KR102008946B1 - 친화성 크로마토그래피에 의한 항체 및 Fc-융합 단백질 정제용 리간드 - Google Patents

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마크 아놀드
올리버 카일
토마스 너위만
잉에 오트
크리스티나 슈미트
다니엘 슈비쩌
레나테 제쿨
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Abstract

본 발명은 지지체 물질 및 상기 지지체 물질에 공유 결합된 하나 이상의 리간드를 포함하는 리간드-치환된 매트릭스의, 항체 또는 항체 단편의 친화성 정제를 위한 용도에 관한 것으로서, 상기 리간드는 하기 식 (I)에 의해 표시된다:
[식 (I)]
Figure 112013019055514-pct00188

식 중,
Sp는 스페이서 기(spacer group)이고;
v는 0 또는 1이고;
Am은 아미드 기 -NR1-C(O)-이고, 여기서 NR1이 Ar1에 부착되고 -C(O)-가 Ar2에 부착되거나, 또는 -C(O)-가 Ar1에 부착되고 NR1이 Ar2에 부착되고;
R1은 수소 또는 C1 내지 C4 알킬, 바람직하게는 수소 또는 메틸이고, 더 바람직하게는 수소이고;
Ar1은 이가 5- 또는 6-원 치환 또는 비치환 방향족 고리이고;
Ar2는 (a) 단일 결합을 통해 추가 5- 또는 6-원 방향족 고리에 부착된 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리이거나; 또는 (b) 다환고리계의 부분으로서 추가 5- 또는 6-원 방향족 고리에 융합된 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리이거나; 또는 (c) C1 내지 C4 알킬, C2 내지 C4 알케닐, C2 내지 C4 알키닐, 할로겐, C1 내지 C4 할로알킬, 히드록실-치환된 C1 내지 C4 알킬, C1 내지 C4 알콕시, 히드록실-치환된 C1 내지 C4 알콕시, C1 내지 C4 알킬아미노, C1 내지 C4 알킬티오, 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 부착된 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리임.

Description

친화성 크로마토그래피에 의한 항체 및 Fc-융합 단백질 정제용 리간드{LIGANDS FOR ANTIBODY AND Fc-FUSION PROTEIN PURIFICATION BY AFFINITY CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 친화성 분리 기법, 특히 소분자 리간드를 이용한 크로마토그래피에 의한 단백질 분리, 바람직하게는 면역글로불린 Fc 부분을 함유하는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 융합 단백질의 정제 분야에 관한 것이다.
면역글로불린은 인간 및 다른 척추동물들의 체액에서 발견되는 가용성 단백질 군이다. 이들은 또한 "항체"라고도 지칭되며, 세포의 인식, 결합 및 부착의 과정에서 중요한 역할을 한다. 항체는 항원, 일반적으로 박테리아 및 바이러스의 인식 및 제거에 의한 면역계에서 중요한 역할을 하는 올리고머성 당단백질이다.
항체의 폴리머쇄는 소위 중쇄 및 경쇄를 포함하도록 구성된다. 기본적인 면역글로불린 단위는 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄와 2개의 동일한 경쇄로 이루어진다. 5개 유형의 중쇄(α, γ, δ, ε, μ)가 있으며, 이는 면역글로불린 군(IgA, IgG, IgD, IgE, IgM)을 결정한다. 경쇄 그룹은 2개의 서브 유형 λ 및 κ을 포함한다.
IgG는 가용성 항체로서, 혈액 및 다른 체액들에서 발견될 수 있다. 이는 박테리아 또는 다른 병원균에 대응하여 B-세포 유래 형질 세포에 의해 만들어지며, 박테리아 또는 다른 병원균을 중화시킨다. IgG는 분자량이 약 150 kDa인 Y-모양 당단백질이며, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 이루어진다. 각 쇄는 보존 영역과 가변 영역으로 구별된다. 중쇄의 2개의 카복시 말단 도메인은 Fc 단편("보존 단편(constant fragment)"을 형성하고, 중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 도메인은 항원을 인식하고, Fab 단편("항원-결합 단편")으로 지칭된다.
Fc 융합 단백질은 특정 약물 표적에 대한 특이성을 제공하는 단백질 또는 단백질 도메인 및 항체 Fc 단편의 조합을 통해 생성된다. 그 예는 Fc 단편의 2개의 중쇄가 특이적 항체의 중쇄의 가변 도메인(VH) 또는 경쇄의 가변 도메인(VL)에 연결된 도메인 항체-Fc 융합 단백질이다. 또다른 Fc 융합 단백질은 임의 유형의 치료적 단백질 또는 단백질 도메인과 Fc 단편의 조합물이다. Fc 부분은 단백질 약물에 안정성 및 운반가능성을 부가하기 위해 고려된다.
치료적 항체 및 Fc 융합 단백질은 다양한 질병들을 치료하기 위해 사용되며, 주된 예에는 류마티스 관절염, 건선, 다발성 경화증 및 다수 형태의 암이 포함된다. 치료적 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 단일 항체 생성 세포주로부터 유래되며, 이는 단일 항원에 대한 동일한 특이성을 보여준다. 암에 대한 가능한 치료에는 종양 세포 특이적 항원을 중화시키는 항체가 포함된다. 베바시주마브(Avastin, Genentech)는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 중화시키는 모노클로날 항체이며, 신혈관의 종양 조직으로의 성장을 방지한다.
에타네르셉트(Enbrel, Amgen, Fc 단편에 연결된 TNF-수용체 도메인) 또는 알레파셉트(Amevive, Biogen Idec, 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 LFA-3)와 같은 치료적 융합 단백질이 자가면역 질환에 대한 약물로서 사용되거나 개발된다.
다양한 생물학적 공급 스트림으로부터 단백질 생성물의 회수 및 정제에 관한 단백질 생분리는 식품, 의약 및 생명공학 산업에서 중요한 단위 조작이다. 점점 더 많은 치료적 모노클로날 항체들(Mabs) 및 융합 단백질들이 시장에 진입하고 있거나, 또는 현재 임상 개발 중에 있다. 이러한 단백질들은 정교한 다단계 정제 프로토콜에 의해 달성되는 매우 높은 순도를 요구한다. 다운스트림 가공(processing) 및 정제는 제조비용의 약 50 내지 80%를 구성하므로, 새로운 정제 전략을 개발하거나 기존의 정제 전략을 개선하려는 상당한 노력들이 진행 중이다(1).
친화성 크로마토그래피는 단백질 정제를 위한 가장 효과적인 크로마토그래피 방법들 중 하나이다. 이는 고도로 특이적인 단백질-리간드 상호작용에 기초한 것이다. 리간드는 공급물 저장액으로부터 표적 단백질을 포획하는데 사용되는 정지상에 공유적으로 고정된다. 친화성 리간드는 높은 특이성 및 선택성으로 그의 표적을 결합할 수 있으며, 복합 혼합물로부터 수천배까지 더 높은 농축을 가능하게 하여 높은 수율이 얻어진다.
통상적으로, 단백질 A(Protein A)에서의 친화성 크로마토그래피가 대부분의 Mab 및 Fc 융합 단백질 정제 도식에서 제1단계이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스의 표면에 노출된 세포벽 연관 단백질이다. 이는 다양한 종들의 면역글로불린의 보존부(Fc 도메인), 특히 인간 서브유형 IgG1, IgG2 및 IgG4에 나노몰 친화성(nanomolar affinity)으로 결합한다(2). 그러나, 단백질 A의 사용은 생성물로의 침출과 위생처리 및 제자리 세정 과정들을 위해 적용되는 가혹한 조건하에서 열악한 안정성에 의해 제한된다. 단백질 A의 화학 안정성은 Mab 정제를 위한 유전적으로 가공된 단백질 A 변이체를 이용함으로써 개선될 수 있다. 다만, 단백질 A 수지의 높은 비용 때문에 적합한 대안들, 특히 소분자로부터 선택된 대안들을 찾는 노력이 있어왔다.
마브소르벤트 A2P(Prometic Biosciences)는 면역글로불린의 정제용 소분자 리간드이다. 그러나, 상기 리간드는 적절한 선택성을 보이지 않으며(3), 공정(process) 크로마토그래피에서 적용되지 않는다.
또다른 접근법은 항체 정제에서 주된 포획 단계로서 혼합 방식(mixed mode) 크로마토그래피를 사용한다. 가장 흔한 물질은 고정된 2-메르캅토에틸피리딘(MEP HyperCel, Pall Corporation)에 기초하고, 이는 효과적으로 발효 브로스로부터 IgG를 포획하지만 단백질 A에 비해 숙주 세포 단백질(HCP)의 클리어런스가 더 낮다(4).
더 용이하게 이용할 수 있는 합성 친화성 리간드, 바람직하게는 단백질-기재 리간드보다 비용이 더 싼 합성 친화성 리간드는 엄격한 조건하에서 더 왕성(robust)하며, 단백질 A와 비슷하거나 훨씬 더 높은 선택성을 가지며, 이는 항체 및 Fc 융합 단백질 정제를 위해 적합한 용액을 제공할 것이다.
합성 소분자 친화성 리간드는 이의 일반적으로 더 높은 화학 안정성과 더 낮은 생산비용 때문에 치료적 단백질의 정제에 대해 특히 관심대상이 된다. 더 용이하게 이용할 수 있는 합성 친화성 리간드, 바람직하게는 단백질-기재 리간드보다 비용이 더 싼 합성 친화성 리간드는 엄격한 조건하에서 더 왕성하며, 단백질 A와 비슷하거나 훨씬 더 높은 선택성을 가지며, 이는 항체 및 Fc 융합 단백질 정제를 위해 적합한 용액을 제공할 것이다. 표적 단백질에 의존하여, 상기 친화성 리간드는 IgG 유형의 면역글로불린 및 Fc 융합 단백질의 보존 Fc 영역을 인식하면서, 바람직하게는 단백질 A와 동일한 광범위한 적용가능성을 제공해야 한다.
본 발명의 기저를 이루는 문제점은 항체 및 Fc 융합 단백질의 Fc 영역에 결합하는 작은 친화성 리간드를 포함하는 매트릭스를 제공하는 것이다.
상기 문제점은 후술하는 본 발명의 구현예들에 의해 해결된다.
본 발명은 지지체 물질(support material) 및 상기 지지체 물질에 공유 결합된 하나 이상의 리간드를 포함하는 리간드-치환된 매트릭스(matrix)의, 단백질의 친화성 정제를 위한 용도, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편의 친화성 정제를 위한 용도에 관한 것으로서, 상기 리간드는 하기 식 (I)에 의해 표시된다:
[식 (I)]
Figure 112013019055514-pct00001
식 중,
L은 리간드가 부착되는 지지체 물질의 연결점(linking point)이고;
Sp는 스페이서 기(spacer group)이고;
v는 0 또는 1이고;
Am은 아미드 기 -NR1-C(O)-이고, 여기서 NR1이 Ar1에 부착되고 -C(O)-가 Ar2에 부착되거나, 또는 -C(O)-가 Ar1에 부착되고 NR1이 Ar2에 부착되고;
R1은 수소 또는 C1 내지 C4 알킬, 바람직하게는 수소 또는 메틸이고, 더 바람직하게는 수소이고;
Ar1은 이가 5- 또는 6-원 치환 또는 비치환 방향족 고리이고;
Ar2는 (a) 단일 결합을 통해 추가 5- 또는 6-원 방향족 고리에 부착된 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리이거나; 또는 (b) 다환고리계의 부분으로서 추가 5- 또는 6-원 방향족 고리에 융합된 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리이거나; 또는 (c) C1 내지 C4 알킬, C2 내지 C4 알케닐, C2 내지 C4 알키닐, 할로겐, C1 내지 C4 할로알킬, 히드록실-치환된 C1 내지 C4 알킬, C1 내지 C4 알콕시, 히드록실-치환된 C1 내지 C4 알콕시, C1 내지 C4 알킬아미노, C1 내지 C4 알킬티오, 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 부착된 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리임.
식 (I)에 따른 본 발명의 리간드-치환된 매트릭스는 본 발명의 일구현예에서 식 (Ia)에 따른 구조를 갖는다. 본 발명의 추가 구현예에서, 식 (I)에 따른 본 발명의 리간드-치환된 매트릭스는 식 (Ib)에 따른 구조를 갖는다. 식 (Ia) 또는 (Ib)에서, L, Sp, N, R1, Ar1 및 Ar2와 정수 v는 식 (I)과 관련하여 상기에서 정의된 의미를 갖는다.
[식 (Ia)]
Figure 112013019055514-pct00002
[식 (Ib)]
Figure 112013019055514-pct00003
Ar1은 AR1로 표시될 수도 있고, Ar2는 AR2로 표시될 수도 있다. 또한, Sp는 V로 표시될 수도 있다. 이는 본 출원에서 우선권으로 주장하는 특허출원 EP 10008089.4에서 사용되는 것과 같은 명명법이다. 또한, 식 (I)에서 정의되고 식 (Ia) 및 (Ib)에서 보여지는 것과 같은 R1은 상기 우선권 출원에서 정의되고 보여지는 것과 같은 R4에 대응한다.
본 발명에 따른 리간드는 인간 기원의 폴리클로날 및 모노클로날 IgG, 특히 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4와 토끼 및 마우스 면역글로불린과 같은 상이한 동물 종들의 폴리클로날 및 모노클로날 IgG에 결합한다.
또한, 본 발명은 리간드-치환된 매트릭스 및 연결점 L에서, 임의적으로 스페이서 기 Sp를 통해, 매트릭스에 부착된 리간드(이는 "화합물(compound)"이라고도 지칭될 수 있음)에 관한 것이다.
상기 식 (I)에서 L은 연결점(linking point)이며, 이는 "부착점(point of attachment)"이라고도 지칭된다. 당업자라면 적절한 연결점/부착점을 파악한다.
연결점 L은 지지체 물질에 직접적으로 연결되거나 또는 스페이서를 통해 연결되는 것으로 이해된다. 통상적으로, L은 리간드를 형성하기 위해 지지체 물질의 적절한 관능기와 리간드의 전구 화합물의 대응하는 관능기의 반응으로부터 생성된 모이어티(moiety)의 부분이다.
일구현예에서, L은 지지체 물질에 직접 부착되는, 일반적으로 지지체 물질상의 적절한 관능기를 통해 부착되는 결합, 바람직하게는 단일 결합이다. 본 명세서에서, "지지체 물질(support material)"은 본 발명의 목적에 적합한 당업자에게 알려져 있고 시판되는 폴리머를 나타낸다. "지지체 물질"의 정의는 하기에 주어진다. 일반적으로, 지지체 물질은 분자의 부착을 위한 관능기, 일반적으로 본 발명의 관능기를 포함한다. 본 명세서에서, 지지체 물질의 관능기는 지지체 물질의 부분으로서 고려되며; 이는 또한 본 발명의 리간드가 결합을 통해 지지체 물질에 연결되는 경우(즉, L은 결합이고 스페이서 기 Sp를 포함하지 않음, 하기 참조)에 적용되며, 여기서 상기 결합은 본 발명에 따른 각각의 리간드와 지지체 물질의 관능기 사이에 직접 형성된다.
본 명세서에서 "관능기"는 한편으로는 지지체 물질상의 적절한 기("전구 기(precursor group)")를 나타내며, 다른 한편으로는 본 발명에 따른 리간드에 존재하는(예컨대, C=O 기 상에 존재하거나, 또는 스페이서 Sp 상에 존재하는) 적절한 기("전구 기")를 나타낸다. 또한, 본 발명에서 "관능기"는 스페이서 기 Sp 상의 적절한 기("전구 기")를 나타낸다. 본 명세서에서 "전구 기(precursor group)" 또는 "관능기"는 화학적 결합을 형성시키면서 상보적인 "전구 기" 또는 "관능기"와 화학적 반응을 할 수 있는 기이다. 필요한 경우, 부가 시약들이 상기 화학적 결합의 형성을 위해 사용될 수 있다. 앞에서 명백한 바와 같이, 반응하는 동안 관능기/전구기는 원 관능기를 "최종 관능기(final functionality)" 또는 "연결 단위(connecting unit)"로 변형시키면서 화학적 결합으로 변형된다. 상기에서, 관능기/전구기는 또한 "상보적 기(complementary group)"이거나 "상보적 기"일 수 있다는 점은 분명하다.
지지체 물질상의 관능기의 예는 당업자에게 알려져 있으며, 여기에는 -OH, -SH, -NH2, >NH -COOH, -SO3H, -CHO, -NHNH2, -P(=O)(OH)2, -O-PH(=O)(OH), -P(OH)2, -O-P(=O)(OH)2, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 에폭시드, 천연 또는 비천연 아미노산, 카복실릭 아미드, 말레이미드, 케톤, 설폭시드, 설폰, 우레아, 이소우레아, 이미도카보네이트, 설폰아미드, 설포닐히드라지드, 설포닉 에스테르, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포릭 아미드, 포스포닉 아미드, 알킨, 옥심 에테르, 옥심, 아지드, 알콕시아민, 세미카바지드, 설포닉 할라이드, 포스포닉 할라이드, 포스포릭 할라이드, 카복실릭 활성 에스테르, 설포닉 활성 에스테르, 포스포닉 활성 에스테르, 포스포릭 활성 에스테르, 포스포라미디트, 시아네이트, 티오시아네이트, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐 설포닐, Cl, Br, I, 알켄, 알킬 포스포늄이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 리간드상에서 -C=O 기에 부착되는 관능기의 예는 당업자에게 알려져 있으며, 여기에는 히드록시, 티올, F, Cl, Br, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 카복실산, 에폭시드, 아민, 아미드, 아미노산, 카복실릭 아미드, 말레이미드, 알데히드, 케톤, 설폰산, 설폭시드, 설폰, 우레아, 이소우레아, 이미도카보네이트, 설폰아미드, 설포닉 에스테르, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포릭 아미드, 포스포닉 아미드, 히드라진, 옥심, 아지드, 알켄, 알킨, 히드록실아민, 티오우레아, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, N-히드록시숙신이미딜, 1-히드록시벤조트리아졸릴, 7-아자-1-히드록시벤조트리아졸릴, 6-클로로-1-히드록시벤조트리아졸릴이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 이러한 구현예에서, 지지체 물질상의 적절한 관능기와 본 발명의 리간드의 -C=O 기 상의 적절한 관능기(또는 "전구 기")의 반응으로부터 생성된 결합 또는 화학 단위는 연결점 L을 구성하고, 여기서 본 발명의 리간드는 지지체 물질/ 매트릭스에 부착된다. 따라서, 지지체 물질상의 관능기와 본 발명의 리간드의 -C=O 기 상의 관능기(또는 "상보적 기") 사이의 화학적 반응은 연결점 L을 통해 지지체 물질과 본 발명에 따른 리간드를 연결한다.
본 발명의 추가 구현예에서, L은 스페이서 기 -Sp-에 연결된다. 이러한 구현예에서, L은 지지체 물질상의 적절한 관능기와 스페이서 기 Sp 상의 적절한 관능기(또는 "전구 기")의 반응으로부터 생성된 결합 또는 화학 단위이다. 따라서, 지지체 물질상의 관능기와 스페이서 기 Sp 상의 관능기(또는 "상보적 기") 사이의 화학적 반응은 연결점 L을 통해 지지체 물질과 본 발명에 따른 리간드를 연결한다.
식 (I)에서 v가 0인 경우, 리간드는 L에 직접 결합된다. 다른 구현예에서, 리간드는 스페이서 기 Sp를 통해 지지체 물질에 결합된다. 이는 식 (I)에서 v가 0과 다른 경우에 적용된다.
상기 스페이서 기 Sp는 바람직하게는 탄화수소 기이며, 이는 C 및 H 원자 이외에 추가 원자들을 함유할 수 있다. 적절한 추가 원자들은 당업자에게 알려져 있다. 바람직한 원자에는 O, S, N, P, Si가 포함된다. 탄화수소 기는 선형 또는 분지형 또는 환형일 수 있다. Sp는 본 발명에 따른 리간드의 -C=O 기에 연결되며, 일반적으로 Sp는 -C=O 기에 대해 알파-위치에서 발견된다. 또한, Sp는 최종 관능기(이는 연결 단위라고도 지칭될 수 있음)를 형성시키면서 본 발명의 리간드가 화학 반응에서 매트릭스와 공유적으로 연결될 수 있는 관능기(전구 기)를 함유한다.
스페이서 기 Sp는 바람직하게는 연결점 L을 통해 지지체 물질과 리간드를 공유적으로 연결하는 연결 단위/최종 관능기를 함유한다. 적절한 연결 단위/최종 관능기는 당업자에게 알려져 있다. 바람직하게는, 상기 연결 단위는 -NH2, >NH, -SH, -COOH, -SO3H, -CHO, -OH, -NHNH2, -P(=O)(OH)2, -O-PH(=O)(OH), -P(OH)2, -O-P(=O)(OH)-NHNH2, 천연 또는 비천연 아미노산, 카복실릭 아미드, 에테르, 에스테르, 티오에테르, 에폭시드, 말레이미드, 케톤, 설폭시드, 설폰, 우레아, 이소우레아, 이미도카보네이트, 설폰아미드, 설포닐히드라지드, 설포닉 에스테르, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포릭 아미드, 포스포닉 아미드, 히드라진, 옥심, 아지드, 알콕시아민, 세미카바지드, 설포닉 할라이드, 포스포닉 할라이드, 포스포릭 할라이드, 카복실릭 활성 에스테르, 설포닉 활성 에스테르, 포스포닉 활성 에스테르, 포스포릭 활성 에스테르, 포스포라미디트, 시아네이트, 티오시아네이트, 알킬 할라이드, 알킬 설포네이트, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 비닐 설포닐, 카복실릭 할라이드, 알켄 및 알킨 기를 포함하는 적합한 전구 기로부터 유래된다.
통상적으로, 상기 연결 단위는 산소 원자 또는 카복스아미드 기와 같은 하나 이상의 헤테로원자가 삽입될 수 있는 탄소 쇄에 부착된다. 일구현예에서, 상기 연결 단위는 알킬렌 또는 알킬렌-폴리옥시알킬렌 기, 예컨대 -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x-에 부착되며, 여기서 x는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6이다. 통상적으로, 스페이서 기 상의 관능기는 N, O, P, S, Si와 같은 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있는 탄화수소 기에 부착된다. 따라서, 스페이서 기는 하나 이상의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O, P, S, Si에서 선택되는 헤테로원자를 함유하는 탄화수소 기이다. 바람직하게는, 본 발명의 리간드의 C=O 기에 연결되는 원자는 질소, 산소, 탄소 또는 황이다. Sp에 함유되는 적절한 화학 엔티티(entity)/화학 단위는 당업자에게 알려져 있다. Sp는 일반적으로 알킬렌, 알코올, 아민, 아미드, 카보닐, 알킬렌옥시 및 포스페이트로부터 선택되는 하나 이상의 단위를 함유한다. 상기 알킬렌 단위는 바람직하게는 1-30개, 바람직하게는 1-12개, 특히 1-6개의 탄소 원자를 갖는다. 상기 알코올은 일차, 이차 또는 삼차 알코올일 수 있다. 상기 아민은 비유기 또는 유기 아민일 수 있다. 상기 아민은 또한 디아민 또는 트리아민, 바람직하게는 디아민일 수 있다. 상기 아미드 비유기 또는 유기 아미드일 수 있으며, 이는 디아민 또는 트리아민, 바람직하게는 디아민에서 유래될 수 있다. 상기 알킬렌옥시 단위는 선형 또는 분지형 알킬렌 단위를 포함할 수 있다. 상기 알킬렌옥시 단위는 바람직하게는 에틸렌옥시 또는 프로필렌옥시 단위, 바람직하게는 에틸렌옥시 단위이다. 이 단위는 또한 둘 이상의 전술한 엔티티/단위, 예컨대 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 상기 아미노산은 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 아미노산은 분지점(branching point)으로 제공될 수 있으며, 하나의 부착점("L")에 대한 하나보다 많은 리간드 모이어티의 연결을 가능하게 한다. 바람직한 아미노산의 예에는 6-아미노헥산산, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, 5-아미노-3-옥사펜탄산, 글리신, 베타-알라닌, 리신, 오르니틴, 글루탐산, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산 및 세린이 포함된다.
스페이서 기 Sp는 전술한 1개의 단위로 구성되거나, 또는 1개보다 많은 단위로 구성될 수 있다. 만일 스페이서 기 Sp가 전술한 1개보다 많은 단위로 구성된다면, 상기 단위는 연결기(connecting group)에 의해 상호연결된다. 상기 연결기에는 아미드, 우레아, 히드라지드, 옥살릭 디아미드, 옥심, 히드라존, 트리아졸, 티오우레아, 이소우레아, 에테르가 포함되지만 이에 한정되지 않으며, 아미드 및 우레아가 바람직하다. 포스페이트 기는 연결기로서 제공하는 것이 바람직하다. 상기 포스페이트 기는 전술한 1개, 2개 또는 3개의 단위에 연결될 수 있다. 만일 포스페이트 기가 전술한 3개의 단위에 연결된다면, 이는 분지점으로 제공될 수 있으며, 하나의 부착점("L")에 대한 하나보다 많은 리간드 모이어티의 연결을 가능하게 한다.
스페이서 기 Sp의 바람직한 단위에는 아민, 바람직하게는 유기 아민, 디아민, 예컨대 에틸렌디아민, 피페라진, 호모피페라진, -(CH2)n-C(=O), -NH-((CH2)2O)n-(CH2)n-NH-; -NH-(CH2)n-NH-, -NH-(CH2)n-, -NH-CH-(C(=O)NH-, -NH-(O-C2H4)n-CH2-C(=O)-가 포함되지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 n은 1-30의 정수, 바람직하게는 1-12의 정수이다. 일구현예에서, n은 1-6의 정수, 즉 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 스페이서 기 Sp의 추가적으로 바람직한 단위에는 아미노산(이는 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있음), 특히 6-아미노헥산산, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, 5-아미노-3-옥사펜탄산, 리신 및 글루탐산이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 명명되는 단위 및 관능기는 스페이서 기 Sp의 부분 및 연결점 L의 부분이다.
스페이서 기 Sp의 특히 바람직한 예는 -NH-(CH2)nNH-, -NH-((CH2)2O)n-(CH2)2-NH-이고, 여기서 n은 1-30의 정수, 바람직하게는 1-12의 정수이다. 일구현예에서, n은 1-6의 정수, 즉 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
스페이서 기 Sp의 특히 바람직한 예는 또한 다음과 같다:
-NH-CH2-CH2-CH2-NH, 여기서 -NH-는 연결점 L에 부착됨;
-NH-(CH2)3-NH-, 여기서 N은 연결점 L에 부착되고, 다른 N은 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-N'H-CH(C(=O)NH-(CH2)3-N''H-)((CH2)2C(=O)NH-(CH2)3-N'''H-), 여기서 N'은 연결점 L에 부착되고, N'' 및 N'''은 2개의 개별 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-NH-(CH2)3-N'(CH3)-, 여기서 N은 연결점 L에 부착되고, N'은 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-N'H-(CH2)3-NH-C(=O)-CH(-N''H-)(-(CH2)4-N'''H-), 여기서 N'은 연결점 L에 부착되고, N'' 및 N'''은 2개의 개별 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-N'H-(CH2)3-NH-C(=O)-CH(-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-N''H-)(-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-N'''H-), 여기서 N'은 연결점 L에 부착되고, N'' 및 N'''은 2개의 개별 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-N'H-(CH2)3-NH-C(=O)-CH(-NH-C(=O)-CH2-O-C2H4-N''H-)(-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-O-C2H4-N'''H-), 여기서 N'은 연결점 L에 부착되고, N'' 및 N'''은 2개의 개별 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-N'H-(CH2)3-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-N''H-, 여기서 N'은 연결점 L에 부착되고, N''은 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-N'H-(CH2)3-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-N''H-, 여기서 N'은 연결점 L에 부착되고, N''은 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-N'H-(C2H4-O)2-C2H4-NH-C(=O)-NH-C2H4-(O-C2H4)2-N'H-, 여기서 N'은 연결점 L에 부착되고, 다른 N'은 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-N'H-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2)3-N''H-, 여기서 N'은 연결점 L에 부착되고, N''은 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-N'H-C2H4-(O-C2H4)2-NH-C(=O)-(CH2)5-N''H-, 여기서 N'은 연결점 L에 부착되고, N''은 리간드의 C(=O)에 부착됨;
-N'H-(CH2)6-NH-C(=O)-CH2-(O-C2H4)2-N''H-, 여기서 N'은 연결점 L에 부착되고, N''은 리간드의 C(=O)에 부착됨.
통상적으로, 스페이서 기 Sp의 전체 길이는 100개 원자 미만, 바람직하게는 60개 원자 미만, 특히 30개 원자 미만이다.
본 발명의 일구현예에서, Sp는 분지형일 수도 있다. 본 명세서에서 "분지형"이라는 용어는 식 (II)에 따른 본 발명의 리간드가 1개보다 많은 수가 스페이서 기 Sp 상에 존재한다는 것을 의미한다. 이러한 구현예는 1개의 매트릭스 부착점(연결점) L에 대한 1개보다 많은 리간드의 연결을 가능하게 한다.
본 명세서에서 "최종 관능기(final functionality)" 또는 "연결 단위(connecting unit)"는 지지체 물질 상의 전구 기(관능기)와 본 발명의 리간드 및/또는 스페이서 기 Sp 상의 전구 기(관능기) 사이의 반응에서 형성된 단위를 나타낸다. 연결 단위는 지지체 물질과 본 발명의 리간드(이는 스페이서 Sp를 함유할 수 있음) 사이에 결합을 혼입하여, 리간드-치환된 매트릭스를 생성시킨다.
L 및/또는 Sp에 혼입되는 연결 단위는 당업자에게 알려져 있으며, 여기에는 하기의 군이 포함될 수 있다: 에테르, 티오에테르, C-C 단일 결합, 알케닐, 알키닐, 에스테르, 아민, 아미드, 카복실릭 아미드, 설포닉 에스테르, 설포닉 아미드, 포스포닉 에스테르, 포스포닉 아미드, 포스포릭 에스테르, 포스포릭 아미드, 포스포릭 티오에스테르, 티오포스포릭 에스테르, 이차 아민, 이차 알코올, 삼차 알코올, 2-히드록시아민, 우레아, 이소우레아, 이미도카보네이트, 알킬티오숙시닉 이미드, 디알킬숙시닉 이미드, 트리아졸, 케톤, 설폭시드, 설폰, 옥심 에테르, 히드라존, 실릴 에테르, 디아실 히드라지드, 아실 설포닐 히드라지드, N-아실 설폰아미드, 히드라지드, N-알콕시 아미드, 아실 세미카바지드, 아실옥시 아미드, 설포닐옥시 아미드, 포스포릴옥시 아미드, 포스포닐옥시 아미드, 아실 히드라존, N-카복스아미도이소우레아, N-카복스아미도이미도카보네이트, N-카복스아미도이소티오우레아, N-카복스아미도이미도티오카보네이트, 아실 우레아, 아실 티오우레아, N-카복스아미도우레아, N-카복스아미도이소우레아, 알킬티오에틸설포닐, 히드라지닐숙신이미드, 아실히드라지닐숙신이미드, 알콕시아미노숙신이미드, 아미노숙신이미드, 히드라지닐에틸설포닐, 아실히드라지닐에틸설포닐, 알콕시아미노에틸설포닐, 아미노에틸설포닐, 테트라졸, 알콕시아미딘.
식 (I)에서 v가 0인 경우, 리간드는 L에 직접 결합된다. 다른 구현예에서, 리간드는 스페이서 기 Sp를 통해 지지체 물질에 결합된다.
본 발명의 일구현예에서, R1은 하기로부터 선택된다: 수소; 및 C1 내지 C4 알킬, 통상적으로 선형 및 분지형 C1 내지 C4 알킬, 여기에는 시클로알킬 단위, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 시클로프로필, 메틸시클로프로필이 포함될 수 있음.
바람직하게는 R1은 수소 및 메틸로부터 선택된다. 더 바람직하게는, R1은 수소이다.
Ar1은 지환족 또는 헤테로환 방향족 고리일 수 있으며; 바람직하게는 Ar1은 지환족 방향족 고리이고, 즉 예를 들어 Ar1은 페닐렌이다. 더욱 바람직한 구현예에서, Ar1은 페닐렌이다. Ar1이 헤테로환 방향족 고리인 경우, 이는 하나, 둘 이상의 헤테로원자를 포함하며, 여기서 헤테로원자는 바람직하게는 N, S, O 및 이의 조합으로부터 선택된다. 적절한 5- 또는 6-원 헤테로시클릭 방향족 고리의 예에는 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 피라졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸(4H-1,2,4-트리아졸 및 1H-1,2,4-트리아졸), 1H-테트라졸, 2H-테트라졸, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 피리다진, 1,2,3-트리아진, 1,2,4-트리아진 및 1,3,5-트리아진이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 5- 또는 6-원 헤테로시클릭 방향족 고리는 이미다졸, 티아졸 및 피리딘이다.
식 (I)에서 Ar1은 C=O 기 및 NH 기에 결합되거나(식 Ia 참조) 또는 2개의 C=O 기에 결합된다(식 Ib 참조).
식 Ia으로 표시되는 경우, 일부 구현예에서 C=O 및 NH 기는 서로에 대해 메타 위치에 있다. Ar1이 페닐렌인 경우, C=O 기 및 NH 기는 서로에 대해 메타 또는 파라, 바람직하게는 메타에 위치한다. 방향족 고리가 이미다졸인 경우, C=O 기는 통상적으로 2-위치에서 결합되고 NH 기는 4-위치에서 결합된다. 방향족 고리가 티아졸인 경우, C=O 기는 통상적으로 4-위치에서 결합되고 NH 기는 2-위치에서 결합된다. 방향족 고리가 피리딘인 경우, C=O 기 및 NH 기는 바람직하게는 서로에 대해 메타에 위치하는 반면, 질소 고리 원자는 다른 위치를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, C=O 기는 통상적으로 피리딘 고리의 3-위치에서 결합되고 NH 기는 5-위치에서 결합된다. 전술한 바람직한 구현예들을 포함하는 이가 5- 또는 6-원 방향족 고리는 치환 또는 비치환일 수 있다. 통상적으로, 5- 또는 6-원 방향족 고리는 치환된 것이고, 바람직하게는 일치환된 것이다. 적절한 치환기의 예는 C1 내지 C4 알콕시, 통상적으로 선형 및 분지형 C1 내지 C4 알콕시(여기에는 시클로알킬 단위, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, i-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 시클로프로폭시, 메틸시클로프로폭시 및 시클로부톡시가 포함될 수 있음); C1 내지 C4 알킬, 통상적으로 선형 및 분지형 C1 내지 C4 알킬(여기에는 시클로알킬 단위, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 시클로프로필, 메틸시클로프로필 및 시클로부틸이 포함될 수 있음); 히드록실; 및 이들의 조합이다. 바람직한 치환기에는 메톡시, 에톡시 및 메틸이 포함되며, 메톡시가 가장 바람직하다.
가장 바람직한 구현예에서, Ar1은 메톡시-치환된 페닐렌이고, 여기서 메톡시 라디칼은 C=O 기에 대해 오르소에 위치하고 NH 기에 대해 파라에 위치한다(상기 C=O 기 및 NH 기는 서로에 대해 메타에 위치한다). 또다른 바람직한 구현예에서, Ar1은 메톡시-치환된 페닐렌이고, 여기서 메톡시 라디칼은 C=O 기에 대해 파라에 위치하고 NH 기에 대해 오르소에 위치한다(상기 C=O 기 및 NH 기는 서로에 대해 메타에 위치한다). 또다른 바람직한 구현예에서, Ar1은 N-메틸-치환된 이미다졸 고리이고, 여기서 C=O 기는 2-위치에서 결합되고 NH 기는 4-위치에서 결합된다. 또다른 바람직한 구현예에서, Ar1은 티아졸이고, 여기서 C=O 기는 4-위치에서 결합되고 NH 기는 2-위치에서 결합된다. 또다른 바람직한 구현예에서, Ar1은 메틸-치환된 페닐렌이고, 여기서 메틸 라디칼은 C=O 기에 대해 오르소에 위치하고 NH 기에 대해 오르소에 위치한다(상기 C=O 기 및 NH 기는 서로에 대해 메타에 위치한다). 또다른 바람직한 구현예에서, Ar1은 메틸-치환된 페닐렌이고, 여기서 메틸 라디칼은 C=O 기에 대해 파라에 위치하고 NH 기에 대해 오르소에 위치한다(상기 C=O 기 및 NH 기는 서로에 대해 메타에 위치한다). 또다른 바람직한 구현예에서, Ar1은 피리딘 고리이고, 여기서 C=O 기는 3-위치에서 결합되고 NH 기는 5-위치에서 결합된다. 또다른 바람직한 구현예에서, Ar1은 비치환된 페닐렌이고, 여기서 C=O 및 NH 기는 서로에 대해 메타 또는 파라에 위치한다.
식 Ib로 표시되는 경우, 일부 구현예에서 2개의 C=O 기는 서로에 대해 메타 위치에 있다. Ar1이 페닐렌인 경우, 2개의 C=O 기는 서로에 대해 메타 또는 파라, 바람직하게는 메타에 위치한다.
Ar2는 5- 또는 6-원 비치환 또는 치환 헤테로환 방향족 고리로서,
(a) 단일 결합을 통해 추가 5- 또는 6-원 방향족 고리에 부착되거나; 또는
(b) 다환고리계의 부분으로서 추가 5- 또는 6-원 방향족 고리에 융합되거나; 또는
(c) C1 내지 C4 알킬, C2 내지 C4 알케닐, C2 내지 C4 알키닐, 할로겐, C1 내지 C4 할로알킬, 히드록실-치환된 C1 내지 C4 알킬, C1 내지 C4 알콕시, 히드록실-치환된 C1 내지 C4 알콕시, C1 내지 C4 알킬아미노, C1 내지 C4 알킬티오, 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 부착된다.
Ar2는 C=O 기에 부착되거나(식 Ia 참조) 또는 NR1 기(식 Ib 참조)에 부착된다.
Ar2의 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하며, 여기서 헤테로원자는 바람직하게는 N, S, O 및 이의 조합으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 상기 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리는 둘 이상의 질소 원자 또는 질소 원자 및 산소 원자를 함유한다. C=O 기는 또한 제1 방향족 고리의 부분일 수도 있다. 통상적으로, Ar2의 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리는 고리 헤테로원자, 바람직하게는 질소 또는 산소 원자에 인접한 탄소 고리 원자를 통해 C=O 기에 부착된다. 일부 구현예에서, Ar2의 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리는 고리 헤테로원자, 바람직하게는 질소, 산소 또는 황 원자에 인접한 탄소 고리 원자를 통해 NR1 기에 부착된다.
식 (I)에서 C=O 기에 직접 결합되거나 NR1 기에 직접 결합된 Ar2의 적절한 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리의 예에는 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 피라졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸(4H-1,2,4-트리아졸 및 1H-1,2,4-트리아졸), 1H-테트라졸, 2H-테트라졸, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 피리다진, 1,2,3-트리아진, 1,2,4-트리아진, 1,3,5-트리아진, 1,2,4 옥사디아졸, 1,3,4 옥사디아졸, 1,2,4-티아디아졸 및 1,3,4-티아디아졸이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 5- 또는 6-원 헤테로시클릭 방향족 고리는 피라졸, 이미다졸, 이속사졸, 피롤, 푸란, 1,2,4-트리아졸, 피리딘, 1,2,4-트리아진, 피리다진, 피리미딘, 1,2,4-옥사디아졸, 1,3,4-옥사디아졸 티아졸 및 1,3,4-티아디아졸이고, 가장 바람직하게는 피라졸, 이미다졸, 이속사졸, 1,2,4-옥사디아졸, 1,3,4 옥사디아졸, 티아졸 및 1,3,4-티아디아졸이다. 피라졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 3-위치, 4-위치 또는 5-위치, 바람직하게는 3-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 피라졸 고리의 경우, NR1-기의 N 원자는 통상적으로 3-위치, 4-위치 또는 5-위치, 바람직하게는 3-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 이미다졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 4-위치 또는 2-위치에서 이미다졸 고리에 결합된다. 이속사졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 5-위치 또는 3-위치에서 이속사졸 고리에 결합된다. 피롤 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 3-위치에서 피롤 고리에 결합된다. 푸란 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 2-위치에서 푸란 고리에 결합된다. 1,2,4-트리아졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 3-위치에서 1,2,4-트리아졸 고리에 결합된다. 피리딘 고리에서, C=O 기는 통상적으로 3-위치 또는 2-위치, 바람직하게는 2- 및 3-위치에서 피리딘 고리에 결합된다. 1,2,4-트리아진 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 3-위치에서 1,2,4-트리아진 고리에 결합된다. 피리다진 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 4-위치에서 피리다진 고리에 결합된다. 1,2,4-옥사디아졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 5-위치에서 1,2,4-옥사디아졸 고리에 결합된다. 1,3,4-옥사디아졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 2- 또는 5-위치에서 1,3,4-옥사디아졸 고리에 결합된다. 티아졸 고리의 경우, NR1-기의 N 원자는 통상적으로 2-위치에서 티아졸 고리에 결합된다. 1,3,4 티아디아졸 고리의 경우, NR1-기의 N 원자는 통상적으로 2-위치에서 1,3,4 티아디아졸 고리에 결합된다.
식 (I)에 대해 전술한 Ar2의 대안적인 (a)에서, 5- 또는 6-원 헤테로시클릭 방향족 고리는 단일 결합을 통해 추가 5- 또는 6-원 방향족 고리(하기에서는 "Ar2의 제2 방향족 고리"라고 함)에 부착된다. 이들 구현예에서, C=O 기에 직접 결합된 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리(하기에서는 "Ar2의 제1 방향족 고리"라고 함)가 피라졸, 피리딘, 이속사졸, 1,2,4-옥사디아졸 또는 1,3,4-옥사디아졸 고리인 것이 특히 바람직하다. 제1 방향족 고리로서 피라졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 3-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 제2 방향족 고리는 바람직하게는 5-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 또다른 구현예에서, C=O 기는 5-위치에서 피라졸 고리에 결합되고 제2 방향족 고리는 3-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 제1 방향족 고리가 피리딘인 경우, C=O 기 및 제2 방향족 고리는 바람직하게는 서로에 대해 메타에서 위치하는 반면, 질소 고리 원자는 다른 위치를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, C=O 기는 3-위치에서 피리딘 고리에 결합되고 제2 방향족 고리는 5-위치에서 피리딘 고리에 결합된다. 또다른 구현예에서, C=O 기는 2-위치에서 피리딘 고리에 결합되고 제2 방향족 고리는 4-위치에서 피리딘 고리에 결합된다. 제1 방향족 고리로서 이속사졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 3-위치에서 이속사졸 고리에 결합된다. 제2 방향족 고리는 바람직하게는 5-위치에서 이속사졸 고리에 결합된다. 또다른 구현예에서, C=O 기는 5-위치에서 이속사졸 고리에 결합되고 제2 방향족 고리는 3-위치에서 이속사졸 고리에 결합된다. 제1 방향족 고리로서 1,2,4-옥사디아졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 5-위치에서 1,2,4-옥사디아졸 고리에 결합된다. 제2 방향족 고리는 바람직하게는 3-위치에서 1,2,4-옥사디아졸 고리에 결합된다. 제1 방향족 고리로서 1,3,4-옥사디아졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 2 위치에서 1,3,4-옥사디아졸 고리에 결합된다. 제2 방향족 고리는 바람직하게는 5-위치에서 1,3,4-옥사디아졸 고리에 결합된다. 일부 구현예에서, NR1-기의 N 원자에 직접 결합된 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리(하기에서는 "Ar2의 제1 방향족 고리"라고 함)가 피라졸, 티아졸, 1,3,4 티아디아졸 고리인 것이 특히 바람직하다. 제1 방향족 고리로서 피라졸 고리의 경우, NR1-기의 N 원자는 통상적으로 5-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 제2 방향족 고리는 바람직하게는 3-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 제1 방향족 고리가 티아졸 고리인 경우, NR1-기의 N 원자는 통상적으로 2-위치에서 티아졸 고리에 결합된다. 제2 방향족 고리는 바람직하게는 4-위치에서 티아졸 고리에 결합된다. 또다른 구현예에서, 제2 방향족 고리는 바람직하게는 5-위치에서 티아졸 고리에 결합된다. 제1 방향족 고리로서 1,3,4 티아디아졸 고리의 경우, NR1-기의 N 원자는 통상적으로 2-위치에서 1,3,4 티아디아졸 고리에 결합된다. 제2 방향족 고리는 바람직하게는 5-위치에서 1,3,4 티아디아졸 고리에 결합된다.
대안적인 (b)에서, 제1 방향족 고리는 다환고리계, 바람직하게는 이환(bicyclic)고리계의 부분으로서 제2의 5- 또는 6-원 방향족 고리에 융합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 피라졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 3-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 피라졸 고리는 바람직하게는 4- 및 5-위치를 통해 제2 방향족 고리에 융합된다. 또다른 경우, C=O 기는 4-위치에서 피라졸 고리에 결합되고 제2 방향족 고리는 1- 및 5-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 또다른 경우, C=O 기는 3-위치에서 피라졸 고리에 결합되고 제2 방향족 고리는 1- 및 5-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 이속사졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 5-위치에서 이속사졸 고리에 결합된다. 이속사졸 고리는 바람직하게는 3- 및 4-위치에서 제2 방향족 고리에 융합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 이미다졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 4-위치에서 이미다졸 고리에 결합된다. 이미다졸 고리는 바람직하게는 1- 및 2-위치에서 제2 방향족 고리에 융합된다. 또다른 경우, C=O 기는 2-위치에서 이미다졸 고리에 결합되고 제2 방향족 고리는 4- 및 5-위치를 통해 이미다졸 고리에 융합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 1,2,4-트리아졸 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 3-위치에서 1,2,4-트리아졸 고리에 결합된다. 1,2,4-트리아졸 고리는 바람직하게는 4- 및 5-위치를 통해 제2 방향족 고리에 융합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 피리다진의 경우, C=O 기는 통상적으로 4-위치에서 피리다진 고리에 결합된다. 피리다진 고리는 바람직하게는 5- 및 6-위치를 통해 제2 방향족 고리에 융합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 피롤 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 3-위치에서 피롤 고리에 결합된다. 피롤 고리는 바람직하게는 4- 및 5-위치를 통해 제2 방향족 고리에 융합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 피리딘 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 2-위치에서 피리딘 고리에 결합된다. 피리딘 고리는 바람직하게는 3- 및 4-위치를 통해 제2 방향족 고리에 융합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 1,2,4-트리아진 고리의 경우, C=O 기는 통상적으로 6-위치에서 1,2,4-트리아진 고리에 결합된다. 1,2,4-트리아진 고리는 바람직하게는 3- 및 4-위치를 통해 제2 방향족 고리에 융합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 피라졸 고리의 경우, NR1-기의 N 원자는 통상적으로 3-위치에서 피라졸 고리에 결합된다. 피라졸 고리는 바람직하게는 4- 및 5-위치를 통해 제2 방향족 고리에 융합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 이미다졸 고리의 경우, NR1-기의 N 원자는 통상적으로 4-위치에서 이미다졸 고리에 결합된다. 이미다졸 고리는 바람직하게는 1- 및 2-위치를 통해 제2 방향족 고리에 융합된다. 제1 방향족 고리로서 융합 고리계의 일부인 티아졸 고리의 경우, NR1-기의 N 원자는 통상적으로 2-위치에서 티아졸 고리에 결합된다. 티아졸 고리는 바람직하게는 4- 및 5-위치를 통해 제2 방향족 고리에 융합된다.
전술한 바람직한 구현예들을 포함하는 2개의 대안 (a) 및 (b)에서 Ar2의 제2 방향족 고리는 통상적으로 5- 또는 6-원 지환족 또는 헤테로환 고리이다. 적절한 5- 또는 6-원 방향족 고리의 예에는 벤젠, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 피라졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸(4H-1,2,4-트리아졸 및 1H-1,2,4-트리아졸), 1H-테트라졸, 2H-테트라졸, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 피리다진, 1,2,3-트리아진, 1,2,4-트리아진 및 1,3,5-트리아진이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 제2 방향족 고리는 벤젠, 푸란, 티오펜, 피롤, 피리딘, 티아졸, 피리미딘 및 피라졸이며, 가장 바람직하게는 벤젠, 티아졸, 푸란 및 티오펜이다.
대안 (a)에서, Ar2의 제2 방향족 고리는 통상적으로 푸란, 티오펜, 피롤, 벤젠, 피리딘 또는 티아졸이고, 바람직하게는 푸란, 티오펜, 벤젠 및 티아졸이고, 가장 바람직하게는 푸란 및 티아졸이다. 대안 (a)에서 제2 방향족 고리로서 푸란, 티오펜, 피롤, 벤젠 또는 티아졸 고리의 경우, 상기 고리들은 바람직하게는 2-, 3- 또는 4-위치를 통해 제1 방향족 고리에 결합되고, 2- 및 4-위치가 가장 바람직하다. 대안 (a)의 전형적인 구현예에서, 제1 방향족 고리는 피라졸 고리이고, 제2 방향족 고리는 푸란 고리, 즉 Ar2는 푸릴피라질, 예컨대 5-(2-푸릴)피라졸-3-일이다. 전형적인 추가 구현예에서, Ar2는 5-(2-메틸티아졸-4-일)이속사졸-3-일, 4-(2-푸릴)피리딘-2-일, 3-(4-메톡시페닐)-[1,2,4]옥사디아졸-5-일, 3-(2-푸릴)-[1,2,4]옥사디아졸-5-일 또는 5-(2-푸릴)-[1,3,4]옥사디아졸-2-일이다.
대안 (b)에서, Ar2의 제2 방향족 고리는 바람직하게는 벤젠, 티아졸, 피롤, 피리미딘 또는 피리딘이고, 가장 바람직하게는 벤젠 및 티아졸이다. 대안 (b)의 전형적인 구현예에서, Ar2는 벤조[c]이속사졸-3-일, 이미다조[2,1-b]티아졸-6-일, 시놀린-4-일, 인돌-3-일, 인다졸-3-일, 벤조[c]푸란-1-일, 1-이소퀴놀리닐, 5-옥소-5H-[1,3]티아졸[3,2-a]피리미딘-6-일, 피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일, [1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리미딘-3-일 및 피라졸로[5,1-c][1,2,4]트리아진-3-일이고, 바람직하게는 벤조[c]이속사졸-3-일, 인다졸-3-일 및 이미다조[2,1-b]티아졸-6-일이다.
식 (I)에 대해 전술한 Ar2의 대안 (c)에서, 5- 또는 6-원 헤테로시클릭 방향족 고리는 C1 내지 C4 알킬, 통상적으로 선형 또는 분지형 C1 내지 C4 알킬(이는 시클로알킬 단위, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 시클로프로필, 메틸시클로프로필 및 시클로부틸을 포함할 수 있음); C2 내지 C4 알케닐; C2 내지 C4 알키닐, 예컨대 에티닐; 할로겐, 예컨대 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오드; C1 내지 C4 할로알킬, 예컨대 트리플루오로메틸; 히드록실-치환된 C1 내지 C4 알킬, 통상적으로 모노- 또는 디히드록시알킬, 예컨대 모노- 또는 디히드록시에틸 또는 모노- 또는 디히드록시프로필; C1 내지 C4 알콕시, 통상적으로 선형 및 분지형 C1 내지 C4 알콕시(이는 시클로알킬 단위, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, i-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 시클로프로폭시, 메틸시클로프로폭시 및 시클로부톡시가 포함될 수 있음); 히드록실-치환된 C1 내지 C4 알콕시, 통상적으로 모노히드록실-치환된 C1 내지 C4 알콕시; C1 내지 C4 알킬아미노; C1 내지 C4 알킬티오, 및 이의 조합들로부터 선택된 하나 이상의(바람직하게는 하나 또는 둘) 치환기에 부착된다. 상기 치환기(들)는 고리 탄소 및/또는 고리 헤테로원자, 바람직하게는 탄소 및/또는 질소 고리 원자를 통해 고리에 결합될 수 있다. 대안 (c)에서 5- 또는 6-원 헤테로시클릭 방향족 고리의 바람직한 치환기는 시클로프로필, 에티닐, 메틸 및 트리플루오로메틸이다. 하나 이상의 치환기는 바람직하게는 C=O 기에 대해 메타에 위치한다. 대안 (c)의 전형적인 구현예에서, Ar2는 3-시클로프로필피리딘-5-일, 3-에티닐피리딘-5-일, 5-(트리플루오로메틸)피라졸-3-일, 5-(트리플루오로메틸)피라졸-3-일 또는 1-메틸-5-(트리플루오로메틸)피라졸-3-일이다.
대안 (a) 및 (b)에서 Ar2의 방향족 고리들, 즉 제1 방향족 고리 또는 제2 방향족 고리 또는 둘다는 통상적으로 대안 (c)에 대해 전술한 치환기로부터 선택되는 하나 이상의 추가 치환기를 임의적으로 함유할 수 있는 것으로 이해된다. 치환기(들)는 고리 탄소 또는 고리 헤테로원자, 바람직하게는 탄소 또는 질소 원자를 통해 고리(들)에 결합될 수 있다. Ar2의 제1 및/또는 제2 방향족 고리의 바람직한 치환기는 C1 내지 C4 알킬, 예컨대 메틸; 할로, 예컨대 브로모 및 클로로; 히드록소알킬, 예컨대 메톡시, 2-히드록시에틸 또는 2,3-디히드록시프로필, 알킬아미노, 예컨대 아미노프로필 및 할로알킬, 예컨대 트리플루오로메틸이다. 제1 방향족 고리가 피라졸 고리인 경우, 이는 통상적으로 메틸-치환된 것이고, 바람직하게는 N-메틸-치환된 것이고, 더 바람직하게는 1-위치에서 치환된 것이다. 피라졸의 N-메틸 치환이 대안 (a)에서 특히 바람직하다.
대안 (a)에서 치환된 Ar2의 전형적인 예는 5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일이다.
제1 방향족 고리가 피리딘 고리인 경우, 이는 통상적으로 추가 치환기를 함유하지 않는다.
대안 (b)에서 치환된 Ar2의 전형적인 예는 5-클로로-1H-인다졸-3-일, 1-메틸인돌-3-일, 1-메틸인다졸-3-일, 5,7-디메틸-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리미딘-3-일 4,7-디메틸피라졸로[5,1-c][1,2,4]트리아진-3-일, 1-에틸인다졸-3-일, 1-(2-히드록시에틸)인다졸-3-일 및 1-(2,3-디히드록시프로필)인다졸-3-일이다.
2개의 대안 (a) 및 (b)에서 제2 방향족 고리가 벤젠과 같은 추가 방향족 고리에 임의적으로 융합될 수 있다는 점은 또한 본 발명에 포함된다. 추가 방향족 고리에 융합되는 제2 방향족 고리의 통상적인 예는 벤조티오펜이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 카보닐 관능기에 대해 알파 위치의 기는 아미노 기 NR2이고, 여기서 R2는 하기에서 정의되는 것과 다양한 의미들을 가질 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 리간드-치환된 매트릭스는 상기 식 (I), (Ia) 및 (Ib)에 의해 커버되는 하기 식 (II), (IIa) 및 (IIb)에서와 같이 나타낼 수 있다.
[식 (II)]
Figure 112013019055514-pct00004
[식 (IIa)]
Figure 112013019055514-pct00005
[식 (IIb)]
Figure 112013019055514-pct00006
상기 식 (II), (IIa) 및 (IIb)에서, NR2 기는 스페이서 기 Sp 또는 연결점 L의 부분으로서 보여지는 것이 아니라, 명확성을 이유로 상기 리간드의 부분으로서 보여진다. 그러나, NR2는 V와 함께 식 (I), (Ia) 및 (Ib)에서 보여지듯이 스페이서 기 Sp를 형성하거나, 또는 연결점 L의 부분이라는 점에 유념하여야 한다.
본 발명의 일구현예에서, R2는 하기로부터 선택된다: 수소; 및 C1 내지 C4 알킬, 통상적으로 선형 및 분지형 C1 내지 C4 알킬(이는 시클로알킬 단위, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 시클로프로필, 메틸시클로프로필이 포함될 수 있음).
바람직하게는 R2는 수소 및 메틸로부터 선택된다. 더 바람직하게는, R1은 수소이다.
다른 기호들 Ar1, Ar2 및 Am은 식 (I), (Ia) 및 (Ib)에 대해 상기에서 정의된 의미와 바람직한 의미를 갖는다.
식 (II)에서 정의되고 식 (IIa) 및 (IIb)에서 보여지는 R2는 본 출원에서 우선권으로 주장하는 특허출원 EP 10008089.4에서 정의되고 보여지는 R3에 대응한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 리간드(지지체 물질에 부착된 이후)가 지지체 물질과 함께 본 발명의 방법에서 사용되는 리간드-치환된 매트릭스를 형성하는 것을 포함한다. 상기 리간드는 하기 식에 따르며, 여기서 기호 Sp, Ar1, Ar2 및 Am은 바람직한 의미를 비롯하여 상기에서 정의된 의미들을 갖는다.
[식 (III)]
Figure 112013019055514-pct00007
[식 (IIIa)]
Figure 112013019055514-pct00008
[식 (IIIb)]
Figure 112013019055514-pct00009
식 (III), (IIIa) 및 (IIIb)에 따른 리간드는 리간드에 부착된 스페이서 기 Sp를 포함한다.
식 (III), (IIIa) 및 (IIIb)에 따른 리간드는 스페이서 기가 부착되지 않은 추가 화합물의 합성을 위한 전구체로서 제공될 수 있다. 상기 명명된 화합물들은 스페이서 기의 분할 이후에, 및 경우에 따라서는 항체에 결합하는 분자의 일부에 존재하는 관능기를 포함하는 -C=O를 당업자에게 알려진 임의의 다른 적절한 관능기로 전환 이후에, 제조된다. 이를 위해 적절한 반응들은 당업자에게 알려져 있다. 생성된 화합물들은 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 매트릭스의 바람직한 리간드는 하기에 보여지며, 각각의 식에서 제일 왼쪽의 N 원자는 도시되지 않은 연결점 L에 연결된다. 하기의 모든 식들은 리간드에 부착된 스페이서 기를 보여준다:
5-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L1)
Figure 112013019055514-pct00010
5-[5-(4-브로모-2-티에닐)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L2)
Figure 112013019055514-pct00011
5-[5-(2,5-디메틸-3-티에닐)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L3)
Figure 112013019055514-pct00012
5-(5-클로로-1H-인다졸-3-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L4)
Figure 112013019055514-pct00013
2-메톡시-5-[3-(2-티에닐)피리딘-5-일]카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L5)
Figure 112013019055514-pct00014
2-메톡시-5-[1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L6)
Figure 112013019055514-pct00015
5-[5-(3-클로로페닐)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L7)
Figure 112013019055514-pct00016
2-메톡시-5-[1-메틸-5-(3-티에닐)피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L8)
Figure 112013019055514-pct00017
2-메틸-3-[1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L9)
Figure 112013019055514-pct00018
4-메틸-3-[1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L10)
Figure 112013019055514-pct00019
2-메톡시-5-(3-페닐피리딘-5-일)카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L11)
Figure 112013019055514-pct00020
2-메톡시-5-{3-[4-(트리플루오로메틸)페닐]피리딘-5-일}카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L12)
Figure 112013019055514-pct00021
5-[3-(2-푸릴)피리딘-5-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L13)
Figure 112013019055514-pct00022
5-[3-(2-벤조티에닐)피리딘-5-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L14)
Figure 112013019055514-pct00023
2-메톡시-5-(1-메틸-5-페닐피라졸-3-일)카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L15)
Figure 112013019055514-pct00024
2-메톡시-5-[5-(1-메틸-2-피롤릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L16)
Figure 112013019055514-pct00025
3-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L17)
Figure 112013019055514-pct00026
4-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L18)
Figure 112013019055514-pct00027
2-[1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-일]카복스아미도티아졸-4-카복실산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L19)
Figure 112013019055514-pct00028
5-[5-(2-푸릴)피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L20)
Figure 112013019055514-pct00029
3-{N-[5-(2-푸릴)피라졸-3-일]카바모일}벤조산 N'-(3-아미노프로필)아미드 (L21)
Figure 112013019055514-pct00030
5-[3-(3-푸릴)피리딘-5-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L22)
Figure 112013019055514-pct00031
5-(3-시클로프로필피리딘-5-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L23)
Figure 112013019055514-pct00032
5-(3-에티닐피리딘-5-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L24)
Figure 112013019055514-pct00033
2-메톡시-5-(1-메틸인돌-3-일)카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L25)
Figure 112013019055514-pct00034
5-(인돌-3-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L26)
Figure 112013019055514-pct00035
2-메톡시-5-(1-메틸인다졸-3-일)카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L27)
Figure 112013019055514-pct00036
5-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)-N-메틸아미드 (L28)
Figure 112013019055514-pct00037
5-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-에톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L29)
Figure 112013019055514-pct00038
5-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-히드록시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L30)
Figure 112013019055514-pct00039
5-(벤조[c]이속사졸-3-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L31)
Figure 112013019055514-pct00040
5-(벤조[c]푸란-1-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L32)
Figure 112013019055514-pct00041
5-(1,5-디메틸피라졸-3-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L33)
Figure 112013019055514-pct00042
2-메톡시-5-[1-메틸-5-(트리플루오로메틸)피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L34)
Figure 112013019055514-pct00043
5-(1-이소퀴놀리닐)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L35)
Figure 112013019055514-pct00044
5-(인다졸-3-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L36)
Figure 112013019055514-pct00045
5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N-(3-아미노프로필)아미드 (L37)
Figure 112013019055514-pct00046
5-(1-에틸인다졸-3-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L38)
Figure 112013019055514-pct00047
5-[N-(1-메틸인다졸-3-일)카바모일]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L39)
Figure 112013019055514-pct00048
(RS)-5-[1-(2,3-디히드록시-1-프로필)인다졸-3-일카복스아미도]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L40)
Figure 112013019055514-pct00049
5-(3H-이미다조[4,5-b]피리딘-2-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L41)
Figure 112013019055514-pct00050
2-메톡시-5-[5-(2-메틸티아졸-4-일)이속사졸-3-일카복스아미도]벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L42)
Figure 112013019055514-pct00051
2-메톡시-5-([1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리딘-3-일카복스아미도)벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L43)
Figure 112013019055514-pct00052
2-메톡시-5-(1-메틸피라졸로[3,4-b]피리딘-3-일카복스아미도)벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L44)
Figure 112013019055514-pct00053
5-[5-(2-푸릴)이속사졸-3-일카복스아미도]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L45)
Figure 112013019055514-pct00054
2-메톡시-5-(피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일카복스아미도)벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L46)
Figure 112013019055514-pct00055
5-(1H-벤즈이미다졸-2-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L47)
Figure 112013019055514-pct00056
5-(이미다조[1,2-b]피리다진-2-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L48)
Figure 112013019055514-pct00057
(S)-2,6-비스[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]헥산산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L49)
Figure 112013019055514-pct00058
(S)-2,6-비스{8-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥타노일아미도}헥산산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L50)
Figure 112013019055514-pct00059
2-메톡시-5-(3-페닐이속사졸-5-일카복스아미도)벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L51)
Figure 112013019055514-pct00060
5-[4-(2-푸릴)피리딘-2-일카복스아미도]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L52)
Figure 112013019055514-pct00061
(S)-2,6-비스{5-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3-옥사펜타노일아미도}헥산산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L53)
Figure 112013019055514-pct00062
2-메톡시-5-[3-(4-메톡시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-5-일카복스아미도]벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L54)
Figure 112013019055514-pct00063
5-[3-(2-푸릴)-1,2,4-옥사디아졸-5-일카복스아미도]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L55)
Figure 112013019055514-pct00064
2-메톡시-5-(피라졸로[1,5-a]피리미딘-2-일카복스아미도)벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L56)
Figure 112013019055514-pct00065
5-(이미다조[1,2-a]피리딘-2-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L57)
Figure 112013019055514-pct00066
5-[5-(2-푸릴)-1,3,4-옥사디아졸-2-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L58)
Figure 112013019055514-pct00067
5-[1-(2-히드록시에틸)인다졸-3-일카복스아미도]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L59)
Figure 112013019055514-pct00068
8-[2-메톡시-5-(1-메틸인다졸-3-일카복스아미도)페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L60)
Figure 112013019055514-pct00069
8-{8-[2-메톡시-5-(1-메틸인다졸-3-일카복스아미도)페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥타노일아미도}-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L61)
Figure 112013019055514-pct00070
(S)-2,6-비스{8-[5-(이미다조[1,2-b]피리다진-2-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥타노일아미도}헥산산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L62)
Figure 112013019055514-pct00071
5-(이미다조[1,2-a]피리미딘-2-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L63)
Figure 112013019055514-pct00072
(S)-1-아미노프로판-1,3-디카복실산 비스{3-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]프로필}아미드 (L64)
Figure 112013019055514-pct00073
8-{8-{5-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일카복스아미도]-2-메톡시페닐카복스아미도}-3,6-디옥사옥타노일아미도}-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L65)
Figure 112013019055514-pct00074
8-{8-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥타노일아미도}-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L66)
Figure 112013019055514-pct00075
8-{8-{5-[5-(2-푸릴)-1,3,4-옥사디아졸-2-일카복스아미도]-2-메톡시페닐카복스아미도}-3,6-디옥사옥타노일아미도}-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L67)
Figure 112013019055514-pct00076
8-{8-{2-메톡시-5-[5-(2-메틸티아졸-4-일)이속사졸-3-일카복스아미도]페닐카복스아미도}-3,6-디옥사옥타노일아미도}-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L68)
Figure 112013019055514-pct00077
N-(8-아미노-3,6-디옥사옥틸)-N'-{8-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥틸}우레아 (L69)
Figure 112013019055514-pct00078
이소프탈산 N-(3-아미노프로필)-N'-[5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드 (L70)
Figure 112013019055514-pct00079
이소프탈산 N-(3-아미노프로필)-N'-(1-메틸인다졸-3-일)아미드 (L71)
Figure 112013019055514-pct00080
이소프탈산 N-(3-아미노프로필)-N'-(벤조티아졸-2-일)아미드 (L72)
Figure 112013019055514-pct00081
이소프탈산 N-(3-아미노프로필)-N'-(4-페닐티아졸-2-일)아미드 (L73)
Figure 112013019055514-pct00082
이소프탈산 N-(3-아미노프로필)-N'-(5-페닐티아졸-2-일)아미드 (L74)
Figure 112013019055514-pct00083
5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 [3-(6-아미노헥사노일아미도)-1-프로필]아미드 (L75)
Figure 112013019055514-pct00084
6-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]헥산산 (8-아미노-3,6-디옥사-1-옥틸)아미드 (L76)
Figure 112013019055514-pct00085
8-[5-(이미다조-[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L77)
Figure 112013019055514-pct00086
8-[5-(이미다조-[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥탄산 (6-아미노-1-헥실)아미드 (L78)
Figure 112013019055514-pct00087
리간드 (II)의 합성은 예를 들어 불용성 지지체(이는 또한 수지로서 알려짐, 예컨대 폴리스티렌 수지)상에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 스페이서 기, 예컨대 Fmoc 보호된 아미노산이 아미드 형성에 의해 부착될 수 있는 반응성 기, 예컨대 아미노 기를 함유한 원하는 링커로 예비-로딩된 불용성 지지체상에서 수행될 수 있다. 스페이서 기의 탈보호 이후에, 분자의 남아있는 부분은 적절한 결합 형성을 야기하는 임의의 반응에 의해, 필요한 경우 추가 합성 단계(예컨대 친핵성 이동 반응)에 의해 부착된다. 마지막으로, 스페이서 기(링커 모이어티(linker moiety))를 함유하는 리간드가 당업자에게 알려진 적절한 분할 프로토콜에 의해 상기 불용성 지지체/수지로부터 방출되고, 당업자에게 또한 알려진 크로마토그래피 방법에 의해 정제된다.
적합한 고체상(solid-phase) 합성 프로토콜이 특정 리간드에 적용될 수 없어야 한다면, 합성은 선택적으로 용액 중에서 수행될 수 있다. 통상적으로, 상기 용액상 합성은 리간드 전구체와 적합한 스페이서 기 사이의 컨쥬게이션 반응(예컨대 아미드 형성) 및 리간드 자체의 어셈블리에 필요한 합성 단계들로 구성된다. 일부 경우에, 보호기들이 부작용들을 방지하기 위해 요구된다.
"항체"라는 용어는 면역글로불린을 의미하며, 여기에는 천연적이거나 전체적으로 또는 부분적으로 합성 제조된 것이 포함되며, 또한 특이적 결합능을 유지하는 이의 모든 단편들과 유도체들이 포함된다. 전형적인 단편들은 Fc, Fab, 중쇄 및 경쇄이다. 상기 용어에는 또한 면역글로불린 결합 도메인에 대해 상동성이거나 또는 매우 상동성인(예컨대 아미노산 서열을 비교할 때 95% 이상의 동일성을 갖는 것) 결합 도메인을 갖는 임의의 폴리펩티드가 포함된다. 이러한 폴리펩티드들은 천연원으로부터 유래되거나, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성 제조될 수 있다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, 인간 또는 비인간 기원일 수 있거나, 또는 인간 Fc 부분이 뮤린 Fab 단편에 융합되거나(ximab으로 끝나는 치료적 항체들, 예컨대 리툭시마브) 또는 인간 및 뮤린 서열을 포함하는 Fab 단편에 융합되거나(zumab로 끝나는 치료적 항체들, 예컨대 베바시주마브) 또는 상이한 Fab 단편들에 연결된(이특이적 항체들) 키메라 단백질일 수 있다. 항체는 임의의 면역글로불린 군의 구성원, 바람직하게는 IgG, 인간 항체의 경우에 더 바람직하게는 IgG1, IgG2 및 IgG4일 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 항체는 Fc 단편 또는 도메인을 포함하는데, 그 이유는 본 발명에 따른 리간드가 항체의 Fc 부분에 결합하는 것으로 여겨지기 때문이다. 따라서, 본 발명의 항체는 가장 바람직하게는 면역글로불린 군, 바람직하게는 IgG, 더 바람직하게는 인간 IgG 또는 인간 기원의 폴리클로날 또는 모노클로날 IgG, 특히 IgG1, IgG2 and IgG4의 Fc 단편 또는 도메인을 함유하는 항체이다.
"Fc 융합 단백질"이라는 용어는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 도메인과 Fc 단편의 임의의 조합을 나타낸다. Fc 융합 단백질의 예에는 가용성 수용체 도메인과 인간 IgG1 Fc 도메인의 키메라(cept로 끝나는 치료적 단백질들), 예컨대 에타네르셉트(2개의 종양 괴사 인자 수용체 도메인들이 조합된 인간 IgG1 Fc) 또는 릴로나셉트(인터루킨-1-수용체 도메인과 융합된 인간 IgG1)이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. Fc 융합 단백질은 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Fc 융합 단백질은 Fc 단편을 적절한 단백질 또는 단백질 도메인에 커플링함으로써 화학적으로 또는 효소적으로 제조될 수 있거나, 또는 Fc 및 단백질/단백질 도메인 서열을 인코딩하는 유전자로부터 재조합 제조될 수 있다. 선택적으로, Fc 융합 단백질은 전체적으로 또는 부분적으로 합성 제조될 수 있다. Fc 융합 단백질은 또한 임의적으로 다분자 복합체일 수 있다. 기능적 Fc 융합 단백질은 통상적으로 적어도 약 50개의 아미노산들을 포함할 것이며, 더 통상적으로는 적어도 약 200개의 아미노산들을 포함할 것이다.
본 발명은 식 (I)의 친화성 리간드를 이용하여 복합 혼합물, 예컨대 인간 또는 동물 기원의 발효 상청액 또는 혈장으로부터 항체 또는 Fc 융합 단백질의 친화성 정제, 바람직하게는 친화성 크로마토그래피에 의한 정제에 관한 것이며, 본 명세서의 다른 부분에서 개시되는 바와 같이 이의 바람직한 구현예들에 관한 것이다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 친화성 정제, 바람직하게는 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질, 바람직하게는 면역글로불린 또는 Fc 융합 단백질을 정제하는 방법을 포함한다. 본 발명에 따른 친화성 리간드는 항체의 Fc 영역에 결합한다.
베바시주마브(Avastin®, Genentech/Roche)는 인간화 모노클로날 항체이다. 이는 표적화에 의해 신혈관의 형성을 방지하고, 신혈관 형성(angiogenesis)을 자극하는 단백질 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF-A)의 기능을 억제함으로써, 종양 성장을 중단시킨다.
토실리주마브(RoActemra®, Genentech/Roche)는 인간화 모노클로날 항체이다. 이는 인터루킨-6 수용체에 대항하는 것이며, 전염증성 시토킨 인터루킨-6의 작용을 차단한다. 이는 류마티스 관절염의 치료에 승인된 것이다.
팔리비주마브(Synagis®, Abbott)는 호흡기 합포체 바이러스(RSV) F-단백질의 A-에피토프에 대항하는 인간화 모노클로날 항체이다. 이는 RSV 감염의 예방에 사용된다.
폴리클로날 인간 및 토끼 IgG는 Fc 부분을 통한 면역글로불린의 친화성 정제를 위한 개시된 리간드의 일반적인 적용가능성을 입증하기 위해 조사되었다.
본 발명을 실시할 때, 일반식 (I)에 따른 리간드는 적절한 지지체 물질의 지지체 매트릭스에 부착되며, 이에 따라 단백질 분리를 위한 리간드-치환된 매트릭스, 통상적으로 친화성 정제, 바람직하게는 친화성 크로마토그래피를 위한 매트릭스(이는 또한 본 명세서에서 친화성 매트릭스라고 언급됨)가 생성된다. 일반식의 리간드는 스페이서 -Sp-를 임의적으로 포함하는, L을 통해 지지체 매트릭스에 부착된다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에서 이전에 기재된 바와 같이 지지체 물질과 하나 이상의 리간드를 포함하며, 여기서 리간드는 L을 통해 부착되는, 단백질 분리를 위한 리간드-치환된 매트릭스(친화성 매트릭스)를 포함한다.
지지체 매트릭스(M으로 표기될 수 있음)는 당업자에게 알려진 임의의 적절한 지지체 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 가용성 또는 불용성이거나, 입자성 또는 비입자성이거나, 또는 섬유 및 멤브레인을 비롯한 모노리식 구조, 다공성 또는 비다공성일 수 있다. 이는 접촉 용액 중 용질로부터 본 발명의 리간드를 분리하는 통상의 수단을 제공한다. 지지체 매트릭스의 예에는 탄수화물 및 가교결합된 탄수화물 매트릭스, 예컨대 아가로스, 세파로스, 세파덱스, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 알기네이트 또는 카라기난; 합성 폴리머 매트릭스, 예컨대 폴리스티렌, 스티렌-디비닐벤젠 코폴리머, 폴리아크릴레이트, PEG 폴리아크릴레이트 코폴리머, 폴리메타크릴레이트, 예컨대 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트), 폴리비닐 알코올, 폴리아미드 또는 퍼플루오로카본; 무기 매트릭스, 예컨대 유리, 실리카 또는 금속 산화물; 및 이의 복합물이 포함된다.
친화성 매트릭스는 적절한 지지체 물질의 지지체 매트릭스를 제공하고, 여기에 식 (I)의 리간드를 부착함으로써 제조된다. 지지체 물질에 리간드 (I)를 부착하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
또한, 본 발명은 단백질의 친화성 정제, 바람직하게는 친화성 크로마토그래피를 위한 방법에 관한 것이며, 여기서 정제하려는 단백질은 전술한 바와 같이 리간드-치환된 매트릭스와 접촉된다.
"친화성 정제"라는 용어(이는 "친화성 분리"라는 용어와 상호교환적으로 사용됨)는 식 (I)의 리간드에 의한 단백질의 분자적 인식을 수반하는 임의의 분리 기법을 나타낸다. 상기 리간드는 나중에 리간드-항체 복합체의 분리를 촉진시키는 고체 지지체상에 고정될 수 있다. 분리 기법에는 충전된(packed) 컬럼, 모노리식(monolithic) 구조 또는 멤브레인에서의 친화성 크로마토그래피가 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 용어에는 배치-방식 흡착 또는 친화성 침전이 포함된다.
풍미와는 독립적으로, 정제 기법은 리간드가 조 상태의 항체와 접촉되는 초기 인식 시기에 의해 구성된다. 제2시기에서, 불순물들이 리간드-항체 복합체로부터 분리되거나(예컨대 컬럼 크로마토그래피) 또는 리간드-항체 복합체가 불순물로부터 분리된다(예컨대 친화성 침전). 제3단계에서, pH, 이온강도의 변화와 같은 화학적 및/또는 물리적 조건의 변형에 의해, 및/또는 유기 용매, 세제 또는 카오트로프(chaotrope)와 같은 개질제의 첨가에 의해, 항체가 리간드-항체 복합물로부터 방출된다.
본 발명은 하기 실시예들에 의해 설명될 것이며, 실시예들이 본 발명을 제한하는 것으로 고려되어서는 안 된다.
본 명세서에서 인용된 문헌들:
1. A.Cecilia, A.Roque, C.R. Lowe, M.A. Taipa: Antibodies and Genetically Engineered Related Molecules: Production and Purification, Biotechnol. Prog. 2004, 20, 639-654
2. K.L.Carson: Flexibility-the guiding principle for antibody manufacturing, Nature Biotechnology, 2005, 23, 1054-1058; S.Hober, K.Nord, M. Linhult: Protein A chromatography for antibody purification, J. Chromatogr. B. 2007, 848, 40-47
3. T.Arakawa, Y.Kita, H.Sato, D. Ejima, Protein Expression and Purification. 2009, 63, 158-163
4. S. Ghose, B. Hubbard, S.M. Cramer, Journal of Chromatography A, 2006, 1122, 144-152
재료 및 방법
달리 언급되지 않는다면, 모든 화학물질과 용매들은 실시예 2를 제외하고 분석용 품위(analytical grade)이다. 실시예 2에서 사용된 시약들은 입자 요건과 유용성에 의존하여 분석용 품위에 대해 예비적이다.
평균 공극 크기가 0.45　μm인 친수성 멤브레인 필터가 구비된 96 및 384-웰 필터 플레이트는 Pall GmbH(Dreieich/Germany)에서 구입되었다. 평균 공극 크기가 10　μm인 폴리에틸렌으로 제조된 탑 프릿(Top frit)은 Porex(Bautzen/Germany)에서 제공되었다. 분획 수집 및 분석 어세이를 위한 일반 목적 마이크로티터플레이트는 Greiner Bio One GmbH(Frickenhausen/Germany)에서 주문받았다. 분석 어세이는 BMG Labtech GmbH(Offenburg/Germany)의 Fluostar Galaxy 플레이트 판독기를 이용하여 판독되었다.
항체의 컬럼 크로마토그래피 및 항체 단편의 정제는 Waters HPLC system(Waters GmbH, Eschborn/Germany)에서 수행되었다. Omnifit 컬럼 하우징(Diba Industries Ltd, Cambridge/United Kingdom)은 컬럼의 패킹(packing)을 위해 사용되었다. NHS-활성화 세파로스 4 FF, rProtein A 세파로스 FF 및 슈퍼덱스 70 크로마토그래피 매질은 GE Healthcare(Uppsala/Sweden)에서 구입되었다. 마브소르벤트 A2P HF는 Prometic Life Sciences(Cambridge/United Kingdom)에서 구입되었으며, MEP Hypercel은 Pall Corporation(Port Washington NY, USA)에서 구입되었다.
리간드의 분석 크로마토그래피는 다이오드 어레이 검출기 및 싱글-쿼드(single-quad) 질량분석기를 포함한 Shimadzu HPLC 시스템(Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg/Germany)에서 수행되었다. 모놀리식(monolithic) C18 역상 컬럼은 Merck KGaA(Darmstadt/Germany)에서 구입되었다. 분석에 사용되는 용매는 질량분석기 등급이었다.
본 발명에서 사용되는 항체들은 베바시주마브(Avastin, F. Hoffmann-La Roche, Switzerland), 토실리주마브(RoActemra, F. Hoffmann-La Roche, Switzerland), 팔리비주마브(Synagis, Abbott, USA), 인간 혈청의 폴리-IgG(Sigma-Aldrich, USA) 및 토끼 혈청의 폴리-IgG(Sigma-Aldrich, USA)였다. 항체 단편을 제조하기 위한 고정 파파인(immobilized papain)은 Thermo Scientific(Bonn/Germany)에서 구입되었다.
단백질 A 크로마토그래피의 플로우스루(flowthrough)(숙주 세포 단백질로서 언급됨)는 무혈청 배지에서 항체-생성 CHO 세포 배양물의 상청액으로부터 유래되었다.
브래드포드(Bradford) 분석을 위한 쿠마시 브릴리안트 블루 염료 시약은 Thermo Scientific(Bonn/Germany)에서 구입되었다.
실시예 1
화학적 마이크로어레이의 SPR 스크리닝
Graffinity사에서는 골드칩(gold chip)에 고정된 수천개의 소분자들을 포함하는 고밀도 화학적 마이크로어레이를 개발하였다. 상기 어레이는 고밀도 핀툴 스폿팅(pintool spotting)과 조합하여 말레이미드-티올 커플링 화학제를 사용하여 구성된다. 상기 구성을 위해, 어레이 당 9,216개까지의 센서 필드(sensor field)를 한정하기 위하여 유리 플레이트는 포토리소그래프 방법에 의해 마이크로구조화(microstructure)된다. 그 후에 도포되는 금 코팅은 SPR 효과를 위한 기반을 제공하며, 2개의 다른 티올의 바이너리(binary) 혼합된 자가 조립 단층(SAM: self assembled monolayer)의 형성을 가능하게 한다. 티올 중 하나는 핀툴 스폿팅 동안 티올-태그된 어레이 화합물이 커플링할 수 있는 반응성 말레이미드 모이어티를 표출한다. 생성된 마이크로어레이는 9,216개의 센서 필드를 포함하며, 이들 각각은 한정되고 품질 제어된(defined and quality controlled) 어레이 화합물의 다수 복제본들을 함유한다.
표면 플라스몬은 적절한 파장 및 입사각의 편광에 의해 공명하여 여기될 수 있는 금속 표면에서 전자의 집단 진동(collective oscillation)이다. 표면 플라스몬 공명 조건하에서, 골드칩으로부터 반사된 빛의 세기는 급격한 감쇠를 나타낸다(SPR 최소값). 이러한 반사도 최소값의 각 및 파장 위치는 금속 표면에 인접한 매질의 굴절률에 크게 의존한다. 따라서, 금속 표면에 가까이 근접하여 로컬(local) 굴절률을 변화시키는 과정들(예컨대, 고정된 리간드에 결합하는 항체)이 민감하게 모니터링될 수 있다. SPR 검출을 위해, 화학적 마이크로어레이는 최적화된 스크리닝 조건하에서 표적 단백질과 인큐베이션된다. 만일 고정된 단편에 표적이 결합한다면, 파장 의존 SPR 최소값에서의 시프트(SPR 시프트(shift)라고 언급됨)는 버퍼 대조군(buffer control)과 관련하여 발생하고, 이에 따라 단백질-리간드 상호작용을 나타낸다. SPR 이미징 접근법은 고정된 각에서 전체 마이크로어레이 센서 영역을 비추는 평행 빛의 확장된 빔을 이용한다. 그 후, 반사된 빛은 CCD 카메라에 의해 캡쳐된다. SPR 공명 조건들을 커버하는 다양한 파장에 걸쳐 스캐닝하면서, 반사 이미지는 단계적으로 기록된다. 자동화된 스폿 발견 루틴 및 이후의 획득한 사진들의 그레이-스케일 분석은 칩 당 9,216개의 모든 센서 필드의 SPR 공명 커브를 동시에 생성한다.
SPR에 의한 항체 및 이의 단편의 스크리닝
상기 플랫폼에 의해, 고속(high-throughout fashion)으로 110,000개의 소분자들의 고정 화합물 라이브러리(Graffinity사)에 대한 단백질, 항체 및 이의 단편의 스크리닝이 가능해졌다. 각각의 표적들에 대해, SPR 스크리닝 조건들은 전체 라이브러리에 대한 표적들의 스크리닝 이전에 개별적으로 최적화되었다. 이와 같이 최적화된 스크리닝 파라미터들 중에서, a) 적절한 세제(detergent)를 포함하는 스크리닝 버퍼의 조성물, b) 용액 중 항체 또는 단백질 표적의 농도, 및 c) 칩 표면에서 고정된 리간드의 표면 밀도가 있다. 문헌 (1) [Neumann et al.]에는 적용되는 스크리닝된 표적들과 대응하는 스크리닝 조건들에 대해 요약되어 있다. 통틀어 4개의 다른 전장길이 항체들이 스크리닝되고 비교되었다. 또한, 2개 항체의 Fc 및 Fab 단편이 단백질가수분해 소화에 의해 획득되었으며, 어레이 스크리닝도 수행되었다. 항체 특이적 리간드를 식별하기 위하여, 스크리닝 활동에는 대조군으로서 CHO 세포주의 무-항체 숙주 세포 단백질(HCP)도 포함되었다.
마이크로어레이 스크리닝 활동의 실험 결과들은 사내용으로 개발된 소프트웨어 루틴을 이용한 수동 히트 선택(manual hit selection)에 의해 분석되었을 뿐만 아니라, 시판되는 데이터 마이닝 툴(data mining tool)에 의한 심층 데이터 분석에 의해 분석되었다. 상기 분석에 의해 도출된 다수의 히트 시리즈들은 항체 및 이의 Fc 단편에 대해 명확한 결합을 보여주었지만, HCP 대조군에 대해서는 단지 무시할 정도의 결합을 약하게 보여주었다. 이러한 일차 히트 시리즈는 이차 어세이에서 히트 확인을 위해 사용되었으며, 일차 히트 주변에서 집중된 라이브러리의 합성을 위한 출발점으로서 사용될 수 있엇다. 예를 들어, Fc 특이적 리간드 L1은 전장길이 베바시주마브 및 이의 Fc 단편에 대한 뚜렷한 결합을 보여주었지만, 베바시주마브 Fab 단편에 대해서는 단지 마이너(minor) 결합을 보여주었다. 더욱이, 이는 명확하게 다른 전장길이 항체들 항 RhD IgG, 토실리주마브 및 팔리비주마브를 결합하였다.
실시예 2
리간드의 합성
일반적 방법 A: 5-아릴카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드의 합성 (L1, L2, L3, L6, L8, L7, L15, L16, L5, L11, L20, L27, L25, L4, L26, L31, L32, L33, L34, L35, L36, L42, L44, L45, L46, L47, L48, L51, L56, L57, L63)
N-Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(0.2-0.5 mmol) 및 HOAt(카복실산에 대해 1 당량)를 DMF, NMP, DMF/DMSO 또는 NMP/DMSO 혼합물(1-3 mL) 중에 용해시키고, DIC(카복실산에 대해 1 당량)로 처리하였다. 2-5분 동안 교반한 후에, 상기 혼합물을 트리틸-폴리스티렌 수지 또는 2-클로로트리틸 폴리스티렌 수지에 연결된 1,3-디아미노프로판 0.1-0.15 mmol에 첨가하였다. 상기 혼합물을 수시간 동안 또는 밤새 동안 흔들었다. 다음으로, 상기 수지를 세척하였으며(DMF 또는 DMF, 디클로로메탄 또는 DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 용매를 여러 번), 15-30분 동안 DMF(1-5 mL)에서 피페리딘 25%로 처리하였다. 그 후, 상기 수지를 철저하게 세척하였으며(DMF, 디클로로메탄 또는 DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 용매를 여러 번), 공기중에서, 질소 스트림에서, 또는 고진공에서 건조시켰다.
아릴카복실산(0.2-0.5 mmol) 및 HOAt(카복실산에 대해 1 당량)를 DMF, NMP, DMF/DMSO 또는 NMP/DMSO 혼합물(1-3 mL) 중에 용해시키고, DIC(카복실산에 대해 1 당량)로 처리하였다. 2-5분 동안 교반한 후에, 상기 혼합물을 수지에 첨가하고, 수시간 동안 또는 밤새 동안 흔들었다. 이어서 세척한 후에(DMF, 디클로로메탄 또는 DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 용매를 여러 번), 표적 화합물을 적합한 분해(cleavage) 혼합물(디클로로메탄, TFA, 트리에틸실란, 트리틸 수지에 대해 85:10:5, 2-클로로트리틸 수지에 대해 45:45:10)로 처리하여 지지체로부터 분해하였다. 통상적으로, 상기 분해 단계는 한 번 반복하였으며, 그 후 디클로로메탄으로 수지를 세정(rinsing)하였다. 용매를 증발시킨 후에, 원 잔여물(crude residue)을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하였다.
아미드 커플링 화학제의 높은 강건성(robustness)과 관련하여, 다른 커플링 프로토콜이 비슷하거나 동일한 결과들과 함께 적용될 수 있다. 특히, TBTU 또는 HATU 커플링(카복실산에 대해 1 당량; 부가적으로 2 당량의 DIPEA가 첨가되어야 함)은 더 신속하게 진행하는 DIC/HOAt 커플링에 대해 신뢰할 수 있는 대안을 나타낸다(전형적인 반응 시간: 30분 내지 3시간); 그러나 일부 카복실산들에 대해, 특히 인돌 또는 (벤조)피라졸과 같이 자유(free) 아릴 NH를 함유한 카복실산들에 대해, 염기 조건하에서의 커플링은 원하지 않는 부산물들을 초래할 수 있다.
5-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L1)
Figure 112013019055514-pct00088
일반적 방법 A에 따라 5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 398 (M+1).
5-[5-(4-브로모-2-티에닐)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L2)
Figure 112013019055514-pct00089
일반적 방법 A에 따라 5-(4-브로모-2-티에닐)-1-메틸피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 493, 495 (M+1).
5-[5-(2,5-디메틸-3-티에닐)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L3)
Figure 112013019055514-pct00090
일반적 방법 A에 따라 5-(2,5-디메틸-3-티에닐)-1-메틸피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 442 (M+1).
2-메톡시-5-[1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L6)
Figure 112013019055514-pct00091
일반적 방법 A에 따라 1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 414 (M+1).
2-메톡시-5-[1-메틸-5-(3-티에닐)피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L8)
Figure 112013019055514-pct00092
일반적 방법 A에 따라 1-메틸-5-(3-티에닐)피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 414 (M+1).
5-[5-(3-클로로페닐)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L7)
Figure 112013019055514-pct00093
일반적 방법 A에 따라 5-(3-클로로페닐)-1-메틸피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 442, 444 (M+1).
2-메톡시-5-(1-메틸-5-페닐피라졸-3-일)카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L15)
Figure 112013019055514-pct00094
일반적 방법 A에 따라 1-메틸-5-페닐피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 408 (M+1).
2-메톡시-5-[5-(1-메틸-2-피롤릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L16)
Figure 112013019055514-pct00095
일반적 방법 A에 따라 5-(1-메틸-2-피롤릴)-1-메틸피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 411 (M+1).
2-메톡시-5-[3-(2-티에닐)피리딘-5-일]카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L5)
Figure 112013019055514-pct00096
일반적 방법 A에 따라 3-(2-티에닐)피리딘-5-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 411 (M+1).
2-메톡시-5-(3-페닐피리딘-5-일)카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L11)
Figure 112013019055514-pct00097
일반적 방법 A에 따라 3-페닐피리딘-5-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 405 (M+1).
5-[5-(2-푸릴)피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L20)
Figure 112013019055514-pct00098
일반적 방법 A에 따라 5-(2-푸릴)피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 384 (M+1).
2-메톡시-5-(1-메틸인다졸-3-일)카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L27)
Figure 112013019055514-pct00099
일반적 방법 A에 따라 1-메틸인다졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 382 (M+1).
2-메톡시-5-(1-메틸인돌-3-일)카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L25)
Figure 112013019055514-pct00100
일반적 방법 A에 따라 1-메틸인돌-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 381 (M+1).
5-(5-클로로-1 H -인다졸-3-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L4)
Figure 112013019055514-pct00101
일반적 방법 A에 따라 5-클로로-1H-인다졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 402, 404 (M+1).
5-(인돌-3-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L26)
Figure 112013019055514-pct00102
일반적 방법 A에 따라 인돌-3-카복실산으로부터 제조됨. 인돌-3-카복실산은 HOBt(1 당량) 및 DIC(카복실산에 대해 1 당량)에 의한 활성화에 의해 커플링되었음; 커플링 시간: 1시간. ESI-MS: 367 (M+1).
5-(벤조[c]이속사졸-3-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L31)
Figure 112013019055514-pct00103
일반적 방법 A에 따라 벤조[c]이속사졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 369 (M+1).
5-(벤조[c]푸란-1-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L32)
Figure 112013019055514-pct00104
일반적 방법 A에 따라 벤조[c]푸란-1-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 368 (M+1).
5-(1,5-디메틸피라졸-3-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L33)
Figure 112013019055514-pct00105
일반적 방법 A에 따라 1,5-디메틸피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 346 (M+1).
2-메톡시-5-[1-메틸-5-(트리플루오로메틸)피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L34)
Figure 112013019055514-pct00106
일반적 방법 A에 따라 1-메틸-5-(트리플루오로메틸)피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 400 (M+1).
5-(1-이소퀴놀리닐)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L35)
Figure 112013019055514-pct00107
일반적 방법 A에 따라 이소퀴놀린-1-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 379 (M+1).
5-(인다졸-3-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L36)
Figure 112013019055514-pct00108
일반적 방법 A에 따라 인다졸-3-카복실산으로부터 제조됨. 인다졸-3-카복실산은 HOBt(1 당량) 및 DIC(카복실산에 대해 1 당량)에 의한 활성화에 의해 커플링되었음; 커플링 시간: 1시간. ESI-MS: 368 (M+1).
2-메톡시-5-[5-(2-메틸티아졸-4-일)이속사졸-3-일카복스아미도]벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L42)
Figure 112013019055514-pct00109
일반적 방법 A에 따라 5-(2-메틸티아졸-4-일)이속사졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 416 (M+1).
2-메톡시-5-(1-메틸피라졸로[3,4-b]피리딘-3-일카복스아미도)벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L44)
Figure 112013019055514-pct00110
일반적 방법 A에 따라 1-메틸피라졸로[3,4-b]피리딘-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 383 (M+1).
5-[5-(2-푸릴)이속사졸-3-일카복스아미도]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L45)
Figure 112013019055514-pct00111
일반적 방법 A에 따라 5-(2-푸릴)이속사졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 385 (M+1).
2-메톡시-5-(피라졸로[1,5-a]피리딘-2-일카복스아미도)벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L46)
Figure 112013019055514-pct00112
일반적 방법 A에 따라 피라졸로[1,5-a]피리딘-2-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 368 (M+1).
5-(1 H -벤즈이미다졸-2-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L47)
Figure 112013019055514-pct00113
일반적 방법 A에 따라 1H-벤즈이미다졸-2-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 368 (M+1).
5-(이미다조[1,2-b]피리다진-2-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L48)
Figure 112013019055514-pct00114
일반적 방법 A에 따라 이미다조[1,2-b]피리다진-2-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 369 (M+1).
2-메톡시-5-(3-페닐이속사졸-5-일카복스아미도)벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L51)
Figure 112013019055514-pct00115
일반적 방법 A에 따라 3-페닐이속사졸-5-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 395 (M+1).
2-메톡시-5-(피라졸로[1,5-a]피리미딘-2-일카복스아미도)벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L56)
Figure 112013019055514-pct00116
일반적 방법 A에 따라 피라졸로[1,5-a]피리미딘-2-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 369 (M+1).
5-(이미다조[1,2-a]피리딘-2-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L57)
Figure 112013019055514-pct00117
일반적 방법 A에 따라 이미다조[1,2-a]피리딘-2-카복실산 히드로브로마이드로부터 제조됨. 카복실산 히드로브로마이드가 HATU/DIPEA를 이용하여 커플링되었을 때 부가적 1 당량의 DIPEA가 첨가되었음. ESI-MS: 368 (M+1).
5-(이미다조[1,2-a]피리미딘-2-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L63)
Figure 112013019055514-pct00118
일반적 방법 A에 따라 이미다조[1,2-a]피리미딘-2-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 369 (M+1).
일반적 방법 B: Suzuki 커플링에 의한 5-[3-(아릴 또는 시클로프로필)피리딘-5-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드의 합성 (L12, L13, L14, L22, L23)
0.1 mmol의 1,3-디아미노프로판-트리틸-폴리스티렌 수지에 대해, N-Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산 및 5-브로모피리딘-3-카복실산이 일반적 방법 A에 따라 커플링되었다. 브로모피리딘 카복실릭 아미드로 로딩된 생성된 수지를 철저하게 건조시키고, 유리 바이알(glass vial)로 이동시켰다. 세슘 카보네이트 또는 포타슘 카보네이트(0.3 mmol) 및 각각의 보론산(1 mmol)을 첨가한 후에, 무수(absolute) DMF(1 mL)을 첨가하였으며, 혼합물을 아르곤으로 광범위하게 플러싱(flushing)하였다. 그 후, 테트라키스-트리페닐포스핀팔라듐(0)(10 μmol)을 첨가하였으며, 혼합물을 다시 아르곤으로 플러싱하고, 바이알을 타이트하게 밀봉하였다. 상기 혼합물을 100 ℃로 가열하고, 밤새 흔들었다. 그 후, 수지를 철저하게 세척하였으며(DMF, 디클로로메탄, 각 용매를 여러 번), 작은 샘플이 분해되었다(조건들, 하기 참조). LCMS가 불완전한 전환을 나타낸 경우, 커플링 단계를 반복하거나 또는 더 높은 온도에서 수행하였다. 그렇지 않으면, 수지를 디클로로메탄-TFA-트리에틸실란 85:10:5로 처리하였으며(이분법(twofold cleavage)), 그 후 디클로로메탄으로 수지를 세정하였다. 증발건고(evaporation to dryness) 이후에, 잔여물을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하였다.
2-메톡시-5-{3-[4-(트리플루오로메틸)페닐]피리딘-5-일}카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L12)
Figure 112013019055514-pct00119
일반적 방법 B에 따라 4-(트리플루오로메틸)페닐보론산으로부터 제조됨. ESI-MS: 473 (M+1).
5-[3-(2-푸릴)피리딘-5-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L13)
Figure 112013019055514-pct00120
일반적 방법 B에 따라 2-푸릴보론산으로부터 제조됨. ESI-MS: 395 (M+1).
5-[3-(2-벤조티에닐)피리딘-5-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L14)
Figure 112013019055514-pct00121
일반적 방법 B에 따라 2-벤조티에닐보론산으로부터 제조됨. ESI-MS: 461 (M+1).
5-[3-(3-푸릴)피리딘-5-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L22)
Figure 112013019055514-pct00122
일반적 방법 B에 따라 3-푸릴보론산으로부터 제조됨. ESI-MS: 395 (M+1).
5-(3-시클로프로필피리딘-5-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L23)
Figure 112013019055514-pct00123
일반적 방법 B에 따라 시클로프로필보론산으로부터 제조됨. ESI-MS: 369 (M+1).
5-(3-에티닐피리딘-5-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L24)
Figure 112013019055514-pct00124
0.1 mmol의 1,3-디아미노프로판-트리틸-폴리스티렌 수지에 대해, N-Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산 및 5-브로모피리딘-3-카복실산이 일반적 방법 A에 따라 커플링되었다. 브로모피리딘 카복실릭 아미드로 로딩된 생성된 수지를 철저하게 건조시키고, 유리 바이알로 이동시켰다. 구리(I) 클로라이드(40 μmol), 트리페닐포스핀(40 μmol), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 디클로라이드(10 μmol) 및 THF(1 mL)를 첨가하였으며, 혼합물을 아르곤으로 플러싱하였다. 그 후, 트리메틸실릴아세틸렌(1 mmol) 및 트리에틸아민(0.5 mL)을 첨가하였으며, 혼합물을 다시 아르곤으로 플러싱하고, 이어서 바이알을 타이트하게 밀봉하고 50 ℃에서 밤새 흔들었다. 그 후, 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 철저하게 세척하였다(각 용매를 여러 번). TMS 탈보호를 위해, THF(1 mL) 및 물(50 μL)을 첨가하였으며, 이어서 테트라부틸암모늄 플루오라이드(THF 중 1 M 용액, 0.5 mL)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 이어서 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 용매를 여러 번). 수지로부터 표적 화합물의 분해는 디클로로메탄-TFA-트리에틸실란 85:10:5로 처리하고(이분법(twofold cleavage)), 이어서 디클로로메탄으로 세정하는 것에 의해 효과적이었다. 증발건고 이후에, 잔여물을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 353 (M+1).
일반적 방법 C: 5-[5-(2-티에닐 또는 2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도아릴 카복실산 N -(3-아미노프로필)아미드의 합성 (L19, L9, L10, L17, L18)
각각의 (N-Fmoc 보호된) 아미노아릴카복실산(0.2-0.5 mmol) 및 HOAt(카복실산에 대해 1 당량)를 DMF, NMP, DMF/DMSO 또는 NMP/DMSO 혼합물(1-3 mL) 중에 용해시키고, DIC(카복실산에 대해 1 당량)로 처리하였다. 2-5분 동안 교반한 후에, 상기 혼합물을 트리틸-폴리스티렌 수지 또는 2-클로로트리틸 폴리스티렌 수지에 연결된 1,3-디아미노프로판 0.1-0.15 mmol에 첨가하였다. 상기 혼합물을 수시간 동안 또는 밤새 동안 흔들었다. 다음으로, 상기 수지를 세척하였으며(DMF 또는 DMF, 디클로로메탄 또는 DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 용매를 여러 번), 15-30분 동안 DMF(1-5 mL)에서 피페리딘 25%로 처리하였다. 그 후, 상기 수지를 철저하게 세척하였으며(DMF, 디클로로메탄 또는 DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 용매를 여러 번), 공기중에서, 질소 스트림에서, 또는 고진공에서 건조시켰다. 1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-카복실산 또는 5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-카복실산(0.2-0.5 mmol) 및 HOAt(카복실산에 대해 1 당량)를 DMF, NMP, DMF/DMSO 또는 NMP/DMSO 혼합물(1-3 mL) 중에 용해시키고, DIC(카복실산에 대해 1 당량)로 처리하였다. 2-5분 동안 교반한 후에, 상기 혼합물을 수지에 첨가하고, 수시간 동안 또는 밤새 동안 흔들었다. 이어서 세척한 후에(DMF, 디클로로메탄 또는 DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 용매를 여러 번), 표적 화합물을 적합한 분해 혼합물(디클로로메탄, TFA, 트리에틸실란, 트리틸 수지에 대해 85:10:5, 2-클로로트리틸 수지에 대해 45:45:10)로 처리하여 지지체로부터 분해하였다. 통상적으로, 상기 분해 단계는 한 번 반복하였으며, 그 후 디클로로메탄으로 수지를 세정하였다. 용매를 증발시킨 후에, 원 잔여물(crude residue)을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하였다.
2-[1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-일]카복스아미도티아졸-4-카복실산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L19)
Figure 112013019055514-pct00125
일반적 방법 C에 따라 N-Fmoc-2-아미노티아졸-4-카복실산 및 1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 391 (M+1).
2-메틸-3-[1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L9)
Figure 112013019055514-pct00126
일반적 방법 C에 따라 N-Fmoc-3-아미노-2-메틸벤조산 및 1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 398 (M+1).
4-메틸-3-[1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L10)
Figure 112013019055514-pct00127
일반적 방법 C에 따라 N-Fmoc-3-아미노-4-메틸벤조산 및 1-메틸-5-(2-티에닐)피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 398 (M+1).
3-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L17)
Figure 112013019055514-pct00128
일반적 방법 C에 따라 N-Fmoc-3-아미노벤조산 및 5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 368 (M+1).
4-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L18)
Figure 112013019055514-pct00129
일반적 방법 C에 따라 N-Fmoc-4-아미노벤조산 및 5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-카복실산으로부터 제조됨. ESI-MS: 368 (M+1).
3-{ N -[5-(2-푸릴)피라졸-3-일]카바모일}벤조산 N'- (3-아미노프로필)아미드 (L21)
Figure 112013019055514-pct00130
1,3-디아미노프로판-트리틸 수지(0.1 mmol)를 디클로로메탄에서 팽창시켰으며, 과량의 DIPEA 및 m-벤젠디카복실릭 디클로라이드로 처리하였다. 수 분 후에, 상기 수지를 디클로로메탄으로 신속하게 세척하고(3회), 즉시 NMP 중 과량의 3-아미노-5-(2-푸릴)피라졸 및 DIPEA로 처리하였다. 분해된 작은 수지 샘플의 LCMS(조건들, 하기 참조)가 완전한 전환을 나타낸 경우, 수지를 세척하고(DMF, 디클로로메탄, 각 용매를 여러 번), 디클로로메탄-TFA-트리에틸실란으로 처리하였다(85:10:5; 2분법, 이어서 디클로로메탄으로 수지를 세정함). 분해 용액을 증발건고시키고, 잔여물을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 354 (M+1).
5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일)카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L37)
Figure 112013019055514-pct00131
1,3-디아미노프로판-트리틸-수지(0.15 mmol)를 NMP에서 예비-팽창시켰다. N-Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(0.2 mmol) 및 HATU(0.2 mmol)를 NMP(1.5 mL) 중에 용해시키고, DIPEA(0.4 mmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 반응 혼합물을 30분 동안 흔들었다. 수지를 DMF로 세척(3회)한 후에, DMF 중 25% 피페리딘을 첨가하였으며, 30분 동안 지속적으로 흔들었다. 다음으로, 상기 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각 용매 3회)으로 철저하게 세척하고, 공기중에서 건조시켰다.
이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산 히드로브로마이드(0.2 mmol) 및 HATU(0.2 mmol)를 NMP(1.5 mL) 중에 용해시키거나 현탁시켰으며, DIPEA(0.8 mmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 밤새 흔들었다. 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각 용매 3회)으로 세척한 후에, 표적 화합물을 디클로로메탄-TFA-트리에틸실란 85:10:5로 처리하고(2분법), 이어서 디클로로메탄으로 세정하는 것에 의해, 수지로부터 분해하였다. 증발건고 이후에, 잔여물을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하였다.
ESI-MS: 374 (M+1).
5-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)- N -메틸아미드 (L28)
Figure 112013019055514-pct00132
2-클로로트리틸 클로라이드 수지(150 μmol)를 NMP에서 예비-팽창시키고, NMP(1.5 mL), 이어서 3-아미노프로판올(1.5 mL)로 처리하였다. 2시간 동안 수지를 흔든 후에, DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각 용매를 여러 번)으로 세척하고, 공기중에서 건조시켰다. 이어서, 디클로로메탄(2 mL) 및 DIPEA(2 mmol)를 첨가하였으며, 그 후 메탄설포닉 클로라이드(1 mmol)를 적하첨가하였다. 수지를 2시간 동안 교반하고, 그 후 디클로로메탄으로 신속하게 세척하고(3회), NMP(1 mL)에서 팽창시켰다. 메틸아민 용액(에탄올 중 8 M, 1 mL)을 첨가한 후에, 수지를 밤새 흔들었으며, 이어서 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄(각 용매를 여러 번)으로 세척하고, 공기중에서 건조시켰다.
N-Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(250 μmol) 및 HOAt(250 μmol)를 NMP(약 1.5 mL) 중에 용해시키고, DIC(250 μmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고 5시간 동안 흔들었다. DMF 및 디클로로메탄(각 용매를 여러 번)으로 세척한 후에, 수지를 DMF 중 25% 피페리딘으로 처리하였다(30분, 그 후 전술한 바와 같이 세척함).
5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-카복실산(250 μmol) 및 HOAt(250 μmol)를 NMP(약 1.5 mL) 중에서 용해시키고, DIC(250 μmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고 밤새 흔들었다. 이어서, 수지를 전술한 바와 같이 세척하고, 표적 화합물을 디클로로메탄-TFA-트리에틸실란 45:45:10으로 처리하고(2분법), 그 후 디클로로메탄으로 세정하는 것에 의해 수지로부터 분해하였다. 증발건고 이후에, 잔여물을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 412 (M+1).
5-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-에톡시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L29)
Figure 112013019055514-pct00133
5-니트로살리실산(0.3 mmol) 및 HOBt(0.3 mmol)를 DMSO(약 1.5 mL) 중에 용해시키고, DIC(0.3 mmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 1,3-디아미노프로판-트리틸 수지(0.15 mmol)에 첨가하고, 1시간 동안 흔들었으며, 그 결과 수지를 DMF, 물, 희석된 소듐 카보네이트 용액, 물, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 용매를 여러 번). 작은 수지 샘플을 벤조일 클로라이드 및 DIPEA로 처리하고, 세척하고, 분해하였으며(조건들, 하기 참조), 생성물을 HPLC-MS에 의해 분석하였으며, 불완전한 로딩을 나타내었다. 따라서, 커플링 단계를 30분 동안 반복하였다. 그 동안 형성된 카바모일-니트로페닐에스테르의 양을 가수분해하기 위하여, 수지를 그 후 5분 동안 THF(1 mL), 메탄올(0.5 mL) 및 수성 NaOH(1 M, 0.5 mL)로 처리하였으며, 황색으로 변한 상청액은 성공적인 에스테르 가수분해를 나타내었다. DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척한 후에(각 용매 3회), DMSO(2 mL), 세슘 카보네이트(1 mmol) 및 에틸 브로마이드(1 mmol)를 첨가하였으며, 수지를 약 2시간 동안 흔들고, 이어서 반응을 밤새 반복하였다(0.2 mL의 물이 카보네이트 염을 용해시키기 위해 첨가되었다). 전환은 여전히 불완전하였기 때문에, 0.5 mL의 에틸 브로마이드 및 물(0.2 mL)을 이용하여 반응을 반복하였으며, 이는 3일 후에 충분한 반응 진행을 가져왔으며, 그 후 수지를 DMF, 물, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 용매를 여러 번).
니트로 기는 NMP(1 mL), 피리딘 (0.5 mL) 및 NMP(1 mL) 중 주석(II) 클로라이드(1 mmol)의 용액의 첨가에 의해 환원되었다. 상기 혼합물을 밤새 흔든 후, 수지를 DMF, 물 및 메탄올로 세척하였으며, 불용성 부산물을 메탄올 중 부유(flotation)에 의해 주의깊게 제거하였다. 디클로로메탄으로 세척한 후에, 수지를 건조시켰다. 5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-카복실산(0.25 mmol) 및 HOAt(0.25 mmol)를 NMP(약 1.5 mL) 중에 용해시키고, DIC(0.25 mmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 밤새 흔들었다. 이어서, 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세척하고(각 용매를 여러 번), 표적 화합물을 디클로로메탄-TFA-트리에틸실란 85:10:5로 처리하고(2분법), 이어서 디클로로메탄으로 세정하는 것에 의해, 수지로부터 분해하였다. 증발건고 이후에, 잔여물을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 412 (M+1).
5-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일]카복스아미도-2-히드록시벤조산 N -(3-아미노프로필)아미드 (L30)
Figure 112013019055514-pct00134
5-니트로살리실산(0.3 mmol) 및 HOBt(0.3 mmol)를 DMSO(약 1.5 mL) 중에 용해시키고, DIC(0.3 mmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 1,3-디아미노프로판-트리틸 수지(0.15 mmol)에 첨가하고 1시간 동안 흔들었으며, 그 결과 수지를 DMF, 물, 희석된 소듐 카보네이트 용액, 물, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 용매를 여러 번). 작은 수지 샘플을 벤조일 클로라이드 및 DIPEA로 처리하고, 세척하고, 분해하였으며(조건들, 하기 참조), 생성물을 HPLC-MS에 의해 분석하였으며, 불완전한 로딩을 나타내었다. 따라서, 커플링 단계를 30분 동안 반복하였다. 그 동안 형성된 카바모일-니트로페닐에스테르의 양을 가수분해하기 위하여, 수지를 그 후 5분 동안 THF(1 mL), 메탄올(0.5 mL) 및 수성 NaOH(1 M, 0.5 mL)로 처리하였으며, 황색으로 변한 상청액은 성공적인 에스테르 가수분해를 나타내었다. DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척한 후에(각 용매 3회), DMSO(2 mL), 세슘 카보네이트(1 mmol) 및 알릴 브로마이드(1 mmol)를 첨가하였으며, 수지를 1시간 동안 흔들고, 이어서 반응을 밤새 반복하였다(0.2 mL의 물이 첨가되었다). 전환은 여전히 불완전하였기 때문에, 3일 동안 반응을 한번 더 반복하였으며, 그 후 수지를 DMF, 물, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 용매를 여러 번).
니트로 기는 NMP(1 mL), 피리딘 (0.5 mL) 및 NMP(1 mL) 중 주석(II) 클로라이드(1 mmol)의 용액의 첨가에 의해 환원되었다. 상기 혼합물을 밤새 흔든 후, 수지를 DMF, 물 및 메탄올로 세척하였으며, 불용성 부산물을 메탄올 중 부유에 의해 주의깊게 제거하였다. 디클로로메탄으로 세척한 후에, 수지를 건조시켰다. 5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-카복실산(0.25 mmol) 및 HOAt(0.25 mmol)를 NMP(약 1.5 mL) 중에 용해시키고, DIC(0.25 mmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 밤새 흔들었다. 그 후 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 용매를 여러 번).
알릴 에테르를 약 2시간 동안 디클로로메탄(2 mL), 피페리딘(0.4 mL) 및 테트라키스-트리페닐포스핀팔라듐(0)(약 10 mg)으로 수지를 처리하는 것에 의해 분해하였다. 그 후, 수지를 철저하게 DMF, 물, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하고(각 용매를 여러 번), 표적 화합물을 디클로로메탄-TFA-트리에틸실란 85:10:5로 처리하고(2분법), 이어서 디클로로메탄으로 세정하는 것에 의해, 수지로부터 분해하였다. 증발건고 이후에, 잔여물을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 384 (M+1).
5-(1-에틸인다졸-3-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L38)
Figure 112013019055514-pct00135
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP로 예비-팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)을 첨가하고, 약 30분 동안 수지를 흔들었으며, 이어서 DMF 및 디클로로메탄으로 철저하게 세척하였다. 인다졸-3-카복실산(0.5 mmol) 및 HOBt(0.5 mmol)를 NMP(1.5 mL) 중에 용해시켰다. DIC(0.5 mmol)를 첨가하고, 상기 용액을 2분 후에 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 1시간 동안 흔들고, 그 후에 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 세슘 카보네이트(1 mmol) 및 건조 DMF(1.5 mL)를 수지에 첨가하고, 이어서 에틸 브로마이드(1.5 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 밤새 흔든 후, DMF, 물, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 세슘 카보네이트/에틸 브로마이드 단계를 3일에 걸쳐 한번 반복하였으며, 그 후 수지를 철저하게 세척하였다. 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물(crude product)을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 396 (M+1).
5-[ N -(1-메틸인다졸-3-일)카바모일]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L39)
Figure 112013019055514-pct00136
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP로 예비-팽창시켰다. 5-Formyl살리실산(0.5 mmol) 및 HOAt(0.5 mmol)를 NMP(1.5 mL) 중에 용해시키고, DIC(0.5 mmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였으며, 그 결과 수지를 DMF 및 DCM으로 여러 번 세척하였다. 이어서, 수지를 실온에서 1시간 동안 THF(1 mL), 메탄올(1 mL) 및 수성 NaOH(2 M, 0.5 mL)로 처리하였으며, 그 후 수지를 메탄올/물, DMF, 메탄올/물, DMF 및 DCM으로 세척하였다. 아세토니트릴(1 mL), tert-부탄올(1 mL) 및 2-메틸-2-부텐(200 μL)을 첨가한 후에, 수지를 0 ℃까지 냉각시키고, 물(0.2 mL) 중 모노소듐 포스페이트(0.2 mmol) 및 소듐 클로라이트(0.25 mmol)의 용액으로 적하 처리하였다. 30분 후에, 아세토니트릴(1 mL) 및 tert-부탄올(1 mL)을 첨가하고, 물(0.4 mL) 중 모노소듐 포스페이트(0.8 mmol) 및 소듐 클로라이트(1 mmol)를 적하 첨가하였으며, 상기 혼합물을 실온까지 따뜻하게 하였다. 수지를 메탄올/물, DMF, 메탄올/물, DMF 및 DCM으로 세척하였다. 철저하게 건조시킨 후, 트리페닐포스핀(1 mmol), THF(2 mL) 및 메탄올(0.2 mL)을 첨가하고, 이어서 디에틸 아조디카복실레이트(1 mmol)를 첨가하였다. 수지를 실온에서 1시간 동안 교반하고, 그 후 DMF 및 디클로로메탄으로 여러 번 세척하였다. THF(1 mL), 메탄올(1 mL) 및 수성 NaOH(2 M, 0.5 mL)를 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 4일 동안 흔들고, 그 후 수지를 메탄올/물, DMF, 메탄올/물, DMF 및 DCM으로 세척하였다. NMP(1 mL) 중 HATU(0.25 mmol) 및 DIPEA(0.5 mmol)의 용액을 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 15분 동안 흔들었다. 그 후, NMP(0.5 mL) 중 3-아미노-1-메틸인다졸(0.25 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 흔들었으며, 이어서 DMF 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 표적 화합물을 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 382 (M+1).
( RS )-5-[1-(2,3-디히드록시-1-프로필)인다졸-3-일카복스아미도]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L40)
Figure 112013019055514-pct00137
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP로 예비-팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)을 첨가하고, 약 30분 동안 수지를 흔들었으며, 이어서 DMF 및 디클로로메탄으로 철저하게 세척하였다. 인다졸-3-카복실산(0.5 mmol) 및 HOBt(0.5 mmol)를 NMP(1.5 mL) 중에 용해시켰다. DIC(0.5 mmol)를 첨가하고, 상기 용액을 2분 후에 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 1시간 동안 흔들고, 그 후에 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 세슘 카보네이트(1 mmol) 및 건조 DMF(1.5 mL)를 수지에 첨가하고, 이어서 알릴 브로마이드(1 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 밤새 흔든 후, DMF, 물, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 세슘 카보네이트/알릴 브로마이드 단계를 밤새 동안 한번 반복하였으며, 그 후 수지를 철저하게 세척하고, 건조시키고, 유리 바이알로 이동시켰다. 물(0.5 mL) 및 아세톤(2 mL) 중 N-메틸모르폴린 옥시드(0.5 mmol)를 수지에 첨가하였다. 오스뮴-(VIII)-옥시드(50μL의 tert-부탄올 중 2.5% 용액)를 첨가하고, 바이알을 단단하게 밀폐하였으며, 밤새 실온에서 흔들었다. 오스뮴-(VIII)-옥시드(50μL의 tert-부탄올 중 2.5% 용액)의 추가 부분을 첨가하고 추가로 2시간 동안 흔든 후에, 수성 소듐 디티오니트(1 mL의 물 중 174 mg)로 반응을 퀀칭(quench)하고, 30분 동안 흔들었다. 그 후, 수지를 물, DMF, 물, 메탄올, DMF 및 디클로로메탄으로 여러 번 세척하였다. 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 442 (M+1).
5-(3 H -이미다조[4,5-b]피리딘-2-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L41)
Figure 112013019055514-pct00138
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP로 예비-팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 실온에서 흔들었다. 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세척한 후에, 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)을 첨가하고, 약 30분 동안 수지를 흔들었으며, 이어서 DMF 및 디클로로메탄으로 철저하게 세척하였다. 수지를 디클로로메탄(1 mL)에서 팽창시키고, DIPEA(1 mmol)를 첨가한 후, 디클로로메탄(1 mL) 중 옥살산 모노에틸 에스테르 모노클로라이드(0.5 mmol)를 첨가하였다. 5분 동안 흔든 후, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). NMP(2 mL) 중 2,3-디아미노피리딘(0.5 mmol)을 첨가하고, 상기 혼합물을 4일 동안 약 100 ℃에서 흔들었다. 수지를 세척한 후에(DMF, 메탄올, 디클로로메탄), 밤새 약 120 ℃에서 반응을 반복하였다. 전술한 바와 같이 세척한 후에, THF(1 mL), 메탄올(0.5 mL) 및 수성 NaOH(2 M, 0.5 mL)를 수지에 첨가하고, 상기 혼합물을 15분 동안 교반하였으며, 그 결과 수지를 메탄올(5회) 및 디클로로메탄(3회)으로 세척하였다. 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 369 (M+1).
2-메톡시-5-([1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리딘-3-일카복스아미도)벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L43)
Figure 112013019055514-pct00139
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP에서 예비-팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하였으며, 2분 후에 상기 혼합물을 3시간 동안 교반한 수지에 첨가하였다. 수지를 DMF로 세척한 후에, 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)을 첨가하고, 30분 동안 수지를 흔들었다. 이어서, 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 철저하게 세척하고, 디클로로메탄에서 팽창시켰다. 디클로로메탄(1.5 mL), DIPEA(1 mmol) 및 옥살산 모노에틸 에스테르 모노클로라이드(0.5 mmol)를 첨가하고, 상기 혼합물을 10분 동안 교반한 후, 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 여러 번 세척하였다. 에틸렌 글리콜(1 mL), 2-피리딜히드라진(1 mmol) 및 DIPEA(1 mmol)를 첨가하고, 상기 혼합물을 4시간 동안 100 ℃로 가열한 후, 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 여러 번 세척하였다. 트리페닐포스핀(0.5 mmol), N-메틸모르폴린(0.5 mmol) 및 디클로로메탄(2 mL)을 수지에 첨가하고, 그 후 트리클로로아세토니트릴(0.4 mmol)을 적하 첨가하였다. 48시간 동안 혼합물을 흔든 후, 디클로로메탄(2 mL) 중 트리페닐포스핀(0.5 mmol) 및 N-메틸모르폴린(1 mmol)의 용액을 테트라클로로카본(0.5 mL)과 함께 첨가하였다. 상기 혼합물을 2시간 동안 40 ℃에서 유지하고, 이어서 THF(2 mL) 및 수성 소듐 카보네이트(2 M, 0.5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 마지막으로, 수지를 DMF, 물, 메탄올 및 디클로로메탄으로 철저하게 세척하였다. 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 369 (M+1).
( S )-2,6-비스[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]헥산산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L49)
Figure 112013019055514-pct00140
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP에서 팽창시켰다. 그 후, (S)-비스-Fmoc-리신(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 NMP(약 1.5 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(400 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후에, 수지를 DMF로 세척하고, 피페리딘(DMF 중 25%, 2 mL)을 첨가하고, 수지를 30분 동안 교반하였다. 이어서, 수지를 세척하였다(DMF, 메탄올 및 디클로로메탄). Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 1시간 동안 혼합물을 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, DMF 중 25% 피페리딘으로 처리하고, 이어서 전술한 바와 같이 세척하는 것에 의해, 탈보호가 달성되었다. 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하였다. 1시간 동안 혼합물을 흔든 후에, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 801 (M+1), 401 ((M+2)/2).
( S )-2,6-비스{8-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥타노일아미도}헥산산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L50)
Figure 112013019055514-pct00141
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP에서 팽창시켰다. 그 후, (S)-비스-Fmoc-리신(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 NMP(약 1.5 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(400 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후에, 수지를 DMF로 세척하고, 피페리딘(DMF 중 25%, 2 mL)을 첨가하고, 수지를 30분 동안 교반하였다. 이어서, 수지를 세척하였다(DMF, 메탄올 및 디클로로메탄). Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 1시간 동안 혼합물을 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, DMF 중 25% 피페리딘으로 처리하고, 이어서 전술한 바와 같이 세척하는 것에 의해, 탈보호가 달성되었다. Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, DMF 중 25% 피페리딘으로 처리하고, 이어서 전술한 바와 같이 세척하는 것에 의해, 탈보호가 달성되었다. 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하였다. 1시간 동안 혼합물을 흔든 후에, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 547 ((M+2)/2).
5-[4-(2-푸릴)피리딘-2-일카복스아미도]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L52)
Figure 112013019055514-pct00142
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP에서 예비팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하였으며, 2분 후에 상기 용액을 수지에 첨가하였다. 105분 동안 흔든 후에, 수지를 DMF로 세척하고, 이어서 1시간 동안 피페리딘(DMF 중 25%, 2 mL)으로 처리하였으며, 그 후 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 철저하게 세척하였다. NMP(3 mL) 중 4-브로모피리딘-2-카복실산(0.3 mmol) 및 HOAt(0.3 mmol)를 DIC(0.3 mmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 흔들었으며, 그 결과 수지를 전술한 바와 같이 세척하고, 건조 질소 스트림으로 철저하게 건조시키고, 유리 바이알로 이동시켰다. 세슘 카보네이트(0.3 mmol) 및 2-푸릴보론산(0.5 mmol)을 DMF(2 mL)와 함께 첨가하였다. 상기 혼합물을 아르곤으로 철저하게 플러싱하였다. 테트라키스-트리페닐포스피닐팔라듐-0(10 μmol)을 첨가한 후에, 혼합물을 한번 더 아르곤으로 플러싱하였으며, 이어서 바이알을 타이트하게 밀폐하고, 혼합물을 밤새 100 ℃에서 교반하였다. 그 후, 수지를 DMF, 물, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 395 (M+1).
( S )-2,6-비스{5-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3-옥사펜타노일아미도}헥산산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L53)
Figure 112013019055514-pct00143
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP에서 팽창시켰다. 그 후, (S)-비스-Fmoc-리신(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 NMP(약 1.5 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(400 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후에, 수지를 DMF로 세척하고, 피페리딘(DMF 중 25%, 2 mL)을 첨가하고, 수지를 30분 동안 교반하였다. 이어서, 수지를 세척하였다(DMF, 메탄올 및 디클로로메탄). Fmoc-5-아미노-3-옥사펜탄산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 1시간 동안 혼합물을 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, DMF 중 25% 피페리딘으로 처리하고, 이어서 전술한 바와 같이 세척하는 것에 의해, 탈보호가 달성되었다. Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, DMF 중 25% 피페리딘으로 처리하고, 이어서 전술한 바와 같이 세척하는 것에 의해, 탈보호가 달성되었다. 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하였다. 1시간 동안 혼합물을 흔든 후에, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 503 ((M+2)/2).
2-메톡시-5-[3-(4-메톡시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-5-일카복스아미도]벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L54)
Figure 112013019055514-pct00144
1,3-디아미노프로판(450 μmol, 약 0.5 g)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 디클로로메탄에서 예비-팽창시키고, 이어서 NMP에서 예비-팽창시켰다. NMP(4.5 mL) 중 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(0.6 mmol) 및 HATU(0.6 mmol)를 2분 동안 DIPEA(1.2 mmol)로 처리하였다. 그 후, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 40분 동안 교반하고, 이어서 DMF로 3회 세척하였다. 피페리딘(DMF 중 25%, 약 6 mL)을 첨가한 후에, 수지를 30분 동안 교반하고, 이어서 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 고진공에서 수지를 건조시킨 후에, 디클로로메탄(3 mL) 및 DIPEA(3 mmol)를 첨가하고, 디클로로메탄 중 옥살산 모노에틸 에스테르 모노클로라이드(1.5 mmol)를 주의깊게 첨가하였다. 2분 동안 혼합물을 흔든 후에, 수지를 디클로로메탄, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 수지를 건조시킨 후에, 150 mg을 빼냈다. 잔존하는 양을 실온에서 2시간 동안 THF(4 mL), 메탄올(2 mL) 및 수성 NaOH(2 M, 2 mL)로 처리하였다. 수지를 세척하였다(DMF, 아세트산 [DMF 중 2.5%], 메탄올 및 디클로로메탄; 각 3회). 상기 수지 중에서, 150 mg을 2분 동안 NMP(1 mL) 중 HOAt(0.5 mmol) 및 DIC(0.5 mmol)와 반응시켰다. 그 후, NMP(1 mL) 중 4-메톡시-N-히드록시벤즈아미딘(0.5 mmol)을 첨가하였다. 1시간 동안 수지를 교반한 후에, DIC(0.5 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 밤새 흔들었다. 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척한 후에(각 3회), 커플링 단계를 반복하였다. DIC의 두번째 첨가로부터 3시간 후에, 수지를 전술한 바와 같이 세척하고, 건조시키고, 유리 바이알로 이동시켰다. NMP(2 mL) 및 DIC(0.5 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 120 ℃로 가열하였다. 이어서, 수지를 전술한 바와 같이 세척하였다. 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 426 (M+1).
5-[3-(2-푸릴)-1,2,4-옥사디아졸-5-일카복스아미도]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L55)
Figure 112013019055514-pct00145
N-히드록시-2-푸릴카복스아미딘의 합성: 에탄올(5 mL) 중 2-시아노푸란(5 mmol)의 교반된 용액에 수성 히드록실아민(50%, 5 mmol)을 첨가하였으며, 그 결과 반응 혼합물의 약간의 발열이 관찰되었다. 약 20분 후에, 추가 수성 히드록실아민(0.5 mmol)을 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후에, 질소 스트림으로 용매를 증발시키고, 잔여물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(NH2-개질된 정지상, 디클로로메탄 중 0-5% 메탄올, 1% 트리에틸아민)에 의해 정제하였으며, 가만히 있을 때 응고되는 약간 탁한 오일이 제공되었다.
표적 화합물의 합성: 건조 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(150 μmol)를 1,3-디아미노프로판(2 mL)으로 처리하고, 이어서 디클로로메탄(2 mL)으로 처리하였다. 5분 후에, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하고(각 3회), NMP 중에서 팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하고, 2분 후에 상기 용액을 30분 동안 실온에서 흔든 수지에 첨가하였다. 수지를 DMF(3회)로 세척하고, 30분 동안 피페리딘(DMF 중 25%, 약 4 mL)으로 처리하였으며, 그 결과 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하고(각 3회), 디클로로메탄에서 팽창시켰다. 디클로로메탄(2 mL) 및 DIPEA(1 mmol)를 첨가한 후에, 디클로로메탄(1 mL) 중 옥살산 모노에틸 에스테르 모노클로라이드(0.5 mmol)의 용액을 주의깊게 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였으며, 그 결과 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하고(각 3회), 건조시키고, 유리 바이알로 이동시켰다. 포타슘 카보네이트(0.5 mmol), 톨루엔(2 mL) 및 N-히드록시-2-푸릴카복스아미딘(0.5 mmol; 합성: 상기 참조)을 첨가하였으며, 바이알을 단단하게 밀폐시키고, 밤새 100 ℃에서 교반하고 2시간 동안 110 ℃에서 교반하였으며, 그 결과 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(45%) 및 트리에틸실란(10%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세정하고 질소 스트림으로 용매를 제거하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 잔여물을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 386 (M+1).
5-[5-(2-푸릴)-1,3,4-옥사디아졸-2-일]카복스아미도-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L58)
Figure 112013019055514-pct00146
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP로 예비-팽창시키고, 이어서 과량의 용매를 제거하였다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 팽창된 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 실온에서 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)을 첨가하고, 약 30분 동안 수지를 흔들었으며, 이어서 DMF 및 디클로로메탄으로 철저하게 세척하였다. 다음으로, 수지를 디클로로메탄에서 팽창시키고, 10분 동안 디클로로메탄(1.5 mL) 중 옥살산 모노에틸 에스테르 모노클로라이드(0.5 mmol) 및 DIPEA(1 mmol)로 처리한 후, DMF 및 디클로로메탄으로 반복 세척하였다. 수지를 THF(1.5 mL)에서 팽창시킨 후, 히드라진 수화물(0.5 mL)을 첨가하고, 수지를 실온에서 3시간 동안 교반하였으며, 이어서 DMF 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 푸란-2-카복실산(0.5 mmol) 및 HOAt(0.5 mmol)를 NMP(1.5 mL) 중에 용해시키고, DIC(0.5 mmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였으며, 이어서 DMF 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 그 후, 디클로로메탄(2 mL) 중 트리페닐포스핀(0.5 mmol) 및 N-메틸모르폴린(1 mmol)의 용액을 첨가하고, 이어서 테트라클로로카본(0.5 mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 철저하게 밀폐된 유리 바이알에서 2시간 동안 40 ℃로 가열하였다. THF(2 mL) 및 수성 Na2CO3(2 M, 0.5 mL)를 첨가한 후에, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였으며, 이어서 DMF, 물, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 386 (M+1).
5-[1-(2-히드록시에틸)인다졸-3-일카복스아미도]-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L59)
Figure 112013019055514-pct00147
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP로 예비-팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 실온에서 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)을 첨가하고, 1시간 동안 수지를 흔들었으며, 이어서 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 철저하게 세척하였다. 인다졸-3-카복실산(0.5 mmol) 및 HOBt(0.5 mmol)를 NMP(1.5 mL) 중에 용해시켰다. DIC(0.5 mmol)를 첨가하고, 2분 후에 상기 용액을 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 40분 동안 흔들고, 그 후 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 수지를 유리 바이알로 이동시키고, NMP(2 mL) 중 브로모아세트산 메틸 에스테르(0.5 mmol) 및 DIPEA(1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 바이알을 철저하게 밀폐시키고, 75분 동안 80 ℃에서 흔들었다. 그 후, 수지를 세척하고(DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 3회), THF(2 mL) 및 메탄올(0.5 mL)에서 팽창시켰으며, 소듐 보로하이드리드(매우 과량, 분량을 나누어 첨가됨)로 처리하였다. 마지막 첨가 이후에, 혼합물을 실온에서 30분 동안 흔들고, 이어서 수지를 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 412 (M+1).
8-[2-메톡시-5-(1-메틸인다졸-3-일카복스아미도)페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L60)
Figure 112013019055514-pct00148
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌을 NMP에서 예비-팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하고, 2분 후에 상기 용액을 1시간 동안 실온에서 흔든 수지에 첨가하였으며, 그 결과 수지를 DMF로 세척하였다(3회). 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 약 30분 동안 흔들었다. 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 다음으로, 커플링/탈보호 프로토콜을 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(전술한 것과 동일한 양)에 적용하였다. 마지막으로, 전술한 HATU 커플링 프로토콜을 이용하여 1-메틸인다졸-3-카복실산을 커플링시켰다. 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 527 (M+1).
8-{8-[2-메톡시-5-(1-메틸인다졸-3-일카복스아미도)페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥타노일아미도}-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L61)
Figure 112013019055514-pct00149
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌을 NMP에서 예비-팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하고, 2분 후에 상기 용액을 1시간 동안 실온에서 흔든 수지에 첨가하였으며, 그 결과 수지를 DMF로 세척하였다(3회). 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 약 30분 동안 흔들었다. 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 다음으로, 커플링/탈보호 프로토콜은 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산으로 반복되었으며, 그 후 이는 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(전술한 것과 동일한 양)에 적용하였다. 마지막으로, 전술한 HATU 커플링 프로토콜을 이용하여 1-메틸인다졸-3-카복실산을 커플링시켰다. 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 672 (M+1).
( S )-2,6-비스{8-[5-(이미다조[1,2-b]피리다진-2-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥타노일아미도}헥산산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L62)
Figure 112013019055514-pct00150
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP에서 팽창시켰다. (S)-비스-Fmoc-리신(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 NMP(약 1.5 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(400 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후에, 수지를 DMF로 세척하고, 피페리딘(DMF 중 25%, 2 mL)을 첨가하고, 수지를 30분 동안 교반하였다. 이어서, 수지를 세척하였다(DMF, 메탄올 및 디클로로메탄). Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 1시간 동안 혼합물을 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, DMF 중 25% 피페리딘으로 처리하고, 이어서 전술한 바와 같이 세척하는 것에 의해, 탈보호가 달성되었다. Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 흔들었다. 수지를 DMF로 세척한 후에, DMF 중 25% 피페리딘으로 처리하고, 이어서 전술한 바와 같이 세척하는 것에 의해, 탈보호가 달성되었다. 이미다조[1,2-b]피리다진-2-카복실산(400 μmol) 및 HATU(400 μmol)를 NMP(약 2 mL) 중에 용해시키고, 2분 동안 DIPEA(800 μmol)로 처리하였으며, 그 결과 용액을 수지에 첨가하였다. 1시간 동안 혼합물을 흔든 후에, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 542 ((M+2)/2).
( S )-1-아미노프로판-1,3-디카복실산 비스{3-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]프로필}아미드 (L64)
Figure 112013019055514-pct00151
5-아미노-2-메톡시벤조산 메틸 에스테르의 합성: 메탄올(5 mL) 중 챠콜(5%, 25 mg [약 50% w/w 물 함유])상의 팔라듐(0) 및 2-메톡시-5-니트로벤조산 메틸 에스테르(1 mmol)를 10분에 걸쳐 트리에틸실란(1 mL)으로 적하 처리하고, 이어서 메탄올(2 mL)로 처리하였다. 추가 5분 동안 교반한 후에, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 이어서 셀라이트 층을 철저하게 세정하였다. 여과액을 농축시키고, 고진공에서 건조시키고, 잔여물을 추가 정제 없이 사용하였다.
아미노프로필-연결된 리간드의 용액-상 합성(L37과 동일함): DMF(2 mL) 중 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산(1 mmol) 및 TBTU(1 mmol)를 5분 동안 DIPEA(2 mmol)로 처리하였다. 이어서, 상기 혼합물을 이전에 획득한 완전량(complete amount)의 5-아미노-2-메톡시벤조산 메틸 에스테르에 첨가하고, 상기 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 포화 수성 소듐 카보네이트(1 mL) 및 물(3 mL)을 첨가한 후에, 혼합물을 에틸 아세테이트로 4회 추출하였다. 결합된(combined) 유기 층들을 수성 시트르산(5%)으로 2회, 포화 수성 소듐 카보네이트로 1회, 및 물로 2회 세척하였다. 잔존 유기 층을 농축시키고, 건조 질소 스트림으로 밤새 건조시켰다. 1,3-디아미노프로판(2 mL)을 잔여물에 첨가하고, 혼합물을 4시간 동안 80 ℃로 가열하였다. 이어서, 상기 용액을 농축건조시키고, 잔여물을 메탄올 중에 재용해시키고, 농축시키고, 고진공에서 건조시켰으며, 냉장함에 따라 응고되는 오일이 제공되었다. 수율: 453 μmol (45%).
표적 화합물의 합성: N-Boc-글루탐산(227 μmol) 및 TBTU(453 μmol)를 DMF(2 mL) 중에 용해시키고, 3분 동안 DIPEA(906 μmol)로 처리한 후, 상기 용액을 이전에 획득한 잔여물에 첨가하였다. 90분 후에, DMF(1 mL; 전술한 바와 같이 2분 동안 활성화) 중 TBTU-활성화된 N-Boc-글루탐산(0.2 mmol)의 다른 부분을 첨가하였다. 45분 후에, 용매를 질소 스트림으로 밤새 증발시켰다. 잔여물을 메탄올 중에 재용해시키고, 증발건고시키고, 트리플루오로아세트산(디클로로메탄 중 25%)으로 처리한 후, 증발건고 및 예비 역상 HPLC에 의한 잔여물의 정제를 수행하였다. ESI-MS: 858 (M+1), 430 ((M+2)/2).
일반적 방법 D: 2개의 Ado 단위 및 1개의 1,3-디아미노프로판 단위에 연결된 5-아미노-2-메톡시벤조산의 합성(기본 수지)
1,3-디아미노프로판으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 DCM 및 NMP에서 예비-팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 2분 동안 DIPEA(400 μmol)로 처리하고, 이어서 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 30분 내지 수시간 동안 교반하였다. 수지를 DMF 또는 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척한 후에, 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)을 첨가하고, 수지를 20분 이상 동안 교반하였다. 이어서, 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 철저하게 세척하고(각 3회), 커플링/탈보호 과정을 한 번 반복하였다. Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(200 μmol)을 전술한 HATU-커플링 프로토콜을 이용하여 수지에 커플링시켰으며, 전술한 바와 같이 피페리딘으로 탈보호하였다. 추가 합성 단계들에 앞서 수지를 공기중에서 건조시켰다.
8-{8-{5-[5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-일카복스아미도]-2-메톡시페닐카복스아미도}-3,6-디옥사옥타노일아미도}-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L65)
Figure 112013019055514-pct00152
NMP(1.5 mL) 중 5-(2-푸릴)-1-메틸피라졸-3-카복실산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 2분 동안 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 이어서, 상기 용액을 일반적 방법 D에 의해 획득한 기본 수지에 첨가하였다. 약 2시간 동안 혼합물을 교반한 후에, 수지를 세척하였다(DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 688 (M+1).
8-{8-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥타노일아미도}-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L66)
Figure 112013019055514-pct00153
NMP(1.5 mL) 중 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 2분 동안 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 이어서, 상기 용액을 일반적 방법 D에 의해 획득한 기본 수지에 첨가하였다. 약 2시간 동안 혼합물을 교반한 후에, 수지를 세척하였다(DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 664 (M+1).
8-{8-{5-[5-(2-푸릴)-1,3,4-옥사디아졸-2-일카복스아미도]-2-메톡시페닐카복스아미도}-3,6-디옥사옥타노일아미도}-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L67)
Figure 112013019055514-pct00154
일반적 방법 D에 의해 획득한 건조 기본 수지를 디클로로메탄(2 mL) 및 DIPEA(1 mmol)로 처리하고, 이어서 디클로로메탄 중 옥살산 모노에틸 에스테르 모노클로라이드(0.5 mmol)를 적하첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반시키고, 그 후 수지를 DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 이어서, 수지를 NMP(2 mL)에서 팽창시키고, 실온에서 50분 동안 히드라진 수화물(1 mmol)로 처리하였으며, 그 후 전술한 바와 같이 세척하였다. NMP(1.5 mL) 중 2-푸로산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 2분 동안 DIPEA(400 μmol)로 처리하고, 이어서 용액을 수지에 첨가하였다. 약 1시간 후에, 수지를 전술한 바와 같이 세척하였다. 다음으로, 디클로로메탄(약 2 mL) 중 4-톨루엔설포닐 클로라이드(0.5 mmol) 및 DIPEA(1 mmol)를 첨가하고, 고리화가 완료될 때까지 상기 혼합물을 교반하였다. 수지를 전술한 바와 같이 세척하였다. 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 676 (M+1).
8-{8-{2-메톡시-5-[5-(2-메틸티아졸-4-일)이속사졸-3-일카복스아미도]페닐카복스아미도}-3,6-디옥사옥타노일아미도}-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L68)
Figure 112013019055514-pct00155
NMP(1.5 mL) 중 5-(2-메틸티아졸-4-일)이속사졸-3-카복실산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 2분 동안 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 이어서, 상기 용액을 일반적 방법 D에 의해 획득한 기본 수지에 첨가하였다. 약 2시간 동안 혼합물을 교반한 후에, 수지를 세척하였다(DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 706 (M+1).
N -(8-아미노-3,6-디옥사옥틸)- N'- {8-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥틸}우레아 (L69)
Figure 112013019055514-pct00156
2-클로로트리틸 클로라이드 폴리스티렌 수지(150 μmol)에 1,8-디아미노-3,6-디옥사옥탄(2 mL)을 첨가하였다. 5분 동안 상기 혼합물을 흔든 후에, 디클로로메탄(1 mL)을 첨가하여 충분한 팽창을 보장하였다. 25분 후에, 수지를 세척하였다(DMF, 메탄올, 디클로로메탄, 각 3회). 수지를 디클로로메탄에서 팽창시킨 후, 디클로로메탄(2 mL) 및 DIPEA(1 mmol)를 첨가하고, 이어서 디클로로메탄(1 mL) 중 클로로포름산 (4-니트로페닐)에스테르(0.5 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 5분 동안 교반하고, 이어서 수지를 여과시키고, 즉시 20분 동안 1,8-디아미노-3,6-디옥사옥탄(2 mL)으로 처리하였다. 그 후, 수지를 전술한 바와 같이 세척하였다.
NMP/DCM(1.5+1.5 mL) 중 Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 2분 동안 DIPEA(400 μmol)로 처리하고, 이어서 상기 용액을 수지에 첨가하였다. 5시간 동안 상기 혼합물을 교반한 후에, 수지를 전술한 바와 같이 세척하고, 30분 동안 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)으로 처리하였으며, 이어서 전술한 바와 같이 세척하였다. 마지막으로, 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산((200 μmol)을 전술한 바와 같이 HATU 커플링 프로토콜을 이용하여 커플링시켰으며(neat NMP, 약 1.5 mL; 반응 시간: 밤새 동안), 이어서 전술한 바와 같이 수지를 세척하였다. 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(45%) 및 트리에틸실란(10%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 622 (M+1), 312 ((M+2)/2).
일반적 방법 E: 이소프탈산 N -(3-아미노-1-프로필)- N' -아릴 아미드의 합성
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 건조 트리틸 폴리스티렌 수지를 3분 동안 디클로로메탄(1.5 mL) 중 이소프탈로일 클로라이드(1 mmol) 및 DIPEA(2 mmol)로 처리하였다. 수지를 디클로로메탄 또는 NMP로 신속하게 세척하였다(2회 또는 3회). 이어서, NMP(1.5 mL) 중 각각의 방향족 아민(0.3 mmol) 및 DIPEA(0.3 mmol)를 첨가하고, 상기 혼합물을 1시간 동안 교반한 후, DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 표적 화합물을, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 화합물의 다소 열등한 가용성 때문에, 일부 경우에는 분해 용액 또는 세척 용액에 메탄올이 첨가될 필요가 있었다.
이소프탈산 N -(3-아미노프로필)- N'- [5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸-2-일]아미드 (L70)
Figure 112013019055514-pct00157
일반적 방법 E에 따라 2-아미노-5-(2-푸릴)-1,3,4-티아디아졸로부터 제조됨. ESI-MS: 372 (M+1).
이소프탈산 N -(3-아미노프로필)- N'- (1-메틸인다졸-3-일)아미드 (L71)
Figure 112013019055514-pct00158
일반적 방법 E에 따라 3-아미노-1-메틸인다졸로부터 제조됨. ESI-MS: 352 (M+1).
이소프탈산 N -(3-아미노프로필)- N'- (벤조티아졸-2-일)아미드 (L72)
Figure 112013019055514-pct00159
일반적 방법 E에 따라 2-아미노벤조티아졸로부터 제조됨. ESI-MS: 355 (M+1).
이소프탈산 N -(3-아미노프로필)- N'- (4-페닐티아졸-2-일)아미드 (L73)
Figure 112013019055514-pct00160
일반적 방법 E에 따라 2-아미노-4-페닐티아졸로부터 제조됨. ESI-MS: 381 (M+1).
이소프탈산 N -(3-아미노프로필)- N'- (5-페닐티아졸-2-일)아미드 (L74)
Figure 112013019055514-pct00161
일반적 방법 E에 따라 2-아미노-5-페닐티아졸로부터 제조됨. ESI-MS: 381 (M+1).
5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 [3-(6-아미노헥사노일아미도)-1-프로필]아미드 (L75)
Figure 112013019055514-pct00162
5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시벤조산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L37)를 일반적 방법 A에 따라 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산 및 150 μmol의 1,3-디아미노프로판-예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지로부터 제조하였다. 지지체 결합 리간드의 산 분해에 의해 획득한 조 생성물을 질소 스트림으로 건조시켰다. 포화 수성 소듐 카보네이트(3 mL)를 첨가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트(3회) 및 디클로로메탄(4회)으로 추출하였다. 결합된 유기 층들을 증발권고시켰다. DMF(1 mL) 중 Boc-6-아미노헥산산(100 μmol) 및 HATU(100 μmol)를 DIPEA(200 μmol)로 처리하고, 2분 후에 상기 용액을 이전에 획득한 잔여물에 첨가하였다 20분 동안 상기 혼합물을 교반한 후에, 물(2 mL) 및 포화 수성 소듐 카보네이트(1 mL)를 첨가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 결합된(combined) 유기 층들을 수성 시트르산(5%, 2회), 포화 소듐 카보네이트 및 물로 세척하고, 농축건조시켰다. 잔여물을 40분 동안 디클로로메탄(1 mL) 및 트리플루오로아세트산(1 mL)으로 처리하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물(crude product)을 역상 예비 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 487 (M+1).
6-[5-(이미다조[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]헥산산 (8-아미노-3,6-디옥사-1-옥틸)아미드 (L76)
Figure 112013019055514-pct00163
2-클로로트리틸 클로라이드 폴리스티렌 수지(150 μmol)를 1,8-디아미노-3,6-디옥사옥탄(500 μL)으로 처리하였다. 3분 동안 상기 혼합물을 흔든 후에, 디클로로메탄(1 mL)을 첨가하고, 15분 동안 지속적으로 흔든 후, DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 이어서, 수지를 NMP에서 팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-6-아미노헥산산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 흔들었다. 이어서, 수지를 전술한 바와 같이 세척한 후, 1시간 동안 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)으로 처리하고, 전술한 바와 같이 세척하였다. 이러한 커플링/탈보호 사이클에 따라, Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산이 수지에 커플링되었으며(커플링 시간: 밤새 동안; 탈보호 시간: 30분), 이어서 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산의 커플링이 수행되었다(커플링 시간: 3시간). 전술한 바와 같이 최종 세척한 이후에, 표적 화합물을 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(45%) 및 트리에틸실란(10%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 561 (M+1).
8-[5-(이미다조-[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥탄산 (3-아미노-1-프로필)아미드 (L77)
Figure 112013019055514-pct00164
1,3-디아미노프로판(150 μmol)으로 예비로딩된 트리틸 폴리스티렌 수지를 NMP에서 예비-팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 수지를 전술한 바와 같이 세척하고, 그 후 1시간 동안 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)으로 세척하고, 전술하나 바와 같이 세척하였다. 이러한 커플링/탈보호 사이클에 따라, Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산이 수지에 커플링되었으며(커플링 시간: 밤새 동안; 탈보호 시간: 30분), 이어서 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산의 커플링이 수행되었다(커플링 시간: 3시간). 전술한 바와 같이 최종 세척한 이후에, 표적 화합물을 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(10%) 및 트리에틸실란(5%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 519 (M+1).
8-[5-(이미다조-[2,1-b]티아졸-6-일카복스아미도)-2-메톡시페닐카복스아미도]-3,6-디옥사옥탄산 (6-아미노-1-헥실)아미드 (L78)
Figure 112013019055514-pct00165
2-클로로트리틸 클로라이드 폴리스티렌 수지(150 μmol)를 1,6-디아미노헥산(500 μL)으로 처리하였다. 3분 동안 상기 혼합물을 흔든 후에, 디클로로메탄(1 mL)을 첨가하고, 15분 동안 지속적으로 흔든 후, DMF, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하였다(각 3회). 이어서, 수지를 NMP에서 팽창시켰다. NMP(1.5 mL) 중 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(200 μmol) 및 HATU(200 μmol)를 DIPEA(400 μmol)로 처리하였다. 2분 후에, 상기 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 흔들었다. 이어서, 수지를 전술한 바와 같이 세척한 후, 1시간 동안 피페리딘(DMF 중 25%, 약 2 mL)으로 처리하고, 전술한 바와 같이 세척하였다. 이러한 커플링/탈보호 사이클에 따라, Fmoc-5-아미노-2-메톡시벤조산이 수지에 커플링되었으며(커플링 시간: 밤새 동안; 탈보호 시간: 30분), 이어서 이미다조[2,1-b]티아졸-6-카복실산의 커플링이 수행되었다(커플링 시간: 3시간). 전술한 바와 같이 최종 세척한 이후에, 표적 화합물을 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산(45%) 및 트리에틸실란(10%)으로 이분법 처리하고, 이어서 수지를 디클로로메탄으로 철저하게 세척하는 것에 의해, 지지체로부터 분해하였다. 용매의 증발 이후에, 조 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다. ESI-MS: 561 (M+1).
실시예 3: 리간드의 고정화
실험
건조된 리간드를 중량 분석에 기초하여 100　mM의 근사 농도에서 DMSO에 재용해시켰다. 저장액의 정확한 농도는 o-프탈디알데히드 어세이(2)에 의해 측정되었다. 염료-리간드 분자는 340　nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량되었다. 측정은 1-(3-아미노프로필)이미다졸에 의해 보정(calibrate)되었다. 커플링 반응에서, 1M　N,N-디이소프로필에틸아민을 함유하는 90%　DMSO 및 10%　N-메틸-2-피롤리돈 중에 15 내지 20　mM의 근사 농도에서 용해된 1 부피의 리간드를 이소프로판올로 평형화된 1 부피의 정치된 NHS-활성화 세파로스 4 FF(GE Healthcare)에 첨가하였다. 반응을 2시간 동안 25　℃에서 수행하면서, 격렬하게 흔들었다. 반응의 상청액을 빼내고, 수지를 적절한 용매로 2회 세척하였다. 수지에 잔존하는 활성 기는 1시간 동안 25　℃에서 1　M 에탄올아민에 의해 차단되었다. 최종 수지를 세척하고, 후속 실험에서 사용할 때까지 4　℃에서 20% 에탄올 중에 저장하였다. 반응 수율은 모든 분획들에서 리간드 농도를 분석한 후에 물질 밸런스(mass balance)에 기초하여 결정하였다.
요약 및 결과
실시예　2의 리간드를 후속 크로마토그래피 및 배치(batch) 흡착 실험을 위해 NHS-활성화 세파로스 4 FF에 고정시켰다. 커플링은 리간드상의 아미노프로필 링커의 아미노 기와 예비-활성화 수지의 NHS-활성화 카복실릭 기 사이의 아미드 결합의 형성을 통해 달성되었다. 하기 표는 실시예 2의 리간드의 커플링 반응에 대한 결과들을 나타낸다. 평균적으로, 수지의 ml 당 15.5　μmol의 고정된 리간드 밀도가 획득되었다. 반응 수율은 평균 74.5%였다.
Figure 112013019055514-pct00166
Figure 112013019055514-pct00167
Figure 112013019055514-pct00168
Figure 112013019055514-pct00169
실시예 4: (실시예 2의) 리간드의 크로마토그래피 평가
실험
수지들은 마이크로티터 플레이트 크로마토그래피에 의해 충전 방식(packed mode)으로 평가되었다. 각 컬럼에 대해, 약 30　μL의 수지가 384-웰 필터 플레이트로 이동되고, 적절한 탑 프릿(top frit)으로 밀폐되었다. rProtein A 세파로스 FF 및 마브소르벤트 A2P HF에 의한 컬럼이 대조군으로서 포함되었다.
컬럼들은 주입하기 전에 6.7 컬럼 부피(cv)의 인산완충식염수(0.15　M NaCl, 20　mM 인산나트륨, pH 7.3; PBS)으로 평형화되었다. 3.3　cv의 0.75　mg　ml-1로 용해된 전(whole) IgGs, 0.25　mg　ml-1로 용해된 Fab 또는 Fc 단편(이들 3개 모두는 PBS에 있음) 또는 숙주 세포 단백질(HCP)이 컬럼상에 주입되었다. 베바시주마브의 항체 단편(Fab 및 Fc)은 제조사의 프로토콜에 따라 파파인 프로테아제(3)로 전 IgG를 분해하여 제조하였다. 결합되지 않은 단백질은 5　cv의 PBS로 컬럼으로부터 세척하고, 그 후 pH 2.5에서 5　cv의 글리신 버퍼로 용출하였다. 이동된 부피는 1-2분 동안 50g로 컬럼을 통해 회전되었다. 샘플을 주입하는 동안, 가속은 10g로 감소되었으며, 원심분리 시간은 5-10분으로 증가되었다. 용출액 분획은 384-웰 플레이트에서 수집되었으며, 단백질의 농도는 브래드포드(Bradford) 어세이에 의해 분석되었다. 단백질 질량(mass) mi, mft 및 me(하기 참조)는 분획 부피 및 측정된 단백질 농도의 산물로서 계산되었다.
요약 및 결과
수개의 항체들의 결합 및 용출이 입증되었다. 그 중에서, 3개의 인간화 치료적 항체들 베바시주마브, 토실리주마브 및 팔리비주마브와 인간 혈청으로부터 단리된 인간 폴리-IgG(h-폴리-IgG) 혼합물이 있었다. 일부 경우에, 정제된 베바시주마브 Fab 및 Fc 단편 또는 토끼 IgG의 혼합물(h-폴리-IgG, 혈청에서 단리됨)이 추가 공급물로서 사용되었다. 항체에 대한 리간드의 선택성은 숙주 세포 단백질의 결합 거동을 조사함으로써 결정되었다. 시판되는 수지들 rProtein A 세파로스 FF(rProtein A), 마브소르벤트 A2P(A2P) 및 MEP Hypercel(Hyper)에 대한 결과들이 비교를 위해 포함되었다.
'결합(bound)' 단백질의 분획은 주입된 단백질의 총 질량 mi과 플로우스루(flowthrough)에서 검출되는 단백질의 질량 mft 사이의 차이를 주입된 단백질의 총 질량으로 나누어 계산되었다.
Figure 112013019055514-pct00170
단백질의 '수율(yield)'은 용출된 단백질의 질량 m e 을 주입된 단백질의 질량 m i 으로 나누어 계산되었다.
Figure 112013019055514-pct00171
수지의 '선택성(selectivity)'은 결합된 항체의 분획(fraction) B Ab 를 결합된 숙주 세포 단백질의 분획 B HCP 로 나누어 계산되었다.
Figure 112013019055514-pct00172
'결합' 단백질의 분획과 단백질의 '수율'은 전 IgG-항체들에 대한 데이터에 기초하여 각각의 수지에 대해 계산되었다. 베바시주마브 단편 및 숙주 세포 단백질의 경우, 오직 '결합' 단백질의 분획만 주어진다. 수지의 선택성은 베바시주마브 전 IgG 및 숙주 세포 단백질에 대한 데이터로부터 계산되었다. 제한된 실험 정확도 때문에, 선택성은 10의 값을 넘어서는 절삭(truncated)되었다.
실시예 3의 수지들과 참조 수지에 대한 크로마토그래피 결과들이 하기 표에 주어진다. L53에 대한 값들은 가까운 유사체 L49 및 L50에 근거하여 예측된 추정값이다.
Figure 112013019055514-pct00173
Figure 112013019055514-pct00174
Figure 112013019055514-pct00175
Figure 112013019055514-pct00176
Figure 112013019055514-pct00177
Figure 112013019055514-pct00178
대조군들은 거의 100%까지 모든 항체들을 결합하였다. 단백질 A는 어떠한 숙주 세포 단백질(HCP)도 결합하지 않은 것과 달리, A2P 및 Hypercel은 그에 대해 높은 결합 성질을 나타내었다. 도출된 선택성 지수는 단백질 A에 대해 10.0, A2P에 대해 1.0, Hypercel에 대해 1.3이었다.
실시예 2의 시험된 리간드들 중에서, L1, L27, L31 및 L37은 항체 결합 및 선택성과 관련하여 가장 우수한 결과를 보여주었다. 이들 모두는 시험된 모든 인간 전 IgG 항체들을 90% 이상으로 결합하였으며, 이에 따라 일반적 Fc-결합자(binder)의 결합 특징들을 갖는다. 이러한 점에 일치하여, L1 및 L27은 베바시주마브의 Fc-단편을 결합하였으나, Fab-단편은 결합하지 않았다. 또한, L1에 대해 토끼 폴리-IgGs의 효과적인 결합이 입증되었다. 크로마토그래피 이후의 베바시주마브, 토실리주마브 및 팔리비주마브의 수율은 87% 내지 100%였다. 폴리-IgG의 수율은 약간 더 낮았으며, 70% 내지 90%였다. 선택성 지수는 L1에 대해 3.3, L27에 대해 2.9, L31에 대해 4.4, L37에 대해 3.4였다.
실시예 2의 다른 리간드들은 시험된 항체들 중 하나 이상의 결합의 감소 또는 40% 이상으로 HCP의 결합을 나타내었다(도출된 선택성 지수는 2.5 이하였음).
실시예 5: 등온선(isotherms) 및 결합의 시간척도(Time-Scale)
실험
항체로서 베바시주마브와 함께 실험들이 수행되었다. 정제된 항체에 대한 랭뮤어 등온선(Langmuir isotherm)의 파라미터들은 96-웰 마이크로티터 플레이트에서 배치 흡착 실험에 의해 결정되었다. 각 웰에서, 10　μL의 흡착제 슬러리(50% v/v)가 100　μL의 단백질 용액과 혼합되었다. 초기 농도들은 인산완충식염수(0.15 M NaCl, 20 mM 포스페이트 버퍼, pH 7.3; PBS) 중에서 0.05-5　mg　ml-1였다. 적어도 3시간 동안 25 ℃에서 반응물은 격렬하게 교반되었다. 그 후 , 상청액 중 항체 농도는 브래드포드 어세이에 의해 측정되었다.
흡수 동역학(uptake kinetics)은 96-웰 필터 플레이트에서 배치 흡착에 의해 유사하게 조사되었다. 다시, 10 μL의 흡착제 슬러리(50% v/v)가 100　μL의 단백질 용액과 혼합되었다. 그러나, PBS 중 0.75 mg　ml-1 베바시주마브의 고정된 최초 농도가 사용되었다. 80분까지 동안 25 ℃에서 반응물은 격렬하게 교반되었다. 상청액들은 2.5, 5, 10, 20, 40 및 80 분 이후에 필터를 통해 회전(spinning)함으로써 신속하게 분리되었으며, 분석을 위해 샘플링되었다. 항체의 농도는 브래드포드 어세이에 의해 측정되었다.
요약 및 결과
실시예 3의 고정된 리간드들의 부분집합은 베바시주마브에 대한 그들의 친화성 및 최대 용량(maximum capacity)과 관련하여 특징지어졌다. 더욱이, L1에 대해, 결합에 대해 요구되는 시간척도가 결정되었다. 시판되는 수지들 rProtein A 세파로스 FF(rProtein A) 및 마브소르벤트 A2P(A2P)가 비교를 위해 포함되었다.
랭뮤어 등온선의 파라미터들, 즉 해리상수 Kd 및 최대용량 qm이 상청액 중에서 측정된 농도들로부터 결정되었다. 파라미터들은 Chase(4)에서 유래되는 모델 방정식의 수치 조정에 의해 추정되었다.
흡수 동역학은 결합의 시간척도 t0.8에 의해 특징지어졌으며, 이는 항체에 의한 수지의 평형 포화의 80%가 발생한 후의 시간으로서 정의되었다. t0.8을 결정하기 위하여, 상청액 중 측정된 농도들은 이중-지수(double-exponentials)(5)의 조정에 의해 보간되었으며, t0.8의 값들은 그래프로부터 판독되었다. 사내용(in-house) 수지 뿐만 아니라 참조 수지에 대한 랭뮤어 등온선의 파라미터들 및 결합의 시간척도들이 하기 표에 제공된다.
Figure 112013019055514-pct00179
가장 높은 친화성은 rProtein　A에 대해 관찰되었으며, 이는 Kd가 4.7　μg　ml-1였다. A2P(49　μg　ml-1), 수지 L1(61 μg　ml-1) 및 L27(92 μg　ml-1)의 해리상수들은 한 자릿수가 더 낮았다. 잔류 수지의 해리상수들은 두 자릿수가 더 낮았으며, 103 μg　ml-1(L23) 내지 252 μg　ml-1(L17)의 범위였다. 최대 용량과 관련하여, 가장 높은 용량은 A2P에서 측정되었다(수지 ml 당 69 mg). rProtein A는 최대 용량이 수지 ml 당 41 mg이었다. 사내용 수지들의 최대 용량들은 수지 ml 당 26 내지 37 mg이었다. 항체의 흡수는 rProtein A에서 가장 빨랐으며(8.9분), 뒤이어 A2P(9.3분) 및 L1(9.9분)이었다.
실시예 6: 동적 결합 용량(dynamic binding capacity)
실험
동적 결합 용량들은 정제된 베바시주마브로 컬럼 크로마토그래피에 의해 결정되었다. 수지들은 25　mm 길이 및 3　mm 내직경의 분석 컬럼으로 충전되었다. 컬럼은 일정한 유속으로 인산완충식염수(150 mM NaCl, 20 mM 포스페이트 버퍼, pH 7.3) 중 1　mg　ml-1 항체로 공급되었으며, 용출액 중 항체의 농도는 흡광도 280　nm를 통해 온라인으로 모니터링되었다. 용출액 농도가 적어도 10%의 공급물 농도에 도달할 때까지, 항체가 로딩되었다. 동적 결합 용량은 비어 있는(empty) 컬럼 잔류 시간 3분에 대응하는 유속 50 cm h-1에서 결정되었다. 또한, 평형 용량은 항체의 완전한 파과(breakthrough)까지 로딩함으로써 유속 50　cm　h-1에서 결정되었다. 결합된 항체는 pH 3.0의 소듐 시트레이트로 세척하고, 이어서 pH 2.5의 글리신 하이드로클로라이드로 세척함으로써, 컬럼으로부터 이탈되었다.
요약 및 결과
유속의 함수로서 베바시주마브에 대한 동적(결합)용량은 L1(실시예 3) 및 rProtein A 세파로스 4 FF(rProtein A)에 대해 결정되었다.
'동적 용량(Dynamic Capacity)'은 용출액 농도가 공급물 농도의 10%에 도달할 때까지 일정 유속에서 컬럼상에 주입될 수 있는 항체의 양으로서 정의되었다. 이는 10% 파과(breakthrough)가 발생된 후의 시간 t0.1을 유속 F 및 공급물 농도 cf와 곱하여 계산되었다.
Figure 112013019055514-pct00180
평형 용량(Equilibrium Capacity)은 주어진 공급물 스트림 농도에 대해 컬럼에 결합하는 항체의 최대 양으로서 정의된다. 이는 공급물 농도 c f , 시간에 따른 용출액 농도 c(t) 및 유속 F를 포함하여 하기 적분을 구함으로써 계산되었다.
Figure 112013019055514-pct00181
적분은 계수적으로 구해졌다. 적분법은 완전 파과(complete breakthrough)가 발생한 후의 시간으로 제한되었다. 동적 용량 및 평형 용량의 계산은 모두 컬럼의 홀드업(hold-up) 및 크로마토그래피 시스템에 대해 보정되었다. 용량은 컬럼 내 수지의 부피에 의해 정규화되었다.
유속의 함수로서 L1 및 rProtein A 세파로스 4 FF에 대한 동적 결합 용량 및 1　mg　ml-1 베바시주마브의 공급물 농도에 대한 평형 결합 용량이 하기 표에서 주어진다.
rProtein A에 대해, 수지 ml 당 28.4 mg의 동적 결합 용량이 결정되었다. L1의 동적 용량은 수지 ml 당 20.2 mg이었다. 계산된 평형 용량은 rProtein A에 대해 수지 ml 당 40 mg이었으며, L1에 대해 수지 ml 당 25.7 mg이었다.
Figure 112013019055514-pct00182
실시예 7: 알칼리성 안정성(Alkaline Stability)
실시예 2의 리간드 L1은 8일의 기간에 걸쳐 그의 알칼리성 안정성에 대해 시험되었다. 이는 25 ℃에서 0.1 M 또는 0.5 M 수산화나트륨으로 처리되었다. LC-MS 분석에 의해 가수분해가 모니터링되었다.
0.5 M NaOH에서, L1의 반감기는 288시간이었다. 0.1 M NaOH에서, 리간드의 어떠한 분해도 검출되지 않았다.
실시예 8: 세포 배양 상청액으로부터 항체의 정제
실험
세포 배양 상청액으로부터 항체를 정제하기 위한 수지의 적합성은 실시예　3과 유사한 마이크로티터 플레이트 크로마토그래피에 의한 충전 방식에서 평가되거나, 또는 정규(regular) 컬럼 크로마토그래피에 의해 평가되었다. 2개의 경우에서, 0.05　mg　ml-1 농도로 숙주 세포 단백질에 첨가된 베바시주마브가 공급물로서 사용되었다. 또한, 숙주 세포 단백질의 크로마토그래피 런(마이크로티터 플레이트 및 컬럼 크로마토그래피) 및 순(pure) 항체 단독의 크로마토그래피 런(오직 마이크로티터 플레이트 크로마토그래피)이 수행되었다. 마이크로티터 플레이트 크로마토그래피에 대해, 25 컬럼 부피가 런(run) 당 주입되었다. 컬럼 크로마토그래피에 대해, 100 컬럼 부피가 주입되었다. 컬럼들은 주입 전과 후에 PBS로 평형화되고 세척되었다. 결합된 단백질은 pH　3.0의 소듐 시트레이트로 용출되었다. 공급물 및 컬럼 용출액 중 단백질 농도는 브래드포드 어세이에 의해 분석되거나, 또는 280 nm에서의 UV-흡광도에 의해 분석되었다.
요약 및 결과
항체는 실시예 3의 수지 L1상에서 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제되었다. 시판되는 수지들 rProtein A 세파로스 FF(rProtein A) 및 마브소르벤트 A2P(A2P)에 대한 크로마토그래피가 비교를 위해 포함되었다. 마이크로티터 플레이트 크로마토그래피에 대해, 동일한 조건하에서 3개의 크로마토그래피 런(run)이 항체, 숙주 세포 단백질 또는 이의 혼합물을 주입한 각 수지에 대해 수행되었다. 컬럼 크로마토그래피에 대해, 단지 2개의 런(run)이 숙주 세포 단백질에 포함된 항체로 수행되거나, 또는 숙주 세포 단백질 단독으로 수행되었다.
혼합물의 크로마토그래피 이후의 작동(operation) '수율'은 혼합물의 주입 후에 용출에 따라 회수된 총 단백질의 질량 mmix,e, 숙주 세포 단백질 단독의 주입 후에 회수된 질량 mHCP,e 및 주입된 항체의 질량 mAb,i로부터 계산되었다.
Figure 112013019055514-pct00183
혼합물의 크로마토그래피 이후의 항체의 '순도'는 혼합물의 주입 후에 용출에 따라 회수된 총 단백질의 질량 mmix,e 및 숙주 세포 단백질의 주입 후에 회수된 질량 mHCP,e 으로부터 계산되었다.
Figure 112013019055514-pct00184
실시예 3의 수지 L1 및 참조 수지에서 크로마토그래피 이후에 획득한 순도 및 수율은 하기 표에 주어진다.
실험 정확도 내에서, 마이크로티터 플레이트 크로마토그래피 이후에 수율은 rProtein A에 대해 100%, L1에 대해 85%, A2P에 대해 12%였다. A2P로부터의 회수율(12%)은 용출시의 온건한 산성(moderate acidic) pH 3.0 때문에 낮았다. 순도는 rProtein A에 대한 크로마토그래피 이후에 가장 높았으며(100%), 뒤이어 수지 L1에 대한 크로마토그래피가 높았다(74%). 순도는 A2P에서의 크로마토그래피 이후에 가장 낮았으며, 단지 32%였다. 컬럼 크로마토그래피 이후의 결과들은 유사한 범위 내에 있었다. 여기서, rProtein A는 97%의 수율과 100%의 순도를 나타내었다. L1은 90%의 수율과 83%의 순도를 나타내었다.
Figure 112013019055514-pct00185
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Claims (15)

  1. 지지체 물질 및 상기 지지체 물질에 공유 결합된 하나 이상의 리간드를 포함하는, 항체 또는 항체 단편의 친화성 정제용, 리간드-치환된 매트릭스로, 상기 리간드는 하기 식 (I)에 의해 표시되는 것을 특징으로 하는 리간드-치환된 매트릭스:
    [식 (I)]
    Figure 112018035831014-pct00186

    식 중,
    L은 리간드가 부착되는 지지체 물질의 연결점이고;
    Sp는 스페이서 기이고;
    v는 0 또는 1이고;
    Am은 아미드 기 -NR1-C(O)-이고, 여기서 NR1이 Ar1에 부착되고 -C(O)-가 Ar2에 부착되거나, 또는 -C(O)-가 Ar1에 부착되고 NR1이 Ar2에 부착되고;
    R1은 수소 또는 C1 내지 C4 알킬이고;
    Ar1은 이가 5- 또는 6-원 치환 또는 비치환 방향족 고리이고, 여기서 치환기는 C1 내지 C4 알콕시, C1 내지 C4 알킬 및 이의 조합으로부터 선택되고;
    Ar2는 (a) 단일 결합을 통해 추가 5- 또는 6-원 방향족 고리에 부착된 5- 또는 6-원 치환 또는 비치환 헤테로환 방향족 고리이거나; 또는 (b) 다환고리계의 부분으로서 추가 5- 또는 6-원 방향족 고리에 융합된 5- 또는 6-원 치환 또는 비치환 헤테로환 방향족 고리이거나; 또는 (c) C1 내지 C4 알킬, C2 내지 C4 알케닐, C2 내지 C4 알키닐, 할로겐, C1 내지 C4 할로알킬, 히드록실-치환된 C1 내지 C4 알킬, C1 내지 C4 알콕시, 히드록실-치환된 C1 내지 C4 알콕시, C1 내지 C4 알킬아미노, C1 내지 C4 알킬티오 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 부착된 5- 또는 6-원 치환 또는 비치환 헤테로환 방향족 고리이고,
    여기서 상기 (a) 및 (b)에서 첫번째 방향족 고리, 두번째 방향족 고리, 또는 첫번째 및 두번째 방향족 고리는 상기 (c)에 기재된 치환기로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 추가로 함유할 수 있음.
  2. 제1항에 있어서,
    Ar1은 페닐렌인 것을 특징으로 하는 리간드-치환된 매트릭스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    C=O 및 NH 기가 서로에 대해 메타 위치에서 Ar1에 결합된 것을 특징으로 하는 리간드-치환된 매트릭스.
  4. 제1항에 있어서,
    Ar2의 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리는 고리 헤테로원자에 인접한 탄소 고리 원자를 통해 C=O 기에 부착된 것을 특징으로 하는 리간드-치환된 매트릭스.
  5. 제1항에 있어서,
    Ar2의 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리는 둘 이상의 질소 원자 또는 하나 이상의 질소 원자 및 산소 원자를 함유하는 것을 특징으로 하는 리간드-치환된 매트릭스.
  6. 제5항에 있어서,
    Ar2의 5- 또는 6-원 헤테로환 방향족 고리는 N-메틸-치환된 피라졸, 피리딘, 이속사졸 또는 옥사디아졸인 것을 특징으로 하는 리간드-치환된 매트릭스.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 지지체 물질은 탄수화물 또는 가교결합된 탄수화물; 합성 폴리머; 무기물; 및 복합물로부터 선택된 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 리간드-치환된 매트릭스.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 IgG 유형의 항체, 또는 Fc 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 리간드-치환된 매트릭스.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 정제는 리간드-치환된 매트릭스의 리간드를 항체 또는 융합 단백질의 Fc 단편 또는 도메인에 결합시킴으로써 달성되는 것을 특징으로 하는 리간드-치환된 매트릭스.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 Fc 단편 또는 도메인 또는 항체는 인간 IgG 또는 인간 기원의 폴리클로날 또는 모노클로날 IgG에 속하는 것을 특징으로 하는 리간드-치환된 매트릭스.
  11. 제1항에 따른 리간드-치환된 매트릭스의 제조방법으로서,
    제1항에서 정의된 식 (I)의 리간드가 지지체 물질에 부착되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 단백질의 친화성 정제를 위한 방법으로서,
    정제하려는 단백질을 제1항에서 정의된 리간드-치환된 매트릭스와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법으로,
    상기 단백질은 항체 또는 Fc 융합 단백질이고, 상기 리간드는 항체 또는 Fc 융합 단백질의 Fc 영역에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 하기 식 (II)에 의해 표시되는 리간드:
    [식 (II)]
    Figure 112019009982260-pct00187

    식 중,
    Sp, Ar1, Ar2 및 Am은 제1항에서 정의된 의미를 가짐.
  14. 삭제
  15. 삭제
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