KR102027158B1 - 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법 - Google Patents
해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 해조류 발효조미액 및 식용 황색색소를 포함하는 김치용 양념장을 제조하는 단계; 상기 김치용 양념장에 해조류를 혼합하고, 배추에 버무리는 단계; 및 상기 김치용 양념장과 해조류가 버무려진 배추를 숙성하는 단계를 포함하는 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법을 제공한다.
Description
본 발명은 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 김치의 고유한 풍미를 유지하면서, 특유의 매운맛은 저감하고 황금의 색택을 발휘하여 관능적 특성이 우수할 뿐만 아니라, 면역조절능력이 우수한 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법에 대한 것이다.
김치는 배추, 무 등의 야채 원료와 고춧가루, 생강, 마늘, 젓갈 등의 향신료를 첨가하여 제조되는 한국 고유의 야채류 발효식품으로서, 사용하는 재료와 제조 방법 및 지역에 따라 그 종류가 매우 다양하다.
김치는 발효 과정 중 생성된 유기산, 유리아미노산 등과 향신료에 의한 향미가 조화를 이루어 특유한 맛을 생성하고 젖산 등 유기산은 식욕을 촉진시키기 때문에 중요한 부식의 역할을 해 왔다.
야채가 귀했던 겨울철의 경우 김장의 형태로 가정에서 제조하여 섭취해오던 과거와는 달리 가공식품산업의 발달, 여성의 사회 참여 증가, 외식산업의 급속한 성장 및 단체 급식의 증가 등에 의하여 제품화된 김치를 구입하여 섭취하는 소비형태로 점차 바뀌어 가고 있다. 이로 인해, 김치의 시장규모가 커지고 있으며, 항암 효과 등이 국제사회에 알려지면서 수출물량이 증가하고 있는 실정이다.
사회의 국제적 교류의 급증에 의한 영향으로 한국의 김치에 대하여 관심도가 높아지고 있으나 중국 혹은 대만과 같은 특정 국가의 경우 매운 맛에 대하여 거부감이 강하고, 특히 색상에서도 금색을 선호하는 경향이 뚜렷하여 김치의 세계화를 위해서는 단순히 맵고 빨간색의 김치에서 벗어날 필요가 있으며, 또한 영양성분의 강화 내지 기능성을 겸비한 고부가가치 김치에 대한 수요가 날로 증가하고 있는 실정에서 보다 다양한 김치의 제조에 대한 소재 개발 및 프로세스의 연구가 요구되고 있다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 김치의 고유한 풍미를 유지하면서, 특유의 매운맛은 저감하고 금색의 색택을 발휘하여 관능적 특성이 우수하고, 면역조절능력이 우수한 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법을 제공함에 있다.
상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.
(1) 해조류 발효조미액 및 식용 황색색소를 포함하는 김치용 양념장을 제조하는 단계;
상기 김치용 양념장을 배추에 버무리는 단계; 및
상기 김치용 양념장이 버무려진 배추를 숙성하는 단계를 포함하는 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법.
(2) 상기 (1)에 있어서, 김치용 양념장에 해조류가 더 포함되는 것을 특징으로 하는 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법.
(3) 상기 (1)에 있어서, 색소는 단호박, 황색색 파프리카, 치자, 홍화, 및 황련의 군에서 선택된 적어도 1종의 물질로부터 유래된 것으로, 이들 물질을 식용 미생물을 이용하여 발효한 상태로 제공되어지는 것을 특징으로 하는 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법.
(4) 상기 (1)에 있어서, 해조류 발효조미액은,
건조다시마와 건조톳을 각각 세척, 탈염 및 불림공정을 거친 후, 세척 및 탈수처리하는 단계;
다시마와 톳이 중량비로 2:1로 혼합된 복합 해조류를 열수추출하여 복합해조류추출액을 얻는 단계;
상기 복합해조류추출액에 유산균을 접종하여 23~25℃에서 48~72시간 발효하여 해조류 유산균 발효액을 얻는 단계; 및
상기 해조류 유산균 발효액을 121℃에서 멸균처리하는 단계를 포함하여 제조된 것을 특징으로 하는 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 김치의 고유한 풍미를 유지하면서, 특유의 매운맛은 저감하고 황금색의 색택을 발휘하여 관능적 특성이 우수하면서, 면역조절능력이 우수한 황금김치를 제공하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 해조류 발효조미액의 제조공정도이다.
도 2는 복합 해조류 발효액 처리가 TNF-a 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 3은 복합 해조류 발효액 처리가 MCP-1 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 4는 복합 해조류 발효액 처리에 따른 세포 독성을 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 해조류 발효조미액을 함유한 김치의 제조공정도이다.
도 6은 본 발명의 김치 추출물의 처리가 TNF-a 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 김치 추출물의 처리가 MCP-1 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 김치 추출물의 처리에 따른 세포 독성을 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 김치 추출물의 처리가 TNF-a 분비에 미치는 영향 재검증 결과이다.
도 10은 본 발명의 김치 추출물의 처리가 MCP-1 분비에 미치는 영향 재검증 결과이다.
도 11은 본 발명의 김치 추출물의 처리가 IL-1b 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 김치 추출물의 처리가 IL-6 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 2는 복합 해조류 발효액 처리가 TNF-a 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 3은 복합 해조류 발효액 처리가 MCP-1 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 4는 복합 해조류 발효액 처리에 따른 세포 독성을 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 해조류 발효조미액을 함유한 김치의 제조공정도이다.
도 6은 본 발명의 김치 추출물의 처리가 TNF-a 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 김치 추출물의 처리가 MCP-1 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 김치 추출물의 처리에 따른 세포 독성을 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 김치 추출물의 처리가 TNF-a 분비에 미치는 영향 재검증 결과이다.
도 10은 본 발명의 김치 추출물의 처리가 MCP-1 분비에 미치는 영향 재검증 결과이다.
도 11은 본 발명의 김치 추출물의 처리가 IL-1b 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 김치 추출물의 처리가 IL-6 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
본 발명에 따른 황금김치의 제조방법은 해조류 발효조미액 및 식용 황색색소를 포함하는 김치용 양념장을 제조하는 단계; 상기 김치용 양념장에 해조류를 혼합하고, 배추에 버무리는 단계; 및 상기 김치용 양념장과 해조류가 버무려진 배추를 숙성하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하면 아래와 같다.
이하, 본 발명의 해조류 발효조미액의 제조공정을 단계별로 분설하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
1. 원료의 전처리 단계
본 단계는 원료의 준비단계로써, 해조류의 열수추출액을 준비한다. 본 발명에서 상기 해조류는 바람직하게는 다시마, 톳 혹은 이들의 혼합 해조류이다. 건조한 다시마 또는/및 톳을 1~3회 정도 물로 세척하고 탈염처리 한 후, 물에 침지하여 불린다. 탈염은 공지된 기술이 이용될 수 있고, 예를 들어 20℃ 이하의 수도수 또는 음용에 적합한 공정수를 해조류 중량의 3~5배 중량을 가한 후 분당 100~200rpm의 속도로 교반하면서 10~20kHz의 초음파 발생조건에서 1~5 분간 2회 탈염처리할 수 있다. 탈염된 해조류는 다시 해조류 중량의 3~5배의 물에 30~60분 정도 침지하여 불린다. 상기와 같이 불린 해조류를 흐르는 물로 2~3회 세척하고, 탈수처리한다. 탈수는 자연탈수 내지 1,000~2,000 rpm의 원심 탈수기를 이용하여 표면수분을 제거하는 방법이 이용될 수 있다.
2. 해조류 추출액의 제조단계
본 단계에서는 해조류 바람직하게는 다시마와 톳의 복합 해조류를 이용하여 열수추출액을 얻는 단계이다. 추출과정은 상기와 같이 전처리된 해조류에 1~10배, 바람직하게는 10배의 물을 가하여 1 내지 2기압, 80~120℃하에 1~12시간 추출하는 과정을 포함한다. 바람직하게는 해조류는 다시마와 톳이 중량비로 1:1~3:1, 보다 바람직하게는 2:1로 혼합된 복합 해조류가 이용된다.
3. 유산균 발효액의 제조단계
본 단계에서는 상기 단계 2에서 얻은 해조류 추출액에 유산균을 접종하여 해조류의 유산균 발효액을 얻는다. 이때, 유산균은 류코노스톡 속에 속하는 공지의 균주를 이용하는 것으로 충분하며, 예를 들어 김치발효 유산균인 류코노스톡 메센테로이데스가 이용될 수 있다. 본 단계의 발효과정은 20~25℃로 유지되는 발효기를 이용하여 생균수가 1.0×108 cfu/ml 이상인 배양액을 해조류 추출액에 대하여 1 내지 5 중량% 접종하고, 48~72시간 동안 발효시키는 과정을 포함한다.
4. 멸균단계
본 단계는 상기 단계 3에서 얻은 해조류 유산균 발효액을 멸균처리하는 과정이다. 멸균과정은 상기 해조류 유산균 발효액을 스팀을 이용하여 120~125℃, 바람직하게는 121℃에서 10~30분 정도 처리하여 멸균한다.
상기와 같이, 원료의 전처리, 해조류 추출액의 제조, 유산균 발효액의 제조 및 멸균과정을 거쳐 최종적으로 해조류 바람직하게는 복합해조류의 발효 조미액이 얻어진다.
본 발명에서는 상기와 같이 얻어진 해조류의 발효조미액을 이용하여 관능성이 우수하면서 면역조절능력이 부여된 고부가가치의 황금김치를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 황금김치의 제조과정은 세척 및 탈수처리를 거친 해조류(다시마 혹은 꼬시래기) 및 배추를 준비하는 단계; 멸치, 다시마, 새우, 파뿌리, 명태머리, 및 무를 정제수에 첨가한 후 추출하고 여과하여 열수 천연물 추출액을 준비하고, 이와 함께 부재료를 혼합하는 단계; 상기 부재료가 혼합된 열수 천연물 추출액에 해조류 발효조미액을 혼합하여 김치용 양념장을 제조하고 숙성하는 단계; 상기 양념장에 준비된 해조류를 혼합하고, 숙성하는 단계; 및 상기 준비된 배추를 해조류가 혼합된 양념장으로 버무리고 숙성하는 단계를 포함한다.
이하, 상기와 같이 제조된 해조류 발효조미액을 이용하여 본 발명에 따른 김치의 제조과정을 단계별로 보다 상세하게 설명한다.
1. 원료의 준비
본 단계는 원료의 준비 단계로써, 다시마와 배추는 다음과 같이 준비된다.
먼저, 1차 세척된 다시마와 배추를 각각 100~300ppm, 바람직하게는 150~200ppm의 차아염소산나트륨을 이용하여 5~10분간 처리하여 소독과정을 거친다. 상기와 같이 소독과정을 거친 다시마와 배추를 물로 2~3회 정도 세척한다. 세척한 다시마와 배추는 탈수처리한 후, 다시마는 2~10cm의 적당한 크기로 절단하여 준비한다.
2. 열수 천연물 추출액의 제조
본 단계에서는 열수 천연물 추출액을 준비하는 과정을 포함한다.
보다 구체적으로 본 단계에서는, 건조멸치 3.0~7.0 중량%, 건조다시마 2.0~6.0 중량%, 건조새우 1.0~5.0 중량%, 파뿌리 1.7~5.7 중량%, 명태머리 2.0~6.0 중량%, 및 무 8.0~12.0중량%를 정제수 48.0~52.0 중량%에 첨가한 후 60~80℃에서 2~6시간 동안 추출하고 여과하여 열수 천연물 추출액을 제조한다.
3. 양념장의 제조
본 단계에서는 위의 단계 2에서 준비된 열수 천연물 추출액과 해조류 발효조미액, 황색색 색소물질 및 부재료를 혼합 및 숙성하여 양념장을 제조하는 과정을 포함한다.
보다 구체적으로 본 단계에서는, 김치 전체의 중량을 기준으로 해조류 발효조미액 0.5~5.0 중량%, 상기 단계 2의 열수 천연물 추출액 0.5~2.0 중량%, 황색색 색소물질 1.0~4.0 중량%, 멸치액젓 1.0~3.0 중량%, 마늘 0.2~0.6 중량%, 생강 0.1~0.5 중량%, 양파 1.0~3.0 중량%, 대파 1.0~2.0 중량%, 찹쌀풀 0.5~1.0 중량%, 솔비톨 2.0~6.0 중량%, 설탕 1.0~3.0 중량%, 고과당 1.0~3.0 중량%, 식염 0.5~1.5 중량%, 및 L-글루타민산나트륨 0.5~1.0 중량%를 첨가한 후 혼합하여 김치용 양념장을 제조하고, 0~5℃에서 3~5일간 숙성시킨다.
4. 김치의 제조 및 숙성
본 단계에서는 위의 단계 3에서 준비된 양념장을 위의 단계 1에서 준비한 10~30 중량%(김치 전체의 중량을 기준)의 다시마와 혼합하고 0~5℃에서 1~2일간 숙성시키고, 이것을 단계 1에서 준비된 탈수된 50.0~55.0 중량%(김치 전체의 중량을 기준)의 배추에 버무려 김치를 담그고 0~10℃에서 저온숙성하여 김치를 제조한다.
상기한 방법으로 제조된 김치는 관능적 특성이 우수하면서, 면역조절기능이 우수하여 고부가가치의 김치로써 제공될 수 있다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시 형태를 실시예 및 실험예를 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시예 및 실험예에 의해 보다 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일 뿐, 첨부된 특허 청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1] 해조류 발효조미액의 제조
해조류로 건조한 다시마 및 톳을 3회 흐르는 물로 세척하고 20℃의 음용에 적합한 공정수를 상기 해조류 중량의 5배를 가한 후 분당 200rpm의 속도로 교반하면서 20kHz의 초음파 발생조건에서 5 분간 2회 탈염처리하였다. 탈염된 해조류는 다시 해조류 중량의 5배의 물에 30분 정도 침지하여 불렸다. 상기와 같이 불린 해조류를 흐르는 물로 3회 세척하고, 2,000 rpm의 원심 탈수기를 이용하여 표면수분을 제거하였다.
상기와 같이 전처리된 해조류[다시마와 톳이 중량비로 2:1로 혼합된 복합 해조류]에 부피비로 10배의 물을 가하여 1기압, 90℃하에 2시간 동안 열수추출하였다.
[실시예 2] 해조류 발효조미액의 제조
해조류로 건조한 다시마 및 톳을 3회 흐르는 물로 세척하고 20℃의 음용에 적합한 공정수를 상기 해조류 중량의 5배를 가한 후 분당 200rpm의 속도로 교반하면서 20kHz의 초음파 발생조건에서 5 분간 2회 탈염처리하였다. 탈염된 해조류는 다시 해조류 중량의 5배의 물에 30분 정도 침지하여 불렸다. 상기와 같이 불린 해조류를 흐르는 물로 3회 세척하고, 2,000 rpm의 원심 탈수기를 이용하여 표면수분을 제거하였다.
상기와 같이 전처리된 해조류[다시마와 톳이 중량비로 2:1로 혼합된 복합 해조류]에 부피비로 10배의 물을 가하여 1기압, 90℃하에 2시간 동안 열수추출하였다.
상기 해조류 열수추출액에 생균수가 1.0×108 cfu/ml 인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액을 3중량% 접종하여 25℃하에 72시간 동안 발효시켰다. 그런 다음 상기 해조류 유산균 발효액을 121℃의 스팀을 이용하여 30분 처리하여 멸균하였다.
[실시예 3] 해조류 발효조미액의 제조
전처리된 해조류[다시마와 톳이 중량비로 2:1로 혼합된 복합 해조류]에 부피비로 6배의 물을 가하여 1기압, 90℃하에 2시간 동안 열수추출한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 해조류 발효조미액을 제조하였다.
[실시예 4] 해조류 발효조미액의 제조
상기 해조류 열수추출액에 생균수가 1.0×108 cfu/ml 인 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 배양액을 3중량% 접종하여 25℃하에 72시간 동안 발효한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 해조류 발효조미액을 제조하였다.
[실시예 5] 해조류 발효조미액의 제조
전처리된 해조류[다시마와 톳이 중량비로 2:1로 혼합된 복합 해조류]에 부피비로 6배의 물을 가하여 1기압, 90℃하에 2시간 동안 열수추출한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 해조류 발효조미액을 제조하였다.
[제조예 1~5] 황금김치의 제조
본 제조예에서는 상기 실시예 1 내지 5에서 얻은 각 해조류 조미액을 양념장에 첨가하여 다시마 김치를 도 5에 도시한 절차에 따라 제조하였으며, 그 구체적인 과정은 다음과 같다.
1. 원료의 준비
다시마 및 배추를 구입하여 표면에 묻은 이물질을 흐르는 물을 이용하여 1차 세척하고, 1차 세척된 다시마와 배추를 각각 200ppm의 차아염소산나트륨과 150ppm의 차아염소산나트륨을 이용하여 5분간 소독하였다. 상기와 같이 소독한 다시마와 배추를 물로 2회 정도 2차 세척하고, 탈수처리하였으며, 다시마는 10cm의 적당한 크기로 절단하여 준비하였다.
2. 열수 천연물 추출액의 제조
정제수 50 중량%에 건조멸치 5.0 중량%, 건조다시마 4.0 중량%, 건조새우 3.0 중량%, 파뿌리 3.7 중량%, 명태머리 4.0 중량%, 및 무 10.0 중량%를 첨가한 후 80℃에서 3시간 동안 추출하고 여과하여 열수 천연물 추출액을 제조하였다.
3. 양념장의 제조
하기 표 1에 나타낸 성분 및 배합비에 따라, 본 단계에서는 위의 단계 2에서 준비된 열수 천연물 추출액과 해조류 발효조미액 및 부재료를 혼합 및 숙성하여 양념장을 제조하는 과정을 포함한다.
해조류 조미액 4.0 중량%, 열수 천연물 추출액 1.0 중량%, 치자분말 2.9 중량%, 멸치액젓 2.0 중량%, 마늘 0.4 중량%, 생강 0.3 중량%, 양파 2.0 중량%, 대파 1.4 중량%, 찹쌀풀 0.7 중량%, 솔비톨 4.0 중량%, 설탕 1.9 중량%, 고과당 1.8 중량%, 식염 1.0 중량%, 및 L-글루타민산나트륨 0.7 중량%를 첨가한 후 혼합하여 양념장을 제조하고, 5℃에서 3일간 숙성시켰다.
4. 김치의 제조 및 숙성
본 단계에서는 위의 단계 3에서 준비된 양념장을 위의 단계 1에서 준비한 22.6 중량%의 다시마와 혼합하고 0~5℃에서 1~2일간 숙성시키고, 이것을 단계 1에서 준비된 탈수된 53.3 중량%의 배추에 버무려 김치를 담그고 8℃에서 15일간 숙성하여 김치를 제조하였다.
원 료 | 제조예1 (중량%) |
제조예2 (중량%) |
제조예3 (중량%) |
제조예4 (중량%) |
제조예5 (중량%) |
배추 | 53.3 | 53.3 | 53.3 | 53.3 | 53.3 |
다시마 | 22.6 | 22.6 | 22.6 | 22.6 | 22.6 |
솔비톨 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
치자분말 | 2.9 | 2.9 | 2.9 | 2.9 | 2.9 |
양파 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
멸치액젓 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
설탕 | 1.9 | 1.9 | 1.9 | 1.9 | 1.9 |
고과당 | 1.8 | 1.8 | 1.8 | 1.8 | 1.8 |
대파 | 1.4 | 1.4 | 1.4 | 1.4 | 1.4 |
열수 천연물 추출액 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
실시예 1의 해조류 조미액 | 4.0 | - | - | - | - |
실시예 2의 해조류 발효조미액 | - | 4.0 | - | - | - |
실시예 3의 해조류 발효조미액 | - | - | 4.0 | - | - |
실시예 4의 해조류 발효조미액 | - | - | - | 4.0 | - |
실시예 5의 해조류 발효조미액 | - | - | - | - | 4.0 |
식염 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
L-글루타민산나트륨 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 |
찹쌀풀 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 | 0.7 |
의성마늘 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
생강 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
합계 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
[제조예 6] 황금김치의 제조
본 제조예에서는 치자분말 대신 단호박분말을 첨가한 것을 제외하고는 제조에 5와 동일한 조성 및 방법에 의해 김치를 제조하였다.
[제조예 7] 황금김치의 제조
본 제조예에서는 치자분말 대신 황색색 파프리카 분말을 첨가한 것을 제외하고는 제조에 5와 동일한 조성 및 방법에 의해 김치를 제조하였다.
[제조예 8] 황금김치의 제조
본 제조예에서는 치자분말 대신 홍화를 첨가한 것을 제외하고는 제조에 5와 동일한 조성 및 방법에 의해 김치를 제조하였다.
[제조예 9] 황금김치의 제조
본 제조예에서는 치자분말 대신 황련을 첨가한 것을 제외하고는 제조에 5와 동일한 조성 및 방법에 의해 김치를 제조하였다.
[실험예 1]
(1) 세포배양
인간 대식 세포-유사 세포주 (human macrophage-like cell line)인 THP-1 세포의 배양은 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS), 10mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate 0.05 mM b-mercaptoethanol, 2.5g/L glucose와 항생제인 streptomycin-penicillin을 추가한 RPMI 1640(WelGENE INC, KOREA) 배양액을 이용하여 이산화탄소 세포 배양기 내에서 5% CO2, 37℃의 조건으로 수행되었다. 세포 배양 및 실험은 자외선 소독을 수행한 무균 실험대 내에서 수행되었다.
(2) 시료처리
세포에 처리할 각 실시예에 의해 얻은 해조류 조미액은 1000 rpm에서 3분간 원심 분리 후 그 상층액을 무균 실험대 내에서 0.22 mm syringe filter로 여과하여 준비하였다. 생리 식염수 (1X phosphate buffer saline, PBS)에 적정 농도로 추출물을 희석한 뒤 세포에 직접 처리하였다.
(3) 염증성 사이토카인 분비 측정(Enzyme-linked immunosrobent assay, ELISA)
세포 배양액 내 분비되어 존재하는 사이토카인들 (TNF-a, MCP-1, IL-1b, IL-6) 의 농도는 샌드위치 ELISA kit (eBioscience, San Diego, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. THP-1 세포를 1.0 X 105cells/well의 농도가 되도록 THP-1 배양용 배지에 현탁하여 96 well plates에 100 ml씩 접종하였다. 그 후 해조류 조미액을 1시간동안 전처리하고 1 mg/ml의 LPS로 자극하였다. 자극으로부터 6시간 (TNF-a) 또는 24시간 후, 배양액을 얻고 8000 rpm에서 3분간 원심 분리를 수행하여 세포를 가라앉히고 상층액만을 분리하여 실험에 사용하였다.
ELISA용 96 well plates의 바닥에 capture antibody(Coating buffer로 1/250 희석)를 coating(O/N, 4℃) 한 후, wash buffer (0.05% Tween-20 in PBS)로 3회 세척 후 200 ml 1X Asaay diluent를 넣어 1시간 동안 실온에서 blocking을 실시하였다. 그 후 다시 위와 같은 방법으로 well을 세척 후 100 ml의 1X Asaay diluent로 희석된 sample들과 standard (Recombinant human TNF-a, MCP-1, IL-1b 또는 IL-6) well에 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 후 다시 세척을 실시한 뒤, Detection antibody (1XAssay diluent로 1/250로 희석) 100 ml를 첨가하여 1시간동안 실온에서 반응시켰다. 그 후 다시 세척을 한 뒤, Streptavidin-HRP (1X Assay diluent로 1/250로 희석)를 첨가하여 빛에 직접적으로 노출되지 않도록 하여 30분동안 실온에서 반응시켰다. 30분 후 세척을 실시하고 Substrate Solution 100 ml를 첨가하여 빛에 직접적으로 노출되지 않도록 하여 적절한 시간 (5분~15분)동안 실온에서 반응시켰다.
효소에 의한 발색 반응을 중지시키기 위해 2N H2SO4 50ml를 첨가한 뒤 microplate reader를 이용하여 450 nm와 540 nm 파장의 흡광도를 측정하였다. 분비된 사이토카인은 450 nm 파장의 흡광도를 540 nm 파장의 흡광도로 보정하고, 그 값을 standard curve로부터 얻어 진 추세 공식에 대입하여 정량화하였다.
유산균으로 발효시킨 해조류 발효조미액의 면역 반응 조절 능력을 평가하기 위해 macrophage-like cell line인 THP-1 세포에 해조류 발효조미액을 처리하고 그 후 염증성 면역 반응을 일으키는 그람 음성 박테리아 외막의 성분인 LPS (lipopolysaccharide)로 세포를 자극한 후, 염증성 사이토카인의 분비 양상에서 변화를 관찰하였다.
실시예 1~5 (샘플 1~5)를 각각 0.5%~2.5%의 농도로 세포에 1시간 전처리한 뒤 LPS를 1 mg/ml로 처리하여 세포를 자극한 후, 6시간 또는 24시간 동안 배양하였다. 그 후 세포 배양 상층액을 얻어 TNF-a와 MCP-1의 분비를 ELISA를 통해 확인하였다.
실험결과, 실시예 1의 발효시키지 않은 복합 해조류 열수추출액(샘플 1) 및 락토바실러스 플란타룸으로 발효시킨 복합 해조류 발효액 2종(샘플 2, 3)에서는 LPS에 의한 TNF-a의 분비에 의미 있는 영향을 미치는 경우는 확인할 수 없었다[도 2].
반면 실시예 4 및 5(샘플 4, 샘플 5)의 경우 LPS 처리에 의해 유도되는 MCP-1의 분비를 감소시키는 것으로 나타났다 [도 3의 D, E]. 더욱이 샘플 1~3 시료의 경우 시료를 단독 처리하였을 때도 TNF-a와 MCP-1의 분비가 촉진되며 LPS에 의한 효과에 추가적인 영향을 미치지 못하는 것으로 미루어 각각의 시료가 LPS에 오염된 것으로 생각된다 [도 3의 A~C].
(4) 해조류 발효조미액의 기초 세포 독성 평가(Cell viability assay)
세포의 생존율은 준비된 해조류 발효조미액을 세포에 처리한 후 cell counting kit (CCK)-8 assay (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 통해 발색의 정도로 측정되었다. THP-1 세포를 5.0 X 104cells/well의 농도가 되도록 THP-1 배양용 배지에 현탁한 뒤 96 well plates에 접종하였다. 그 후 해조류 발효조미액을 0.2%~3%까지의 농도로 세포에 처리한 뒤 48시간 동안 이산화탄소 세포 배양기 내에서 배양하였다. 세포 생존율의 측정은 CCK-8 용액을 1/10로 RPMI 1640 배지에 희석한 뒤 50 ml씩 배양된 세포에 추가한 뒤 30분 간격으로 발색의 정도를 microplate reader를 이용하여 450 nm 파장을 측정하여 결정하였다. 모든 실험은 3배수로 수행되었으며, 450 nm 파장의 흡광도가 0.5~1사이의 값으로 측정된 수치로 분석되었다.
실험 결과를 통해 확인 된 실시예 4(샘플 4) 및 실시예 5(샘플 5)의 MCP-1 분비 억제 효과가 발효액 자체의 독성 때문에 나타난 현상이 아님을 확인하고자 세포 독성 평가를 수행하였다. 이를 위해 실시예 4 및 5의 각 샘플을 THP-1 세포에 0.2~3% 농도로 처리한 후 48시간 동안 배양하고 CCK-8 kit을 이용하여 세포 생존율을 비교하였다. 실험 결과, 상기 두 종류의 복합 해조류 발효액 모두 시험된 농도에서 세포의 생존율에 큰 영향을 미치지 않았다 [도 4]. 특히 사이토카인 분비 평가 사용된 농도보다 고농도인 3%의 추출물 처리에서도 생존율의 변화가 관찰되지 않은 것으로 보아 세포 독성에 의한 가능성이 낮다고 생각 할 수 있다. 따라서 앞서 확인된 MCP-1 분비 억제효과가 본 발명의 해조류 발효조미액 내 유용물질에 의한 직접적인 면역 반응 조절의 결과라 할 수 있다.
[실험예 2] 해조류 발효조미액 함유 김치의 면역 조절 효과 평가
(1) 염증성 사이토카인 분비 평가
앞서 실험예 1의 처리와 같은 실험 조건에서 해조류 발효조미액액과 다시마, 꼬시래기를 첨가하여 담근 김치의 면역조절 효능을 평가하였다.
이를 위하여 해조류 발효조미액과 다시마를 첨가한 제조예 4의 다시마 김치(sample A), 발효조미액과 꼬시래기를 첨가한 꼬시래기 김치(sample B), 그리고 일반 김치(sample C)의 김치 3종을 10일간 4℃에서 숙성시킨 후, 각각의 김치액에서 고형분을 제외한 액체 부분만을 수득하여 염증성 사이토카인의 분비에 미치는 영향을 확인하였다.
실험 결과, 다시마 김치(sample A)와 꼬시래기 김치(sample B)의 처리시 LPS에 의해 유도되는 TNF-a의 분비가 억제되는 양상을 확인하였으나 일반 김치(sample C)는 의미 있는 효과를 나타내지 않았다 (도 6).
다시마 김치(sample A)의 경우 낮은 농도인 0.5% 처리 시 가장 큰 효과를 보였고 그 보다 높은 농도에서는 오히려 억제 효과가 줄어드는 양상을 보였다. 꼬시래기 김치(sample B)의 경우 전체적으로 처리 농도에 비례하여 TNF-a 분비 억제 효과를 보였으며 1.5% 농도에서 가장 큰 효과를 나타냈다. 반면 앞서 실험예 1의 효과와는 달리 해조 김치의 처리시 전반적으로 MCP-1의 분비가 증가되는 양상을 보였다 (도 7). 특히 TNF-a의 분비를 억제시켰던 다시마 김치와 꼬시래기 김치에서 이러한 증가 효과가 두드러지게 나타났다.
(2) 세포 독성 평가
위의 염증성 사이토카인 분비 평가에서 LPS에 의한 TNF-a의 분비를 억제시키는 것으로 확인된 다시마 김치(sample A)와 꼬시래기 김치(sample B) 처리 효과가 추출물의 독성에 의한 것이 아님을 실험예 1의 세포 독성 평가와 같은 방식으로 확인하였다.
실험 결과, 실험예 1의 결과와 같이 이를 첨가한 꼬시래기 김치의 처리 또한 세포의 생존율에 큰 영향을 미치지 않았다 [도 8]. 따라서 다시마 김치와 꼬시래기 김치의 TNF-a의 분비 억제 효과가 면역 반응을 조절한 결과라 할 수 있다.
(3) 2차 염증성 사이토카인 분비 평가
1차 염증성 사이토카인 분비 평가와 세포 독성 평가를 통해 면역 조절능력이 확인된 다시마 김치(샘플 A)와 고시래기 김치(샘플 B) 추출물의 처리 농도를 0.1~2%로 낮추어 세포에 처리한 후 TNF-a, MCP-1의 분비에서 그 효과를 재확인하였다.
그 결과 LPS 자극에 의해 유도되는 TNF-a의 분비가 0.5%의 다시마 김치 추출물과 꼬시래기 김치 추출물 처리 시 의미 있게 감소하는 것을 확인하였다. 특히 꼬시래기 김치 추출물(샘플 B)의 억제 효과는 0.1~0.5% 농도 구간에서 그 처리 농도에 비례하는 양상을 보였다 [도 9].
MCP-1 분비의 경우 상기 두 종류의 김치 추출물의 처리가 LPS 처리에 의한 MCP-1의 분비를 약간 촉진시키는 것으로 나타났다 [도 10]. 이러한 결과를 통해 앞서 1차 사이토카인 평가 시 확인된 다시마 김치 추출물과 꼬시래기 김치 추출물의 효과가 재현될 수 있음이 확인되었다. 또한 같은 조건에서 다른 종류의 염증성 사이토카인인 IL-1b 및 IL-6 분비에 대한 영향을 추가로 확인하였다.
그 결과 다시마 김치 (샘플 A)와 꼬시래기 김치(샘플 B) 추출물의 처리 시 LPS에 의해 유도되는 IL-1b의 분비가 시험된 농도 모두에서 유사한 수준으로 감소됨을 확인하였다 [도 11].
IL-6 분비에서도 IL-1b의 경우와 유사한 양상의 억제 효과를 확인하였다 [도 12]. TNF-a의 경우와 마찬가지로 IL-1b와 IL-6 분비 억제 효과는 꼬시래기 김치 추출물(샘플 B) 처리 시 더 크게 나타났다.
(4) 실험결과에 대한 평가
본 발명에서 다시마와 톳을 혼합 후 열수 추출하여 유산균으로 발효시킨 복합 해조류 발효조미액 및 이를 첨가한 김치의 유효 성분의 대식 세포의 면역 반응을 조절가능성을 기초적으로 확인하였다. 특히 염증을 촉진시키는 인자인 TNF-a, IL-1b 그리고 IL-6의 분비를 억제함으로써 과도한 또는 장기적인 염증 반응을 감소시키는데 기여할 것이라 생각된다. 대식 세포는 면역 반응의 강도와 양상을 결정하는 중요한 세포로써 이러한 해조류 발효 추출물의 효과가 단순히 세포 수준을 넘어서 개체의 염증 반응 조절에도 의미 있는 영향을 미칠 것이라 예측 할 수 있다.
[실험예 3] 관능평가
상기 제조예 1 내지 제조예 9 및 비교예(해조류 추출액 무첨가군)의 김치의 관능적 차이를 비교, 판단하기 위해서 30대 남녀 각각 10명을 대상으로 색상은 육안검사를 수행하고, 맛, 매운정도, 향, 및 전체적인 기호도에 대하여는 5점 척도법을 이용하여 관능 평가를 수행하고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
샘플 | 색상(황색) | 맛 | 향 | 전반적인 기호도 |
제조예 1 | 4.8 | 4.7 | 4.6 | 4.7 |
제조예 2 | 4.8 | 4.8 | 4.7 | 4.7 |
제조예 3 | 4.8 | 4.8 | 4.7 | 4.7 |
제조예 4 | 4.8 | 4.9 | 4.8 | 4.8 |
제조예 5 | 4.8 | 4.9 | 4.8 | 4.8 |
제조예 6 | 4.8 | 4.9 | 4.8 | 4.8 |
제조예 7 | 4.8 | 4.9 | 4.8 | 4.8 |
제조예 8 | 4.8 | 4.9 | 4.8 | 4.8 |
제조예 9 | 4.8 | 4.9 | 4.8 | 4.8 |
비교예 | 4.7 | 4.0 | 3.9 | 3.8 |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조예에 따라 제조된 김치의 경우, 비교예의 김치와 대비할 때, 색상, 맛, 향의 모든 점에서 우수한 것으로 나타나 관능적 품질도 개선된 것으로 나타났다.
상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
Claims (4)
- (1) 1차 세척된 다시마와 배추를 각각 150~200ppm의 차아염소산나트륨을 이용하여 5~10분간 처리하여 소독과정을 거치고, 상기와 같이 소독과정을 거친 다시마와 배추를 물로 2~3회 정도 세척한 후, 세척한 다시마와 배추는 탈수처리한 후, 다시마는 2~10cm의 적당한 크기로 절단하여 준비하는 단계;
(2) 김치 전체의 중량을 기준으로 해조류 발효조미액 0.5~5.0 중량%, 열수 천연물 추출액 0.5~2.0 중량%, 황색 색소물질 1.0~4.0 중량%, 멸치액젓 1.0~3.0 중량%, 마늘 0.2~0.6 중량%, 생강 0.1~0.5 중량%, 양파 1.0~3.0 중량%, 대파 1.0~2.0 중량%, 찹쌀풀 0.5~1.0 중량%, 솔비톨 2.0~6.0 중량%, 설탕 1.0~3.0 중량%, 고과당 1.0~3.0 중량%, 식염 0.5~1.5 중량%, 및 L-글루타민산나트륨 0.5~1.0 중량%를 첨가한 후 혼합하여 김치용 양념장을 제조하고, 0~5℃에서 3~5일간 숙성시키는 단계;
(3) 상기 김치용 양념장을 단계 (1)에서 준비한 10~30중량%(김치 전체의 중량을 기준)의 다시마와 혼합하고 0~5℃에서 1~2일간 숙성시키고, 상기 단계 (1)에서 준비된 탈수된 50.0~55.0중량%(김치 전체의 중량을 기준)의 배추에 버무리는 단계; 및
(4) 상기 김치용 양념장이 버무려진 배추를 0~10℃에서 숙성하는 단계를 포함하되,
상기 해조류 발효조미액은,
건조다시마와 건조톳을 각각 세척, 탈염 및 불림공정을 거친 후, 세척 및 탈수처리하는 단계;
다시마와 톳이 중량비로 2:1로 혼합된 복합 해조류를 열수추출하여 복합해조류추출액을 얻는 단계;
상기 복합해조류추출액에 유산균을 접종하여 23~25℃에서 48~72시간 발효하여 해조류 유산균 발효액을 얻는 단계; 및
상기 해조류 유산균 발효액을 121℃에서 멸균처리하는 단계를 포함하여 제조되며,
상기 열수 천연물 추출액은, 열수 천연물 추출액의 중량을 기준으로 건조멸치 3.0~7.0 중량%, 건조다시마 2.0~6.0 중량%, 건조새우 1.0~5.0 중량%, 파뿌리 1.7~5.7 중량%, 명태머리 2.0~6.0 중량%, 및 무 8.0~12.0중량%를 정제수 48.0~52.0 중량%에 첨가한 후 60~80℃에서 2~6시간 동안 추출하고 여과하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법. - 삭제
- 제 1항에 있어서,
색소는 단호박, 황색색 파프리카, 치자, 홍화, 및 황련의 군에서 선택된 적어도 1종의 물질로부터 유래된 것으로, 이들 물질을 식용 미생물을 이용하여 발효한 상태로 제공되어지는 것을 특징으로 하는 해조류 발효조미액을 포함한 황금김치의 제조방법. - 삭제
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