KR102047808B1 - 특유의 성장인자들의 조합을 유효성분으로 함유하는 피부재생 또는 주름개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 TGF-β1(Transforming Growth Factor β1), TGF-β3(Transforming Growth Factor β3), PDGF-BB(Platelet-Derived Growth Factor BB) 및 IGF-1(Insulin-like growth factor 1)으로만 이루어진 4종의 성장인자들의 조합을 유효성분으로 함유하는 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 제공한다. 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 피부섬유아세포의 증식 및 이동을 촉진시키고 피부에서 콜라겐 생성을 증가시킴으로써 피부재생 및/또는 주름개선 효과가 우수하다. 특히, 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 TGF-β1(Transforming Growth Factor β1), TGF-β3(Transforming Growth Factor β3), PDGF-BB(Platelet-Derived Growth Factor BB) 및 IGF-1(Insulin-like growth factor 1)으로만 이루어진 4종의 성장인자들의 조합에 의해 피부재생 및/또는 주름개선의 시너지 효과를 나타내어 피부재생 및/또는 주름개선 효과를 극대화할 수 있다.
Description
본 발명은 특유의 성장인자들의 조합을 유효성분으로 함유하는 피부재생 또는 주름개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 TGF-β1(Transforming Growth Factor β1), TGF-β3(Transforming Growth Factor β3), PDGF-BB(Platelet-Derived Growth Factor BB) 및 IGF-1(Insulin-like growth factor 1)으로만 이루어진 4종의 성장인자들의 조합을 유효성분으로 함유하는 피부재생 또는 주름개선용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 화장료 조성물, 피부외용제 및 약학 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부는 표피, 진피, 결합조직 및 피하지방 등으로 구성되어 있다. 진피층은 탄력섬유로 알려진 콜라겐과 엘라스틴으로 구성되어 있는데, 콜라겐과 엘라스틴은 피부의 탄력을 주어 피부의 처짐이나 주름을 방지한다.
피부 노화가 일어나면 피부탄력이 감소하고 피부주름이 증가하게 된다. 피부탄력 감소 및 피부주름 형성은 진피층에서의 콜라겐 및 엘라스틴의 합성이 감소하고 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP(matrix metalloproteinase) 및 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스틴분해효소(elastase)의 발현이 촉진되어 나타나는 것으로 알려져 있다. 또한, 탄력섬유인 콜라겐과 엘라스틴이 자외선 등의 산화인자들에 의해 생성된 자유 라디칼에 의해 손상을 받아 피부의 탄력이 감소되고 주름이 생성된다.
주름방지를 위해 아데노신, 레티노인산(retinoic acid), 식물추출물 등을 사용하고 있으나, 아데노신은 임상 효능이 미미하고 레티노인산은 가임여성에게 사용할 수 없고 홍반 등의 부작용이 있다. 또한, 식물추출물의 경우 그 효능이 미미하며 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있는 것에 불과한 경우가 많다.
한편, 성장인자는 체내에서 세포의 성장, 증식 및 분화를 촉진하는 단백질로서, 현재 화장품 원료로 ICID (국제 화장품 원료집)에 20여종이 등재되어 있다. 성장인자는 동일한 성분이라도 적용되는 인체 부위에 따라 세포 성장에 대한 영향이 다양하게 나타나며, 세포의 성장과 증식을 유도하는 성장인자와 세포의 분화를 촉진시키는 역할을 하는 성장인자로 크게 나눌 수 있다.
성장인자들 중 EGF(Epidermal growth factor)는 각종 상피의 상처를 치유하는 내인성 인자로 알려져 있고, 당뇨병성 족부궤양을 포함한 난치성 만성 창상 치료제로 사용되고 있다. 창상 치료제는 피부의 섬유아세포의 증식과 세포 이동을 유도하는 특징이 있어 피부재생에도 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 성장인자들 중 EGF(Epidermal growth factor), FGF(Fibroblast growth factor), PDGF(Platelet-Derived Growth Factor) 등은 진피 세포의 성장과 콜라겐 생성을 촉진하는 것으로 알려져 있고, EGF는 화장품 원료로도 사용되고 있다.
이와 관련하여 대한민국 공개특허공보 제10-2007-0000005호는 섬유아세포 성장인자(FGF)를 동종 유래 혹은 자가유래 지방세포로부터 분리하여 주름개선 및/또는 노화방지용 기능성 화장료 조성물로 사용하는 것을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2007-0118719호는 상피세포성장인자(EGF) 및 섬유아세포성장인자(FGF)를 함유하는 피부 도포용 조성물을 미백, 항산화, 보습, 튼살 방지 및 주름개선 등에 사용하는 것을 개시하고 있으며, 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0056838호에서는 상피세포성장인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자-AA(PDGF-AA) 및 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1)을 포함하는 피부 재생 촉진제를 개시하고 있다.
전술한 종래기술들에 개시된 바와 같이 성장인자는 단일성분 뿐만 아니라 복합성분으로 사용되어 주름개선이나 피부재생 효과를 극대화하는 방안들이 모색되고 있다. 그러나 성장인자들을 단순히 추가하는 방식으로 복합 성장인자 조성물을 구성할 경우 성장인자 추가에 따른 주름개선이나 피부재생 효과의 추가적 상승이 기대와는 달리 얻어지지 않고 제조비용만 증가하는 문제가 있다.
본 발명자들은 피부주름개선이나 피부재생에 있어서 그 효과를 극대화할 수 있는 성장인자들의 특유의 조합에 대해 예의 연구를 거듭한 결과, TGF-β1(Transforming Growth Factor β1), TGF-β3(Transforming Growth Factor β3), PDGF-BB(Platelet-Derived Growth Factor BB) 및 IGF-1(Insulin-like growth factor 1)으로 이루어진 4종의 성장인자들의 조합에 의한 피부주름개선 및/또는 피부재생 시너지 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 특유의 성장인자들의 조합을 유효성분으로 함유하는 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 제공하는데 있다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 TGF-β1(Transforming Growth Factor β1), TGF-β3(Transforming Growth Factor β3), PDGF-BB(Platelet-Derived Growth Factor BB) 및 IGF-1(Insulin-like growth factor 1)으로만 이루어진 4종의 성장인자들의 조합을 유효성분으로 함유하는 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 화장료 조성물, 피부외용제 및 약학 조성물을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 주름개선이나 피부재생에 관련된 개별 성장인자들을 스크리닝한 후 성장인자들의 다양한 조합을 도출하였고 이들 중 피부재생 및 피부주름 개선 효과가 가장 우수한 성장인자들의 조합을 안출하였다.
즉, 본 발명자들은 개별 성장인자들의 피부재생이나 주름개선 관련 효력시험 결과를 바탕으로 TGF-β1(Transforming Growth Factor β1), TGF-β3(Transforming Growth Factor β3), PDGF-BB(Platelet-Derived Growth Factor BB), IGF-1(Insulin-like growth factor 1) 및 EGF(Epidermal growth factor)로 구성된 5종의 성장인자들의 조합을 1차로 선별하였고 상기 5종의 성장인자들 중 1종의 성장인자를 각기 배제한 4종의 성장인자들의 조합들(총 5가지)을 추가로 도출하였다. 그리고 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합과 4종의 성장인자들의 조합 각각(5종의 성장인자들에서 각기 1종의 성장인자를 배제한 것)의 피부재생 및 피부주름 개선 효과를 비교 평가한 결과, TGF-β1(Transforming Growth Factor β1), TGF-β3(Transforming Growth Factor β3), PDGF-BB(Platelet-Derived Growth Factor BB) 및 IGF-1(Insulin-like growth factor 1)으로만 이루어진 4종의 성장인자들의 조합이 피부재생 및 피부주름 개선 효과에서 가장 우수한 것을 확인하여 본 발명을 안출하기에 이르렀다.
한편, 본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부주름" 또는 "주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐과 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어인 "주름개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화하는 것을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "피부"는 인간이나 동물의 얼굴, 목, 손, 발, 팔다리, 기타 몸통 부위 등의 체표를 덮는 조직으로서 두피를 포함하는 개념이다.
본 발명의 일 구체예의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 TGF-β1(Transforming Growth Factor β1), TGF-β3(Transforming Growth Factor β3), PDGF-BB(Platelet-Derived Growth Factor BB) 및 IGF-1(Insulin-like growth factor 1)으로만 이루어진 4종의 성장인자들의 조합을 유효성분으로 함유한다.
본 발명의 일 구체예의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 피부섬유아세포의 증식을 촉진시키고, 피부섬유아세포의 이동을 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 콜라겐 생성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 EGF(Epidermal growth factor)를 배제한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 EGF를 포함하는 5종의 성장인자들의 조합인 TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF의 조합 보다 피부재생 또는 주름개선 효능이 우수하다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF의 조합 보다 콜라겐 생성을 더 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF의 조합 보다 피부섬유아세포의 이동을 더 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 화장료 조성물, 피부 외용제 또는 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부재생 또는 주름개선용 조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 피부재생 및/또는 주름개선 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여량은 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 구성하는 성장인자들의 활성, 연령, 체중, 성별, 건강 상태, 투여시간, 투여 경로, 배출률, 약물 배합, 피부 상태 및 주름의 경중을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주름이 생긴 피부 부위 또는 피부재생을 촉진하고자 하는 부위에 국소 도포 또는 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 진피층 또는 피하조직에 투여될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 피부재생 또는 주름개선용 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 크림, 로션, 연고, 토닉, 트리트먼트, 컨디셔너, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 오일, 왁스, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 샴푸, 비누, 린스, 계면활성제-함유 클렌징 등의 다양한 형태로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 피부재생 및/또는 주름개선을 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 전술한 것 이외에도 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부의 주름개선을 통한 미용방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 피부의 주름개선을 통한 미용방법은, 상기 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 준비하는 단계와, 상기 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 포유동물의 피부에 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 피부섬유아세포의 증식 및 이동을 촉진시키고 피부에서 콜라겐 생성을 증가시킴으로써 피부재생 및/또는 주름개선 효과가 우수하다. 특히, 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물은 TGF-β1(Transforming Growth Factor β1), TGF-β3(Transforming Growth Factor β3), PDGF-BB(Platelet-Derived Growth Factor BB) 및 IGF-1(Insulin-like growth factor 1)으로만 이루어진 4종의 성장인자들의 조합에 의해 피부재생 및/또는 주름개선의 시너지 효과를 나타내어 피부재생 및/또는 주름개선 효과를 극대화할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 성장인자들 각각의 처리에 의한 HDF 세포 이동 효능을 나타내는 현미경 사진들이다.
도 2는 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포 증식률과 4종의 성장인자들의 조합 각각(5종의 성장인자들에서 각기 1종의 성장인자를 배제한 것)의 처리에 의한 HDF 세포 증식률을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 구성하는 4종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1F)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포 증식률과 상기 조합을 구성하는 각각의 성장인자의 처리에 의한 HDF 세포 증식률을 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 구성하는 4종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1F)의 조합의 처리에 의한 콜라겐 생성량과 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 콜라겐 생성량을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 구성하는 4종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1F)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포 이동 효능과 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포 이동 효능을 비교하여 나타내는 현미경 사진들이다.
도 6은 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 구성하는 4종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1F)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포의 이동 세포수와 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포의 이동 세포수를 비교한 그래프이다.
도 2는 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포 증식률과 4종의 성장인자들의 조합 각각(5종의 성장인자들에서 각기 1종의 성장인자를 배제한 것)의 처리에 의한 HDF 세포 증식률을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 구성하는 4종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1F)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포 증식률과 상기 조합을 구성하는 각각의 성장인자의 처리에 의한 HDF 세포 증식률을 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 구성하는 4종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1F)의 조합의 처리에 의한 콜라겐 생성량과 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 콜라겐 생성량을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 구성하는 4종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1F)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포 이동 효능과 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포 이동 효능을 비교하여 나타내는 현미경 사진들이다.
도 6은 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물을 구성하는 4종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1F)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포의 이동 세포수와 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포의 이동 세포수를 비교한 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 실험방법
실시예 1-1: 세포 배양
모든 세포는 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. HDF(Human dermal fibroblast)는 인간의 피부섬유아세포로 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. HDF 세포는 일차배양세포로 계대 8(passage 8) 이하의 세포만을 이용하여 실험을 수행하였다. CCD-986sk 세포는 HDF 세포와 유사한 피부섬유아세포로 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 IMDM 배지에서 배양하였다.
실시예 1-2: 세포 증식 실험
성장인자 처리에 의한 피부섬유아세포의 증식 효과를 확인하기 위해 성장인자를 처리한 후 24시간, 48시간 및 72시간이 경과한 시점에서 MTT 어세이를 통해 피부섬유아세포의 증식을 관찰하였다. HDF 세포는 10% FBS DMEM 배지에서 3×103 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하였다. CCD-986sk 세포는 10% FBS DMEM 배지에서 6×103 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하였다. 다음날 FBS 제거를 위해 무혈청 배지로 교체한 후 1시간 동안 인큐베이션하였다. 성장인자를 각각의 농도에 맞게 HDF 세포 및 CCD-986sk 세포에 처리한 후 24시간, 48시간 및 72시간이 경과한 시점에서 MTT 용액을 추가하였고 3시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 제거하고 불용성 포르마잔(unsoluble formazan)을 DMSO로 녹인 후 색깔 변화 차이를 570nm 흡광도에서 ELISA 리더기(SoftMax Pro5, Molecular Devices, USA)를 사용하여 측정하였다.
실시예 1-3: 세포 이동 실험
6-웰 플레이트에 90% 이상의 세포밀집도(confluency)가 되도록 HDF 세포를 2.5×105 세포/웰로 파종하였다. 200μL 파이펫 팁을 이용하여 플레이트 바닥을 긁어 세포가 부착되지 않은 부분을 만들었다. PBS로 2회 세척하여 떨어져 나간 세포들을 제거하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에서 10ng/ml 및 100ng/ml의 성장인자 각각을 처리하였다. 상처가 생긴 후 0시간째, 24시간째 및 48시간째에 같은 위치를 현미경으로 촬영하였다. 24시간 동안 및 48시간 동안 이동한 세포수를 카운팅하여 세포 이동 효능을 측정하였다.
실시예 1-4: 콜라겐 생성 측정 실험
HDF 세포를 24웰 플레이트에 2×104 세포/웰로 파종한 다음, 다음날 무혈청 DMEM 배지로 교체하여 1시간 동안 배양하였다. 새로운 무혈청 DMEM 배지에서 다양한 성장인자 각각을 10ng/ml 및 100ng/ml의 농도로 처리하였고 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양하였다. 각각의 성장인자 처리 후 24시간, 48시간 및 72시간이 경과한 시점에서 세포배양 상층액을 튜브에 모은 후, 1500 rmp에서 3분 동안 원심분리하여 세포 찌거기(debris)를 제거하였다. 확보한 상층액은 ELISA 실험 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
ELISA 실험을 위해 R&D system사의 Human Pro-collagen I α1/COL1A1 ELISA 키트를 사용하였다. ELISA 실험에 필요한 세척 버퍼로서 0.05% Tween20 PBS를 제조하고 시약 희석제(reagent diluent)는 1% BSA를 PBS에 희석하여 제조하였다. 콜라겐 검출을 위해 면역마이크로플레이트(immunomicroplate)에 100μL/웰의 농도로 포획 항체(capture antibody)를 로딩하여 상온에서 인큐베이션하였다. 포획 항체를 코팅한 플레이트는 다음 날 세척 버퍼를 이용하여 3회 세척하였다. 세척을 마친 플레이트는 시약 희석제(reagent diluent)를 100μL/웰의 농도로 로딩한 후 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하여 블록킹하였다. 블록킹 완료 후 플레이트를 3회 세척하였고, 콜라겐 1 재조합체(collagen 1 recombinant)를 이용하여 표준자(standard)를 제조하고 HDF 세포 상층액을 이용하여 샘플을 제조하였다. 표준자와 샘플을 상온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 그런 다음 검출 항체를 100μL/웰의 농도로 추가하여 2시간 동안 상온에서 보관한 후 스트렙타비딘-HRP를 100μL 로딩하여 20분간 상온에서 인큐베이션하였다. 최종 3회 세척 후 기질(substrate)을 100μL 로딩하고 암실상태의 상온에서 반응시켰다. 발색 정도를 확인하고 정지 용액(stop solution)을 50 μL 로딩하여 반응을 중단시켰다. 실험 종료 후 플레이트를 450nm 파장에서 판독하였다.
실시예 2: 개별 성장인자에 대한 효능 평가
실시예 2-1: HDF 세포 및 CCD-986sk 세포를 이용한 세포 증식 효능
실시예 1-2에 따라 다양한 성장인자들을 HDF 세포 및 CCD-986sk 세포에 처리하고 세포 증식률을 확인하였다. 다양한 성장인자들 각각을 피부섬유아세포에 처리한 후 피부섬유아세포 증식 효능을 평가하여 후보 성장인자들을 스크리닝하였다. 후보로 선정된 12종 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, FGF-1, FGF-2, FGF-7, FGF-10, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, IGF-1, VEGF 및 EGF) 중 TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF 각각을 HDF 세포에 처리한 경우 음성대조군과 대비하여 약 130~150%의 세포증식률을 나타내었다. 또한, 상기 12종의 성장인자들 중 PDGF-BB, IGF-1 및 FGF-10 각각을 CCD-986sk 세포에 처리한 경우 음성대조군과 대비하여 약 120%의 세포증식률을 나타내었다.
따라서, 2종의 피부섬유아세포를 이용하여 성장인자 처리에 의한 세포 증식 효능을 평가한 결과, PDGF-BB와 IGF-1은 2종의 피부섬유아세포에서 모두 음성대조군에 비해 유의적으로 증가된 세포 증식률을 나타내었고 TGF-β1, TGF-β3 및 EGF는 HDF 세포에서만 음성대조군에 비해 유의적으로 증가된 세포 증식률을 나타내었다.
실시예 2-2: 개별 성장인자의 HDF 세포 이동 효능
실시예 1-3에 따라 12종 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, FGF-1, FGF-2, FGF-7, FGF-10, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, IGF-1, VEGF 및 EGF) 각각을 HDF 세포에 처리하고 세포 이동 효능을 확인하였다. 이를 위해 도 1에 도시된 바와 같은 현미경 사진들을 촬영하여 세포 이동을 비교하였다. 그 결과, 상기 12종 성장인자들 중 PDGF-BB, TGF-β3, PDGF-AA 순으로 세포 이동에 효과적임이 확인되었다(도 1).
실시예 2-3: 개별 성장인자의 콜라겐 생성량 증가 효능
실시예 1-4에 따라 12종 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, FGF-1, FGF-2, FGF-7, FGF-10, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, IGF-1, VEGF 및 EGF) 각각을 HDF 세포에 처리한 후 콜라겐 생성량을 측정하였다(표 1 참조). 그 결과, TGF-β1을 10ng/ml 및 100ng/ml의 농도로 HDF 세포에 처리 시 음성대조군과 대비하여 각각 약 227% 및 190%의 콜라겐 생성량을 나타내었고, IGF-1은 100ng/ml의 농도로 HDF 세포에 처리 시 음성대조군과 대비하여 약 155%의 콜라겐 생성량을 나타내었다.
또한, PDGF-AA는 10ng/ml의 농도로 HDF 세포에 처리시 음성대조군과 대비하여 약 143%의 콜라겐 생성량을 나타내었고, TGF-β3는 10ng/ml의 농도로 HDF 세포에 처리시 음성대조군과 대비하여 약 124%의 콜라겐 생성량을 나타내었다.
한편, EGF는 100ng/ml의 농도로 HDF 세포에 처리 시 음성대조군과 대비하여 약 106%의 콜라겐 생성량을 나타내었다.
| 성장인자 | 농도 | 생성량 (ng/ml) | 대조군 대비 (% of control) |
| TGF-β1 | 0ng/ml | 87.80 | - |
| 10ng/ml | 200.09 | 227.88 | |
| 100ng/ml | 166.99 | 190.19 | |
| TGF-β3 | 0ng/ml | 75.79 | - |
| 10ng/ml | 94.04 | 124.07 | |
| 100ng/ml | 80.51 | 106.22 | |
| FGF-1 | 0ng/ml | 37.66 | - |
| 10ng/ml | 37.07 | 98.42 | |
| 100ng/ml | 38.30 | 101.71 | |
| FGF-2 | 0ng/ml | 38.91 | - |
| 10ng/ml | 37.42 | 96.18 | |
| 100ng/ml | 40.42 | 103.88 | |
| FGF-7 | 0ng/ml | 35.60 | - |
| 10ng/ml | 35.27 | 99.05 | |
| 100ng/ml | 35.19 | 98.84 | |
| FGF-10 | 0ng/ml | 34.20 | - |
| 10ng/ml | 31.96 | 93.45 | |
| 100ng/ml | 34.74 | 101.56 | |
| PDGF-AA | 0ng/ml | 75.79 | - |
| 10ng/ml | 94.04 | 143.89 | |
| 100ng/ml | 80.51 | 123.19 | |
| PDGF-AB | 0ng/ml | 8.37 | - |
| 10ng/ml | 7.58 | 90.55 | |
| 100ng/ml | 7.31 | 87.36 | |
| PDGF-BB | 0ng/ml | 8.37 | - |
| 10ng/ml | 7.58 | 90.55 | |
| 100ng/ml | 7.31 | 87.36 | |
| IGF-1 | 0ng/ml | 26.88 | - |
| 10ng/ml | 28.75 | 106.95 | |
| 100ng/ml | 41.89 | 155.81 | |
| VEGF | 0ng/ml | 27.03 | - |
| 10ng/ml | 25.00 | 92.50 | |
| 100ng/ml | 26.27 | 97.20 | |
| EGF | 0ng/ml | 60.43 | - |
| 10ng/ml | 59.64 | 98.68 | |
| 100ng/ml | 64.06 | 106.00 |
실시예 3: 성장인자들의 조합 선정
피부섬유아세포의 증식을 촉진하는 최적의 성장인자들의 조합을 도출하기 위해 실시예 2-1 내지 실시예 2-3을 통해 확인된 세포 증식률, 세포 이동 효능 및 콜라겐 생성량에 기초하여 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)을 선정하였다. 그리고 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 HDF 세포 증식률과 4종의 성장인자들의 조합 각각(5종의 성장인자들에서 각기 1종의 성장인자를 배제한 것)의 처리에 의한 HDF 세포 증식률을 비교하였다(표 2 참조).
| 그룹 | 성장인자 | 농도 | 세포 증식률 (%) |
| 음성대조군 | - | 0 ng/ml | 100 |
| 5종 성장인자 | TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1, EGF | 각 성장인자 10ng/ml로 처리; 성장인자 총 50ng/ml 처리 | 172.45 |
| TGF-β1 제외 4종 성장인자 | TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1, EGF | 각 성장인자 10ng/ml로 처리; 성장인자 총 40ng/ml 처리 | 220.56 |
| TGF-β3 제외 4종 성장인자 | TGF-β1, PDGF-BB, IGF-1, EGF | 210.33 | |
| PDGF-BB 제외 4종 성장인자 | TGF-β1, TGF-β3, IGF-1, EGF | 165.929 | |
| IGF-1 제외 4종 성장인자 | TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, EGF | 205.867 | |
| EGF 제외 4종 성장인자 | TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 | 234.034 |
성장인자들의 각각의 조합의 처리에 의한 세포 증식률을 확인하기 위해 상기 표 2에 제시된 조건으로 성장인자들의 각각의 조합을 HDF 세포에 처리한 후 실시예 1-2에 따라 24시간, 48시간 및 72시간 경과한 시점에서 MTT 어세이를 수행하였다.
상기 표 2의 성장인자들의 조합 각각에 대해 72시간 동안 HDF 세포 증식을 관찰한 결과, 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합을 상기 표 2의 농도로 HDF 세포에 처리 시 음성대조군과 대비하여 172.45%의 세포 증식률을 나타낸 반면에, TGF-β1, TGF-β3, IGF-1 또는 EGF를 각각 제외한 4종의 성장인자들의 조합을 상기 표 2의 농도로 HDF 세포에 처리 시 음성대조군과 대비하여 200% 이상의 세포 증식률을 나타내었다. 한편, PDGF-BB가 제외된 4종 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, IGF-1 및 EGF)의 조합을 상기 표 2의 농도로 HDF 세포에 처리 시 음성대조군과 대비하여 약 165%의 세포 증식률을 나타내었다.
상기 결과들을 종합하면, 5종의 성장인자들의 조합 처리 시에는 세포 증식률이 약 172%에 불과한 반면에, TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1의 4종의 성장인자들의 조합 처리 시에는 세포 증식률이 약 234%로서 최고치를 나타내었다. 따라서, TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1의 4종의 성장인자들의 조합을 최적의 조합으로 선정하여 본 발명의 피부재생 또는 주름개선용 조성물의 유효성분으로 하였다.
5종의 성장인자들의 조합의 경우 본 발명의 TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1의 4종의 성장인자들의 조합 보다 성장인자의 수가 많고 농도가 높음에도 불구하고 세포 증식률은 본 발명의 TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1의 4종의 성장인자들의 조합 보다 낮았다. 이러한 결과는 성장인자들의 종류를 단순히 추가하고 그 농도를 높인다고 하여 주름개선이나 피부재생 효과의 추가적 상승이 기대와는 달리 얻어지지 않는다는 사실과 성장인자들의 조합의 중요성을 강력히 뒷받침하고 있는 것이다.
실시예 4: 4종의 성장인자들의 조합와 단일 성장인자의 세포 증식률 비교
실시예 3에서는 본 발명의 TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1의 4종의 성장인자들의 조합을 HDF 세포에 처리 시 음성대조군과 대비하여 세포 증식률이 약 234%가 되는 것을 확인하였다. 이러한 결과가 4종의 성장인자들의 조합에 의한 시너지 효과인지 성장인자 농도 증가에 의한 효과인지에 대한 평가를 하기 위해 단일 성장인자의 농도를 40ng/ml로 상향 조정하여 4종의 성장인자들의 조합과 세포 증식률을 비교하는 실험을 하기 표 3과 같은 조건으로 수행하였다. 세포증식 실험 및 MTT 어세이는 실시예 3과 동일한 방식으로 수행하였다.
| 그룹 | 성장인자 | 농도 | 세포 증식률 (%) |
||
| 24시간 | 48시간 | 72시간 | |||
| 음성대조군 | - | 0 ng/ml | 100 | 100 | 100 |
| EGF 제외 4종 성장인자 | TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 | 각 성장인자 10ng/ml로 처리; 성장인자 총 40ng/ml 처리 | 158.47 | 197.62 | 239.81 |
| TGF-β1 단독 | TGF-β1 | 성장인자 40ng/ml | 108.13 | 127.06 | 131.32 |
| TGF-β3 단독 | TGF-β3 | 성장인자 40ng/ml | 82.693 | 124.30 | 132.27 |
| PDGF-BB 단독 | PDGF-BB | 성장인자 40ng/ml | 104.63 | 113.43 | 139.98 |
| IGF-1 단독 | IGF-1 | 성장인자 40ng/ml | 99.524 | 127.96 | 132.63 |
| EGF 단독 | EGF | 성장인자 40ng/ml | 99.47 | 174.55 | 175.07 |
본 발명의 4종의 성장인자들의 조합을 HDF 세포에 처리 시 시간의존적으로 세포 증식이 관찰되었고, 처리 후 72시간이 경과한 시점에서는 음성대조군과 대비하여 약 239%의 세포 증식률을 나타내었다(도 3 및 표 3).
반면에, TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 또는 IGF-1의 단일 성장인자의 농도를 본 발명의 4종의 성장인자들의 조합의 농도와 동일한 농도인 40ng/ml로 상향 조정한 후 HDF 세포에 처리한 경우에는 약 130%의 세포 증식률을 나타내었고, EGF를 40ng/ml의 농도로 HDF 세포에 처리한 경우에는 약 175%의 세포 증식률을 나타내었다. 즉, 본 발명의 4종의 성장인자들의 조합은 TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1, 또는 EGF의 단일 성장인자에 비해 약 64% 내지 100% 이상의 세포 증식률의 증가를 나타내었다.
상기 결과들로부터 단일 성장인자의 농도를 증가시켜도 세포 증식이 크게 증가하지 않았으나 본 발명의 4종의 성장인자들의 조합을 처리한 경우에는 약 230% 이상의 높은 세포 증식률이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 4종의 성장인자들의 조합은 성장인자들의 상호작용에 의해 HDF 세포 증식에 있어 시너지 효과를 유도하는 것으로 판단되며, 나아가서는 피부재생 및/또는 주름개선의 시너지 효과를 나타내어 피부재생 및/또는 주름개선 효과를 극대화할 수 있다.
실시예 5: 본 발명의 4종의 성장인자들의 조합와 5종의 성장인자들의 조합의 콜라겐 생성량 비교
본 발명의 4종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1)의 조합의 처리에 의한 콜라겐 생성량과 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 콜라겐 생성량을 비교하였다. 실시예 1-4에 따라 TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF의 5종의 성장인자들의 조합과 본 발명의 4종 성장인자들의 조합을 각 성장인자 당 10ng/ml 농도로 HDF 세포에 처리한 후 24시간, 48시간 및 72시간이 경과한 시점에서 콜라겐 생성량을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 4종 성장인자들의 조합을 처리한 경우 시간 의존적으로 콜라겐 생성량이 증가하였으며, 시간이 경과함에 따라 음성대조군 및 5종의 성장인자들 처리군에 비해 콜라겐 생성량이 현저하게 증가하는 것이 확인되었다(도 4). 본 발명의 4종 성장인자들의 조합과 5종의 성장인자들의 조합의 콜라겐 생성량 차이는 50ng/ml 이상이었다.
이러한 결과로부터 성장인자들의 종류를 단순히 추가하고 그 농도를 높인다고 하여 주름개선이나 피부재생 효과의 추가적 상승이 기대와는 달리 얻어지지 않는 것을 알 수 있고, 본 발명의 4종의 성장인자들의 조합은 성장인자들의 상호작용에 의해 콜라겐 생성에 있어 시너지 효과를 유도하는 것으로 판단되며, 나아가서는 피부재생 및/또는 주름개선의 시너지 효과를 나타내어 피부재생 및/또는 주름개선 효과를 극대화할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6: 본 발명의 4종의 성장인자들의 조합와 5종의 성장인자들의 조합의 세포 이동 효능 평가
본 발명의 4종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB 및 IGF-1)의 조합의 처리에 의한 세포 이동 효능과 5종의 성장인자들(TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF)의 조합의 처리에 의한 세포 이동 효능을 비교하였다. 실시예 1-3에 따라 TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF의 5종의 성장인자들의 조합과 본 발명의 4종 성장인자들의 조합을 각 성장인자 당 100ng/ml 농도로 HDF 세포에 48시간 동안 처리한 후, 각 조합에 대해 HDF 세포 이동을 나타내는 현미경 사진을 촬영하였고 HDF 세포의 이동 세포수를 카운팅하였다. 그 결과, 본 발명의 4종 성장인자들의 조합을 처리한 경우 세포 이동을 효과적으로 유도하는 것이 관찰되었으며 이동 세포수가 음성대조군 및 5종의 성장인자들 처리군에 비해 현저하게 많은 것이 확인되었다(도 5 및 도 6).
이러한 결과들로부터 성장인자들의 종류를 단순히 추가하고 그 농도를 높인다고 하여 주름개선이나 피부재생 효과의 추가적 상승이 기대와는 달리 얻어지지 않는 것을 알 수 있고, 본 발명의 4종의 성장인자들의 조합은 성장인자들의 상호작용에 의해 세포 이동 효능(피부재생 관련)에 있어 시너지 효과를 유도하는 것으로 판단되며, 나아가서는 피부재생 및/또는 주름개선의 시너지 효과를 나타내어 피부재생 및/또는 주름개선 효과를 극대화할 수 있음을 알 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
Claims (8)
- TGF-β1(Transforming Growth Factor β1), TGF-β3(Transforming Growth Factor β3), PDGF-BB(Platelet-Derived Growth Factor BB) 및 IGF-1(Insulin-like growth factor 1)으로만 이루어진 4종의 성장인자들의 조합을 유효성분으로 함유하는, 주름개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
피부섬유아세포의 증식을 촉진시키고, 콜라겐 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 주름개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
EGF(Epidermal growth factor)를 배제한 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물. - 제3항에 있어서,
TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB, IGF-1 및 EGF의 조합 보다 피부섬유아세포의 증식을 더 촉진시키고, 콜라겐 생성을 더 증가시키는 것을 특징으로 하는, 주름개선용 화장료 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 주름개선용 화장료 조성물을 준비하는 단계와, 상기 주름개선용 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 처리하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 피부의 주름개선을 통한 미용방법.
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| KR1020190055281A KR102047808B1 (ko) | 2019-05-10 | 2019-05-10 | 특유의 성장인자들의 조합을 유효성분으로 함유하는 피부재생 또는 주름개선용 조성물 |
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- 2019-05-10 KR KR1020190055281A patent/KR102047808B1/ko active IP Right Grant
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| KR102364823B1 (ko) | 2020-05-06 | 2022-02-21 | 연세대학교 산학협력단 | 피부 세포 재생용 화장료 조성물 |
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