KR102092221B1

KR102092221B1 - 갈만 추출물 유래의 생리활성 물질을 포함하는 피부 미백 및 피부 과색소침착 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102092221B1
Application number: KR1020180157199A
Authority: KR
Inventors: 김성연; 김윤철; 김다은; 장보윤; 함상옥
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2020-03-23

Abstract

피부 미백 또는 과색소침착의 예방 및 개선에 탁월한 효능을 보이는 갈만 유래의 특정 생리활성 물질을 밝히고, 이러한 생리활성 물질을 유효성분으로 함유하는 조성물로서, 의약품, 화장료 또는 건강기능식품 용도로 활용 가능한 조성물이 개시된다. 본 발명은 코릴린(Corylin) 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

Description

갈만 추출물 유래의 생리활성 물질을 포함하는 피부 미백 및 피부 과색소침착 개선용 조성물{COMPOSITIONS FOR IMPROVING SKIN WHITENING AND SKIN HYPERKERATOSIS COMPRISING PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES DERIVED FROM EXTRACT OF PUERARIAE CAULIS}

피부 미백 및 피부 과색소침착 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 갈만 추출물을 이용한 피부 미백 및 과색소침착 개선용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 나이가 들면서 피부 노화와 색소 침착에 의해 끊임없이 변한다. 이러한 피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은 부분 또는 전체적인 색소침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소침착이다.

피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제(tyrosinase)에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 케라티노사이트로의 이동은 일차적으로는 유전적 영향을 크게 받으며 부분적으로는 호르몬과 자외선 등에 영향을 받는다. 그 밖에 티로시나제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인(cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다(박수남, 대한화장품학회지, 25: 77-127, 1999). 따라서 피부색을 결정짓는 멜라닌의 합성을 억제하고 이에 관여하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하여 피부의 미백효과를 기대할 수 있다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.

한편, 갈만(葛蔓; Puerariae Caulis)은 콩과(Leguminosae)에 속하는 칡(Pueraria lobata ([0018] Willd) Ohwi)의 덩굴성 줄기로 전국의 산야에 분포한다(정보섭외, 향약대사전, pp704-706, 1998) 칡의 뿌리를 건조한 것을 갈근, 꽃은 갈화, 열매는 갈곡 혹은 갈실, 잎은 갈엽으로 한의학에서 사용하고 있다. 갈만의 성분은 푸에라린(puerarin), 다이드제인(daizein), 다이드진(daidzin), 제니스테인 (genistein), 제니스틴 (genistin) 등의 이소플라보노이드(isoflavonoid)계 화합물이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(Kinjo JE et al., Chem Pharm Bull, 35, pp4846-4850, 1987).

이러한 갈만의 용도와 관련하여 등록특허 제1151484호는 갈만 추출물의 면역증강효능 등에 관해 개시하고 있고, 피부 미백에 대하여는 명확히 알려져 있지 않고, 또한 갈만의 다양한 생리활성 물질 중 어떠한 물질이 특히 피부 미백 또는 과색소성 질환의 예방 및 개선에 영향을 미치는 것인지 명확히 알려지지 않고 있다.

따라서 본 발명은 상기 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 피부 미백 또는 과색소침착 예방 및 개선에 탁월한 효능을 보이는 갈만 유래의 특정 생리활성 물질을 밝히고, 이러한 생리활성 물질을 유효성분으로 함유하는 조성물로서, 의약품, 화장료 또는 건강기능식품 용도로 활용 가능한 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 코릴린(Corylin) 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 코릴린(Corylin) 화합물은 갈만 추출물로부터 획득된 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

또한, 상기 갈만 추출물은 에탄올 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 피부 미백과 과색소침착 예방 및 개선에 탁월한 효능을 나타내는 갈만 유래 생리활성 물질이 코릴린(Corylin) 화합물임을 명확히 제시함으로써 갈만 추출물을 활용한 피부 미백 또는 과색소침착 예방 및 개선용 조성물 제조 시 상기 물질 함량 조절 등을 통해 효율적인 제조기준을 제공하는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따른 조성물은 천연물로부터 추출한 추출물에서 유래하여 부작용이 거의 없고, 피부 세포의 티로시나제 활성을 억제하기 때문에, 이를 피부 미백 및 피부색소침착 등을 치료하거나 개선하기 위한 의약품, 화장료 또는 건강기능식품으로 사용할 경우 우수한 피부 미백 효과 및 과색소성 질환의 예방 및 개선 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 코릴린 화합물 자체의 직접적인 티로시나아제(tyrosinase) 억제능을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 2는 코릴린 화합물의 멜라닌 생합성 억제효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 3은 코릴린 화합물의 티로시나아제(tyrosinase) 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 4는 코릴린 화합물의 알파-글루코시다아제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 5a는 5B16F10 세포주에서 코릴린 화합물에 의한 MITF의 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 5b는 5B16F10 세포주에서 코릴린 화합물에 의한 TRP1의 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 5c는 5B16F10 세포주에서 코릴린 화합물에 의한 티로시나아제의 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 6은 B16F10 세포주에서 코릴린 화합물에 의한 티로시나아제(tyrosinase), MITF 및 TRP1의 단백질의 발현을 측정한 결과를 촬영한 사진이다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명자들은 갈만 추출물이 멜라닌 합성을 저해 및 티로시나아제(tyrosinase) 활성도 저해를 통해 미백 개선에 탁월한 효과를 보이고, 티로시나아제(tyrosinase), MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 및 TRP1(tyrosinase related protein 1)의 단백질과 유전자 발현을 억제시키는 것을 확인하였고, 이러한 갈만 추출물에 포함된 생리활성 물질 중 피부 미백 및 과색소침착 개선에 특이적 활성을 보이는 물질을 탐색하고자 예의 연구를 거듭한 결과, 미백 및 과색소침착 개선에 기능성을 나타내는 유효물질은 코릴린(Corylin) 화합물임을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명은 코릴린(Corylin) 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물을 개시한다.

상기 코릴린 화합물은 하기 화학식 1로 표현될 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에서 상기 코릴린 화합물은 특별히 한정되는 것은 아니나, 갈만 추출물로부터 획득되는 것이 바람직하다.

상기 갈만 추출물은 갈만으로부터 당 업계에 알려진 방법을 적절히 채택하여 제조될 수 있고, 따라서 추출시간, 용매, 온도 등의 조건은 통상의 기술자가 적절히 조절할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 또는 에틸아세테이트를 사용하여 추출할 수 있다.

본 발명에 따른 코릴린 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물은 그 목적에 따라 의약품, 화장료 또는 건강기능식품 형태로 활용될 수 있다.

상기 의약품으로 활용 시 약학적 조성물 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물로 활용 시 상기 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함될 수 있으며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체가 포함될 수 있다. 또한 상기 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 이용될 수 있다. 또한 상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 또한 상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다. 또한 상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 또한 상기제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 건강기능식품으로 활용 시 상기 유효성분 이외에 건강기능식품에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함될 수 있으며, 예컨대 건강기능성 음료로 제조 시 구연산, 올리고당, 타우린, 과실농축액 등이 포함될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

실시예 1 : 갈만 추출물 제조

갈만 에틸아세테이트(Ethyl acetate; EA) 추출

갈만 시료(경남 거창에서 채취) 10kg를 추출기에 넣고 10배의 30% 에탄올을 넣어 90∼100℃에서 3시간 추출하였다. 상기 추출된 갈만 추출액을 5μm 크기의 마이크로필터를 이용하여 여과하고 잔사를 동일 조건으로 2차 추출 및 여과 후 60℃ 이하에서 감압농축 후 건조한다. 건조 후 상기 건조된 갈만 추출물 대비 10배의 정제수를 넣어 현탁시키고, 헥산을 상기 정제수와 동일 비율로 넣어 추출한 후 헥산층을 제거하고 정제수층 취한다. 상기 정제수 층에 에틸아세트산을 넣어 2회 추출하고, 상기 추출된 에틸아세트산 층을 모두 합하여 감압농축 후 건조하여 갈만 에틸아세테이트 추출물(CDG-E) 0.145kg을 얻었다.

실시예 2 : 생리활성 물질 분리

실시예 1에서 제조한 갈만 에틸아세테이트 추출물(CDG-E) 58g을 증류수 1L에 현탁시킨 다음 클로로포름 1L로 2회 및 에틸아세테이트 1L로 2회씩 순차적으로 용매분획을 실시하여, 클로로포름 가용부 CDG-EC (10.1g)와 에틸아세테이트 가용부 CDG-EE (5.3g), 물 불용부 CDG-ES (34g) 및 물 가용부 CDG-EW(7.5g)를 얻었다.

클로로포름 가용부 CDG-EC를 CHCl₃-MeOH(18:1~0:1)을 용출용매로 하는 silica gel CC(column chromatography)를 실시하여 14개의 소분획(CDG-EC1 ~ 14)을 얻었다.

CDG-EC 3~5를 합하여 얻은 1.79g은 CHCl₃을 용출용매로 하는 Sephadex LH-20 CC를 실시하여 11개의 소분획(CDG-EC3 A ~ K)을 얻었다.

CDG-EC3 K(1.105g)를 hexane-EtOAc(4:1)를 용출용매로 하는 silica gel CC를 실시하여 13개의 소분획(CDG-EC3K 1~13)을 얻었다. 이들 소분획물 중에서 CDG-EC3K8(46.8mg)을 메탄올로 재결정하여 화합물 코릴린(corylin)을 18.5mg 얻었다.

실험예 1 : 머쉬룸 티로시나아제 저해활성 측정

머쉬룸 티로시나아제(Mushroom tyrosinase)는 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액(Potassium Phosphate Buffer(PPB), pH 6.81)에 증류수를 가한 용매에 25,000unit을 녹여 효소액으로 사용하고, 기질은 L-DOPA(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)를 0.01%로 증류수에 녹여 사용하였다. 시료는 실시예 2에서 분리한 코릴린 화합물을 농도별로 50uM, 100uM, 200uM 및 500uM을 사용하고, 양성 대조군으로 코직산(kojic acid)을 사용하였고, 무첨가군은 시료 대신 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액을 사용하였다. 96 웰(well)에 0.1M PPB 160㎕, 시료 10㎕, 기질액 20㎕, 효소액 10㎕를 넣고 실온에서 2분간 반응시켜 475nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 코릴린 화합물 자체의 직접적인 티로시나아제(tyrosinase) 억제능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 양성대조군으로 사용한 코직산(kojic acid)은 농도 의존적으로 멜라닌 함량이 감소하였으나, 코릴린 화합물의 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase) 억제 활성은 없는 것으로 나타났다.

실험예 2 : 세포 내 멜라닌 생합성 억제효과 측정

세포내 멜라닌 생합성 억제효과는 B16F10을 6 웰 플레이트(well plate)에 3×10⁴ cells/well을 접종하고 24시간 배양한 후, α-MSH(멜라닌세포 자극 호르몬, 100nM)를 처리하여 24시간 더 배양하였다. 시료는 실시예 2에서 분리한 코릴린 화합물을 농도별로 2uM, 10uM 및 50uM을 각각 사용하여 상기 α-MSH를 처리하고 48시간 동안 배양한 후 배양액을 모두 제거(PBS buffer로 세척)하여 세포를 회수한 후 3000rpm으로 5분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 제거 후 1N NaOH 용액 400㎕ 넣어 90℃ 항온조에서 1시간 반응시켜 멜라닌을 녹여내고 405nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 양성대조군으로 알부틴(Arbutin) 100uM을 사용하였다.

도 2는 코릴린 화합물의 멜라닌 생합성 억제효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 세포내 멜라닌 생합성 억제효과는 α-MSH 처리한 그룹을 100% 기준으로 해서 미백효과를 확인하는 것으로 하였다. 양성대조군으로 사용한 알부틴은 100uM에서 23.1±1.3% 멜라닌 함량이 감소하였다. 코릴린 화합물의 경우, 농도 의존적으로 멜라닌 함량이 감소하였다.

실험예 3 : 세포 내 티로시나아제 활성 측정

세포 내 티로시나아제(tyrosinase) 활성 측정은 B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 α-MSH(100nM)를 24시간 처리한 후, α-MSH와 함께 시료를 사용하였고 상기 시료는 실시예 2에서 분리한 코릴린 화합물을 농도별로 2uM, 10uM 및 50uM을 각각 사용하였다. 시료와 함께 48시간 배양한 후 트립신(trypsin)으로 세포를 얻어 PBS(PHOSPHATE BUFFERED SALINE)로 펠렛(pellet)의 배양액을 완전히 제거한 다음 EDTA와 트리톤(triton) X-100, PMSF를 포함하는 0.1M 완충액(sodium phosphate buffer(SPB), pH 6.8)으로 얼음에서 30분간 세포를 용해시켰다. 이후 4℃에서 13,000rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액에서 티로시나아제(tyrosinase)를 얻은 다음 단백질량을 계산하였다. 단백질 정량 후 각각의 세포 용해액과 0.1M SPB에 희석한 동량의 단백질과 L-DOPA를 37℃에서 1시간 반응시키고 475nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 양성대조군으로 알부틴을 사용하였다.

도 3은 코릴린 화합물의 티로시나아제(tyrosinase) 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. α-MSH를 처리한 그룹을 100% 기준으로 해서 저해 활성을 측정하였다. 양성 대조군인 알부틴은 100μM에서 14.9±1.4%의 저해활성을 나타내었고, 코릴린 화합물은 10μM 및 50μM에서 각각 19.6±2.4% 및 81.7±0.5%의 티로시나아제 저해 활성을 나타내었다.

실험예 4 : in vitro 알파-글루코시다아제(α- glucosidase ) 활성 측정

알파-글루코시다아제가 p-nitrophenyl(pNP) glycoside의 glycoside 부분을 기질로 인식하여, pNP와 glycoside를 효소반응으로 끊어주고, 여기에서 끊어져 나온 pNP의 양을 405nm에서 흡광도를 측정하여 알파-글루코시다아제의 활성을 간접적으로 측정하였다. 50mM phosphate buffer(pH 6.8)에 시료 10μl, 효소 알파-글루코시다아제(0.5 unit/mL) 10μl 를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 시료는 실시예 2에서 분리한 코릴린 화합물을 농도별로 62.5uM, 125uM 및 250uM의 농도로 각각 사용하였다. 여기에 0.2mM pNP glycoside를 넣고 37℃에서 10분 동안 효소반응을 시킨 후 1M Na₂CO₃를 3배 넣어서 반응을 정지시키고 생성된 pNP의 양을 405nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 양성대조군으로 Acarbose 500(ug/ml)를 사용하였다.

도 4는 코릴린 화합물의 알파-글루코시다아제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프로서, 코릴린 ㅎ화합물이 티로시나아제 활성화 이후 단계에 미치는 영향을 확인하고자 번역 후 변형 단계에서 작용하는 α-glucosidase의 활성을 측정하였다.

코릴린과 알파-글루코시다아제에 기질인 pNPG를 넣고 반응을 시킨 결과, 농도 의존적으로 알파-글루코시다아제의 활성을 억제시켰다. 코릴린 화합물에 의한 알파-글루코시다아제의 활성은 62.5μM에서 11%, 125μM에서 32.2% 및 250μM에서 61.4%가 저해되었으며, IC₅₀이 204.3μM로 관찰되었다.

실험예 5 : 코릴린 화합물의 미백관련 인자 mRNA 발현 분석

B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 α-MSH(100nM)를 처리하여 수행되었다. 24시간 뒤에 α-MSH와 함께 시료를 사용하였고 상기 시료는 실시예 2에서 분리한 코릴린 화합물을 농도별로 1uM 및 5uM를 각각 사용하였다. 시료를 처리한 후 48시간 동안 배양한 후 세포를 모두 수거하였다. 트립신(Trypsin)으로 세포를 얻어 PBS로 펠렛(pellet)의 배양액을 완전히 제거하였다. Eszy-Blue™ Total RNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, Korea)을 사용하여 mRNA를 추출 후, TaqMan RNA-to-Ct™ 1-Step Kit를 사용하여 추출물과 프라이머(primer)를 혼합하고 StepOne 기계에서 48℃에서 15분, 95℃에서 10분 1회, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분으로 40~60회 반복하여 Ct(threshold cycle) 값을 측정하였고, 그 결과를 도 5a 내지 도 5c에 나타내었다. 대조군으로 알부틴을 사용하였다.

도 5a 내지 5c는 5B16F10 세포주에서 코릴린 화합물에 의한 MITF, TRP1 및 티로시나아제(tyrosinase)의 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 코릴린 화합물의 MITF mRNA 발현은 α-MSH 처리군에 비해 1μM 및 5μM에서 각각 16.7% 및 34.7%의 발현 감소를 보였다. 또한, 코릴린 화합물의 TRP-1 mRNA 발현은 α-MSH 처리군에 비해 1μM 및 5μM에서 각각 26% 및 49.4%의 발현 감소를 보였다. 또한, 코릴린 화합물의 tyrosinase mRNA 발현은 α-MSH 처리군에 비해 1μM 및 5μM에서 각각 38.7 및 61%의 발현 감소를 보였다.

실험예 6 : 코릴린 화합물의 미백인자 관련 인자 단백질 발현 분석

B16F10 멜라노마 세포(melanoma cell)에 α-MSH(100nM)를 처리하여 수행되었다. 24시간 뒤에 α-MSH와 함께 시료를 사용하였고 상기 시료는 실시예 2에서 분리한 코릴린 화합물을 농도별로 1uM 및 5uM를 각각 사용하였다. 시료를 처리한 후 48시간 동안 배양한 후 세포를 모두 수거하였다. PBS로 펠렛(pellet)의 배양액을 완전히 제거한 후 프로테이나제 저해제(proteinase inhibitors)를 포함한 용균 버퍼(lysis buffer)로 얼음에서 30분간 용해시켰다. 용해물(lysate)을 13,000rpm에서 25분간 원심분리한 후, 상층액을 취해 얻은 단백질을 정량하여 사용하였다. 정량된 단백질과 5× sample buffer를 혼합하여 95℃에서 5분간 가열하여 불활성화시킨 후 SDS polyacrylamide gel에서 전기영동을 실행했다. 전기영동 된 gel의 protein을 nitrocellulose membrane으로 이동시키고 skim milk 또는 BSA로 1시간 동안 blocking 시킨 후 washing 했다. membrane에 primary antibody (Tyrosinase, TRP1, TRP2, MITF, p-GSK-3β 등)를 희석하여 4℃에서 24시간 동안 반응시키고 PBST로 세척한 후 primary-specific HRP conjugate secondary antibody를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 세척한 후 ECL 용액으로 발광시켜 ECL 용액으로 발광시켜 FluorChem E system image analyzer(Cell Biosciences, Santa Clara, CA)를 이용하여 band의 사진을 촬영하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 대조군으로 알부틴을 사용하였다.

도 6은 B16F10 세포주에서 코릴린 화합물에 의한 티로시나아제(tyrosinase), MITF 및 TRP1의 단백질의 발현을 측정한 결과를 촬영한 사진이다. α-MSH 처리군은 무처리군에 비하여 TRP-1, tyrosinase 및 MITF의 단백질 발현이 현저히 높아졌다. 코릴린 화합물을 처리 한 경우 α-MSH 처리로 증가된 MITF, TRP-1 및 tyrosinase의 단백질 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다. 양성대조군인 arbutin 100μM군과 비교했을 때 코릴린 화합물의 감소율이 현저히 높았다. 또한, 코릴린 화합물의 미백 기전을 확인하기 위하여 p-GSK3β 단백질의 발현을 확인하였고, 그 결과 p-GSK3β 단백질의 발현 증가로 인한 MITF의 억제가 일어나는 미백 기전을 확인할 수 있었다.

이와 같이, 본 발명에 따른 코릴린(Corylin) 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물의 경우, 코릴린(Corylin) 화합물은 멜라닌 합성을 저해 및 티로시나아제(tyrosinase) 활성도 저해를 통해 미백 개선에 탁월한 효과를 보이고, 티로시나아제(tyrosinase), MITF(microphthalmia-associated transcription factor) 및 TRP1(tyrosinase related protein 1)의 단백질과 유전자 발현을 억제하고 있으므로 미백 및 과색소침착을 예방 및 개선할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 도면을 참고하여 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

코릴린(Corylin) 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물로서,
상기 코릴린(Corylin) 화합물은 갈만 추출물로부터 획득된 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 갈만 추출물은 에탄올 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.