KR102098388B1 - 피부 항상성 유지 및 항염성 천연 화장료 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 천연 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 특정 천연 물질의 추출물을 이용하여, 피부 자극이 없으면서도 피부 마이크로바이옴 항상성 및 항염 성능이 우수한 화장료 조성물 및 이를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 천연 혼합 추출물을 이용한 천연 화장료 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 피부 자극이 없으면서도 피부 마이크로바이옴 항상성 및 항염 성능이 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
강황(Curcuma longa Rhizoma)은 생강목에 속하는 다년생 식물로서 인도를 중심으로 한 열대, 아열대 지역에서 주로 재배되어 왔으며, 줄기와 뿌리는 식용, 약용 등으로 사용되어 왔다. 한약재로 사용 되는 강황의 뿌리줄기는 맵고 쓴 맛이 나는 황색의 약재로서 통증완화에 효능이 있으며 해독작용이 있어 전통적으로 염증치료용 약용식물로 사용되어 왔다.
계피(Cinnamonum zeylanicum Beryn)는 녹나무과에 속하는 육계 또는 동속 근연식물의 수피를 말하며, 주로 중국의 남부, 일본 남부, 월남, 캄보디아, 태국 등지에서 자생하고 있다. 약효 성분은 휘발성 정유 성분인 펠란드렌(phellandrene), 유게놀(Eugenal), 메틸유게놀(Methyleugual) 등이 함유되어 있으며, 혈액순환 촉진, 소화 촉진, 통증 억제, 피부진균 억제 등의 효력이 우수한 것으로 알려져 있다.
이러한 계피를 꿀과 함께 혼합하여 사용할 경우 그 효능이 배가 되는 것으로 알려져 있으며, 꿀과 계피 혼합물은 피로 회복, 노화 방지, 면역력 강화, 항암 효과, 피부 미용 등에 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다. 이에 따라 강황과 계피에 꿀과 같이 벌 유래 물질들인 로얄젤리, 프로폴리스, 봉독, 벌화분을 함께 혼합하여 기존보다 뛰어난 효능을 나타내고자 하였다.
꿀은 꿀벌이 꽃의 밀선에서 빨아내어 축적한 감미료이며, 대부분 당분으로서 약 36~38% 과당, 34~36% 포도당, 2%의 슈크로스로 이루어져 있다. 이들 당분은 원래 꽃에 있던 슈크로스가 꿀벌의 입에서 나오는 효소의 작용으로 전화당인 과당과 포도당으로 변환된 다당류이기 때문에 흡수가 쉽고 칼로리원(源)으로서 속효성(速效性)이며 영양가가 높다. 특수한 풍미를 가지고 있으므로 꿀술이나 제과원료로 이용되기도 하며, 예로부터 약용으로 귀중하게 사용되어 왔다.
화분은 꿀벌의 먹이로서, 영양가가 높기 때문에 유럽에서는 완전식품으로 불리고 있으며, 영양 보급, 신진대사 기능, 빈혈 치료, 전립선 질환 개선에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 예로부터 미용, 강장, 장수 식품으로 사용되었으며, 고대 이집트의 절세미인 클레오파트라 여왕도 미용과 강장을 목적으로 화분을 애용하였다고 알려져 있다.
로얄젤리는 꿀벌의 포육선에서 분비되는 유상물질로서, 주로 여왕벌을 기르기 위하여 저장된다. 단백질, 탄수화물, 지방, 수분 외에도 여러 종류의 비타민을 풍부하게 함유하고 있으며 강장, 피로, 빈혈, 피부미용, 노화방지 등에 이용된다.
프로폴리스는 꿀벌이 자신의 생존과 번식을 위해 여러 식물에서 뽑아낸 수지와 같은 물질에 자신의 침과 효소 등을 섞어서 만든 물질로, 성분으로는 유기물과 미네랄이 가장 많으며 이와 함께 104종 정도의 성분이 함유되어 있다. 사람의 몸에 염증을 일으키는 프로스타그란딘을 만들어내는 효소를 억제하여 항염 효능을 타나내며, 주요 성분인 플라보노이드가 활성 산소를 없애 항산화 효과도 나타낸다.
봉독은 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액으로써 75%가 단백질로 이루어져 있다. 다양한 아미노산들이 함유되어 있으며 신경통, 류머티즘, 요통 등에 민감요법으로 많이 사용 된다.
마이크로바이옴(Microbiome)은 인간의 몸 안팎에서 서식하고 있는 미생물들과 유전정보 전체를 말하는 것으로, 우리 몸에는 매우 많은 미생물이 서식하고 있고 건강과 질병에 미치는 영향도 매우 커서 ‘두 번째 유전자’라고도 불린다. 많은 연구 결과들로부터 인체 미생물의 불균형이 여러 종류의 인간 질병에 영향을 미칠 수 있다는 것이 밝혀졌으며, 특히 최근에는 기존에 많이 알려진 아토피 피부염과 같은 염증성 질환뿐만 아니라 인간의 노화에도 영향을 미칠 수 있다는 결과들이 보고되고 있다. 미생물의 조성과 다양성에 의해 숙주의 면역 시스템이 조절되고 이것이 다시 공생 세균의 조성과 다양성으로 피드백 되어 공생 세균과 면역 시스템이 상호 영향을 미치게 된다. 피부의 경우 공생 세균이 직접 항박테리아 펩타이드를 분비하여 병권균의 증식을 억제하게 되는데, 피부의 공생세균인 Staphylococcus epidermidis는 여러 종류의 항박테리아 단백질과 proteases를 분비하는 능력을 가지고 있으며 이로 인해 피부염의 주 원인균으로 알려진 Staphylococcus aureus의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다.
일반적으로 정상 피부의 pH는 감염에 대한 방어 기전으로서 약산성(pH 4.0 ~ 4.5)을 유지하고 있으며, 세안제 등에 의해 중성 ~ 알칼리성(pH 5.0 ~ 7.0)으로 변하게 된다. 피부의 pH가 증가하면 Serine protease의 활성도가 증가함으로써 S.aureus의 군락화가 촉진되고 이에 따라 항균 장벽 기능이 감소한다. 또한 Serine protease의 활성도 증가는 활성화된 IL-1을 증가시키며 이에 따라 염증 반응을 유도해 다양한 피부 질병을 일으키게 된다.
기존에 천연 추출물을 이용한 다양한 화장료 조성물이 개발되고 이를 이용한 미용제품이 시판되고 있지만, 마이크로바이옴의 항상성이 우수한 화장료에 대한 개발은 미흡한 실정이다.
본 발명의 목적은 피부의 마이크로바이옴의 항상성을 유지하면서도 항염성이 우수한 천연 성분을 이용한 화장료 조성물 및 이를 효과적으로 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 천연 화장료는 강황 추출물, 계피 추출물, 꿀 추출물, 화분 추출물, 로얄젤리 추출물, 프로폴리스 추출물 및 봉독 추출물을 포함하는 혼합 추출물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 혼합 추출물은 강황, 계피, 꿀, 화분, 로얄젤리, 프로폴리스 및 봉독의 혼합물에 대한 부틸렌 글리콜 추출물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 부틸렌 글리콜 추출물의 상기 혼합물은 화분 100 중량부에 대하여, 강황 200 ~ 400 중량부, 계피 200 ~ 400 중량부, 꿀 150 ~ 400 중량부, 로얄젤리 20 ~ 100 중량부, 프로폴리스 10 ~ 50 중량부 및 봉독 5 ~ 30 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 혼합 추출물은 부틸렌 글리콜 추출물 및 물(H2O) 추출물을 포함하며, 상기 부틸렌 글리콜 추출물은 강황, 계피, 화분 및 프로폴리스를 혼합한 제1혼합물의 부틸렌 글리콜 추출물이며, 상기 정제수 추출물은 꿀, 로얄젤리 및 봉독을 혼합한 제2혼합물의 물 추출물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 혼합 추출물은 부틸렌 글리콜 추출물 및 물(H2O) 추출물을 1 : 0.30 ~ 0.50 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 제1혼합물은 화분 100 중량부에 대하여, 강황 200 ~ 400 중량부, 계피 200 ~ 400 중량부 및 프로폴리스 10 ~ 50 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 제2혼합물은 꿀 100 중량부에 대하여, 로얄젤리 20 ~ 40 중량부 및 봉독 2 ~ 10 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 혼합 추출물은 화분 추출물 100 중량부에 대하여, 강황 추출물 200 ~ 400 중량부, 계피 추출물 200 ~ 400 중량부, 꿀 추출물 150 ~ 400 중량부, 로얄젤리 추출물 20 ~ 100 중량부, 프로폴리스 추출물 10 ~ 50 중량부 및 봉독 추출물 5 ~ 30 중량부를 포함하며, 이때, 상기 화분 추출물, 상기 강황 추출물, 상기 계피 추출물, 상기 꿀 추출물, 상기 로얄젤리 추출물, 상기 프로폴리스 추출물 및 상기 봉독 추출물 각각은 부틸렌 글리콜 추출물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 혼합 추출물은 화분 추출물 100 중량부에 대하여, 강황 추출물 200 ~ 400 중량부, 계피 추출물 200 ~ 400 중량부, 꿀 추출물 150 ~ 400 중량부, 로얄젤리 추출물 20 ~ 100 중량부, 프로폴리스 추출물 10 ~ 50 중량부 및 봉독 추출물 5 ~ 30 중량부를 포함하며, 이때, 상기 화분 추출물, 상기 강황 추출물, 상기 계피 추출물 및 상기 프로폴리스 추출물 및 각각은 부틸렌 글리콜 추출물이고, 상기 꿀 추출물, 상기 로얄젤리 추출물 및 상기 봉독 추출물 각각은 물(H2O) 추출물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 천연 화장료는 SPINK5(Serine protease inhibitor Kazal-type 5 precursor) 발현 증가율이 85% 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 앞서 설명한 천연 화장료를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 강황, 계피, 꿀, 화분, 로얄젤리, 프로폴리스 및 봉독을 혼합한 혼합물을 준비하는 1단계; 상기 혼합물을 부틸렌 글리콜 수용액과 혼합한 후, 교반하는 2단계; 및 교반용액을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 혼합 추출물을 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 천연 화장료를 제조하는 방법은 부틸렌 글리콜 추출물 및 물 추출물을 혼합하여 제조하며, 이때, 상기 부틸렌 글리콜 추출물은 강황, 계피, 화분 및 프로폴리스를 혼합한 제1혼합물을 준비하는 1단계; 상기 제1혼합물을 부틸렌 글리콜 수용액과 혼합한 후, 교반하여 제1혼합용액을 제조하는 2단계; 및 상기 제1혼합용액을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 혼합 추출물을 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조하며, 상기 물 추출물은 꿀, 로얄젤리 및 봉독을 혼합한 제2혼합물을 준비하는 1단계; 상기 제2혼합물을 물과 혼합한 후, 교반하여 제2혼합용액을 제조하는 2단계; 및 상기 제2혼합용액을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 혼합 추출물을 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
본 발명의 천연 화장료는 높은 S.aureus 감소율, 높은 S.epidermidis 증가율, 높은 SPINK5 발현 증가율 및 높은 IL-1α 발현 억제율을 가지는 바, 항염 효능이 우수할 뿐만 아니라, 피부의 마이크로바이옴 항상성이 우수하면서도 피부 트러블이 거의 없기 때문에, 화장품, 헤어용 샴푸, 바디 샴푸, 비누 등의 기능성 미용제품의 화장료로 사용하기에 적합하다.
이하에서는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명을 한다.
본 발명에서 사용하는 용어인 화장료는 미용제품에 사용되어 피부 보호 및/또는 개선 효과가 있는 미용 소재를 의미한다.
본 발명의 천연 화장료는 7가지 천연 재료를 이용한 화장료로서, 강황 추출물, 계피 추출물, 꿀 추출물, 화분 추출물, 로얄젤리 추출물, 프로폴리스 추출물 및 봉독 추출물을 포함하는 혼합 추출물을 포함한다.
본 발명의 천연 화장료는 다양한 방법을 통해서 제조할 수 있다.
이 중 한가지 방법(방법 1)은 강황, 계피, 꿀, 화분, 로얄젤리, 프로폴리스 및 봉독을 혼합한 혼합물을 준비하는 1단계; 상기 혼합물을 부틸렌 글리콜과 혼합한 후, 교반하는 2단계; 및 교반용액을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 혼합 추출물을 제조하는 3단계;를 수행하여 제조할 수 있다.
방법 1에서 1단계의 상기 혼합물은 화분 100 중량부에 대하여, 강황 200 ~ 400 중량부, 계피 200 ~ 400 중량부, 꿀 150 ~ 400 중량부, 로얄젤리 20 ~ 100 중량부, 프로폴리스 10 ~ 50 중량부 및 봉독 5 ~ 30 중량부를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 화분 100 중량부에 대하여, 강황 250 ~ 380 중량부, 계피 200 ~ 350 중량부, 꿀 180 ~ 320 중량부, 로얄젤리 35 ~ 80 중량부, 프로폴리스 15 ~ 45 중량부 및 봉독 8 ~ 26 중량부를 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 화분 100 중량부에 대하여, 강황 270 ~ 350 중량부, 계피 250 ~ 330 중량부, 꿀 180 ~ 250 중량부, 로얄젤리 35 ~ 70 중량부, 프로폴리스 20 ~ 40 중량부 및 봉독 10 ~ 25 중량부를 포함할 수 있다. 그리고, 상기 화분, 강황, 계피는 분말일 수 있다.
이때, 상기 혼합물 내 강황이 200 중량부 미만이면 다소 효능이 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 강황이 400 중량부를 초과하면 여과가 용이하지 않은 문제가 있을 수 있다. 또한, 상기 혼합물 내 계피가 200 중량부 미만이면 다소 효능이 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 계피가 400 중량부를 초과하면 여과가 용이하지 않은 문제가 있을 수 있다. 상기 혼합물 내 꿀이 150 중량부 미만이면 다소 효능이 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 꿀이 400 중량부를 초과하면 추후 침전물이 발생할 가능성이 높아지는 문제가 있을 수 있다. 또한, 상기 혼합물 내 로얄젤리가 20 중량부 미만이면 다소 효능이 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 로얄젤리가 100 중량부를 초과하면 용해도가 낮아지는 문제가 있을 수 있다. 또한, 상기 혼합물 내 프로폴리스가 10 중량부 미만이면 다소 효능이 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 프로폴리스가 50 중량부를 초과하면 용해도가 낮아지는 문제가 있을 수 있다. 상기 혼합물 내 봉독이 5 중량부 미만이면 다소 효능이 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 봉독이 30 중량부를 초과하여 사용하더라도 효과 증대가 없으면서 경제성이 저하되는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내로 사용하는 것이 좋다.
방법 1에서 상기 부틸렌 글리콜은 40 ~ 60 부피%의 부틸렌 글리콜 수용액을, 바람직하게는 45 ~ 55 부피% 농도의 부틸렌 글리콜 수용액을 사용하는 것이 높은 용해도를 가지면서도 여과에 어려움이 없어 제품 생산에 용이한 측면에서 유리하다.
그리고, 방법 1의 2단계에서 상기 교반은 20 ~ 30℃ 하에서 200 ~ 500 rpm의 교반 속도로 2 ~ 5시간 동안 수행하는 것이, 바람직하게는 20 ~ 26℃ 하에서, 250 ~ 400 rpm의 교반 속도로 2.5 ~ 4 시간 정도 수행하는 것이 좋다.
3단계의 원심분리는 당업계에 일반적으로 알려진 방법으로 수행할 수 있으며, 바람직한 일구현예를 들면, 3,500 rpm ~ 5,000 rpm에서 10분 ~ 30분간 원심분리를 수행한 후, 상등액을 수득할 수 있다.
그리고, 3단계의 여과 역시 당업계에서 사용하는 일반적인 방법으로 여과를 수행할 수 있으며, 바람직한 일구현예를 들면, 평균입경 0.5 ~ 2㎛의 PVDF(polyvinylidene fluoride) 필터를 이용하여 여과를 수행하여, 여과액을 수득하여 천연 화장료를 얻을 수 있다.
이러한 방법을 통해 7종 소재에 대한 부틸렌 글리콜 추출물인 천연 화장료를 제조할 수 있다.
본 발명의 천연 화장료를 제조하는 다른 방법(방법 2)는 부틸렌 글리콜 추출물 및 물 추출물이 혼합된 혼합 추출을 제조하는 방법으로서, 부틸렌 글리콜 추출물 및 물 추출물을 1 : 0.30 ~ 0.50 중량비로, 바람직하게는 1 : 0.35 ~ 0.45 중량비로 혼합하여 제조할 수 있다. 이때, 물 추출물 함량이 0.30 중량비 미만이면 화장료의 S.aureus 감소 효과가 떨어질 수 있고, 1 : 50 중량비를 초과하여 사용하면 S.epidermidis 증가 효과가 미흡한 문제가 있을 수 있다.
방법 2에서, 상기 부틸렌 글리콜 추출물은 제1혼합물을 준비하는 1단계; 상기 제1혼합물을 부틸렌 글리콜 수용액과 혼합한 후, 교반하여 제1혼합용액을 제조하는 2단계; 상기 제1혼합용액을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 혼합 추출물을 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
상기 1단계의 상기 제1혼합물은 강황, 계피, 화분 및 프로폴리스를 포함하며, 바람직하게는 화분 100 중량부에 대하여, 강황 200 ~ 400 중량부, 계피 200 ~ 400 중량부 및 프로폴리스 10 ~ 50 중량부를 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 화분 100 중량부에 대하여, 강황 250 ~ 380 중량부, 계피 200 ~ 350 중량부 및 프로폴리스 15 ~ 45 중량부를 포함할 수 있다. 그리고, 상기 화분, 강황, 계피은 분말일 수 있다.
그리고, 상기 부틸렌 글리콜 수용액은 40 ~ 60 부피%의 부틸렌 글리콜 수용액, 바람직하게는 45 ~ 55 부피%의 부틸렌 글리콜 수용액을 사용할 수 있다.
방법 2에서, 상기 물 추출물은 꿀, 로얄젤리 및 봉독을 혼합한 제2혼합물을 준비하는 1단계; 상기 제2혼합물을 물과 혼합한 후, 교반하여 제2혼합용액을 제조하는 2단계; 상기 제2혼합용액을 교반용액을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 혼합 추출물을 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
상기 제2혼합물은 꿀, 로얄젤리 및 봉독을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 꿀 100 중량부에 대하여, 로얄젤리 25 ~ 38중량부 및 봉독 4 ~ 8.5 중량부를 포함할 수 있다.
방법 2에서 상기 부틸렌 글리콜 추출물 및/또는 물 추출물 제조시, 2단계의 교반 및 3단계의 원심분리 및 여과는 상기 방법 1의 2단계의 교반, 3단계의 원심분리 및 여과와 동일한 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 천연 화장료를 제조하는 또 다른 방법(방법 3)은 강황, 계피, 꿀, 화분, 로얄젤리, 프로폴리스 및 봉독 각각에 대한 부틸렌 글리콜 추출물, 즉, 강황 추출물, 계피 추출물, 꿀 추출물, 화분 추출물, 로얄젤리 추출물, 프로폴리스 추출물 및 봉독 추출물을 각각 별도로 제조한 후, 이들은 화분 추출물 100 중량부에 대하여, 강황 추출물 200 ~ 400 중량부, 계피 추출물 200 ~ 400 중량부, 꿀 추출물 150 ~ 400 중량부, 로얄젤리 추출물 20 ~ 100 중량부, 프로폴리스 추출물 10 ~ 50 중량부 및 봉독 추출물 5 ~ 30 중량부로 혼합하여 제조할 수 있다. 이때, 상기 추출물은 부틸렌 글리콜 추출물이다. 이해를 돕기 위해 좀 더 구체적으로 설명하면 상기 강황 추출물은 강황 부틸렌 글리콜 추출물인 것이다.
상기 추출물 각각을 제조하는 방법은 방법 1과 동일하며 1단계에서 혼합물이 아닌 각각의 개별 성분만을 사용하여 부틸렌 글리콜 수용액으로 추출물을 제조할 수 있다.
본 발명의 천연 화장료를 제조하는 또 다른 방법(방법 4)은 방법 3과 마찬가지로, 강황, 계피, 화분 및 프로폴리스 각각에 대한 부틸렌 글리콜 추출물을 제조하고, 또한 꿀, 로얄젤리 및 봉독 각각에 대한 물 추출물을 제조한다. 그리고, 부틸렌 글리콜 추출물인 강황 추출물, 계피 추출물, 화분 추출물 및 프로폴리스 추출물을 혼합하여 혼합 부틸렌 글리콜 추출물을 제조하고, 이와는 별도로 물 추출물인 꿀 추출물, 로얄젤리 추출물 및 봉독 추출물은 혼합하여 혼합 물 추출물을 제조한 뒤, 상기 혼합 부틸렌 글리콜 추출물 및 혼합 물 추출물을 1 : 0.30 ~ 0.50 중량비로, 바람직하게는 1 : 0.35 ~ 0.45 중량비로 혼합하여 최종 천연 화장료를 제조할 수 있다. 이때, 상기 부틸렌 글리콜 추출물, 물 추출물을 제조하는 방법은 상기 방법 2와 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
이와 같이 방법 1 내지 방법 4 중 어느 하나의 방법으로 제조한 본 발명의 천연 화장료는 S.aureus 감소율이 90% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 93% 이상, 더욱 바람직하게는 95.0 ~ 99.5%일 수 있다.
또한, 본 발명의 천연 화장료는 S.epidermidis증가율이 90% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 93% ~ 98%, 더욱 바람직하게는 93.5 ~ 97.5%일 수 있다.
또한, 본 발명의 천연 화장료는 SPINK5(Serine protease inhibitor Kazal-type 5 precursor) 발현 증가율이 85% 이상이며, 바람직하게는 87.5% ~ 96.0%, 더욱 바람직하게는 88.0 ~ 95.0%일 수 있다.
또한, 본 발명의 천연 화장료는 IL-1α 발현 억제율이 85% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 86.5 ~ 95%, 더욱 바람직하게는 87 ~ 94.5%일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
[
실시예
]
준비예
1-1 :
강황
-물 추출물 제조
약업사에서 구매한 강황의 뿌리줄기 건조물을 분쇄기를 이용하여 50 ~ 60 mesh로 잘게 분쇄하여 강황 분말을 제조하였다.
다음으로, 상기 강황 분말 5g과 추출 용매로서 정제수 100ml을 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다.
다음으로 상기 추출용액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리 한 뒤, 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 여과하여 강황-물 추출물을 제조하였다.
준비예
1-2:
강황
-에탄올 추출물 제조
정제수 대신 70 부피% 농도의 에탄올 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 1-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 강황-에탄올 추출물을 제조하였다.
준비예
1-3:
강황
-부틸렌 글리콜 추출물 제조
정제수 대신 50 부피% 농도의 부틸렌 글리콜 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 1-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 강황-부틸렌 추출물을 제조하였다.
준비예
2-1 : 계피-물 추출물 제조
약업사에서 구매한 계피 건조물을 분쇄기를 이용하여 50 ~ 60 mesh로 잘게 분쇄하여 계피 분말을 제조하였다. 다음으로, 상기 계피 분말 5g과 추출 용매로서 정제수 100ml을 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다.
다음으로 상기 추출용액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리 한 뒤, 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 여과하여, 계피-물 추출물을 제조하였다.
준비예
2-2 ~ 2-3
정제수 대신 70 부피% 농도의 에탄올 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 2-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 계피-에탄올 추출물을 제조하여 준비예 2-2를 실시하였다.
또한, 정제수 대신 50 부피% 농도의 부틸렌 글리콜 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 2-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 계피-부틸렌 추출물을 제조하여 준비예 2-3을 실시하였다.
준비예
3-1 : 꿀-물 추출물 제조
지리산꿀 원액 5g과 추출 용매로서 정제수 100ml을 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다. 다음으로 상기 추출용액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리 한 뒤, 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 여과하여, 꿀-물 추출물을 제조하였다.
준비예
3-2 ~ 3-3
정제수 대신 70 부피% 농도의 에탄올 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 3-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 꿀-에탄올 추출물을 제조하여 준비예 3-2를 실시하였다.
또한, 정제수 대신 50 부피% 농도의 부틸렌 글리콜 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 3-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 꿀-부틸렌 추출물을 제조하여 준비예 3-3을 실시하였다.
준비예
4-1: 화분-물 추출물 제조
화분을 분쇄기를 이용하여 50 ~ 60 mesh로 잘게 분쇄하여 화분 분말을 제조하였다. 다음으로, 상기 화분 분말 5g과 추출 용매로서 정제수 100ml을 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다. 다음으로 상기 추출용액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리 한 뒤, 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 여과하여, 화분-물 추출물을 제조하였다.
준비예
4-2 ~ 4-3
정제수 대신 70 부피% 농도의 에탄올 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 4-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 화분-에탄올 추출물을 제조하여 준비예 4-2를 실시하였다.
또한, 정제수 대신 50 부피% 농도의 부틸렌 글리콜 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 4-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 화분-부틸렌 추출물을 제조하여 준비예 4-3을 실시하였다.
준비예
5-1:
로얄젤리
-물 추출물 제조
로얄젤리 파우더 5g과 추출 용매로서 정제수 100ml을 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다. 다음으로 상기 추출용액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리 한 뒤, 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 여과하여, 로얄젤리-물 추출물을 제조하였다.
준비예
5-2 ~ 5-3
정제수 대신 70 부피% 농도의 에탄올 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 5-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 로얄젤리-에탄올 추출물을 제조하여 준비예 5-2를 실시하였다.
또한, 정제수 대신 50 부피% 농도의 부틸렌 글리콜 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 5-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 로얄젤리-부틸렌 추출물을 제조하여 준비예 5-3을 실시하였다.
준비예
6-1 : 프로폴리스-물 추출물 제조
프로폴리스 원액 5g과 추출 용매로서 정제수 100ml을 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다. 다음으로 상기 추출용액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리 한 뒤, 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 여과하여, 프로폴리스-물 추출물을 제조하였다.
준비예
6-2 ~ 6-3
정제수 대신 70 부피% 농도의 에탄올 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 6-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 프로폴리스-에탄올 추출물을 제조하여 준비예 6-2를 실시하였다.
또한, 정제수 대신 50 부피% 농도의 부틸렌 글리콜 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 6-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 프로폴리스-부틸렌 추출물을 제조하여 준비예 5-3을 실시하였다.
준비예
7-1 :
봉독
-물 추출물 제조
정제된 봉독 파우더 1g과 추출 용매로서 정제수 20ml을 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다. 다음으로 상기 추출용액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리 한 뒤, 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 여과하여, 봉독-물 추출물을 제조하였다.
준비예
7-2 ~ 7-3
정제수 대신 70 부피% 농도의 에탄올 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 7-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 봉독-에탄올 추출물을 제조하여 준비예 7-2를 실시하였다.
또한, 정제수 대신 50 부피% 농도의 부틸렌 글리콜 수용액을 사용한 것을 제외하고는 상기 준비예 7-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여, 봉독-부틸렌 추출물을 제조하여 준비예 7-3을 실시하였다.
실험예
1 :
물추출물
, 에탄올 추출물 및 부틸렌 글리콜 추출물의 항염 성능 평가
상기 준비예의 추출물들 각각에 대한 항염 효능을 확인하기 위해 질소 산화물(NO; Nitric oxide) 생성 저해능 평가(NO assay)를 수행하였다.
24 well plate에 1×105 cells/ml의 Raw264.7 세포가 들어있는 부유액 500㎕를 넣고 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 추출물의 최종 농도가 0.01% ~ 0.5%가 되도록 처리한 후 염증 반응 유도 인자인 리포폴리사카라이드(LPS)를 100ng/ml의 농도가 되도록 처리하였다.
24시간 배양 후 세포 배양액 50㎕와 그리스 시약(Griess reagent) 50㎕를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광값을 측정하여 NO 생성 정도를 측정하였다. 양성대조군으로는 L-NMMA(iNOS 효소의 기질 유사 물)를 이용하여 효능을 비교하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
상기 준비예 1-1 ~ 준비예 7-3에서 정제수로 추출한 추출물을 정제수 추출물, 70 부피% 농도 에탄올 수용액으로 추출한 추출물은 70% 에탄올 추출물, 50 부피% 농도 부틸렌 글리콜 수용액로 추출한 추출물은 50% BG 추출물이라 표기하기로 한다.
| 구분 | 처리농도 | NO 생성 저해능(% of control) | ||
| 정제수 추출물 | 70부피% 에탄올 추출물 |
50부피% BG 추출물 |
||
| 강황 | 0.05% | 25.6 | 66.1 | 79.4 |
| 0.1% | 28.5 | 78.0 | 87.7 | |
| 계피 | 0.05% | 20.3 | 70.2 | 88.5 |
| 0.1% | 51.5 | 84.6 | 90.1 | |
| 지리산꿀 | 0.05% | 47.0 | 33.4 | 40.3 |
| 0.1% | 53.8 | 39.8 | 48.1 | |
| 화분 | 0.05% | 9.1 | 54.6 | 61.9 |
| 0.1% | 10.9 | 52.1 | 67.7 | |
| 로얄젤리 | 0.05% | 69.7 | 34.3 | 75.0 |
| 0.1% | 85.2 | 35.0 | 81.9 | |
| 프로폴리스 | 0.05% | 78.4 | 71.1 | 72.7 |
| 0.1% | 82.9 | 73.5 | 86.3 | |
| 봉독 | 0.05% | 61.3 | 34.5 | 39.8 |
| 0.1% | 72.0 | 39.8 | 54.7 | |
| L-NMMA | 10 | 92.7 | ||
상기 표 1을 살펴보면, 50% BG 추출물이 전반적으로 우수한 NO 생성 저해능을 보였다. 다만, 꿀, 로얄제리 및 봉독의 경우, BG 추출물 보다 물 추출물이 상대적으로 더 우수한 NO 생성 저해능을 보였다.
실시예
1-1: 혼합 BG 추출물의 제조
화분 분말 100 중량부에 대하여, 강황 분말 300 중량부, 계피 분말 300 중량부, 지리산꿀 200 중량부, 로얄젤리 분말 60 중량부, 프로폴리스 원액 30 중량부 및 정제된 봉독 분말 10 중량부를 혼합하여 혼합물을 제조하였다.
이때, 상기 강황분말은 강황 뿌리줄기 건조물을 50 ~ 60 mesh로 분쇄시킨 것이며, 상기 계피 분말 역시 계피 건조물을 50 ~ 60 mesh로 분쇄시킨 것이다.
다음으로, 상기 혼합물과 50 부피% 농도의 부틸렌 글리콜과 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다.
다음으로 상기 추출용액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리 한 뒤, 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 여과하여, 혼합 BG 추출물을 제조하였다.
비교예
1-1 ~ 1-6
상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 BG 추출물을 제조하되, 하기 표 2와 같은 조성 및 조성비를 가지도록 BG 추출물을 제조하여 비교예 1-1 ~ 1-6을 각각 실시하였다.
| 구분 (중량부) |
화분 | 강황 | 계피 | 꿀 | 로얄젤리 | 프로폴리스 | 봉독 |
| 실시예1-1 | 100 | 300 | 300 | 200 | 60 | 30 | 10 |
| 비교예 1-1 | - | 300 | 300 | - | - | - | - |
| 비교예 1-2 | - | 300 | 300 | 200 | - | - | - |
| 비교예 1-3 | 100 | 300 | 300 | - | - | - | - |
| 비교예 1-4 | - | 300 | 300 | - | 60 | - | - |
| 비교예 1-5 | - | 300 | 300 | - | - | 30 | - |
| 비교예 1-6 | - | 300 | 300 | - | - | - | 10 |
실시예
2-1 : 물 추출물 및 BG 추출물의 혼합 추출물의 제조
(1) 화분 분말 100 중량부에 대하여, 강황 분말 300 중량부, 계피 분말 300 중량부 및 프로폴리스 원액 30 중량부를를 혼합하여 제1혼합물을 제조하였다.
다음으로, 상기 제1혼합물과 50 부피% 농도의 부틸렌 글리콜과 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다.
다음으로 상기 추출용액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리 한 뒤, 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 여과하여, BG 추출물을 제조하였다.
(2) 지리산꿀 100 중량부에 대하여, 로얄젤리 분말 30 중량부 및 정제된 봉독 분말 5 중량부를 혼합하여 제2혼합물을 제조하였다.
다음으로, 상기 제2혼합물과 정제수를 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다.
다음으로 상기 추출용액을 4,000rpm에서 20분간 원심분리 한 뒤, 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 여과하여, 물 추출물을 제조하였다.
(3) 상기 제1혼합물 및 제2혼합물을 1 : 0.4 중량비로 혼합하여 물 추출물 및 BG 추출물의 혼합 추출물을 제조하였다.
비교예
2-1 및
비교예
2-2
상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 물 추출물 및 BG 추출물의 혼합 추출물을 제조하되, 비교예 2-1은 물 추출물 및 BG 추출물을 1 : 0.22 중량비로 혼합하였고, 비교예 2-2는 물 추출물 및 BG 추출물을 1 : 0.57 중량비로 혼합하였 혼합 추출물을 각각 제조하였다.
실험예
2 : 피부
마이크로바이옴
항상성 효능 평가
상기 실시예 1-1, 실시예 2-1, 준비예 1-3 ~ 7-3 및 비교예 1-1 ~ 1-6, 비교예 2-1 ~ 2-2에서 제조한 BG 추출물을 각각 시료로 준비하였다.
pH 4.5로 유지된 미생물 배지에 S. aureus(Staphylococcus aureus)와 S. epidermidis(Staphylococcus epidermidis)를 동시에 접종하였다.
세안제 및 샴푸 등에 사용되는 계면활성제 SLS(Sodium lauryl sulfate)를 처리하여 마이크로바이옴 밸런스를 손상시킨 후, 희석된 시료를 처리하고 24시간 동안 배양한 뒤, 한천 배지에 도말하여 colony 수를 측정하였다.
S.aureus와 S.epidermidis의 생장을 통해 바이크로바이옴 밸런스의 회복능을 평가하였다. 그리고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 구분 | S.aureus 감소율 (% of control) |
S.epidermidis 증가율 (% of control) |
| 실시예 1-1 | 95.3 | 93.7 |
| 준비예 1-3 | - | 12.6 |
| 준비예 2-3 | 9.7 | - |
| 준비예 3-3 | 79.6 | 83.4 |
| 준비예 4-3 | 21.3 | 37.7 |
| 준비예 5-3 | 75.5 | 43.9 |
| 준비예 6-3 | 49.0 | 63.8 |
| 준비예 7-3 | 81.2 | 74.3 |
| 비교예 1-1 | 13.9 | 12.9 |
| 비교예 1-2 | 68.3 | 75.1 |
| 비교예 1-3 | 22.5 | 33.9 |
| 비교예 1-4 | 54.2 | 36.5 |
| 비교예 1-5 | 25.7 | 42.7 |
| 비교예 1-6 | 44.8 | 50.0 |
| 실시예 2-1 | 98.7 | 96.3 |
| 비교예 2-1 | 95.1 | 94.2 |
| 비교예 2-2 | 96.2 | 93.0 |
상기 표 3의 실험결과를 살펴보면, 실시예 1이 90% 이상의 S.aureus 감소율 및 90% 이상의 S.epidermidis 증가율을 보임을 확인할 수 있었다. 그리고, 실시예 1-1의 BG 추출물 보다 물 추출물 및 BG 추출물을 혼합하여 사용한 실시예 2-1이 상대적으로 더 우수한 S.aureus 감소율 및 S.epidermidis 증가율을 보였다.
그러나, 강황, 계피 등의 단독 성분에 대한 BG 추출물(준비예 1-3 ~ 준비예 7-3) 또는 비교예 1-1 ~ 1-6의 경우, 실시예 1-1과 비교할 때 상대적으로 매우 낮은 S.aureus 감소율 및 높은 S.epidermidis 증가율을 보였다.
그리고, 물 추출물 및 BG 추출물을 1 : 0.3 중량비 미만으로 혼합한 비교예 2-1의 경우, 실시예 1-1과 비교할 때, S.epidermidis는 증가율이 다소 우수하나, S.aureus 감소율이 오히려 낮아졌고, 비교예 2-2의 경우, 실시예 1-1과 비교할 때, S.epidermidis는 증가율이 다소 감소하고, S.aureus 감소율은 다소 증가하는 경향을 보였다. 그러나, 비교예 2-1 및 비교예 2-2 모두 실시예 2-1과 비교할 때, 바이크로바이옴 밸런스의 회복능이 크게 낮은 결과를 보였다.
실험예
3 : 단백분해효소 저해제인
SPINK5의
활성 증가 효능 평가
세린단백질가수분해효소(Serine protease)의 작용은 단백질분해효소 억제제(protease inhibitor)에 의해 조절되며 일부 피부 질환 환자에서는 이러한 세린 단백질분해효소 억제제(serine protease inhibitor)를 발현시키는 유전자인 SPINK5(Serine protease inhibitor Kazal-type 5 precursor)의 변이가 있어 억제제가 결핍되므로 세린 단백질분해효소(serine protease)의 활성화가 증가한다고 알려져 있다. SPINK5는 15개의 강력한 억제 도메인(inhibitory domain)을 가지고 있고, 피부에 중요한 역할을 하며 점막상피에서 항염증 혹은 항미생물 효능을 나타낸다.
상기 실시예 1-1, 실시예 2-1, 준비예 1-3 ~ 7-3 및 비교예 1-1 ~ 1-6, 비교예 2-1 ~ 2-2에서 제조한 추출물에 대한 세린 단백질분해효소(serine protease) 활성 억제를 확인하기 위해 세린 단백질분해효소 억제제(serine protease inhibitor)를 활성화시키는 SPINK5의 발현이 얼마나 증가하는지 여부를 확인하고자 하였다.
HEK(Human epidermal keratinocyte)를 60 mm 플레이트(plate)에 8×105 cells/well이 되도록 접종한 후, 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 혈청이 포함되지 않은 배지에 시료를 희석하여 각 플레이트(plate)에 3ml씩 처리하였다. 처리 후, 24시간 추가 배양한 세포로부터 발현된 SPINK5 유전자 양을 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 확인하고자 하였다.
상기에서 배양한 HEK 세포를 DPBS 완충 용액으로 두 번 세척한 다음 각 플레이트에 1ml의 QIAzol을 넣고 5분 동안 상온에서 반응시킨 후, 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 200㎕ 클로로포름(chloroform)을 넣고, 15초간 보텍싱(vortexing)을 수행한 뒤, 4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심분리를 수행하였다.
이후 400㎕의 상층액을 회수한 후, 각각의 튜브에 500㎕의 아이소프로판올(isopropanol)을 가한 후, 보텍싱(vortexing) 하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 그 후, 4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 RNA를 침전시킨 후, 상등액을 버리고 75% 에탄올로 RNA 펠렛을 세척(4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심분리)한 후, 공기 중에 건조시키고 DEPC H2O를 넣어 RNA를 추출하였다.
다음으로, 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 RNA를 정량한 다음 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 Thermo 社의 cDNA 합성 키트(#K 1643)를 사용하여 다음과 같이 수행하였다. 총 RNA(1㎍)에 4㎕의 5X 반응용완충용액(reaction buffer)와 2㎕의 maxima enzyme mix를 가한 후, 총 부피가 20㎕가 되도록 뉴클레아제 프리 워터를 가하고 25℃ 10분, 50℃ 15분, 85℃ 5분 순서대로 반응 조건을 설정하여 cDNA를 합성하였다.
그 후, cDNA 증폭은 TAKARA 사의 EmeraldAmp GT PCR Master Mix(RR310A)를 사용하여 다음과 같이 수행하였다. 1㎕ cDNA와 12.5㎕ master mix, 1.25㎕ 정방향 프라이머(10pmol), 1.25㎕ 역방향 프라이머(10pmol), 9㎕ 뉴클레아제 프리 워터를 혼합하여 cDNA를 증폭하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
| 구분 | SPINK5 발현 증가율 (% of control) |
| 실시예 1-1 | 88.1 |
| 준비예 1-3 | 3.8 |
| 준비예 2-3 | 7.0 |
| 준비예 3-3 | 80.5 |
| 준비예 4-3 | 18.6 |
| 준비예 5-3 | 49.9 |
| 준비예 6-3 | 76.4 |
| 준비예 7-3 | 50.2 |
| 비교예 1-1 | 8.2 |
| 비교예 1-2 | 81.1 |
| 비교예 1-3 | 22.7 |
| 비교예 1-4 | 37.9 |
| 비교예 1-5 | 43.4 |
| 비교예 1-6 | 30.6 |
| 실시예 1-2 | 93.4 |
| 비교예 2-1 | 90.8 |
| 비교예 2-2 | 88.9 |
상기 표 4의 SPINK5 발현 증가율 평가 결과를 살펴보면, 실시예 1-1 및 실시예 2-1은 85% 이상의 SPINK5 발현 증가율을 보이는데 반해, 단독 추출물 및 비교예 1-1 ~ 1-6은 실시예 보다 상대적으로 낮은 SPINK5 발현 증가율을 보였다. 그리고, 비교예 2-1 및 비교예 2-2는 실시예 1-1 보다 상대적으로 높은 SPINK5 발현 증가율을 보였으나, 실시예 1-2와 비교할 때 낮은 SPINK5 발현 증가율을 보였다.
실험예
4 : 염증 인자 발현 억제 효능 평가
상기 실시예 1-1, 실시예 2-1 및 준비예 1-3 ~ 7-3, 비교예 1-1 ~ 1-6에서 제조한 추출물에 대한 염증 인자 발현 억제를 확인하기 위해 IL-1α의 활성이 얼마나 감소하는지 여부를 확인하고자 하였다.
HEK(Human epidermal keratinocyte)를 24 well plate에 1×105 cells/ml이 되도록 접종한 후, 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, IL-1α의 발현을 증가시키기 위한 자극원으로써 S.aureus와 S.epidermidis를 혼합 배양한 뒤 계면활성제를 처리하여 단백질분해효소의 분비를 유도한 배지를 처리함과 동시에 혈청이 포함되지 않은 배지에 시료를 희석하여 각 plate에 처리하였다. 처리 후, 24시간 배양한 세포배양액을 사용하여 ELISA 방법(Human IL-1α Quantikine ELISA kit, R&D system, DLA50)으로 배양액으로 분비된 IL-1α를 측정하였다.
배양액으로 방출된 IL-1α의 양은 ELISA 키트(kit)에 포함되어 있는 표준 용액을 희석하여 작성된 표준 농도 곡선에 시료의 흡광도를 대입하여 계산하였으며, 그 결과는 표 5에 나타내었다.
| 구분 | IL-1α 발현 억제율 (% of control) |
| 실시예 1-1 | 87.4 |
| 실시예 2-1 | 92.6 |
| 준비예 1-3 | 61.2 |
| 준비예 2-3 | 53.7 |
| 준비예 3-3 | 42.5 |
| 준비예 4-3 | 80.8 |
| 준비예 5-3 | 28.6 |
| 준비예 6-3 | 49.0 |
| 준비예 7-3 | 77.7 |
| 비교예 1-1 | 66.1 |
| 비교예 1-2 | 58.2 |
| 비교예 1-3 | 75.3 |
| 비교예 1-4 | 58.9 |
| 비교예 1-5 | 53.5 |
| 비교예 1-6 | 69.2 |
| 덱사메타손 (Dexamethasone) |
85.6 |
상기 표 5의 염증인자 발현 억제 효능 평가 결과를 살펴보면, 실시예 1-1 및 실시예 2-1은 85% 이상의 IL-1α 발현 억제율을 보이는데 반해, 단독 추출물 및 비교예 1-1 ~ 1-6은 실시예 보다 상대적으로 낮은 IL-1α 발현 억제율을 보였다.
실험예
5 : 피부 안전성 평가
실시예 1-1 및 실시예 2-1을 대상으로 피부 안전성 평가를 실시하였다.
피부 안전성 평가로 인체 첩포 실험을 수행하였으며, 이는 일차자극물질(primary irritants)을 검색하기 위한 방법으로 널리 사용되고 있으나, 피부과적으로는 알레르기성 접촉피부염의 진단을 위한 진단용 첩포시험(Diagnostic patch test)을 의미한다. 따라서 본 실험예에서는 실시예 1-1을 시료로 피부 사용에 적합한지를 판정하고자 하였다.
건강한 성인 여자 20명의 팔 안쪽 부위에 핀 챔버(Finn chamber) 키트를 이용하여 2%로 희석된 시료를 처리하여 피부에 고정하였다. 24시간 후에 이를 피부에서 떼어내고 1시간 후, 홍반과 부종의 정도를 판정하였다. 판정기준은 하기의 국제 접촉피부염 연구위원회(International contact dermatitis research group:ICDRG)의 기준에 따랐으며, 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
표 6에서 대조군은 실시예 1-1과 2-1의 추출 용매를 동일하게 2%로 희석하여 측정한 것이다.
| 시료 | 피시험자수 | 판정결과 | 자극도 | |||
| ++ | + | ± | - | |||
| 실시예 1-1 | 20 | 0 | 0 | 0 | 20 | 0 |
| 실시예 2-1 | 20 | 0 | 0 | 0 | 20 | 0 |
| 대조군 | 20 | 0 | 0 | 0 | 20 | 0 |
| (판정기준) - : 홍반이나 특이한 현상 없음 ± : 주위보다 약간 붉어짐 + : 주위보다 현저히 붉어짐 ++ : 주위보다 심하게 붉어지고 부풀어 오름 (자극도 계산식) 자극도 = [{(±)수 × 1} + {(+)수 × 2} + {(++)수 × 3}]/피시험자수 |
||||||
실험예
6 : 피부 자극 완화 효능 평가
실시예 1-1 및 실시예 2-1을 대상으로 피부 자극 완화 평가를 실시하였다. 다양한 자극원에 의해 피부 염증반응이 일어나게 되면 피부 표면에서 가려움 및 따가움 등의 자극을 느끼게 된다. 따라서 본 실험예에서는 실시예 1-1을 시료로 캡사이신에 의한 임의의 자극에 대해 완화 효능을 보이지는 확인하고자 하였다.
건강한 성인 여자 20명을 대상으로 팔 안쪽 부위에 0.02% 캡사이신을 처리하여 임의의 피부 자극을 유도한 뒤, 실시예 1-1과 실시예 2-1을 함유하는 하기 표 7과 같은 처방의 크림을 이용해 사용 전과 사용 직후의 피부 자극 완화 정도를 확인하였다. 홍반이나 특이한 현상이 없는 경우 0, 주위보다 약간 붉어지거나 약간의 자극이 있는 경우 1, 주위보다 현저히 붉어지거나 자극이 있는 경우 2, 주위보다 심하게 붉어지고 부풀어 오르거나 자극이 심한 경우 3으로 판정하고 평균으로 자극도를 계산하였으며, 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
표 8에서 대조군은 표 7에서 제조된 크림 제형에 실시예 대신 정제수를 첨가한 크림으로 측정한 것이다.
| 성분 | 실시예 1-1 (중량%) |
실시예 2-1 (중량%) |
| 정제수 (Water) | 65.70 | 65.70 |
| 디소듐 이디티에이 (Disodium EDTA) | 0.05 | 0.05 |
| 소르비탄 올리베이트 (Sorbitan Olivate) | 1.00 | 1.00 |
| 베타인 (Betaine) | 1.00 | 1.00 |
| 알란토인 (Allantoin) | 0.20 | 0.20 |
| 글리세린 (Glycerin) | 5.00 | 5.00 |
| 부틸렌 글리콜 (Butylene Glycol) | 7.00 | 7.00 |
| 1,2-헥산디올 (1,2-Hexanediol) | 2.00 | 2.00 |
| 비스-피이지-18 메칠 에텔 디메칠실란 (Bis-PEG-18 Methyl Ether Dimethyl Silane) | 1.00 | 1.00 |
| 하이드록시에칠셀룰로오스 (Hydroxyethylcellulose) | 0.05 | 0.05 |
| 폴리글리세릴-10-올리에이트 (Polyglyceryl-10 Oleate) | 1.00 | 1.00 |
| 글리세릴 스테아레이트 에스이 (Glyceryl Stearate SE) | 0.50 | 0.50 |
| 피이지-10 디메치콘 (PEG-10 Dimethicone) | 0.50 | 0.50 |
| 코코넛 오일, 알로에바라 잎 추출물 (Cocos Nucifera (Coconut) Oil, Aloe Barbadensis Leaf Extract) | 1.00 | 1.00 |
| C12-15알킬벤조에이트 (C12-15 Alkyl Benzoate) | 2.00 | 2.00 |
| 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 (Caprylic/Capric Triglyceride) | 3.00 | 3.00 |
| 디메치콘 (Dimethiocone) | 5.00 | 5.00 |
| 소듐아크릴레이트/소듐아크릴로일디메칠타우레이트코폴리머, 이소헥사데칸, 폴리소르베이트 80 (Sodium Acrylate/Sodium Acryloyldimethyl Taurate Copolymer, Isohexadecanem Polysorbate 80) | 2.00 | 2.00 |
| 실시예 1-1 or 실시예 2-1 | 2 | 2 |
| 시료 | 피시험자수 | 사용 전 자극도 | 사용 후 자극도 | 자극 완화율(%) |
| 실시예 1-1 | 20 | 2.35 | 0.35 | 85.11 |
| 실시예 2-1 | 20 | 2.3 | 0.3 | 86.96 |
| 대조군 | 20 | 2.35 | 2.25 | 4.26 |
상기 표 8의 피부 자극 완화 효능 평가 결과를 살펴보면, 실시예 1-1 및 실시예 2-1이 2% 함유된 크림을 사용했을 때 모두 85% 이상의 피부 자극 완화율을 보였다.
상기 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명의 혼합 추출물이 피부 마이크로바이옴 항상성 및 항염 효능이 우수하면서도 피부 안정성이 우수한 바, 화장료로 사용하기에 적합함을 확인할 수 있었다. 이러한 상기 혼합 추출물은 화장품, 샴푸, 비누 등 미용 소재에 적용함으로써, 고부가가치의 다양한 천연 미용제품을 제공할 수 있다.
Claims (10)
- 강황, 계피, 꿀, 화분, 로얄젤리, 프로폴리스 및 봉독의 혼합물에 대한 부틸렌 글리콜 추출물;
화분의 부틸렌 글리콜 추출물, 강황의 부틸렌 글리콜 추출물, 계피의 부틸렌 글리콜 추출물, 꿀의 부틸렌 글리콜 추출물, 로얄젤리의 부틸렌 글리콜 추출물, 프로폴리스의 부틸렌 글리콜 추출물 및 봉독의 부틸렌 글리콜 추출물을 포함하는 부틸렌 글리콜 추출물의 혼합물;
제1혼합물의 부틸렌 글리콜 추출물 및 제2혼합물의 물 추출물을 포함하는 혼합 추출물; 또는
화분의 부틸렌 글리콜 추출물, 강황의 부틸렌 글리콜 추출물, 계피의 부틸렌 글리콜 추출물, 프로폴리스의 부틸렌 글리콜 추출물, 꿀의 물 추출물, 로얄젤리의 물 추출물, 및 봉독의 물 추출물을 포함하는 추출물의 혼합물; 을 포함하고,
상기 제1혼합물은 강황, 계피, 화분 및 프로폴리스를 포함하고, 제2혼합물은 꿀, 로얄젤리 및 봉독을 포함하며,
SPINK5(Serine protease inhibitor Kazal-type 5 precursor) 발현 증가율이 85% 이상인 것을 특징으로 하는 피부 항상성 유지 및 항염성 천연 화장료.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 부틸렌 글리콜 추출물의 혼합물은 화분 100 중량부에 대하여, 강황 200 ~ 400 중량부, 계피 200 ~ 400 중량부, 꿀 150 ~ 400 중량부, 로얄젤리 20 ~ 100 중량부, 프로폴리스 10 ~ 50 중량부 및 봉독 5 ~ 30 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 항상성 유지 및 항염성 천연 화장료.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 부틸렌 글리콜 추출물 및 물(H2O) 추출물을 1 : 0.30 ~ 0.50 중량비로 포함하며,
상기 제1혼합물은 화분 100 중량부에 대하여, 강황 200 ~ 400 중량부, 계피 200 ~ 400 중량부 및 프로폴리스 10 ~ 50 중량부를 포함하고,
상기 제2혼합물은 꿀 100 중량부에 대하여, 로얄젤리 20 ~ 40중량부 및 봉독 2 ~ 10 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 항상성 유지 및 항염성 천연 화장료.
- 제1항에 있어서, 상기 부틸렌 글리콜 추출물의 혼합물은 화분의 부틸렌 글리콜 추출물 100 중량부에 대하여, 강황의 부틸렌 글리콜 추출물 200 ~ 400 중량부, 계피의 부틸렌 글리콜 추출물 200 ~ 400 중량부, 꿀의 부틸렌 글리콜 추출물 150 ~ 400 중량부, 로얄젤리의 부틸렌 글리콜 추출물 20 ~ 100 중량부, 프로폴리스의 부틸렌 글리콜 추출물 10 ~ 50 중량부 및 봉독의 부틸렌 글리콜 추출물 5 ~ 30 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 항상성 유지 및 항염성 천연 화장료.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물의 혼합물은 화분의 부틸렌 글리콜 추출물 100 중량부에 대하여, 강황의 부틸렌 글리콜 추출물 200 ~ 400 중량부, 계피의 부틸렌 글리콜 추출물 200 ~ 400 중량부, 프로폴리스의 부틸렌 글리콜 추출물 10 ~ 50 중량부 꿀의 물 추출물 150 ~ 400 중량부, 로얄젤리의 물 추출물 20 ~ 100 중량부, 및 봉독의 물 추출물 5 ~ 30 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 항상성 유지 및 항염성 천연 화장료.
- 삭제
- 강황, 계피, 꿀, 화분, 로얄젤리, 프로폴리스 및 봉독을 혼합한 혼합물을 준비하는 1단계;
상기 혼합물을 40 ~ 60 부피%의 부틸렌 글리콜 수용액과 혼합한 후, 20 ~ 30℃ 하에서 2 ~ 5시간 동안 교반하는 2단계; 및
교반용액을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 혼합 추출물을 제조하는 3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 항상성 유지 및 항염성 천연 화장료의 제조방법.
- 부틸렌 글리콜 추출물 및 물 추출물을 1 : 0.30 ~ 0.50 중량비로 혼합하여 제조하며,
상기 부틸렌 글리콜 추출물은
강황, 계피, 화분 및 프로폴리스를 혼합한 제1혼합물을 준비하는 1단계;
상기 제1혼합물을 40 ~ 60 부피%의 부틸렌 글리콜 수용액과 혼합한 후, 20 ~ 30℃ 하에서 2 ~ 5시간 동안 교반하여 제1혼합용액을 제조하는 2단계;
상기 제1혼합용액을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 혼합 추출물을 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조하며,
상기 물 추출물은
꿀, 로얄젤리 및 봉독을 혼합한 제2혼합물을 준비하는 1단계;
상기 제2혼합물을 물과 혼합한 후, 20 ~ 30℃ 하에서 2 ~ 5시간 동안 교반하여 제2혼합용액을 제조하는 2단계; 및
상기 제2혼합용액을 원심분리 후, 상등액을 여과하여 혼합 추출물을 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것을 특징으로 하는 피부 항상성 유지 및 항염성 천연 화장료의 제조방법.
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