ES2877560T3

ES2877560T3 - Oligonucleótidos modificados y métodos para su síntesis

Info

Publication number: ES2877560T3
Application number: ES14838930T
Authority: ES
Inventors: Dmitry Stetsenko; Maxim Kupryushkin; Dmitrii Pyshnyi
Original assignee: Noogen LLC
Current assignee: Noogen LLC
Priority date: 2014-08-22
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2021-11-17
Anticipated expiration: 2034-08-28
Also published as: CN106795197B; PT3183260T; KR102143384B1; DK3183260T3; RU2708237C2; US11208430B2; US20210032283A1; KR20170043543A; CN115010780A; CN106795197A; PL3183260T3; US20170362270A1; WO2016028187A1; RU2014134380A; EP3183260A1; EP3183260B1; EP3904364A1; JP2017527277A; JP6632605B2

Abstract

Un compuesto de Fórmula (I) **(Ver fórmula)** en la que: Z es -O-; X se selecciona del extremo 5' de un nucleósido, análogo de nucleósido, oligonucleótido, o análogo de oligonucleótido, e Y se selecciona del extremo 3' de un nucleósido, análogo de nucleósido, oligonucleótido, o análogo de oligonucleótido; -H, -OH, -SH, -O-PG, S-PG, un enlazador, un monofosfato o difosfato, o un marcador o inactivador; o Y se selecciona del extremo 3' de un nucleósido, análogo de nucleósido, oligonucleótido, o análogo de oligonucleótido, y X se selecciona del extremo 5' de un nucleósido, análogo de nucleósido, oligonucleótido, o análogo de oligonucleótido, -H, -OH, -SH, -O-PG o S-PG, un enlazador, un monofosfato o difosfato, o un marcador o inactivador; R1 se selecciona de -NR1AR1B, -OR3, -SR3, -H, -S(O)H, -S(O)R3, -S(O)2H, -S(O)2R3, -S(O)2NH2, -S(O)2NHR3, - S(O)2NR32, -alquilo de C1-10, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10; R2 se selecciona de -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, halógeno, -CN, -S(O)H, -S(O)R3 , -S(O)2H, -S(O)2R3, -S(O)2NH2, - S(O)2NHR3, -S(O)2NR32, -alquilo de C1-10, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5- 10; en la que cada R1A, R1B, R2A, y R2B se selecciona independientemente de -H, -alquilo de C1-10, -alquenilo de C2-10, - alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10; opcionalmente en el que R1A y R2A forman juntos una cadena de alquileno o heteroalquileno de 2-4 átomos de longitud; opcionalmente en el que R1A y R1B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros; opcionalmente en el que R2A y R2B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros; R3 se selecciona de -alquilo de C1-10, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10; en la que cada alquilo, arilo, heteroarilo, alquileno o heteroalquileno está opcionalmente sustituido; en la que PG es un grupo protector.

Description

DESCRIPCIÓN

Oligonucleótidos modificados y métodos para su síntesis

Campo técnico

La presente invención se refiere a nucleótidos y oligonucleótidos que tienen un grupo fosfato modificado, y a métodos para su síntesis.

Antecedentes

Los derivados de ácidos nucleicos, tales como los oligonucleótidos con varias funcionalidades adicionales, se usan ampliamente como herramientas de investigación en las ciencias de la vida, en particular, se consideran terapias prometedoras [1] y sondas sensibles para el diagnóstico molecular [2]. Varias terapias con oligonucleótidos han recibido la aprobación de la FDA para pasar a la clínica. Los ejemplos incluyen un agente antivírico Vitravene (Fomivirsen, ISIS 2922) [3], un aptámero anti-angiogénico Macugen (Pegaptanib sódico) [4] y un gápmero anticolesterol Mipomersen (Kynamro, ISIS 301012) [5]. Varios otros oligonucleótidos candidatos, tales como ARNip, ADNzimas y análogos de morfolino antisentido (PMO), se encuentran actualmente en diversas fases de ensayos clínicos.

Para ser considerados candidatos terapéuticos potenciales, los oligonucleótidos deben cumplir los siguientes requisitos.

1. Estabilidad y especificidad de secuencia suficientes de un complejo complementario con su diana biológica (la mayoría de las veces es un ARN celular).

2. Mayor resistencia en medios biológicos tal como suero.

3. Propiedades físico-químicas beneficiosas tales como solubilidad acuosa y estabilidad química.

4. Síntesis rentable y precio asequible.

5. Absorción celular eficaz y administración in vivo, preferiblemente en ausencia de agentes de transfección externos.

Según el mecanismo de acción, los análogos de oligonucleótidos pueden interferir con prácticamente cualquier etapa de la transferencia de información genética: ya sea de ADN a ARN (transcripción) o de ARN a proteína (traducción). La inhibición de la transcripción se realiza mediante la unión del ADN genómico mediante oligonucleótidos formadores de tríplex (TFO) [6], en particular ácidos nucleicos peptídicos (PNA) [7]. La inhibición de la traducción (mecanismo antisentido) se realiza mediante el bloqueo del ARNm [8]. La mayoría de los análogos de oligonucleótidos conocidos hasta la fecha actúan mediante un mecanismo antisentido. Se trata de pequeños ARN interferentes (ARNip) [9], enzimas de ácidos nucleicos (ribozimas o ADNzimas) [10], y una mayoría de los análogos de oligonucleótidos modificados químicamente [11]. Los derivados de oligonucleótidos específicos, tales como aptámeros, también pueden bloquear la función de las proteínas mediante la unión directa a proteínas o cofactores de moléculas pequeñas [12].

La mayoría de los análogos de oligonucleótidos antisentido se unen al ARNm e inhiben la traducción a través del bloqueo estérico [13]. Entre ellos se incluyen la mayoría de análogos con modificaciones en el azúcar, tales como derivados de 2’-fluoro [14], 2’-O-metilo [15], 2’-O-p-metoxietilo (2’-MOE) [16] o ácido nucleico bloqueado (LNA) [17]. Los análogos de oligonucleótidos, que sustituyen un grupo no cargado por un grupo fosfato internucleosídico aniónico tales como metilfosfonatos [18], fosfotriésteres [19] o fosforamidatos [20], también actúan mediante bloqueo estérico. El mismo mecanismo antisentido está implicado en la acción de imitadores distantes de ácidos nucleicos tales como los PNA [21] o los fosforodiamidato morfolino oligonucleótidos (PMO) [22].

Un interés adicional atrae a esos análogos, que son capaces de inactivar irreversiblemente el ARN catalizando su escisión hidrolítica, por ejemplo mediante el reclutamiento de la enzima celular RNasa H por 2’-desoxi fosforotioatos [23], derivados de ara-2’-fluoro (2’-FANA) [24] o gápmeros [24]. Los ARNip inducen la división catalítica del ARNm activando el complejo RISC con actividad de ribonucleasa [25], mientras que las enzimas de ácido nucleico (ribozimas o ADNzimas) no requieren proteínas para su acción catalítica de división del ARN [27].

Muchos análogos de oligonucleótidos tienen grupos fosfato internucleosídicos modificados. Entre ellos, los fosforotioatos [28], los fosforoditioatos [29] y los boranofosfatos [30]. Una característica positiva de estos derivados es su coste relativamente bajo debido al uso de 2’-desoxirribonucleótidos naturales y una química de fosforamidito de ADN en fase sólida altamente eficaz [31]. Los análogos modificados con fosfato contienen átomo o átomos de fósforo asimétricos, y generalmente se obtienen como una mezcla de 2n-1 diastereómeros para oligonucleótidos n-meros. Diferentes diastereómeros a menudo tienen diferente afinidad por el ARN y la resistencia enzimática, que son cruciales para una posible acción antisentido.

Actualmente, una tarea de especial prioridad es el desarrollo de análogos de oligonucleótidos con absorción celular eficaz y administración in vivo, preferiblemente en ausencia de agentes de administración externos tales como lípidos catiónicos, polímeros o nanopartículas. Aquí, los análogos de oligonucleótidos con carga negativa reducida o completamente eliminada pueden ser particularmente interesantes [32]. Entre ellos se encuentran los fosforamidatos de oligonucleósidos que sustituyen el fosfato aniónico por un grupo fosforamidato de carga neutra. La síntesis química de fosforamidatos es relativamente sencilla. Sin embargo, esos análogos exhiben una afinidad reducida por el ARN [33] y son sensibles a la hidrólisis ácida [34]. Los fosforamidatos N3’ ^ P5’ tienen una unión de ARN mejorada, pero son difíciles de sintetizar [35]. Los representantes que tienen grupos cargados positivamente en las cadenas laterales son más accesibles y tienen una excelente estabilidad enzimática, pero su afinidad por el ARN es menor [36]. Al mismo tiempo, la mayoría de los derivados de fosforamidato conocidos, incluyendo agentes antisentido útiles tales como los morfolinos (PMO) [37], muestran cierta labilidad a pH ácido. Se necesitaría una estabilidad ácida mejorada para evitar la degradación de los análogos de oligonucleótidos dentro de los endosomas.

Durante la última década han surgido nuevos análogos de oligonucleótidos de fosfonato, que sustituyen un fosfato natural por un grupo fosfonato ionizable. Entre ellos se encuentran los fosfonoacetatos y tiofosfonoacetatos [38], los fosfonoformiatos [39] y los 1,2,3-triazol-4-ilfosfonatos [40]. Esos compuestos exhiben una resistencia biológica aumentada y una unión de ARN adecuada, y, adicionalmente, apoyan la escisión de la ARNasa H y tienen una absorción celular mejorada incluso en ausencia de agentes de transfección. Sin embargo, su síntesis química es difícil y costosa.

También se han descrito nucleótidos y oligonucleótidos modificados que contienen al menos una vez la estructura P=N-Acc, en la que Acc es un aceptor electrónico [41]. Las identidades adecuadas para Acc son -CN, -SO²R, y heterociclos N+ de seis miembros deficientes en electrones, en los que al menos un nitrógeno está alquilado y en posición orto o para.

Por el momento, se llama mucho la atención sobre fosforodiamidato morfolino oligonucleótidos (PMO), que son agentes antisentido conocidos [42]. Están disponibles comercialmente en GeneTools LLC. Los PMO son explorados activamente como posibles terapias por Sarepta Therapeutics, (hasta 2012 AVI Biopharma). En 2013, la compañía anunció la finalización con éxito de los ensayos clínicos de Fase III contra la distrofia muscular de Duchenne (DMD) con un fármaco PMO Eteplirsen (AVI-4658), que corrige el empalme aberrante del pre-ARNm de la distrofina [43]. A principios de 2014, Sarepta Therapeutics afirmó que su candidato a fármaco de tipo morfolino AVI-7288 había superado con éxito los ensayos clínicos de Fase I contra la letal fiebre hemorrágica de Marburgo causada por un virus que contiene ARN [44].

Sin embargo, los morfolinos son sensibles a los ácidos al igual que otros fosforamidatos [45]. Además, su síntesis se basa en la química P(V) [46]. La química puede conducir a reacciones secundarias tal como la modificación del O6 en guanina [47]. Puede prevenirse mediante un grupo protector en la posición O6 [48], pero eso requiere un monómero G especial, que se suma a los costes de la síntesis de los PMO. Otro inconveniente de la química es que es incompatible con el método común de fosforamidito, y no puede usar los reactivos de marcaje y modificación disponibles de proveedores habituales tal como Glen Research, Inc.

Otro inconveniente grave de los PMO es la dificultad de su modificación química para obtener diversos derivados para estudios de estructura-actividad. Solo se propusieron unas pocas modificaciones de la cadena lateral al PMO que, según se afirma, mejoran su absorción celular y su eficacia terapéutica [49].

Los morfolinos muestran a menudo eficiencias relativamente bajas de absorción celular y, por lo tanto se requieren altas dosis repetidas para que se observe un buen efecto terapéutico. La absorción celular de conjugados de PMO-péptido es mucho mayor que la de PMO a solas, y de este modo se necesitan dosis mucho más bajas in vivo [50]. Existe la necesidad de obtener mejores análogos de oligonucleótidos que muestren mayores niveles de suministro de células y tejidos y una eficacia terapéutica mejorada en ausencia de auxiliares de suministro.

De este modo, el desarrollo de nuevos análogos de oligonucleótidos sigue siendo una tarea importante.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Esta presente invención se basa en el conocimiento de los inventores sobre posibles candidatos para sustancias terapéuticas oligonucleotídicas con absorción celular mejorada. Específicamente, la presente invención se basa en las siguientes ideas para enfoques adecuados/características para nuevas sustancias terapéuticas oligonucleotídicas de este tipo:

1. Sustituir un grupo fosfato aniónico natural por grupos de carga neutra o cargados positivamente.

2. Cumplir con los requisitos para posibles sustancias terapéuticas oligonucleotídicas descritas anteriormente.

3. Preferiblemente, conservar una cadena principal de nucleótidos convencional.

4. Mostrar suficiente estabilidad química.

5. Poseer una flexibilidad estructural que permita la incorporación de diversos grupos de cadenas laterales.

6. Tener baja toxicidad.

En el presente documento se describen nuevos análogos de oligonucleótidos que corresponden a los requisitos anteriores y que pueden exhibir potencialmente una absorción celular mejorada. En términos generales, estos análogos de oligonucleótidos pertenecen a la clase de fosforiliminas y análogos de las mismas, por ejemplo fosforil guanidinas, fosforil amidinas, fosforil isoureas, fosforil isotioureas, fosforil imidatos, fosforil imidotioatos, y análogos de los mismos.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se refiere a un nucleótido u oligonucleótido que comprende una fosforil guanidina (FI), fosforil amidina (FII), fosforil isourea (FIII), fosforil isotiourea (FIV), fosforil imidato (FV), o fosforil imidotioato (FVI), por ejemplo una fosforil guanidina (FI), fosforil amidina (FII), fosforil isourea (FIII), fosforil isotiourea (FIV). Se apreciará que la invención también se refiere a versiones de fosfato modificadas de estos restos; es decir, fosfatos en los que uno o más de los átomos de oxígeno que rodean a los átomos de fósforo han sido reemplazados, por ejemplo, por un átomo de azufre, un átomo de selenio, un grupo imino o un borano.

Por ejemplo, la presente invención se refiere a, entre otros, nucleótidos u oligonucleótidos, y análogos de los mismos, que comprenden uno o más de los siguientes motivos:

en los que ---- indica un punto de unión a un sustituyente.

Estos grupos fosfato modificados son de considerable interés debido a sus propiedades físico-químicas. Sin desear estar ligados a ninguna teoría en particular, los presentes inventores creen que estos restos pueden ser de carga neutra, carga negativa o carga positiva a pH fisiológico, haciéndolos de considerable interés para la síntesis de nucleótidos y oligonucleótidos útiles en aplicaciones de terapia, diagnóstico e investigación.

Además, los presentes inventores han descubierto que estos grupos fosfato modificados pueden incorporarse en estructuras de oligonucleótidos convenientemente usando métodos como se describen en el presente documento, y son compatibles con muchos motivos y secuencias de oligonucleótidos modificados y/o marcados conocidos y biológicamente interesantes.

Por ejemplo, el motivo puede ser:

FVII

en el que:

R1 se selecciona de -NR1AR1B, -OR3, -SR3, -H, -S(O)H, -S(O)R3, -S(O)2H, -S(O)2R3, -S(O)2NH2, -S(O)2NHR3, -S(O)2NR32, -alquilo de C1 -10, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10;

R2 se selecciona de -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, halógeno, -CN, -S(O)H, -S(O)R3, -S(O)2H, -S(O)2R3,-S(O)2NH2, -S(O)2NHR3, -S(O)2NR32, -alquilo de C1-10, alquenilo de C2-10, alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10;

en el que cada R1A, R1B, R2A y R2B se selecciona independientemente de -H, -alquilo de C1-10, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10;

opcionalmente en el que R1A y R2A forman juntos una cadena de alquileno o heteroalquileno de 2-4 átomos de longitud;

opcionalmente en el que R1A y R1B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros;

opcionalmente en el que R2A y R2B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros;

R3 se selecciona de -alquilo de C1-10, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10;

en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, alquileno o heteroalquileno está opcionalmente sustituido.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula (I):

en la que Z es -O-;

X se selecciona del extremo 5’ de un nucleósido, análogo de nucleósido, oligonucleótido, o análogo de oligonucleótido, e Y se selecciona del extremo 3’ de un nucleósido, análogo de nucleósido, oligonucleótido, o análogo de oligonucleótido; -H, -OH, -SH, -O-PG, o S-PG, un enlazador, un monofosfato o difosfato, o un marcador o inactivador;

o

Y se selecciona del extremo 3’ de un nucleósido, análogo de nucleósido, oligonucleótido, o análogo de oligonucleótido, y X se selecciona del extremo 5’ de un nucleósido, análogo de nucleósido, oligonucleótido, o análogo de oligonucleótido, -H, -OH, -SH, -O-PG o S-PG, un enlazador, un monofosfato o difosfato, o un marcador o inactivador;

R2 se selecciona de -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, halógeno, -CN, -S(O)H, -S(O)R3, -S(O)2H, -S(O)2R3,-S(O)2NH2, -S(O)2NHR3, -S(O)2NR32, -alquilo de C 1-10, alquenilo de C2-10, alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10;

R3 se selecciona de -alquilo de C1-10, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10; en la que cada alquilo, arilo, heteroarilo, alquileno o heteroalquileno está opcionalmente sustituido; en la que PG es un grupo protector.

En algunas realizaciones, R1 se selecciona de -NR1AR1B, -OR3, y -SR3. En algunas realizaciones, R1 es -NR1AR1B. Por consiguiente, el compuesto puede ser un compuesto de fórmula (Ia), en la que X, Y, Z, R1A, R1B y R2 son como se definen aquí.

El compuesto puede ser un nucleótido “modificado”, un oligonucleótido “modificado”, o un nucleósido trifosfato “modificado”. Se entenderá que el término “modificado” en este contexto se refiere a la incorporación del resto fosfato modificado representado en la Fórmula (I), es decir, un fosfato que comprende el motivo representado en la Fórmula (FVII).

Los nucleósido trifosfatos son moléculas que contienen un nucleósido unido a tres grupos fosfato. Se entenderá que en este contexto, el término fosfato incluye fosfatos modificados, como se define en el presente documento. De manera adecuada, el nucleósido trifosfato tiene un grupo trifosfato que tiene tres fosfatos unidos en una fila; es decir, la molécula puede ser un dNTP o similar. En otras realizaciones, los nucleósidos pueden tener fosfatos en las posiciones 5’ y 3’, por ejemplo un solo grupo fosfato en la posición 5’ y un grupo difosfato (dos fosfatos unidos entre sí) en la posición 3’. Se apreciará que cualquiera y todos estos grupos fosfato pueden modificarse como se describe en el presente documento.

Cuando el compuesto es un oligonucleótido, se entenderá que cada nucleósido adicional puede ser él mismo independientemente un análogo de nucleósido y, adicional o alternativamente, cada grupo fosfato adicional (si está presente) puede modificarse en sí mismo.

En algunas realizaciones, R2 se selecciona de -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, -S(O)H, -S(O)R3, -S(O)2H, -S(O)2R3, -S(O)2NH2, -S(O)2NHR3, -S(O)2NR32, -alquilo de C1-10, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10, en el que cada alquilo, arilo, heteroarilo, alquileno o heteroalquileno está opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R2 es -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, -alquilo de C1-10, alquenilo de C2-10, alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10, en el que cada alquilo, arilo, heteroarilo, alquileno o heteroalquileno está opcionalmente sustituido.

En algunas realizaciones, R2 es -H, -NR2AR2B o -OR3. Por ejemplo, el compuesto puede contener un grupo fosforil formamidina (P-N=CHNR1AR1B), una fosforil guanidina (P-N=C(N^r1AR1B) (NR2AR2B)), o un grupo fosforil isourea (P-N=C(NR1AR1B)OR3).

En algunas realizaciones, R3 es alquilo de C1-4, preferiblemente metilo.

En algunas realizaciones, R1A se selecciona independientemente de -H y -alquilo de C1-4 opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -alcoxi de C1-4, -NH2, -NH(alquilo de C1-4) y -N(alquilo de C1-4)2; preferiblemente de -H y -alquilo de C1-4, más preferiblemente de -H y metilo.

En algunas realizaciones, R1B se selecciona independientemente de -H y -alquilo de C1-4 opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -alcoxi de C1-4, -NH2, -NH(alquilo de C1-4) y -N(alquilo de C1-4)2; preferiblemente de -H y -alquilo de C1-4, más preferiblemente de -H y metilo.

En algunas realizaciones, R2A se selecciona independientemente de -H y -alquilo de C1-4 opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -alcoxi de C1-4, -NH2, -NH(alquilo de C1-4) y -N(alquilo de C1-4)2; preferiblemente de -H y -alquilo de C1-4, más preferiblemente de -H y metilo.

En algunas realizaciones, R2B se selecciona independientemente de -H y -alquilo de Ci -4 opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de -F, -Cl, -OH, -alcoxi de C1-4, -NH2, -NH(alquilo de C1-4) y -N(alquilo de C1-4)2; preferiblemente de -H y -alquilo de C1-4, más preferiblemente de -H y metilo.

En algunas realizaciones, cada R1A, R1B, R2A, y R2B se selecciona independientemente de -H y -alquilo de C1-4 opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de -F, -Cl, -Br, -I, -OH, -alcoxi de C1-4, -NH2, -NH(alquilo de C1-4), y -N(alquilo de C1-4)2; preferiblemente de -H y -alquilo de C1-4 opcionalmente sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados de -F, -Cl, -OH y -NH2, más preferiblemente de -H y -alquilo de C1-4, más preferiblemente de -H y metilo.

En algunas realizaciones, R2 es -NR2AR2B, preferiblemente -NMe2.

En algunas realizaciones, R1 es -NH2 o -NMe2.

En algunas realizaciones, R1A y R2A forman juntos una cadena de alquileno o heteroalquileno de 2-4 átomos de longitud, y R1B y R2B se seleccionan cada uno independientemente de -H y -alquilo de C1-4. En algunas realizaciones, R1A y R2A forman juntos -CH2-CH2-. En algunas realizaciones, R1A y R2A forman juntos -CH2-CH2-, y R1B y R2B son -H o metilo. En algunas realizaciones, R1A y R1B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros, preferiblemente una pirrolidina, piperidina, piperazina o morfolina. Adecuadamente, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5 miembros, preferiblemente una pirrolidina.

En algunas realizaciones, R2A y R2B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros, preferiblemente una pirrolidina, piperidina, piperazina o morfolina. Adecuadamente, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5 miembros, preferiblemente una pirrolidina.

Z es -O-. Se apreciará que -P+-O- es una estructura de resonancia de -P=O.

Ciertos compuestos preferidos son compuestos de las siguientes fórmulas:

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un oligonucleótido que tiene al menos un resto fosfato modificado de fórmula FVII:

R1 y R2 son como se definen anteriormente.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un oligonucleótido en el que un fosfato que une nucleósidos/análogos de nucleósidos adyacentes comprende una fosforil guanidina, fosforil amidina, fosforil isourea, fosforil isotiourea, fosforil imidato o fosforil imidotioato.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso, in vitro, del oligonucleótido propuesto como agente de diagnóstico.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el oligonucleótido propuesto para uso en un método de tratamiento médico.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso del oligonucleótido propuesto en la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para uso en el tratamiento de una enfermedad.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para sintetizar un compuesto de Fórmula (I), que comprende la conversión de un derivado de ácido fosforoso en un grupo fosfato modificado.

En un aspecto, el método comprende la reacción de un derivado de ácido fosforoso con un derivado de imino HN=CR1R2 o un derivado de imino N-sililado RSi3SiN=CR1R2 en presencia de un oxidante, y opcionalmente un agente sililante y/o una base (Procedimiento A), en el que cada RSi es un grupo alquilo o arilo. Por ejemplo, el derivado de ácido fosforoso puede ser un fosfito o H-fosfonato.

Ejemplos de derivados de imino para el Procedimiento A incluyen, sin limitación, 1,1,3,3-tetrametilguanidina (TMG), hidrocloruro de guanidina, sulfato de 1,1-dimetilguanidina, 1,3-difenilguanidina, hidrocloruro de formamidina, hidrocloruro de acetamidina, hidrocloruro de 1H-pirazol-1-carboxamidina, N-Boc-1H-pirazol-1-carboxamidina, hidrocloruro de formimidato de etilo, hidrocloruro de acetimidato de etilo, hidrogenosulfato de O-metilisourea, hidrogenosulfato de S-metilisotiourea, hidrocloruro de S-bencilisotiourea, y similares.

Se apreciará que un derivado de imino puede estar en forma de una base libre o una sal como se describe en el presente documento. Si el derivado de imino es una sal, se puede añadir una base para liberar una base libre del derivado de imino, y/o se puede emplear un agente sililante para producir un derivado N-sililado de un compuesto de imino.

El oxidante puede ser yodo I2, bromo Br2, cloro Cl2, cloruro de yodo ICl, N-bromosuccinimida, N-clorosuccinimida, N-yodosuccinimida, tetracloruro de carbono CCl4, bromotriclorometano CCl3Br, tetrabromometano CBr4, tetrayodometano CI4, yodoformo CHI3, hexacloroetano C2Cl6, hexacloroacetona (CCl3)2CO, o similares. Un oxidante preferido es el yodo I2.

En un aspecto adicional, el método comprende la reacción de un derivado de ácido fosforoso con una azida orgánica, opcionalmente en presencia de un agente sililante y/o una base (Procedimiento B).

Por ejemplo, la azida orgánica se puede seleccionar de una sal de bis(amino disustituido)-1 -azidocarbenio, una sal de 1-(amino disustituido)-1-azidocarbamidinio, un 1-(amino disustituido)-1-azido-eteno, una 1-azido-carbamidina N-sustituida, y similares.

En las reacciones del Procedimiento A y el Procedimiento B, la reacción se puede llevar a cabo en presencia de un agente sililante, por ejemplo N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA), N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), clorotrimetilsilano, bromotrimetilsilano, yodotrimetilsilano, cloruro de trietilsililo, cloruro de trifenilsililo, hexametildisilazano, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (TMSOTf), cloruro de dimetilisopropilsililo, cloruro de dietilisopropilsililo, cloruro de terc-butildimetilsililo, cloruro de terc-butildifenilsililo, cloruro de triisopropilsililo, dimetildiclorosilano, difenildiclorosilano, y similares. Por ejemplo, la reacción se puede llevar a cabo en presencia de un agente sililante seleccionado de N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA), N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), y clorotrimetilsilano.

En las reacciones del Procedimiento A y el Procedimiento B, la reacción se puede llevar a cabo en presencia de una base, por ejemplo trietilamina, N,N-diisopropiletilamina (DIEA), N-metilmorfolina, N-etilmorfolina, tributilamina, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO), N-metilimidazol (NMI), piridina, 2,6-lutidina, 2,4,6-colidina, 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno (“esponja de protones”), 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (Db N), 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno (TBD), 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]-dec-5-eno (MTBD), 1,1,3,3-tetrametilguanidina (TMG), 2-terc-butil-1,1,3,3-tetrametilguanidina, 2,8,9-trimetil-2,5,8,9-tetraaza-1-fosfabiciclo[3.3.3]-undecano, base de fosfaceno, o similares.

Los ejemplos de disolventes para el Procedimiento A incluyen, sin limitación, piridina, 2-picolina, 3-picolina, 4-picolina, quinolina, tetrahidrofurano (THF), 1,4-dioxano, 1,2-dimetoxietano (DME), dietilenglicol dimetil éter (diglima), éter dietílico, acetonitrilo, y similares.

Ejemplos de disolventes para el Procedimiento B incluyen, sin limitación, acetonitrilo, N,N-dimetilformamida (DMF), N,N-dimetilacetamida (DMA), N-metilpirrolidona (NMP), tetrametilurea, 1,3-dimetilimidazolidin-2-ona, sulfolano, hexametilfosfortriamida (HMPT), 1,4-dioxano, tetrahidrofurano (THF), acetona, acetato de etilo, y similares:

A continuación se proporcionan más detalles de estos Procedimientos.

Como se describe en el presente documento, una ventaja particular de los restos fosfato modificados de la presente invención es la incorporación conveniente de estos restos como lo demuestran los presentes inventores. Por ejemplo, un resto fosfato modificado de Fórmula VI puede incorporarse fácilmente en un oligonucleótido durante la síntesis secuencial de oligonucleótidos basada en la química de H-fosfonato o fosforamidito. A continuación se proporcionan más detalles.

Uno o más de los aspectos de la presente invención pueden combinarse con uno o más de los otros aspectos de la presente invención. De manera similar, cualquiera o más de las características y características opcionales de cualquiera de los aspectos pueden aplicarse a uno cualquiera de los otros aspectos. De este modo, la discusión en este documento de características opcionales y preferidas puede aplicarse a algunos o todos los aspectos. En particular, las características opcionales y preferidas relacionadas con los compuestos, motivos e intermedios, métodos para preparar los compuestos y métodos para usar los compuestos, etc., se aplican a todos los demás aspectos. Por ejemplo, las preferencias de sustituyentes para los compuestos también se aplican a los azidas/derivados de imino y viceversa. Además, las características opcionales y preferidas asociadas con un método o uso también pueden aplicarse a un producto y viceversa.

FIGURAS

La invención se describe con más detalle, sin limitación, con referencia a las siguientes:

FIGURA 1. RP-HPLC de oligonucleótidos 5’-d(GCGCCAAACpA) (línea negra delgada), 5’-d(GCGCCAAApCpA) (línea gris) y 5’-d(GCGCCAApApCpA) (línea negra en negrita) modificados con grupos N,N,N’,N’-tetrametil-N”-fosforilguanidina; p, aquí y más abajo, marca la posición de un grupo modificador.

FIGURA 2. RP-HPLC del oligonucleótido 5’-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpT) modificado con el grupo N-fosforilguanidina.

FIGURA 3. RP-HPLC de oligodesoxirribonucleótidos con un nucleótido LNA 5’-d(TTTT)tdT (línea negra delgada), 5’-d(TTTT)tpdT (línea gris) y 5’-tpd(TTTTT) (línea discontinua) modificado con grupos N,N,N’,N’-tetrametil-N”-fosforilguanidina; t marca la posición de un nucleótido de LNA.

FIGURA 4. RP-HPLC de oligo-2’-O-metilrribonucleótidos 5’-UUUUUp*U modificado con un grupo N,N’-bis(tetrametilen)-N”-fosforilguanidina (línea negra en negrita), -UUUUUpU modificado con un grupo N,N’-dimetil-N”-fosforilimino-2-imidazolidina (línea gris), y un oligo-2’-O-metilrribonucleótido no modificado 5’-UUUUUU (línea negra delgada).

FIGURA 5. RP-UPLC de un oligonucleótido 5’-d(TpTTTTT) modificado con un grupo N-cianoiminofosfato.

FIGURA 6. RP-HPLC de oligonucleótidos 5’-d(TTTTTT)p (línea negra en negrita), 5’-DMTr-Flu pd(TTTTTT) (línea negra delgada) y un nucleótido 5’-DMTr-Flu pdT (línea gris) modificado con un grupo N,N’-bis(tetrametilen)-N”-guanidinofosfato.

FIGURA 7. RP-HPLC de oligonucleótidos 5’-d(TTTTTpT), 5’-d(TTTTpTpT), 5’-d(TTTpTpTpT), 5’-d(TTpTpTpTpT) y 5’-d(TpTpTpTpTpT) modificados con grupos N,N’-dimetil-N”-fosforilimino-2-imidazolidina; p marca la posición de un grupo modificador.

FIGURA 8. RP-HPLC de un oligonucleótido 5’-d(GpCpGpCpCpApApApCpA) completamente modificado con grupos N,N’-dimetil-N”-fosforilimino-2-imidazolidina en todas las posiciones internucleosídicas.

Abreviaturas y notación

p - indica la posición de un grupo fosfato modificado como se describe

t - indica la posición de un nucleótido LNA-T

a - indica la posición de un nucleótido LNA-A

c - indica la posición de un nucleótido LNA-5-Me-C

g - indica la posición de un nucleótido LNA-G

F - fosfato de 2-hidroximetil-3-hidroxitetrahidrofurano (sitio apurínico/apirimidínico)

BHQ - BlackHole Quencher™

DD - fosfato de 1,12-dodecanodiol

Flu - marcador de 5(6)-carboxifluoresceína

N^s- indica el resto de fosforotioato del nucleótido “N”

BSA - N,O-bis(trimetilsilil)acetamida

BSTFA - N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida

DIEA - N,N-diisopropiletilamina

NMI - N-metilimidazol

DMAP - 4-dimetilaminopiridina

DBU - 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno

TMG - 1,1,3,3-tetrametilguanidina

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Las fosforil guanidinas están representadas en la naturaleza por compuestos tales como fosfato de creatina y fosfoarginina. Las fosforil guanidinas sintéticas de bajo peso molecular se conocen desde al menos la década de 1960 [52]. Las fosforil guanidinas de molécula pequeña han encontrado un uso limitado como plaguicidas [53], retardadores de llama [54] y sustancias terapéuticas [55]. Los diésteres de fosforilguanidina forman complejos con iones metálicos a través del nitrógeno de guanidina [56]. El análisis de rayos X de O,O’-diisopropil fosforil guanidina ha confirmado la presencia de solamente el tautómero con el grupo fosforilimino >P(=O)-N=C< en la estructura cristalina.

Sin embargo, hasta ahora no se han descrito derivados de nucleósidos u oligonucleótidos, y sus propiedades siguen siendo desconocidas. Los presentes inventores han preparado las primeras oligonucleósido fosforil guanidinas mediante oxidación con yodo de ditimidina p-cianoetil fosfito en presencia de N,N,N’,N’-tetrametilguanidina (TMG) en piridina usando una metodología similar a la descrita anteriormente en relación con las aminas primarias [57].

Los presentes inventores han estudiado la oxidación de 3’,5’-ditimidina p-cianoetil fosfito unido a CPG, que es un intermedio común en la síntesis de ADN en fase sólida según el método de p-cianoetil fosforamidito [58]. Como se describe en el presente documento, la oxidación del fosfito anterior mediante una disolución 0,1 M de yodo en piridina seca en presencia de TMG 1 M y 20% de N,O-bis(trimetilsilil)acetamida produjo 3’,5’-ditimidina-N,N,N’,N’-tetrametil fosforil guanidina como producto principal. El oligonucleótido 5’-d(TTTTTpT), en el que p indica la posición del grupo fosfato modificado, se aisló después de un tratamiento con amoniaco acuoso concentrado durante 1 h a temperatura ambiente como una mezcla de dos diastereómeros (Ejemplo 1.1). El único subproducto que se aisló fue dT6, que es el resultado probable de la hidrólisis simultánea de un intermedio reactivo de yodofosfonio por trazas de humedad. Los inventores han concluido que el grupo fosforil guanidina es estable durante la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida y la desprotección del amoniaco a pH 11.

La integridad de la oligotimidina monofosforil guanidina fue confirmada por MALDI-TOF MS. Su movilidad durante la electroforesis en gel en gel de poliacrilamida al 20% fue menor que para dT6, lo que sugiere un carácter de carga neutra del grupo tetrametil fosforil guanidina a pH 7,4, que corresponde a los datos de la bibliografía para fosforil guanidinas de bajo peso molecular [59].

A través de la síntesis de oligotimidilatos de 20-meros con un grupo tetrametil fosforil guanidina, los inventores han observado que los rendimientos empeoran progresivamente con el aumento del soporte en una fila 5'-d(T1sTpT) > 5'-d(T1üTpTg) > 5'-d(TTpT18). Los oligotimidilatos obtenidos se utilizaron para determinar la influencia del grupo tetrametil fosforil guanidina individual sobre la estabilidad térmica del dúplex complementario con el oligonucleótido 5'-d(C2A20C2) en comparación con dT20 sin modificar.

Los inventores también han obtenido con éxito oligonucleótidos con grupo fosforil guanidina no sustituido. La oxidación de 3’,5’-ditimidina p-cianoetil fosfito unido a CPG mediante una disolución de yodo 0,1 M en piridina en presencia de hidrocloruro de guanidina 0,5 M, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) 0,5 M y BSA al 20%, seguida de la síntesis oligonucleotídica, produjo un hexatimidilato con grupo fosforil guanidina como producto principal junto con el producto de la hidrólisis dT6 (Ejemplo 5).

De manera análoga, la oxidación con yodo del fosfito de ditimidina en presencia de hidrocloruro de formamidina, DBU y BSA en piridina, seguida de la síntesis oligonucleotídica, dio como resultado la formación de hexatimidina fosforil formamidina, que es un representante de otra clase de compuestos de fosforilimino: fosforil amidinas (Ejemplo 39).

La oxidación de 3’,5’-ditimidina p-cianoetil fosfito unido a CPG mediante una disolución de yodo 0,1 M en piridina en presencia de hidrogenosulfato de O-metilisourea 0,5 M, DBU 1 M y BSA al 20%, seguida de la síntesis oligonucleotídica y desprotección por amoniaco acuoso concentrado durante 1 h a temperatura ambiente, ha dado lugar a una mezcla de productos que contienen dT6, oligonucleósido O-metil fosforil ¡sourea y fosforil guanidina según MALDI-TOF MS (Ejemplo 7). Es probable que este último se forme mediante la sustitución del grupo metoxi de la fosforil isourea por amoniaco. El tratamiento adicional con amoniaco a 55°C durante 16 h dio como resultado el aumento de la cantidad de fosforil guanidina y la disminución de la cantidad de O-metil fosforil isourea. Asimismo, el tratamiento de la mezcla con etilendiamina en etanol (1:1 v/v) a 55°C durante 16 h dio como resultado la desaparición de O-metil fosforil isourea, y proporcionó N-p-aminoetil fosforil guanidina como el producto principal (Ejemplo 8). Esto abre el camino para sustituir fosfatos cargados negativamente por grupos cargados positivamente en secuencias de oligonucleótidos, ya que el grupo N-p-aminoetil fosforil guanidina debería estar cargado positivamente a pH fisiológico. Las fosforil guanidinas de oligonucleósido catiónicas pueden exhibir potencialmente una mejor absorción celular y la administración in vivo en ausencia de agentes de transfección externos.

Como se describe en el presente documento, los presentes inventores han obtenido oligotimidilatos de 20-meros con un solo grupo fosforil guanidina no sustituido (Fig. 2). Los rendimientos disminuyeron con la longitud del oligonucleótido en una fila d(T¹⁸TpT) > d(T¹⁰TpTg) > d(TTpT¹⁸). También se prepararon oligonucleótidos con dos y tres grupos fosforil guanidina; sin embargo, las reacciones dieron como resultado mezclas de productos que eran difíciles de separar, lo que llevó a los inventores a concluir que la química de oxidación con yodo es más eficaz para la preparación de oligonucleótidos monosustituidos.

La química del H-fosfonato puede usarse para preparar oligonucleótidos con dos y tres modificaciones [63], como se describe en el presente documento. El 3’,5’-ditimidina-H-fosfonato soportado por CPG se puede oxidar en N,N,N’,N’-tetrametil fosforil guanidina ya sea con yodo 0,1 M y 20% en vol. de TMG en piridina con o sin BSA (Ejemplos 1.2 y 1.3) o con CCl4 o CChBr y 20% en vol. de TMG en piridina (Ejemplos 1.4 y 1.5) [64]. La conversión en el caso del yodo (70-75%) fue mayor que en el caso de CCU o CChBr (10-20%). En presencia de BSA, la conversión aumentó a 80-85%. Después de la síntesis en fase sólida mediante el método del fosforamidito, se obtuvo un hexatimidilato 5’-d(TTTTTpT) con grupo tetrametil fosforil guanidina con buen rendimiento, junto con los subproductos dTs y dT6 (Ejemplo 1.3). Los inventores han obtenido con éxito fosforil guanidinas di- y trisustituidas 5’-d(TTTTpTpT) (Ejemplo 3.1) y 5’-d(TTTpTpTpT) (Ejemplo 4.1) mediante oxidación con yodo/TMG/BSA, pero en el último caso el rendimiento fue más bajo.

Para aumentar el rendimiento de oligonucleósido fosforil guanidinas, los inventores exploraron una nueva reacción entre el dinucleósido p-cianoetil fosfito unido a CPG y las sales de tetraalquil azidocarbenio en N,N-dimetilformamida o acetonitrilo con o sin BSA. La reacción puede ocurrir a temperatura ambiente o a 40-45°C. La adición de trietilamina al 5%, así como BSA, aumenta el rendimiento. El método demostró ser eficaz para la preparación de oligonucleótidos con múltiples grupos tetraalquil fosforil guanidino (Fig. 1). Se usó una versión automatizada del método en un sintetizador de ADN para producir oligonucleósido fosforil guanidinas completamente modificadas (Ejemplo 47).

Junto con fosforil guanidinas de carga neutra o catiónicas, los inventores también han preparado oligonucleótidos que contienen un grupo N-cianoimino fosfato ionizable. En ese caso, se hizo reaccionar un fosfito de dinucleósido unido a CPG con una disolución 0,25 M de azida de cianógeno en acetonitrilo a temperatura ambiente. Los resultados sugieren que el rendimiento del oligonucleótido depende del método de desprotección usado. Se obtuvieron buenos resultados cuando una mezcla de etilendiamina y etanol (1:1 v/v) [65] se sustituyó por amoniaco acuoso y se usó para desproteger el oligonucleótido con el grupo N-cianoimino fosfato durante 1 h a 70°C (Ejemplos 40 y 41).

La movilidad electroforética de los N-cianoimino hexatimidilatos obtenidos 5’-d(TTTTTpT) y 5’-d(TpTTTTT) fue muy similar a dT6, lo que sugiere que el grupo N-cianoimino tiene carga negativa a pH fisiológico. Los oligonucleótidos eran solo ligeramente más hidrófobos que el hexatimidilato sin modificar. Se observaron dos diastereómeros en la traza de RP-HPLC (Fig. 5).

Se encontró que una variedad de oligonucleótidos modificados era compatible con modificaciones de fosforil guanidina, en particular derivados de ribonucleótidos tales como oligo-2’-O-metilrribonucleótidos (Fig. 4), LNA (Fig. 3) y el propio ARN (Ejemplo 46). Los grupos fosforotioato se pueden incorporar con éxito en oligonucleótidos junto con grupos fosforil guanidina (Ejemplos 32-35). Se toleró una variedad de otras modificaciones, tales como fluoresceína, sitio abásico, inserto no nucleosídico, o inactivador BlackHole. También se prepararon mononucleótidos con grupos 3’- o 5’-fosforil guanidina (Ejemplos 42 y 44, Fig. 6).

Definiciones

El término “nucleótido” se refiere a un compuesto que contiene un nucleósido o un nucleósido modificado y al menos un grupo fosfato o un grupo fosfato modificado unido a él por un enlace covalente. Los enlaces covalentes ejemplares incluyen, sin limitación, un enlace de éster entre el grupo hidroxilo 3’, 2’ o 5’ de un nucleósido y un grupo fosfato.

El término “oligonucleótido” se refiere a un compuesto que contiene dos o más nucleótidos unidos en una cadena polimérica. Los oligonucleótidos pueden ser ácidos desoxirribonucleicos o ácidos ribonucleicos. Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En el caso de oligonucleótidos bicatenarios, una o ambas hebras pueden contener un fosfato modificado según la presente invención.

Un oligonucleótido puede ser un polímero de dos o más nucleótidos, pero puede tener cualquier longitud. Por ejemplo, un oligonucleótido puede tener una longitud mínima de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. Opcionalmente, puede tener

una longitud máxima de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34,

35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 5 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,9 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300,

310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, o 500 nucleótidos,

aunque también se proporcionan oligonucleótidos más largos en algunas realizaciones. Exclusivamente, a modo de

ejemplo, se proporciona un oligonucleótido que tiene uno de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 nucleótidos.

En los oligonucleótidos de la presente invención, uno, varios (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) o cada

nucleótido puede contener un fosfato modificado según la presente invención.

Los nucleótidos y oligonucleótidos de la presente invención pueden incluir modificaciones químicas como se describe

en este documento, tales como una sustitución química en una posición de azúcar, una posición de fosfato, y/o una

posición de base del ácido nucleico que incluye, por ejemplo, la incorporación de un nucleótido modificado,

incorporación de un resto de protección (por ejemplo, protección 3’), conjugación con un compuesto no inmunogénico

de alto peso molecular (por ejemplo, polietilenglicol (PEG)), conjugación con un compuesto de bajo peso molecular

(por ejemplo, colesterol), conjugación con un péptido (por ejemplo, un péptido que penetra en las células),

sustituciones en el grupo fosfato (por ejemplo, fosforotioato). Las modificaciones de bases pueden incluir

modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina,

sustitución de 5-bromo- o 5-yodo-uracilo, modificaciones de la cadena principal. Las modificaciones del azúcar pueden

incluir 2’-amino nucleótidos (2’-NH2), 2 ’-fluoro nucleótidos (2’-F), 2’-O-metil (2’-OMe) nucleótidos, 2 ’-O-alil nucleótidos,

2’-O-p-metoxietil nucleótidos, nucleótidos “bloqueados” (por ejemplo, LNA), o triciclo-ADN nucleótidos. Los enlaces

entre el átomo de fósforo central de un fosfato y el o cada nucleósido se realizan adecuadamente a través del oxígeno,

es decir, el extremo 3’ y o 5’ del nucleósido es un alcohol. Sin embargo, también se prevén análogos de nucleósidos

en los que el extremo 3’ y/o 5’ del nucleósido no es un alcohol, sino más bien un análogo adecuado. Por ejemplo, el

extremo 3’ y/o 5’ de un nucleósido puede ser un tiol, un selenol, o una amina.

Los nucleótidos y oligonucleótidos según la presente invención pueden proporcionarse en forma aislada o purificada.

El término “nucleósido” se refiere a un compuesto que contiene una parte de azúcar y una nucleobase. Los azúcares

ejemplares incluyen, sin limitación, ribosa, 2-desoxirribosa, arabinosa, y similares. Ejemplos de nucleobases incluyen,

sin limitación, timina, uracilo, citosina, adenina, guanina, purina, hipoxantina, xantina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina, 4-fluorouracilo, 5-clorouracilo, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo, 5-trifluorometiluracilo, 5-fluorocitosina, 5-clorocitosina, 5-bromocitosina, 5-yodocitosina, 5-propiniluracilo, 5-propinilcitosina, 7-desazaadenina,

7-desazaguanina, 7-desaza-8-azaadenina, 7-desaza-8-azaguanina, isocitosina, isoguanina, y similares.

La expresión “análogos de nucleósidos”, como se usa en este documento, se refiere a un nucleósido modificado en el

que la parte de azúcar se reemplaza con cualquier otra estructura cíclica o acíclica. Ejemplos de análogos de

nucleósidos en los que la parte de azúcar se reemplaza con otra estructura cíclica incluyen, sin limitación, unidades

monoméricas de morfolinos (PMO) y triciclo-ADN. Los ejemplos de análogos de nucleósidos en los que la parte de

azúcar se reemplaza con una estructura acíclica incluyen, sin limitación, unidades monoméricas de ácidos nucleicos

peptídicos (PNA) y ácidos nucleicos de glicerol (GNA).

La expresión “análogo de nucleósido” se refiere además a un nucleósido cuya parte está reemplazada por un grupo

químico de cualquier naturaleza. Ejemplos de tales análogos de nucleósidos incluyen, sin limitación, nucleósidos

sustituidos en 2’ tales como 2’-fluoro, 2-desoxi, 2’-O-metilo, 2’-O-p-metoxietilo, 2’-O-alilriborribonucleósidos, 2’-amino,

monómeros de ácido nucleico bloqueado (LNA), y similares.

De manera adecuada, los análogos de nucleósidos pueden incluir análogos de nucleósidos en los que la parte de

azúcar se reemplaza por un anillo de morfolina como se muestra a continuación.

En estructuras de este tipo, se apreciará que las etiquetas 3’ y 5’, aplicadas a la química convencional del azúcar, se

aplican por analogía. Es decir, en la estructura representada, el sustituyente hidroxilmetilo en el anillo se considera el

extremo 5’, mientras que la tercera valencia de nitrógeno se considera el extremo 3’.

La expresión “análogo de oligonucleótido”, como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido modificado, que se modifica químicamente en sus grupos fosfato, o tiene sus nucleósidos reemplazados por análogos de nucleósidos. Los análogos de oligonucleótidos ejemplares incluyen, sin limitación, oligonucleótidos de fosforotioato (PS), fosforodiamidato morfolino oligonucleótidos (morfolinos, PMO), triciclo-ADN, y ácidos nucleicos peptídicos (PNA). La expresión “ácido nucleico peptídico” se refiere normalmente a análogos de oligonucleótidos que sustituyen el grupo fosfato por el enlace peptídico. Sin embargo, como se usa en este documento, incluye compuestos que pueden incorporar grupos fosfato modificados de acuerdo con la presente invención. Se entiende que esos compuestos también estarían cubiertos por la presente solicitud.

La expresión “grupo fosfato”, como se usa en este documento, se refiere a ácido fosfórico H3PO4 en el que cualquier átomo de hidrógeno se reemplaza por uno, dos o tres radicales orgánicos para dar un fosfoéster, fosfodiéster o fosfotriéster, respectivamente.

La expresión “grupo fosfato modificado” se refiere a un grupo fosfato en el que cualquier oxígeno conectado al átomo de fósforo se reemplaza por un grupo químico de cualquier naturaleza. Los reemplazos adecuados pueden incluir azufre, selenio, imino (NR) y borano (-BH3"). Por ejemplo, el grupo puede ser un grupo fosforotioato, un grupo fosforoselenoato o boranofosfato. Preferiblemente, el “grupo fosfato modificado” es un grupo fosforotioato.

Se apreciará que, dependiendo de su sustitución, los fosfatos y fosfatos modificados descritos en el presente documento pueden ser quirales. Cuando no se indica la estereoquímica, la estructura abarca tanto configuraciones Rp como Sp, cada una aislada y como mezclas de las mismas (por ejemplo, una mezcla racémica). Por ejemplo, y no a modo de limitación, la estructura:

0 = P 1 —Y

N

Me2N -C -N M e 2

como se muestra, abarca

Se apreciará que los compuestos descritos en el presente documento pueden contener más de un centro quiral. Excepto cuando se indique lo contrario, se pretende que estén incluidos todos los enantiómeros y diastereómeros. La expresión “oligonucleótido protegido”, como se usa en este documento, se refiere a un oligonucleótido, que incorpora uno o más grupos protectores.

La expresión “oligonucleótido desprotegido”, como se usa en este documento, se refiere a un oligonucleótido del que se han eliminado uno o más grupos protectores.

Se entenderá que las referencias a nucleósidos, nucleótidos y oligonucleótidos incluyen formas protegidas de los mismos.

La expresión “grupo protector” se refiere a un grupo químico que se usa para bloquear temporalmente un sitio reactivo en un compuesto. Un grupo protector se elimina en condiciones específicas. Los ejemplos de grupos protectores incluyen, sin limitación, acetilo (Ac), benzoílo (Bz), isobutirilo (Ibu), terc-butilfenoxiacetilo (Tac), levulinilo (Lev), metilo (Me), 2-cianoetilo (CE), alilo (All), 2-clorofenilo (o-ClPh), 4,4’-dimetoxitritilo (DMTr), 4-metoxitritilo (MMTr), terc-butildimetilsililo (TBDMS), triisopropilsililoximetilo (TOM), y similares.

El término “enlazador”, como se usa en este documento, abarca un grupo químico que conecta un compuesto a un soporte sólido y se puede escindir en condiciones específicas liberando dicho compuesto de dicho soporte sólido. Los conectores ejemplares usados en la síntesis oligonucleotídica en fase sólida incluyen, sin limitación, succinilo, diglicolilo, oxalilo, hidroquinona-O, O’-diacetilo (conector Q), ftaloílo, 4,5-dicloroftaloílo, malonilo, glutarilo, diisopropilsililo, 1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano-1,3-diilo, y similares.

Otros enlazadores pueden incluir grupos químicos no nucleotídicos insertados en un oligonucleótido u oligonucleótido modificado (“enlazadores internucleosídicos/ internucleotídicos”), o grupos químicos no nucleotídicos que forman un enlace entre un nucleótido y otro resto químico, por ejemplo un marcador o inactivador. Los enlazadores adecuados son conocidos en la técnica, e incluyen 1,12-dodecanodiol fosfato (DD).

La expresión “soporte sólido” se refiere a un soporte polimérico usado en la síntesis oligonucleotídica en fase sólida. Los soportes sólidos ejemplares incluyen, sin limitación, vidrio de poro controlado (CPG), resina de poliestireno, resina TentaGel®, resina TSK Gel® Toyopearl®, resina de poli(alcohol vinílico), y similares. La expresión “soporte sólido”, como se usa en este documento, también se refiere a tipos de soportes sólidos no de resina usados, por ejemplo, en síntesis oligonucleotídica múltiple, que incluyen, sin limitación, discos de filtro, sistemas de múltiples alfileres, placas de múltiples pocillos, y similares.

La expresión “radical orgánico”, como se usa en este documento, se refiere a un grupo químico, que contiene uno o más átomos de carbono conectados a cualquier otro átomo, con una valencia libre en el carbono. Los ejemplos de otros átomos incluyen, sin limitación, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, flúor, silicio, fósforo, azufre, cloro, bromo y yodo.

El término alquilo, como se usa en este documento, se refiere a formas cíclicas y acíclicas de cadena tanto lineal como ramificada. El término “alquilo” incluye grupos hidrocarbilo acíclicos saturados, lineales o ramificados, monovalentes. Los grupos alquilo de C1-4 incluyen, sin limitación, grupos metilo, etilo, n-propilo, i-propilo o t-butilo.

El término “alquenilo” incluye grupos hidrocarbilo acíclicos, insaturados, monovalentes, lineales o ramificados, que tienen al menos un doble enlace carbono-carbono y, en algunas realizaciones, ningún triple enlace carbono-carbono. En algunas realizaciones, el alquenilo es alquenilo de C2-10, en algunas realizaciones alquenilo de C2-6, en algunas realizaciones alquenilo de C2-4.

El término “alquinilo” incluye grupos hidrocarbilo acíclicos, insaturados, monovalentes, lineales o ramificados, que tienen al menos un triple enlace carbono-carbono y, en algunas realizaciones, ningún doble enlace carbono-carbono. En algunas realizaciones, alquinilo es alquinilo de C2-10, en algunas realizaciones alquinilo de C2-6, en algunas realizaciones alquinilo de C2-4.

La expresión “compuesto heterocíclico” se refiere a un compuesto que comprende un grupo heterocíclico. La expresión “grupo heterocíclico” se refiere a un grupo saturado, parcialmente insaturado o insaturado (por ejemplo, aromático) monocíclico o bicíclico que contiene uno o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4 o 5) heteroátomos anulares seleccionados de O, S(O)t (en el que t es 0, 1 o 2) o N, e incluye grupos no sustituidos y grupos sustituidos con uno o más sustituyentes (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituyentes), opcionalmente en el que el uno o más sustituyentes se toman juntos para formar un sistema anular adicional. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cuando un grupo heterocíclico está enlazado a otro grupo, el grupo heterocíclico puede estar enlazado mediante C o enlazado mediante N, es decir, puede estar enlazado al resto de la molécula a través de un átomo de carbono anular o mediante un átomo de nitrógeno anular (es decir, un átomo de nitrógeno endocíclico). La expresión grupo heterocíclico incluye así grupos heterocicloalquilo, heterocicloalquenilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos como se definen en el presente documento.

El término “arilo” incluye grupos hidrocarbilo cíclicos, aromáticos, monovalentes, tales como fenilo o naftilo (por ejemplo, 1 -naftilo o 2-naftilo). En general, los grupos arilo pueden ser grupos aromáticos anulares condensados monocíclicos o policíclicos.

El término “heteroarilo” incluye grupos arilo en los que uno o más átomos de carbono se reemplazan cada uno por heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y NRN, en el que RN se define aquí.

El término “halógeno” se refiere a -F, -Cl, -Br e -I. En algunas realizaciones, el halógeno es -F, -Cl o -Br. En algunas realizaciones, el halógeno es -F o- Cl, por ejemplo Cl.

En general, los grupos heteroarilo pueden ser grupos heteroaromáticos anulares condensados monocíclicos o policíclicos (por ejemplo, bicíclicos). Normalmente, los grupos heteroarilo contienen de 5 a 10 miembros en los que 1, 2, 3 o 4 miembros del anillo se seleccionan independientemente de O, S, N y NRN.

Como se usa en este documento, la expresión “opcionalmente sustituido” se refiere a un sustituyente que puede estar sustituido con uno o más (hasta el número máximo de valencias libres en ese sustituyente) sustituyentes. Los sustituyentes se pueden seleccionar de:

-alquilo de C1-4,

-F, -CI, -Br, -I

-CF3, -OCF3, -SCF3,

-OH, -L-OH, -O-L-OH, -NH-L-OH, -NR30-L-OH,

-Oalquilo de C1-4, -L-Oalquilo de C1-4, -O-L-Oalquilo de C1-4, -NH-L-Oalquilo de C1-4, -NR30-L-Oalquilo de C1-4,

-SH, -Salquilo de C1-4,

-CN,

-NH2, -NHalquilo de C1-4, -N(alquilo Ci -4)2,

-L-NH2, -L-NHalquilo de C1-4, -L-N(alquilo C i-4)2,

-OC(O)alquilo de C1-4,

-C(O)OH, -C(O)Oalquilo de C1-4,

-C(O)alquilo de C1-4,

-C(O)NH2, -C(O)NHalquilo de C1-4, -C(O)N(alquilo C1-4)2,

-NHC(O)alquilo de C1-4, -N(alquilo C1-4)C(O)alquilo de C1-4; y

=O;

en los que cada -L- es un enlace o un alquileno de C1-4 y R30 es -alquilo de C1-10, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10.

En algunas realizaciones, estos sustituyentes opcionales se seleccionan de -alquilo de C1-4, -F, -CI, -CF3, -OH, -Oalquilo de C1-4, -NH2, -NHalquilo de C1-4, y -N(alquilo C1-4)2.

La expresión “temperatura ambiente”, como se usa en este documento, se refiere a temperaturas en el intervalo de 15-29°C, preferiblemente en el intervalo de 20-25°C.

Reacciones

Como se describe en el presente documento, una ventaja particular de los restos fosfato modificados de la presente invención es la incorporación conveniente de estos restos como lo demuestran los presentes inventores. Por ejemplo, un resto fosfato modificado de Fórmula VI puede incorporarse fácilmente en un oligonucleótido durante la síntesis secuencial de oligonucleótidos basada en la química de H-fosfonato o fosforamidito. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para sintetizar los compuestos de la presente invención. Estos métodos pueden usar reactivos con soporte sólido, y pueden realizarse en un sintetizador de ADN.

Se apreciará que las fosforil isoureas, fosforil isotioureas, fosforil imidatos y fosforil imidotioatos son, entre otros, intermedios reactivos, que tras la reacción con aminas primarias o secundarias se pueden convertir en fosforil guanidinas o fosforil amidinas como se describe en el presente documento (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 7 y 8). Por consiguiente, la presente invención también proporciona un método para sintetizar un compuesto como se describe en este documento que tiene un grupo fosforil guanidina o fosforil amidina, comprendiendo el método hacer reaccionar un compuesto como se describe en este documento que tiene un grupo fosforil isourea, fosforil isotiourea, fosforil imidato o fosforil imidotioato con una amina primaria o secundaria.

Química del H-fosfonato

La química del H-fosfonato es un método conveniente y establecido de síntesis química de oligonucleótidos. De forma adecuada, un nucleótido protegido con 5’-DMT fijado mediante un enlazador a un soporte sólido experimenta una desprotección secuencial y después una reacción de acoplamiento con un monoéster de H-fosfonato para formar un diéster de H-fosfonato. Pueden añadirse más unidades de nucleósidos en secuencia, siguiendo las etapas de destritilación y después acoplamiento, con oxidación de los enlaces de diéster de H-fosfonato internucleosídico a enlaces de fosfodiéster que se producen al final del ensamblaje con un oxidante, típicamente yodo.

Los presentes inventores han demostrado, como se describe en el presente documento, que los grupos fosfato modificados de la invención se pueden incorporar fácilmente en oligonucleótidos ensamblados usando la química del H-fosfonato. Para incorporar un fosfato modificado, como se describe en el presente documento, la oxidación se puede realizar en presencia de una guanidina, amidina, isourea, isotiourea, imidato o imidotioato adecuados que pueden estar presentes como una base libre o en su forma de sal, por ejemplo como un hidrocloruro u otra sal, con un oxidante adecuado. Los oxidantes adecuados incluyen yodo I2, bromo Br2, cloro Cl2, cloruro de yodo ICl, N-bromosuccinimida, N-clorosuccinimida, N-yodosuccinimida, tetracloruro de carbono CCl4, bromotriclorometano CChBr, tetrabromometano CBr4, tetrayodometano CI4, yodoformo CHI3, hexacloroetano C2Cl6, y hexacloroacetona (CCh)2CO. Un oxidante preferido es el yodo.

Por supuesto, se apreciará que después de la oxidación para incorporar uno o más grupos fosfato modificados, se puede reanudar el ciclo de destritilación seguido de acoplamiento, realizándose más etapas de oxidación en puntos apropiados durante el ensamblaje de la cadena. De esta manera, se pueden incorporar grupos fosfato modificados según la invención en puntos apropiados durante el ensamblaje de la cadena.

Puede usarse una variedad de disolventes conocidos en la técnica, que incluyen piridina, 2-picolina, 3-picolina, 4-picolina, quinolina, tetrahidrofurano (THF), 1,4-dioxano, 1,2-dimetoxietano (DME), acetonitrilo. La piridina es un disolvente preferido.

Puede ser preferible incluir una base durante la etapa de oxidación. De forma adecuada, la base es una base de amina, por ejemplo trietilamina, N,N-diisopropiletilamina (DIEA), N-metilmorfolina, N-etilmorfolina, tributilamina, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO), N-metilimidazol (NMI), piridina, 2,6-lutidina, 2,4,6-colidina, 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno (“esponja de protones”), 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN), 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno (MTBD), 2-ferc-butil-1,1,3,3-tetrametilguanidina, 2,8,9-trimetil-2,5,8,9-tetraaza-1-fosfabiciclo[3.3.3]undecano, o base de fosfaceno. Por ejemplo, la base puede ser trietilamina o DBU.

Los presentes inventores han descubierto que puede ser deseable la adición de un reactivo sililante durante la etapa de oxidación que incorpora el motivo o motivos fosfato modificados. Por consiguiente, se puede añadir N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA), N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), clorotrimetilsilano, bromotrimetilsilano, yodotrimetilsilano, cloruro de trietilsililo, cloruro de trifenilsililo, hexametildisilazano, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (TMSOTf), cloruro de dimetilisopropilsililo, cloruro de dietilisopropilsililo, cloruro de terc-butildimetilsililo, cloruro de terc-butildifenilsililo, cloruro de triisopropilsililo, dimetildiclorosilano, difenildiclorosilano, o similares. Un reactivo sililante preferido es N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA).

Química del fosforamidito

La química del fosforamidito también es un método atractivo de síntesis química de oligonucleótidos. El ciclo asociado con la química de oligonucleótidos basada en la química del fosforamidito es conocido en la técnica. En resumen, se destritila un nucleótido soportado en un sólido, después se acopla con un nucleósido fosforamidito adecuadamente activado para formar un enlace triéster de fosfito. Entonces puede ocurrir una protección, seguido de oxidación del triéster de fosfito con un oxidante, típicamente yodo. Después se repite el ciclo para ensamblar la cadena.

Los presentes inventores han descubierto, como se describe en el presente documento, que la realización de dicha etapa de oxidación en presencia de una guanidina, amidina, isourea o isotiourea adecuada, que puede estar presente en su forma de sal, por ejemplo como una sal de hidrocloruro, se puede utilizar para producir el grupo o grupos fosfato modificados deseados. La eliminación del grupo protector de p-cianoetil fosfito completa la síntesis. Como se describió anteriormente para la etapa de oxidación en el método de H-fosfonato, puede ser deseable la inclusión de bases y/o agentes sililantes.

Uso de azidas orgánicas

También se describe en el presente documento una nueva reacción para obtener grupos fosfato modificados de la invención mediante la reacción de un dinucleósido p-cianoetilfosfito y una azida orgánica adecuada, opcionalmente en presencia de un agente sililante tal como BSA. Puede incluirse una base, por ejemplo una base de amina, por ejemplo trietilamina.

Los presentes inventores han demostrado que este método es eficaz para la preparación de oligonucleótidos con varios patrones de sustitución de fosforil guanidina, tales como los que tienen grupos fosforil guanidina no sustituidos, mono-, di-, tri- y tetrasustituidos, y para oligonucleótidos que tienen múltiples grupos fosfatos modificados de este tipo. De forma adecuada, la azida orgánica puede ser una azida de fórmula R1-C+(N3)-R2, tal como una sal de bis(amino disustituido)-1-azidocarbenio, una sal de 1-(amino disustituido)-1-azidocarbamidinio, y similares, o un 1-(amino disustituido)-1-azido-eteno, una N-sustituido-1-azidocarbamidina; o una azida de fórmula (N3)2C=NR2, (N3)2C=N+R1AR1B, o azida de cianógeno N3-CN. La azida orgánica se puede preparar usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las tetraalquil ureas se pueden convertir en sales de azidobis(dialquilamino)carbenio [60], las dialquil amidas se pueden convertir en sales de N,N-dialquil-azidocarbamidinio [61], mientras que las trialquil ureas o monoalquil amidas pueden producir azidas neutras [62].

De forma adecuada, la azida orgánica se puede seleccionar de:

en las que R1, R2, R1A, R1B, R2A, y R2B son como se definen aquí. En algunas realizaciones, R2 adicionalmente puede ser -N3.

Por ejemplo, la azida se puede seleccionar de:

en la que cada R1A, R1B, R2A, R2B es independientemente -H o alquilo de C1-10 opcionalmente sustituido, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10; y/o

opcionalmente en la que R1A y R2A juntos forman una cadena de alquileno o heteroalquileno de 2-4 átomos de longitud; opcionalmente en la que R1A y R2A forman juntos -CH2-CH2-, y R1B y R2B se seleccionan cada uno independientemente de -H y metilo;

opcionalmente en el que R1A y R1B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros; o opcionalmente en la que R2A y R2B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros, opcionalmente una pirrolidina;

o

en la que cada R1A y R1B es independientemente -H o alquilo de C1-10 opcionalmente sustituido, -alquenilo de C2-10, -alquinilo de C2-10, -arilo de C6-10, o -heteroarilo de C5-10; o R1A y R1B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros, y R2 se selecciona de -H, -F, -OPG, Cl, -Br, -I, -CN, -N3, -O-alquilo de C1-10, -SPG y -S-alquilo de C1-10, en los que PG es un grupo protector.

En algunas reacciones preferidas, la azida orgánica es:

con un contraión adecuado, por ejemplo cloruro.

Los contraiones adecuados incluyen, sin limitación, cloruro Cl-, bromuro Br, yoduro I-, triflato (trifluorometanosulfonato) CF3SO3-, p-toluenosulfonato C7H7SO3-, diclorofosfato PO2Cl2-, perclorato ClO4-, tetrafluoroborato BF4-, tetrafenilborato BPh4-, hexafluorofosfato PF6-, y similares.

En algunas realizaciones, cada uno de R1A, R1B, R2A, y R2B es independientemente -H o alquilo de C1-10 opcionalmente sustituido, por ejemplo, H o alquilo de C1-4 opcionalmente sustituido, por ejemplo -H o metilo. En algunas realizaciones, cada uno de R1A, R1B, R2A, y R2B es metilo; es decir, el fosfato resultante se modifica con una tetrametil guanidina. En algunas realizaciones, R1A y R2A forman juntos una cadena de alquileno o heteroalquileno de 2-4 átomos de longitud, y R1B y R2B se seleccionan cada uno independientemente de -H y -alquilo de C1-4. En algunas realizaciones, R1A y R2 ^ forman juntos -CH2-CH2-. En algunas realizaciones, R1A y R2A forman juntos -CH2-CH2-, y R1B y R2B son -H o metilo. En algunas realizaciones, R1A y R1B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros, preferiblemente una pirrolidina, piperidina, piperazina o morfolina. Por ejemplo, pueden, junto con el átomo al que están unidos, formar un heterociclo de 5 miembros, preferiblemente una pirrolidina.

En algunas realizaciones, R2A y R2B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros, preferiblemente una pirrolidina, piperidina, piperazina o morfolina. Por ejemplo, pueden, junto con el átomo al que están unidos, formar un heterociclo de 5 miembros, preferiblemente una pirrolidina.

Procedimiento A y Procedimiento B

Los compuestos descritos en este documento se pueden sintetizar usando el Procedimiento A o el Procedimiento B, como se describe en el presente documento. Estos Procedimientos pueden usarse en la síntesis automatizada de oligonucleótidos como se describe en el presente documento y se ilustra en los ejemplos adjuntos.

El Procedimiento A comprende:

(i) sumergir un soporte sólido al que se une un oligonucleótido protegido o un oligonucleótido modificado protegido que contiene dicho derivado de ácido fosforoso, en una mezcla que contiene dicho oxidante, un derivado de imino, y, opcionalmente, un reactivo sililante, una base y un disolvente;

(ii) mantener el soporte sólido sumergido mientras se mantiene la temperatura dentro del intervalo requerido durante un período de tiempo suficiente para asegurar la conversión de dicho derivado de ácido fosforoso en un grupo fosfato modificado, produciendo así un oligonucleótido modificado de Fórmula (I) con un grupo fosfato modificado;

(iii) continuar la síntesis oligonucleotídica en fase sólida de acuerdo con el protocolo deseado hasta la siguiente posición deseada de modificación, repitiendo después las etapas (i) y (ii), o hasta el final de la secuencia de oligonucleótidos;

(iv) realizar la desprotección deseada y/o la escisión del soporte sólido, produciendo así un oligonucleótido modificado desprotegido de Fórmula (I) con uno o más grupos fosfato modificados.

El Procedimiento B comprende:

(i) sumergir un soporte sólido al que se une un oligonucleótido protegido o un oligonucleótido modificado protegido que contiene dicho derivado de ácido fosforoso, en una mezcla que contiene dicha azida orgánica, un disolvente, y, opcionalmente, un reactivo sililante y una base;

(ii) repetir las etapas (ii) a (iv) del Procedimiento A;

El oligonucleótido modificado se recupera al final del método.

Los métodos se pueden llevar a cabo a una temperatura de -20-1502C, preferiblemente a 0-100°C, y más preferiblemente a 15-80°C.

Preferiblemente, el Procedimiento A se realiza a temperatura ambiente.

La concentración de un derivado de imino en el Procedimiento A es adecuadamente 0,005-3 M, más preferiblemente 0,1-1,5 M.

La concentración de azida en el Procedimiento B es adecuadamente 0,005-3 M, y preferiblemente 0,1-1,5 M.

Opcionalmente, se puede añadir un reactivo sililante. Los agentes sililantes adecuados incluyen N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA), N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), clorotrimetilsilano, bromotrimetilsilano, yodotrimetilsilano, cloruro de trietilsililo, cloruro de trifenilsililo, hexametildisilazano, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (TMSOTf), cloruro de dimetilisopropilsililo, cloruro de dietilisopropilsililo, cloruro de terc-butildimetilsililo, cloruro de terc-butildifenilsililo, cloruro de triisopropilsililo, dimetildiclorosilano, difenildiclorosilano, y similares. En algunas realizaciones preferidas, se usa N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA) como agente sililante.

Opcionalmente, se puede añadir una base. Las bases adecuadas son bases de amina, por ejemplo trietilamina, N,N-diisopropiletilamina (DIEA), N-metilmorfolina, N-etilmorfolina, tributilamina, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO), N-metilimidazol (NMI), piridina, 2,6-lutidina, 2,4,6-colidina, 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno (“esponja de protones”), 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN), 1,5,7-triazabiciIclo[4.4.0]dec-5-eno (TBD), 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno (MTBD), 1,1,3,3-tetrametIlguanidina (TMG), 2-ferc-butil-1,1,3,3-tetrametilguanidina, 2,8,9-trimetil-2,5,8,9-tetraaza-1-fosfabiciclo[3.3.3]undecano, base de fosfaceno, y similares.

Una base preferida es la trietilamina.

Los disolventes adecuados para el Procedimiento A incluyen piridina, 2-picolina, 3-picolina, 4-picolina, quinolina, tetrahidrofurano (THF), 1,4-dioxano, 1,2-dimetoxietano (DME), dietilenglicol dimetil éter (diglima), éter dietílico, acetonitrilo, y similares.

Un disolvente preferido para el Procedimiento A es la piridina.

Los disolventes adecuados para el Procedimiento B incluyen acetonitrilo, N,N-dimetilformamida (DMF), N,N-dimetilacetamida (DMA), N-metilpirrolidona (NMP), tetrametilurea, 1,3-dimetilimidazolidin-2-ona, sulfolano, hexametil fosfortriamida (HMPT), 1,4-dioxano, tetrahidrofurano (THF), acetona, acetato de etilo, y similares.

Los disolventes preferidos para el Procedimiento B incluyen N,N-dimetilformamida; N-metilpirrolidona y acetonitrilo.

Aplicaciones de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención se pueden usar en una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, pueden usarse in vitro, por ejemplo como agentes de investigación o diagnóstico, o in vivo, por ejemplo como agentes terapéuticos, de diagnóstico o de investigación.

Por consiguiente, en un aspecto de la presente invención se proporciona un método, comprendiendo el método poner en contacto, in vitro o in vivo, un oligonucleótido según la presente invención (preferiblemente monocatenario) con un oligonucleótido que tiene un alto grado de identidad de secuencia (preferiblemente monocatenario), y permitir que los oligonucleótidos se hibriden (por ejemplo, para formar un oligonucleótido bicatenario). El método puede comprender además opcionalmente la etapa de detectar y/o cuantificar los oligonucleótidos hibridados. El método puede ser un método para detectar un oligonucleótido específico, por ejemplo mutante, variante, u oligonucleótido que contiene polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). El método puede ser un método para diagnosticar la presencia de una enfermedad en un paciente, por ejemplo que implica la detección de un oligonucleótido en una muestra de tejido o fluido corporal recogido de un paciente.

Los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención pueden diseñarse y sintetizarse para que sirvan como cebadores en un método de amplificación de ácidos nucleicos, tal como en los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención pueden diseñarse y fabricarse como micromatrices de oligonucleótidos (“chips de ADN”) para uso en métodos, en los que es necesario el uso de micromatrices de oligonucleótidos.

Los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención también pueden usarse para diseñar y sintetizar ácidos nucleicos terapéuticos, tales como ARNip (Angell & Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16, 12:3675-3684; y Voinnet & Baulcombe (1997) Nature 389: p. 553); Fire A. et al., Nature, Vol 391, (1998); Fire (1999) Trends Genet. 15: 358 363, Sharp (2001) Genes Dev. 15: 485-490, Hammond et al. (2001) Nature Rev. Genes 2: 1110-1119 and Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2: 239-245), ribozimas, aptámeros (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 1990 Aug 3; 249(4968):505-10); WO91/19813), ADNzimas, antisentido, PMO, PNA, LNA o gápmeros. Las terapias basadas en oligonucleótidos son bien conocidas en la técnica para tratar una variedad de enfermedades, por ejemplo incluso en el tratamiento de infecciones virales o enfermedades mediadas por virus, cáncer, trastornos del ojo, tal como la degeneración macular relacionada con la edad, prevención de neovascularización no deseada, trastornos por deficiencia de empalme de exones, tal como distrofia muscular de Duchenne, y como agentes anti-colesterol. El diseño de los agentes oligonucleotídicos conocidos o propuestos para tales tratamientos puede modificarse para incorporar el fosfato o los fosfatos modificados descritos en el presente documento. Opcionalmente, los ácidos nucleicos terapéuticos se pueden conjugar con un agente de administración tal como un péptido que penetra en las células (por ejemplo, como se describe en WO2009/147368).

Por consiguiente, en un aspecto se proporciona un oligonucleótido según la presente invención para uso en un método de tratamiento médico, o para uso en terapia. En otro aspecto, se proporciona el uso de un oligonucleótido según la presente invención en la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para uso en el tratamiento de una enfermedad. En otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad, comprendiendo el método administrar un oligonucleótido según la presente invención a un paciente que lo necesita, tratando de ese modo dicha enfermedad.

Los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención se pueden formular como un medicamento o una composición farmacéutica. Un medicamento o composición farmacéutica puede comprender un oligonucleótido de la presente invención, por ejemplo en forma purificada o aislada, y un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Los medicamentos y las composiciones farmacéuticas de acuerdo con aspectos de la presente invención pueden formularse para su administración por varias vías, que incluyen, pero no se limitan a, parenteral, intravenosa, intraarterial, intramuscular, oral y nasal. Los medicamentos y composiciones se pueden formular en forma líquida o sólida. Se pueden formular formulaciones fluidas para la administración mediante inyección en una región seleccionada del cuerpo humano o animal.

La administración es preferiblemente en una “cantidad terapéuticamente eficaz”, que es suficiente para mostrar beneficio al individuo. La cantidad real administrada y la velocidad y la duración de la administración dependerán de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se esté tratando. La prescripción de tratamiento, por ejemplo las decisiones sobre la dosis, etc., son responsabilidad de los médicos generales y otros médicos, y generalmente tienen en cuenta el trastorno que se va a tratar, el estado del paciente individual, el lugar de la administración, el método de administración, y otros factores conocidos por el médico. Se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20a Edición, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.

Los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden realizar in vitro o in vivo. El termino "in vitro" está destinado a abarcar experimentos con materiales, sustancias biológicas, células y/o tejidos en condiciones de laboratorio o en cultivo, mientras que el término “in vivo” pretende abarcar experimentos y procedimientos con organismos multicelulares intactos.

Un sujeto a tratar puede ser cualquier animal o ser humano. El sujeto es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. El sujeto puede ser un mamífero no humano, pero más preferiblemente es un ser humano. El sujeto puede ser hombre o mujer. El sujeto puede ser un paciente.

La invención incluye la combinación de los aspectos y características preferidas descritos excepto cuando tal combinación es claramente inadmisible o se evita expresamente.

Los títulos de las secciones que se usan en este documento son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito.

Se ilustrarán ahora aspectos y realizaciones de la presente invención, a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas. Otros aspectos y realizaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Todos los documentos mencionados en este texto se incorporan aquí como referencia.

A lo largo de esta memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

Debe observarse que, como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Los intervalos se pueden expresar en el presente documento desde “alrededor de” un valor particular y/o hasta “alrededor de” otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente “alrededor de”, se entenderá que el valor particular forma otra realización.

Si bien la presente invención se ha descrito con referencia a las realizaciones específicas de la misma, los expertos en la técnica deben entender que pueden realizarse diversos cambios y sustituirse por equivalentes sin apartarse del verdadero espíritu y alcance de la invención.

Además, se pueden realizar muchas modificaciones para adaptar una situación, material, composición de materia, procedimiento, etapa o etapas del procedimiento en particular, al espíritu objetivo y al alcance de la presente invención. Todas estas modificaciones están destinadas a estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitativos, con referencia a las Figuras correspondientes.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la invención.

Métodos generales

Se sintetizaron oligonucleótidos modificados en un sintetizador de ADN automatizado ASM-800 de Biosset usando la química de p-cianoetil fosforamidito [58] o la química de H-fosfonato [66] en una escala de 0,2 gmoles usando columnas estándar de 12 gl.

Todas las reacciones se llevaron a cabo en tubos de polipropileno de 1,5 ml con tapones de rosca y juntas tóricas de goma. Después de la síntesis en fase sólida, el soporte polimérico de la columna se transfirió a un tubo de plástico y se trató con 200 gl de disolución de desbloqueo por 5 mg de soporte. Como disolución de desbloqueo se utilizó una disolución acuosa de amoniaco concentrada (aprox. 33%) (Disol. A) o una mezcla 1:1 en vol. de etilendiamina y etanol abs. (Disol. B). Después de desbloquear, el sobrenadante se evaporó a vacío usando un concentrador SpeedVac, y se añadieron 400 gl de acetato de trietilamonio 20 mM, pH 7, y el soporte se eliminó por centrifugación.

Los oligonucleótidos modificados se purificaron mediante HPLC de fase inversa (RP) en modo DMTr OFF o en modo DMTR ON en un cromatógrafo Agilent serie 1200 usando un gradiente de acetonitrilo de 0 a 40% en acetato de trietilamonio 0,02 M, pH 7 durante 30 min, caudal 2 cm3 min-1 en una columna Zorbax SB-C18 (5 gm) (4,6x150 mm). El grupo DMTr 5’-terminal se eliminó mediante un tratamiento de 15 min con 100 gl de ácido acético al 80%, seguido de neutralización con 400 gl de acetato de trietilamonio 20 mM, pH 7,0, y evaporación en un concentrador SpeedVac. Después, los oligonucleótidos se precipitaron añadiendo 1 ml de LiClO41 M en acetona, el pelete se lavó con acetona, y se secó al aire durante 20 min. Se usó electroforesis en gel desnaturalizante en gel de poliacrilamida al 20% (PAGE) para comprobar la pureza de los oligonucleótidos, con bandas visualizadas mediante tinción con Stains-All. Las estructuras de los oligonucleótidos modificados se confirmaron mediante espectros de masas de tiempo de vuelo con ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF) registrados en modo de ion negativo o positivo en un espectrómetro de masas Bruker Reflex III Autoflex Speed usando ácido 3-hidroxipicolínico como matriz.

Preparación de una disolución 0,5 M de diclorofosfato de bis(dimetilamino)azidocarbenio. A una disolución de diclorofosfato de bis(dimetilamino)clorocarbenio (1,105 g, 4,1 mmoles) [67] en MeCN seco (10 ml) se añadió NaN3 en polvo y seco (1,1 equiv, 288 mg, 4,4 mmoles). La suspensión se agitó durante 2 h a temperatura ambiente, se filtró, se lavó con MeCN seco, se evaporó y se secó a vacío, dando 1,08 g (95%) de producto aceitoso. Se disolvieron 69 miligramos del producto en 1 ml de DMF - Et3N 95:5 (v/v), se agitaron vigorosamente durante 2 min, y el precipitado se separó por centrifugación durante 3 min a 14.500 rpm para dar una disolución 0,5 M, que se puede almacenar a temperatura ambiente durante hasta una semana.

Preparación de una disolución 1 M de hexafluorofosfato de 2-azido-1,3-dimetilimidazolinio. Se pesaron hexafluorofosfato de 2-cloro-1,3-dimetilimidazolinio (139 mg) y NaN3 (1,1 equiv, 36 mg) en un tubo de plástico de 1,5 ml, se añadió acetonitrilo seco (0,5 ml), y la suspensión se agitó durante 2 h a 30°C, después el precipitado se separó por centrifugación durante 5 min a 14.500 rpm. La disolución se almacenó a -18°C.

Preparación de una disolución 1 M de hexafluorofosfato de azidodipirrolidinocarbenio. Se pesaron hexafluorofosfato de clorodipirrolidinocarbenio (166 mg) y NaN3 (1,1 equiv, 36 mg) en un tubo de plástico de 1,5 ml, se añadió acetonitrilo seco (0,5 ml), y la suspensión se agitó durante 2 h a 30°C, después el precipitado se separó por centrifugación durante 5 min a 14.500 rpm. La disolución se almacenó a -18°C.

Ejemplo 1. Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTTpT) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII); p, aquí y en los siguientes Ejemplos, indica la posición del grupo fosfato modificado.

⁰il

N u -3 '-0 -P ₁ -0 -5 ’-Nu

Nn

Me2N-C-NMe2

(FVIII)

1.1. Procedimiento (a) con B-cianoetil fosfito y yodo.

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de la destritilación en 5’, el acoplamiento de fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó mezclando 124 pl de N,N,N’,N’-tetrametilguanidina (TMG), 50 pl de N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA) y 325 pl de piridina seca, y añadiendo tamices moleculares de 3Á hasta aprox. 1/4 vol. Se mezclaron alícuotas de 20 pl de disolución 1 y 2 en un tubo de plástico, se añadieron 10 pl de BSA, y después de 1 min de espera el contenido se transfirió al tubo con polímero. El tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 1 h a temperatura ambiente.

Masa molecular: calc. [M] 1860,39, exp. [M+H] 1860,93, [M-H] 1859,14.

1.2. Procedimiento (a) con H-fosfonato y yodo.

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5'-DMTr-dT CPG (40 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida automatizada, mediante el método de1H-fosfonato,a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de la destritilación en 5’ y el acoplamiento de H-fosfonato, y la columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con dinucleósido H-fosfonato unido se transfirió a un tubo de plástico.

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó mezclando 100 pl de TMG y 400 pl de piridina seca (20% vol), y añadiendo tamices moleculares de 3Á hasta aprox. / vol. Se añadieron al tubo con soporte alícuotas de 20 pl de disolución 1 y 2, se sometieron a vórtice durante 30 s, se centrifugaron a 14.500 rpm durante 15 s,y se agitaron durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 1860,39, exp. [M+H] 1861,17, [M-H] 1857,96.

1.3. Procedimiento (a) con H-fosfonato, BSA y yodo.

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5'-DMTr-dT CPG (40 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida automatizada, mediante el método de1H-fosfonato,a una escala de 0,2 gmol. La síntesis se interrumpió después de la destritilación en 5’ y el acoplamiento de H-fosfonato, y la columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con dinucleósido H-fosfonato unido se transfirió a un tubo de plástico.

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó mezclando 125 gl de TMG ^{( 2}M), 50 gl BSA (1 M) y 325 gl de piridina seca (20% vol), y añadiendo tamices moleculares de 3Á hasta aprox. % vol. Se añadieron alícuotas de 20 gl de disolución 1 y 2 al tubo con soporte, se añadieron 10 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 1860,39, exp. [M+H] 1861,17, [M-H] 1857,96.

1.4. Procedimiento (a) con H-fosfonato y CCU.

La disolución 1 se preparó manteniendo CCl⁴sobre tamices moleculares de 3Á durante 16 h. La disolución 2 se preparó mezclando 100 gl de TMG y 400 gl de piridina seca (20% en volumen), y añadiendo tamices moleculares de 3Á hasta aprox. % vol. Se añadieron al tubo con soporte alícuotas de 20 gl de disolución 1 y 2, se sometieron a vórtice durante 30 s, se centrifugaron a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitaron durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 1860,39, exp. [M+H] 1860,78, [M-H] 1858,67.

1.5. Procedimiento (a) con H-fosfonato y CChBr.

La disolución 1 se preparó manteniendo CCbBr sobre tamices moleculares de 3Á durante 16 h. La disolución 2 se preparó mezclando 100 gl de TMG y 400 gl de piridina seca (20% en volumen), y añadiendo tamices moleculares de 3Á hasta aprox. % vol. Se añadieron al tubo con soporte alícuotas de 20 gl de disolución 1 y 2, se sometieron a vórtice durante 30 s, se centrifugaron a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitaron durante 1 h a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 1860,39, exp. [M+H] 1861,13, [M-H] 1859,25.

1.6. Procedimiento (b) con B-cianoetil fosfito y diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio.

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 gmol. La síntesis se interrumpió después de la destritilación en 5’, el acoplamiento de fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 40 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 10 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante D-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 1860,39, exp. [M+H] 1860,35, [M-H] 1857,54.

Ejemplo 2. Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TpTTTTT) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 gmol. La síntesis se interrumpió después de cuatro incorporaciones de dT seguidas de 5’-destritilación, acoplamiento de fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 40 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 10 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se completó mediante 5’-destritilación.

Masa molecular: calc. [M] 1860,39, exp. [M+H] 1860,34, [M-H] 1858,63.

Ejemplo 3. Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTpTpT) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

3.1. Procedimiento (a) con H-fosfonato. BSA y yodo.

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5'-DMTr-dT CPG (40 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida automatizada, mediante el método de1H-fosfonato,a una escala de 0,2 gmol. La síntesis se interrumpió después de dos incorporaciones de dT H-fosfonato y la columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con trinucleósido bis-H-fosfonato unido se transfirió a un tubo de plástico.

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó mezclando 125 gl de TMG (2 M), 50 gl de BSA (1 M) y 325 gl de piridina seca (20% vol), y añadiendo tamices moleculares de 3Á hasta aprox. % vol. Se añadieron alícuotas de 20 gl de disolución 1 y 2 al tubo con soporte, se añadieron 10 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 10 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 1957,55, exp. [M+H] 1958,28, [M-H] 1956,34.

3.2. Procedimiento (b) con B-cianoetil fosfito y diclorofosfato de b¡s(d¡metilam¡no)-1-az¡docarben¡o.

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 umol. La síntesis se interrumpió después de la destritilación en 5’, el acoplamiento de fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 80 pl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 20 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló otro dT fosforamidito, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 1957,55, exp. [M+H] 1958,32, [M-H] 1955,44.

Ejemplo 4. Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTpTpTpT) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

4.1. Procedimiento (a) con H-fosfonato, BSA y yodo.

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5'-DMTr-dT CPG (40 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida automatizada, mediante el método de1H-fosfonato,a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de tres incorporaciones de dT H-fosfonato y la columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con tetranucleósido tris-H-fosfonato unido se transfirió a un tubo de plástico.

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó mezclando 125 pl de TMG (2 M), 50 pl de BSA (1 M) y 325 pl de piridina seca (20% vol), y añadiendo tamices moleculares de 3Á hasta aprox. % vol. Se añadieron alícuotas de 20 pl de disolución 1 y 2 al tubo con soporte, se añadieron 10 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 10 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 2054,72, exp. [M+H] 2055,49.

4.2. Procedimiento (b) con B-cianoetil fosfito y diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio.

Una alícuota de 120 pl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1 -azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 30 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló otro dT fosforamidito, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una segunda alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló otro dT fosforamidito, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una tercera alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 2054,72, exp. [M+H] 2054,49.

Ejemplo 5. Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTTpT) con el grupo fosforil guanidina (FIX).

⁰ii

Nu-3’-0 -P -0 -5 '-N u ₁

N _ii

h2n- c - nh2

(FIX)

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 umol. La síntesis se interrumpió después de la destritilación en 5’, el acoplamiento de fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó pesando 9,6 mg de hidrocloruro de guanidina seco en un tubo de plástico, añadiendo 85 pl de piridina seca, 15 pl de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), 10 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 5 min y se sonicó hasta que se volvió transparente (aprox. 5 min). Se mezclaron alícuotas de 20 pl de disolución 1 y 2 en un tubo de plástico, se añadieron 10 pl de b Sa , y después de 1 min de espera, el contenido se transfirió al tubo con polímero. El tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 1804,28, exp. [M+H] 1804,62, [M-H] 1803,25.

Ejemplo 6. Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TpTTTTT) con el grupo fosforil guanidina (FIX).

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 umol. La síntesis se interrumpió después de cuatro incorporaciones de dT seguidas de 5’-destritilación, acoplamiento de fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó pesando 9,6 mg de hidrocloruro de guanidina seco en un tubo de plástico, añadiendo 85 pl de piridina seca, 15 pl de DBU, 10 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 5 min y se sonicó hasta que se volvió transparente (aprox. 5 min). Se mezclaron alícuotas de 20 pl de disolución 1 y 2 en un tubo de plástico, se añadieron 10 pl de BSA, y después de 1 min de espera, el contenido se transfirió al tubo con polímero. El tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se completó mediante 5’-destritilación.

Masa molecular: calc. [M] 1804,28, exp. [M+H] 1804,76, [M-H] 1803,06.

Ejemplo 7. Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTTpT) con el grupo O-metil fosforil isourea (FX).

⁰ II

Nu~3'-0-P ₁ “0~-5'-Nu

N _n

MeO-C-NH2

(FX)

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó pesando 8,6 mg de hidrogenosulfato de O-metilisourea seco en un tubo de plástico, añadiendo 35 pl de piridina seca, 15 pl de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), 5 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 5 min y se sonicó hasta que se aclaró (aprox. 10 min), seguido de centrifugación a 14.500 rpm durante 2 min. Se mezclaron alícuotas de 20 pl de disolución 1 y 2 en un tubo de plástico, se añadieron 10 pl de BSA, y después de 1 min de espera, el contenido se transfirió al tubo con polímero. El tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 16 h a 55°C.

Masa molecular: calc. [M] 1819,29, exp. [M+H] 1819,59, [M-H] 1818,26.

Ejemplo 8. Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTTpT) con el grupo N-B-aminoetil fosforil guanidina (FXI).

0

_n

Nu-3'-o-p ₁ ~0-5 '-N u

N t i U H

H2N-C-N-CH2-CH2-NH2

(FXI)

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución B durante 16 h a 55°C.

Masa molecular: calc. [M] 1847,35, exp. [M+H] 1847,16, [M-H] 1844,76.

Ejemplo 9 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TCpA) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5’-DMTr-dA(Bz) CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de la 5’-destritilación, el acoplamiento de dC fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 40 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 10 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 16 h a temperatura ambiente.

Masa molecular: calc. [M] 941,80, exp. [M+H] 942,17, [M-H] 938,97.

RMN 31P (D²O, 5, ppm): diastereoisómero “rápido” 0,37, diastereoisómero “lento” 0,21.

Ejemplo 10 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(GCGCCAAACpA) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5’-DMTr-dA(Bz) CPG (110 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 gmol. La síntesis se interrumpió después de la 5’-destritilación, el acoplamiento de dC fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 12 h a 55°C. En la Fig. 1 se muestra una traza de HPLC del oligonucleótido.

Masa molecular: calc. [M] 3103,21, exp. [M+H] 3102,12, [M-H] 3100,61.

Ejemplo 11 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(GCGCCAAApCpA) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una alícuota de 80 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 20 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló dA, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una segunda alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 3200,38, exp. [M+H] 3199,90, [M-H] 3199,00.

Ejemplo 12 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(GCGCCAApACpA) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una alícuota de 80 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 20 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, después se acopló un dA fosforamidito, seguido de otra dA, y la síntesis se interrumpió antes de la última etapa de oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 12 h a 55°C.

Masa molecular: calc. [M] 3200,38, exp. [M+H] 3199,51.

Ejemplo 13 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(GCGCCApAACpA) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una alícuota de 80 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 20 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, después se acoplaron dos fosforamiditos dA, seguido de otro dA, y la síntesis se interrumpió antes de la última etapa de oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Masa molecular: calc. [M] 3200,38, exp. [M+H] 3199,15.

Ejemplo 14 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(GCGCCAApApCpA) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una alícuota de 120 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 30 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló dA, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una segunda alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló dA, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Masa molecular: calc. [M] 3297,54, exp. [M+H] 3296,80.

Ejemplo 15 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(GGAAGGGGAGAGpA) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5’-DMTr-dA(Bz) CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de la 5’-destritilación, el acoplamiento de dG fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 40 pl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 10 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 4234,94, exp. [M-H] 4233,84.

Ejemplo 16 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTpT) con el grupo N. N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de O, 2 umol. La síntesis se interrumpió después de la destritilación en 5’, el acoplamiento de fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó mezclando 124 pl de TMG, 50 pl de BSA y 325 pl de piridina seca, y añadiendo tamices moleculares de 3Á hasta aprox. % vol. Se mezclaron alícuotas de 20 pl de disolución 1 y 2 en un tubo de plástico, se añadieron 10 pl de BSA, y después de 1 min de espera, el contenido se transfirió al tubo con polímero. El tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 2 h a temperatura ambiente.

Masa molecular: calc. [M] 6119,16, exp. [M+H] 6121,13, [M-H] 6113,80.

Ejemplo 17 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTTTTTTTTpTTTTTTTTT) con el grupo N. N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de O, 2 pmol. La síntesis se interrumpió después de ocho ciclos de incorporación de dT seguidos de 5’-destritilación, otro acoplamiento de dT fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó mezclando 124 gl de TMG, 50 gl de BSA y 325 gl de piridina seca, y añadiendo tamices moleculares de 3Á hasta aprox. % vol. Se mezclaron alícuotas de 20 gl de disolución 1 y 2 en un tubo de plástico, se añadieron 10 gl de BSA, y después de 1 min de espera, el contenido se transfirió al tubo con polímero. El tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 6119,16, exp. [M+H] 6121,54.

Ejemplo 18 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTpTTTTTTTTTTTTTTTTTT) con el grupo N. N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de O, 2 gmol. La síntesis se interrumpió después de 17 ciclos de incorporación de dT seguidos de 5’-destritilación, otro acoplamiento de dT fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó mezclando 124 gl de TMG, 50 gl de BSA y 325 gl de piridina seca, y añadiendo tamices moleculares de 3Á hasta aprox. % vol. Se mezclaron alícuotas de 20 gl de disolución 1 y 2 en un tubo de plástico, se añadieron 10 gl de BSA, y después de 1 min de espera, el contenido se transfirió al tubo con polímero. El tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 6119,16, exp. [M+H] 6120,01, [M-H] 6114,19.

Ejemplo 19 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTpTTTTTTTTTTTTTTTTpT) con el grupo N. N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de O, 2 umol. La síntesis se interrumpió después de la 5’-destritilación, el acoplamiento de dT fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 80 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 20 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, la síntesis se reanudó incorporando 17 nucleótidos dT, y se detuvo después de otro acoplamiento de dT y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Masa molecular: calc. [M] 6216,33, exp. [M-H] 6221,11.

Ejemplo 20 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTpTTTTTTTTTpTTTTTTTTpT) con el grupo N. N. N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de O, 2 gmol. La síntesis se interrumpió después de la 5’-destritilación, el acoplamiento de dT fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 120 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1 -azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 30 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se incorporaron ocho nucleótidos dT, y la síntesis se interrumpió en el último dT antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una segunda alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se incorporaron nueve nucleótidos dT, y la síntesis se interrumpió en el último dT antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una tercera alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó para la última incorporación del nucleótido dT.

Masa molecular: calc. [M] 6313,49, exp. [M-H] 6310,71.

Ejemplo 21 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTpT) con el grupo fosforil guanidina (FIX).

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó pesando 9,6 mg de hidrocloruro de guanidina seco en un tubo de plástico, añadiendo 85 gl de piridina seca, 15 gl de DBU, 10 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 5 min y se sonicó hasta que se volvió transparente (aprox. 5 min). Se mezclaron alícuotas de 20 gl de disolución 1 y 2 en un tubo de plástico, se añadieron 10 gl de BSA, y después de 1 min de espera, el contenido se transfirió al tubo con polímero. El tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 6063,05, exp. [M+H] 6065,02, [M-H] 6058,30.

Ejemplo 22 Preparación de un oligodesoxirribonucleótido modificado 5’-d(TTTT)tpdT con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII); t, aquí y en el siguiente Ejemplo, indica la posición del nucleótido LNA-T.

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 gmol. La etapa de acoplamiento para la incorporación de LNA-T se extendió a 6 min. La síntesis se interrumpió después de la 5’-destritilación, el acoplamiento de LNA-T fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 40 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 10 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Después, el contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 1 h a temperatura ambiente. En la Fig. 3 se muestra una traza de RP-HPLC del oligonucleótido.

Masa molecular: calc. [M] 1888,40, exp. [M+H] 1888,15, [M-H] 1886,86.

Ejemplo 23 Preparación de un oligodesoxirribonucleótido modificado 5’-tpd (TTTTT) con el grupo N,N,N’,N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII); p indica la posición del grupo fosfato modificado: t indica la posición del nucleótido LNA-T.

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 gmol. La etapa de acoplamiento para la incorporación de LNA-T se prolongó 6 min. La síntesis se interrumpió después de cuatro ciclos de incorporación de dT, 5’-destritilación, acoplamiento de LNA-T fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 40 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 10 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora y la síntesis se completó mediante 5’-destritilación.

Masa molecular: calc. [M] 1888,40, exp. [M+H] 1888,27, [M-H] 1887,44.

Ejemplo 24 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(AACGTCAGGGTCTTCCp)BHQ con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (Fórmula XIV). Aquí y en el siguiente Ejemplo. BHQ es BlackHole Quencher™ (FXII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte BHQ CPG (42 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 gmol. La síntesis se interrumpió después de la 5’-destritilación, el acoplamiento de dC fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 40 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 10 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Después, el contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 5510,92, exp. [M-H] 5509,50.

grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII). DD es 1.12-dodecanodiol fosfato (FXIII), Flu es marcador 5(6)-carboxifluoresceína (FXIV).

Una columna que contiene 5 mg de soporte BHQ CPG (42 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de la 5’-destritilación, el acoplamiento de dT fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 40 pl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 10 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Después, el contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia usando los correspondientes 1,12-dodecanodiol y fosforamiditos de fluoresceína como modificadores.

Masa molecular: calc. [M] 6078,50, exp. [M+H] 6084,38.

Ejemplo 26 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TCTCTCpFCCTTCpC) con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (Fórmula XIV). F, aquí y en el siguiente Ejemplo, es fosfato de 2-hidroximetil-3-hidroxitetrahidrofurano (sitio apurínico/apirimidínico) (FXV).

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5’-DMTr-dC(Bz) CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de la 5’-destritilación, el acoplamiento de dC fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 80 pl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 20 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se incorporaron cinco nucleótidos, incluyendo la unidad dF, hasta el siguiente nucleótido dC, en el que se interrumpió la síntesis antes de la etapa de oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una segunda alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 3857,76, exp. [M-H] 3856,74.

Ejemplo 27 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(GCGCCAAACpA) con el grupo 1.3-dimetil-2-(fosforilimino)imidazolidina (FXVI).

⁰

Nu_ 3._0 _ p ^II _ 0 _ 5._Nu

1

^Nj í

M e - N N - M e

L__ /

(FXVI)

A 100 gl de hexafluorofosfato de 2-azido-4,5-dihidro-1,3-dimetil-1 H-imidazolio 1 M se añadieron 25 gl de BSA y 5 gl de trietilamina, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 3101,20, exp. [M+H] 3101,55.

Ejemplo 28 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(GCGCCAAACpA) con el grupo N.N’-ó/s(tetramet¡len)-N”-fosforil guanidina (FXVII).

(FXVII)

A 100 gl de hexafluorofosfato de azidodipirrolidinocarbenio 1 M se añadieron 25 gl de BSA y 5 gl de trietilamina, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 3155,29, exp. [M+H] 3153,75.

Ejemplo 29 Preparación de un ol¡qo-2’-O-metilr¡bonucleót¡do 5 -AUCGpU modificado con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5’-DMTr-2’-OMe-rU CPG (40 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis automatizada de oligo-2’-O-metilribonucleótidos en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito en una escala de 0,2 gmoles. La síntesis se interrumpió después de 5’-destritilación, acoplamiento y protección de 2’-OMe-rG fosforamidito, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Masa molecular: calc. [M] 1697,28, exp. [M+H] 1697,59, [M-H] 1694,77.

Ejemplo 30 Preparación de un oligo^’-O-metilribonucleótido 5 -GCGCCAAACpA modificado con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5’-DMTr-2’-OMe-rA(Bz) CPG (60 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis automatizada de oligo-2’-O-metilribonucleótidos en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito en una escala de 0,2 gmoles. La síntesis se interrumpió después de 5’-destritilación, acoplamiento de 2’-OMe-rC fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 40 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 10 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 3403,48, exp. [M-H] 3402,55.

Ejemplo 31 Preparación de un oligo^’-O-metilribonucleótido 5 -GCGCCAAApCpA modificado con el grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII).

Una alícuota de 80 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 20 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló un 2’-OMe-rU fosforamidito, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una segunda alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 3500,64, exp. [M+H] 3199,90, [M-H] 3499,75.

Ejemplo 32 Preparación de un ol¡ao-2’-O-metilr¡bonucleót¡do fosforotioato modificado 5’-G^sA^sC^sA^sU^sC^sC^sA^sU^sU^sC^sA^sA^sA^sU^sG^sG^sU^sUpUpG con grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (Fórmula XIV): ^s, aquí y en los siguientes Ejemplos, indica un resto de fosforotioato (FXVIII).

0 ^“ _i

w Q - P —0 ,AA'

ⁱⁱs

(FXVIII)

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5’-DMTr-2’-OMe-rG(Tac) CPG (60 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis automatizada de oligo-2’-O-metilribonucleótidos en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito en una escala de 0,2 pmoles. La síntesis se interrumpió después de 5 ’-destritilación, acoplamiento de 2’-OMe-rU fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 80 pl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1-azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 20 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló un 2’-OMe-rA fosforamidito, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una segunda alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó sustituyendo la sulfuración con 3-[(dimetilaminometilen)imino]-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona 0,1 M en piridina seca para la oxidación con yodo hasta el final de la secuencia.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 3 h a 70°C.

Masa molecular: calc. [M] 7436,14, exp. [M+H] 7433,89.

Ejemplo 33 Preparación de un oligo^’-O-metilríbonucleótido fosforotioato modificado 5’-Flu G^sA^sC^sA^sU^sC^sC^sA^sU^sU^sC^sA^sA^sA^sU^sG^sG^sU^sUpUpG con grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII); Flu indica marcador de 5’-fluoresceína (FXIXV); ^sindica resto de fosforotioato (FXVIII).

Se transfirió una segunda alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó sustituyendo la sulfuración con 3-[(dimetilaminometilen)imino]-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona 0,1 M en piridina seca para la oxidación con yodo hasta el final de la secuencia. La síntesis se completó mediante la incorporación de la correspondiente fosforamidito de fluoresceína en modo DMTr ON.

Masa molecular: calc. [M] 8003,63, exp. [M-H] 8001,25.

Ejemplo 34 Preparación de un ol¡qo-2’-O-metilr¡bonucleót¡do fosforotioato modificado 5'-Flu G^sG^sC^sC^sA^sA^sA^sC^sC^sU^sC^sC^sG^sC^sUpUpACpCpU con grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII): Flu indica marcador de 5’-fluoresceína (FXIX): ^sindica resto de fosforotioato (FXVIII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5’-DMTr-2’-OMe-rU CPG (40 gmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis automatizada de oligo-2’-O-metilribonucleótidos en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito en una escala de 0,2 gmoles. La síntesis se interrumpió después de 5’-destritilación, acoplamiento de 2’-OMe-rC fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Una alícuota de 160 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1 -azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 40 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló un 2’-OMe-rC fosforamidito, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una segunda alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló un 2’-OMe-rA fosforamidito, seguido de 2’-OMe-rU, y la síntesis se interrumpió antes de la última etapa de oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una tercera alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1,5 h a 45°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló un 2’-OMe-rU fosforamidito, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una cuarta alícuota de 50 gl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1,5 ha 45°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 gl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó sustituyendo la sulfuración con 3-[(dimetilaminometilen)imino]-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona 0,1 M en piridina seca para la oxidación con yodo hasta el final de la secuencia. La síntesis se completó mediante la incorporación de la correspondiente fosforamidito de fluoresceína en modo DMTr ON.

Masa molecular: calc. [M] 7763,48, exp. [M-H] 7759,37.

Ejemplo 35 Preparación de una mezcla de LNA-oliqo^’-O-metilribonucleótido fosforotioato 5'-Flu GsgsCsgsAsasAsCsCsUsCsCsCsCsUpUpaCpCpU con grupo N.N.N’.N’-tetrametilfosforil guanidina (FVIII): Flu indica marcador de 5’-fluoresceína (FXIX): s indica resto de fosforotioato (FXVIII). Los nucleótidos A. 5-Me-C y G del LNA se muestran con letras minúsculas a. c y g. respectivamente.

Una alícuota de 160 gl de diclorofosfato de bis(dimetilamino)-1 -azidocarbenio 0,5 M se transfirió a un tubo de plástico, se añadieron 40 gl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirió una alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló un 2’-OMe-rC fosforamidito, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una segunda alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1 h a 40°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló un LNA-A fosforamidito, seguido de 2’-OMe-rU, y la síntesis se interrumpió antes de la última etapa de oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una tercera alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1,5 h a 45°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, se acopló un 2’-OMe-rU fosforamidito, y la síntesis se interrumpió antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

Se transfirió una cuarta alícuota de 50 pl al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s y se agitó durante 1,5 h a 45°C. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó sustituyendo la sulfuración con 3-[(dimetilaminometilen)imino]-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona 0,1 M en piridina seca para la oxidación con yodo y usando LNA y 2'-OMe fosforamiditos hasta el final de la secuencia. La síntesis se completó mediante la incorporación de la correspondiente fosforamidito de fluoresceína en modo DMTr ON.

Masa molecular: calc. [M] 7793,47, exp. [M-H] 7792,92.

Ejemplo 36 Preparación de un ol¡qo-2’-O-metilr¡bonucleót¡do 5 -UUUUUpU modificado con el grupo 1.3-dimetil-2-(fosforilimino)imidazolidina (FXVI).

Una columna que contiene 5 mg de soporte 5’-DMTr-2’-OMe-rU CPG (40 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis automatizada de oligo-2’-O-metilribonucleótidos en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito en una escala de 0,2 pmoles. La síntesis se interrumpió después de 5’-destritilación, acoplamiento de 2’-OMe-rU fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

A 100 pl de hexafluorofosfato de 2-azido-4,5-dihidro-1,3-dimetil-1 H-imidazolio 1 M se añadieron 25 pl de BSA y 5 pl de trietilamina, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 1 h a temperatura ambiente. En la Fig. 4 se muestra una traza de RP-HPLC del oligonucleótido.

Masa molecular: calc. [M] 1954,37, exp. [M+H] 1953,37.

Ejemplo 37 Preparación de un oliqo^’-O-metilribonucleótido 5 -UUUUUpU modificado con el grupo N.N’-b/s(tetrametMen)-N”-fosforM quanidina (FXVII).

A 100 pl de hexafluorofosfato de azidodipirrolidinocarbenio 1 M se añadieron 25 pl de BSA y 5 pl de trietilamina, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se reanudó hasta el final de la secuencia.

Masa molecular: calc. [M] 2008,46, exp. [M-H] 2007,57.

Ejemplo 38 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTTpT) con el grupo N.N-dimetilfosforil guanidina (FXX).

0

ii

N u -3 '-0 -P -0 ~ 5 ’-Nu

1

Nti

H2N-C-NMe2

(FXX)

A 12 mg de cloruro de (clorometilen)dimetiliminio y 4 mg (1,1 equiv) de NaN3 en un tubo de plástico, se añadieron 100 pl de MeCN seco, y el tubo se agitó durante 2 h a 30°C, se centrifugó a 14.500 rpm durante 5 min, se añadieron 25 pl de BSA, el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y el sobrenadante se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 18 h a 55°C.

Masa molecular: calc. [M] 1832,22, exp. [M-H] 1831,57.

Ejemplo 39 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTTpT) con el grupo N-fosforil formamidina (FXXI).

0_n

N u-3 '-0-P -0-5 '-N u

1

Nn

h2n- c - h

(FXXI)

La disolución 1 se preparó disolviendo cristales de yodo en piridina seca hasta una concentración de 0,2 M (51 mg por ml). La disolución 2 se preparó pesando 40 mg de hidrocloruro de formamidina seco en un tubo de plástico, añadiendo 375 pl de piridina seca, 75 pl de DBU, y 50 pl de BSA, y el tubo se sometió a vórtice durante 3-4 min y se sonicó hasta que se volvió transparente (aprox. 3-4 min). Se mezclaron alícuotas de 20 pl de disolución 1 y 2 en un tubo de plástico, se añadieron 10 pl de BSA, y después de 1 min de espera, el contenido se transfirió al tubo con polímero. El tubo se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia. El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 1 h a temperatura ambiente.

Masa molecular: calc. [M] 1789,27, exp. [M-H] 1788,60.

- -(FXXII).

(FXXII)

A 20 pl de disolución 0,25 M de azida de cianógeno en MeCN seco preparada como se describe por McMurry [51] se añadieron 5 pl de BSA, y el tubo se mantuvo durante 15 min a temperatura ambiente, el contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución B durante 1 h a 70°C.

Masa molecular: calc. [M] 1787.25, exp. [M+H] 1787,27, [M-H] 1785,19.

Ejemplo 41 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TpTTTTT) con el grupo N-cianoimino fosfato (FXXII).

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de cuatro ciclos de incorporación de dT, 5’-destritilación, acoplamiento de dT fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico. A 20 pl de disolución 0,25 M de azida de cianógeno en MeCN seco preparada como se describe por McMurry [51] se añadieron 5 pl de BSA, y el tubo se mantuvo durante 15 min a temperatura ambiente, el contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 15 s, y se agitó durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2 x 200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y se reanudó la síntesis en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito hasta el final de la secuencia.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución B durante 1 h a 70°C. En la Fig. 5 se muestra una traza de RPHPLC del oligonucleótido.

Masa molecular: calc. [M] 1787,25, exp. [M+H] 1787,19, [M-H] 1785,11.

Ejemplo 42 Preparación de un nucleósido modificado dTp con el grupo 3’-N,N’-b¡s(tetrametilen)-N”-

Una columna que contiene 5 mg de soporte soporte 3’-fosfato CPG (30-40 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de la 5’-destritilación, el acoplamiento de dT fosforamidito y la protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

A 100 pl de hexafluorofosfato de azidodipirrolidinocarbenio 1 M se añadieron 25 pl de BSA y 5 pl de trietilamina, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN, se transfirió a una columna sintetizadora, y la síntesis se completó mediante 5’-destritilación.

El oligonucleótido se separó del soporte mediante disolución A durante 1 h a temperatura ambiente. Masa molecular: calc. [M] 471,45, exp. [M+H] 471,08.

Ejemplo 43 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-d(TTTTTT)p con el grupo 3’-N,N’-bis(tetrametilen)-N”-guanidinofosfato (FXXIII).

El oligonucleótido se separó del soporte mediante disolución A durante 1 h a temperatura ambiente. En la Fig. 6 se muestra un RP-HPLC del oligonucleótido.

Masa molecular: calc. [M] 1992,44, exp. [M+H] 1991,46.

Ejemplo 44 Preparación de un nucleósido de timidina modificado con el grupo 5’-N.N’-bis(tetrametilen)-N”-

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 pmol usando el mismo fluoresceín fosforamidito como en el Ejemplo 25. La síntesis se interrumpió antes de la oxidación, la columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

A 100 pl de hexafluorofosfato de azidodipirrolidinocarbenio 1 M se añadieron 25 pl de BSA y 5 pl de trietilamina, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN y se secó en aire durante 5 min.

Masa molecular: calc. [M] 1263,32, exp. [M-H] 1262,22.

Ejemplo 45 Preparación de un oligonucleótido modificado 5’-Flu pd(TTTTTT) con el grupo 5’-N,N’-bis(tetrametilen)-N”-fosforil quanidina y un marcador de fluoresceína (FXXIV).

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de la incorporación de cinco restos de dT y un marcador de fluoresceína Flu’ (XXV), pero antes de la última etapa de oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

A 100 de hexafluorofosfato de azidodipirrolidinocarbenio 1 M se añadieron 25 pl de BSA y 5 pl de trietilamina, y el tubo se sometió a vórtice durante 1 min, se centrifugó a 14.500 rpm durante 1 min, y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido se transfirió al tubo con soporte, se sometió a vórtice durante 30 s, se centrifugó a 14.500 rpm durante 30 s, y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó, el soporte se enjuagó con 2x200 pl de MeCN y se secó en aire durante 5 min.

Masa molecular: calc. [M] 2784,31, exp. [M-H] 2782,96.

Ejemplo 46 Preparación de un oligonucleótido híbrido de ADN-ARN 5’-d(TTTT)rUpdT modificado con el grupo 1.3-dimetil-2-(fosforilimino)imidazolidina (FXVI).

Una columna que contiene 5 mg de soporte High Load 5'-DMTr-dT CPG (110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN, y se inició la síntesis oligonucleotídica en fase sólida mediante p-cianoetil fosforamidito automatizada a una escala de 0,2 pmol. La síntesis se interrumpió después de 5’-destritilación, acoplamiento de 2'-TOM-rU fosforamidito y protección, pero antes de la oxidación. La columna se separó del sintetizador, se escurrió en una bomba de agua, se enjuagó con MeCN, y el soporte con el fosfito unido se transfirió a un tubo de plástico.

El oligonucleótido se separó del soporte, y los grupos protectores se eliminaron mediante disolución A durante 1 h a temperatura ambiente. El grupo TOM se eliminó entonces mediante trihidrofluoruro de trietilamina - trietilamina - NMP (4:3:6 v/v/v) a 65°C durante 2 h.

Masa molecular: calc. [M] 1860,34, exp. [M-H] 1859,21.

Ejemplo 47 Un protocolo para la preparación de oligodesoxirribonucleótidos 5’-d(TTTTTpT), 5’-d(TTTTpTpT), 5’-d(TTTpTpTpT), 5’-d(TTpTpTpTpT), 5’-d(TpTpTpTpTpT)

ÍL

5’-d(GpCpGpCpCpApApApCpA) modificados con grupos 1.3-dimetil-N-fosforilimino-2-imidazolidina (FXVI) usando un sintetizador de ADN automatizado.

Una columna que contiene 5 mg de soporte de 5’-DMTr-dT o de dA CPG (35-110 pmol g-1) se colocó en un sintetizador de ADN y la síntesis de ADN en fase sólida mediante p-cianoetilfosforamidito automatizada se inició a una escala de 0,2 pmol, sustituyendo el tratamiento con hexafluorofosfato de 2-azido-4,5-dihidro-1,3-dimetil-1 H-imidazolio 1 M en acetonitrilo seco para la oxidación con yodo por las posiciones correspondientes (p) dentro de la secuencia.

Los oligonucleótidos se separaron del soporte mediante disolución A durante 12 h a 55°C para el oligonucleótido 5’-d(GpCpGpCpCpApApApCpA), o durante 1 h a temperatura ambiente para oligotimidilatos. En las Figs. 7 y 8 se muestra un RP-HPLC de los oligonucleótidos.

Masas moleculares:

5'-d(TTTTTpT) - calc. [M] 1858,37, exp. [M-H] 1857,57.

5'-d(TTTTpTpT) - calc. [M] 1953,32, exp. [M-H] 1952,57.

5'-d(TTTpTpTpT) - calc. [M] 2048,67, exp. [M+H] 2047,77.

5'-d(TTpTpTpTpT) - calc. [M] 2143,82, exp. [M-H] 2142,77.

5'-d(TpTpTpTpTpT)- calc. [M] 2238,96, exp. [M-H] 2237,97.

5'-d(GpCpGpCpCpApApApCpA) - calc. [M] 3862,38, exp. [M-H] 3860,50.

Referencias

Se citan en el presente documento varias publicaciones con el fin de describir y divulgar de manera más completa la invención y el estado de la técnica a la que pertenece la invención. A continuación se dan las citas completas para estas referencias.

(1) Therapeutic Oligonucleotides, J. Goodchild (ed.), Methods Mol. Biol. 764, Humana Press, 2011.

(2) Bell, N.M.; Micklefield, J. ChemBioChem 2009, 10, 2691.

(3) Mulamba, G.B.; Hu, A.; Azad, R.F.; Anderson, K.P.; Coen, D.M. Antimicrob. Agents Chemother. 1998, 42, 971.

(4) Vinores, S.A. Int. J. Nanomed. 2006, 1,263.

(5) Merki, E.: Graham, M.J.; Mullick, A.E. et al. Circulation 2008, 118, 743.

(6) Duca, M.; Vekhoff, P.; Oussedik, K.; Halby, L.; Arimondo, P.B. Nucl. Acids Res. 2008, 36, 5123.

(7) Nielsen, P.E. Curr. Opin. Mol. Ther. 2010, 12,184.

(8) Zamecnik, P.C.; Stephenson, M.L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978, 75, 280.

(9) Behlke, M.A. Oligonucleotides 2008, 18, 305.

(10) Xu, Z.J.; Yang, L.F.; Sun, L.Q.; Cao, Y. Chin. Sci. Bull. 2012, 57, 3404.

(11) Wilson, C.; Keefe, A.D. Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, 10, 607.

(12) Lee, J.F.; Stovall, G.M.; Ellington, A.D. Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, 10, 282.

(13) Du, L.; Gatti, R.A. Curr. Opin. Mol. Ther. 2009, 11, 116; Pérez, B.; Laura Rodriguez-Pascau, L.; Vilageliu, L.; Grinberg, D.; Ugarte, M.; Desviat, L.R. J. Inherit. Metabol. Disease 2010, 33, 397.

(14) Ruckman, J.; Green, L.S.; Beeson, J.; Waugh, S.; Gillette, W.L.; Henninger, D.D.; Claesson-Welsh, L.; Janjic, N. J. Biol. Chem. 1998, 273, 20556.

(15) Lamond, A.I.; Sproat, B.S. FEBS Lett. 1993, 325, 123.

(16) Chi, K.N.; Eisenhauer, E.; Jones, E.C.; Goldenberg, S.L., Powers, J.; Tu, D.; Gleave, M.E. J. Natl. Cancer Inst. 2005, 97, 1287.

(17) Kaur, H.; Babu, B.R.; Maiti, S. Chem. Rev. 2007, 107,4672.

(18) Jager, A.; Engels, J. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 1437.

(19) Hau, J.F.; Asseline, U.; Thuong, N.T. Tetrahedron Lett. 1991,32, 2497.

(20) Jager, A.; Levy, M.J.; Hecht, S.M. Biochemistry 1988, 27, 7237.

(21) Egholm. M.; Buchardt, O.; Nielsen, P.E.; Berg, R.H. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 1895.

(22) Summerton, J.; Weller, D. Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 1997, 7, 187.

(23) Stein, C.A.; Subasinghe, C.; Shinozuka, K.; Cohen, J.S. Nucl. Acids Res. 1988, 16, 3209.

(24) Patureau, B.M.; Hudson, R.H.E.; Damha, M.J. Bioconjugate Chem. 2007, 18, 421.

(25) Crooke, S.T. Methods Enzymol. 2000, 313, 3.

(26) Behlke, M.A. Oligonucleotides 2008, 18, 305.

(27) Xu, Z.J.; Yang, L.F.; Sun, L.Q.; Cao, Y. Chin. Sci. Bull. 2012, 57, 3404.

(28) Stec, W.J.; Zon, G.; Egan, W.; Stec, B. J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 6077.

(29) Seeberger, P.H.; Caruthers, M.H. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117,1472.

(30) Hall, A.H.; Wan, J.; Spesock, A.; Sergueeva, Z.; Shaw, B.R.; Alexander, K.A. Nucleic Acids Res. 2006, 34, 2773.

(31) Beaucage, S.L.; Caruthers, M.H. Tetrahedron Lett. 1981, 22, 1859.

(32 Sazani, P.; Kang, S.-H.; Maier, M.A.; Wei, C.; Dillman, J.; Summerton, J.; Manoharan, M.; Kole, R. Nucl. Acids Res. 2001,29, 3965.

(33) Froehler, B.; Ng, P.; Matteucci, M. Nucl. Acids Res. 1988, 16, 4831.

(34) Dolinnaya, N.G.; Sokolova, N.I.; Gryaznova, O.I.; Shabarova, Z.A. Nucl. Acids Res. 1988, 16, 3721. (35) Mignet, N.; Gryaznov, S.M. Nucl. Acids Res. 1998, 26, 431.

(36) Letsinger, R.L.; Singman, C.N.; Histand, G.; Salunkhe, M. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 4470.

(37) Summerton, J.; Weller, D. Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 1997, 7, 187.

(38) Dellinger et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 940.

(39) Yamada et al. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 5251.

(40) Krishna, H.; Caruthers, M.H. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 11618.

(41) WO2007/059816 A1 and WO2008/128686 A1.

(42) Summerton, J.; Weller, D. Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 1997, 7, 187.

(43) Mendell, J.; Rodino-Klapac, L.R.; Sahenk, Z.; Roush, K.; Bird, L.; Lowes, L.P.; Alfano, L.; Gomez, A.M.; Lewis, A.; Kota, J. et al. Ann. Neurol. 2013, 74, 637; www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01 396239.

(44) mail.pipelinereview.com/index.php/2014021053402/DNA-RNA-and-Cells/Sarepta-Therapeutics-Announces-Positive-Safety-Results-from-Phase-I-Clinical-Study-of-Marburg-Drug-Candidate.html.

(45) Summerton, J.E. En Peptide Nucleic Acids, Morpholinos and Related Antisense Biomolecules (Janson, C.G.; During, M.J., Eds), 2003, Kluwer Academic/Plenum Publishers, Capítulo 6.

(46) Summerton, J.; Weller, D. Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 1997, 7, 187.

(47) Reese, C.B., Ubasawa, A. Tetrahedron Lett. 1980, 21,2265.

(48) Jones, S.S.; Reese, C.B.; Sibanda, S.; Ubasawa, A. Tetrahedron Lett. 1981,22, 4755.

(49) Swenson, D.L.; Warfield, K.L.; Warren, T.K.; Lovejoy, C.; Hassinger, J.N.; Ruthel, G.; Blouch, R.E.; Moulton, H.M.; Weller, D.D.; Iversen, P.L.; Bavari, S. Antimicrob. Agents Chemother. 2009, 53, 2089; Mellbye, B.M.; Weller, D.D.; Hassinger, J.N.; Reeves, M.D.; Lovejoy, C.E.; Iversen, P.L.; Geller, B.L. J. Antimicrob. Chemother. 2010, 65, 98.

(50) Jearawiriyapaisarn, N.; Moulton, H.M.; Buckley, B.; Roberts, J.; Sazani, P.; Fucharoen, S.; Iversen, P.L.; Kole, R. Mol. Ther. 2008, 16,1624; Wu, B.; Moulton, H.M.; Iversen, P.L.; Juang, J.; Li, J.; Spurney, C.F.; Sali, A.; Guerron, A.D.; Nagaraju, K.; Doran, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105, 14814; Yin, H.; Moulton, H.M.; Seow, Y.; Boyd, C.; Boutilier, J.; Iversen, P.; Wood, M.J.A. Human Mol. Genetics 2008, 17, 3909. (51) McMurry, J.E.; Coppolino, A.P. J. Org. Chem. 1973, 38, 2821.

(52) Alimov, P.I.; Levkova, L.N. Izv. Akad. Nauk SSSR, Ser. Khim. 1964, 1889; Cates, L.A.; Ferguson, N.M. J. Pharm. Chem. 1966, 55, 966.

(53) Rathgeb, P., patente US 4154826 A, fecha de prioridad 30 de diciembre de 1976.

(54) Sherif, F.G., patente US 3634555 A, fecha de prioridad 31 de julio de 1969.

(55) Anatol, J.; Vidalenc, H.; Loiseau, G., patente US 3769406 A, fecha de prioridad 19 de junio de 1970. (56) Lin, W.O.; Guimarates, C.N.; De Souza, J.B.N.; Alt, H.G. Phosphorus Sulfur 1994, 92, 1.

(57) Jager, A.; Levy, M.J.; Hecht, S.M. Biochemistry 1988, 27, 7237.

(58) Sinha, N. D.; Biemat, J.; McManus, J.; Koster, H. Nucleic Acids Res. 1984, 12, 4539.

(59) Xi, S.-K.; Zhao, Y.-F. Synth. Commun. 1990, 20, 3295.

(60) Kitamura, M.; Yano, M.; Tashiro, N.; Miyagawa, S.; Sando, M.; Okauchi, T. Eur. J. Org. Chem. 2011,458. (61) Kokel, B.; Viehe, H. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1980, 19, 716.

(62) Boyd, G. V.; Lindley, P. F.; Mitchell, J. C.; Nicolaou, G. A. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1985, 1522. (63) Garegg, P.J.; Lindh, I.; Regberg, T.; Stawinski, J.; Stromberg, R. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 4051. (64) Atherton, F.R.; Openshaw, H.T.; Todd, A.R. J. Chem. Soc. 1945, 660.

(65) Barnett, R.W.; Letsinger, R.L. Tetrahedron Lett. 1981,22, 991.

(66) Froehler, B. C.; Ng, P. G.; Matteucci, M. D. Nucleic Acids Res. 1986, 14, 5399.

(67) Bezgubenko, L.V.; Pipko, S.E.; Shalimov, A.A.; Sinitsa, A.D. Heteroatom Chemistry 2008, 19, 408.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de Fórmula (I)

en la que:

Z es -O-;

X se selecciona del extremo 5’ de un nucleósido, análogo de nucleósido, oligonucleótido, o análogo de oligonucleótido, e Y se selecciona del extremo 3’ de un nucleósido, análogo de nucleósido, oligonucleótido, o análogo de oligonucleótido; -H, -OH, -SH, -O-PG, S-PG, un enlazador, un monofosfato o difosfato, o un marcador o inactivador;

o

R1 se selecciona de -NR1AR1B, -OR3, -SR3, -H, -S(O)H, -S(O)R3, -S(O)²H, -S(O)²R3, -S(O)²NH², -S(O S(O)²NR³², -alquilo de C¹-¹⁰, -alquenilo de C²-¹⁰, -alquinilo de C²-¹⁰, -arilo de C⁶-¹⁰, o -heteroarilo de C^5-10;

R2 se selecciona de -H, -NR2AR2B, -OR3, -SR3, halógeno, -CN, -S(O)H, -S(O)R3 , -S(O)²H, -S(O)²R3, -S(O)²NH², -S(O)²NHR3, -S(O)²NR³², -alquilo de C¹-¹⁰, -alquenilo de C²-¹⁰, -alquinilo de C²-¹⁰, -arilo de C⁶-¹⁰, o -heteroarilo de C⁵-¹⁰;

en la que cada R1A, R1B, R2A, y R2B se selecciona independientemente de -H, -alquilo de C¹-¹⁰, -alquenilo de C²-¹⁰, -alquinilo de C²-¹⁰, -arilo de C⁶-¹⁰, o -heteroarilo de C^5-10;

opcionalmente en el que R1A y R2A forman juntos una cadena de alquileno o heteroalquileno de 2-4 átomos de longitud; opcionalmente en el que R1A y R1B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros; opcionalmente en el que R2A y R2B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros;

R3 se selecciona de -alquilo de C¹-¹⁰, -alquenilo de C²-¹⁰, -alquinilo de C²-¹⁰, -arilo de C⁶-¹⁰, o -heteroarilo de C^5-10; en la que cada alquilo, arilo, heteroarilo, alquileno o heteroalquileno está opcionalmente sustituido; en la que PG es un grupo protector.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R1 es -NR1AR1B, -OR3, y -SR3.

3. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, en el que R1 es -NR1AR1B.

4. El compuesto según cualquier reivindicación anterior, en el que R2 es -H, -NR2AR2B o -OR3.

5. El compuesto según cualquier reivindicación anterior, en el que R2 es -NR2AR2B.

6. El compuesto según cualquier reivindicación anterior, en el que cada uno de R1A, R1B, R2A, y R2B is se selecciona independientemente de -H y -alquilo C^1-4opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de -F,

-CI, -OH, -alcoxi de C^1-4, -NH², -NH(alquilo C^1-4), y -N(alquilo C1-4)2.

7. El compuesto según la reivindicación 6, en el que R1A, R1B, R2A, R2B son cada uno metilo.

8. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R1A y R2A forman juntos una cadena de alquileno o heteroalquileno de 2-4 átomos de longitud, y R1B y R2B se seleccionan cada uno independientemente de -H y -alquilo de C^1-4.

9. El compuesto de la reivindicación 8, en el que R1A y R2A juntos forman -CH²-CH²- y R1B y R2B se seleccionan cada uno independientemente de -H y metilo.

10. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R1A y R1B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros, opcionalmente una pirrolidina.

11. El compuesto de la reivindicación 10, en el que R2A y R2B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros, opcionalmente una pirrolidina.

12. Un método para sintetizar un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende la conversión de un derivado de ácido fosforoso en un grupo fosfato modificado.

13. Método para sintetizar un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo el método hacer reaccionar un derivado de ácido fosforoso con un derivado de imino HN=CR1R2 o un derivado N-sililado RSi3SiN=CR1R2 en presencia de un oxidante, y opcionalmente un agente sililante y/o una base, en el que RSi es un grupo alquilo o arilo.

14. El método según la reivindicación 13, en el que el derivado de ácido fosforoso es un fosfito o H-fosfonato.

15. El método según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que el oxidante es yodo (I²), bromo (Br²), cloro (Cl²), cloruro de yodo (ICl), N-bromosuccinimida, N-clorosuccinimida, N-yodosuccinimida, tetracloruro de carbono (CCl4), bromotriclorometano (CChBr), tetrabromometano (CBr4), tetrayodometano (CU), yodoformo (CHU), hexacloroetano (C²CU) o hexacloroacetona ((CCh)²CO); opcionalmente en el que el oxidante es yodo (I²).

16. Método para sintetizar un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo el método hacer reaccionar un derivado de ácido fosforoso con una azida orgánica, opcionalmente en presencia de un agente sililante y/o una base.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la azida se selecciona de

en la que cada R1A, R1B, R2A, y R2B se selecciona independientemente de -H, -alquilo de C¹-¹⁰, -alquenilo de C²-¹⁰, -alquinilo de C²-¹⁰, -arilo de C⁶-¹⁰, o -heteroarilo de C^5-10; y/o

opcionalmente en la que R1A y R2A juntos forman una cadena de alquileno o heteroalquileno de 2-4 átomos de longitud; opcionalmente en la que R1A y R2A forman juntos -CH²-CH²-, y R1B y R2B se seleccionan cada uno independientemente de -H y metilo;

o

en la que cada R1A y R1B es independientemente -H o alquilo de -alquilo de C¹-¹⁰opcionalmente sustituido, -alquenilo de C²-¹⁰, -alquinilo de C²-¹⁰, -arilo de C⁶-¹⁰, o -heteroarilo de C^5-10; o R1A y R1B, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo de 5-8 miembros, y R2 se selecciona de -H, -F, -O-PG, Cl, -Br, -I, -CN, -N³, -O-alquilo de C^1-10, -S-PG y -S-alquilo de C^1-10, en los que p G es un grupo protector.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente sililante, en el que opcionalmente el agente sililante es N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (b Sa ), N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), clorotrimetilsilano, bromotrimetilsilano, yodotrimetilsilano, cloruro de trietilsililo, cloruro de trifenilsililo, hexametildisilazano, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (TMSOTf), cloruro de dimetilisopropilsililo, cloruro de dietilisopropilsililo, cloruro de terc-butildimetilsililo, cloruro de terc-butildifenilsililo, cloruro de triisopropilsililo, dimetildiclorosilano, difenildiclorosilano.

19. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que la reacción se lleva a cabo en presencia de una base, en el que opcionalmente una base es trietilamina, N,N-diisopropiletilamina (DIEA), N-metilmorfolina, N-etilmorfolina, tributilamina, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO), N-metilimidazol (NMI), piridina, 2,6-lutidina, 2,4,6-colidina, 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 1,8-bis(dimetilamino)naftaleno (“esponja de protones”), 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN), 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno (TBD), 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]-dec-5-eno (MTBD), 1,1,3,3-tetrametilguanidina (TMG), 2-terc-butil-1,1,3,3-tetrametilguanidina, 2,8,9-trimetil-2,5,8,9-tetraaza-1-fosfabiciclo[3.3.3]-undecano o base de fosfaceno.

20. Un oligonucleótido que tiene al menos un resto fosfato modificado como se muestra en la fórmula I:

en la que:

Z es -O-;

X, Y, R1, R2 son como se describen en la reivindicación 1.

21. Uso, in vitro, de un oligonucleótido según la reivindicación 20, como agente de diagnóstico.

22. Un oligonucleótido según la reivindicación 20 para uso en un método de tratamiento médico.

23. Uso de un oligonucleótido según la reivindicación 20, en la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para uso en el tratamiento de una enfermedad.