KR102070479B1

KR102070479B1 - 드라이 아이 예방·치료제

Info

Publication number: KR102070479B1
Application number: KR1020157018349A
Authority: KR
Inventors: 가즈오 츠보타; 시게루 나카무라; 도시히로 이마다; 준지 다나카; 다카시 가데카루; 히로시 시모다; 히로미치 무라이
Original assignee: 오리자유화주식회사; 각고호우징 게이오기주크
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2020-01-28
Also published as: BR112015014459A2; US20150359812A1; JP6265500B2; EP2937091A4; US11033566B2; IL239478B; US20180036328A1; ES2720205T3; IL239478A0; KR20150109354A; CN105007927A; JPWO2014098092A1; EP2937091A1; CA2895353A1; HK1214144A1; EP2937091B1; CA2895353C; WO2014098092A1

Abstract

누액의 분비능 저하를 억제하고, 또한 눈물샘 조직에서의 활성 산소의 생성을 억제하는 신규 성분의 드라이 아이 예방·치료제를 제공하는 본 발명의 드라이 아이 예방·치료제는, 마퀴 베리 추출물을 유효 성분으로서 함유한다. 또한, 본 발명의 드라이 아이 예방·치료제는, 마퀴 베리(Maqui Berry)로부터 추출되는 델피니딘(Delphinidin) 배당체를 유효 성분으로서 함유한다. 또한, 본 발명의 드라이 아이 예방·치료제는, 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드, 델피니딘-3,5-디글루코사이드, 델피니딘-3-삼부바이오사이드 및 델피니딘-3-글루코사이드 중 적어도 1종, 바람직하게는, 델피니딘-3,5-디글루코사이드를 유효 성분으로서 함유한다.

Description

드라이 아이 예방·치료제{PROPHYLACTIC／THERAPEUTIC AGENT FOR DRY EYE}

본 발명은, 누액 분비를 증가시키기 위한 안용(眼用) 조성물, 더 상세하게는 눈에 대한 과도한 부하에 의해 눈물샘의 기능이 저하하여, 분비량이 감소한 누액을 증가시키기 위한 안용 조성물에 관한 것이다.

누액은, 안구의 최외층을 덮는 두께 약 7㎛의 얇은 액층이다. 누액은, 표층으로부터, 유층(油層)·수층(水層)·무틴층의 3층 구조를 가지고 있고, 이들의 각 층이 서로 영향을 주어, 누액의 구조를 정돈하고 있다. 또한, 이들 누액의 각 층에는, 예를 들면, 락토페린, 리소자임, IgA, IgG 및 알부민 등의 단백질, 왁스, 콜레스테롤, 당질, 무틴 등의 여러 가지의 성분이 함유되어 있다. 이들의 성분을 함유하는 누액의 기능으로서는, 눈 표면의 환경을 습윤하게 유지하면서, 외계로부터 침입하는 병원체 등으로부터의 감염 방어, 다수의 생리 활성 물질의 공급 및 무혈관조직인 각막에의 산소 공급 등을 들 수 있다.

이와 같이, 누액은 여러 가지 기능을 가지고 있지만, 예를 들면, 누액의 분비에 이상이 일어나서 그의 양적·질적 변화에 의해서 누액의 증발량이 증가한 경우 등에는, 누액의 기능이 정상적으로 기능 하지 않게 되는 경우가 있다. 이러한 누액 이상이 생겼을 경우, 자각 증상으로서 안구 건조 등의 드라이 아이 증상(dry eye syndrom)을 호소하는 사례가 많다.

이러한 드라이 아이 증상이 야기되는 원인은 여러 가지 것이 보고되고 있지만, 근래 주목되고 있는 것의 하나로서, 퍼스널 컴퓨터(PC)의 디스플레이 화면(VDT)을 보면서 행하는 작업(VDT 작업)에 의한 눈에 대한 부하가 있다.

근래, IT기술의 향상과 기반 정비의 충실에 수반하여, 일상생활 중에서 PC를 사용할 기회가 비약적으로 증가했다. Intel사가 어림잡아 계산한 바, 세계에는 약 10억대의 인터넷에 접속한 PC가 있다고 말해지고 있고, 지금 오피스 워커의 대부분이 VDT를 보면서 일을 하고 있다. 이러한 PC 사용 빈도의 증가에 수반하여, VDT 작업이 원인이라고 생각되는 시각장애를 수반한 안정피로(眼精疲勞)나 드라이 아이 증상을 호소하는 사람의 증가가 확인되고 있고, 선진 공업국에서는 중대한 건강 문제로 다루어지기 시작하고 있다. 드라이 아이 증상은, VDT 작업에 의해서 눈 깜박임 회수가 통상의 4분의 1 정도로 감소하여, 누액의 증발량이 증가하는 것이 한 요인이라고 생각되고 있지만, 본 발명자들은 VDT 작업과 같은 눈에 대한 과도한 부하에 의해서 눈물샘 기능이 저하하여, 누액의 분비량이 감소하고 있는 것을 새롭게 찾아냈다.

또한, 이러한 눈에 대한 부하는 산화 스트레스인 것이 의심되고 있고, 2007년 나카무라 등의 보고(비특허문헌 1)에 의하면, VDT 작업에 의해서 야기되는 각막상피 장애는 산화 스트레스에 의한 것이 나타나고 있다.

현재, 이러한 안정피로나 안구 건조 등의 불쾌 증상을 완화하는 방법으로서, 인공누액을 점안함으로써 부족한 누액을 외부로부터 보충하는 방법이나, 눈물점을 폐쇄하는 방법 등이 알려져 있다. 그렇지만, 어느 방법도 일시적인 대증요법에 지나지 않는 것이며, 만족할 만한 것은 아니다. 그러므로, 이러한 대증요법이 아닌, 감소한 누액의 분비량을 증가시킴으로써, 안구 건조, 이물감, 눈의 불쾌감, 눈의 피로 등의 증상을 근본적으로 개선하는 방법이나, 상술한 효과가 있는 조성물이 요구되고 있다.

또한, 드라이 아이는, 눈물샘 조직에 있어서의 활성 산소가 관여하여, 드라이 아이를 예방, 치료하기 위해서 눈물샘 조직에서의 활성 산소의 생성을 억제할 필요가 있다.

Investigative Ophthalmology & Visual Science, April 2007, Vol.48, No.4, p1552-1558 「Involvement of Oxidative Stress on Corneal Epithelial Alterations in a Blink-Suppressed Dry Eye」

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은, 마퀴 베리(Maqui Berry)의 추출물이 누액의 분비능 저하를 억제하고, 또한 눈물샘 조직에서의 활성 산소의 생성을 억제하는 것을 지견했다. 그리고, 마퀴 베리의 추출물에 대부분이 포함되는 델피니딘(Delphinidin)의 배당체가 상기 생리 활성에 중요한 역할을 하는 것을 찾아내어, 본 발명을 완성 시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은, 마퀴 베리 추출물, 혹은 델피니딘 배당체에 의해, 누액의 분비능 저하를 억제하고, 또한 눈물샘 조직에서의 활성 산소의 생성을 억제하는 신규 성분의 드라이 아이 예방·치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 특징은 이하와 같다.

1. 마퀴 베리 추출물을 유효 성분으로서 함유하는, 드라이 아이 예방·치료제.

2. 마퀴 베리로부터 추출되는 델피니딘 배당체를 유효 성분으로서 함유하는, 드라이 아이 예방·치료제.

3. 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드, 델피니딘-3,5-디글루코사이드, 델피니딘-3-삼부바이오사이드 및 델피니딘-3-글루코사이드 중의 적어도 1종을 유효 성분으로서 함유하는, 드라이 아이 예방·치료제.

4. 델피니딘-3,5-디글루코사이드를 유효 성분으로서 함유하는, 드라이 아이 예방·치료제.

5. 델피니딘-3,5-디글루코사이드를 포함하는 마퀴 베리 추출물을 유효 성분으로서 함유하는, 드라이 아이 예방·치료제

6. 마퀴 베리 추출물을 유효 성분으로서 함유하는, 누액 분비능 저하 억제제.

7. 마퀴 베리로부터 추출되는 델피니딘 배당체를 유효 성분으로서 함유하는, 누액 분비능 저하 억제제.

8. 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드, 델피니딘-3,5-디글루코사이드, 델피니딘-3-삼부바이오사이드 및 델피니딘-3-글루코사이드를 유효 성분으로서 함유하는, 누액 분비능 저하 억제제.

9. 델피니딘-3,5-디글루코사이드를 포함하는 마퀴 베리 추출물을 유효 성분으로서 함유하는, 누액 분비능 저하 억제제.

10. 마퀴 베리 추출물을 유효 성분으로서 함유하는, 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제.

11. 마퀴 베리로부터 추출되는 델피니딘 배당체를 유효 성분으로서 함유하는, 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제.

12. 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드, 델피니딘-3,5-디글루코사이드, 델피니딘-3-삼부바이오사이드 및 델피니딘-3-글루코사이드 중의 적어도 1종을 유효 성분으로서 함유하는, 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제.

13. 델피니딘-3,5-디글루코사이드를 유효 성분으로서 함유하는, 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제.

14. 델피니딘-3,5-디글루코사이드를 포함하는 마퀴 베리 추출물을 유효 성분으로서 함유하는, 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제.

도 1은, 4일간 반복 투여에 의한 마우스 스트레스성 드라이 아이 모델에 있어서의 마퀴 베리 추출물 투여 후의 누액 분비능 변화(측정치, 평균±표준오차, **p < 0.01 대 초기치, # p < 0.05 대 비히클(vehicle))를 나타내는 그래프이다.
도 2는, 4일간 반복 투여에 의한 마우스 스트레스성 드라이 아이 모델에 있어서의 마퀴 베리 추출물 투여 후의 누액 분비능 변화(투여 전 값 대한 변동비, 평균±표준오차, **p < 0.01 대 초기치, # p < 0.05 대 비히클)를 나타내는 그래프이다.
도 3은, 5일간 반복 투여에 의한 마우스 스트레스성 드라이 아이 모델에 있어서의 마퀴 베리 추출물 투여 후의 누액 분비능 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 눈물샘 세포에 있어서의 마퀴 베리 추출물의 활성 산소종 발생 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 눈물샘 세포에 있어서의 활성 산소종, 발생 억제 효과에 대하여 마퀴 베리 추출물과, 다른 엑기스와의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 6은, 마퀴 베리 추출물로부터 단리(單離)된 델피니딘 배당체의 활성 산소종 발생 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은, 마퀴 베리 추출물의 HPLC 차트이다.
도 8은, 마퀴 베리 추출물의 Fr.1: 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드의 HPLC 차트이다.
도 9는, 마퀴 베리 추출물의 Fr.2: 델피니딘-3,5-디글루코사이드의 HPLC 차트이다.
도 10은, 마퀴 베리 추출물의 Fr.5: 델피니딘-3-삼부바이오사이드의 HPLC 차트이다.
도 11은, 마퀴 베리 추출물의 Fr.6: 델피니딘-3-글루코사이드의 HPLC 차트이다.
도 12는, Fr.2: 델피니딘-3,5-디글루코사이드(실시예 3) 및 Fr.6: 델피니딘-3-글루코사이드(실시예 5)와, 델피니딘-3-루티노사이드에 있어서의 눈물샘 세포에 있어서의 활성 산소종 발생 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 13은, Fr.6: 델피니딘-3-글루코사이드(실시예 5)와 그 외의 안토시아닌류(페투니딘-3-글루코사이드, 페오니딘-3-글루코사이드, 모비딘-3-글루코사이드, 시아니딘-3-글루코사이드)와의 눈물샘 세포에 있어서의 활성 산소종 발생 억제 효과의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 14는, 눈물샘 세포에 대한 각종 안토시아닌(델피니딘-3, 5-디글루코사이드; D3G5G, 델피니딘-3-글루코사이드; D3G, 델피니딘-3-루티노사이드; D3R)을 넣는 양의 비교를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 드라이 아이 예방·치료제, 누액 분비능 저하 억제제, 또는 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제는, 마퀴 베리 추출물 또는 마퀴 베리로부터 추출되는 델피니딘 배당체를 유효 성분으로서 함유한다.

또한, 본 발명의 드라이 아이 예방·치료제, 또는 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제는, 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드, 델피니딘-3,5-디글루코사이드, 델피니딘-3-삼부바이오사이드 및 델피니딘-3-글루코사이드 중의 적어도 1종 이상을 유효 성분으로서 함유한다.

상기 델피니딘은, 하기 화학 식(1)에 나타낸 화합물이다.

[화 1]

화학식 (1)

델피니딘은, 안토시아니딘의 1종이며, 식물의 주요한 색소로서 알려진 항산화물질이다. 한편, 안토시아니딘은 아글리콘으로서 당이나 당쇄와 결합되어 안토시아닌(배당체)으로 된다.

델피니딘을 얻는 방법은 특별히 제한되지는 않지만, 식물로부터 추출한 것을 이용해도 좋고, 화학적으로 합성한 것을 이용해도 좋다. 물론 델피니딘의 시판품(예를 들면 EXTRASYNTHESE 사제)을 이용해도 좋다.

본 발명에 사용하는 델피니딘 배당체로서는, 예를 들면, 하기 화학 식(2)에 나타내는 것을 들 수 있다.

[화 2]

화학식 (2)

[여기서, R¹ 내지 R³은 수산기, 당의 단량체 또는 이량체가 치환되어 있다.]

상기 델피니딘 배당체는 특별히 제한되지는 않지만, 예를 들면, 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드, 델피니딘-3,5-디글루코사이드, 델피니딘-3-삼부바이오사이드, 및 델피니딘-3-글루코사이드 등인 것이 바람직하다. 이들의 화합물은, 상기 화학 식(2)에서 나타낸 화합물 중 R₁ 내지 R₃에 하기 표 1에 나타낸 것이 치환된 것이다. 한편, 이들은 1종만 이용해도 좋고, 2종 이상 병용해도 좋다.

	R₁	R₂	R₃
델피니딘 3-O-삼부바이오사이드-5-O-글루코사이드	OH	Sam	Glu
델피니딘 3,5-O-디글루코사이드	OH	Glu	Glu
델피니딘 3-O-삼부바이오사이드	OH	Sam	H
델피니딘 3-O-글루코사이드	OH	Glu	H

Glu: 글루코스, Sam: 삼부바이오스

델피니딘 배당체를 얻는 방법은 특별히 제한되지는 않지만, 식물로부터 추출한 것을 이용해도 좋고, 화학적으로 합성한 것을 이용해도 좋다. 식물로부터 추출하는 경우는, 마퀴 베리 외, 빌베리, 카시스, 크랜베리, 콩코드(포도), 석류 등을 원료로서 이용할 수 있지만, 특히 마퀴 베리로부터 추출하는 것이 바람직하다. 마퀴 베리에는, 본 발명의 유효 성분으로 되는 델피니딘 배당체가 고농도로 함유되어 있기 때문에, 그 추출이 용이하기 때문이다. 또한 시판품을 이용해도 좋다.

마퀴 베리('아리스토넬리아 칠렌시스(Aristotelia Chilensis)'라고도 함)는, 남아메리카의 칠레 남부 원산의 베리계의 식물이며 항산화 작용이 매우 높은 것으로 알려져 있다.

또한, 마퀴 베리는, 델피니딘 배당체인 및 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드 및 델피니딘-3,5-O-디글루코사이드를 함유하는 것이 알려져 있다. 한편, 이들 성분은 다른 베리계, 예를 들면, 빌베리나 카시스(블랙 커런트)에는 함유되어 있지 않다.

발명자들의 연구에 의하면, 마퀴 베리에는, 델피니딘 배당체로서, 상기 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드 및 델피니딘-3,5-디글루코사이드에 더하여, 델피니딘-3-삼부바이오사이드 및 델피니딘-3-글루코사이드가 포함되는 것이 확인되고 있다. 특히, 델피니딘-3,5-디글루코사이드는, 그 활성이 우수하여, 드라이 아이 예방·치료제, 누액 분비능 저하 억제제, 또는 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제의 유효 성분으로서 효과적으로 작용한다.

상기 마퀴 베리 추출물에 있어서의 델피니딘 배당체의 함유량은 특별히 제한되지는 않지만, 상기 마퀴 베리 추출물을 100wt%로 한 경우, 델피니딘-3,5-O-디글루코사이드를 6 내지 25wt%, 바람직하게는 10 내지 20wt% 함유하고, 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드를 1 내지 10wt%, 바람직하게는 4 내지 8wt% 함유하는 것이 더 바람직하다.

본 발명에 있어서, 식물 원료로서 마퀴 베리로부터 유효 성분인 델피니딘 배당체를 추출하는 경우, 그 부위는 특히 한정되지 않고, 예를 들면, 과실, 종자, 꽃, 입, 뿌리, 줄기 등을 이용할 수 있으며, 특히 과실을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 유효 성분을 고농도로 추출할 수 있기 때문이다.

추출 용매로서는, 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올, 1,3-부틸렌 글리콜, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에틸 등의 극성 용매를 사용할 수 있다. 이들 용매를 2종 이상 혼합해도 좋다.

바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물인 함수 에탄올을 추출 용매로서 이용하면, 유효 성분이 효율적으로 추출된다.

추출 용매로서 물을 이용하는 경우, 물의 종류는, 특히 한정되지 않고, 수도물, 증류수, 미네랄수, 알칼리 이온수, 심층수 등을 사용할 수 있다.

추출 용매로서의 함수 에탄올을 이용하는 경우, 에탄올의 농도는 특별히 제한되지는 않지만, 특히 에탄올 농도 10 내지 90%(wt/wt), 바람직하게는 에탄올 농도 20 내지 80%(wt/wt)이면 좋다. 에탄올 농도 90%(wt/wt) 이하로 한 것은, 에탄올 농도가 너무 높으면, 마퀴 베리 중의 유분이 함수 에탄올 중으로 녹기 쉬워지기 때문이다.

추출 온도로서는, 20 내지 80℃, 바람직하게는 40 내지 50℃정도에서 행하면 좋다. 추출 온도가 너무 낮으면, 유효 성분이 추출되기 어려워지고, 추출 온도가 너무 높으면, 유효 성분이 분해되어, 생리 활성(건강 기능성)이 저하하기 때문이다.

추출 방법으로서는, 교반추출, 연속 추출, 침지 추출, 향류추출, 초임계 추출 등 임의의 방법을 채용할 수 있고, 실온 내지 환류 가열하에서 임의의 장치를 사용할 수 있다.

구체적인 추출 방법을 나타내면, 추출 용매를 채운 처리 조에 원료(마퀴 베리 과실 등)를 투입하고, 교반하면서 유효 성분을 용출시킨다. 예를 들면, 추출 용매로서 함수 에탄올을 이용하는 경우에는, 추출 원료의 2 내지 100배량 정도 (중량비)의 추출 용매를 사용하여, 30분 내지 2시간 정도 추출을 행한다. 용매 중에 유효 성분을 용출킨 후, 여과하여 추출 잔사를 제외함으로써 추출액을 얻는다.

그 후, 통상의 방법에 따라서 추출액에 희석, 농축, 정제, 건조 등의 처리를 실시하고, 본 발명에 의한 드라이 아이 예방·치료제, 누액 분비능 저하 억제제, 또는 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제로 한다.

정제 방법은, 합성 흡착 수지, 겔 여과 수지 등에 추출액을 통하여 유효 성분을 흡착시키고, 이것을 메탄올, 에탄올 등으로 용출시켜서 농축을 행하면 된다.

본 발명의 드라이 아이 예방·치료제, 누액 분비능 저하 억제제, 또는 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제는, 각종 음료 및 식품의 소재로서 사용할 수 있다. 음료 및 식품으로서는, 예를 들면, 과자류(껌, 캔디, 카라멜, 초콜릿, 쿠키, 스넥, 젤리, 구미, 정과(錠菓) 등), 면류(소바, 우동, 라면 등), 유제품(밀크, 아이스크림, 요구르트 등), 조미료(된장, 간장 등), 스프류, 음료(쥬스, 커피, 홍차, 차, 탄산음료, 스포츠 음료 등)를 비롯하는 일반 식품이나, 건강식품(정제, 캅셀 등), 영양 보조 식품(영양 드링크 등)을 들 수 있다. 이들 음료 및 식품에 본 발명의 드라이 아이 예방·치료제를 적당히 배합하면 좋다.

이들 음료 및 식품에는, 그 종류에 따라 여러 가지의 성분을 배합할 수 있고, 예를 들면, 포도당, 과당, 자당, 말토오스, 소르비톨, 스테비오사이드, 콘 시럽, 젖당, 구연산, 주석산, 사과산, 호박산, 젖산, L-아스코르빈산, dl-α-토코페롤, 에리소르빈산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 아라비아 검, 카라기난, 카제인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B류, 니코틴산 아미드, 판토텐산 칼슘, 아미노산류, 칼슘 염류, 색소, 향료, 보존제의 식품 소재를 사용할 수 있다.

구체적인 제법으로서는, 드라이 아이 예방·치료제를 분말 셀룰로오스와 함께 스프레이 드라이 또는 동결건조하여, 이것을 분말, 과립, 타정 또는 용액으로 하는 것으로 용이하게 음료 및 식품(인스턴트 식품 등)에 함유시킬 수 있다. 또한, 상기 드라이 아이 예방·치료제를, 예를 들면, 유지, 에탄올, 글리세린 혹은 이들의 혼합물에 용해하여 액상으로 하여, 음료에 첨가하든지, 고형 식품에 첨가하는 것이 가능하다. 필요에 따라서 아라비아 검, 덱스트린 등의 바인더와 혼합하여 분말 형상 혹은 과립 형상으로 하여, 음료에 첨가하든지 고형 식품에 첨가하는 것도 가능하다.

본 발명의 드라이 아이 예방·치료제, 누액 분비능 저하 억제제, 또는 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제를 음료 및 식품에 적용하는 경우의 첨가량으로서는, 병예방이나 건강 유지가 주된 목적이므로, 음료 및 식품에 대하여 유효 성분의 함량이 합계 1 내지 20wt% 이하인 것이 바람직하다.

본 발명의 드라이 아이 예방·치료제, 누액 분비능 저하 억제제, 또는 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제는, 약품(의약품 및 의약부외품을 포함한다.)의 소재로서 이용해도 좋다. 약품 제재용의 원료에, 본 발명의 드라이 아이 예방·치료제를 적당히 배합하여 제조할 수 있다. 본 발명의 드라이 아이 예방·치료제에 배합할 수 있는 제재 원료로서는, 예를 들면, 부형제(포도당, 젖당, 백당, 염화 나트륨, 전분, 탄산칼슘, 카올린, 결정 셀룰로오스, 카카오지방, 경화 식물유, 카올린, 탈크 등), 결합제(증류수, 생리식염수, 에탄올수, 단(單)시럽, 포도당액, 전분액, 젤라틴 용액, 카르복실메틸셀룰로오스, 인산 칼륨, 폴리비닐 피롤리돈 등), 붕괴제(알긴산나트륨, 칸텐, 탄산수소나트륨, 탄산칼슘, 라우릴 황산나트륨, 스테아린산 모노글리세리드, 전분, 젖당, 파우더 아라비아(powdered arabic), 젤라틴, 에탄올 등), 붕괴 억제제(백당, 스테아린, 카카오지방, 수소 첨가유 등), 흡수 촉진제(제 4급 암모늄 염기, 라우릴 황산나트륨 등), 흡착제(글리세린, 전분, 젖당, 카올린, 벤토나이트, 규산 등), 활택제(정제 탈크, 스테아린산염, 폴리에틸렌 글리콜 등) 등을 들 수 있다.

본 발명의 드라이 아이 예방·치료제, 누액 분비능 저하 억제제, 또는 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제의 투여 방법은, 일반적으로는, 정제, 환제, 연·경 캅셀제, 세립제, 산제, 과립제, 액제 등의 형태로 경구투여할 수 있지만, 비경구 투여라도 좋다. 비경구제로서 투여하는 경우는, 용액의 상태, 또는 분산제, 현탁제, 안정제 등을 첨가한 상태로, 국소 조직 내 투여, 피내, 피하, 근육내 및 정맥내 주사 등에 의할 수 있다. 또한, 좌제 등의 형태로 해도 좋다. 또한, 점안약으로서 투여할 수 있다.

투여량은, 투여 방법, 병상, 환자의 연령 등에 의해서 변화할 수 있지만, 어른은, 통상, 1일당 유효 성분으로서 0.5 내지 5000㎎, 어린이는 통상 0.5 내지 3000㎎ 정도 투여할 수 있다.

드라이 아이 예방·치료제의 배합비는, 제형에 의해서 적당히 변경하는 것이 가능하지만, 통상, 경구 또는 점막 흡수에 의해 투여되는 경우는 약 0.3 내지 15.0wt%, 비경구투여에 의한 경우는, 0.01 내지 10wt% 정도로 하면 좋다. 한편, 투여량은 여러 가지의 조건으로 다르므로, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또한, 범위를 초과하여 투여할 필요가 있는 경우도 있다.

실시예

이하, 본 발명의 실시예를 설명한다. 한편, 이하에 나타내는 실시예는, 본 발명에 의해서 얻어지는 드라이 아이 예방·치료제, 누액 분비능 저하 억제제, 또는 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제의 각종 작용·효과 등의 확인을 위해서 설명하는 것으로, 본 발명의 범위는, 이들의 제품 및 제법으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1: 마퀴 베리 추출물의 조제]

마퀴 베리(Aristotelia Chilensis)의 과실을 증류수를 이용하여 50℃에서 교반 추출을 행하였다. 그 후, 추출액을 여과하고, 합성 흡착제 컬럼에 통액(通液)하여, 80% 에탄올 수용액으로 유효성분을 포함하는 마퀴 베리 추출액(마퀴 베리 엑기스)을 용출했다. 그 후, 건조하여 마퀴 베리 추출물(실시예 1)을 얻었다. 실시예 1의 마퀴 베리 추출물을 HPLC에서 분석한 결과, 델피니딘-3,5-디글루코사이드를 12.26%, 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드를 7.76% 함유하는 것이 확인되었다.

[실시예 2 내지 5: 마퀴 베리 엑기스로부터 관여 성분의 단리]

지금까지 마퀴 베리 엑기스에 마우스 드라이 아이 모델로의 개선 작용이 분명하게 되어 있다. 그래서, 활성 성분 탐색을 위해서, 마퀴 베리 엑기스로부터 안토시아닌 성분의 단리·정제를 행하였다.

단리·정제의 방법은, 실시예 1의 조제법에 의해 얻어지는 마퀴 베리 엑기스(0.25g/5ml)를 면전(綿栓) 여과하고, 그 후 ODS Sep-Pak(Waters 사제)에 통과했다. 그리고, 분취용 HPLC에서 단리·정제를 행하였다. 조건은 이하와 같다.

이동상: 25%MeOH 0.3%TFA

UV: 520㎚

유량: 9.0ml/min

컬럼: Inertsil PREP-ODS 20×250㎜

마퀴 베리 엑기스의 성분 단리·정제를 행한 결과,

델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드(Fr.1: 실시예 2)를 6.3㎎,

델피니딘-3,5-디글루코사이드(Fr.2: 실시예 3)를 6.3㎎,

델피니딘-3-삼부바이오사이드(Fr.5: 실시예 4)를 2.5㎎,

델피니딘-3-글루코사이드(Fr.6: 실시예 5)를 4.8㎎

을 각각 단리할 수 있었다. 각각의 순도는 95% 이상이다.

이때의 HPLC 차트를 도 7 내지 도 11에 나타낸다.

[시험예 1: 마우스 스트레스성 드라이 아이 모델을 이용한 누액 분비능 저하 억제 작용의 평가]

(1-1) 시험 조건

마퀴 베리 추출물(실시예 1)에 대하여, 이하의 방법에 의해, 마우스 스트레스성 드라이 아이 모델에 있어서의 누액 분비능의 저하 억제 작용의 평가를 행하였다.

시험 동물로서 C57BL/6, 암컷, 10주령의 마우스를 이용했다. 예 수는 각 군 5-10마리로 했다.

누액 분비능, 저하 처치(스트레스 부하)는, 문헌(Tracy L. Bale1, Angelo Contarino, George W. Smith, Raymond Chan, Lisa H.gold, Paul E. Sawchenko: Mice deficient for corticotropin-releasing hormone receptor-2 display anxiety-like behaviour and are hypersensitive to stress. Naturegenetics. 24: 410-414, 2000.)에 기초하여 행하였다. 즉, 마우스를, 1일 4시간, 호흡/배설 가능한 처치를 실시한 폴리프로필렌제 원심관(용량 약 60ml) 내에 구속한다. 구속 중은 마우스 안면에 송풍(풍속 0.5 내지 1.0m/s)을 행하였다. 구속 처치 시간 이외는 케이지 내에서 먹이와 음료는 자유 섭취로 했다. 일련의 처치를 투여 기간 중, 반복 행하였다.

투여는, 이하 용량의 마퀴 베리 추출물(실시예 1)을 증류수에 적당량 용해 후, 1일당 하기 용량이 되도록, 스트레스 부하 전에 경구 존데를 이용하여 행하였다.

용량: 4㎎/kg, 20㎎/kg

대조: 증류수(비히클)

회수: 1일 1회, 4일 또는 8일간 반복

사육 조건은 이하와 같다.

온도: 23±5℃

습도: 70±15%

조명: 8시부터 20시까지 점등, 20시부터 이튿날 아침 8시까지 소등

사료 및 급수: 고형 사료, 수도물을 자유 섭취

누액 분비량의 측정은, 다음에 나타내는 방법으로 행하였다. 즉, 마우스 좌우, 외안각에 면사(ZONE-QUICK, 쇼와야쿠힝카코우 가부시키가이샤(昭和藥品化工株式會社))를 15초, 삽입하여, 면사가 누액의 침투에 의해 갈색 변색한 길이를, 0.5㎜의 정밀도로 측정했다. 측정은 스트레스 부하 전(초기치), 스트레스 부하 기간 중은 투여 눈의 다음날, 스트레스 부하 전에 실시했다. 좌우 눈의 평균치를, 개체의 누액 분비량으로 했다.

통계 해석은 다음에 나타내는 방법으로 행하였다. 즉, 초기치와 투여 4일째의 비교에서는 대응이 있는 t검정을, 군 간의 비교에서는 대응이 없는 t검정 혹은 두넷법(Dunnet method)에 의한 다중 비교 검정을 행하였다.

(1-2) 결과 및 시험예 1에 있어서의 실시예의 효과

(A) 4일간 반복 투여에 있어서의 결과(도 1 및 도 2)

4일간 반복 투여에 의한 마우스 스트레스성 드라이 아이 모델에 있어서의 마퀴 베리 추출물 투여 후의 누액 분비능 변화(측정치)의 결과를 도 1에 나타낸다. 누액량은 마퀴 베리 추출물 투여군 및 비히클 투여군 모두 감소 경향을 나타내고, 특히 비히클 투여군에 대해서는, 초기치에 비교하여 투여 1일째, 4일째에 유의하게 감소했다.

투여 전 값(초기치)에 대한 변동비를 도 2에 나타낸다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 초기치에 대한 투여 4일째의 변동비에서는 마퀴 베리 추출물은, 20㎎/kg투여군에 있어서 비히클 투여군에 대해 유의하게, 변동이 작았다. 이상에 의해, 본 실시예의 마퀴 베리 추출물은 누액 분비능의 저하를 억제하는 작용을 가지고, 드라이 아이 예방·치료제로서 유효하다는 것이 확인되었다.

(B) 8일간 반복 투여에 대한 결과(도 3)

8일간 반복 투여에 의한 마우스 스트레스성 드라이 아이 모델에 있어서의 마퀴 베리 추출물 투여 후의 누액 분비능 변화(측정치)의 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에 나타내는 바와 같이, 투여 3, 5, 8일째에서 마퀴 베리 추출물 20㎎/kg투여군에 있어서, 비히클 투여군과 비교하여 유의하게 누액 분비량이 많았다. 이상에 의해, 본 실시예의 마퀴 베리 추출물은 누액 분비능의 저하를 억제하는 작용을 가지고, 드라이 아이 예방·치료제로서 유효하다는 것이 확인되었다.

[시험예 2: 마우스 적출 눈물샘을 이용한, 마퀴 베리 추출물의 활성 산소종 억제 작용의 평가 1]

(2-1) 시험 조건

마우스 생체내(in vivo) 모델로 마퀴 베리 추출물(실시예 1)의 눈물샘 조직에서의 활성 산소종에 대한 작용을 이하의 조건에 의해 평가했다.

마우스에의 투여 방법은, 마퀴 베리 추출물(실시예 1)을 증류수에 적당량 용해 후, 1일당 하기 용량이 되도록, 스트레스 부하 전에 경구 존데를 이용하여 투여했다.

동물: C57BL/6, 암컷, 10주령

용량: 4㎎/kg, 20㎎/kg.

대조: 증류수(비히클).

회수: 1일 1회, 8일간 반복 투여.

예 수: 각 군 5-10마리

마우스의 사육 조건은, 이하와 같다.

온도: 23±5℃

습도: 70±15%

사료, 급수: 고형 사료, 수도물을 자유 섭취

활성 산소종 억제 작용의 평가는, 하기 방법에 의해 행하였다.

튜브에 적출 눈물샘을 채취하여, 25㎎ tissue/mL가 되도록 냉PBS를 첨가했다. 그 후, 산화 지르코늄 비즈를 더하고, 비즈식 파쇄장치로 눈물샘 조직을 파쇄하여, 세포 현탁액을 50μL씩 분주했다. 그 후, 세포 현탁액에 실시예 1(1, 10㎍/mL)의 마퀴 베리 추출물을 첨가하여, 활성 산소종으로서의 DCFH-DA액을 종농도 75㎛가 되도록 첨가했다. 그리고, 37℃, 60분간 인큐베이트 후, 세포를 PBS로 세정 하고, 형광 플레이트 리더로 형광 강도를 측정(λ 485/528)했다.

한편, 비교예로서 루테인(Lutein) 10㎍/mL(비교 대조)에 대해서도 같은 시험을 행하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.

또한, 비교예로서, 빌베리 엑기스(인데나 사제) 및 블랙 커런트엑기스(TAMA BIOCHEMICAL CO.,LTD제)에 대해서도 같은 시험을 행하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.

또한, Fr.1: 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드(실시예 2),

Fr.2: 델피니딘-3,5-디글루코사이드(실시예 3),

Fr.5: 델피니딘-3-삼부바이오사이드(실시예 4),

Fr.6: 델피니딘-3-글루코사이드(실시예 5)

에 대해서도 같은 시험을 행하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.

(2-2) 결과 및 시험예 2에 있어서의 실시예의 효과

도 4에 나타내는 바와 같이, 마퀴 베리 추출물(10㎍/mL)에 있어서, 눈물샘 조직에서의 활성 산소종을 유의하게 억제했다. 또한, 같은 항산화 작용을 가지고, 안질 예방 효과가 있다고 되는 루테인과 비교해도, 우수한 눈물샘 조직에서의 활성 산소 억제 효과를 가지는 것이 확인되었다.

또한, 도 5에 나타내는 바와 같이, 빌베리 엑기스(Bilberry) 및 카시스 엑기스(black currant)와 비교하여 마퀴 베리 엑기스는 활성 산소를 유의하게 억제했다. 이것에 의해, 마퀴 베리 추출물은, 드라이 아이 예방·치료제로서 유효하고, 또한, 마퀴 베리 추출물은 다른 성분과 비교해도 우수한 드라이 아이 예방·치료 효과를 가지는 것이 확인되었다. 한편, 도 5에 있어서, 「1」, 「3」, 「10」은, 각각 식물 추출물의 첨가량㎍/mL을 나타내고, 「마퀴 베리(Maquiberry)」는 실시예 1에 있어서의 마퀴 베리 엑기스이다.

또한, 도 6에 나타내는 바와 같이, Fr.1: 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드(실시예 2) Fr.2: 델피니딘-3,5-디글루코사이드(실시예 3), Fr.5: 델피니딘-3-삼부바이오사이드(실시예 4) 및 Fr.6: 델피니딘-3-글루코사이드(실시예 5)의 각 성분에 대하여, 활성 산소를 유의하게 억제하는 것이 확인되었다. 이것에 의해, 마퀴 베리 엑기스에 포함되는 이들 성분이 드라이 아이 예방·치료 효과에 있어서의 관여 성분인 것이 확인되었다.

[시험예 3: 마우스 적출 눈물샘을 이용한, 마퀴 베리 추출물의 활성 산소종 억제 작용의 평가 2]

(3-1) 시험 조건

또한, Fr.2: 델피니딘-3,5-디글루코사이드(실시예 3) 및 Fr.6: 델피니딘-3-글루코사이드(실시예 5)와, 델피니딘-3-루티노사이드(카시스에 포함되는 성분, 비교예 1)에 대하여, 시험예 2와 같은 평가를 행하였다. 그 결과를 도 12에 나타낸다.

또한, Fr.6: 델피니딘-3-글루코사이드(실시예 5)와 그 외의 안토시아닌류(페투니딘-3-글루코사이드, 페오니딘-3-글루코사이드, 말비딘-3-글루코사이드, 시아니딘-3-글루코사이드)에 대해서도, 시험예 2와 같은 평가를 행하였다. 그 결과를 도 13에 나타낸다.

(3-2) 결과 및 시험예 3에 있어서의 실시예의 효과

도 12에 나타내는 바와 같이, 델피니딘-3-루티노사이드(비교예 1)는 활성 산소를 억제하지 않고, Fr.2: 델피니딘-3,5-디글루코사이드(실시예 3) 및 Fr.6: 델피니딘-3-글루코사이드(실시예 5)는 활성 산소를 억제하고, 특히 마퀴 베리 고유의 성분인 Fr.2: 델피니딘-3,5-디글루코사이드(실시예 3)에 대하여 우수한 활성 산소의 억제 작용을 나타냈다.

이것에 의해, 다른 델피니딘 배당체와 비교하여, 마퀴 베리에 포함되는 고유의 성분인 Fr.2: 델피니딘-3,5-디글루코사이드(실시예 3)에 있어서 특히 우수한 드라이 아이 예방·치료 효과를 가지는 것이 확인되었다.

또한, 도 13에 나타내는 바와 같이, 다른 안토시아닌과 비교하여, 마퀴 베리 고유의 성분인 Fr.2: 델피니딘-3,5-디글루코사이드(실시예 3)가 특히 우수한 눈물샘 세포에 있어서의 활성 산소 억제 작용을 나타냈다. 이것에 의해, 마퀴 베리에 포함되는 안토시아닌이 보다 우수한 드라이 아이 예방·치료 작용을 가지는 것이 확인되었다.

[시험예 4: 마퀴 베리 엑기스 함유 성분의 눈물샘 세포에 있어서의 넣는 시험]

(4-1) 시험의 목적

시험예 1에 의해, 마퀴 베리 엑기스에 드라이 아이 억제 작용이 인정되고 있다. 또한, 빌베리 및 카시스와 비교하여 강한 작용이 분명하게 되어 있다. 또한, 성분에 있어서도 마퀴 베리 특유의 안토시아닌인 델피니딘-3, 5-디글루코사이드(실시예 3)가 다른 안토시아닌인 델피니딘-3-글루코사이드(빌베리의 주안토시아닌) 및 델피니딘-3-루티노사이드(카시스의 주안토시아닌: 비교예 1)와 비교하여 강한 작용을 나타냈다. 본 시험에서는, 상기의 작용 기서 해명을 위해서 HPLC를 이용하여 눈물샘 세포에 있어서의 안토시아닌의 넣는 양을 비교했다.

(4-2) 시험 조건

시험 방법은 하기와 같이 행하였다. 눈물샘 세포 현탁액에, 종농도 100nM이 되도록 각종 안토시아닌(델피니딘-3, 5-디글루코사이드, 델피니딘-3-O-글루코사이드 및 델피니딘-3-O-루티노사이드)을 첨가했다.

그 후, 37℃에서 30분간 인큐베이트를 한 후, 세포를 세정 후 buffer에 재현탁하여 HPLC로 안토시아닌 함량을 분석했다. 분석 조건을 하기에 나타낸다.

분석 플로우

세포 현탁액 50μL

↓

50μL 더한다(0.2% TFA-40% MeOH)

↓

시린지필터로 여과

↓

HPLC 분석

HPLC 조건은, 하기에 나타내는 바와 같다.

컬럼: YMC UltraHT Pro C18 φ2.0×100㎜

컬럼 온도: 30℃

용리액: A=0.3%TFA 수용액, B=아세토니트릴

그라디언트: 5%B (0 min) - 5%B (0.60 min) - 13%B (0.61 min) - 15%B (3.00 min) - 26%B (6.00 min) - 90%B (6.20 min) - 90%B (7.20 min) - 5%B (7.40 min) - 5%B (9.50 min)

유속: 0.3mL/min, 주입량: 50μL

정량 한계: 2ng/mL (시아니딘-3-O-글루코사이드)

참고문헌: Exp. Eye Res, 83, 348 (2006)

J Agric. Food Chem, 49, 1546 (2001)

(4-3) 결과 및 시험예 4에 있어서의 실시예의 효과

눈물샘 세포에의 넣는 시험을 행한 결과를 도 14에 나타낸다.

눈물샘 세포에 대한 각종 안토시아닌의 넣는 양(Mean±SE, n=6, 델피니딘-3, 5-디글루코사이드; D3G5G, 델피니딘-3-글루코사이드; D3G, 델피니딘-3-루티노사이드; D3R)을 비교한 결과, 마퀴 베리 특유 성분인 델피니딘-3, 5-디글루코사이드 (D3G5G)은, 델피니딘-3-글루코사이드 (D3G;빌베리 성분) 및 델피니딘-3-루티노사이드 (D3R;카시스 성분)보다, 많이 세포 내에 받아들여지는 것이 분명해졌다. 이것에 의해, 마퀴 베리 엑기스는 눈물샘 세포에의 넣는 기구에 의해서 동(同) 세포에 축적되기 쉽고, 다른 안토시아닌 소재보다 드라이 아이에 대하여 유효적으로 작용하는 것이 판명되었다.

본 발명에 의한 드라이 아이 예방·치료제의 배합예를 나타낸다. 한편, 이하의 배합예는 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

배합예 1: 추잉껌

설탕 53.0wt%

껌 베이스 20.0

글루코오스 10.0

물엿 16.0

향료 0.5

드라이 아이 예방·치료제 0.5

100.0wt%

배합예 2: 구미

환원 물엿 40.0wt%

그라뉴당 20.0

포도당 20.0

젤라틴 4.7

물 9.68

유자 과즙 4.0

유자 플레이버 0.6

색소 0.02

드라이 아이 예방·치료제 1.0

100.0wt%

배합예 3: 캔디

설탕 50.0wt%

물엿 33.0

물 14.4

유기산 2.0

향료 0.2

드라이 아이 예방·치료제 0.4

100.0wt%

배합예 4: 요구르트(하드·소프트)

우유 41.5wt%

탈지분유 5.8

설탕 8.0

한천 0.15

젤라틴 0.1

유산균 0.005

드라이 아이 예방·치료제 0.4

향료 미량

물 잔여

100.0wt%

배합예 5: 청량 음료

과당 포도당 액당 30.0wt%

유화제 0.5

드라이 아이 예방·치료제 0.3

향료 적당량

정제수 잔여

100.0wt%

배합예 6: 정과

설탕 76.4wt%

글루코오스 19.0

자당 지방산 에스테르 0.2

드라이 아이 예방·치료제 0.5

정제수 3.9

100.0wt%

배합예 7: 소프트 캅셀

현미 배아유 47.0wt%

유자 종자유 40.0

유화제 12.0

드라이 아이 예방·치료제 1.0

100.0wt%

배합예 8: 정제

젖당 54.0wt%

결정 셀룰로오스 30.0

전분 분해물 10.0

글리세린 지방산 에스테르 5.0

드라이 아이 예방·치료제 1.0

100.0wt%

배합예 9: 점안제

푸말산 케토티펜 0.7wt%

아줄렌 설폰산나트륨 0.2

크로모글릭산나트륨 9.8

L-아스파라긴산 칼륨 8.5

알란토인 3.0

염산 테트라히드로졸린 0.5

메틸 황산 네오스티그민 0.05

염화 벤잘코늄액 0.1

글리세린 25.0

드라이 아이 예방·치료제 1.0

pH조절제 적당량

정제수 잔부

100.0wt%

산업상의 이용 가능성

이상에 의해, 본 발명은, 식재로서 안전한 마퀴 베리를 원료로서, 신규 성분의 드라이 아이 예방·치료제, 눈물샘 분비능 저하 방지 억제제, 및 눈물샘 조직에서의 활성 산소 생성 억제제를 제공할 수 있다.

Claims

마퀴 베리(Maqui Berry) 추출물을 유효 성분으로 하는, 누액 분비능 저하 억제제로서,
상기 마퀴 베리 추출물을 100wt%로 한 경우, 델피니딘-3,5-O-디글루코사이드를 6 내지 25wt% 함유하고, 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드를 1 내지 10wt% 함유하는, 누액 분비능 저하 억제제.
마퀴 베리(Maqui Berry) 추출물을 유효 성분으로 하는, 누액 분비능 저하 억제용 식품조성물로서,
상기 마퀴 베리 추출물을 100wt%로 한 경우, 델피니딘-3,5-O-디글루코사이드를 6 내지 25wt% 함유하고, 델피니딘-3-삼부바이오사이드-5-글루코사이드를 1 내지 10wt% 함유하는, 누액 분비능 저하 억제제용 식품조성물.
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