KR102126083B1 - 상기생 추출물을 포함하는 피부발진 예방, 치료 또는 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상기생 추출물을 포함하는 피부발진 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 피부발진, 특히 상피 성장 인자 수용체 억제제에 의한 피부발진을 완화하는 효과가 우수하므로, 상피 성장 인자 수용체 억제제의 부작용의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

상기생 추출물을 포함하는 피부발진 예방, 치료 또는 개선용 조성물{Composition for Prevention, Treatment or Improvement of Skin Rash comprising the Loranthus parasiticus Extract}

본 발명은 상기생 추출물을 포함하는 피부발진 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부발진은 피부나 점막에 돋아난 작은 종기를 지칭하는 것으로, 보통 일시적으로 피부가 붉어지면서 염증과 부종을 동반한다. 다양한 질환에서 발진을 동반하며, 대표적으로 홍역, 수두, 농가진 등의 감염 또는 약물에 의한 알레르기에 반응에 의해 피부발진이 나타난다. 다양한 피부발진의 원인 중, 최근 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 억제제의 투여에 의해 발생하는 피부발진이 문제되고 있다.

EGFR은 다양한 고형암에서 높은 수준으로 발현되며, 세포의 증식, 생존, 전이 및 혈관신생의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다(Ciardiello F et al., Eur J Cancer 39:1348-1354). 따라서, 리간드-수용체 결합을 억제하는 단일클론항체 및/또는 타이로신 키나아제 도메인 활성화를 억제하는 작은-분자(small molecules) 등을 사용한 암 치료용 EGFR 억제제의 개발이 진행되고 있다. 그러나, 모든 EGFR 억제제의 사용시 공통적으로 피부발진이 나타나는 것으로 알려져 있다(Lynch TJ, Jr. et al, Oncologist 12:610-621; 및 Li T et al., Target Oncol 4:107-119).

특히, EGFR 억제제 중, 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC) 및 췌장암(pancreatic cancer; PC)에 사용하기 위한, 타세바(Tarceva)® 라는 상품명으로 판매되고 있는 엘로티닙(erlotinib) 투여시, 일반적으로 허리 위쪽에서의 피부발진 부작용이 문제되며, 이는 일반적으로 치료 시작 후 7-10일 내에 발생한다. 부작용의 발생빈도는 NSCLC 및 PC에 대한 엘로티닙 임상시험에서 75%(약 10%의 환자에서는 등급 3-4)로 나타났을 정도로 매우 흔하며, 이러한 부작용은 치료 용량 조절 혹은 치료의 일시적 중단을 야기할 정도로 환자에게 매우 고통스럽다. 그러나, 폐암의 빈도가 전 세계적으로 증가하는 추세이며, 전체 폐암 중 75%가 비소세포성 폐암으로, 국내에서도 높은 빈도로 발생함에 따라, 엘로티닙의 사용 역시 증가하고 있다.

이러한 EGFR 억제제의 부작용으로 발생하는 피부발진을 완화하기 위하여, 스테로이드 연고의 도포 또는 스테로이드 연고와 독시사이클린(doxycycline), 미노사이클린(minocycline)의 도포가 수행되고 있으나, 장기적인 약물투여가 어려워 문제가 된다. 또한, EGFR 억제제의 부작용에 대한 집중적인 연구는 아직까지 거의 이루어지지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 EGFR 억제제의 부작용으로 발생하는 피부발진의 완화에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허공개 제10-2002-0080659호

본 발명의 목적은 상기생(Loranthus parasiticus) 추출물을 포함하는 피부발진 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기생 추출물을 포함하는 피부발진 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 상기생(Loranthus parasiticus) 추출물을 포함하는 피부발진 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, '피부발진'은 피부나 점막에 작은 종기가 발생하는 증상을 의미하며, 염증과 부종이 동반된 피부가 붉어지는 증상을 포함한다. 피부발진은 다양한 원인에 의해 발생하며, 예를 들어, 타세바의 투여에 따른 부작용으로 발생한 것일 수 있다.

MCP-1 및 RNATES는 일반적으로 피부발진에서 증가하는 인자로써, 대식세포에서, 피부발진 사이토카인인 MCP-1 및/또는 RNATES의 분비에 의해 피부발진이 발생할 수 있다. 상기생 추출물은 이러한 MPC-1 및 RNATES의 발현을 억제할 수 있으므로, 피부발진의 완화에 유용하게 활용할 수 있다. 또한, 상기생 추출물은 EGFR 억제 작용에 영향을 미치지 않으므로, EGFR 억제제, 예를 들어, 타세바(엘로티닙)의 약효를 감소시키지 않으면서도, EGFR 억제제에 의해 발생하는 피부발진을 완화할 수 있으므로, EGFR 억제제에 의한 부작용의 예방 또는 치료에 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 상기생을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다. 상기생을 물로 세척하여 이물질을 제거한 후 그늘에서 건조하여 준비한다. 상기생은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 준비된 상기생에 적당한 양의 용매를 첨가하여 저온에서 완전히 침지되도록 하여 추출한다. 이때, 상기생은 건조된 것을 그대로 사용하거나 분쇄하여 분말 형태로 사용할 수 있으며, 용매는 예를 들어, 에탄올을 사용할 수 있다. 저온 추출된 상기생 추출물은 예를 들어, Whatman No.2 필터를 사용하여 2회 여과한 후, 동결 건조하여 분말 형태로 수득될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 피부발진에 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 피부발진의 치료를 위하여 단독으로, 또는 시술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001~1000㎎/kg일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 환제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 등의 고형제제 형태로 투여될 수 있으며, 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물을 분말, 과립, 정제 또는 캅셀 형태로 제형화 할 경우, 이의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 예를 들어, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 규산칼슘, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및/또는 광물유가 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 제제화에 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함하여 조제될 수 있으며, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여 시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 등일 수 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 피부발진은 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 억제제의 부작용일 수 있다.

모든 EGFR 억제제에서 공통적으로 피부발진이 나타나는 것으로 알려져 있다(Lynch TJ, Jr. et al, Oncologist 12:610-621; 및 Li T et al., Target Oncol 4:107-119). 본 발명의 상기생 추출물은 EGFR 억제제의 효능을 감소시키지 않으므로, EGFR 억제제에 의해 발생하는 부작용인 피부발진을 예방 또는 치료하는데 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 상피 성장 인자 수용체 억제제는 엘로티닙(erlotinib)일 수 있다.

엘로티닙은 타세바®라는 상품명으로 판매되는 항암제에 포함되는 유효성분으로, EGFR 억제제 중 하나이다. 타세바 사용시 피부발진이 흔히 나타나며, 심각한 경우, 타세바의 치료 용량 조절 혹은 치료의 일시적 중단을 야기할 정도로 환자에게 매우 고통스럽다. 본 발명의 상기생 추출물은 이러한 타세바의 부작용을 완화할 수 있으므로, 적절한 치료 용량을 유지할 수 있도록 할 수 있을 뿐만 아니라, 환자의 삶의 질 개선에 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 상기생 에탄올 추출물을 헥세인(hexane) 용매로 분획하여 수득된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 상기생 에탄올 추출물을 헥세인 용매로 분획하고 남은 물층(water layer)을 염화메틸로 분획한 다음, 잔류한 물층을 아세트산 에틸(ethyl acetate) 용매로 분획하여 수득된 것일 수 있다.

본 발명의 상기생 에탄올 추출물의 헥세인 분획물, 헥세인 분획 후 남은 물층의 염화메틸 분획물 및 염화메틸 분획 후 남은 물층의 아세트산 에틸 분획물에 피부발진에 활성을 나타내는 유효성분이 다량 함유되어 있으며, 그 중, 헥세인 분획물 및 아세트산 에틸 분획물이 낮은 세포 독성을 나타내므로, 피부발진의 예방 또는 치료에 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 상기생 에탄올 추출물을 헥세인 용매로 분획한 것을 아세토니트릴(acetonitrile) 용매로 용리하여 수득된 것일 수 있다.

헥세인 용매로 분획한 상기생 에탄올 추출물을 아세토니트릴 용매로 용리할 경우, 용리된 물질은 MCP-1 발현 억제 활성이 우수하다. 한편, 40%의 아세토니트릴을 사용할 경우, 가장 낮은 세포독성을 나타낸다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 상기생 에탄올 추출물을 헥세인 용매로 분획하고 남은 물층(water layer)을 염화메틸로 분획한 다음, 잔류한 물층을 아세트산 에틸(ethyl acetate) 용매로 분획한 것을 메탄올 용매로 용리하여 수득된 것일 수 있다.

헥세인 용매로 분획하고 남은 물층(water layer)을 염화메틸로 분획한 다음, 잔류한 물층을 아세트산 에틸(ethyl acetate) 용매로 분획한 상기생 에탄올 추출물을 메탄올 용매로 용리할 경우, 30% 또는 50% 메탄올을 사용하여 용리된 물질은 우수한 MCP-1 발현 억제 활성을 나타낸다. 한편, 30% 내지 70%의 메탄올을 사용한 경우, 세포독성이 거의 나타나지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 상기생은 한국산일 수 있다.

한국산 상기생의 피부발진 완화 효과가 중국산 상기생의 효과보다 약 2배 이상 우수하다.

본 발명의 다른 양상은 상기생 추출물을 포함하는 피부발진 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기생 추출물은 MPC-1 및 RNATES의 발현을 억제할 수 있으므로, 피부발진을 개선하기 위하여 유용하게 활용할 수 있다. 또한, 상기생 추출물은 EGFR 억제 작용에 영향을 미치지 않으므로, EGFR 억제제, 예를 들어, 타세바(엘로티닙)의 약효를 감소시키지 않으면서도, EGFR 억제제에 의해 발생하는 피부발진을 완화할 수 있으므로, EGFR 억제제에 의한 부작용의 개선에 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속 이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 일반적으로 사용되는 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화장료 조성물은 화장수, 젤, 로션, 연고, 크림, 팩, 에멀젼, 에센스, 패치 및 분무제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 예를 들어, 용액, 젤, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구, 이온형(리포좀) 또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱 등의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 상기생 추출물을 포함하는 피부발진 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 따르면, 피부발진, 특히 상피 성장 인자 수용체 억제제에 의한 피부발진을 완화하는 효과가 우수하므로, 상피 성장 인자 수용체 억제제의 부작용의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 상기생 추출물이 대식세포에 나타내는 세포독성을 평가한 세포 생존력을 나타낸 그래프이다.
도 2는 상기생 추출물이 대식세포에서 타세바에 의한 피부발진 면역인자인 MCP-1의 발현에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 양성대조군으로는 1 μM의 사이클로스포린 A(CsA)을 사용하였다.
도 3은 상기생 추출물이 대식세포에서 타세바에 의한 피부발진 면역인자인 RANTES의 발현에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 양성대조군으로는 1 μM의 사이클로스포린 A(CsA)을 사용하였다.
도 4는 상기생 추출물이 대식세포의 이주에 미치는 영향을 나타낸 현미경 사진으로, 상기생은 100, 200 또는 300㎍/㎖ 농도로 처리하였으며, 각각 상 100, 상 200 및 상 300에 해당한다.
도 5는 상기생 추출물이 대식세포의 이주에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 폐암세포주인 A549 세포에서, EGF와 타세바에 의한 EGF 수용체(EGFR)의 활성(인산화)에 대한 상기생 추출물의 영향을 나타낸 것으로, 타세바 1μM, EGF 100ng/㎖ 및/또는 상기생 300㎍/㎖를 처리하였다.
도 7은 피부각질세포주인 HaCat 세포에서 EGF와 타세바에 의한 EGF수용체(EGFR)의 활성(인산화)에 대한 상기생 추출물의 영향을 나타낸 것으로, 타세바 1μM, EGF 100 ng/㎖, 및/또는 상기생 300㎍/㎖을 처리하였다.
도 8은 대식세포주인 Raw264.7 세포에서 EGF와 타세바에 의한 EGF수용체(EGFR)의 활성(인산화)에 대한 상기생 추출물의 영향을 나타낸 것으로, 타세바 1μM, EGF 100 ng/㎖, 및/또는 상기생 300㎍/㎖을 처리하였다.
도 9는 상기생 추출물의 유기용매 분획과정을 나타낸 모식도이다.
도 10은 상기생 추출물의 각 유기용매의 순차적 분획물(BuOH, EA, H₂O, hexane 및 MC)에 대한 HPLC 분석의 광 다이오드 어레이(photo diode array: PDA) 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 상기생 추출물의 각 유기용매의 순차적 분획물에 대한 HPLC 분석의 MS 크로마토그램(chromatogram) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 상기생 추출물의 유기용매의 순차적 분획물에 대한 MCP-1 발현 억제능을 (A) 각 용매에 의한 분획물 100㎍/㎖에 대하여 비교한 그래프 및 각 용매에 의한 분획물((B) 헥세인(Hex), (C) 염화메틸(methylchoride: MC), (D) 아세트산 에틸(ethyl acetate: EA), (E) 부탄올(buthanol: BuOH) 및 (F) 물(water))의 농도(1, 10, 25 및 50㎍/㎖)에 따라 나타낸 그래프이다.
도 13은 상기생 추출물의 유기용매의 순차적 분획물에 대한 세포독성을 각 용매((A) 헥세인(Hex), (B) 염화메틸(methylchoride: MC), (C) 아세트산 에틸(ethyl acetate: EA), (D) 부탄올(buthanol: BuOH) 및 (E) 물(water))에 따라 나타낸 그래프이다.
도 14는 상기생 추출물의 헥세인 분획물에 대한 아세토니트릴(acetonitrile: ACN)의 각 농도별((A) 40%, (B) 60%, (C) 80% 또는 (D) 100%) 용리 물질의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 15는 상기생 추출물의 헥세인 분획물에 대한 아세토니트릴(acetonitrile: ACN)의 각 농도별((A) 40%, (B) 60%, (C) 80% 또는 (D) 100%) 용리 물질의 MCP-1 발현 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 16은 상기생 추출물의 아세트산 에틸(EA) 분획물에 대한 각 농도별 메탄올(MeOH)((A) 0%(물), (B) 30%, (C) 50%, (D) 70% 또는 (E) 100%) 또는 (F) 아세톤 용리 물질의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 17은 상기생 추출물의 아세트산 에틸(EA) 분획물에 대한 30, 50, 70% 메탄올 용리 물질의 MCP-1 발현 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 18은 상기생 추출물의 아세트산 에틸 분획물에 각 농도별 메탄올(0%(물), 30%, 50%, 70% 또는 100%) 또는 아세톤 용리 물질의 HPLC 분석에 대한 MS 크로마토그램(chromatogram) 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 상기생 추출물의 아세트산 에틸 분획물에 대한 물, 각 농도별 메탄올(0%(물), 30%, 50%, 70% 또는 100%) 또는 아세톤 용리 물질의 MS 크로마토그램(chromatogram) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명에서 사용한 한국산 상기생(A) 및 중국산 상기생(B)의 사진이다.
도 21은 한국산 상기생 추출물과 중국산 상기생 추출물의 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 22는 한국산 상기생 추출물과 중국산 상기생 추출물의 MCP-1 발현 억제능을 비교한 그래프이다.

이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 상기생 추출물의 제조

상기생은 초원한방플러스(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 다진 상기생 3㎏을 70% 에탄올 10ℓ에 3일간 침지하여 추출한 후, Whatman No.2 필터(Maidstone, UK)로 여과하였다. 여과된 상기생 추출물에 70% 에탄올 10ℓ를 첨가하여 3일 동안 다시 저온 추출한 후, Whatman No.2 필터로 추출물을 여과하였다. 그 다음, 추출물을 회전 증발기(Buchi, Switzerland)에서 60℃의 감압하에, 총 20ℓ의 추출 용액을 증발시킨 후, 동결 건조하여 총 584.78g의 추출물을 수득하였고, 이때의 수율은 19.5%로 확인되었다. 분말은 -80℃에서 보관하였고, 사용시에는 증류수로 희석한 후, 0.45㎛ 필터에 여과하여 사용하였다.

실시예 2. 대식세포에 대한 상기생 추출물의 세포독성 평가

대식세포를 통한 세포실험을 수행하기 위하여 상기생 추출물이 대식세포에 나타내는 독성을 평가하였다.

구체적으로, 96-웰 플레이트에 2×10⁵ cells/㎖의 RAW264.7 대식세포주(한국세포주은행, 서울, 한국)를 100㎕씩 분주하고, 하루 배양한 후, 실시예 1에서 제조한 상기생 추출물을 1, 10, 100, 200 또는 300 ㎍/㎖의 농도로 각 웰에 처리하고, 37℃의 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 최종농도가 5㎎/㎖이 되도록 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(Sigma) 용액을 각 웰에 넣은 다음, 배양기에서 4시간 동안 반응시키고, MTT 용액을 제거한 후, DMSO 100㎕를 넣어 교반하였다. 완전히 교반되면, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)(Molecular Device, Sunnyvale, Cam USA)를 이용하여 570㎚에서 UV 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(％)은 상기생 추출물을 처리하지 않은 정상대조군의 흡광도값에 대한 백분율로 나타냈다.

그 결과, 300㎍/㎖ 이하의 상기생 추출물을 처리한 경우, 대조군 대비 80% 이상의 세포 생존율을 확인하였다(도 1). 따라서, 이후 대식세포에 대한 상기생 추출물의 최고투여농도를 300㎍/㎖로 설정하고, 이보다 낮은 농도에서 상기생 추출물의 효과를 평가하였다.

실시예 3. 피부발진 사이토카인 발현에 대한 상기생 추출물의 활성 평가

MCP-1 및 RNATES는 일반적으로 피부발진에서 증가하는 인자로써 알려져 있다. 따라서, 대식세포에서, LPS(lipopolysaccharide)에 의해 증가하는 피부발진 사이토카인인 MCP-1 및 RNATES의 분비에 미치는 상기생 추출물의 활성을 평가하였다.

구체적으로, 24-웰 플레이트에 2×10⁵ cells/㎖의 RAW264.7 대식세포를 500㎕씩 접종하고, 실시예 1에서 제조한 상기생 추출물을 농도별(10, 50, 100, 200 또는 300㎍/㎖)로 처리하였다. 그 후, 0.5ng/㎖의 LPS를 처리하고, 37℃의 5% CO₂의 조건에서 18 내지 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포배양액으로 분비된 MCP-1과 RANTES의 양을 제조사의 설명서에 따라 표 1의 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.

구분	ELISA 키트	Cat#	제조사
MCP-1	Mouse CCL2/JE/MCP-1 DuoSet ELISA	DY479	R&D systems, Minneapolis, MN, USA
RANTES	Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA	DY479

양성대조군으로는 1μM의 사이클로스포린(cyclosporine) A를 사용하였으며, MCP-1 및 RANTES의 농도는 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

그 결과, 상기생 추출물은 농도의존적으로 MCP-1(도 2)와 RANTES(도 3)의 분비를 억제하였으며, 이를 통하여, 상기생 추출물의 면역조절에 의한 피부발진 효능을 확인하였다.

실시예 4. 면역세포 활성화에 대한 상기생 추출물의 활성 평가

대식세포의 과활성화는 피부발진을 유발하는 요인으로 알려져 있다. 따라서, 면역세포의 활성화지표 가운데 하나인 이주(transmigration) 활성을 측정하였다.

구체적으로, 트렌스웰(transwell)(Corning)의 상부 챔버 막의 하부 표면을 미리 콜라겐으로 코팅하고 완전히 건조시킨 후, 6×10⁵ cells/㎖의 농도로 무혈청 배지에 함유된 Raw264.7 세포주를 각 웰당 150㎕씩 분주하였다. 하부 챔버에 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지 500㎕를 넣은 후, 상부 챔버에 실시예 1에서 제조한 상기생 추출물을 각각 100, 200 및 300㎍/㎖로 처리하고, 하부 챔버에 100ng/㎖의 MCP-1을 처리하여 대식세포가 하단부로 이동하도록 하였다. 그 후, 세포 배양기에서 1일 동안 37℃의 5% CO₂조건에서 배양한 다음, 인서트(insert) 상부의 세포를 면봉으로 조심스럽게 제거하였다. 인서트 반대편으로 이동한 세포를 70% 에탄올로 10분간 고정시킨 후, 0.1% 크리스탈 바이올렛(Crystal violet)으로 10분 동안 염색하였다. 그 후, 깨끗해질 때까지 증류수로 세척하고 완전히 건조시킨 다음, 건조된 막을 현미경으로 촬영하였다.

그 다음, 33% 아세트산을 사용하여 세포를 용해시키고, 96-웰 플레이트에 200㎕씩 분주한 후, 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여, 570nm 파장에서 흡광도를 측정한 다음, 상대 흡광도를 계산하였다.

그 결과, 현미경상에서 어두운 점들은 대식세포들로 반대편 막에서 활성화되어 이주해온 세포들로, 대조군은 MCP-1을 투여에 의해 이주가 증가되어 정상군에 비해 검은 점들이 더 많은 것을 확인하였다. 반면, 상기생 추출물이 처리된 세포(상 100, 상 200 및 상 300)에서는 검은 반점들이 감소하여 이주의 정도가 상당량 감소하였음을 확인하였다(도 4). 또한, 흡광도 분석에 의해서도 이주한 세포가 상대적으로 감소하였음을 확인였다(도 5).

즉, 막 건너편으로 이주하는 대식세포들의 활성이 상기생에 의해 억제되고 있음을 확인하여, 상기생 추출물의 대식세포 억제 활성을 확인하였다.

실시예 5. 엘로티닙 신호전달에 대한 상기생 추출물의 영향 평가

EGFR의 인산화를 측정하여, 상기생 추출물이 엘로티닙(erlotinib)을 유효성분으로 포함하는 타세바(Tarceva)®의 항암작용에 중요한 역할을 하는 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR)의 활성 억제에 미치는 영향을 평가하였다.

구체적으로, A549 폐암세포주(타세바 표적 세포)(한국세포주은행, 서울, 한국)(도 6), HaCat 각질세포주(타세바 작용세포)(한국세포주은행, 서울, 한국)(도 7) 및 RAW264.7 대식세포주(도 8)를 2×10⁵ cells/㎖로 각각 준비하고, 6-웰 플레이트에 각 웰당 2㎖를 분주한 다음, 37℃의 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 다음날 실시예 1에서 제조한 상기생 추출물 300㎍/㎖으로 1시간 동안 전처리한 다음, 1μM의 타세바(엘로티닙)를 처리하고, 16시간 동안 배양하였다. 그 후, 100ng/㎖의 표피성장인자(epidermal growth factor: EGF)를 10분 동안 처리한 다음, 차가운 인산완충식염수(phosphate buffer saline: PBS)로 2회 세척하였다. 프로테아제 억제제 칵테일과 인산염 억제제 칵테일(Sigma, St. Louis, USA)을 보충한 RIPA(Radioimmunoprecipitation assay) 버퍼 120㎕를 넣고, 얼음에서 30분간 방치한 후, 4℃에서 20분 동안 13,000rpm으로 원심 분리하여 상등액을 수득하였다.

상등액에 포함된 단백질은 BCA(Bicinchoninic acid assay)(INTRON, Korea) 방법으로 정량하였다. 각 레인당 30㎍의 단백질을 10% SDS-PAGE에서 전기영동하고 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 그 후, 1차 항체(phospho EGFR(1:1,000)(Cell signaling technology Inc.), EGFR(1:1,000)(Cell signaling technology Inc.) 및 β-actin(1:100,000)(Sigma))를 첨가하고, 5% 탈지유가 첨가된 TBST와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, TBST로 각각 10분 동안 3회 세척한 후, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(Cell signaling technology Inc.)와 일정 시간 동안 반응시켰다. Amersham ECL Select Western blotting detection reagent(GE healthcare) 시약을 PVDF 멤브레인에 제공하여 나타나는 광반응을 Gel-Doc system(Bio-Rad)을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 폐암세포주와 각질세포에서 EGF에 의해 활성화된 EGFR을 타세바가 억제하였고, 상기생 추추물은 이러한 타세바의 EGFR 억제 작용에 거의 영향을 나타내지 않았으며, 대식세포는 EGF에 대해 반응하지 않음을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 상기생 추출물은 타세바의 효력을 억제하거나 무력화시키지 않으면서도 피부발진을 개선할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6. 상기생 추출물 분획물의 피부발진 개선 효과 확인

6-1. 상기생 추출물 분획물의 제조

유기용매를 이용하여 상기생 추출물의 분획을 실시하였다.

구체적으로, 실시에 1에서 제조한 상기생 추출물의 동결 건조 분말(544.92 g)을 1ℓ의 증류수에 현탁시킨 다음, 도 9에 나타낸 바와 같이 용매 분획하여 각 분획물을 수득하였다. 증류수에 현탁된 상기생 추출물에 동량의 헥세인(hexane: Hex)을 첨가하고, 잘 교반한 다음, 두 용매 층이 서로 분리되도록 놓아 두었다. 하부 물층을 회수하고, 상부의 헥세인 층을 동결 건조하여 46.16g의 건조 분말(Hexane ext.)을 얻었다. 분리된 물층(aqua layer)을 1ℓ의 염화메틸(methylchoride: MC)과 다시 혼합하고, 두 층이 잘 분리되도록 놓아두었다. 하부 물층을 회수하고, 상부의 염화메틸 층을 동결 건조하여 3.89g의 건조 분말(CH₂CL₂ ext.)을 얻었다. 동일한 방법으로 아세트산 에틸(ethyl acetate: EA)과 부탄올(butanol)을 이용하여 순차적으로 분획을 실시하여, 아세트산 에틸 분획 건조 분말 9.54g(EtOAc ext.), 부탄올 분획 건조 분말 68.68g(BuOH ext.) 및 최종 물층으로부터 341.24g의 분획물을 수득하였다.

LC/MS 분석은 ABsciex Triple Tof 5600+(Sciex, USA)와 Dionex 고압액체크로마토그래피(ultra-high pressure liquid chromatography system)(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 수행하였다. 크로마토그래피를 이용한 분석은 ACQUITY UPLC® BEH C18 column(2.1 × 150mm, 1.7μm, Waters Co., Milford, MA, USA) 컬럼을 사용하였으며 40℃에서 이동상 A(water)와 이동상 B(0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴)를 사용하여 0.4㎖/min의 flow rate로 분획하였다. 초기 농도 구성은 95%A/5%B를 1분동안 유지하다가 20분까지 80%B로 증가시킨 뒤 24분까지 0%A로 낮춘 뒤 3분 동안 유지하였다. 컬럼 재사용을 위한 세척은 초기 농도구배 조건으로 3분 동안 평형을 이루게 하였다. 광 다이오드 어레이(photodiode array: PDA)를 사용하여 200 내지 500nm의 파장 영역에서 검출되는 물질들을 측정하였다(도 10). 데이터-의존 이중질량분석기(data-dependent tandem mass spectrometry)(MS/MS) 분석은 Peakview system에서 제공되는 menu-driven 소프트웨어를 사용하여 조절하였다(도 11). 모든 분석은 automatic gain control condition으로 수행하였다.

그 결과, 유기용매 분획으로 상기생의 주요성분들이 분리된 것을 확인하였으며, 특히, 헥세인 층이 다른 층에 비해 늦은 체류 시간(retention time)의 물질을 많이 포함하는 것을 확인하였다(도 10 및 도 11).

6-2. 상기생 추출물 분획물의 세포독성 평가

실시예 6-1에서 제조한 상기생 추출물 분획물 중, 실시예 6-2에서 MCP-1의 발현 억제 활성이 우수한 것으로 확인된 MC, 헥세인 및 EA 유기용매 분획물의 세포독성을 평가하였다.

구체적으로, 실시예 6-2에서 MCP-1의 발현 억제 활성이 우수한 것으로 확인된 MC, 헥세인 및 EA 유기용매 분획물을 10㎍/㎖ 단위로 10㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖의 농도로 각 웰에 처리한 것 외에는 실시예 2와 동일한 방법으로 세포 독성을 평가하였다.

그 결과, MC 분획물은 강력한 세포독성을 나타낸 반면, 헥세인 분획물 및 EA 분획물은 낮은 세포독성을 나타냄을 확인하였다(도 12). 따라서 이후 상기생 추출물의 유기용매 분획물에 대한 활성은 세포독성의 평가 결과를 바탕으로 50 ㎍/㎖의 농도 이내에서 활성을 측정하였다.

6-3. MCP-1 발현에 대한 상기생 추출물 분획물의 활성 평가

실시예 6-1에서 제조한 상기생 추출물 분획물 중 유효성분을 포함하는 유기용매 분획물을 확인하기 위하여 MCP-1의 발현 억제 활성을 평가하였다.

구체적으로, RAW264.7 대식세포에 LPS를 투여한 뒤, 실시예 6-1 에서 제조한 상기생 추출물 분획물을 농도별(1, 10, 25 또는 50 ㎍/㎖)로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포배양액으로 분비된 MCP-1의 양을 실시예 3의 ELISA 방법으로 측정하였다.

그 결과, MC층에서 가장 강력한 MCP-1의 발현 억제 활성이 나타나며, 헥세인 층 및 EA에서도 MCP-1의 발현 억제 활성을 확인하였다(도 13). 그러나, MC층은 세포독성이 강하게 나타나 MCP-1의 발현을 억제하는 것으로 보여졌다. 반면, 헥세인 층과 EA 층은 세포독성이 거의 나타나지 않았다. 따라서, 이후 실시예에서는, 헥세인 분획물 및 EA 분획물에 대한 피부발진 개선 효과를 확인하였다.

6-4. 헥세인 분획물에 대한 아세토니트릴 용리 물질의 세포독성 및 MCP-1 발현 억제 활성 평가

강한 MCP-1 발현억제 효능을 나타낸 헥세인 분획물에 대하여 이온교환크로마토그래피(HP-20)에 의해 추가로 아세토니트릴 용리 물질을 수득하였다. 실시예 6-1에서 제조한 상기생 추출물의 헥세인 분획물에 대하여, HP-20 수지(Mitsubishi)를 크로마토그래피 칼럼(10×40cm)에 충전한 후, 증류수에 현탁시킨 헥세인 분획물을 부어 흡착시켰다. 충분한 용매를 흘려 흡착되지 않은 물질을 완전히 제거한 후, 아세토니트릴(acetonitrile: ACN)의 농도를 증가시키고, 흡착된 물 용리액(adsorbed water elution)을 제거하였다. 아세토니트릴은 40, 60, 80 및 100% 농도로 내보냈으며, 컬럼이 더 이상 분별을 하지 않을 때까지 용리하였다. 이후, 수득된 용리 물질의 세포독성 및 MCP-1 발현 억제 활성을 평가하였다.

구체적으로, 40%, 60%, 80% 또는 100% 농도의 아세토니트릴로 용리하여 수득된 물질을 각각 처리한 것 외에는 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 세포독성을 평가한 결과, 40%의 아세토니트릴에서 용리된 물질은 세포독성이 100㎍/㎖에서 거의 나타나지 않았으나 60%, 80%, 100%의 아세토니트릴에서 용리된 물질은 10㎍/㎖ 이상의 농도에서 세포독성이 나타남을 확인하였다(도 14).

또한, RAW264.7 대식세포에 LPS를 투여한 뒤, 40%, 60%, 80% 또는 100% 농도의 아세토니트릴로 용리하여 수득된 물질을 농도별(1, 2, 4 또는 6㎍/㎖)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포배양액으로 분비된 MCP-1의 양을 실시예 3의 ELISA 방법으로 측정한 결과, 모든 용리 물질에서 강력한 MCP-1 발현 억제 활성을 확인하였다(도 15).

6-5. EA 분획물에 대한 메탄올 용리 물질의 세포독성 및 MCP-1 발현 억제 활성 평가

헥세인 분획물 다음으로 강한 MCP-1 발현억제 효능을 나타낸 EA 분획물에 대하여 이온교환크로마토그래피에 의해 추가로 메탄올 용리 물질을 수득하였다. 실시예 6-1에서 제조한 상기생 추출물의 EA 분획물에 대하여, HP-20 수지(Mitsubishi)를 크로마토그래피 칼럼(10×40cm)에 충전한 후, 증류수에 현탁시킨 EA 분획물을 부어 흡착시켰다. 충분한 용매를 흘려 흡착되지 않은 물질을 완전히 제거한 후, 메탄올의 농도를 증가시키고, 흡착된 물 용리액(adsorbed water elution)을 제거하였다. 메탄올은 30, 50, 70 및 100% 농도로 내보냈으며, 컬럼이 더 이상 분별을 하지 않을 때까지 용리하였다. 마지막으로, 모든 물질을 회수하기 위해 아세톤으로 씻어 내고 용리액을 받아내었다. 사용하기 전까지 동결 건조 후, 각 분획을 -80℃에서 보관하였다. 이후, 수득된 용리 물질의 세포독성 및 MCP-1 발현 억제 활성을 평가하였다.

구체적으로, 30%, 50%, 70% 및 100% 농도의 메탄올, 및 아세톤으로 용리한 물질을 각각 처리한 것 외에는 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 세포독성을 평가한 결과, 30%, 50%, 70% 메탄올 용리 물질은 세포독성이 100 μg/ml 이하의 농도에서는 80% 이상 나타나 거의 세포독성이 없음을 확인하였다. 반면 100% 메탄올 용리 물질 및 아세톤 용리 물질은 50 μg/ml 이상의 농도에서 매우 강력한 세포독성을 나타냄을 확인하였다(도 16). 따라서 이후 상기생 추출물 용리 물질에 대한 활성평가는 세포독성의 결과를 바탕으로 농도를 정하여 확인하였다.

상기생 추출물 EA 분획물 용리물질에 대한 활성을 평가하기 위하여, RAW264.7 대식세포에 LPS를 투여한 뒤, 30%, 50%, 70% 및 100% 농도의 메탄올, 및 아세톤으로 용리한 물질을 농도별(1, 10, 25 또는 50㎍/㎖)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포배양액으로 분비된 MCP-1의 양을 실시예 3의 ELISA 방법으로 측정한 결과, 30% 및 50% 메탄올 용리 물질에서 약한 MCP-1 억제 활성을 확인하였다(도 17).

위의 결과를 바탕으로 상기생 EA 분획물의 메탄올 용리 물질에 대한 HPLC 분석을 실시예 6-1과 같은 방식으로 분석하였으며, 각 메탄올 농도별 화합물의 구성 패턴은 PDA 및 MS 방법으로 분석하여 확인하였다.

PDA 분석 결과, 상기생 EA 분획물에 대한 메탄올 용리 물질은 메탄올 농도가 증가함에 따라 늦은 체류 시간의 물질이 주로 분획되는 것을 확인하였다(도 18). 또한, MS 분석 결과에서도 메탄올 용리과정에 의해 상기생 성분들이 분리되었음을 확인하였다(도 19).

실시예 7. 대식세포의 생장에 대한 중국산 상기생 및 한국산 상기생 추출물의 세포 독성 및 MCP-1 억제 활성 비교

한국산 상기생(도 20A, 강원도 정선군)과 중국산 상기생(도 20B, 중국 원난성) 추출물이 대식세포의 생장에 미치는 효능을 비교하였다.

구체적으로, 실시예 1의 방법으로 제조한 한국산 상기생 및 중국산 상기생 상기생 추출물을 10, 100, 500 및 1000㎍/㎖의 농도로 처리한 것 외에는 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 세포독성을 평가한 결과, 300㎍/㎖ 까지는 대조군 대비 80% 이상의 세포 생존력을 보여, 한국산 상기생 및 중국산 상기생은 비슷한 세포독성을 나타냄을 확인하였다(도 21).

한편, 실시예 1의 방법으로 제조한 한국산 상기생 추출물 및 중국산 상기생 추출물을 200㎍/㎖의 농도로 처리한 것 외에는 실시예 3의 방법과 동일한 방법으로 MCP-1 억제 활성을 평가한 결과, 중국산 상기생 대비 한국산 상기생의 MCP-1 억제 활성이 우수한 것을 확인하였다(도 22).

이를 통하여, 한국산 상기생의 피부발진 억제 활성이 중국산 상기생에 비해 탁월함을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

1. 피부발진 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서,
   상기 조성물은 상기생(Loranthus parasiticus) 에탄올 수용액 추출물을 헥세인(hexane) 용매로 분획하여 수득된 것을 포함하고,
   상기 피부발진은 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 억제제의 부작용인 것인
   피부발진 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 상피 성장 인자 수용체 억제제는 엘로티닙(erlotinib)인 것인 피부발진 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 상기생 에탄올 수용액 추출물을 헥세인 용매로 분획한 것을 아세토니트릴(acetonitrile) 용매로 용리하여 수득된 것인 피부발진 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1 항에 있어서, 상기 상기생은 한국산인 것인 피부발진 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
10. 피부발진 개선용 화장료 조성물에 있어서,
    상기 조성물은 상기생(Loranthus parasiticus) 에탄올 수용액 추출물을 헥세인(hexane) 용매로 분획하여 수득된 것을 포함하고,
    상기 피부발진은 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 억제제의 부작용인 것인
    피부발진 개선용 화장료 조성물.

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