KR102081852B1 - 한우육 유래 펩타이드의 제조 방법 및 이로부터 제조된 한우육 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 - Google Patents

한우육 유래 펩타이드의 제조 방법 및 이로부터 제조된 한우육 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소고기 유래 펩타이드의 제조 방법 및 이로부터 제조된 소고기 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 소고기는 한우의 사태 부위를 사용하였으며, 본 발명의 소고기 유래 펩타이드의 제조 방법에 따르면 별도의 추가적인 공정이나 인체에 해로운 화학 약품 처리를 하지 않아 단백질이 변성될 위험이 없으며 고유의 성질 그대로 유지하면서 단백질을 높은 수율로 분리할 수 있고, 소고기 유래 펩타이드의 제조에 이용한 효소는 저렴한 비용으로 구입하여 사용이 가능하며 일반 상용 효소와 가수분해도의 차이가 없어, 상기 효소를 이용하여 경제적이면서 효율적으로 소고기 유래 펩타이드를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 소고기 유래 가수분해물 또는 펩타이드는 천연 소재에서 유래된 것으로 독성 및 부작용이 없으며, 안지오텐신 전환 효소 억제 효과 및 신경세포 보호 효과를 나타내는 것을 확인하여, 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 등으로 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

한우육 유래 펩타이드의 제조 방법 및 이로부터 제조된 한우육 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 {Method of manufacturing peptide from korean native cattle meat and composition for preventing, treating, or improving the hypertension or neurodegenerative disease comprising the peptide from korean native cattle meat using thereof}
본 발명은 한우육 유래 펩타이드의 제조 방법 및 이로부터 제조된 한우육 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
고혈압은 심장 및 혈관, 신장 질환, 동맥 경화증 및 뇌졸중과 같은 많은 심각한 질환을 유발할 수 있다. 고혈압의 원인으로는 혈전 또는 동맥경화가 가장 직접적인 원인으로 알려져 있으나, 그 외에도 생리적인 조건에서 혈압을 상승시키는 인자들에 의해 고혈압이 유발되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin converting enzyme, ACE)는 혈관을 수축시켜 혈압을 증가시키는데 결정적인 역할을 하며, 체내 유량 조절에 의해 혈압이 조절되는 RAS(Renin-angiotensin system)의 주요 인자로 알려져 있는데, 간에서 나온 prohormone인 angiotensinogen의 N 말단은 신장에서 분비되는 레닌에 의해 분해되면서 데카펩티드(decapeptide)인 안지오텐신 Ⅰ(angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ)을 분비하고, 이 때 안지오텐신 전환효소(Angiotensin converting enzyme, ACE)가 Ang Ⅰ의 C-말단에 존재하는 dipeptide His-Leu를 분해하여 혈압을 증가하는 인자인 Ang Ⅱ를 생성한다. 따라서, 이런 과정을 통해 ACE 억제제는 Ang Ⅱ 형성을 감소시키는 기전을 통해 항고혈압 활성을 가질 수 있다. 시중에서 판매되고 있는 ACE 억제제는 captopril, benzapril, enalapril, fosinopril, lisinopril, aceon 및 univasc 등 항고혈압 활성을 가지고 있지만, 이들은 기침, 고칼륨혈증, 저혈압, 두통, 피로, 태아 질병 등의 부작용을 가지고 있다. 따라서, 천연 소재에서 획득한 ACE 억제제를 이용하여 부작용을 최소화한 항고혈압 치료제에 대한 연구가 필요한 실정이었다.
또한, 최근 고령화 사회의 증가로 인해 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 기억장해 등과 같은 퇴행성 신경질환의 발생이 증가하고 있는데, 이러한 퇴행성 신경질환은 급격히 또는 천천히 진행되는 괴사(necrosis)나 아폽토시스(apoptosis)에 의한 신경 세포의 사멸로 특징지어 지며, 세포보호 기능, 산화스트레스 요인 및 항산화 활성과 관련이 있다고 보고되어 있다. 종래의 연구들에 의하면 산화 스트레스 및 자유라디칼은 세포 손상 및 기억력 손상에 영향을 준다는 보고가 있으며, 이를 예방 또는 치료하기 위한 항산화제에 있어서, 최근 안전상의 이유로 합성 항산화제보다는 천연 항산화제 사용이 증가하고 있고, 특히, 식물, 동물, 어류, 곤충 등과 같은 식품 단백질 가수분해물에서 획득한 항산화제는 흡수도, 소화, 배출, 부작용이 없다는 이점으로 많이 사용되고 있다. 또한, 식품 단백질에서 획득한 항산화 활성을 가진 생리활성 펩타이드는 자유 라디칼 소거 및 기억력 향상과 관련된 신경보호 활성을 가지고 있다고 발표된 바 있다.
이에 따라, 식품 소재에서 획득한 생리활성 펩타이드 및 그들의 항산화, 항고혈압, 항균, 항면역, 항혈전 및 오피오드 수용체 활성에 관한 많은 연구가 이루어지고 있으며, 생리활성 펩타이드는 주로 펩신(pepsin), 트립신(trypsin), alcalase, neutrase, thermolysin 등의 다양한 단백질 분해효소를 사용하여 식품 소재에서 생산될 수 있다. 그러나, 안전성이 더 높은 생리활성 펩타이드의 경우 이들을 획득하기 위해 사용되는 효소들의 비용이 매우 고가이며, 가수분해 효율이 가격에 비해 그리 크지 않다.
상기 생리활성 펩타이드 중에서도 식물 단백질 보다 필수 아미노산을 풍부하게 함유하고 있는 육류 단백질의 효소적 가수분해에 의해 획득한 생리활성 펩타이드에 대한 연구가 활발히 진행되어오고 있으나, 우리나라의 한우에서 추출한 생리활성 펩타이드에 관한 연구는 아직 미비한 실정이다.
한국등록특허 제10-1594972호
본 발명자들은 독성 및 부작용이 없는 천연 소재로부터 고혈압 및 퇴행성 신경질환의 치료제로 사용될 수 있는 생리활성 펩타이드를 획득하기 위해 연구한 결과, 바실러스 메틸로트로피쿠스(bacillus methylotrophicus)를 접종하여 발효시킨 대두박에서 추출한 효소를 이용하여 한우육 단백질로부터 저비용·고효율로 생리활성 펩타이드를 획득하였으며, 상기 생리활성 펩타이드가 안지오텐신 전환 효소 억제 및 신경세포 보호 활성을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 한우육 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 및 한우육 유래 펩타이드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 소고기로부터 단백질을 추출하는 단계;
(b) 바실러스 메틸로트로피쿠스(bacillus methylotrophicus)를 접종하여 발효시킨 대두박에서 추출한 효소를 이용하여 상기 (a) 단계의 단백질을 가수분해시킨 후 가수분해물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 수득한 가수분해물을 원심분리 하여 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 소고기 유래 펩타이드의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조한 소고기 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조한 소고기 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 소고기는 한우의 사태 부위일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin-converting enzyme, ACE) 억제 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 신경세포 보호 활성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 소고기 유래 펩타이드의 제조 방법에 따르면 별도의 추가적인 공정이나 인체에 해로운 화학 약품 처리를 하지 않아 단백질이 변성될 위험이 없으며 고유의 성질 그대로 유지하면서 단백질을 높은 수율로 분리할 수 있고, 소고기 유래 펩타이드의 제조에 이용한 효소는 저렴한 비용으로 구입하여 사용이 가능하며 일반 상용 효소와 가수분해도의 차이가 없어, 상기 효소를 이용하여 경제적이면서 효율적으로 소고기 유래 펩타이드를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 소고기 유래 가수분해물 또는 펩타이드는 천연 소재에서 유래된 것으로 독성 및 부작용이 없으며, 안지오텐신 전환 효소 억제 효과 및 신경세포 보호 효과를 나타내는 것을 확인하여, 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 등으로 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 한우육 유래 단백질로부터 가수분해물 및 펩타이드를 획득하는 방법을 순서대로 나타낸 도면이다.
도 2a 내지 도 2i는 본 발명의 일구현예에 따른 한우육 유래 단백질에 처리한 가수분해제의 종류에 따른 가수분해도를 나타낸 것으로, 도 2a는 bacillus methylotrophicus를 접종하여 발효된 대두박에서 추출한 Alkaline-AK® 효소, 도 2b는 papain, 도 2c는 tween-20, 도 2d는 detergent, 도 2e는 포화소금물, 도 2f는 염산(HCl), 도 2g는 Lactobacillus casei KCTC 9029 및 Lactobacillus sakei KCTC 3603, 도 2h는 Bacillus lichemiformis 및 Lactobacillus sakei KCTC 3598, 도 2i는 Lactobacillus sakei KCTC 3802 및 Lactobacillus sakei KCTC 3598을 이용하여 한우육 유래 단백질을 가수분해한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일구현예에 따른 한우육 단백질 유래 가수분해물로부터 분자량별로 획득한 펩타이드의 안지오텐신 전환 효소(ACE) 저해 활성을 나타낸 도면이다.
도 4a 내지 4b는 본 발명의 일구현예에 따른 한우육 단백질 유래 가수분해물로부터 분자량별로 획득한 펩타이드의 신경세포 보호 활성을 나타낸 것으로, 도 4a는 신경세포의 세포사멸(apoptosis) 억제 효과를 나타낸 도면이고, 도 4b는 신경세포 보호 활성을 핵 염색(Hoechst 33342) 방법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일구현예에 따른 한우육 단백질 유래 가수분해물로부터 분자량별로 획득한 펩타이드의 DNA 산화적 손상 예방 효과를 나타낸 도면이다.
도 6a 및 6b는 본 발명의 일구현예에 따른 한우육 단백질 유래 가수분해물로부터 분자량별로 획득한 펩타이드를 산화적 손상을 유도한 신경세포에 처리함에 따른 신경세포의 활성을 나타낸 도면이다.
도 7a는 본 발명의 일구현예에 따른 한우육 단백질 유래 가수분해물로부터 분자량별로 획득한 펩타이드를 산화적 손상을 유도한 신경세포에 처리함에 따른 활성산소종(ROS) 발생량 감소 효과를 나타낸 도면이고, 도 7b는 SOD 활성, 도 7c는 catalase 활성을 나타낸 도면이다.
본 발명은 (a) 소고기로부터 단백질을 추출하는 단계;
(b) 바실러스 메틸로트로피쿠스(bacillus methylotrophicus)를 접종하여 발효시킨 대두박에서 추출한 효소를 이용하여 상기 (a) 단계의 단백질을 가수분해시킨 후 가수분해물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 수득한 가수분해물을 원심분리 하여 펩타이드를 수득하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 소고기 유래 펩타이드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 (a) 단계의 소고기는 한우의 사태 부위일 수 있으며, 상기 단백질은 근원섬유 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 근원섬유 단백질은 인산 완충액(phosphate buffer)을 이용하여 추출될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 바실러스 메틸로트로피쿠스(bacillus methylotrophicus)를 접종하여 발효시킨 대두박에서 추출한 효소는 Alkaline-AK®이며, 상기 근원섬유 단백질에 Alkaline-AK®를 pH 7 내지 14, 40℃ 내지 80℃ 조건으로 6 내지 10시간 동안 처리하여 가수분해물을 수득할 수 있으며, Alkaline-AK®를 pH 11, 60℃에서 8시간 동안 처리할 경우, 최적의 가수분해물을 수득할 수 있으나, 상기 조건으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 (b) 단계에서 소고기 유래 단백질로부터 수득한 효소적 가수분해물 또는 (c) 단계에서 수득한 펩타이드는 생리활성 펩타이드일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "가수분해"는 생물체를 이루는 여러 유기화합물들을 물 분자를 이용하여 분해하는 과정을 말하는 것으로, 이 과정에서 첨가된 물 분자의 수소(-H)와 수산기(-OH)는 각각 중합체를 이루고 있는 인접한 두 개의 단위체와 결합을 이루게 되는데 이 과정에서 단위체들은 기존의 결합을 끊고 물 분자와 결합을 이루면서 중합체의 분리가 일어나게 되며, 일반적으로 생명체 내에서는 이러한 분해과정의 촉매로 여러 가수분해효소를 사용한다.
본 발명에서는 소고기 유래 단백질에 대한 최적의 가수분해제를 선택하기 위해 여러 가수분해효소 (papaya에서 추출한 papain, pepsin), bacillus methylotrophicus를 접종하여 발효된 대두박에서 추출한 Alkaline-AK®, Tween-20, detergent, 포화소금물, 염산, 및 발효균(Lactobacillus casei KCTC 9029, Lactobacillus sakei KCTC 3603, Bacillus lichemiformis, Lactobacillus sakei KCTC 3598, Lactobacillus sakei KCTC 3802)을 이용하여 소고기 유래 단백질을 가수분해하고 각각의 가수분해도를 모두 비교하여 분석한 결과, Alkaline-AK® 및 papain을 이용할 경우 가장 효율적이고 경제적으로 가수분해할 수 있음을 확인하였다(실시예 2 참조).
따라서, 본 발명에 따른 Alkaline-AK®는 본 발명에서 상기 여러 가지 물질들을 이용한 가수분해도 비교 실험을 통해 소고기 유래 단백질에 대한 최적의 가수분해제로 확인된 것이며, 상기 Alkaline-AK® 및 papain을 이용하여 소고기 유래 펩타이드를 제조하고 실험을 수행하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 "생리활성 펩타이드"는 몇개 또는 수십개의 아미노산이 아미노기와 카르복실기와의 탈수축합반응에 의해 결합한 펩타이드 중에서 생체에 대해 어떠한 생리작용을 가진 펩타이드를 의미하며, 상기 생리작용은 펩타이드의 종류마다 다양하다. 본 발명에서는 소고기 유래 단백질을 가수분해하여 획득한 생리활성 펩타이드가 안지오텐신 전환 효소 억제 활성 및 신경세포 보호 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조한 소고기 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "고혈압"은 18세 이상의 성인에서 수축기 혈압이 140mmHg 이상이거나 확장기 혈압이 90mmHg 이상인 증상을 나타내는 질환을 의미한다. 상기 고혈압은 발병원인에 따라 일차성 고혈압(본태성 고혈압)과 이차성 고혈압으로 분류되는데, 발병원인이 규명되지 않은 고혈압을 일차성 고혈압으로 분류하고, 발병원인이 규명된 고혈압을 이차성 고혈압으로 분류한다. 현재 밝혀진 고혈압 환자의 95%가 일차성 고혈압으로 분류되고 있다. 본 발명에서 상기 고혈압의 종류는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "퇴행성 신경질환"은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차적원인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환이며, 급격히 혹은 천천히 진행되는 괴사(necrosis)나 아폽토시스(apoptosis)에 의한 신경 세포의 사멸로 특징 지어진다. 따라서 신경세포의 사멸기전에 대한 이해는 중추신경계 질환의 예방, 조절 및 치료법 개발을 위하여 반드시 이루어져야 한다.
상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 고혈압 또는 퇴행성 신경질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 고혈압 또는 퇴행성 신경질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "약학적 조성물"은 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 이 때, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조한 소고기 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “개선”은, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품 조성물"은, 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 소고기 유래 펩타이드에 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알코올, 탄산화제, 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토오스, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐키롤리돈, 셀룰로오스, 폴리비닐피로리돈, 메틸셀룰로오스, 물, 설탕시럽, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 고혈압 또는 퇴행성 신경질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 일 실험예에서는 한우육 단백질 유래 가수분해물로부터 분자량별로 획득한 펩타이드가 안지오텐진 전환 효소(Angiotensin-converting enzyme, ACE) 억제 활성을 나타냄을 확인하였다(실험예 1 참조).
본 발명의 다른 실험예에서는 한우육 단백질 유래 가수분해물로부터 분자량별로 획득한 펩타이드가 세포 사멸(apoptosis) 억제, DNA 산화적 손상 예방, 활성산소종(ROS) 감소 효과가 있어 신경세포 보호 활성을 나타냄을 확인하였다(실험예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 한우육 단백질 유래 가수분해물로부터 분자량별로 획득한 펩타이드가 항산화 효소(SOD 및 catalase) 증가 효과를 나타냄을 확인하였다(실험예 3 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 한우육으로부터 근원섬유 단백질 추출
한우의 사태 부위를 이용하여, 외부의 과도한 결체조직을 제거하고 적육(500g)은 약 1.5cm2로 잘라 10배의 물과 함께 균질기를 이용하여 균질화 하였다. 근원섬유 단백질을 추출하기 위해 상기 균질화된 현탁액의 혈액, 지방 및 결체조직을 제거해야 하므로 계속 물을 이용하여 수세과정을 10회 이상 반복하였다. 상기의 방법으로 획득한 혈액, 지방 및 결체조직이 제거된 근원섬유 단백질이 있는 현탁액을 치즈천에 통과시켜 여과시킨 후, 3,000 × g, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상등액은 버리고 근원섬유 단백질을 획득하였다. 이러한 과정을 통해 획득한 근원섬유 단백질은 -20℃이하에서 냉동보관 하였다.
상기와 같은 근원섬유 단백질 추출 과정은 도 1에 순서대로 나타내었다.
실시예 2. 가수분해제 종류에 따른 가수분해도 평가
상기 실시예 1에서 추출한 근원섬유 단백질에 대한 최적의 가수분해제를 선택하기 위해, bacillus methylotrophicus를 접종하여 발효된 대두박에서 추출한 Alkaline-AK® 효소, papaya에서 추출한 papain, Tween-20, detergent, 포화소금물, 염산, 발효균(Lactobacillus casei KCTC 9029, Lactobacillus sakei KCTC 3603, Bacillus lichemiformis, Lactobacillus sakei KCTC 3598, Lactobacillus sakei KCTC 3802)을 이용하여 가수분해도를 평가하였다.
2-1. 효소를 이용한 가수분해
Alkaline-AK® 효소를 이용하여 상기 실시예 1에서 추출한 근원섬유 단백질을 가수분해한 결과는 도 2a에 나타내었으며, line 1은 standard, 2는 myofibrillar protein, 3은 pepsin, 4는 Alkaline-AK®를 이용하였을 때의 가수분해도를 의미한다.
또한, papain을 이용하여 상기 단백질을 가수분해한 결과는 도 2b에 나타내었으며, line 1은 standard, 2는 pepsin, 3은 Alkaline-AK®, 4는 papain을 이용하였을 때의 가수분해도를 의미한다.
상기와 같은 효소를 이용한 가수분해의 최적 조건은 pepsin의 경우 pH 2.0으로 37℃에서 1시간, Alkaline-AK®의 경우 pH 11로 60℃에서 8시간, papain의 경우 pH 6.0으로 60℃에서 4시간 반응시키는 것으로 확인되었다.
2-2. 계면활성제를 이용한 가수분해
Tween-20을 이용하여 상기 실시예 1에서 추출한 근원섬유 단백질을 가수분해한 결과는 도 2c에 나타내었으며, line 1은 standard, 2는 myofibrillar protein, 3은 pepsin, 4는 0.01% tween-20을 이용하였을 때의 가수분해도를 의미한다.
Detergent를 이용하여 상기 단백질을 가수분해한 결과는 도 2d에 나타내었으며, line 1은 standard, 2는 myofibrillar protein, 3은 pepsin, 4는 0.01% detergent를 이용하였을 때의 가수분해도를 의미한다.
상기와 같은 계면활성제를 이용한 가수분해의 최적 조건은 tween-20의 경우 0.01% tween-20 및 0.5% pepsin의 혼합을 첨가하여 pH 2.0에서 반응시키는 것, detergent의 경우는 0.01% detergent 및 0.5% pepsin의 혼합을 첨가하여 pH 2.0에서 반응시키는 것으로 확인되었다.
2-3. 포화소금물을 이용한 가수분해
포화소금물을 이용하여 상기 실시예 1에서 추출한 근원섬유 단백질을 가수분해한 결과는 도 2e에 나타내었으며, line 1은 standard, 2는 pepsin, 3은 myofibrillar protein, 4는 10% 소금물을 이용하였을 때의 가수분해도를 의미한다.
상기와 같은 포화소금물을 이용한 가수분해의 최적 조건은 10% 소금물 및 0.5% pepsin의 혼합을 첨가하여 pH 2.0에서 반응시키는 것으로 확인되었다.
2-4. 염산을 이용한 가수분해
염산(HCl)을 이용하여 상기 실시예 1에서 추출한 근원섬유 단백질을 가수분해한 결과는 도 2f에 나타내었으며, line 1은 standard, 2는 myofibrillar protein, 3은 pepsin, 4는 0.05% 1M 염산을 이용하였을 때의 가수분해도를 의미한다.
상기와 같은 염산을 이용한 가수분해의 최적 조건은 0.05% 염산 및 0.5% pepsin의 혼합을 첨가하여 pH 2.0에서 반응시키는 것으로 확인되었다.
2-5. 발효균을 이용한 가수분해
Lactobacillus casei KCTC 9029 및 Lactobacillus sakei KCTC 3603을 이용하여 상기 실시예 1에서 추출한 근원섬유 단백질을 가수분해한 결과는 도 2g에 나타내었으며, line 1은 standard, 2는 L. casei의 24시간 배양물, 3은 L. casei의 48시간 배양물, 4는 L. casei의 24시간 배양물 파쇄 후 사용, 5는 L. casei의 48시간 배양물 파쇄 후 사용, 6은 L. sakei의 24시간 배양물, 7은 L. sakei의 48시간 배양물, 8은 L. sakei의 24시간 배양물 파쇄 후 사용, 9는 L. sakei의 48시간 배양물을 파쇄 후 사용하였을 때의 가수분해도를 의미한다.
Bacillus lichemiformis 및 Lactobacillus sakei KCTC 3598을 이용하여 상기 단백질을 가수분해한 결과는 도 2h에 나타내었으며, line 1은 standard, 2는 B. lichemiformis의24시간 배양물, 3은 B. lichemiformis의 48시간 배양물, 4는 B. lichemiformis의 24시간 배양물 파쇄 후 사용, 5는 B. lichemiformis의 48시간 배양물 파쇄 후 사용, 6은 L. sakei의 24시간 배양물, 7은 L. sakei의 48시간 배양물, 8은 L. sakei의 24시간 배양물 파쇄 후 사용, 9는 L. sakei의 48시간 배양물을 파쇄 후 사용하였을 때의 가수분해도를 의미한다.
Lactobacillus sakei KCTC 3802 및 Lactobacillus sakei KCTC 3598을 이용하여 상기 단백질을 가수분해한 결과는 도 2i에 나타내었으며, line 1은 standard, 2는 L. sakei KCTC 3802 의24시간 배양물, 3은 L. sakei KCTC 3802 의 48시간 배양물, 4는 L. sakei KCTC 3802 의 24시간 배양물 파쇄 후 사용, 5는 L. sakei KCTC 3802 의 48시간 배양물 파쇄 후 사용, 6은 L. sakei KCTC 3598의 24시간 배양물, 7은 L. sakei KCTC 3598의 48시간 배양물, 8은 L. sakei KCTC 3598의 24시간 배양물 파쇄 후 사용, 9는 L. sakei KCTC 3598의 48시간 배양물을 파쇄 후 사용하였을 때의 가수분해도를 의미한다.
상기와 같은 발효균들을 이용하여 가수분해한 결과, 발효균들은 가수분해도가 낮아 가수분해제로서의 사용이 적합하지 않다고 판단되었다.
따라서, 상기 실시예 2-1 내지 2-5의 결과로부터, 다양한 가수분해제 후보물질 중에서도 가장 효율적이고 경제적인 가수분해제는 bacillus methylotrophicus를 접종하여 발효된 대두박에서 추출한 Alkaline-AK® 효소 및 papaya에서 추출한 papain인 것을 확인하였으며, 이들을 이용하여 한우육 단백질 유래 펩타이드를 제조하고, 실험을 수행하였다.
실시예 3. 한우육 유래 근원섬유 단백질로부터 가수분해물 및 펩타이드 획득
상기 실시예 1에서 추출한 근원섬유 단백질에 bacillus methylotrophicus를 접종하여 발효된 대두박에서 추출한 Alkaline-AK® 효소 및 papaya에서 추출한 papain이라는 저렴한 효소를 이용하였다. Alkaline-AK®는 IU가 180,000~200,000/g이며, 근원섬유 단백질 대비 2:1,000 중량비로 60℃, pH 11 조건에서 8시간 반응 시켰고, papain은 2:1,000 중량비로 60℃, pH 6 조건에서 4시간 반응시켰으며, 불활성화 (80℃, 15분간) 과정을 진행하여 가수분해물을 제조하였고, 이 가수분해물은 건조하여 냉동보관 하였다.
또한, 상기 제조한 가수분해물의 분자량별 펩타이드를 획득하기 위해 초미세여과장치를 이용하여 <3kDa 및 <10kDa를 분리할 수 있는 필터로 <3kDa 및 <10kDa의 펩타이드를 분리하였다. 이 과정을 통하여 획득한 펩타이드는 -80℃에서 3일간 동결건조 하여 분말화 하고 냉동보관 하였으며, 상기 과정은 도 1에 순서대로 나타내었다.
실시예 4. 아미노산 조성 분석
상기 실시예 3에서 제조한 <3kDa 및 <10kDa의 분자량을 가진 펩타이드의 아미노산 조성 분석을 수행하였다. 아미노산 조성은 C18 컬럼(5 μm, 4.6 × 250 mm, Waters, Milford, MA, USA)을 사용한 자동 아미노산 분석기(Model 835-50, Hitachi, Tokyo, Japan)로 측정하였다.
실험예 1. 한우육 단백질 유래 펩타이드의 안지오텐신 전환 효소(ACE) 저해 활성 확인
본 발명의 ACE 저해 활성은 Cushman 및 Cheung (1971)의 방법을 통해 측정하였다. 상기 실시예 3에서 획득한 펩타이드 50㎕와 기질로 사용된 4.15mM HHL(0.5M 염화나트륨(NaCl)을 포함한 50mM 나트륨 붕산염(sodium borate buffer) pH 8.3에서 N-Hippuryl-His-Leu hydrate를 녹여서 제조함) 50㎕를 혼합 후, 37℃에서 10분간 전배양하였고, 상기 혼합물에 ACE 용액 (25mU/㎖)을 혼합하여 37℃에서 30분간 더 배양하였다. 배양이 완료되면, 1M HCl을 250㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰고, 500㎕의 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 반응물에서 히프루산 (hippuric acid)를 추출하였다. 그 다음 상기 반응물을 혼합기를 사용하여 강하게 혼합해준 후, 3,000 × g, 10 분간 원심분리한 후, 상등액 250㎕를 새로운 튜브에 옮기고 1-2시간 동안 건조시켰다. 상기 추출된 히프루산을 3mL의 증류수에 녹인 후, UV-분광광도계(UV-spectrophotometer, Jasco, Tokyo, Japan)를 이용하여 228nm에서 흡광도를 측정하고, 하기 수학식 1을 이용하여 ACE 억제활성을 산출하였다.
[수학식 1]
Figure 112018078478085-pat00001
상기 수학식 1에서 C는 한우육 유래 펩타이드 대신 증류수를 첨가한 대조군의 흡광도, S는 한우육 유래 펩타이드 처리군의 흡광도, B는 대조군의 흡광도를 의미한다.
상기 방법으로 실시예 3에서 제조한 한우육 단백질 펩타이드의 ACE 억제활성을 측정한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, Alkaline-AK® 를 이용하여 획득한 펩타이드의 경우 <10kDa을 가진 펩타이드(AK10K) 보다 <3kDa 분자량을 가진 펩타이드(AK3K)에서 유의적으로 ACE 억제활성이 있는 것으로 나타났으며, papain을 이용하여 획득한 펩타이드의 경우 분자량과 상관없이 <3kDa을 가진 펩타이드(PA3K) 및 <10kDa 분자량을 가진 펩타이드(PA10K) 모두에서 ACE 억제활성이 있는 것으로 나타났다. 그러나, Alkaline-AK®를 이용하여 펩타이드를 획득하였을 때 ACE 억제활성이 더 높은 것으로 보아, Alkaline-AK®가 ACE 억제활성을 지닌 펩타이드 획득에 있어서 더 효과적인 효소라 판단되었다.
실험예 2. 한우육 단백질 유래 펩타이드의 신경세포 보호 활성 확인
2-1. SH - SY5Y 세포 배양
상기 실시예 3에서 제조한 한우육 단백질 유래 <3kDa 및 <10kDa 의 분자량을 가진 펩타이드의 신경세포 보호 효과를 확인하기 위해 인간 신경모세포종인 SH-SY5Y(KCLB, 한국세포주은행)를 사용하였다. 이들의 배양은 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 MEM 배지를 사용하였으며, 37℃로 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
2-2. Annexin V/PI 염색을 이용한 한우육 단백질 유래 펩타이드의 SH - SY5Y 세포 apoptosis 억제 효과 확인
상기 실시예 3에서 제조한 한우육 단백질 유래 펩타이드가 산화적 손상을 유도한 SH-SY5Y cell의 apoptosis 발생을 억제하여 세포 보호활성에 영향을 미치는지 확인하였다. 먼저, 상기 실험예 2-1에서 배양한 세포를 6well plate에 2×106 cells/well로 분주하고, 37℃로 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 기존 배지를 제거한 후, 상기 세포에 각 농도에 맞게 상기 실시예 3에서 획득한 한우육 단백질 유래 펩타이드를 2시간 처리한 후, 산화적 손상을 유도하기 위해 200μM H2O2로 1시간 처리하여 배양한 후 차가운 PBS를 사용하여 세포를 수거하였다. 상기 수거한 세포를 105-106 cells/㎖dl이 되도록 1X 바인딩 버퍼(binding buffer)로 희석해준 후, 2㎕의 Annexin-FITC와 2㎕의 PI(propidium iodide)를 넣어 암실상태에서 10분간 ice에서 반응시키고, 500㎕의 1X 바인딩 버퍼로 희석하였다. 상기와 같이 준비한 반응물은 flow cytometry를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 105개의 세포에 대해 분석하였을 때, 도 4a에 나타낸 바와 같이, H2O2를 처리하여 산화적 손상을 유도한 SH-SY5Y 세포에서 세포사멸율이 가장 높게 나타났으며, 한우육 단백질 유래 펩타이드를 처리한 경우 세포사멸율이 20.06-33.25%까지 감소한 것을 확인하였다. 특히, Alkaline-AK® 를 이용하여 한우육 유래 단백질로부터 획득한 <3kDa 분자량을 가진 펩타이드(AK3K)에서 세포사멸율이 가장 높게 감소한 것으로 나타나, 세포 보호 효과가 가장 뛰어남을 확인할 수 있었다(###p<0.001: 대조군과 비교한 경우, ***p<0.001: 산화적 손상 유도한 대조군과 비교한 경우).
2-3. 핵 염색을 이용한 한우육 단백질 유래 펩타이드의 SH - SY5Y 세포 사멸 억제 효과 확인
상기 실험예 2-1에서 배양한 세포를 6well plate에 2×106 cells/well로 분주하고, 37℃로 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 기존 배지를 제거한 후, 상기 세포에 각 농도에 맞게 상기 실시예 3에서 획득한 한우육 단백질 유래 펩타이드를 2시간 처리한 후, 산화적 손상을 유도하기 위해 200μM H2O2로 1시간 처리하여 배양한 후, 형광 현미경으로 측정하기 15분 전에 Hoechst 33342 형광 dye (0.5μg/mL)를 100㎕씩 처리하였다.
형광현미경 측정 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, H2O2를 처리하여 산화적 손상을 유도한 SH-SY5Y 세포에서 DNA 절편, 핵 응축 및 세포 수축 등과 같은 세포사멸과 관련된 형태가 나타났으며, 한우육 단백질 유래 <3kDa 및 <10kDa 의 펩타이드를 처리한 경우 세포 사멸과 관련된 형태가 많이 감소한 것으로 보아, 세포 보호 효과가 있는 것으로 확인되었다.
2-4. 한우육 단백질 유래 펩타이드의 DNA 산화적 손상 예방 효과 확인
DNA의 산화적 손상 예방 확인을 위해, sudhakar & Nazeer (2015)의 방법을 약간 수정하여 분석하였다. 플라스미드 pBR 322 DNA (0.5μg/mL) 1μL, 10mM PBS(pH 7.4) 3μL, 상기 실시예 3에서 획득한 한우육 단백질 유래 펩타이드 (1.25mg/mL) 1μL, 2mM FeSO4 3μL, 1mM H2O2 4μL로 구성된 총 12μL의 반응물을 잘 혼합하여, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 6X DNA loading dye 1μL을 첨가하여 실온에서 100V로 40분간 1.5% agarose gel electrophoresis에 반응시켰다. DNA 산화를 억제하는 효과는 대조군 기준으로 supercoiled monomer의 증가와 감소로 평가하였다.
상기 실시예 3에서 획득한 한우육 단백질 유래 펩타이드의 DNA 산화적 손상 예방 효과를 확인한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, H2O2를 처리하여 산화적 손상을 유도한 처리군에서 산화적 손상을 입은 형태인, supercoiled, open circular, linear 형태로 DNA 변성이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 산화적 손상을 준 처리군에 비해 한우육 단백질 유래 <3kDa 및 <10kDa 의 펩타이드 처리군에서 open circular 형태가 많이 감소하였고, 특히 Alkaline-AK®를 처리하여 얻은 펩타이드에서 확실히 open circular 형태가 감소하며 supercoiled 형태가 많이 나타난 것으로 보아, Alkaline-AK® 를 이용하여 한우육 유래 단백질로부터 획득한 펩타이드가 DNA 산화적 손상 예방 효과를 나타냄을 확인하였다.
2-5. 한우육 단백질 유래 펩타이드의 처리에 따른 세포 활성 측정
상기 실험예 2-1에서 배양한 세포를 96well plate에 5×105 cells/well로 분주하고, 37℃로 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 기존 배지를 제거한 후, 상기 세포에 각 농도에 맞게 상기 실시예 3에서 획득한 한우육 단백질 유래 펩타이드를 2시간 처리한 후, 산화적 손상을 유도하기 위해 200μM H2O2로 1시간 처리하여 배양하고, 배지가 있는 상태에서 각 well에 XTT reagent(1mg/mL의 XTT sodium salt에 0.25% electron coupling reagent(3mg/mL)혼합 용액)를 25μL 처리하고 배양기에서 2시간 배양하였다. 이후, ELISA를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 활성을 분석하였다. 또한, 형태학적 분석을 위해 상기와 같은 조건으로 세포에 한우육 단백질 유래 펩타이드를 처리한 후에 기존 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후, 현미경으로 측정하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, H2O2의 농도가 200μM 이상일 때 세포 활성이 유의하게 감소하였으며, 200μM H2O2를 처리하여 산화적 손상을 유도한 처리군에서 세포 활성이 유의하게 감소한 것에 비해, 펩타이드의 분자량과 상관없이 모든 펩타이드 처리군에서 세포 활성이 증가하는 것으로 나타났다(###p<0.001: 대조군과 비교한 경우, *p<0.05, ***p<0.001: 산화적 손상 유도한 대조군과 비교한 경우).
또한, 광학현미경으로 세포를 형태학적으로 분석한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 실제로 H2O2를 처리하여 산화적 손상을 유도한 대조군에서 세포수 감소 및 세포 형태가 손상을 입은 것을 확실하게 확인할 수 있었다. 그러나 한우육 단백질 유래 <3kDa 및 <10kDa 의 펩타이드를 처리한 경우, 정상세포와 거의 비슷한 형태를 나타내며, 세포 수도 많이 증가한 것으로 나타났다.
2-6. 한우육 단백질 유래 펩타이드의 처리에 따른 ROS 발생량 측정
상기 실험예 2-1에서 배양한 SH-SY5Y 세포를 black 96well plate에 5×105 cells/well로 분주하고, 37℃로 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 기존 배지를 제거한 후, 상기 세포에 각 농도에 맞게 상기 실시예 3에서 획득한 한우육 단백질 유래 펩타이드를 2시간 처리하고, 산화적 손상을 유도하기 위해 200μM H2O2로 1시간 처리하여 배양하였다. 그 후, 종료 30분 전에 10μM dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA)를 넣고 30분간 37℃에서 배양하고 이를 형광리더기로 측정하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, H2O2를 처리하여 산화적 손상을 유도한 처리군에서 ROS 생성량이 크게 증가한 것에 비해, 한우육 단백질 유래 펩타이드를 처리한 경우, 분자량과 상관없이 ROS 생성량이 모두 감소한 것으로 나타났다. 특히 Alkaline-AK®를 처리하여 얻은 펩타이드의 경우 papain을 처리하여 얻은 펩타이드를 처리한 경우 보다 유의적으로 ROS 생성량이 감소하여, 세포사멸 및 세포 내 산화적 손상을 더 효과적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 더 높은 세포 보호 효과를 가지는 것으로 확인되었다(###p<0.001: 대조군과 비교한 경우, **p<0.01, ***p<0.001: 산화적 손상 유도한 대조군과 비교한 경우).
실험예 3. 한우육 단백질 유래 펩타이드의 처리에 따른 신경세포 내 항산화 효소 활성 측정
3-1. SOD 활성 측정
상기 실험예 2-1에서 배양한 세포를 96well plate에 5×105 cells/well로 분주하고, 37℃로 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 기존 배지를 제거한 후, 상기 세포에 각 농도에 맞게 상기 실시예 3에서 획득한 한우육 단백질 유래 펩타이드를 2시간 처리한 후, 산화적 손상을 유도하기 위해 200μM H2O2로 1시간 처리하여 배양하였다. 그 후, 상기와 같이 처리된 세포들을 모은 후 차가운 PBS로 2,000 × g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, freeze-thaw 방법으로 20분간 세 번씩 반응시켜주었고, 다시 10,000 × g, 4℃에서 15분간 원심분리한 후에 상등액을 취하여 SOD를 측정하였으며, 이를 96well plate에 20μL 넣어주고, WST working solution을 200μL 처리한 후 잘 섞어주고, 반응물에 enzyme working solution을 20μL을 넣어 강하게 섞은 후, 37℃에서 20분간 반응시키고, ELISA를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 수학식 2를 이용하여 SOD 활성을 산출하였다.
[수학식 2]
Figure 112018078478085-pat00002
상기 수학식 2에서 A는 한우육 유래 펩타이드 처리군의 흡광도, B는 한우육 유래 펩타이드 대신 증류수를 처리한 대조군의 흡광도, C는 한우육 유래 펩타이드의 blank, D는 reagent의 blank를 의미한다.
상기 방법으로 SOD 활성을 측정한 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, papain을 이용하여 획득한 펩타이드를 처리한 세포에서는 큰 활성이 나타나지 않았지만, Alkaline-AK®를 이용하여 획득한 <3kDa 펩타이드(AK3K)를 처리한 세포에서 SOD 활성이 유의적으로 증가한 것으로 나타났다(###p<0.001: 대조군과 비교한 경우, **p<0.01, ***p<0.001: 산화적 손상 유도한 대조군과 비교한 경우).
3-2. Catalase 활성 측정
상기 실험예 2-1에서 배양한 세포를 96well plate에 5×105 cells/well로 분주하고, 37℃로 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 기존 배지를 제거한 후, 상기 세포에 각 농도에 맞게 상기 실시예 3에서 획득한 한우육 단백질 유래 펩타이드를 2시간 처리한 후, 산화적 손상을 유도하기 위해 200μM H2O2로 1시간 처리하여 배양하였다. 그 후, 상기와 같이 처리된 세포들을 모은 후 차가운 PBS로 2,000 × g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 세포 펠렛에 1mM EDTA가 들어간 1mL PBS를 넣어 초음파 처리해주고, 다시 10,000 × g, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 그 후 다시 상등액을 제거하고, 남은 부분에 catalase 처리를 한 후, ELISA를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, catalase 활성은 SOD 활성 결과와 비슷한 결과 양상을 보였으며, 특히 <3kDa 분자량을 가진 펩타이드(AK3K)를 처리한 세포에서 더 catalase 활성이 높은 것으로 나타났다(###p<0.001: 대조군과 비교한 경우, **p<0.01, ***p<0.001: 산화적 손상 유도한 대조군과 비교한 경우).
따라서, 상기 결과로부터 전반적으로 Alkaline-AK®를 이용하여 획득한 <3kDa 펩타이드를 처리한 세포에서 세포 내 항산화 효소 활성이 높은 것으로 보아, 세포 보호 효과가 높은 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (6)

  1. (a) 소고기로부터 단백질을 추출하는 단계; 및
    (b) 바실러스 메틸로트로피쿠스(bacillus methylotrophicus)를 접종하여 발효시킨 대두박에서 추출한 효소를 이용하여 상기 (a) 단계의 단백질을 가수분해시킨 후 단백질 가수분해물을 수득하는 단계를 포함하고,
    상기 단백질 가수분해물은 원심분리를 통해 분자량이 3kDa 미만 또는 3kDa 이상 10kDa 미만인 것으로 분리된 것으로, 신경세포 보호 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 소고기 유래 단백질 가수분해물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 소고기는 한우의 사태 부위인 것을 특징으로 하는, 소고기 유래 단백질 가수분해물의 제조 방법.
  3. 제1항의 방법으로 제조한 소고기 유래 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 및 뇌허혈로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin-converting enzyme, ACE) 억제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항의 방법으로 제조한 소고기 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 및 뇌허혈로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.

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