아세톤(CCl3)2CO 등을 포함한다. 바람직한 산화제는 요오드이다.
물론, 하나 이상의 변형된 포스페이트기를 도입하기 위한 산화 반응 후에, 디트리틸화 반응에 이은 커플링 반응의 사이클이 재개될 수 있고, 이로써 사슬 합성 공정 동안의 적절한 시점에서 추가의 산화 단계들이 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 변형된 포스페이트 기들은 사슬 합성 공정 동안의 적절한 시점에서 도입될 수 있다.
피리딘, 2-피콜린, 3-피콜린, 4-피콜린, 퀴놀린, 테트라하이드로푸란(THF), 1,4-디옥산, 1,2-디메톡시에탄(DME), 아세토니트릴을 포함하는, 당분야에 알려진 다양한 용매들이 사용될 수 있다.
상기 산화 반응 동안에 염기를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 적합하게는, 상기 염기는 아민 염기이고, 예를 들어 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA), N-메틸모르폴린, N-에틸모르폴린, 트리부틸아민, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄(DABCO), N-메틸이미다졸(NMI), 피리딘, 2,6-루티딘, 2,4,6-콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌("프로톤 스폰지"), 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU), 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5엔(DBN), 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔(MTBD), 2-터셔리-부틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2,8,9-트리메틸2,5,8,9-테트라아자-1-포스파비시클로[3.3.3]운데칸, 또는 포스파젠 염기이다. 예를 들어, 상기 염기는 트리에틸아민 또는 DBU일 수 있다.
본 발명자들은, 상기 변형된 포스페이트 모티프(들)을 도입하는 산화반응 단계 동안에 실릴화제를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, N,0-비스(트리메틸실릴)아세트아미드(BSA), N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(BSTFA), 클로로트리메틸실란, 브로모트리메틸실란, 요오도트리메틸실란, 트리에틸실릴 클로라이드, 트리페닐실릴 클로라이드, 헥사메틸디실라잔, 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf), 디메틸이소프로필실릴 클로라이드, 디에틸이소프로필실릴 클로라이드, 터셔리-부틸디메틸실릴 클로라이드, 터셔리-부틸디페닐실릴 클로라이드, 트리이소프로필실릴 클로라이드, 디메틸디클로로실란, 디페닐디클로로실란 또는 그의 유사물이 첨가될 수 있다. 바람직한 실릴화제는 N,0-비스(트리메틸실릴)아세트아미드(BSA)이다.
포스포르아미다이트 화학법
포스포르아미다이트 화학법 또한 화학적 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 매력적인 방법이다. 포스포르아미다이트 화학법에 근거한 올리고뉴클레오타이드 화학법과 관련된 사이클은 당분야에 알려져 있다. 요약하면, 고체-지지된 뉴클레오타이드를 디트리틸화 시킨 다음, 적절히 활성화된 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트와 커플링 반응시켜 포스파이트 트리에스테르 결합을 형성한다. 그런 다음, 캡핑(capping)이 수행된 후, 산화제, 전형적으로 요오드를 사용하여 포스파이트 트리에스테르의 산화가 수행된다. 그 후, 상기 사이클은 사슬의 조립을 위해 반복된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은, 원하는 변형된 포스페이트 기(들)을 생성하기 위하여, 염의 형태, 예를 들어 염산염 형태로 존재할 수 있는 적합한 구아니딘, 아미딘, 이소우레아 또는 이소티오우레아의 존재하에서의 그러한 산화반응의 수행이 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. β-시아노에틸포스파이트 보호기의 제거에 의해 합성 과정은 완료된다. H-포스포네이트 방법에서의 상기 산화 반응에 대해 상술한 바와 같이, 염기들 및/또는 실릴화제들의 사용이 바람직할 수 있다.
유기 아자이드들의 사용
또한, 본 명세서에는, 선택적으로 BSA와 같은 실릴화제의 존재하에, 디뉴클레오사이드 β-시아노에틸포스파이트와 적합한 유기 아자이드의 반응을 통해 본 발명의 변형된 포스파이트 기들을 수득하기 위한 신규의 반응이 개시된다. 염기, 예를 들어 트리에틸아민과 같은 아민 염기가 포함될 수 있다.
본 발명자들은, 본 방법이 비치환된 기, 모노-, 디-, 트리- 및 테트라-치환된 기들을 갖는 것과 같은 다양한 포스포릴구아니딘 치환 패턴을 갖는 올리고뉴클레오타이드들의 제조를 위해, 그리고 이러한 타입의 다중 변형된 포스페이트기들을 갖는 올리고뉴클레오타이드들의 제조에 효과적임을 입증하였다.
적합하게는, 상기 유기 아자이드들은 비스(이치환 아미노)-1-아지도카르베늄 염, 1-(이치환 아미노)-1-아지도카르바미디늄 염 등, 또는 1-(이치환 아미노)-1-아지도-에탄, N-치환-1-아지도카르바미딘과 같은 화학식 R1-C+(N3)-R2 의 아자이드; 또는 (N3)2C=NR2, (N3)2C=N+R1AR1B, 또는 시아노겐 아자이드 N3-CN 일 수 있다. 상기 유기 아자이드는 당분야에 알려진 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 테트라알킬우레아는 아지도비스(디알킬아미노)카르베늄 염으로 전환될 수 있고[60], 디알킬아미드는 N,N-디알킬-아지도카르바미디늄 염으로 전환될 수 있으며[61], 반면에 트리알킬우레아 또는 모노알킬아미드는 중성의 아자이드들을 제공할 수 있다[62].
적합하게, 상기 유기 아자이드는 다음으로부터 선택될 수 있다:
Figure 112017020126395-pct00014
여기서, R1, R2, R1A, R1B, R2A, 및 R2B는 상기에서 정의된 바와 같다. 일부 구체예에서, R2는 추가적으로 -N3일 수 있다.
예를 들어, 상기 아자이드는 다음으로부터 선택될 수 있다:
Figure 112017020126395-pct00015
여기서, 각각의 R1A, R1B, R2A, R2B는 독립적으로 -H, 또는 선택적으로 치환된 -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴이고, 그리고/또는,
선택적으로 R1A 및 R2A가 함께 2~4개 원자 길이의 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 사슬을 형성하고, 선택적으로 R1A 및 R2A는 함께 -CH2-CH2-를 형성하며, R1B 및 R2B는각각 독립적으로 -H 및 메틸로부터 선택되고,
선택적으로 R1A 및 R1B는 그들이 결합된 원자와 함께 5~8원 헤테로고리를 형성하며, 또는
선택적으로 R2A 및 R2B는 그들이 결합된 원자와 함께 5~8원 헤테로고리, 선택적으로 피롤리딘을 형성한다; 또는
Figure 112017020126395-pct00016
여기서, 각각의 R1A 및 R1B는 독립적으로 -H, 또는 선택적으로 치환된 -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴이고, 또는 R1A 및 R1B는 그들이 결합된 원자와 함께 5~8원 헤테로고리를 형성하며, R2는 -H, -F, -OPG, -Cl, -Br, -I, -CN, -N3, -O-C1-10 알킬, -SPG, 및 -S-C1-10 알킬로부터 선택되고, 상기 PG는 보호기이다.
일부 바람직한 반응들에서, 상기 유기 아자이드는 적합한 반대이온, 예를 들어 클로라이드를 갖는 다음의 화합물이다:
Figure 112017020126395-pct00017
.
적합한 반대이온은, 제한없이, 클로라이드 Cl-, 브로마이드 Br-, 요오다이드 I-, 트리플레이트(트리플루오로메탄설포네이트) CF3SO3 -, p-톨루엔설포네이트 C7H7S03 ~, 디클로로포스페이트 PO2Cl2 -, 퍼크롤레이트 ClO4 -, 테트라플루오로보레이트 BF4 -, 테트라페닐보레이트 BPh4 -, 헥사플루오로포스페이트 PF6 - 등을 포함한다.
일부 구체예에서, 각각의 R1A, R1B, R2A, 및 R2B는 독립적으로 -H, 또는 선택적으로 치환된 -C1-10 알킬이고, 예를 들어 -H 또는 선택적으로 치환된 -C1-4 알킬, 예를 들어 -H 또는 메틸이다. 일부 구체예에서, 각각의 R1A, R1B, R2A, 및 R2B는 메틸이다; 즉, 결과의 포스페이트는 테트라메틸구아니딘으로 변형된다.
일부 구체예에서, R1A 및 R2A는 함께 2~4개 원자 길이의 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 사슬을 형성하고, R1B 및 R2B는 각각 독립적으로 -H 및 -C1-4 알킬로부터 선택된다. 일부 구체예에서, R1A 및 R2A는 함께 -CH2-CH2-를 형성한다. 일부 구체예에서, R1A 및 R2A는 함께 -CH2-CH2-를 형성하고, R1B 및 R2B는 -H 또는 메틸이다.
일부 구체예에서, R1A 및 R1B는 그들이 결합된 원자와 함께 5~8원 헤테로고리, 바람직하게는 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진 또는 모르폴린을 형성한다. 예를 들어, 그들은 그들이 결합된 원자와 함께 5원 헤테로고리, 바람직하게는 피롤리딘을 형성한다.
일부 구체예에서, R2A 및 R2B는 그들이 결합된 원자와 함께 5~8원 헤테로고리, 바람직하게는 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진 또는 모르폴린을 형성한다. 예를 들어, 그들은 그들이 결합된 원자와 함께 5원 헤테로고리, 바람직하게는 피롤리딘을 형성한다.
공정 A 및 공정 B
본 명세서에 기재된 화합물들은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 공정 A 또는 공정 B를 사용하여 합성될 수 있다. 이들 공정들은, 본 명세서에 기재되고, 하기 에서 예시된 바와 같이, 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성에 사용될 수 있다.
공정 A는 다음의 단계들을 포함한다:
(ⅰ) 상기 인산 유도체를 포함하는 보호된 올리고뉴클레오타이드 또는 보호된 변형된 올리고뉴클레오타이드가 부착될 고체 지지체를 상기 산화제, 이미노 유도체, 및 선택적으로 실릴화제, 염기 및 용매를 포함하는 혼합물에 침지하는 단계;
(ⅱ) 상기 인산 유도체가 변형된 포스페이트기로 전환되기에 충분한 시간 동안 요구되는 범위 내의 온도를 유지하면서, 침지된 상기 고체 지지체를 유지하여, 변형된 포스페이트기를 갖는 화학식 (Ⅰ)의 변형된 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계;
(ⅲ) 원하는 다음 위치에서의 변형이 이루어질 때까지, 원하는 프로토콜에 따라 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성을 계속한 다음, 올리고뉴클레오타이드 서열이 완료될 때까지 상기 단계 (ⅰ) 및 (ⅱ)를 반복하는 단계;
(ⅳ) 고체 지지체로부터 원하는 탈보호 및/또는 절단을 수행하여, 하나 이상의 변형된 포스페이트기를 갖는 화학식 (Ⅰ)의 탈보호된 변형된 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계.
공정 B는 다음의 단계들을 포함한다:
(i) 상기 인산 유도체를 포함하는 보호된 올리고뉴클레오타이드 또는 보호된 변형된 올리고뉴클레오타이드가 부착될 고체 지지체를 상기 유기 아자이드, 용매, 및 선택적으로 실릴화제 및 염기를 포함하는 혼합물에 침지하는 단계;
(ⅱ) 상기 공정 A의 상기 단계 (ⅱ) 내지 (ⅳ)를 반복하는 단계.
상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 상기 방법의 말기에 회수될 수 있다.
상기 방법들은 -20~150℃, 바람직하게는 0~100℃, 더욱 바람직하게는 15~80℃의 온도에서 수행될 수 있다.
바람직하게는, 공정 A는 주위 온도에서 수행된다.
공정 A에서, 이미노 유도체의 농도는 적합하게는 0.005~3M, 더욱 바람직하게는 0.1~1.5M이다.
공정 B에서, 아자이드의 농도는 적합하게는 0.005~3M, 더욱 바람직하게는 0.1~1.5M이다.
선택적으로, 실릴화제가 첨가될 수 있다. 적합한 실릴화제는 N,0-비스(트리메틸실릴)아세트아미드(BSA), N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(BSTFA), 클로로트리메틸실란, 브로모트리메틸실란, 요오도트리메틸실란, 트리에틸실릴 클로라이드, 트리페닐실릴 클로라이드, 헥사메틸디실라잔, 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf), 디메틸이소프로필실릴 클로라이드, 디에틸이소프로필실릴 클로라이드, 터셔리-부틸디메틸실릴 클로라이드, 터셔리-부틸디페닐실릴 클로라이드, 트리이소프로필실릴 클로라이드, 디메틸디클로로실란, 디페닐디클로로실란 등을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, N,0-비스(트리메틸실릴)아세트아미드(BSA)가 실릴화제로서 사용된다.
선택적으로, 염기가 첨가될 수 있다. 적합한 염기는 아민 염기이고, 예를 들어 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA), N-메틸모르폴린, N-에틸모르폴린, 트리부틸아민, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄(DABCO), N-메틸이미다졸(NMI), 피리딘, 2,6-루티딘, 2,4,6-콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌("프로톤 스폰지"), 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU), 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5엔(DBN), 1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔(TBD), 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔(MTBD), 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(TMG), 2-터셔리-부틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2,8,9-트리메틸2,5,8,9-테트라아자-1-포스파비시클로[3.3.3]운데칸, 포스파젠 염기 등이다.
바람직한 염기는 트리에틸아민이다.
공정 A를 위한 적합한 용매는 피리딘, 2-피콜린, 3-피콜린, 4-피콜린, 퀴놀린, 테트라하이드로푸란(THF), 1,4-디옥산, 1,2-디메톡시에탄(DME), 디에틸렌글리콜디메틸에테르(디글림), 디에틸에테르, 아세토니트릴 등을 포함한다.
공정 A를 위한 바람직한 용매는 피리딘이다.
공정 B를 위한 적합한 용매는 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드(DMF), N,N-디메틸아세트아미드(DMA), N-메틸피롤리돈(NMP), 테트라메틸 우레아, 1,3-디메틸이미다졸리딘-2-온, 설포란, 헥사메틸포스포르트리아미드(HMPT), 1,4-디옥산, 테트라히드로푸란(THF), 아세톤, 에틸아세테이트 등을 포함한다.
공정 B를 위한 바람직한 용매는 N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 및 아세토니트릴을 포함한다.
올리고뉴클레오타이드의 용도
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 광범위한 용도에 사용될 수 있다. 예를 들어, 그들은 연구 시약 또는 진단제로서 시험관내 시험에 사용될 수 있고, 또는 치료제, 진단제 또는 연구 시약으로서 생체내 시험에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 측면에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 시험관내 또는 생체내에서 고수준의 서열 동일성을 갖는 (바람직하게는 단일 가닥의) 올리고뉴클레오타이드와 접촉시켜서, (예를 들어, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위하여) 상기 올리고뉴클레오타이드들을 혼성화하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 상기 방법은, 선택적으로 상기 혼성화된 올리고뉴클레오타이드를 검출 및/또는 정량화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 특정의 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 돌연변이체, 변형체, 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 단일 뉴클레오타이드 다형체(SNP)를 검출하는 방법일 수 있다. 상기 방법은, 예를 들어 환자로부터 회수된 조직 샘플 또는 체액 중의 올리고뉴클레오타이드를 검출하는 것을 포함하는, 환자의 질병의 존재를 진단하는 방법일 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 중합효소반응(PCR) 방법들과 같은 핵산의 증폭 방법에서 프라이머로서 사용되기 위해 설계 및 합성될 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이의 사용이 요구되는 방법들에서 사용되기 위한 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이("DNA 칩")로서 설계 및 제조될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는, siRNA (Angell & Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16, 12:3675-3684; and Voinnet & Baulcombe (1997) Nature 389: pg 553); Fire A. et al., Nature, Vol 391, (1998); Fire (1999) Trends Genet. 15: 358-363, Sharp (2001) Genes Dev. 15: 485-490, Hammond et al. (2001) Nature Rev. Genes 2: 1110-1119 및 Tuschl (2001) Chem . Biochem. 2: 239-245), 리보자임, 앱타머 (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 1990 Aug 3; 249(4968):505-10); W091/19813), DNA 효소, 안티센스, PMO, PNA, LNA, 또는 갭타머들과 같은 치료제용 핵산을 설계 및 합성하기 위해서도 사용될 수 있다. 치료요법에 기초한 올리고뉴클레오타이드가, 예를 들어 바이러스 감염 또는 바이러스 매개 질병, 암, 노인황반변성과 같은 눈의 장애의 치료, 원치않는 맥락막신생혈관(neovascularisation), 듀켄씨근이영양증과 같은 엑손-접합 결핍 장애의 예방을포함하는 다양한 질병들의 치료에 사용되고, 항-콜레스테롤제로서 사용되는 것은 당분야에 잘 알려져 있다. 그러한 치료를 위해 알려지거나 제안된 올리고뉴클레오타이드 제제의 설계는 본 명세서에서 개시된 변형된 포스페이트(들)을 도입하기 위해 변형될 수 있다. 선택적으로, 치료용 핵산들은 세포침투 펩타이드(예를 들어, WO2009/147368에 개시)와 같은 전달제에 컨쥬게이션될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 하나의 측면에서, 의료적 치료 방법에서의 사용 또는 치료 요법에서의 사용이 제공된다. 다른 측면에서, 질병의 치료용 의약 또는 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 사용이 제공된다. 또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 치료가 필요한 환자에게 투여하여, 해당 질병을 치료하는 것을 포함하는 질병 치료 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 의약 또는 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 상기 의약 또는 약학적 조성물은 정제된 형태 또는 분리된 형태의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 의약 및 약학적 조성물들은, 제한되지는 않지만, 비경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 경구 및 비강내 투여를 포함하는 여러 투여 경로에 의한 투여를 위해 제제화될 수 있다. 상기 의약 및 조성물들은 액상 또는 고체상 형태로 제제화될 수 있다. 액상 제제는 인간 또는 동물의 신체 중 선택된 영역에 주사에 의해 투여하기 위해 제제화될 수 있다.
투여는, 바람직하게는, 개별 대상에게 유리한 효과를 나타내기에 충분한 양인 "치료적으로 효과적인 양"으로 수행된다. 실제적인 투여량, 투여 속도 및 시간 경과는 치료되어질 질병의 성질 및 심각도에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, 투여량의 결정 등의 치료 처방은 일반의 및 다른 의사들의 책임 범위에 속하는 것이고, 전형적으로는, 치료될 질병, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 다른 요소들을 고려하여 이루어진다. 상기에서 언급한 기술들 및 프로토콜들의 예들은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins를 참고할 수 있다.
본 발명에 따른 방법들은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 용어 "시험관내(in vitro)"는 재료 물질들, 생물학적 물질들, 세포들 및/또는 조직들을 사용하여 실험실 조건 또는 배양 조건에서 이루어지는 실험들을 포함하는 의미이고, 반면에 용어 "생체내(in vivo)"는 온전한(intact) 다세포(multi-cellular) 유기체 내에서 이루어지는 실험들 및 과정들을 포함하는 의미이다.
치료 대상은 동물 또는 인간일 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상은 포유류, 더욱 바람직하게는 인간이다. 상기 대상은 비-인간 포유류일 수 있으나, 더 바람직하게는 인간이다. 상기 대상은 수컷 또는 암컷일 수 있다. 상기 대상은 환자일 수 있다.
본 발명은, 상기한 측면들의 조합 및 상기한 특징들의 조합이 명확하게 허용될 수 없거나 회피되는 것으로 명시된 경우를 제외하고는, 상기한 측면들의 조합 및 상기한 특징들의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 섹션 제목들은 단지 명세서 기재 방식상의 목적일 뿐, 본 발명의 주제를 해당 제목들에 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 측면들 및 구체예들을, 첨부한 도면들을 참조하여, 하기 을 통하여 예시할 것이다. 다른 측면들 및 구체예들은 당분야의 기술자들에게 명백할 것이다. 본 명세서에서 언급된 모든 문헌들은 참고문헌으로서 본 명세서에 통합된다.
하기의 청구범위를 포함하는 본 명세서의 전반에 있어서, 다른 경우를 명시하지 않는 한, 용어 "포함하다", 및 "포함하고", "포함하는"과 같은 그의 변형 용어들은 기재된 정수(integer) 또는 단계, 또는 기재된 정수들 또는 단계들의 그룹을 모두 포함하는 의미이고, 어느 다른 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하는 것은 아님을 의미한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "상기"는 다르게 명시되지 않는 한, 복수의 지시어를 포함하는 것임에 주목하여야 한다. 본 명세서에서 범위들은 "약" 하나의 특정 수치로부터 그리고/또는 "약" 다른 특정 수치까지로 표시될 수 있다. 그러한 범위가 표시된 경우, 다른 구체예들은 하나의 특정 수치로부터 그리고/또는 다른 특정 수치까지를 포함한다. 유사하게, 수치들이 대략값으로 표시된 경우, "약"이라는 선행 수식어를 기재함으로써 특정 수치는 다른 구체예를 구성한다는 것으로 이해될 것이다.
본 발명이 특정 구체예들을 참조하여 기술되었지만, 당분야의 기술자들은 다양한 변경이 이루어질 수 있고, 본 발명의 기술사상 및 범위를 벗어남이 없이, 균등한 치환이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
또한, 특정의 상황, 물질, 조성물, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 채택하기 위하여, 본 발명의 기술사상 및 범위에 많은 변형이 이루어질 수 있다. 그러한 모든 변형들은 첨부한 본 발명의 청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
이하, 대응 도면들을 참조하여, 하기의 비제한적인 실시예들을 통해 본 발명이 예시될 것이다.
실시예
다음 실시예들은 설명을 하기 위해 제공하나, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
일반적인 방법들
변형 올리고뉴클레오타이드는 표준 12㎕ 컬럼을 이용하여 0.2μ㏖ 스케일로 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 화학법[58] 또는 H-포스포네이트 화학법[66]을 사용하여 Biosset 자동화 DNA 합성기 ASM-800에서 합성하였다. 모든 반응들은 스크류캡들 및 고무 O-링들을 갖는 1.5ml 폴리프로필렌 튜브에서 수행하였다. 고체상(solid-phase) 합성 후, 컬럼으로부터 폴리머 지지체(polymer support)를 플라스틱 튜브로 옮기고, 지지체 5mg 당 200㎕의 탈블로킹 용액으로 처리하였다. 농축 (약 33%) 수성 암모니아 용액(용액 A) 또는 1:1부피의 에틸렌디아민과 무수 에탄올(absolute ethanol)의 혼합물(용액 B)을 탈블록킹 용액으로 사용하였다. 탈블록킹 후에, 상등액을 SpeedVac 농축기를 사용하여 진공하에서 증발시켰고, pH 7인 20mM 트리에틸암모늄 아세테이트 400㎕를 첨가하였으며, 지지체를 원심분리기로 제거하였다.
변형 올리고뉴클레오타이드들은 Zorbax SB-C18 (5㎛) 컬럼 (4.6×150mm) 상에서 2㎤ min-1의 유속으로 30분 동안, pH 7인 0.02M 트리에틸암모늄아세테이트 중의 0~40%의 아세토니트릴 구배를 사용하여, 애질런트 1200 시리즈 크로마토그래피의 DMTr OFF 또는 DMTr ON 모드에서 역상(RP) HPLC에 의해 정제하였다. 5'-말단 DMTr기를, 100㎕의 80% 아세트산으로 15분 동안 처리하고, 이어서 pH 7.0인 20mM 트리에틸암모늄 아세테이트 400㎕로 중화시키고, SpeedVac 농축기에서 증발시켜 제거하였다. 그런 다음, 아세톤 중의 1M LiClO4 1ml를 첨가함으로써 올리고뉴클레오타이드를 침전시켰고, 펠렛을 아세톤으로 세척하고, 20분 동안 공기 중에서 건조하였다. 스테인-올(Stains-All)로 염색함으로써 시각화된 밴드들을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 순도를 체크하기 위해 20% 폴리아크릴아마이드겔(PAGE)에서의 변성화 겔전기영동법이 사용되었다. 변형된 올리고뉴클레오타이드의 구조들은 매트릭스로서 3-히드록시피콜린산을 사용하여 브루커 리플럭스 III 오토플렉스 스피드 질량 분석기에서 음성 이온 또는 양성 이온 모드로 기록된 매트릭스-지원 레이저 탈착 이온화 - 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 스펙트라에 의해 확인되었다.
비스(디메틸아미노)아지도카르베늄 디클로로포스페이트의 0.5M 수용액의 제조.
무수 MeCN(10ml) 중의 비스(디메틸아미노)클로로카르베늄 디클로로포스페이트(1.105g, 4.1mmol)[67] 용액에, 분말화된 무수 NaN3 (1.1 당량, 288mg, 4.4 mmol)을 첨가하였다. 상기 현탁액을 주위 온도에서 2시간 동안 교반하고, 여과 및 무수 MeCN으로 세척하였고, 진공 하에서 증발시켜 건조하여, 1.08g(95%)의 오일상의 생성물을 수득하였다. 69mg의 생성물을 1ml의 DMF-Et3N 95:5(v/v)에 용해시키고, 2분 동안 강하게 흔들고, 침전물은 14,500rpm에서 3분 동안 원심분리로 분리하여, 0.5M 용액을 수득하였고, 이는 한 주 동안 주위 온도에서 저장할 수 있다.
2- 아지도 -1,3- 디메틸이미다졸리늄 헥사플루오로포스페이트의 1M 용액의 제조.
2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 헥사플루오로포스페이트(139mg) 및 NaN3 (1.1 당량, 36mg)를 칭량하여 1.5ml 플라스틱 튜브에 넣고, 무수 아세토니트릴(0.5ml)을 첨가하였으며, 상기 현탁액을 30℃에서 2시간 동안 흔들고, 그런 다음 침전물을 14,500rpm에서 5분 동안 원심분리로 분리하였다. 상기 용액은 -18℃에서 저장하였다.
아지도피롤리디노카르베늄 헥사플루오로포스페이트의 1M 용액의 제조.
클로로디피롤리디노카르베늄 헥사플루오로포스페이트(166mg) 및 NaN3(1.1 당량, 36mg)를 칭량하여 1.5ml 플라스틱 튜브에 넣고, 무수 아세토니트릴(0.5ml)을 첨가하였으며, 상기 현탁액을 30℃에서 2시간 동안 흔들고, 그런 다음 침전물을 14,500rpm에서 5분 동안 원심분리로 분리하였다. 상기 용액은 -18℃에서 저장하였다.
실시예 1 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTTTTpT )의 제조; 본 실시예 및 하기 실시예들에서 p는 변형된 포스페이트기의 위치를 나타낸다.
Figure 112017020126395-pct00018
(FⅧ)
β- 시아노에틸 포스파이트 및 요오드를 이용한 공정 (a).
5mg의 고 로딩(High Load) 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 124㎕의 N,N,N',N'-테트라메틸구아니딘(TMG), 50㎕의 N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드(BSA) 및 325㎕의 무수 피리딘을 혼합하고, 3Å 몰레큘러 시브를 약 1/4부피가 될때까지 첨가함으로써 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액(aliquot)을 플라스틱 튜브에 넣어 혼합하고, 10㎕의 BSA를 첨가하고 1분간 기다린 후, 상기 내용물을 폴리머가 있는 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱(voltex)하고, 15초 동안 14,500rpm에서 원심분리한 다음, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1860.39, 실험치 [M+H] 1860.93, [M-H] 1859.14.
1.2. H- 포스포네이트 및 요오드를 이용한 공정 (a)
5mg의 5'-DMTr-dT CPG 지지체(40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, H-포스포네이트 방법에 의한 자동화된 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응 및 H-포스포네이트 커플링 반응 후 중단되었고, 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 디뉴클레오사이드 H-포스포네이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 100㎕의 TMG 및 400㎕ 무수 피리딘(20부피%)을 혼합하고, 3Å 몰레큘러 시브를 약 1/4부피가 될때까지 첨가함으로써 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액(aliquot)을 지지체를 갖는 플라스틱 튜브에 첨가하였고, 30초간 볼텍싱하였으며, 15초 동안 14,500rpm에서 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1860.39, 실험치 [M+H] 1861.17, [M-H] 1857.96.
1.3. H- 포스포네이트 , BSA 및 요오드를 이용한 공정 (a)
5mg의 5'-DMTr-dT CPG 지지체(40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, H-포스포네이트 방법에 의한 자동화된 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응 및 H-포스포네이트 커플링 반응 후 중단되었고, 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 디뉴클레오사이드 H-포스포네이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 125㎕의 TMG(2M), 50㎕ BSA(1M) 및 325㎕의 무수 피리딘(20부피%)을 혼합하고, 3Å 몰레큘러 시브를 약 1/4부피가 될때까지 첨가함으로써 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 지지체를 갖는 튜브에 첨가하였고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱하였고, 15초 동안 14,500rpm에서 원심분리한 다음, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1860.39, 실험치 [M+H] 1861.17, [M-H] 1857.96.
1.4. H- 포스포네이트 및 CCl 4 를 이용한 공정 (a)
5mg의 5'-DMTr-dT CPG 지지체(40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, H-포스포네이트 방법에 의한 자동화된 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응 및 H-포스포네이트 커플링 반응 후 중단되었고, 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 디뉴클레오사이드 H-포스포네이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 CCl4를 3Å 몰레큘러 시브에 16시간 동안 유지함으로써 제조하였다. 용액 2는 100㎕의 TMG 및 400㎕ 무수 피리딘(20부피%)을 혼합하고, 3Å 몰레큘러 시브를 약 1/4부피가 될때까지 첨가함으로써 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 지지체를 갖는 튜브에 첨가하였고, 30초간 볼텍싱하였으며, 15초 동안 14,500rpm에서 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1860.39, 실험치 [M+H] 1860.78, [M-H] 1858.67.
1.5. H- 포스포네이트 및 CCl 3 Br을 이용한 공정 (a).
5mg의 5'-DMTr-dT CPG 지지체(40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, H-포스포네이트 방법에 의한 자동화된 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응 및 H-포스포네이트 커플링 반응 후 중단되었고, 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 디뉴클레오사이드 H-포스포네이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 CCl3Br를 3Å 몰레큘러 시브에 16시간 동안 유지함으로써 제조하였다. 용액 2는 100㎕의 TMG 및 400㎕ 무수 피리딘(20부피%)을 혼합하고, 3Å 몰레큘러 시브를 약 1/4부피가 될때까지 첨가함으로써 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 지지체를 갖는 튜브에 첨가하였고, 30초간 볼텍싱하였으며, 15초 동안 14,500rpm에서 원심분리한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1860.39, 실험치 [M+H] 1861.13, [M-H] 1859.25.
1.6. β- 시아노에틸 포스파이트 및 비스 (디메틸아미노)-1- 아지도카르베늄 디클로로포스페이트를 이용한 공정 (b)
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30분 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1860.39, 실험치 [M+H] 1860.35, [M-H] 1857.54.
실시예 2 . N,N,N ',N'- 테트라메틸 포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TpTTTTT )의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 4개의 dT의 도입 후, 이어서 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트의 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30분 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 5'-디트리틸레이션 반응으로 완성하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1860.39, 실험치 [M+H] 1860.34, [M-H] 1858.63.
실시예 3 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTTTpTpT )의 제조.
3.1. H- 포스포네이트 , BSA 및 요오드를 이용한 공정 (a).
5mg의 5'-DMTr-dT CPG 지지체 (40μ㏖ g-1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, H-포스포네이트 방법에 의한 자동화된 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 두개의 dT H-포스포네이트의 도입 후 중단되었고, 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 비스-H-포스포네이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 125㎕의 TMG(2M), 50㎕의 BSA(1M) 및 325㎕ 무수 피리딘(20부피%)을 혼합하고, 3Å 몰레큘러 시브를 약 1/4부피가 될때까지 첨가함으로써 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 지지체를 갖는 튜브에 첨가하였고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브는 30초 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였으며, 주위 온도에서 10분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1957.55, 실험치 [M+H] 1958.28, [M-H] 1956.34.
3.2. β- 시아노에틸 포스파이트 및 비스 (디메틸아미노)-1- 아지도카르베늄 디클로로포스페이트를 이용한 공정 (b).
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
80㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 20㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 추가의 dT 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 상기 합성은 산화 반응 전에 중단하였다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1957.55, 실험치 [M+H] 1958.32, [M-H] 1955.44.
실시예 4 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTTpTpTpT )의 제조.
4.1. H- 포스포네이트 , BSA 및 요오드를 이용하는 공정 (a)
5mg의 5'-DMTr-dT CPG 지지체(40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, H-포스포네이트 방법에 의한 자동화된 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 3개의 dt H-포스포테이트의 도입 후에 중단되었고, 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 테트라뉴클레오사이드 트리스-H-포스포네이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 125㎕의 TMG(2M), 50㎕의 BSA(1M) 및 325㎕ 무수 피리딘(20부피%)을 혼합하고, 3Å 몰레큘러 시브를 약 1/4부피가 될때까지 첨가함으로써 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 지지체를 갖는 튜브에 첨가하였고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브는 30초 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였으며, 주위 온도에서 10분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 2054.72, 실험치 [M+H] 2055.49.
4.2. β- 시아노에틸 포스파이트 및 비스 (디메틸아미노)-1- 아지도카르베늄 디클로로포스페이트를 이용하는 공정 (b).
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
120㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 30㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 추가의 dT 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 상기 합성은 산화 반응 전에 중단하였다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 추가의 dT 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 상기 합성은 산화 반응 전에 중단하였다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 세번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 2054.72, 실험치 [M+H] 2054.49.
실시예 5 . 포스포릴 구아니딘기(FⅨ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d(TTTTTpT)의 제조.
Figure 112017020126395-pct00019
(FⅨ)
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 무수 구아니딘 하이드로클로라이드 9.6mg을 칭량하여 플라스틱 튜브에 넣고, 85㎕의 무수 피리딘, 15㎕의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔 (DBU), 10㎕의 BSA를 첨가한 후, 상기 튜브를 5분 동안 볼텍싱하고, 맑아질 때까지 초음파분쇄하여(약 5분) 제조하였다.
20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 플라스틱 튜브에 넣어 혼합하고, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 1분 후에 상기 내용물을 폴리머가 있는 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1804.28, 실험치 [M+H] 1804.62, [M-H] 1803.25.
실시예 6 . 포스포릴 구아니딘기(FⅨ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d(TpTTTTT)의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 4개의 dT 도입에 이어 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 무수 구아니딘 하이드로클로라이드 9.6mg을 칭량하여 플라스틱 튜브에 넣고, 85㎕의 무수 피리딘, 15㎕의 DBU, 10㎕의 BSA를 첨가한 후, 상기 튜브를 5분 동안 볼텍싱하고, 맑아질 때까지 초음파분쇄하여 제조하였다(약 5분). 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 플라스틱 튜브에 넣어 혼합하고, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 1분 후에 상기 내용물을 폴리머가 있는 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 합성을 5'-디트리틸레이션 반응에 의해 완성하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1804.28, 실험치 [M+H] 1804.76, [M-H] 1803.06.
실시예 7 . O- 메틸포스포릴 이소우레아기(FX)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTTTTpT )의 제조.
Figure 112017020126395-pct00020
(FX)
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 무수 O-메틸이소우레아 하이드로겐 설페이트 8.6mg을 칭량하여 플라스틱 튜브에 넣고, 35㎕의 무수 피리딘, 15㎕의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU), 5㎕의 BSA를 첨가한 후, 상기 튜브를 5분 동안 볼텍싱하고, 맑아질 때까지 초음파분쇄한(약 10분) 후, 이어서 14,500rpm에서 2분 동안 원심분리하여 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 플라스틱 튜브에 넣어 혼합하고, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 1분 후에 상기 내용물을 폴리머가 있는 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 16시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1819.29, 실험치 [M+H] 1819.59, [M-H] 1818.26.
실시예 8 . N-β- 아미노에틸 포스포릴 구아니딘기( FXI )를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTTTTpT )의 제조.
Figure 112017020126395-pct00021
(FXI)
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 무수 O-메틸이소우레아 하이드로겐 설페이트 8.6mg을 칭량하여 플라스틱 튜브에 넣고, 35㎕의 무수 피리딘, 15㎕의 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU), 5㎕의 BSA를 첨가한 후, 상기 튜브를 5분 동안 볼텍싱하고, 맑아질 때까지 초음파분쇄(약 10분)한 후, 이어서 14,500rpm에서 2분 동안 원심분리하여 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 플라스틱 튜브에 넣어 혼합하고, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 1분 후에 상기 내용물을 폴리머가 있는 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 16시간 동안 용액 B로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1847.35, 실험치 [M+H] 1847.16, [M-H] 1844.76.
실시예 9 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TCpA )의 제조.
5mg의 5'-DMTr-dA(Bz) CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30분 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 주위 온도에서 16시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 941.80, 실험치 [M+H] 942.17, [M-H] 938.97.
31P NMR(D20, δ, ppm): "빠른" 부분입체이성질체 0.37, "느린" 부분입체이성질체 0.21.
실시예 10 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( GCGCCAAACpA )의 제조.
5mg의 5'-DMTr-dA(Bz) CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 HPLC 결과는 도 1에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 3103.21 , 실험치 [M+H] 3102.12, [M-H] 3100.61.
실시예 11 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( GCGCCAAApCpA )의 제조.
5mg의 5'-DMTr-dA(Bz) CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
80㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 20㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, dA 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 합성을 산화 반응 전에 중단하였다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다. 올리고뉴클레오타이드의 HPLC 결과는 도 1에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 3200.38, 실험치 [M+H] 3199.90, [M-H] 3199.00.
실시예 12 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( GCGCCAApACpA )의 제조.
5mg의 5'-DMTr-dA(Bz) CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
80㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 20㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 그런 다음, dA 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 이어서 추가의 dA를 커플링시키고, 합성을 마지막 산화 반응 단계 전에 중단하였다.
상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 3200.38, 실험치 [M-H] 3199.51.
실시예 13. N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( GCGCCApAACpA )의 제조.
5mg의 5'-DMTr-dA(Bz) CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
80㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 20㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 그런 다음 두개의 dA 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 이어서 추가의 dA를 커플링시키고, 합성을 마지막 산화 반응 단계 전에 중단하였다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 3200.38, 실험치 [M-H] 3199.15.
실시예 14 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( GCGCCAApApCpA )의 제조.
5mg의 5'-DMTr-dA(Bz) CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
120㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 30㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, dA 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 합성을 산화 반응 전에 중단하였다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, dA 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 합성을 산화 반응 전에 중단하였다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 세번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다. 올리고뉴클레오타이드의 HPLC 결과는 도 1에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 3297.54, 실험치 [M-H] 3296.80.
실시예 15 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( GGAAGGGGAGAGpA )의 제조.
5mg의 5'-DMTr-dA(Bz) CPG 지지체(10μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dG 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트의 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30분 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흠들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 16시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 4234.94, 실험치 [M-H] 4233.84.
실시예 16 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTTTTTTTTTTTTTTTTTTpT )의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 124㎕의 TMG, 50㎕의 BSA 및 325㎕의 무수 피리딘을 혼합하고, 3Å 몰레큘러 시브를 약 1/4부피가 될때까지 첨가함으로써 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 플라스틱 튜브에 넣어 혼합하고, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 1분 후에 상기 내용물을 폴리머가 있는 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 주위 온도에서 2시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 6119.16, 실험치 [M+H] 6121.13, [M-H] 6113.80.
실시예 17 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTTTTTTTTTTpTTTTTTTTT )의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 8 사이클의 dT 도입에 이어 5'-디트리틸레이션 반응, 추가의 dT 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 124㎕의 TMG, 50㎕의 BSA 및 325㎕의 무수 피리딘을 혼합하고, 3Å 몰레큘러 시브를 약 1/4부피가 될때까지 첨가함으로써 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 플라스틱 튜브에 넣어 혼합하고, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 1분 후에 상기 내용물을 폴리머가 있는 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 주위 온도에서 2시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 6119.16, 실험치 [M+H] 6121.54.
실시예 18 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-( TTpTTTTTTTTTTTTTTTTTT )의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 17 사이클의 dT 도입에 이어 5'-디트리틸레이션 반응, 추가의 dT 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 124㎕의 TMG, 50㎕의 BSA 및 325㎕의 무수 피리딘을 혼합하고, 3Å 몰레큘러 시브를 약 1/4부피가 될때까지 첨가함으로써 제조하였다. 20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 플라스틱 튜브에 넣어 혼합하고, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 1분 후에 상기 내용물을 폴리머가 있는 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 주위 온도에서 2시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 6119.16, 실험치 [M+H] 6120.01 , [M-H] 6114.19.
실시예 19 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-( TTpTTTTTTTTTTTTTTTTTpT )의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dT 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
80㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트의 분액을 플라스틱 튜브로 옮겼고, 20㎕의 BSA를 첨가하고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮기고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 상기 합성은 17개의 dT 뉴클레오타이드를 도입함으로써 재개하였고, 추가의 dT 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단하였다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 주위 온도에서 2시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 6216.33, 실험치 [M-H] 6221.11.
실시예 20 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTpTTTTTTTTTpTTTTTTTTpT )의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dT 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
120㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 30㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 8개의 dT 뉴클레오타이드들을 도입하고, 합성은 산화 반응 전에 마지막 dT 도입으로 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 9개의 dT 뉴클레오타이드들을 도입하고, 합성은 산화 반응 전에 마지막 dT 도입으로 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 세번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겼으며, 상기 합성은 마지막 dT 뉴클레오타이드 도입을 위해 재개하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 주위 온도에서 2시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 6313.49, 실험치 [M-H] 6310.71.
실시예 21 . 포스포릴 구아니딘기(FⅨ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTpT)의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 4개의 dT 도입에 이어 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 무수 구아니딘 하이드로클로라이드를 9.6mg 칭량하여 플라스틱 튜브에 넣고, 85㎕의 무수 피리딘, 15㎕의 DBU, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 상기 튜브를 5분 동안 볼텍싱하고, 맑아질 때까지 초음파분쇄(약 5분)하여 제조하였다.
20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 플라스틱 튜브에 넣어 혼합하고, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 1분 후에 상기 내용물을 폴리머가 있는 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 6063.05, 실험치 [M+H] 6065.02, [M-H] 6058.30.
실시예 22 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 5'- d(TTTT)tpdT의 제조; 본 실시예 및 하기 실시 예들에서 t는 LNA-T 뉴클레오타이드의 위치를 나타낸다.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. LNA-T의 도입을 위한 커플링 단계는 6분으로 연장되었다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, LNA-T 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 그런 다음, 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30분 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 RP-HPLC 결과는 도 3에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 1888.40, 실험치 [M+H] 1888.15, [M-H] 1886.86.
실시예 23 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 5'- tpd(TTTTT)의 제조; p는 변형된 포스포페이트기의 위치를 나타내고; t는 LNA-T 뉴클레오타이드의 위치를 나타낸다.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. LNA-T의 도입을 위한 커플링 단계는 6분으로 연장되었다. 합성은 4 사이클의 dT 도입 반응, 5'-디트리틸레이션 반응, LNA-T 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 합성을 5'-디트리틸레이션 반응에 의해 완성하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 RP-HPLC 결과는 도 3에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 1888.40, 실험치 [M+H] 1888.27, [M-H] 1887.44.
실시예 24 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(화학식 XⅣ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'- d(AACGTCAGGGTCTTCCp)BHQ의 제조; 본 실시예 및 하기 실시예들에서 BHQ는 BlackHole Quencher TM (FXⅡ)이다.
Figure 112017020126395-pct00022
(FXⅡ)
5mg의 BHQ CPG 지지체(42μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 그런 다음, 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 5510.92, 실험치 [M-H] 5509.50.
실시예 25 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-Flu d(GGAAG DDCCCTGACGTTp)BHQ의 제조. DD는 1,12-도데칸디올 포스페이트 ( FX Ⅲ), Flu는 5(6)- 카르복시플루오레세인 라벨(label)( FX Ⅳ)이다.
Figure 112017020126395-pct00023
(FXⅢ)
Figure 112017020126395-pct00024
(FXⅣ)
5mg의 BHQ CPG 지지체(42μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dT 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 그런 다음, 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 변형제(modifier)로서 상응하는 1,12-도데칸디올 및 플루오레세인 포스포르아미다이트를 사용하여 서열의 종결까지 합성을 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 6078.50, 실험치 [M+H] 6084.38.
실시예 26 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(화학식 XⅣ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TCTCTCpFCCTTCpC )의 제조; 본 실시예 및 하기 실시예들에서 F는 2- 히드록시메틸 -3- 히드록시테트라히드로푸란 ( 아푸리닉 / 아피리미 디닉 사이트)포스페이트(FXV)이다.
Figure 112017020126395-pct00025
(FXV)
5mg의 5'-DMTr-dC(Bz) CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
80㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 20㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 다음의 dC 뉴클레오타이드까지 dF 단위를 포함하는 5개의 뉴클레오타이드들을 도입하고, 합성은 산화 반응 단계 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 주위 온도에서 16시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 3857.76, 실험치 [M-H] 3856.74.
실시예 27 . 1,3-디메틸-2- (포스포릴이미노)이미다졸리딘기(FXⅥ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( GCGCCAAACpA )의 제조.
Figure 112017020126395-pct00026
(FXⅥ)
5mg의 5'-DMTr-dA(Bz)CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
100㎕의 1M 2-아지도-4,5-디히드로-1,3-디메틸-1H-이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트에 25㎕의 BSA 및 5㎕의 트리에틸아민을 첨가하고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 3101.20, 실험치 [M-H] 3101.55.
실시예 28 . N.N '- 비스 ( 테트라메틸렌 )-N"- 포스포릴 구아니딘기( FX Ⅶ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( GCGCCAAACpA )의 제조.
Figure 112017020126395-pct00027
(FXⅦ)
5mg의 5'-DMTr-dA(Bz) CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
100㎕의 1M 아지도디피롤리디노카르베늄 헥사플루오로포스페이트에 25㎕의 BSA 및 5㎕의 트리에틸아민을 첨가하고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 3155.29, 실험치 [M-H] 3153.75.
실시예 29 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 5'- AUCGpU의 제조.
5mg의 5'-DMTr-2'-OMe-rU CPG 지지체(40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 2'-OMe-rG 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 16시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1697.28, 실험치 [M+H] 1697.59, [M-H] 1694.77.
실시예 30 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 5'- GCGCCAAACpA의 제조.
5mg의 5'-DMTr-2'-OMe-rA(Bz) CPG 지지체(60μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 2'-OMe-rC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
40㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 10㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 3403.48, 실험치 [M-H] 3402.55.
실시예 31 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 5'- GCGCCAAApCpA의 제조.
5mg의 5'-DMTr-2'-OMe-rA(Bz) CPG 지지체(60μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 2'-OMe-rC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
80㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 20㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 2'-OMe-rU 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 합성은 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 12시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 3500.64, 실험치 [M+H] 3199.90, [M-H] 3499.75.
실시예 32 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(화학식 XⅣ)를 갖는 변형된 올리고-2'-O- 메틸리보뉴클레오타이드 포스포로티오에이트 5'-G S A S C S A S U S C S C S A S U S U S C S A S A S A S U S G S G S U S UpUpG의 제조: 본 실시예 및 하기 실시예들에서 s는 포스포로티오에이트 잔기(FXⅧ)를 나타낸다.)
Figure 112017020126395-pct00028
(FXⅧ)
5mg의 5'-DMTr-2'-OMe-rG(Tac) CPG 지지체(60μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 2'-OMe-rU 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
80㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 20㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 2'-OMe-rA 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 합성은 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 합성을 재개하여, 서열의 종결까지 요오드 산화 반응을 위하여, 황화물을 무수 피리딘 중의 0.1M 3-[(디메틸아미노에틸렌)이미노]-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온으로 치환하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 70℃에서 3시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 7436.14, 실험치 [M-H] 7433.89.
실시예 33 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 포스포로티오에이트 5'-Flu G S A S C S A S U S C S C S A S U S U S C S A S A S A S U S G S G S U S UpUpG의 제조: Flu는 5'-플루오레세인 라벨( FXIXV )을 나타내고, s는 포스포로티오에이트 잔기(FXⅧ)를 나타낸다.)
Figure 112017020126395-pct00029
5mg의 5'-DMTr-2'-OMe-rG(Tac) CPG 지지체(60μ㏖ g~ 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 2'-OMe-rU 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
80㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 20㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 2'-OMe-rA 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 합성은 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 합성 과정을 재개하여, 서열의 종결까지, 요오드 산화 반응을 위하여, 황화물을 무수 피리딘 중의 0.1M 3-[(디메틸아미노에틸렌)이미노]-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온으로 치환하였다. 상기 합성은 DMTr ON 모드에서 상응하는 플루오레세인 포스포르아미다이트를 도입함으로써 완성되었다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 70℃에서 3시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 8003.63, 실험치 [M-H] 8001.25.
실시예 34 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 변형된 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 포스포로티오에이트 5'-Flu G S G S C S C S A S A S A S C S C S U S C S C S G S C S UpUpACpCpU의 제조: Flu는 5'-플루오레세인 라벨( FXIX )을 나타내고, s는 포스포로티오에이트 잔기(FXⅧ)를 나타낸다.)
5mg의 5'-DMTr-2'-OMe-rU CPG 지지체(40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 2'-OMe-rC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
160㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 40㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 2'-OMe-rC 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 합성은 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 2'-OMe-rA 포스포르아미다이트, 이어서 2'-OMe-rU를 커플링시키고, 합성은 마지막 산화 반응 단계 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 세번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 45℃에서 1.5시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 2'-OMe-rU 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 합성은 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 네번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 45℃에서 1.5시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮기고, 상기 합성 과정을 재개하여, 서열의 종결까지, 요오드 산화 반응을 위하여, 황화물을 무수 피리딘 중의 0.1M 3-[(디메틸아미노에틸렌)이미노]-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온으로 치환하였다. 상기 합성은 DMTr ON 모드에서 상응하는 플루오레세인 포스포르아미다이트를 도입함으로써 완성되었다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 70℃에서 3시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 7763.48, 실험치 [M-H] 7759.37.
실시예 35 . N,N,N ',N'- 테트라메틸포스포릴 구아니딘기(FⅧ)를 갖는 혼합된 LNA-올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 포스포로티오에이트 5'-Flu G S g S C S g S A S a S A S C S c S U S C S C S c S C S UpUpaCpCpU의 제조: Flu는 5'-플루오레세인 라벨( FXIX )을 나타내고, s는 포스포로티오에이트 잔기(FXⅧ)를 나타낸다. LNA 뉴클레오타이드 A, 5-Me-C 및 G는 각각 소문자 a, c 및 g로 나타낸다.)
5mg의 5'-DMTr-2'-OMe-rU CPG 지지체(40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 2'-OMe-rC 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
160㎕의 0.5M 비스(디메틸아미노)-1-아지도카르베늄 디클로로포스페이트 분액을 플라스틱 튜브로 옮기고, 40㎕의 BSA를 첨가하였으며, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 50㎕의 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 2'-OMe-rC 포스포르아미다이트를 커플링시키고, 합성은 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 두번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 40℃에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, LNA-A 포스포르아미다이트, 이어서 2'-OMe-rU를 커플링시키고, 합성은 마지막 산화 반응 단계 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 세번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 45℃에서 1.5시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 2'-OMe-rU 포스포르아미다이트를 결합시키고, 합성은 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
50㎕의 네번째 분액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리하였고, 45℃에서 1.5시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 상기 합성 과정을 재개하여, 서열의 종결까지, 요오드 산화 반응을 위하여, 황화물을 무수 피리딘 중의 0.1M 3-[(디메틸아미노에틸렌)이미노]-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온으로 치환하였고, LNA 및 2'-OMe 포스포르아미다이트를 사용하였다. 상기 합성은 DMTr ON 모드에서 상응하는 플루오레세인 포스포르아미다이트를 도입함으로써 완성되었다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 70℃에서 3시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 7793.47, 실험치 [M-H] 7792.92.
실시예 36 . 1,3-디메틸-2- (포스포릴이미노)이미다졸리딘기(FXⅥ)를 갖는 변형된 올리고-2'-O- 메틸리보뉴클레오타이드 5'- UUUUUpU의 제조.
5mg의 5'-DMTr-2'-OMe-rU CPG 지지체(40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 2'-OMe-rU 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
100㎕의 1M 2-아지도-4,5-디히드로-1,3-디메틸-1H-이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트에 25㎕의 BSA 및 5㎕의 트리에틸아민을 첨가하고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다. 올리고뉴클레오타이드의 RP-HPLC의 결과는 도 4에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 1954.37, 실험치 [M-H] 1953.37.
실시예 37 . N.N '- 비스 ( 테트라메틸렌 )-N"- 포스포릴 구아니딘기( FX Ⅶ)를 갖는 변형된 올리고-2'-O- 메틸리보뉴클레오타이드 5'- UUUUUpU의 제조.
5mg의 5'-DMTr-2'-OMe-rU CPG 지지체(40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 올리고-2'-O-메틸리보뉴클레오타이드 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 2'-OMe-rU 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
100㎕의 1M 아지도디피롤리디노카르베늄 헥사플루오로포스페이트에 25㎕의 BSA 및 5㎕의 트리에틸아민을 첨가하였고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다. 올리고뉴클레오타이드의 RP-HPLC의 결과는 도 4에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 2008.46, 실험치 [M-H] 2007.57.
실시예 38 . N,N - 디메틸포스포릴 구아니딘기( FXX )를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTTTTpT )의 제조.
Figure 112017020126395-pct00030
(FXX)
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
플라스틱 튜브 내에 12mg의 (클로로메틸렌)디메틸이미늄 클로라이드 및 4mg(1.1 당량)의 NaN3를 첨가하고, 100㎕의 무수 MeCN을 첨가하였고, 상기 튜브를 30℃에서 2시간 동안 흔들었고, 14,500rpm에서 5분 동안 원심분리하였으며, 25㎕의 BSA를 첨가하였고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리하였으며, 상기 상등액을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
상기 올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 55℃에서 18시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1832.22, 실험치 [M-H] 1831.57.
실시예 39 . N- 포스포릴 포름아미딘기(FXXI)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTTTTpT )의 제조.
Figure 112017020126395-pct00031
(FXXI)
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
용액 1은 무수 피리딘 중에 요오드 크리스탈을 0.2M로 농도(51mg/ml)로 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 2는 무수 포름아미딘 하이드로클로라이드 40mg을 칭량하여 플라스틱 튜브에 넣고, 375㎕의 무수 피리딘, 75㎕의 DBU 및 50㎕의 BSA를 첨가한 후, 상기 튜브를 3~4분 동안 볼텍싱하였고, 맑아질 때까지 초음파분쇄하여(약 3~4분) 제조하였다.
20㎕씩의 용액 1과 2의 분액을 플라스틱 튜브에 넣어 혼합하고, 10㎕의 BSA를 첨가하고, 1분 후에 상기 내용물을 폴리머가 있는 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였고, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1789.27, 실험치 [M-H] 1788.60.
실시예 40 . N- 시아노이미노 포스페이트기(FXXⅡ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TTTTTpT )의 제조.
Figure 112017020126395-pct00032
(FXXⅡ)
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
McMurry [51]에 기재된 바와 같이 제조된, 무수 MeCN 중의 0.25M 시아노겐 아자이드 용액 20㎕에 5㎕의 BSA를 첨가하였고, 상기 튜브를 주위 온도에서 15분 동안 유지하였으며, 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브에 옮겨, 30초 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였으며, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
상기 올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 70℃에서 1시간 동안 용액 B로 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1787.25, 실험치 [M+H] 1787.27, [M-H] 1785.19.
실시예 41 . N- 시아노이미노 포스페이트기(FXXⅡ)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d( TpTTTTT )의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 4 사이클의 dT 도입 반응, 5'-디트리틸레이션 반응, dT 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
McMurry [51]에 기재된 바와 같이 제조된, 무수 MeCN 중의 0.25M 시아노겐 아자이드 용액 20㎕에 5㎕의 BSA를 첨가하였고, 상기 튜브를 주위 온도에서 15분 동안 유지하였으며, 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브에 옮겨, 30초 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 15초 동안 원심분리하였으며, 주위 온도에서 5분 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하고, 보호기들은 70℃에서 시간 동안 용액 B로 제거하였다. 올리고뉴클레오타이드의 RP-HPLC는 도 5에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 1787.25, 실험치 [M+H] 1787.19, [M-H] 1785.11.
실시예 42 . 3'- N,N '- 비스 ( 테트라메틸렌 )-N"- 구아니디노포스페이트기(FXXⅢ) 를 갖는 변형된 뉴클레오사이드 dTp의 제조.
Figure 112017020126395-pct00033
(FXXⅢ)
5mg의 3'-포스페이트 CPG 지지체(30~40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dT 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
100㎕의 1M 아지도디피롤리디노카르베늄 헥사플루오로포스페이트에 25㎕의 BSA 및 5㎕의 트리에틸아민을 첨가하였고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 상기 합성을 5'-디트리틸레이션 반응으로 완성하였다.
주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였다.
분자량: 이론치 [M] 471.45, 실험치 [M-H] 471.08.
실시예 43 . 3'- N,N '- 비스 ( 테트라메틸렌 )-N"- 구아니디노포스페이트기(FXXⅢ) 를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드 5'-d(TTTTTT)p의 제조.
5mg의 3'-포스페이트 CPG 지지체(30~40μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, dT 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
100㎕의 1M 아지도디피롤리디노카르베늄 헥사플루오로포스페이트에 25㎕의 BSA 및 5㎕의 트리에틸아민을 첨가하고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였다. 올리고뉴클레오타이드의 RP-HPLC는 도 6에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 1992.44, 실험치 [M-H] 1991.46.
실시예 44 . 5'- N,N '- 비스 ( 테트라메틸렌 )-N"- 포스포릴구아니딘기 및 플루오레세인 라벨(FXXⅣ)를 갖는 변형된 티미딘 뉴클레오사이드의 제조.
Figure 112017020126395-pct00034
(FXXⅣ)
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 실시예 25에서와 같이 동일한 플루오레세인 포스포르아미다이트를 사용하여, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 산화 반응 전에 중단하고, 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
100㎕의 1M 아지도디피롤리디노카르베늄 헥사플루오로포스페이트에 25㎕의 BSA 및 5㎕의 트리에틸아민을 첨가하였고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 공기 중에서 5분 동안 건조하였다.
주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였다. 올리고뉴클레오타이드의 RP-HPLC는 도 6에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 1263.32, 실험치 [M-H] 1262.22.
실시예 45 . 5'- N,N '- 비스 ( 테트라메틸렌 )-N"- 포스포릴구아니딘기 및 플루오레세인 라벨(FXXⅣ)을 갖는 변형된 올리고 뉴클레오타이드 5'-Flu pd( TTTTTT )의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5개의 dT 잔기들 및 플루오레세인 라벨 Flu' (XXV)의 도입 반응 후, 마지막 산화 반응 단계 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
100㎕의 1M 아지도디피롤리디노카르베늄 헥사플루오로포스페이트에 25㎕의 BSA 및 5㎕의 트리에틸아민을 첨가하였고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 공기 중에서 5분 동안 건조하였다.
주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였다. 올리고뉴클레오타이드의 RP-HPLC는 도 6에 나타낸다.
분자량: 이론치 [M] 2784.31 , 실험치 [M-H] 2782.96.
실시예 46 . 1,3-디메틸-2- (포스포릴이미노)이미다졸리딘기(FXⅥ)를 갖는 변형된 하이브리드 DNA-RNA 올리고뉴클레오타이드 5'- d(TTTT)rUpdT의 제조.
5mg의 고 로딩 5'-DMTr-dT CPG 지지체(110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하였다. 합성은 5'-디트리틸레이션 반응, 2'-TOM-rU 포스포르아미다이트 커플링 반응 및 캡핑 반응 후, 산화 반응 전에 중단되었다. 상기 컬럼을 합성기로부터 분리하고, 물 펌프에서 배수시키고, MeCN으로 헹구고, 부착된 포스파이트를 갖는 지지체를 플라스틱 튜브로 옮겼다.
100㎕의 1M 2-아지도-4,5-디히드로-1,3-디메틸-1H-이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트에 25㎕의 BSA 및 5㎕의 트리에틸아민을 첨가하였고, 상기 튜브를 1분 동안 볼텍싱하였고, 14,500rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 30분 동안 두었다. 상기 내용물을 지지체가 있는 튜브로 옮겼고, 30초 동안 볼텍싱하였으며, 14,500rpm에서 30초 동안 원심분리한 다음, 주위 온도에서 1시간 동안 흔들었다. 상등액은 버리고, 상기 지지체를 2×200㎕의 MeCN으로 헹구고, 합성기 컬럼 내로 옮겨, 합성을 서열의 종결까지 재수행하였다.
올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 분리하였고, 보호기들은 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 제거하였다. 그런 다음, TOM기는 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드-트리에틸렌아민-NMP(4:3:6 v/v/v)로 65℃에서 2시간 동안 제거하였다.
분자량: 이론치 [M] 1860.34, 실험치 [M-H] 1859.21.
실시예 47 . 자동화된 DNA 합성기를 이용하여, 1,3-디메틸-N- 포스포릴이미노 -2-이미다졸리딘기(FXⅥ)를 갖는 변형된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드들 5'-d(TTTTTpT), 5'-d( TTTTpTpT ), 5'-d( TTTpTpTpT ), 5'-d( TTpTpTpTpT ), 5'-d( TpTpTpTpTpT ), 5'-d(GpCpGpCpCpApApApCpA)의 제조.
5mg의 5'-DMTr-dT 또는 dA CPG 지지체(35~110μ㏖ g- 1)를 함유하는 컬럼을 DNA 합성기 내에 놓고, 자동화된 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 고체상 DNA 합성을 0.2μ㏖의 스케일로 개시하여, 서열 내의 상응하는 위치(p)에 대한 요오드 산화반응을 위해, 무수 아세토니트릴 중의 1M 2-아지도-4,5-디히드로-1,3-디메틸-1H-이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트로 치환처리하였다.
올리고뉴클레오타이드 5'-d(GpCpGpCpCpApApApCpA)는 55℃에서 12시간 동안, 또는 올리고티미딜레이트는 주위 온도에서 1시간 동안 용액 A로 지지체로부터 분리되었다. 올리고뉴클레오타이드들의 RP-HPLC는 도 7 및 8에 나타낸다.
분자량:
5'-d(TTTTTpT) - 이론치 [M] 1858.37, 실험치 [M-H] 1857.57;
5'-d(TTTTpTpT) - 이론치 [M] 1953.32, 실험치 [M-H] 1952.57;
5'-d(TTTpTpTpT) - 이론치 [M] 2048.67, 실험치 [M-H] 2047.77;
5'-d(TTpTpTpTpT) - 이론치 [M] 2143.82, 실험치 [M-H] 2142.77;
5'-d(TpTpTpTpTpT) - 이론치 [M] 2238.96, 실험치 [M-H] 2237.97;
5'-d(GpCpGpCpCpApApApCpA) - 이론치 [M] 3862.38, 실험치 [M-H] 3860.50.
참고문헌들
본 발명 및 본 발명이 속하는 기술의 분야의 상태를 기재하고 개시하기 위해 많은 문헌들이 본 명세서에서 인용된다. 이들 참고 문헌에 대한 전체 인용은 하기에 제공된다. 이들 각각의 참고문헌들은 각각의 개별적인 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참고문헌으로서 통합된 것과 동일한 정도로, 그 전체가 본 명세서에서 참고 문헌으로 통합된다.
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Figure 112017020126395-pct00036
Figure 112017020126395-pct00037
Figure 112017020126395-pct00038
SEQUENCE LISTING <110> NooGen LLC <120> Modified Oligonucleotides and Methods for their Synthesis <130> RIC/FP6992291 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 1..2, 2..3, 3..4, 4..5, 5..6, 6..7, 7..8, 8..9, 9..10 <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> 6..7, 9..10 <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> 7..8, 9..10 <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> 7..8, 8..9, 9..10 <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> 8..9, 9..10 <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> In an embodiment, 1,3-dimethyl-2-(phosphorylimino)imidazolidine group <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> In an embodiment, N,N'-bis(tetramethylene)-N"-phosphoryl guanidine group <400> 1 gcgccaaaca 10 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> 2..3, 19..20 <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> 2..3, 11..12, 19..20 <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> In an embodiment, phosphoryl guanidine group <400> 2 tttttttttt tttttttttt 20 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <400> 3 ggaaggggag aga 13 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Covalently linked to BHQ via an N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <400> 4 aacgtcaggg tcttcc 16 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Linked to Flu, 5(6)-carboxyfluorescein label <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Linked by 1,12-dodecanediol phosphate <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Covalently linked to BHQ via an N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <400> 5 ggaagccctg acgtt 15 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic modified oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> (N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group) - (2-hydroxymethyl-3-hydroxytetrahydrofurane (apurinic/apyrimidinic site) phosphate) <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <400> 6 tctctccctt cc 12 <210> 7 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic modified oligo-2'-O-methylribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 8..9, 9..10 <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> In an embodiment, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <400> 7 gcgccaaaca 10 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic modified oligo-2'-O-methylribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 1..2, 2..3, 3..4, 4..5, 5..6, 6..7, 7..8, 8..9, 9..10, 10..11 <223> In the embodiments of Examples 32 & 33, phosphorothioate residue <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> In the embodiment of Example 33, linked to Flu, 5(6)-carboxyfluorescein label <220> <221> misc_feature <222> 11..12, 12..13, 13..14, 14..15, 15..16, 16..17, 17..18, 18..19 <223> In the embodiments of Examples 32 & 33, phosphorothioate residue <220> <221> misc_feature <222> 19..20, 20..21 <223> In the embodiments of Examples 32 & 33, N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <400> 8 gacauccauu caaaugguuu g 21 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic modified oligo-2'-O-methylribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Linked to Flu, 5(6)-carboxyfluorescein label <220> <221> misc_feature <222> 1..2, 2..3, 3..4, 4..5, 5..6, 6..7, 7..8, 8..9, 9..10 <223> Phosphorothioate residue <220> <221> misc_feature <222> 10..11, 11..12, 12..13, 13..14, 14..15 <223> Phosphorothioate residue <220> <221> misc_feature <222> 15..16, 16..17, 18..19, 19..20 <223> N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <400> 9 ggccaaaccu ccgcuuaccu 20 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic mixed LNA-oligo-2'-O-methylribonucleotide phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Linked to Flu, 5(6)-carboxyfluorescein label <220> <221> misc_feature <222> 1..2, 2..3, 3..4, 4..5, 5..6, 6..7, 7..8, 8..9, 9..10 <223> Phosphorothioate residue <220> <221> misc_feature <222> 2, 4, 6, 9, 13, 17 <223> LNA base <220> <221> misc_feature <222> 10..11, 11..12, 12..13, 13..14, 14..15 <223> Phosphorothioate residue <220> <221> modified_base <222> 9, 13 <223> m5c <220> <221> misc_feature <222> 15..16, 16..17, 18..19, 19..20 <223> N,N,N',N'-tetramethyl phosphoryl guanidine group <400> 10 ggcgaaaccu ccccuuaccu 20

Claims (26)

  1. 화학식 (Ⅰ)의 화합물:
    Figure 112020006340234-pct00039
    (Ⅰ)
    여기서, Z는 -O-, -S-, -Se-, -N-RN, 또는 -BH3 -로부터 선택되고, RN은 H, -C1-4 알킬, 또는 보호기이고;
    X는 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 선택되고, Y는 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단; -H, -OH, -SH, NHRN, -O-PG, S-PG (여기서, PG는 보호기이다); 연결기; 모노포스페이트 또는 디포스페이트; 또는 라벨 또는 퀀처(quencher)로부터 선택되거나; 또는
    Y는 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단으로부터 선택되고, X는 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단; -H, -OH, -SH, NHRN, -O-PG, 또는 S-PG (여기서, PG는 보호기이다); 연결기; 모노포스페이트 또는 디포스페이트; 또는 라벨 또는 퀀처로부터 선택되고;
    R1은 -NR1AR1B, -OR3, -SR3, -H, -S(0)H, -S(0)R3, -S(0)2H, -S(0)2R3, -S(0)2NH2, -S(0)2NHR3, -S(0)2NR3 2, -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴(여기서, 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된다)로부터 선택되며;
    R2는 -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, 할로겐, -CN, -S(0)H, -S(0)R3, -S(0)2H, -S(0)2R3, -S(0)2NH2, -S(0)2NHR3, -S(0)2NR3 2, -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴(여기서, 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된다)로부터 선택되고;
    여기서, 각각의 R1A, R1B, R2A, 및 R2B는 독립적으로 -H, -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴(여기서, 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된다)로부터 선택되며;
    선택적으로, R1A 및 R2A는 함께 2~4개 원자 길이의 알킬렌 또는 헤테로알킬렌(여기서, 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된다) 사슬을 형성하고;
    선택적으로, R1A 및 R1B는 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 모르폴리닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 형성하며;
    선택적으로, R2A 및 R2B는 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 및 모르폴리닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 형성하고;
    R3는 -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴(여기서, 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된다)로부터 선택되며;
    여기서, 각각의 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌은 선택적으로 치환되며,
    상기 연결기는 숙시닐, 디글리콜일, 옥살릴, 하이드로퀴논-O,O'-디아세틸(Q-linker), 프탈로일, 4,5-디클로로프탈로일, 말로닐, 글루타릴, 디이소프로필실릴 및 1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일 및 1,12-도데칸디올 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 라벨은 플루오레세인이고,
    상기 퀀처는 BlackHole 퀀처(BHQ)이다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1은 -NR1AR1B, -OR3 또는 -SR3인 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    R1은 -NR1AR1B인 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    R2는 -H, -NR2AR2B, 또는 -OR3인 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    R2는 -NR2AR2B인 화합물.
  6. 제1항에 있어서,
    R1A, R1B, R2A, 및 R2B 각각은 독립적으로 -H, 및 -F, -Cl, -OH, -C1-4 알콕시, -NH2, -NH(C1-4 알킬) 및 -N(C1-4 알킬)2 로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 -C1-4 알킬로부터 선택되는 화합물.
  7. 제6항에 있어서,
    R1A, R1B, R2A, 및 R2B는 각각 메틸인 화합물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1A 및 R2A는 함께 2~4개 원자 길이의 알킬렌 또는 헤테로알킬렌(여기서, 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된다) 사슬을 형성하고, R1B 및 R2B는 각각 독립적으로 -H 및 -C1-4 알킬로부터 선택되는 화합물.
  9. 제8항에 있어서,
    R1A 및 R2A는 함께 -CH2-CH2-를 형성하고, R1B 및 R2B는 각각 독립적으로 -H 및메틸로부터 선택되는 화합물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1A 및 R1B는 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 모르폴리닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 형성하는 화합물.
  11. 제10항에 있어서,
    R2A 및 R2B는 그들이 결합되어 있는 원자와 함께 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 모르폴리닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 형성하는 화합물.
  12. 삭제
  13. 산화제, 및 선택적으로 실릴화제와 염기 중 적어도 하나의 존재하에, 인산 유도체와 이미노 유도체 HN=CR1R2 또는 N-실릴화 이미노 유도체 RSi 3SiN=CR1R2 (여기서, RSi는 알킬 또는 아릴기이다)의 반응을 포함하고, 상기 인산 유도체는 포스파이트 또는 H-포스포네이트인, 제1항에 따른 화합물의 합성 방법.
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서,
    상기 산화제는 요오드 I2, 브로민 Br2, 염소 Cl2, 요오드 클로라이드 ICl, N-브로모숙신이미드, N-클로로숙신이미드, N-요오도숙신이미드, 카본 테트라클로라이드 CCl4, 브로모트리클로로메탄 CCl3Br, 테트라브로모메탄 CBr4, 테트라요오도메탄 CI4, 요오도포름 CHI3, 헥사클로로에탄 C2Cl6, 또는 헥사클로로아세톤 (CCl3)2CO인 방법.
  16. 선택적으로 실릴화제 및 염기 중 적어도 하나의 존재하에, 인산 유도체와 유기 아자이드의 반응을 포함하고, 상기 인산 유도체는 포스파이트 또는 H-포스포네이트인, 제1항에 따른 화합물의 합성 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 아자이드는 하기 화학식의 화합물들로부터 선택되는 방법:
    Figure 112020006340234-pct00051
    ,
    여기서, 각각의 R1A, R1B, R2A, R2B는 독립적으로 -H, 또는 선택적으로 치환된 -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴(여기서, 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된다)이고, 또는,
    선택적으로 R1A 및 R2A가 함께 2~4개 원자 길이의 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 (여기서, 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된다) 사슬을 형성하고, 선택적으로 R1A 및 R2A는 함께 -CH2-CH2-를 형성하며, R1B 및 R2B는각각 독립적으로 -H 및 메틸로부터 선택되고,
    선택적으로 R1A 및 R1B는 그들이 결합된 원자와 함께 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 모르폴리닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 형성하거나, 또는
    선택적으로 R2A 및 R2B는 그들이 결합된 원자와 함께 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 모르폴리닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 형성한다; 또는

    Figure 112020006340234-pct00052

    여기서, 각각의 R1A 및 R1B는 독립적으로 -H, 또는 선택적으로 치환된 -C1-10 알킬, -C2-10 알케닐, -C2-10 알키닐, -C6-10 아릴, 또는 -C5-10 헤테로아릴(여기서, 헤테로 원자는 N, O 또는 S로부터 선택된다)이거나; 또는 R1A 및 R1B는 그들이 결합된 원자와 함께 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐 또는 모르폴리닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로고리를 형성하며, R2는 -H, -F, -OPG, -Cl, -Br, -I, -CN, -N3, -O-C1-10 알킬, -SPG, 및 -S-C1-10 알킬로부터 선택되고, 여기서 PG는 보호기이다.
  18. 제13항, 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 반응은 실릴화제의 존재하에 수행되고, 선택적으로 상기 실릴화제는 N,0-비스(트리메틸실릴)아세트아미드(BSA), N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(BSTFA), 클로로트리메틸실란, 브로모트리메틸실란, 요오도트리메틸실란, 트리에틸실릴 클로라이드, 트리페닐실릴 클로라이드, 헥사메틸디실라잔, 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf), 디메틸이소프로필실릴 클로라이드, 디에틸이소프로필실릴 클로라이드, 터셔리-부틸디메틸실릴 클로라이드, 터셔리-부틸디페닐실릴 클로라이드, 트리이소프로필실릴 클로라이드, 디메틸디클로로실란, 또는 디페닐디클로로실란인 방법.
  19. 제13항, 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 반응은 염기의 존재하에 수행되고, 선택적으로 상기 염기는 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA), N-메틸모르폴린, N-에틸모르폴린, 트리부틸아민, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄(DABCO), N-메틸이미다졸(NMI), 피리딘, 2,6-루티딘, 2,4,6-콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌("프로톤 스폰지"), 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU), 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5엔(DBN), 1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔(TBD), 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔(MTBD), 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(TMG), 2-터셔리-부틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2,8,9-트리메틸-2,5,8,9-테트라아자-1-포스파비시클로[3.3.3]운데칸 또는 포스파젠 염기인 방법.
  20. 적어도 하나의 화학식 (Ⅰ)의 변형된 포스페이트 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오타이드:

    Figure 112020006340234-pct00053
    (Ⅰ)
    여기서, Z는 O이고; X, Y, R1 및 R2는 제1항에서 정의된 바와 같다.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 변형된 포스페이트 모이어티가 포스포릴 구아니딘, 포스포릴 아미딘, 포스포릴 이소우레아, 포스포릴 이소티오우레아, 포스포릴 이미데이트 또는 포스포릴 이미도티오에이트인 올리고뉴클레오타이드.
  22. 삭제
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오타이드는 시험관내 진단제로서의 사용을 위한 것인 올리고뉴클레오타이드.
  24. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오타이드는 의학적 치료 방법에서의 사용을 위한 것인 올리고뉴클레오타이드.
  25. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오타이드는 질병의 치료에 사용하기 위한 의약 또는 약학적 조성물의 제조를 위한 것인 올리고뉴클레오타이드
  26. 삭제
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