KR102110956B1 - 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디 cey2 변이 균주 및 이의 용도 - Google Patents

글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디 cey2 변이 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 자외선을 조사하여 개발한 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주를 제공함으로써, 글리코겐을 대량 생산할 수 있으며, 이를 이용하여 글리코겐 생산용 미생물 제제, 동물 사료 조성물, 건강보조식품, 프로바이오틱스 제제 등을 개발할 수 있으므로, 이와 관련된 산업에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주 및 이의 용도{Saccharomyces boulardii CEY2 mutant strain having high productivity of glycogen and uses thereof}
본 발명은 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
글리코겐(glycogen)은 동물의 체내에 널리 존재하는 저장 다당류의 하나로, 간이나 근육에 존재하며 세포질 속에서 물에 불용상태인 과립으로 존재하며, 간에는 2~10%, 근육에는 1~2%의 중량을 차지하고 있다. 간이나 근육의 글리코겐은 혈액 중의 포도당 값(혈당치)이나 운동량 등에 따라 변한다. 혈당치가 상승하면 글리코겐의 합성이 촉진되고, 혈당치가 저하하면 글리코겐의 분해가 촉진된다. 이에 의해 혈당치가 일정하게 유지되기 때문에 생리적 의의는 높다. 간에서 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate, G-6-P)은 효소 포스파타아제의 작용으로 인산기가 분리되고 포도당은 혈중에 방출된다. 근육에는 이 포스파타제가 없다. 그 때문에 근육의 글리코겐은 혈당치 상승에 기여하지 않는다. 근육에서는 운동에 의해 글리코겐이 분해되어 G-6-P가 생성되나 그것은 근육세포에서만 이용될 뿐이다.
글리코겐의 합성 또는 분해에는 2개의 제어메커니즘이 알려졌다. 한 개는 호르몬에 의한 제어와 그 외의 글리코겐의 합성 또는 분해에 관여하는 효소로 작용하는 여러 가지 물질에 의한 제어이다. 호르몬으로는 인슐린이나 피질 코르티코이드는 글리코겐의 합성에, 아드레날린(adrenaline)이나 글루카곤(glucagon)은 글리코겐의 분해에 작용한다. 또 다른 물질에 의한 것으로서는 Ca2 ＋나 cAMP(cyclic adenosine-3' ,5'-monophosphate, cyclic AMP)가 있고, 그들이 글리코겐의 합성 또는 분해에 관여하는 효소의 구조를 바꿔 조절하고 있다. 이를 입체성(allosteric) 조절메커니즘이라 한다.
글리코겐의 구조는 포도당 분자가 나뭇가지 모양으로 결합되어 있다. 그와 같은 의미로 글리코겐을 식물 전분이라고도 한다. 분자량은 백만 내외이다. 구조는 포도당 분자가 α-1,4 배당체(glycoside) 결합을 하여 10여 개 연속해있는 곳에 α-1,6 배당체 결합으로 다른 포도당 분자가 결합되고 거기에서 다시 α-1,4 배당체 결합으로 포도당 분자가 결합되어 글리코겐은 나뭇가지 모양을 하게 된다. 이 구조는 아밀로펙틴(amylopectin)과 유사하나 가지의 수는 글리코겐이 더 많고 가지의 길이는 더 짧다. 요오드 반응에서는 전분이 보라색 또는 적자색을 보이는 데 대하여 글리코겐은 적색 또는 갈색을 나타낸다.
한편, 한국공개특허 제2010-0095829호에는 '글루타치온을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애의 돌연변이체 및 이를 배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1704212호에는 '젖산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주 및 이의 용도에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 자연계로부터 분리한 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) 모균주에 돌연변이원(mutagen)인 자외선을 처리하여 개발한, 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주가 모균주에 비해 글리코겐 생산량이 현저하게 우수하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18749P이며, 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) CEY2 변이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 글리코겐 생산용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 동물 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 글리코겐의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 자외선을 조사하여 개발한 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주를 제공함으로써, 글리코겐을 대량 생산할 수 있으며, 이를 이용하여 글리코겐 생산용 미생물 제제, 동물 사료 조성물, 건강보조식품, 프로바이오틱스 제제 등을 개발할 수 있으므로, 이와 관련된 산업에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 자외선을 이용한 사카로마이에스 보울라디(Saccharomyces boulardii) 모균주를 대상으로 돌연변이 균주 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 사카로마이에스 보울라디 CEY2 변이 균주로부터 생산된 글리코겐 함량을 측정하여 나타낸 그래프이다. 26는 최종 선발한 사카로마이에스 보울라디 CEY2 변이 균주이며, 13, 14, 19 및 28은 사카로마이에스 보울라디 변이 균주로서 비교 대조구이며, control은 사카로마이에스 보울라디 모균주이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18749P이며, 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) CEY2 변이 균주를 제공한다.
상기 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주는 사카로마이세스 보울라디 모균주에 돌연변이원(mutagen)인 자외선을 처리하여 돌연변이를 유발하고, 글리코겐 생산 능력을 확인하여 선발한 것이다. 상기 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2018년 11월 23일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC18749P).
본 발명에 따른 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주는 모균주가 18.44mg/g의 글리코겐을 생산하는데 반해, 동일 배양 조건에서 23.34mg/g의 글리코겐을 생산하여, 모균주 대비 1.3배 이상의 높은 글리코겐을 생산할 수 있다. 상기 글리코겐 고생산은 22~25mg/g의 글리코겐을 생산하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 글리코겐 생산용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미생물 제제에서, 상기 균주는 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) 변이 균주이며, 바람직하게는 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) CEY2 변이 균주(KCTC18749P)이다. 상기 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주는 글리코겐 생산능이 우수한 균주이므로, 글리코겐 생산에 효과적으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 동물 사료 조성물을 제공한다. 상기 균주는 사카로마이세스 보울라디 변이 균주이며, 바람직하게는 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주(KCTC18749P)이다.
본 발명의 동물 사료 조성물은 기초사료에 일정 비율로 첨가할 수 있다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
사료 조성물 중의 상기 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 상기 배양액의 추출물의 함량은 급여 동물의 종, 주령, 체중, 및 사육 조건 등에 따라 적절히 선택될 수 있다. 본 발명의 동물 사료 조성물에 있어서, 상기 동물은 쥐, 생쥐 또는 가축 등의 포유동물 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 사료 조성물은 기술분야에 공지된 사료 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들어, 각종 사료 원료 또는 배합사료와 본 발명의 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 혼합한 후, 추가적인 가공 공정, 예를 들어 펠렛 형태로의 성형 또는 과립 등의 형태로의 절단 단계 등을 더 수행함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 사료 조성물의 구성성분, 조성,제조방법, 급여방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 배양액의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.
본 발명의 건강보조식품은 영양보조제, 건강식품 및 식품 첨가제 등의 모든 형태를 포함하고, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 상기 배양액의 추출물의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대해 약 1 내지 100중량%를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 사카로마이세스 보울라디 CEY2 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 글리코겐의 생산 방법을 제공한다.
상기 균주는 바람직하게는 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) CEY2 변이 균주(KCTC18749P)이다. 본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있으며, 일례로 YPD 액체 배지에 상기 균주를 접종하여 배양하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 자연계로부터 고함량의 글리코겐을 생산하는 균주 선별
자연계에서 분리 동정한 효모 균주(모균주) 30종을 YPD(1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤 및 2% D-글루코오스) 액체배지에서 배양한 배양액을 YPD 고체배지에 접종한 후, 글리코겐이 아이오딘과 결합하여 염색되는 원리를 통해 아이오딘 증기(iodine vapor)에 의해 콜로니가 염색될 수 있도록 항온수조의 온도를 50℃로 설정하였으며, 한천 배지에 고르게 염색될 수 있도록 루골용액(Lugol's solution, 5% I2 및 10% KI)을 넓게 펼친 뒤 그 위에 철망과 배양 배지를 올린 후 콜로니의 색 변화를 확인하여 고함량의 글리코겐을 생산하는 균주를 선별하였다. 그 결과, 균주들 중에 아이오딘 염색을 통해 적색 또는 갈색으로 확인되는 14종의 효모 균주를 확보하였다(표 1).
상기 확보된 14종의 균주를 대상으로 글리코겐 분석을 수행하였다. 구체적으로, 사카로마이에스 세레비지애 EBY vw 4000 및 CEN.PK2-1D 균주는 YPHM(1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤 및 2% 고 말토 시럽) 액체배지에서 배양하고, 나머지 12종의 균주는 YPD 액체배지에 배양하였으며, 배양은 30℃에서 진행하였다. 이후에, 동결 건조기를 이용하여 건조한 효모 균체의 건조중량을 측정한 다음, 10배의 증류수에 세포를 혼합하고 호모게나이저 PANDA2000을 이용하여 1,300~1,500psi의 압력조건으로 균체를 파쇄하였다. 파쇄한 균주는 100℃에서 10분간 끓여 단백질을 침전시킨 다음 원심분리(10,000 rpm, 20분 및 20℃)하여 상등액과 주정을 1:1로 혼합한 후 4℃에서 24시간 동안 그대로 두어 침전시켰다. 이후에, 주정으로 침전된 글리코겐은 원심분리(10,000 rpm, 20분 및 20℃)를 통해 분리시킨 후 진공회전농축기를 이용하여 동결건조한 후, 시료를 정량하여 각 균주별 글리코겐 함량을 측정하였다. 그 결과, 글리코겐을 생산하며 프로바이오틱스 효과를 가지는 사카로마이에스 보울라디(Saccharomyces boulardii) 균주를 선발하였으며, 하기 실시예 2의 돌연변이 제조에 모균주로 사용하였다.
글리코겐을 생산하는 선별된 균주
균주명 최종 O.D. 건조
세포량(g)		 글리코겐(g) 글리코겐/
건조 세포(mg/g)		 글리코겐/
건조 세포(%)
S. cerevisiae 7906 9.58 1.92 12.833 6.701 1.01
S. cerevisiae 7913 10.600 1.89 21.000 11.109 1.67
S. cerevisiae 7916 12.160 1.05 12.667 12.013 1.80
S. cerevisiae 7931 10.420 1.56 13.000 8.355 1.25
S. cerevisiae 7950 9.880 0.89 9.667 10.888 1.63
S. cerevisiae 7964 13.520 1.53 15.667 10.250 1.54
S. cerevisiae 17350 10.340 1.53 10.000 6.542 1.05
S. cerevisiae 17915 4.620 1.39 11.333 8.177 1.23
S. cerevisiae EBY vw 4000 6.200 3.18 16.000 5.039 0.76
S. cerevisiae CEY 5.360 1.79 22.667 12.630 1.89
S. cerevisiae Y2805 6.210 1.89 10.000 5.291 1.01
S. cerevisiae CEN.PK2-1D 7.020 3.27 16.333 4.995 0.95
S. cerevisiae D452-2 7.080 1.77 12.333 6.968 1.05
S. boulardii 6.660 2.02 15.333 7.587 1.14
실시예 2. 자외선을 이용한 돌연변이 유발
상기 실시예 1에서 선별된 사카로마이에스 보울라디 균주를 이용하여 고함량의 글리코겐을 생산하는 돌연변이체를 제조하기 위해, 사카로마이에스 보울라디 균주 배양액을 OD 값이 1.0이 되도록 증류수로 희석하여 배양 플레이트에 스프레딩(spreading)한 후, 사멸률이 약 70% 이상 나올 수 있도록 UV cross linker BLX-254를 이용하여 자외선을 2.8J/cm2의 세기로 5분 동안 조사한 다음, 5% YPHM(1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤 및 2% 고 말토 시럽) 액체배지에 30℃에서 6시간 동안 배양하여 회복시킨 다음, 증류수로 세척하였다. 원심분리(13,000 rpm, 4℃ 및 1분)한 후, 펠렛(pellet)을 OD 값 1.0까지 희석(102 cell/ml)시킨 다음 5% YPHM 고체배지에 스프레딩(spreading)한 후 3~4일 동안 배양하였다(도 1). 그 결과, 아이오딘 증기 및 루골용액을 이용하여 1차 스크리닝을 통해 특정 콜로니를 선별하고 이들을 하나의 플레이트에 배양한 후, 아이오딘 증기 및 루골용액을 이용하여 2차 스크리닝을 진행하였으며, 최종적으로 아이오딘 염색이 진하게 나오는 13번, 14번, 19번, 26번 및 28번 콜로니를 선별하였다.
실시예 3. 사카로마이에스 보울라디 CEY2 변이 균주로부터 생산된 글리코겐 함량 확인
상기 실시예 2에서 선별한 13번, 14번, 19번, 26번 및 28번 콜로니(OD=0.1)를 400mL의 YPHM 액체배지에 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 48시간 동안 배양한 후 균체를 회수하였다. 이후에, 호모게나이저 PANDA2000을 이용하여 1,300~1,500psi의 압력조건으로 균체를 파쇄하였다. 파쇄한 균주는 100℃에서 10분간 끓여 단백질을 침전시킨 다음 원심분리(10,000 rpm, 20분 및 20℃)하여 상등액과 주정을 1:1로 혼합한 후 4℃에서 24시간 동안 그대로 두어 침전시켰다. 이후에, 주정으로 침전시킨 글리코겐은 원심분리(10,000 rpm, 20분 및 20℃)를 통해 분리시킨 후 진공회전농축기를 이용하여 동결건조한 후, 시료를 정량하여 각 균주별 글리코겐 함량을 측정하였다. 그 결과, 하기 표 2에 개시한 바와 같이 모균주(cotnrol)에 비해 13번, 19번 및 26번 변이 균주가 글리코겐 생산량이 우수하였고, 특히 26번 변이 균주가 13번 및 19번 변이 균주에 비해 글리코겐 생산량이 우수한 것을 확인하여, 26번 변이 균주를 최종 선발하였으며, 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) CEY2 변이 균주로 명명하고, 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(기탁번호: KCTC18749P).
선별 균주의 글리코겐 생산량 측정
균주명 최종 O.D(600nm) 글리코겐(mg/g)
13 5.52 19.36
14 5.37 16.4
19 5.79 19.68
26( CEY2 ) 5.21 23.34
28 5.46 16.42
Control 5.81 18.44
한국생명공학연구원 KCTC18749P 20181123

Claims (6)

  1. 기탁번호가 KCTC18749P이며, 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) CEY2 변이 균주.
  2. 제1항의 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 글리코겐 생산용 미생물 제제.
  3. 제1항의 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 동물 사료 조성물.
  4. 제1항의 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 건강보조식품.
  5. 제1항의 변이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 제제.
  6. 제1항의 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 글리코겐의 생산 방법.
KR1020180158832A 2018-12-11 2018-12-11 글리코겐을 고생산하는 사카로마이세스 보울라디 cey2 변이 균주 및 이의 용도 KR102110956B1 (ko)

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