KR102004668B1 - 아드레노메둘린의 폴리에틸렌 글리콜 기반 전구약물 및 그의 용도 - Google Patents

아드레노메둘린의 폴리에틸렌 글리콜 기반 전구약물 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 아드레노메둘린의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기반 전구약물, 그의 제조 방법, 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 그의 용도, 및 질환, 특히 심혈관, 부종 및/또는 염증성 질병의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

아드레노메둘린의 폴리에틸렌 글리콜 기반 전구약물 및 그의 용도{POLYETHYLENE GLYCOL BASED PRODRUG OF ADRENOMEDULLIN AND USE THEREOF}
본 발명은 신규 아드레노메둘린의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기반 전구약물, 그의 제조 방법, 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 그의 용도, 및 질환, 특히 심혈관, 부종 및/또는 염증성 질병의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
52 아미노산 펩티드 호르몬 아드레노메둘린 (ADM)은 부신, 폐, 신장, 심근 및 기타 기관에서 생산된다. ADM의 혈장 수준은 피코몰 아래 범위이다. ADM은 펩티드의 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP) 패밀리 일원이고, CRLR 및 RAMP 2 또는 3 (칼시토닌-수용체-유사 수용체 및 수용체 활성 변경 단백질 2 또는 3)으로 이루어진 헤테로다이머 G-단백질 커플링된 수용체에 결합한다. ADM 수용체가 활성화되면 이 수용체를 가진 세포에서 아데노신 3',5'-사이클릭 모노포스페이트 (cAMP)의 세포내 상승이 일어난다. ADM 수용체는 내피 세포를 포함하여 거의 모든 기관에서 상이한 세포 타입 상에 존재한다. ADM은 중성 엔도펩티다제에 의해 대사되며, 대개 ADM-수용체가 고 발현되는 폐에서 청소된다 [참조예: Gibbons C., Dackor R., Dunworth W., Fritz-Six K., Caron K.M., Mol Endocrinol 21(4),783-796 (2007)].
문헌으로부터의 실험 데이터는 ADM이 혈압 조절, 기관지확장, 신기능, 호르몬 분비, 세포 성장, 분화, 신경전달, 및 면역 반응 조절을 포함하는 각종 기능적 역할에 관여함을 제안한다. 또한, ADM은 내피 세포의 증식 및 재생동안 자가분비 인자로서 중요한 역할을 한다 [참조: Garcia M.A., Martin-Santamaria S., de Pascual-Teresa B., Ramos A., Julian M., Martinez A., Expert Opin Ther Targets, 10(2), 303-317 (2006)].
문헌에 ADM이 온전한 내피 배리어 기능에 없어서는 안되고 생리적 초과 수준으로의 ADM 투여가 동물 실험시 패혈증, 급성 폐 손상 및 장 염증을 포함한 각종 염증성 상태에서 강력한 항-부종 및 항-염증성 기능을 발휘함을 보여주는 광범한 증거가 있다 [참조: Temmesfeld-Wollbruek B., Hocke A.C., Suttorp N., Hippenstiel S., Thromb Haemost; 98, 944-951 (2007)].
ADM의 임상 실험은 지금까지 폐고혈압, 고혈압, 심부전 및 급성 심근 경색과 같이 측정가능한 혈류역학적 종점을 가지는 심혈관 징후에서 수행되었다. ADM은 몇몇 연구에서 상기 언급된 상태로 고통받는 환자에게서 혈류역학적 효과를 나타내었다. 그러나, 효과는 겨우 단기 지속성이며, 투여가 끝나면 바로 중지된다. 이러한 조사결과는 ADM의 알려진 약동학 프로파일과 잘 상호관련되었다. 약력학적 효과는 다른 것중에서도 전신 및 폐동맥 혈압 저하 및 심박출량 증가를 포함하였다 [Troughton R.W., Lewis L.K., Yandle T.G., Richards A.M., Nicholls M.G., Hypersion, 36(4), 588-93 (2000); Nagaya N., Kangawa K., Peptides,. 25(11), 2013-8 (2004); Kataoka Y., Miyazaki S., Yasuda S., Nagaya N., Noguchi T., Yamada N., Morii I., Kawamura A., Doi K., Miyatake K., Tomoike H., Kangawa K., J Cardiovasc Pharmacol, 56(4), 413-9 (2010)].
요약하면, 동물에 있어서 수많은 실험 데이터 및 인간에게서 첫 임상 실험으로부터의 증거에 기초해, ADM의 생리초과 수준으로의 상승이 인간 및 동물에서 각종 질환 상태를 치료하기 위한 목표 메카니즘으로서 고려될 수 있을 것이다. 그러나, ADM을 치료제로 사용하는데 주요 제한은 대부분의 잠재적 징후에 그의 사용을 불가능하게 하는 지속적인 주입 치료의 불편한 적용성과 ADM의 볼러스 투여로 초래할 수 있는 저혈압과 관련한 잠재적으로 제한된 안전 한계이다.
본 발명의 목적은 질환, 특히 심혈관, 부종 및 염증성 질병의 치료에 사용될 수 있는 신규 화합물을 제공하는 것이다.
치료적으로 활성인 많은 펩티드 또는 단백질은 생체내에서 높은 클리어런스(high clearance)를 겪고 있다. 마크로분자의 사용을 포함하여 이러한 약물을 주사가능한 데포로 형성하기 위한 다수의 접근법이 존재한다.
비공유적으로 결합된 상태로 약물 분자를 함유하는 폴리머 매트릭스는 주지이다. 이들은 또한 하이드로겔, 마이크로 입자 또는 미셸로서 주입가능하다. 이러한 약물 제품의 방출 키네틱은 환자간 변동이 커 매우 신뢰할 수 없다. 상기 폴리머의 생산은 민감한 약물 물질에 해를 입힐 수 있거나, 그의 분해동안 폴리머와 부반응을 일으킬 수 있다 (D.H. Lee et al., J. Contr. Rel., 2003, 92, 291-299).
그의 용해도를 증가시키고, 면역원성을 감소시키고, 신장 클리어런스 감소로 반감기를 증가시키기 위해 펩티드 또는 단백질을 영구 페길화 (PEGylation) 하는 것은 1980년 대 초부터 잘 알려진 개념이다 (Caliceti P.,Veronese F.M., Adv. Drug Deliv. Rev.2003, 55, 1261-1277). 다수의 약물의 경우, 이는 성공적으로 사용되어 왔으나, 많은 예에서 페길화는 이러한 개념이 더 이상 적합치 않은 정도로 약물 물질의 효능을 감소시킨다 (T. Peleg-Shulman et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 4897-4904).
적합한 대안은 폴리머 기반 전구약물이다. IUPAC에 의한 전구약물에 대한 현재의 정의는 다음 조건을 말한다 (국제순수응용화학연합 및 국제생화학연합: GLOSSARY OF TERMS USED IN MEDICINAL CHEMISTRY (Recommendations 1998); in Pure & Appl. Chem. Vol 70, No. 5, 1998, p. 1129-1143):
전구약물: 전구약물은 그의 약학상 효과를 나타내기 전에 생체내 변화를 거치는 임의의 화합물이다. 따라서, 전구약물은 모 분자에서 바람직하지 않은 성질들을 변경 또는 없애기 위해 일시적으로 특수 비독성 보호기를 함유하는 약물로서 비춰질 수 있다.
담체-결합된 전구약물 (담체 전구약물): 담체-결합된 전구약물은 물리화학적 또는 약리역학적 성질을 개선하고 보통 가수분해 절단에 의해 생체내에서 용이하게 제거될 수 있는 주어진 활성 물질과 일시 담체 그룹의 임시 연결을 함유하는 전구약물이다.
캐스케이드 전구약물: 캐스케이드 전구약물은 담체 그룹의 절단이 활성 그룹의 탈마스킹 후에만 효과적이 되는 전구약물이다.
PEG-기반 담체 전구약물의 예는 다수가 존재하는데, 이들의 대부분은 활성 약물과 담체간 링커의 효소 활성화를 필요로 하며, 주로 효소 가수분해로 개시된다. 에스테르는 생체내에서 아주 쉽게 비예측적으로 절단되기 때문에, 담체 전구약물에 대한 직접 에스테르 링커는 그의 사용성에 제한을 가지게 된다 (J. Rautio et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7 255-270).
보통 사용되는 대안적인 접근은 펩티드 또는 단백질중 아민 작용기에 부착된 캐스케이드 링커이다. 링커 캐스케이드시, 마스킹 그룹은 캐스케이드에서 율속 단계로서 제거되어야만 한다. 이는 링커를 제2 위치에서 분해되도록 활성화하여 펩티드 또는 단백질을 방출한다. 보통 마스킹 그룹은 효소 메카니즘에 의해 제거될 수 있다 (R.B.Greenwald 등의 WO2002/089789, Greenwald 등의 J. Med. Chem. 1999, 42, 3657-3667, F.M.H. DeGroot 등의 WO2002/083180 및 WO2004/043493, 및 D. Shabat 등의 WO2004/019993).
효소 활성화에 의존하지 않는 대안은 U. Hersel 등에 의한 WO2005/099768에서의 개념이다. 그의 방법에서는, 페놀 상의 마스킹 그룹이 내부 친핵체의 공격에 의해 순전히 pH 의존 방식으로 제거된다. 이는 링커가 추가 분해되도록 활성화한다.
U. Hersel 등에 의한 WO2005/099768에서 언급된 바와 같이, Greenwald, DeGroot 및 Shabat에 의해 기술된 상기 언급된 전구약물 시스템에서의 단점은 임시 결합 절단 후 퀴논 메타이드 등의 잠재적으로 독성인 방향족 소분자 부산물의 방출이다. 잠재적으로 독성인 실체는 약물과 1:1 화학량론으로 방출되며, 생체내에서 높은 농도로 추정될 수 있다. 동일한 문제가 Hersel 등에 의한 시스템에도 마찬가지로 적용된다.
소 유기 분자에 대해 많은 상이한 전구약물 접근법이 존재한다 (J. Rautio et al., Nature Reviews Drug 디scovery, 2008, 7 255-270). 그의 마스킹 그룹에 대한 방출 메카니즘으로서 U. Hersel 등이 사용한 접근법은 1980년 대 후반부터 소분자의 페놀 그룹에 대한 전구약물 접근법으로서 이용되어 오고 있다 (W.S. Saari in EP 0296 811 and W.S. Saari et al., J. Med. Chem. 1990, Vol 33, No 1, p 97-101).
대안적인 아민 기반 전구약물 시스템은 캐스케이딩 전구약물으로서 비스-하이드록시에틸 글리신의 저속 가수분해에 기초한다. 비스-하이드록시에틸 글리신의 하이드록시 그룹은 에스테라제에 의해 가수분해가 쉼게 되는 에스테르로 마스킹된다 (R. Greenwald et al., J. Med. Chem. 2004, 47, 726-734 and D. Vetter et al. WO 2006/136586).
이미지화제 및 또한 치료제로서 사용하기 위한 표지 아드레노메둘린 유도체가 공지되었다 (J. Depuis et al. in CA 2567478 및 WO 2008/138141). 이들 ADM 유도체에서, 방사성 동위원소와 결합할 수 있는 분자 구조와 같은 복합화 케이지는 직접적으로 또는 잠재적으로 또한 짧은 PEG 스페이서를 포함하는 스페이서 단위를 통해 ADM의 N 말단에 부착된다. 방사성 분자의 표적 전달로 이들 약물의 진단 또는 치료 가치가 올라간다.
모두 마스킹 아민 작용기를 기초로 하고 있는 상술된 전구약물 접근법과 달리, 본 발명은 ADM중 티로신의 페놀 그룹을 마스킹하는 것에 기초한다. 이 페놀 그룹 상의 카바메이트의 내부 친핵체 보조 절단에 기초한 담체-결합된 전구약물이 사용된다. 상술된 다른 전구약물류에 있어서의 주요 이점은 링커 분해 산물인 담체에 영구 부착된 사이클릭 우레아가 독물학상 무해하다는 것이다. 또한, 전구약물의 분해는 환자간 절단 키네틱의 변동성을 높일 수 있는 효소 메카니즘에 의존하지 않는다. 절단 메카니즘은 산성 pH에서 프로톤화되는 내부 아민이 티로신에 기반한 페놀 카바메이트를 공격하는 친핵체로서 작용하기 위해 더 높은 (중성) pH에서 활성되기 때문에, pH에만 의존성이다.
본 발명과 관련하여, 이하에 ADM에 비해 약학 작용의 기간이 연장되고 이러한 특이적 작용 메카니즘에 기초해 - 비경구 투여 후 - 생체내에서 각각 내피 배리어 기능 안정화, 및 혈압 감소와 같은 지속적인 항-염증성 및 혈류역학적 효과를 발휘하는 서방성 ADM-전구약물으로서 작용하는 화합물이 기술된다.
도 1: ADM 또는 비히클의 피하 투여 후 원격 계측 정상 혈압 암컷 위스타 래트에서 기록된 평균 동맥 혈압 (MABP)의 24 시간 프로파일 (점선).
도 2: 실시예 1 또는 비히클의 피하 투여 후 원격 계측 정상 혈압 암컷 위스타 래트에서 기록된 평균 동맥 혈압 (MABP)의 24 시간 프로파일 (점선).
본 발명은 화학식 (I)의 화합물 및 그의 염, 그의 용매화물 및 그의 염의 용매화물을 제공한다:
Figure 112018094277901-pat00001
상기 식에서,
n은 0, 1, 2 또는 3의 수를 나타내고,
R1은 수소, 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필을 나타내고,
R2는 메톡시-그룹으로 말단 캡핑된 선형 또는 분지형 PEG 20kDa 내지 80kDa를 나타낸다.
본 발명에 따른 화합물은 화학식 (I)의 화합물, 및 그의 염, 그의 용매화물 및 염의 용매화물, 하기 언급되는 화학식들 중 화학식 (I)에 포함되는 화합물, 및 그의 염, 용매화물 및 염의 용매화물, 및 화학식 (I)에 포함되고 수행 실시예로서 하기 언급되는 화합물, 및 그의 염, 용매화물 및 염의 용매화물이며, 여기서 화학식 (I)에 포함되고 하기에 언급되는 화합물은 이미 염, 용매화물 및 염의 용매화물이 아니다.
본 발명에 따른 화합물은 이들의 구조에 따라 입체이성체 형태 (거울상이성체, 부분입체이성체)로 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 거울상이성체 또는 부분입체이성체, 및 이들의 특정 혼합물을 포함한다. 입체이성체적으로 균일한 성분은 공지된 방식으로 상기 거울상이성체 및/또는 부분입체이성체의 혼합물로부터 단리될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물이 호변이성체 형태로 존재할 수 있는 경우, 본 발명은 모든 호변이성체 형태를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 바람직한 염은 본 발명에 따른 화합물의 생리적으로 허용가능한 염이다. 그 자체가 제약 용도에 적합하지는 않지만, 예를 들어, 본 발명에 따른 화합물의 단리 또는 정제에 사용될 수 있는 염이 또한 포함된다.
본 발명에 따른 화합물의 생리적으로 허용가능한 염은 무기산, 카복실산 및 설폰산의 산 부가염, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 나프탈렌디설폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 락트산, 타르타르산, 말산, 시트르산, 푸마르산, 말레산 및 벤조산의 염을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물의 생리적으로 허용가능한 염은 또한, 통상적인 염기의 염, 예컨대 예로써 및 바람직하게는, 알칼리 금속 염 (예를 들어, 나트륨 및 칼륨 염), 알칼리 토금속 염 (예를 들어, 칼슘 및 마그네슘 염), 및 암모니아 또는 1개 내지 16개의 C 원자를 갖는 유기 아민, 예컨대 예로써 및 바람직하게는 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 에틸디이소프로필아민, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디시클로헥실아민, 디메틸아미노에탄올, 프로카인, 디벤질아민, N-메틸모르폴린, 아르기닌, 리신, 에틸렌디아민 및 N-메틸피페리딘으로부터 유도된 암모늄 염을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 용매화물은 용매 분자와의 배위에 의해 고체 또는 액체 상태의 착물을 형성하는 본 발명에 따른 화합물의 형태로서 기재된다. 수화물은 배위가 물과 함께 일어나는 특정 형태의 용매화물이다. 수화물이 본 발명의 맥락에서 바람직한 용매화물이다.
본 발명의 맥락에서 R2에서 언급된 "메톡시-그룹으로 말단 캡핑된" 이란 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 말단에서 메톡시 그룹으로 치환되었고 산소에 결합되지 않은 것, 즉 - PEG 40kDa-OMe임을 의미한다.
n은 1 또는 2의 수를 나타내고,
R1은 수소 또는 메틸을 나타내고
R2는 메톡시-그룹으로 말단 캡핑된 선형 PEG 40kDa를 나타내는 화학식 (I)의 화합물이 바람직하다.
n이 1 또는 2의 수를 나타내고,
R1은 수소를 나타내고,
R2는 메톡시-그룹으로 말단 캡핑된 선형 PEG 40kDa를 나타내는 화학식 (I)의 화합물이 또한 바람직하다.
n이 1의 수를 나타내는 화학식 (I)의 화합물이 또한 바람직하다.
R1이 수소를 나타내는 화학식 (I)의 화합물이 또한 바람직하다.
NHR1 치환체가 결합된 탄소 원자가 S 배열을 가지는 화학식 (I)의 화합물이 또한 바람직하다.
R2가 메톡시-그룹으로 말단 캡핑된 선형 PEG　40kDa를 나타내는 화학식 (I)의 화합물이 또한 바람직하다.
하기 화학식 (Ia)의 구조를 가지는 화학식 (I)의 화합물 및 그의 염, 그의 용매화물 및 그의 염의 용매화물이 또한 바람직하다:
Figure 112018094277901-pat00002
상기 식에서, n, R1 및 R2는 각각 상기 정의된 바와 같다.
래디칼들의 특정 조합 또는 바람직한 조합에서 주어진 특정 래디칼 정의는 서술된 래디칼들의 특정 조합과 상관없이 임의의 다른 조합의 래디칼 정의로 또한 대체된다.
상기 언급된 바람직한 범위의 2 이상의 조합이 매우 특히 바람직하다.
본 발명은 또한 화학식 (II)의 화합물을 화학식 (III)의 화합물과 반응시키는 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 염, 그의 용매화물 또는 그의 염의 용매화물의 제조방법을 제공한다:
Figure 112018094277901-pat00003
Figure 112018094277901-pat00004
상기 식에서, n, R1 및 R2는 각각 상기 정의된 바와 같다.
반응은 일반적으로 바람직하게는 0℃ 내지 50℃의 온도 범위 및 표준 압력하에 불활성 용매에서 수행된다.
불활성 용매는, 예를 들어, pH 3 내지 5의 시트레이트 완충액, 글리신-하이드로클로라이드 완충액, 프탈레이트 완충액 또는 아세테이트 완충액이고, pH 4의 시트레이트 완충액이 바람직하다.
화학식 (III)의 화합물은 공지되었거나, 적질한 출발 화합물로부터 공지 방법으로 합성될 수 있다.
화학식 (II)의 화합물은 공지되었거나, 또는 화학식 (IV)의 화합물을 제1 단계에서 화학식 (V)의 화합물과 반응시키고, 제2 단계에서 산과 반응시켜 제조할 수 있다:
Figure 112018094277901-pat00005
Figure 112018094277901-pat00006
상기 식에서, n 및 R1은 각각 상기 정의된 바와 같다.
제1 단계에서의 반응은 일반적으로 탈수제의 존재하, 임의로 염기의 존재하에, 바람직하게는 실온 내지 70℃의 온도 범위 및 표준 압력하에서 불활성 용매에서 수행된다.
불활성 용매는, 예를 들어, 할로탄화수소, 예컨대 디클로로메탄, 트리클로로메탄 또는 1,2-디클로로에탄, 에테르, 예컨대 디옥산, 테트라하이드로푸란 또는 1,2-디메톡시에탄, 또는 다른 용매, 예컨대 아세톤, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 2-부타논 또는 아세토니트릴이다. 용매의 혼합물도 마찬가지로 사용될 수 있다. 디메틸포름아미드가 바람직하다.
본 발명과 관련하여 적합한 탈수제는, 예를 들어, 카보디이미드, 예를 들어 N,N'-디에틸-, N,N'-디프로필-, N,N'-디이소프로필-, N,N'-디사이클로헥실카보디이미드, N-(3-디메틸아미노이소프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC), N-사이클로헥실카보디이미드-N'-프로필옥시메틸폴리스티렌 (PS-카보디이미드), 또는 카보닐 화합물, 예컨대 카보닐디이미다졸, 또는 1,2-옥사졸륨 화합물, 예컨대 2-에틸-5-페닐-1,2-옥사졸륨 3-설페이트 또는 2-tert-부틸-5-메틸이속사졸륨 퍼클로레이트, 또는 아실아미노 화합물, 예컨대 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린, 또는 프로판포스폰산 무수물, 또는 이소부틸 클로로포르메이트, 또는 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스포릴 클로라이드 또는 벤조트리아졸릴옥시트리(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 또는 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), 벤조트리아졸-1-일-N-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), 2-(2-옥소-1-(2H)-피리딜)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TPTU) 또는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU), 또는 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt), 또는 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP), 또는 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PYBOP), 또는 N-하이드록시숙신이미드, 또는 이들과 염기의 혼합물이다.
염기는, 예를 들어, 알칼리 금속 탄산염, 예를 들어 탄산나트륨 또는 탄산칼륨, 또는 탄산수소나트륨 또는 탄산수소칼륨, 또는 유기 염기, 예컨대 트리알킬아민, 예를 들어 트리에틸아민, N-메틸모르폴린, N-메틸피페리딘, 4-디메틸아미노피리딘 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, N,N-디이소프로필에틸아민이 바람직하다.
바람직하게는, 축합은 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재하에 TBTU를 사용하여 수행된다.
제2 단계 반응은 임의로, 바람직하게는 실온 내지 60℃의 온도 범위 및 표준 압력하에 불활성 용매에서 수행된다.
불활성 용매는, 예를 들어, 할로탄화수소, 예컨대 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 사염화탄소 또는 1,2-디클로로에탄, 또는 에테르, 예컨대 테트라하이드로푸란 또는 디옥산이고, 디클로로메탄이 바람직하다.
산은, 예를 들어, 트리플루오로아세트산 또는 디옥산중 염화수소이고, 농축 트리플루오로아세트산이 바람직하다. 농축 트리플루오로아세트산은 물, 페놀, 티오아니솔 및 1,2-에탄디올 등의 스캐빈저 (scavanger)를 첨가하여 사용될 수 있다. 1 내지 5%의 이들 스캐빈저 각각이 바람직하다.
화학식 (V)의 화합물은 공지되었거나, 적질한 출발 화합물로부터 공지 방법으로 합성될 수 있다 (실시예 14A).
화학식 (IV)의 화합물은 공지되었거나, 또는 화학식 (VI)의 화합물을 팔라듐(0) 공급원 및 환원제와 반응시켜 제조할 수 있다:
Figure 112018094277901-pat00007
상기 식에서, n 및 R1은 각각 상기 정의된 바와 같다.
반응은 일반적으로 임의로, 약염기의 존재하에, 바람직하게는 0℃ 내지 50℃의 온도 범위 및 표준 압력하에서 불활성 용매중에 수행된다.
불활성 용매는, 예를 들어, 할로탄화수소, 예컨대 디클로로메탄, 트리클로로메탄 또는 1,2-디클로로에탄, 에테르, 예컨대 디옥산, 테트라하이드로푸란 또는 1,2-디메톡시에탄, 또는 다른 용매, 예컨대 아세톤, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 2-부타논 또는 아세토니트릴이다. 용매의 혼합물도 마찬가지로 사용될 수 있다. 테트라하이드로푸란이 바람직하다.
팔라듐(0) 공급원은, 예를 들어, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0) 또는 반응동안 동소에서 팔라듐(0)으로 환원되는 팔라듐(II) 공급원이고, 테트라키스(트리페닐포스핀)-팔라듐(0)이 바람직하다.
환원제는, 예를 들어, 포름산 또는 트리에틸 실란이고, 포름산이 바람직하다.
염기는, 예를 들어, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 또는 인산칼륨 용액이고, 트리에틸아민이 바람직하다.
화학식 (VI)의 화합물은 공지되었거나, 또는 화학식 (VII)의 화합물을 화학식 (VIII)의 화합물과 반응시켜 제조할 수 있다:
Figure 112018094277901-pat00008
Figure 112018094277901-pat00009
상기 식에서, n 및 R1은 각각 상기 정의된 바와 같다.
반응은 일반적으로 탈수제의 존재하, 임의로 염기의 존재하, 바람직하게는 실온 내지 70℃의 온도 범위 및 표준 압력하에 불활성 용매에서 수행된다.
불활성 용매는, 예를 들어, 할로탄화수소, 예컨대 디클로로메탄, 트리클로로메탄 또는 1,2-디클로로에탄, 에테르, 예컨대 디옥산, 테트라하이드로푸란 또는 1,2-디메톡시에탄, 또는 다른 용매, 예컨대 아세톤, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 2-부타논 또는 아세토니트릴이다. 용매의 혼합물도 마찬가지로 사용될 수 있다. 디클로로메탄이 바람직하다.
본 발명과 관련하여 적합한 탈수제는, 예를 들어, 카보디이미드, 예를 들어 N,N'-디에틸-, N,N'-디프로필-, N,N'-디이소프로필-, N,N'-디사이클로헥실카보디이미드, N-(3-디메틸아미노이소프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC), N-사이클로헥실카보디이미드-N'-프로필옥시메틸폴리스티렌 (PS-카보디이미드), 또는 카보닐 화합물, 예컨대 카보닐디이미다졸, 또는 1,2-옥사졸륨 화합물, 예컨대 2-에틸-5-페닐-1,2-옥사졸륨 3-설페이트 또는 2-tert-부틸-5-메틸이속사졸륨 퍼클로레이트, 또는 아실아미노 화합물, 예컨대 2-에톡시-1-에톡시카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린, 또는 프로판포스폰산 무수물, 또는 이소부틸 클로로포르메이트, 또는 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스포릴 클로라이드 또는 벤조트리아졸릴옥시 트리(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 또는 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), 벤조트리아졸-1-일-N-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), 2-(2-옥소-1-(2H)-피리딜)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TPTU) 또는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU), 또는 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt), 또는 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP), 또는 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로-포스페이트 (PYBOP), 또는 N-하이드록시숙신이미드, 또는 이들과 염기의 혼합물이다.
염기는, 예를 들어, 알칼리 금속 탄산염, 예를 들어 탄산나트륨 또는 탄산칼륨, 또는 탄산수소나트륨 또는 탄산수소칼륨, 또는 유기 염기, 예컨대 트리알킬아민, 예를 들어 트리에틸아민, N-메틸모르폴린, N-메틸피페리딘, 4-디메틸아미노피리딘 또는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, N,N-디이소프로필에틸아민이 바람직하다.
바람직하게는, 축합은 N,N-디이소프로필에틸아민의 존재하에 HATU를 사용하여 수행된다.
화학식 (VII) 및 (VIII)의 화합물은 공지되었거나, 적질한 출발 화합물로부터 공지 방법으로 합성될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 다음 합성 반응식으로 나타내어질 수 있다:
반응식 1
Figure 112018094277901-pat00010
본 발명에 따른 화합물은 예기치 않은 유용한 약학적 활성 스펙트럼을 나타낸다.
따라서, 이들은 인간 및 동물에서 질환의 치료 및/또는 예방용 약제로서 사용하기에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 특이적 아드레노메둘린 (ADM) 방출 전구약물로서 특징지어 진다.
본 발명은 추가로 질병, 특히 심혈관, 부종 및/또는 염증성 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명에서 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환, 장애, 병태 또는 상태, 그의 발생 및/또는 진행 및/또는 그의 증상을 억제, 지연, 경감, 완화, 저지, 감소시키거나, 퇴행을 야기하는 것을 포함한다. 용어 "예방" 또는 "예방하는"은 질환, 장애, 병태 또는 상태, 그의 발생 및/또는 진행 및/또는 그의 증상을 가지거나, 이에 걸리거나, 또는 경험의 위험을 감소시키는 것을 포함한다. 용어 "예방"은 방지를 포함한다. 질환, 장애, 병태 또는 상태의 치료 또는 예방은 부분적 또는 완전한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 그의 약학적 성질에 기초해, 심혈관 질환, 특히 심부전, 특히 만성 및 급성 심부전, 확장기 및 수축기 (울혈성) 심부전, 급성 비대상성 심부전, 심장 기능부전, 관상동맥 심장 질환, 협심증, 심근 경색, 허혈성 재관류 손상, 허혈성 및 출혈성 뇌졸중, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 고혈압, 특히 본태성 고혈압, 악성 본태성 고혈압, 이차성 고혈압, 신혈관성 고혈압 및 신장 및 내분비 질병 속발성 고혈압, 고혈압성 심장 질환, 고혈압성 신장 질환, 폐고혈압, 특히 이차성 폐고혈압, 급성 폐심증이 있거나 없는 폐색전을 동반하는 폐고혈압, 원발성 폐고혈압, 및 말초 동맥 폐색증 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 고혈압 (전자간증)이 있거나 없는 임신성 [임신 유발] 부종 및 단백뇨의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 폐기관 장애, 예컨대 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 급성 및 만성 폐부종, 앨러지성 폐포염 및 유기 분진 및 진균 입자, 방선균 또는 다른 기원의 흡입에 의한 폐렴, 급성 화학성 기관지염, 급성 및 만성 화학성 폐부종 (예를 들면, 포스겐, 산화질소 흡입후), 신경성 폐부종, 방사선에 의한 급성 및 만성 폐징후, 급성 및 만성 간질성 폐 질병 (예를 들어 블레오마이신 치료에 이은 약물-유발 간질성 폐기관 장애가 예시되나 이에 한정되지 않음), 성인 또는 신생아를 포함한 소아에서 급성 폐 손상/급성 호흡 장애 증후군 (ALI/ARDS), 폐렴 및 패혈증에 속발하는 ALI/ARDS, 흡입성에 속발하는 흡입성 폐렴 및 ALI/ARDS (예를 들어 위 내용물 역류에 의한 흡입성 폐렴이 예시되나 이에 한정되지 않음), 담배 연기 흡입에 속발하는 ALI/ARDS, 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI), 수술, 외상 또는 화상후 ALI/ARDS 또는 급성 폐 기능장애, 인공호흡기 유발 폐 손상 (VILI), 아편 흡입후 폐 손상, 폐 섬유증, 및 고산병의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 만성 신장 질환 (단계 1-5), 신부전, 당뇨병성 신장증, 고혈압성 만성 신장 질환, 사구체 신염, 급속 진행성 및 만성 신 증후군, 비특이적 신 증후군, 신장 증후군, 유전적 신증, 급성 및 만성 관상-간질성 신염, 급성 신장 손상, 급성 신장 부전증, 외상후 신장 부전증, 외상성 및 수술후 신장 손상, 심신 증후군, 및 신장 이식 보호 및 기능 향상의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
화합물은 추가로 진성 당뇨병 및 그의 연속 증상, 예컨대 당뇨병성 대혈관- 및 미소혈관 장애, 당뇨병성 신장증 및 신경 장애의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 그밖에 예컨대 바이러스성 및 박테리아성 수막염 및 뇌염 (예를 들어 조스터 (Zoster) 뇌염), 뇌 손상, 뇌 및 척수의 원발성 또는 속발성 [전이] 악성 신생물, 신경근염 및 다발성신경근염, 귈랑바레 (Guillain-Barre) 증후군 [급성 (후-)감염성 다발성신경염, 밀러 피셔 (Miller Fisher) 증후군], 근위축성 측색 경화증 [진행성 척수성 근위축], 파킨슨 질환, 급성 및 만성 다발성신경병증, 통증, 뇌수종, 알츠하이머 질환, 퇴행성 신경계 질환 및 중추 신경계의 탈수 질환, 예컨대 다발성 경화증이 예시되나 이로 제한되지 않는 중추 및 말초 신경계 장애의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 그외에도 문맥압항진 및 간 섬유증 [간경변] 및 그의 후유증, 예컨대 식도 정맥류 및 복수의 치료 및/또는 예방, 악성 종양 또는 염증에 속발하는 흉수의 치료 및/또는 예방 및 림프 부종 및 정맥류에 속발하는 부종의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 위장관의 염증성 질병, 예컨대 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 및 장의 독성 및 관다발 질병의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 패혈증, 패혈성 쇼크, 비감염성 기원의 전신 염증성 반응 증후군 (SIRS), 기관 기능장애 또는 다기관 부전증 (MOF)이 있는 출혈성 쇼크, 패혈증 또는 SIRS, 외상성 쇼크, 독성 쇼크, 아나필락시스 쇼크, 두드러기, 곤충 쏘임 및 자상-관련 앨러지, 맥관신경성 부종 [거대 두드러기, 퀸케 (Quincke's) 부종], 급성 후두염 및 기관염, 및 급성 폐쇄성 후두염 [크루프] 및 후두개염의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
화합물은 또한 다발성 관절염, 홍반성 낭창, 경피증, 지반병 및 맥관염을 예로 들 수 있으나 이들에 한정되지는 않는 류마티스 형태의 질환 및 자가면역 질환으로 계속되는 다른 질환 형태의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 안내압항진 (녹내장), 당뇨병성 망막증 및 황반 부종의 치료에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 허혈의 수술-관련 상태 및 외과적 처치, 특히 인공 심폐 장치를 사용한 심장 시술 (예를 들면, 바이패스 수술, 심장 판막 이식), 경동맥 시술, 대동맥 시술 및 기계공 또는 스컬캡 관통에 의한 시술 후 그의 연속 증상의 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다.
화합물은 또한 외과 수술의 경우 상처 치유를 촉진하고 회복 시간을 단축하기 위해서 일반적인 치료 및/또는 예방에 적합하다. 이들은 그밖에도 상처 치유를 촉진하는데 적합하다.
화합물은 또한 골다공증, 골연화증 및 부갑상선기능항진-관련 골 장애가 예시되나 이로 한정되지 않는 골밀도 및 구조 장애의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
화합물은 또한 성 기능장애, 특히 남성 발기부전의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
바람직한 화합물은 심부전, 관상 동맥 심장 질환, 허혈성 및/또는 출혈성 뇌졸중, 고혈압, 폐고혈압, 말초 동맥 폐색성 질환, 전자간증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 급성 및/또는 만성 폐부종, 유기 분진 및 진균 입자렴, 방선균 또는 다른 기원 흡입에 의한 앨러지성 폐포염 및/또는 폐, 및/또는 급성 화학성 기관지염, 급성 및/또는 만성 화학성 폐부종, 신경성 폐부종, 방사선에 의한 급성 및/또는 만성 폐징후, 급성 및/또는 만성 간질성 폐 질병, 성인 또는 신생아를 포함한 소아에서 급성 폐 손상/급성 호흡 장애 증후군 (ALI/ARDS), 폐렴 및 패혈증에 속발하는 ALI/ARDS, 흡입성 폐렴 및 흡입성에 속발하는 ALI/ARDS, 담배 연기 흡입에 속발하는 ALI/ARDS, 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI), 수술, 외상 및/또는 화상후 ALI/ARDS 및/또는 급성 폐 기능장애, 및/또는 인공호흡기 유발 폐 손상 (VILI), 아편 흡입후 폐 손상, 폐 섬유증, 고산병, 만성 신장 질환, 사구체 신염, 급성 신장 손상, 심신 증후군, 림프부종, 염증성 장 질환, 패혈증, 패혈성 쇼크, 비감염성 기원의 전신 염증성 반응 증후군 (SIRS), 아나필락시스 쇼크, 염증성 장 질환 및/또는 두드러기의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
더욱 바람직한 화합물은 심부전, 고혈압, 폐고혈압, 천식, 급성 및/또는 만성 화학성 폐부종, 성인 또는 신생아를 포함한 소아에서 급성 폐 손상/급성 호흡 장애 증후군 (ALI/ARDS), 폐렴 및 패혈증에 속발하는 ALI/ARDS, 흡입성 폐렴 및 흡입에 속발하는 ALI/ARDS, 담배 연기 흡입에 속발하는 ALI/ARDS, 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI), 수술, 외상 및/또는 화상후 ALI/ARDS 및/또는 급성 폐 기능장애, 및/또는 인공호흡기 유발 폐 손상 (VILI), 아편 흡입후 폐 손상, 패혈증, 패혈성 쇼크, 비감염성 기원의 전신 염증성 반응 증후군 (SIRS), 아나필락시스 쇼크, 염증성 장 질환 및/또는 두드러기의 치료 및/또는 예방에 적합하다.
본 발명은 또한 질병, 특히 상기 언급된 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 질병, 특히 상기 언급된 질병의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 활성량의 본 발명에 따른 화합물을 사용하여 질병, 특히 상기 언급된 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 특히 상기 언급된 질병의 치료 및/또는 예방을 위한, 본 발명에 따른 화합물 및 하나 이상의 추가의 활성 성분을 포함하는 약제를 제공한다. 예시적인 바람직한 활성 성분의 조합물은 다음과 같다:
ACE 저해제, 안지오텐신 수용체 길항제, 베타-2 수용체 작용제, 포스포디에스테라제 저해제, 글루코코르티코이드 수용체 작용제, 이뇨제, 또는 재조합형 안지오텐신 전환 효소-2 또는 아세틸살리실산 (아스피린).
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 ACE 저해제, 바람직한 예로서, 에날라프릴, 퀴나프릴, 캅토프릴, 리시노프릴, 라미프릴, 델라프릴, 포시노프릴, 페린도프릴, 실라자프릴, 이미다프릴, 베나제프릴, 모엑시프릴, 스피라프릴 또는 트란도프릴과 조합으로 투여된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 안지오텐신 수용체 길항제, 바람직한 예로서, 로사르탄, 칸데사르탄, 발사르탄, 텔미사르탄 또는 엠부사르탄과 조합으로 투여된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 베타-2 수용체 작용제, 바람직한 예로서, 살부타몰, 피르부테롤, 살메테롤, 테르부탈린, 페노테롤, 툴로부테롤, 클렌부테롤, 레프로테롤 또는 포르모테롤과 조합으로 투여된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 포스포디에스테라제 (PDE) 저해제, 바람직한 예로서, 밀리논, 암리논, 피모벤단, 실로스타졸, 실데나필, 바르데나필 또는 타달라필과 조합으로 투여된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 글루코코르티코이드 수용체 작용제, 바람직한 예로서, 코르티오솔, 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손, 메틸-프레드니솔론, 프레드닐리덴, 데플라자코르트, 플루오코르톨론, 트리암시놀론, 덱사메타손 또는 베타메타손과 조합으로 투여된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물은 이뇨제, 바람직한 예로서, 푸로세미드, 토라세미드 및 하이드로클로로티아지드와 조합으로 투여된다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명에 따른 화합물을, 통상 하나 이상의 불활성의 비독성인 약학적으로 적합한 부형제와 함께 포함하는 약제 및 상기 언급된 목적을 위한 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화합물은 전신적 및/또는 국소적으로 작용할 수 있다. 이를 위해, 본 발명에 따른 화합물은 적합한 방식, 예를 들어 비경구, 폐, 비강, 혀밑, 혀, 구강, 피부, 경피, 결막, 눈 경로를 통해. 또는 이식물 또는 스텐트로서 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 이들 투여 경로에 적합한 투여 형태로 투여될 수 있다.
비경구 투여는 흡수 단계를 피해 (예를 들면, 정맥내, 동맥내, 심장내, 척수내 또는 요추내) 또는 흡수를 포함하여 (예를 들면, 근육내, 피하, 피내, 경피 또는 복강내) 일어날 수 있다. 비경구 투여에 적합한 투여 형태는 주사용 제제 및 용액, 현탁액, 에멀젼, 동결건조물 또는 멸균 산제 형태의 주입물을 포함한다.
다른 투여 경로에 적합한 투여 형태는, 예를 들어, 흡입 (분말식 흡입기, 네뷸라이저 포함), 비강 점적제, 점안제, 용액 또는 스프레이; 필름/와퍼 또는 수성 현탁액 (로션, 진탕 혼합물), 친유성 현탁액, 연고, 크림, 경피 치료 시스템 (예를 들면, 패치), 밀크, 페이스트, 포움, 더스팅 분말, 임플란트 또는 스텐트용 의약품 형태이다.
비경구 투여, 특히 정맥내 투여가 바람직하다.
본 발명에 따른 화합물은 제시된 투여 형태로 전환될 수 있다. 이는 불활성인 비독성의 약학적으로 적합한 부형제와 혼합하여 공지된 방식 자체로 수행될 수 있다. 이들 부형제는 담체 (예를 들어 미정질 셀룰로스, 락토스, 만니톨), 용매 (예를 들면, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 유화제 및 분산제 또는 습윤제 (예를 들어 나트륨 도데실설페이트, 폴리옥시소르비탄 올레에이트), 결합제 (예를 들어 폴리비닐피롤리돈), 합성 및 천연 폴리머 (예를 들어 알부민), 안정제 (예를 들면, 항산화제, 예를 들어 아스코르브산), 착색제 (예를 들면, 무기 안료, 예를 들어 철산화물) 및 마스킹 향미제 및/또는 향료를 포함한다.
일반적으로, 비경구 투여의 경우, 효과적인 결과를 이루기 위해서는 체중 kg당 약 0.001 내지 5　mg, 바람직하게는 약 0.01 내지 1　mg을 투여하는 것이 유리한 것으로 발견되었다.
그렇지만, 일부 경우에는, 특히 체중, 투여 경로, 활성 성분에 대한 개체 반응, 제제의 특성 및 투여가 일어나는 시간 또는 간격의 함수로서, 언급된 양으로부터 벗어날 수도 있다. 예를 들어, 일부 경우에는 상기 언급된 최소량 미만으로도 충분할 수 있으나, 다른 경우에는, 언급된 상한선을 초과하기도 한다. 다량 투여의 경우, 이를 하루에 다중 개별량으로 나누는 것이 권해질 수 있다.
다음 실시예가 본 발명을 설명한다. 본 발명은 이들 실시예로 한정되지 않는다.
하기 표 및 실시예에서 백분율은 달리 언급이 없으면, 중량 백분율이고; 부는 중량부이다. 액체/액체 용액에 대한 용매비, 희석비 및 농도 데이터는 각각 부피에 기초한다.
A. 실시예
약어
AA 아미노산
Acm 아세트아미도메틸
ADM 아드레노메둘린 (인간)
ADM(2-52) 디설파이드 결합 및 C-말단 아미드를 포함한 ADM AA 2 에서 AA 52의 펩티드 서열
aprox.약
Boc tert-부틸옥시카보닐
CDI 카보닐디이미다졸
d 일, 이중선 (NMR에서)
TLC 박층 크로마토그래피
DCI 직접 화학 이온화 (MS에서)
dd 이중선의 이중선 (NMR에서)
DIEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMAP 4-디메틸아미노피리딘
DMF N,N-디메틸포름아미드
DMSO 디메틸 설폭사이드
of theory 이론치의 (수율에서)
eq. 당량
ESI 전기분무 이온화 (MS에서)
Fmoc (9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐
h 시간
HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HPLC 고압, 고성능 액체 크로마토그래피
LC-MS 액체 크로마토그래피-결합 질량 분석법
m 다중선 (NMR에서)
min 분
MS 질량 분석법
NMR 핵자기공명분광법
pbf 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-설포닐
PEG 폴리에틸렌 글리콜
RP 역상 (HPLC에서)
RT 실온
Rt 체류 시간 (HPLC에서)
s 단일선 (NMR에서)
TBTU 벤조트리아졸-1-일-N-테트라메틸-우로늄 테트라플루오로보레이트
tBu tert-부틸
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라하이드로푸란
Trt 트리틸
아미노산 및 펩티드 서열의 명명은 다음에 따랐다:
International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry: Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (Recommendations 1983). In: 순수한 & Appl. Chem. 56, Vol. 5, 1984, p. 595-624
Figure 112018094277901-pat00011
LC-MS 및 MS 방법
방법 1 (LC-MS): 기기 타입: Waters ACQUITY SQD UPLC 시스템; 칼럼: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 mm x 1 mm; 이동상 A: 1 l 물 + 0.25 ml 99% 세기 포름산, 이동상 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.25 ml 99% 세기 포름산; 구배: 0.0 min 90% A → 1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A; 오븐: 50℃; 유량: 0.40 ml/min; UV-검출: 210-400 nm.
방법 2 (LC-MS): MS 기기 타입: Waters (Micromass) Quattro Micro; HPLC 기기 타입: Agilent 1100 series; 칼럼: Thermo Hypersil GOLD 3 μ 20 mm x 4 mm; 이동상 A: 1 l 물 + 0.5 ml 50% 세기 포름산, 이동상 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.5 ml 50% 세기 포름산; 구배: 0.0 min 100% A → 3.0 min 10% A → 4.0 min 10% A; 오븐: 50℃; 유량: 2.0 ml/min; UV-검출: 210 nm.
방법 3 (HPLC): 기기 타입: HP 1200 Series; UV DAD; 칼럼: Phenomenex Luna 5 ㎛ C5 100Å, 150 mm x 4.6 mm; 이동상 A: 1 l 물 + 0.5 ml 50% 세기 포름산, 이동상 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.5 ml 50% 세기 포름산; 구배: 0.0 min 95%A → 5 min 5%　A; → 5.8 min 95% A → 6.2 min 95% A; 유량: 2.5　ml/min; 오븐: RT; UV 검출: 210 nm.
방법 4 (HPLC): 기기 타입: HP 1200 Series; UV DAD; 칼럼: Merck Chromolith Fastgradient RP18 50 mm x 2 mm; 이동상 A: 1 l 물 + 0.5 ml 50% 세기 포름산, 이동상 B: 1 l 아세토니트릴 + 0.5 ml 50% 세기 포름산; 구배: 0.0 min 95%A → 2.9　min 5% A → 3.2 min 5% A; 유량: 3　ml/min; 오븐: RT; UV 검출: 210 nm.
방법 5 (DCI MS): 기기 타입: Thermo Fisher-Scientific DSQ; 화학 이온화; 반응물 암모니아 가스; 공급원 온도: 200℃; 이온화 에너지 70eV.
방법 6 (MALDI MS): 기기 타입 Kratos PC-Kompact SEQ V1.2.2 MALDI TOF MS, 양 이온화 모드, 직선 높이, 출력: 75.
마이크로파 합성기: Biotage Emrys Initiator II 합성기, 20 ml 반응 용적 이하의 가변 바이알 사이즈 및 "로봇 60" 샘플 프로세서 구비
pH 4 시트레이트 완충액: Fluka No 82566; 시트레이트 완충액 pH 4, 다음 소듐 아지드 조성물로 안정화: 시트르산, ~0.056 M; 소듐 아지드, ~0.05%; 염화나트륨, ~0.044 M; 수산화나트륨, ~0.068 M.
40kDa 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 말레이미도 프로피온아미드 (선형 40k mPEG 말레이미드); CAS No 724722-89-8; Dr. Reddys Inc. 제품, Lot No 233101301; 중량 평균 분자량, Mw (GPC) 40500 Da; 다분산도 (GPC) 1.08.
출발 화합물
실시예 1A
알릴-N-(tert-부톡시카보닐)-O-[(4-니트로페녹시)카보닐]-L-티로시네이트
Figure 112018094277901-pat00012
36.7 g (114.3 mmol) N-Boc-L-티로신 알릴 에스테르, 23.0 g (114.3 mmol) 4-니트로페닐 클로로포르메이트, 17.5 ml (125.7 mmol) 트리에틸아민 및 1.40 g (11.4 mmol) 4-디메틸아미노 피리딘을 1000 ml 디클로로메탄에서 배합하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 약 500 ml 물 및 약 250 ml 염수로 추출하고, 약 100 g 황산나트륨에서 건조시켰다. 용매를 회전 증발로 제거하고 (약 40℃, 약 200 mbar, 약 30 min.), 생성물을 따뜻한 디에틸 에테르에 용해시킨 뒤, 4℃에서 밤새 결정화하였다. 결정을 여과하고, 냉 디에틸 에테르로 세척한 다음, 고 진공 (약 0.1 mbar, 18 h) 중에 건조시켰다. 29.86 g (59.6 mmol, 이론치의 52%)의 목적 생성물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.23 min., m/z = 487 (M+H)+
실시예 2A
(2S)-4-{[(4-{(2S)-3-(알릴옥시)-2-[(tert-부톡시카보닐)아미노]-3-옥소프로필}페녹시)카보닐]아미노}-2-[(tert-부톡시카보닐)아미노]부탄산
Figure 112018094277901-pat00013
실시예 1A로부터의 화합물 4.0 g (8.22 mmol)을 60 ml 디클로로메탄에 용해시켰다. 1.795 (8.22 mmol) (2S)-4-아미노-2-[(tert-부톡시카보닐)아미노]부탄산 및 1.43 ml (8.22 mmol) N,N-디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 3개로 분할하였다. 분할물을 마이크로파 합성기에서 밀봉 튜브중 75℃에서 30 분동안 가열하였다. 모아진 반응 혼합물에서 용매를 회전 증발로 제거하였다 (약 40℃, 약 200 mbar, 약 30 min.). 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시킨 뒤, 약 600 ml 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 용매로는 디클로로메탄/에틸 아세테이트 4/1, 디클로로메탄/에틸 아세테이트 1/1, 디클로로메탄/메탄올 4/1 및 디클로로메탄/ 메탄올 1/1을 사용하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 4.02 g (6.54 mmol, 이론치의 80%)의 목적 생성물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.07 min., m/z = 564 (M-H)-
실시예 3A
알릴　O-({(3S)-4-{[(2R)-1-아미노-1-옥소-3-(트리틸설파닐)프로판-2-일]아미노}-3-[(tert-부톡시카보닐)아미노]-4-옥소부틸}카바모일)-N-(tert-부톡시카보닐)-L-티로시네이트
Figure 112018094277901-pat00014
실시예 2A로부터의 화합물 2.50 g (4.42 mmol)을 100 ml 디클로로메탄에 용해시켰다. 1.602 g (4.42 mmol) S-트리틸-L-시스테인아미드, 0.77 ml (4.42 mmol) N,N-디이소프로필에틸아민 및 1.68 g (4.42 mmol) HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5 개로 분할하였다. 분할물을 마이크로파 합성기에서 밀봉 튜브중 60℃에서 30 분동안 가열하였다. 모아진 반응 혼합물에서 용매를 회전 증발로 제거하였다 (약 40℃, 약 200 mbar, 약 30 min.). 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시킨 뒤, 약 600 ml 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 용매로는 디클로로메탄/에틸 아세테이트 2/1, 디클로로메탄/에틸 아세테이트 1/1, 디클로로메탄/메탄올 20/1 및 디클로로메탄/메탄올 10/1을 사용하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 4.12 g (3.30 mmol, 이론치의 75%, 73% 순도)의 목적 생성물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.36 min., m/z = 911 (M+H)+
실시예 4A
O-({(3S)-4-{[(2R)-1-아미노-1-옥소-3-(트리틸설파닐)프로판-2-일]아미노}-3-[(tert-부톡시카보닐)-아미노]-4-옥소부틸}카바모일)-N-(tert-부톡시카보닐)-L-티로신
Figure 112018094277901-pat00015
실시예 3A로부터의 화합물 4.14 g (4.55 mmol)을 90 ml 테트라하이드로푸란에 용해시켰다. 3.17 ml (22.8 mmol) 트리에틸아민, 0.86 ml (22.8 mmol) 포름산 및 0.526 g (0.455 mmol) 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 약 100 ml 물로 희석하고, 약 100 ml 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 합해진 유기상을 염수로 추출하고, 황산나트륨에서 건조시킨 뒤, 감압하에 농축 건고하였다. 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시킨 뒤, 약 500 ml 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 용매로는 디클로로메탄, 디클로로메탄/메탄올 20/1 및 디클로로메탄/메탄올 1/1을 사용하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 2.62 g 미정제 생성물을 94.5% 순도로 수득하였다. 생성물을 C18 상에서 물/메탄올 구배로 제조용 RP-HPLC에 의해 추가로 정제하여 2.35 g (2.70 mmol, 이론치의 59%)의 순수한 생성물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.22 min., m/z = 871 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): δ = 7.92 (d, 1H), 7.65 (t, 1H), 7.28-7.35 (m, 12H), 7.25-7.28 (t, 3H), 7.15-7.20 (m, 4H), 6.95 (d, 2H), 4.29 (q, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.11 (m, 3H), 2.90 (m, 1H), 2.36 (m, 2H), 1.84 (m, 1H), 1.68 (m, 1H), 1.34 (d, 18H).
실시예 5A
tert-부틸-메틸(2-옥소테트라하이드로푸란-3-일)카바메이트
Figure 112018094277901-pat00016
화합물을 [Alberico, Dino; Paquin, Jean-Francois; Lautens, Mark; Tetrahedron, 2005, vol. 61, p. 6283 - 6297]에 따라 합성하였다.
5.18 g (25.7 mmol) tert-부틸(테트라하이드로-2-옥소-3-푸라닐)카바메이트, 4.81 ml (77.2 mmol) 요오도메탄을 100 ml 무수 디메틸 포름아미드에 용해시켰다. 용액을 0℃로 냉각시키고, 1.34 g (광유중 60%, 33.5 mmol) 수소화나트륨을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 약 400 ml 물에 첨가하고, 혼합물을 약 300 ml 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합해진 유기상을 황산나트륨에서 건조시킨 뒤, 감압하에 농축 건고하였다. 8.70 g (25.7 mmol, 이론치의 100%, 63% 순도)의 목적 생성물을 수득하였다.
분석 데이터는 문헌에 따랐다. 생성물을 다음 합성 단계에 추가 정제없이 사용하였다.
실시예 6A
2-[(tert-부톡시카보닐)(메틸)아미노]-4-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)부탄산
Figure 112018094277901-pat00017
실시예 5A로부터의 화합물 8.70 g (약 25 mmol, 약 63% 순도)을 560 ml 디메틸 포름아미드에 용해시켰다. 8.23 g (44.4 mmol) 칼륨 오프탈이미드를 첨가하고, 반응 혼합물을 7 시간동안 150℃로 가열하였다. 약 400 ml의 용매를 회전 증발로 제거하였다 (약 60℃, 약 10 mbar, 약 30 min.). 반응 혼합물을 약 100 ml 물, 200 g 얼음과 15 ml 아세트산의 혼합물에 부었다. 남은 얼음이 녹은 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 약 100 ml 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 합해진 유기상을 황산나트륨에서 건조시킨 뒤, 감압하에 농축 건고하였다. 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시킨 뒤, 약 70 ml 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 용매로는 디클로로메탄/에틸 아세테이트 9/1 내지 디클로로메탄/에틸 아세테이트 6/4를 사용하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 2.39 g (6.04 mmol, 이론치의 24%)의 생성물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 0.92 min., m/z = 363 (M+H)+
실시예 7A
4-아미노-2-[(tert-부톡시카보닐)(메틸)아미노]부탄산
Figure 112018094277901-pat00018
실시예 6A로부터의 화합물 11.8 g (32.6 mmol) 을 약 640 ml 에탄올에 용해시키고, 23.8 ml (488 mmol) 히드라진 하이드레이트를 반응 혼합물에 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 감압하에 농축 건고하였다. 미정제 생성물을 에탄올에 용해시킨 뒤, 약 50 g 실리카겔을 첨가하고, 용매를 감압하에 제거하였다. 생성된 고체를 약 500 g 실리카겔 칼럼 상에 가하고, 크로마토그래피하였다. 용매로는 디클로로메탄/메탄올 9/1 내지 디클로로메탄/메탄올 1/1을 사용하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 2.98 g (12.8 mmol, 이론치의 39%)의 생성물을 수득하였다.
LC-MS (방법 2): Rt = 0.21 min., m/z = 233 (M+H)+
DCI MS (방법 5): m/z = 233 (M+H)+
실시예 8A
4-{[(4-{(2S)-3-(알릴옥시)-2-[(tert-부톡시카보닐)아미노]-3-옥소프로필}페녹시)카보닐]아미노}-2-[(tert-부톡시카보닐)(메틸)아미노]부탄산
Figure 112018094277901-pat00019
실시예 1A로부터의 화합물 0.931 g (1.92 mmol)을 30 ml 디클로로메탄에 용해시켰다. 실시예 7A로부터의 화합물 0.455 g (1.92 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 개로 분할하였다. 분할물을 마이크로파 합성기에서 밀봉 튜브중에 80℃에서 30 분동안 가열하였다. 모아진 반응 혼합물에서 용매를 감압하에 제거하였다. 미정제 생성물을 C18 칼럼 상의 제조용 RP-HPLC에 의해 9/1 내지 1/9의 물 메탄올 구배로 정제하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 0.523 g (0.85 mmol, 이론치의 44%)의 목적 생성물을 두 부분입체이성체의 혼합물로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.08 및 1.11 min., m/z = 578 (M-H)-
실시예 9A
알릴　O-[(4-{[(2R)-1-아미노-1-옥소-3-(트리틸설파닐)프로판-2-일]아미노}-3-[(tert-부톡시카보닐)-(메틸)아미노]-4-옥소부틸)카바모일]-N-(tert-부톡시카보닐)-L-티로시네이트
Figure 112018094277901-pat00020
실시예 8A로부터의 화합물 2.24 g (3.86 mmol)을 100 ml 디클로로메탄에 용해시켰다. 1.401 g (3.86 mmol) S-트리틸-L-시스테인아미드, 0.67 ml (3.86 mmol) N,N-디이소프로필에틸아민 및 1.47 g (3.86 mmol) HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5 개로 분할하였다. 분할물을 마이크로파 합성기에서 밀봉 튜브중에 60℃에서 30 분동안 가열하였다. 모아진 반응 혼합물에서 용매를 회전 증발로 제거하였다 (약 40℃, 약 200 mbar, 약 30 min.). 미정제 생성물을 C18 칼럼 상의 제조용 RP-HPLC에 의해 9/1 내지 1/9의 물 메탄올 구배로 정제하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 3.26 g (2.75 mmol, 이론치의 71%, 78% 순도)의 목적 생성물을 부분입체이성체의 혼합물로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.41 및 1.43 min., m/z = 924 (M+H)+
실시예 10A
O-[(4-{[(2R)-1-아미노-1-옥소-3-(트리틸설파닐)프로판-2-일]아미노}-3-[(tert-부톡시카보닐)-(메틸)아미노]-4-옥소부틸)카바모일]-N-(tert-부톡시카보닐)-L-티로신
Figure 112018094277901-pat00021
실시예 9A로부터의 화합물 2.2 g (2.38 mmol)을 48 ml 테트라하이드로푸란에 용해시켰다. 1.66　ml (11.9 mmol) 트리에틸아민, 0.45 ml (11.9 mmol) 포름산 및 0.275 g (0.238 mmol) 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 약 50 ml 물로 희석하고, 약 50 ml 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 합해진 유기상을 염수로 추출하고, 황산나트륨에서 건조시킨 뒤, 감압하에 농축 건고하였다. 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시킨 뒤, 약 100 g 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 용매로는 디클로로메탄, 디클로로메탄/메탄올 50/1 및 디클로로메탄/메탄올 4/1을 사용하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 1.44 g (1.61 mmol, 이론치의 68%)의 생성물을 부분입체이성체의 혼합물로서 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.20 및 1.24 min., m/z = 884 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): δ = 8.00 (m, 1H), 7.65-7.90 (m, 4H), 7.18-7.35 (m, 18H), 7.10 (m, 2H), 6.96 (m, 4H), 4.60 (m, 1H), 4.46 (m, 1H), 4.30 (m, 2H), 4.05 (m, 2H), 3.00 (m, 4H), 2.75 (m, 6H), 2.36 (m, 3H), 2.00 (m, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.40 (m, 3H), 1.35 (s, 18H).
실시예 11A
N5-[(4-{(2S)-3-(알릴옥시)-2-[(tert-부톡시카보닐)아미노]-3-옥소프로필}페녹시)카보닐]-N2-(tert-부톡시카보닐)-L-오르니틴
Figure 112018094277901-pat00022
실시예 1A로부터의 화합물 6.00 g (12.33 mmol)을 120 ml 디클로로메탄에 용해시켰다. 2.57 g (12.33 mmol) N2-(tert-부톡시카보닐)-L-오르니틴을 첨가하였다. 반응 혼합물을 6 개로 분할하였다. 분할물을 마이크로파 합성기에서 밀봉 튜브중에 75℃에서 90 분동안 가열하였다. 반응 혼합물을 모아 약 100 ml 포화 염화암모늄 용액으로 추출하였다. 수성상을 각각 약 30 ml 디클로로메탄으로 2회 역추출하였다. 합해진 유기상을 약 50 ml 염수로 추출하고, 황산나트륨에서 건조시켰다. 용매를 감압하에 제거하였다. 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시킨 뒤, 약 600 ml 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 용매로는 디클로로메탄, 디클로로메탄/메탄올 40/1 내지 디클로로메탄/메탄올 1/1을 사용하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 2.63 g (4.06 mmol, 이론치의 33%, 89% 순도)의 목적 생성물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.03 min., m/z = 578 (M-H)-
실시예 12A
N5-[(4-{(2S)-3-(알릴옥시)-2-[(tert-부톡시카보닐)아미노]-3-옥소프로필}페녹시)카보닐]-N2-(tert-부톡시카보닐)-L-오르니틸-S-트리틸-L-시스테인아미드
Figure 112018094277901-pat00023
실시예 11A로부터의 화합물 1.20 g (2.07 mmol)을 48 ml 디클로로메탄에 용해시켰다. 0.750 g (2.07 mmol) S-트리틸-L-시스테인아미드, 0.36 ml (2.07 mmol) N,N-디이소프로필에틸아민 및 0.787 g (2.07 mmol) HATU를 첨가하였다. 반응 혼합물을 3개로 분할하였다. 분할물을 마이크로파 합성기에서 밀봉 튜브중 60℃에서 30 분동안 가열하였다. 모아진 반응 혼합물에서 용매를 회전 증발로 제거하였다 (약 40℃, 약 200 mbar, 약 30 min.). 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시킨 뒤, 약 400 ml 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 용매로는 디클로로메탄/에틸 아세테이트 2/1, 디클로로메탄/에틸 아세테이트 1/1을 사용하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 1.30 g (1.5 mmol, 이론치의 56%, 82% 순도)의 목적 생성물을 수득하였다.
LC-MS (방법 1): Rt = 1.35 min., m/z = 924 (M+H)+
실시예 13A
N2-(tert-부톡시카보닐)-N5-[(4-{(2S)-2-[(tert-부톡시카보닐)아미노]-2-카복시에틸}페녹시)카보닐]-L-오르니틸-S-트리틸-L-시스테인아미드
Figure 112018094277901-pat00024
실시예 12A로부터의 화합물 3.06 g (2.33 mmol)을 46 ml 테트라하이드로푸란에 용해시켰다. 1.63 ml (11.6 mmol) 트리에틸아민, 0.44 ml (11.6 mmol) 포름산 및 0.265 g (0.233 mmol) 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 약 50 ml 물로 희석하고, 약 50 ml 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 합해진 유기상을 염수로 추출하고, 황산나트륨에서 건조시킨 뒤, 감압하에 농축 건고하였다. 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해시킨 뒤, 약 500 ml 실리카겔에서 크로마토그래피하였다. 용매로는 디클로로메탄, 디클로로메탄/메탄올 40/1 및 디클로로메탄/메탄올 1/1을 사용하였다. 생성물-함유 분획을 합하고, 감압하에 농축 건고하였다. 1.40 g 미정제 생성물을 86% 순도로 수득하였다. 생성물을 C18 칼럼 상에서 물/메탄올 구배로 제조용 RP-HPLC에 의해 추가로 정제하여 2개의 분획을 얻었다: 0.93 g 생성물 (이론치의 45%).
LC-MS (방법 1): Rt = 1.18 min., m/z = 885 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): δ = 7.89 (d, 1H), 7.65 (t, 1H), 7.25-7.35 (m, 12H), 7.20-7.25 (m, 6H), 7.10-7.20 (m, 3H), 6.95 (d, 2H), 4.29 (m, 1H), 4.05 (m, 1H), 3.88 (m, 1H), 3.11 (d, 1H), 3.00 (m, 4H), 2.75 (m, 2H), 2.36 (m, 3H), 1.64 (m, 1H), 1.51 (m, 3H), 1.36 (s, 9H), 1.32 (s, 9H).
실시예 14A
텐타겔 기반 아미드 수지 결합된 ADM (2-52)
Figure 112018094277901-pat00025
펩티드를 자동 펩티드 합성기 (Protein Technologies Inc. Symphony)에서 텐타겔 기반 아미드 수지에 단계적으로 어셈블링하였다. 8개의 폴리-프로필렌 반응 베슬을 동일 화학 수행에 의해 병렬로 사용하였다. 각 베슬에 0.05 mmol 텐타겔 기반 링크 (Rink) 수지를 총 0.4 mmol의 배치 크기로 로딩하였다.
각 아미노산은 수지 로딩에 대해 8배 몰 접근으로 첨가되었다. 아미노산을 N-말단 보호 그룹으로서 Fmoc 보호하였는데, 후술하는 보호 그룹이 측쇄 작용기로 사용되었다. 또한 188 mg (0.59 mmol, 7.8 eq.) TBTU 및 0.21　ml (1.2 mmol, 16 eq.) DIEA를 첨가하였다. 반응을 용매로서 DMF에서 수행하는데, DMF는 수지를 팽창시키고 자유로이 저어질 수 있기에 충분한 양으로 사용되었다. 아미노산당 반응 시간은 약 1 시간이었다. 20% 피페리딘/DMF를 사용하여 Fmoc 보호 그룹의 절단을 행하였는데, 20% 피페리딘/DMF는 수지를 팽창시키고 자유로이 저어질 수 있기에 충분한 양으로 사용되었다.
커플링 시퀀스는 다음과 같다:
1. Tyr(tBu) (Tyr = Y = 인간 ADM의 AA 52)
2. Gly (Gly = G = 인간 ADM의 AA 51)
3. Gln(Trt) (Gln = Q = 인간 ADM의 AA 50)
4. Pro (Pro = P = 인간 ADM의 AA 49)
5. Ser(tBu) (Ser = S = 인간 ADM의 AA 48)
6. Ile (Ile = I = 인간 ADM의 AA 47)
7. Lys(Boc) (Lys = K = 인간 ADM의 AA 46)
8. Ser(tBu) (Ser = S = 인간 ADM의 AA 45)
9. Arg(pbf) (Arg = R = 인간 ADM의 AA 44)
10. Pro (Pro = P = 인간 ADM의 AA 43)
11. Ala (Ala = A = 인간 ADM의 AA 42)
12. Val (Val = V = 인간 ADM의 AA 41)
13. Asn(Trt) (Asn = N = 인간 ADM의 AA 40)
14. Asp(OtBu) (Asp = D = 인간 ADM의 AA 39)
15. Lys(Boc) (Lys = K = 인간 ADM의 AA 38)
16. Asp(OtBu) (Asp = D = 인간 ADM의 AA 37)
17. Lys(Boc) (Lys = K = 인간 ADM의 AA 36)
18. Asp(OtBu) (Asp = D = 인간 ADM의 AA 35)
19. Thr(tBu) (Thr = T = 인간 ADM의 AA 34)
20. Phe (Phe = F = 인간 ADM의 AA 33)
21. Gln(Trt) (Gln = Q = 인간 ADM의 AA 32)
22. Tyr(tBu) (Tyr = Y = 인간 ADM의 AA 31)
23. Ile (Ile = I = 인간 ADM의 AA 30)
24. Gln(Trt) (Gln = Q = 인간 ADM의 AA 29)
25. His(Trt) (His = H = 인간 ADM의 AA 28)
26. Ala (Ala = A = 인간 ADM의 AA 27)
27. Leu (Leu = L = 인간 ADM의 AA 26)
28. Lys(Boc) (Lys = K = 인간 ADM의 AA 25)
29. Gln(Trt) (Gln = Q = 인간 ADM의 AA 24)
30. Val (Val = V = 인간 ADM의 AA 23)
31. Thr(tBu) (Thr = T = 인간 ADM의 AA 22)
32. Cys(Trt) (Cys = C = 인간 ADM의 AA 21)
33. Thr(tBu) (Thr = T = 인간 ADM의 AA 20)
34. Gly (Gly = G = 인간 ADM의 AA 19)
35. Phe (Phe = F = 인간 ADM의 AA 18)
36. Arg(pbf) (Arg = R = 인간 ADM의 AA 17)
37. Cys(Acm) (Cys = C = 인간 ADM의 AA 16)
38. Gly (Gly = G = 인간 ADM의 AA 15)
39. Phe (Phe = F = 인간 ADM의 AA 14)
40. Ser(tBu) (Ser = S = 인간 ADM의 AA 13)
41. Arg(pbf) (Arg = R = 인간 ADM의 AA 12)
42. Leu (Leu = L = 인간 ADM의 AA 11)
43. Gly (Gly = G = 인간 ADM의 AA 10)
44. Gln(Trt) (Gln = Q = 인간 ADM의 AA 9)
45. Phe (Phe = F = 인간 ADM의 AA 8)
46. Asn(Trt) (Asn = N = 인간 ADM의 AA 7)
47. Asn(Trt) (Asn = N = 인간 ADM의 AA 6)
48. Met (Met = M = 인간 ADM의 AA 5)
49. Ser(tBu) (Ser = S = 인간 ADM의 AA 4)
50. Gln(Trt) (Gln = Q = 인간 ADM의 AA 3)
51. Arg(pbf) (Arg = R = 인간 ADM의 AA 2)
수지 산화는 Cys(Trt) 및 Cys(Acm) 보호와 보호 그룹의 동반 절단 및 요오드를 사용한 디설파이드 결합으로의 산화 (8 당량의 요오드와 8 당량의 DIEA로 30 분의 반응 시간)를 이용하여 달성하였다. 산화는 샘플 절단으로 확인하고, 분석에는 HPLC 및 MALDI-MS를 사용하였다.
8개의 배치를 추가 사용을 위해 풀링하였다.
실시예 15A
O-{[(3S)-3-아미노-4-{[(2R)-1-아미노-1-옥소-3-설파닐프로판-2-일]아미노}-4-옥소부틸]-카바모일}-L-티로실-아드레노메둘린(2-52)
Figure 112018094277901-pat00026
0.075 mmol의 실시예 14A의 화합물에 520 mg (0.6 mmol, 8 eq.)의 실시예 4A의 화합물을 첨가하였다. 또한 188 mg (0.59 mmol, 7.8 eq.) TBTU 및 0.21　ml (1.2 mmol, 16 eq.) DIEA를 첨가하였다. 반응을 용매로서 DMF를 사용하여 수행하였는데, DMF는 수지를 팽창시키고 자유로이 저어질 수 있기에 충분한 양으로 사용되었다. 반응 시간은 실온에서 약 1 시간이었다. 농축 TFA를 수지를 팽창시키고 자유로이 저어질 수 있기에 충분한 양으로 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하는 동시에 전반적인 탈보호가 일어나도록 하였는데, 여기서 TFA는 스캐빈저 (scavenger) (각각 1- 5% 물, 페놀, 티오아니솔 및 1,2-에탄디올)를 함유하였으며, 반응 시간은 2 ½ 시간이었다. 정제 및 동결건조 공정 내내 pH가 4 이하로 유지되도록 조 생성물을 동결건조하고, 이동상으로 물중 0.1% TFA 및 아세토니트릴중 0.1% TFA를 사용하여 RP-크로마토그래피로 정제하였다. MALDI-MS 분석에 의해 적절한 이온을 함유하는 모든 분획을 풀링하였다. 44.0 mg의 부분 정제된 펩티드 (약 0.0035 mmol, 이론치의 약 4.7%; 추정 순도: 약 50%, 주요 불순물: ADM (2-52))를 수득하였다.
MALDI MS (방법 6): m/z = 6275(M+H)+ 및 5866 (불순물: (ADM(2-52)+H)+)
실시예 16A
O-{[4-{[(2R)-1-아미노-1-옥소-3-설파닐프로판-2-일]아미노}-3-(메틸아미노)-4-옥소부틸]-카바모일}-L-티로실-아드레노메둘린(2-52)
Figure 112018094277901-pat00027
0.075 mmol의 실시예 14A의 화합물에 530 mg (0.6 mmol, 8eq.)의 실시예 10A의 화합물을 첨가하였다. 또한 188 mg (0.59 mmol, 7.8 eq.) TBTU 및 0.21　ml (1.2 mmol, 16 eq.) DIEA를 첨가하였다. 반응을 용매로서 DMF를 사용하여 수행하였는데, DMF는 수지를 팽창시키고 자유로이 저어질 수 있기에 충분한 양으로 사용되었다. 반응 시간은 실온에서 약 1 시간이었다. 농축 TFA를 수지를 팽창시키고 자유로이 저어질 수 있기에 충분한 양으로 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하는 동시에 전반적인 탈보호가 일어나도록 하였는데, 여기서 TFA는 스캐빈저(각각 1- 5% 물, 페놀, 티오아니솔 및 1,2-에탄디올)를 함유하였으며, 반응 시간은 2 ½ 시간이었다. 정제 및 동결건조 공정 내내 pH가 4 이하로 유지되도록 조 생성물을 동결건조하고, 이동상으로 물중 0.1% TFA 및 아세토니트릴중 0.1% TFA를 사용하여 RP-크로마토그래피로 정제하였다. MALDI-MS 분석에 의해 적절한 이온을 함유하는 모든 분획을 풀링하였다. 34.0 mg의 부분 정제된 펩티드 (약 0.0026 mmol, 이론치의 약 3.5%; 추정 순도: 약 50%, 주요 불순물: ADM (2-52))를 수득하였다.
MALDI MS (방법 6): m/z = 6289(M+H)+ 및 5866 (불순물: (ADM(2-52)+H)+)
실시예 17A
O-{[(4R)-4-아미노-5-{[(2R)-1-아미노-1-옥소-3-설파닐프로판-2-일]아미노}-5-옥소펜틸]카바모일}-L-티로실-아드레노메둘린(2-52)
Figure 112018094277901-pat00028
0.075 mmol의 실시예 14A의 화합물에 530 mg (0.6 mmol, 8eq.)의 실시예 13A의 화합물을 첨가하였다. 또한 188 mg (0.59 mmol, 7.8 eq.) TBTU 및 0.21　ml (1.2 mmol, 16 eq.) DIEA를 첨가하였다. 반응을 용매로서 DMF를 사용하여 수행하였는데, DMF는 수지를 팽창시키고 자유로이 저어질 수 있기에 충분한 양으로 사용되었다. 반응 시간은 실온에서 약 1 시간이었다. 농축 TFA를 수지를 팽창시키고 자유로이 저어질 수 있기에 충분한 양으로 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하는 동시에 전반적인 탈보호가 일어나도록 하였는데, 여기서 TFA는 스캐빈저(각각 1- 5% 물, 페놀, 티오아니솔 및 1,2-에탄디올)를 함유하였으며, 반응 시간은 2 ½ 시간이었다. 정제 및 동결건조 공정 내내 pH가 4 이하로 유지되도록 조 생성물을 동결건조하고, 이동상으로 물중 0.1% TFA 및 아세토니트릴중 0.1% TFA를 사용하여 RP-크로마토그래피로 정제하였다. MALDI-MS 분석에 의해 적절한 이온을 함유하는 모든 분획을 풀링하였다. 47 mg의 부분 정제된 펩티드 (약 0.0037 mmol, 이론치의 약 5.0%; 추정 순도: 약 50%, 주요 불순물: ADM (2-52))를 수득하였다.
MALDI MS (방법 6): m/z = 6289(M+H)+ 및 5866 (불순물: (ADM(2-52)+H)+)
수행 실시예
실시예 1
O-{[(3S)-3-아미노-4-({(2R)-1-아미노-3-[(2,5-디옥소-1-{3-옥소-3-[(2-{ω-메톡시폴리옥시에틸렌[40kDa]}에틸)아미노]프로필}피롤리딘-3-일)설파닐]-1-옥소프로판-2-일}아미노)-4-옥소부틸]카바모일}-L-티로실-아드레노메둘린(2-52)
Figure 112018094277901-pat00029
44 mg의 실시예 15A의 조 펩티드를 pH 4의 9 ml 시트레이트 완충액에서 426　mg (10.5 μmol, 1.5 eq, Dr. Reddys에서 공급) 40 kDa 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 말레이미도 프로피온아미드와 실온에서 밤새 교반하였다. 조 반응 혼합물을 Phenomenex Luna 10μ Proteo C5 100A AXIA 250 mm x 21.2 mm 칼럼을 갖춘 제조용 HPLC 시스템 상에 두 분량으로 주입하고, 물/아세토니트릴 (모두 0.1% TFA 함유) 구배로 크로마토그래피하였다. 분획들을 자동 분획 수집기 상에 20 ml 시험관에 수집하였다. 수집 전에 충분한 산성 확보를 위해 각 바이알에 0.5 ml 아세트산을 채웠다.
실시예 15A의 부산물이고 이 반응에서 페길화되지 않은 ADM(2-52)과 비반응 PEG를 완전히 제거하였다.
실시예 1을 함유하는 모든 분획을 합하였다. 아세토니트릴을 회전 증발기에서 30℃ 수조 온도 및 약 50 mbar 하에 약 30 분동안 부분적으로 제거하였다.
0.5 ml 아세트산 첨가 후, 남은 용액을 동결건조하였다. 실시예 1의 총 수율은 109 mg (2.35 μmol, 이론치의 33%)이었다.
HPLC (방법 3): Rt = 4.23-4.30 min
실시예 2
O-{[(3-N-메틸-아미노-4-({(2R)-1-아미노-3-[(2,5-디옥소-1-{3-옥소-3-[(2-{ω-메톡시폴리옥시에틸렌[40kDa]}에틸)아미노]프로필}피롤리딘-3-일)설파닐]-1-옥소프로판-2-일}아미노)-4-옥소부틸]카바모일}-L-티로실-아드레노메둘린(2-52)
Figure 112018094277901-pat00030
15 mg의 실시예 16A의 조 펩티드를 pH 4의 5 ml 시트레이트 완충액에서 145　mg (3.58 μmol, 1.5 eq, Dr. Reddys에서 공급) 40 kDa 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 말레이미도 프로피온아미드와 실온에서 밤새 교반하였다. 조 반응 혼합물을 Phenomenex Luna 10μ Proteo C5 100A AXIA 250 mm x 21.2 mm 칼럼을 갖춘 제조용 HPLC 시스템 상에 주입하고, 물/아세토니트릴 (모두 0.1% TFA 함유) 구배로 크로마토그래피하였다. 분획들을 자동 분획 수집기 상에 20 ml 시험관에 수집하였다. 수집 전에 충분한 산성 확보를 위해 각 바이알에 0.5 ml 아세트산을 채웠다.
실시예 16A의 부산물이고 이 반응에서 페길화되지 않은 ADM(2-52)과 비반응 PEG를 완전히 제거하였다.
실시예 2를 함유하는 모든 분획을 합하였다. 아세토니트릴을 회전 증발기에서 30℃ 수조 온도 및 약 50 mbar 하에 약 30 분동안 부분적으로 제거하였다.
0.5 ml 아세트산 첨가 후, 남은 용액을 동결건조하였다. 실시예 2의 총 수율은 50 mg (1.08 μmol, 이론치의 43%)이었다.
HPLC (방법 4): Rt = 2.02-2.08 min
실시예 3
O-{[(4S)-4-아미노-5-({(2R)-1-아미노-3-[(2,5-디옥소-1-{3-옥소-3-[(2-{ω-메톡시폴리옥시에틸렌[40kDa]}에틸)아미노]프로필}피롤리딘-3-일)설파닐]-1-옥소프로판-2-일}아미노)-5-옥소펜틸]카바모일}-L-티로실-아드레노메둘린(2-52)
Figure 112018094277901-pat00031
15 mg의 실시예 17A조 펩티드를 pH 4의 5 ml 시트레이트 완충액에서 145　mg (3.58 μmol, 1.5 eq, Dr. Reddys에서 공급) 40 kDa 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 말레이미도 프로피온아미드와 실온에서 밤새 교반하였다. 조 반응 혼합물을 Phenomenex Luna 10μ Proteo C5 100A AXIA 250 mm x 21.2 mm 칼럼을 갖춘 제조용 HPLC 시스템 상에 주입하고, 물/아세토니트릴 (모두 0.1% TFA 함유) 구배로 크로마토그래피하였다. 분획들을 자동 분획 수집기 상에 20 ml 시험관에 수집하였다. 수집 전에 충분한 산성 확보를 위해 각 바이알에 0.5 ml 아세트산을 채웠다.
실시예 17A의 부산물이고 이 반응에서 페길화되지 않은 ADM(2-52)과 비반응 PEG를 완전히 제거하였다.
실시예 3을 함유하는 모든 분획을 합하였다. 아세토니트릴을 회전 증발기에서 30℃ 수조 온도 및 약 50 mbar 하에 약 30 분동안 부분적으로 제거하였다.
0.5 ml 아세트산 첨가 후, 남은 용액을 동결건조하였다. 실시예 3의 총 수율은 19.5 mg (0.42 μmol, 이론치의 17%)이었다.
HPLC (방법 4): Rt = 2.02-2.08 min
B. 약학적 활성 평가
질환 치료를 위한 본 발명에 따른 화합물의 적합성은 다음 분석 시스템을 사용하여 입증될 수 있다:
1) 시험 설명 ( 시험관내 )
1a) 재조합형 아드레노메둘린-수용체 리포터 세포에 대한 시험
인간 아드레노메둘린-수용체를 가지고 있는 재조합형 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 사용하여 본 발명에 따른 화합물의 활성을 정량하였다. 리간드에 의한 수용체의 활성화는 에쿼린 발광으로 측정될 수 있다. 세포주 작제 및 측정 절차는 문헌[Wunder F., Rebmann A., Geerts A, and Kalthof B., Mol Pharmacol, 73, 1235-1243 (2008)]에 자세히 실려있다. 요약하면, 세포를 불투명한 384-웰 마이크로타이터 플레이트에 웰당 4000 세포의 밀도로 시딩하고, 24 시간동안 증식시켰다. 배양 배지 제거 후, 세포 배양 인큐베이터에서 0.2　mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX)이 보충된 무 Ca2+ 타이로드 용액 (130 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼륨, 20 mM HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰), 1 mM 염화마그네슘 및 4.8 mM 탄산수소나트륨, pH 7.4) 중의 0.6 ㎍/ml 코엘렌테라진 (coelenterazine)을 세포에 3 시간동안 로딩하였다. 화합물을 0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 무 칼슘2+ 타이로드 용액에 6 분간 첨가하였다. 칼슘2+를 3 mM 최종 농도로 첨가하기 직전에, 적합한 발광 측정기를 사용하여 에쿼린 발광 측정을 시작하였다. 발광을 60 s간 측정하였다. 전형적인 실험으로 화합물을 1 x 10-13 내지 3 x 10-6 M의 농도 범위에서 시험하였다.
본 발명에 따른 화합물로부터 활성 아드레노메둘린의 방출을 측정하기 위해, 화합물을 우태아혈청, 세포 배양 배지 또는 상이한 종으로부터의 혈장이 보충된 타이로드 용액 (pH 7.4)에서 상이한 농도로 24 시간 이하의 상이한 기간동안 배양하였다. 샘플을 아드레노메둘린-수용체 리포터 세포에 첨가하기 전에 4 mM EDTA (에틸렌 디아민 테트라아세트산)을 가하여 각 배양 배지의 칼슘2+ 내용물을 완충시켰다.
적당한 예비배양 후, 구체 실시예는 아드레노메둘린-수용체 리포터 세포를 예비배양 전보다 더 강력하게 활성화시킨다. 이는 EC50 값이 예비배양 후 그 전보다 최대 10배 더 작은 사실로 알 수 있으며, 이는 화합물로부터 활성 아드레노메둘린의 방출로 설명될 수 있다.
2.5% 우태아혈청이 보충된 완충액에서 배양 전 및 24 시간 배양 후 구체 실시예에 대한 대표적인 EC50 값을 하기 표 1에 나타내었다:
실시예 번호 EC50 T = 0 h [nM] EC50 T = 24 h [nM]
ADM 0.5 2.5
1 110 8.4
2 > 1000 161
3 124 12.3
1b) 내피 세포에서 세포를 통한 전기 저항 분석본 발명에 따른 화합물의 활성은 인간 배꼽 정맥 세포 (HUVEC, Lonza)에서 시험관내-투과성 측정으로 특정된다. ECIS 장치 (ECIS: Electric Cell-substrate Impedance Sensing; Applied Biophysics Inc; Troy, NY)를 사용하여 셀이 배치된 소형 금 전극으로 내피 단층에서의 내피를 통한 전기 저항 (TEER) 변화를 연속적으로 측정하였다. HUVEC를 96-웰 센서 전극판 (96W1E, Ibidi GmbH, Martinsried)에서 융합성 단층으로 증식시켰고, 과투과성은 모두 내피 세포 접촉 결렬 및 TEER 감소를 야기하는 것으로 입증된 트롬빈, TNF-α, IL-1β, VEGF, 히스타민 및 과산화수소와 같은 염증성 자극으로 유발시킬 수 있다. 트롬빈은 0.5 U/ml의 최종 농도로 사용되었다. 시험 화합물을 트롬빈 첨가 전 또는 후에 첨가하였다. 전형적인 실험으로 화합물을 1 x 10-10 내지 1 x 10-6 M의 농도 범위에서 시험하였다.
이 시험에서 구체 실시예는 트롬빈 유도된 과투과성을 ≤10-6 M의 농도로 억제하였다.
1c) 내피 세포에서 시험관내 -투과성 측정
다른 내피 과투과성 시험관내 모델에서, 본 발명에 따른 화합물의 활성을 거대분자 투과성 조절에 대해 시험하였다. 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVECS)를 상부 챔버의 바닥에서 내피 세포가 증식하게 아래쪽 조직 배양 챔버와 윗부분을 분리하는 피브로넥틴-코팅된 Transwell® 필터막 (24-웰 플레이트, 0.4 μM 폴리카보네이트 막을 가진 6.5　mm-삽입물; Costar #3413)에서 융합될 때까지 증식시켰다. 상부 챔버의 배지에 250 ㎍/ml의 40 kDa FITC-덱스트란 (Invitrogen, D1844)을 보충하였다. 트롬빈을 0.5 U/ml의 최종 농도로 첨가하여 단층의 과투과성을 유도하였다. 하부 챔버에서 배지 샘플을 30 분 마다 수집하고, 시간에 따른 거대분자 투과성 변화에 대한 파라미터로서 상대 형광을 적합한 형광계에서 측정하였다. 트롬빈 시도는 내피 단층을 통한 FITC-덱스트란 전이를 거의 두배로 유도한다. 전형적인 실험으로 화합물을 1 x 10-10 내지 1 x 10-6 M의 농도 범위에서 시험하였다.
이 시험에서 구체 실시예는 트롬빈 유도된 과투과성을 ≤10-6 M의 농도로 억제하였다.
2. 시험 설명 (생체내)
2a) 원격 계측 정상 혈압 위스타 래트에서 혈압 및 심박동수 측정
본 발명에 따른 화합물로 유도되는 심혈관 효과를 의식이 있는 자유 이동 위스타 래트 (체중: >200 g)에서 혈압 및 심박동수의 라디오 원격측정으로 조사하였다. 요약하면, 원격 계측 시스템 (DSI Data Science International, MN, USA)은 다음 3개의 기본 요소로 구성된다: 삽입형 트랜스미터 (TA11PA-C40), 수용기 (RA1010) 및 컴퓨터 기반 수집 소프트웨어 (DataquestTM A.R.T. 4.1, 윈도우용). 실험전 적어도 14 일에 만성 사용을 위한 압력 임플란트를 래트에 장치하였다. 센서 카테터를 4-0 본합사로 수회 묶어 카테터 끝으로부터 0.5 cm에 스토퍼를 만들었다. 카테터 이식동안 래트를 펜토바비탈 (Nembutal, Sanofi: 50 mg/kg i.p.)로 마취하였다. 복부 피부를 면도한 후, 정중선 복부 절개를 행한 뒤, 액체 충만 센서 카테터를 장골 분지부와 신장 동맥 사이에 노출된 하향 대동맥에 상류로 삽입하였다. 카테터를 스토퍼에서 수회 묶었다. 원격 계측 카테터 끝을 신장 동맥 꼬리에 바로 위치시키고, 조직 접착제로 고정시켰다. 복부를 닫기 전에 트랜스미터 바디를 복막 내벽에 부착하였다. 복막 및 근육벽의 개별 봉합술에 이어 표피를 폐쇄하는 2층 복부 절개 폐쇄를 이용하였다. 수술후 감염 및 통증에 대한 보호를 위해, 단일 투여량의 항생제 (옥시테트라사이클린 10% R, 5.0 ml/kg s.c., beta-pharma GmbH&Co, Germany) 및 진통제를 주사하였다 (Rimadyl R, 5.0 ml/kg s.c., Pfizer, Germany). 하드웨어 구성을 24 마리의 동물에 장착하였다. 각 래트 우리를 개별 수용기 플랫폼의 상부에 위치시켰다. 이식한 트랜스미터의 작동 후, 온-라인 데이터 수집 시스템은 샘플 데이터를 원격 계측 압력 신호에서 mm Hg로 변환시킨다. 기압 기준은 절대 압력 (진공에 대한)을 주변 대기압에 상관시킨다. 데이터 수집 소프트웨어는 5 분 마다 10-s 간격의 샘플 혈류역학적 데이터로 미리 정해져 있다. 파일 보관을 위한 데이터 수집을 시험 화합물 투여 2 시간 전에 시작하여 24-시간 사이클 완료 후 마쳤다. 진형적인 실험으로, 시험 화합물을 볼러스로서 체중 kg당 1 내지 1000 ㎍의 용량 (펩티드 성분에 대한 것)으로 피하 또는 정맥내 투여하였다.
이 시험에서 야생형 아드레노메둘린 (Bachem, H-2932)은 체중 kg당 ≤300 ㎍의 용량으로 시험한 경우 ≤4 h의 기간으로 혈압 강하를 유도하였다 [도 1].
도 1: 제시된 바와 같이 (점선) ADM 또는 비히클의 피하 투여 후 원격 계측 정상 혈압 암컷 위스타 래트에서 기록된 평균 동맥 혈압 (MABP)의 24 시간 프로파일. 데이터 점은 그룹당 4 마리의 동물로부터 평균 30 분 간격의 평균±SEM으로 플롯팅되었다. 투여 1 시간 후, ADM으로 처리된 동물은 피크에서 거의 20%의 MABP의 평균 감소를 나타내었다 (채워진 원). 약 3.5 시간 후, MABP는 기본선으로 되돌아왔으며, 비히클 처리 동물 (빈 원)의 것 범위내였다.
이 시험에서, 본 발명에 따른 물질은 체중 kg당 ≤　500 ㎍의 용량 (펩티드 성분에 대한 것)에서 최대 10 시간까지 혈압 감소를 유도하였다 [도 2].
도 2: 제시된 바와 같이 (점선) 실시예 1 또는 비히클의 피하 투여 후 원격 계측 정상 혈압 암컷 위스타 래트에서 기록된 평균 동맥 혈압 (MABP)의 24 시간 프로파일. 데이터 점은 그룹당 6 마리의 동물로부터 평균 30 분 간격의 평균±SEM으로 플롯팅되었다. 체중 kg당 150 ㎍의 용량 (펩티드 성분에 대한 것)으로 실시예 1을 투여하면, 투여 후 6 시간 까지 MABP를 약 15 내지 19% 감소시켰다 (채워진 원). 투여 후 6 시간 내지 14 시간 사이에 MABP는 점차 기본 값으로 되돌아왔으며, 마침내 비히클 처리 동물의 것 범위내로 들어 왔다.
2b) 위스타 래트에서 피부관 누출 시험
피내 히스타민 시도 시험을 이용하여 건강한 동물에서 관 배리어 기능에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과를 평가하였다. 수컷 스프라그 도울리 래트 (체중 >200 g)를 이소플루란 (주위 공기에서 2%-3%)으로 마취시키고, 앙아위로 하였다. 복부를 면도하고, 카테터를 대퇴 정맥에 삽입하였다. 비히클 단독 (0.5ml PBS + 0.1% 소혈청 알부민) 또는 적당한 농도의 시험 화합물을 i.v. 볼러스 주사로 투여하였다. 15 분 후, 100 ㎕/kg 2% 에반스 블루 (Sigma) 용액의 이차 주사를 투여하고, 그 즉시 적당한 농도의 100 ㎕ 히스타민 용액 (예를 들어 0 - 2.5 - 5 - 10 - 20 - 40 ㎍/ml)을 복부 피부에 피내로 주사하였다. 에반스 블루는 고 혈장 단백질 결합 염료이며, 따라서 단백질이 풍부한 유체 혈관밖 유출 및 관 누출 지시제이다. 이 절차 30 분 후에 이소플루란을 과다 투여하여 래트를 희생시키고, 목 탈구한 뒤, 복부 피부를 절개하였다. 8 mm 생검 펀치로 팽진을 잘라 내고, 조직 샘플의 무게를 달은 후, 48 시간 포름아미드에 옮겨 에반스 블루를 추출하였다. 샘플을 620 nM 및 750 nM 파장에서 적합한 광도계로 측정하고, 샘플의 에반스 블루 함량을 식 A620 (보정) = A620 - (1.426 X A750 + 0.030)에 따라 헴 색소에 대해 보정하고 표준 곡선에 대해 계산하였다. [Wang L.F., Patel M., Razavi H.M., Weicker S., Joseph M.G., McCormack D.G., Mehta S., Am . Respir Crit Care Med, 165(12), 1634-9 (2002)로부터 개작된 방법].
이 시험에서 본 발명에 따른 물질은 히스타민 시도로 단백질이 풍부한 혈장 유체의 혈관밖 유출을 감소시켰다.
2c) 마우스에서 LPS의 기관내 주입
리포폴리사카라이드 (LPS)로의 기관내 시도로 급성 폐 손상에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과를 조사하였다. 수컷 BALB/c 마우스 (평균 동물 체중 20-23 g)를 이소플루란 (7%)으로 마취시키고, 마이크로피펫을 사용하여 대장균 (E. coli)으로부터의 LPS (예를 들면, 혈청형 055:B5; Sigma)를 100 ㎕ 염수에 주입하였다. 이 시도를 위해 사용된 LPS의 대표적인 용량은 체중 kg당 1 내지 10 mg이다. 주입 전 및 후 상이한 시점에서 시험 화합물을 피하 경로로 투여하였다. 대표적인 용량은 체중 kg당 1 내지 300 ㎍이다. 이 시험에서, 시험 화합물의 대표적인 투여 시점은 LPS 시도 15 분 전 또는 1 시간 후이다. LPS 주입 48 시간 후, 마우스를 이소플루란으로 깊이 마취시키고, 목 탈구로 희생시켰다. 기관 삽관 후, 0.5 ml 빙-냉 염수로 기관지 폐포 공간을 세척하였다. 폐를 준비하고, 무게를 달았다. 기관지 폐포 세척액 (BALF)내 세포수를 세포 계수기 (Cell Dyn 3700, Abbott)에서 계수하였다. 이 시험에서, 폐 부종에 대한 척도로서 폐 무게는 LPS 시도 48 시간 후 허위 대조군에 비해 약 50% 또는 이상 증가한 것으로 재현적으로 확인되었다. 폐 무게는 그룹들에서 변동성이 아주 낮게 나타났기 때문에, 절대 폐 무게가 파라미터로서 사용된다. 백혈구 수는 LPS 시도 후 BALF에서 대조군에 비해 항상 상당히 증가한 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 물질은 체중 kg당 ≤ 300 ㎍의 용량 (펩티드 성분에 대한 것)으로 볼러스로 투여된 경우, 48 시간 후 BALF에서 폐 무게 및 백혈구 수를 상당히 감소시켰다.
2d) 미니 돼지에서 급성 폐 손상 유도
마취한 미니 돼지에서 리포폴리사카라이드 (LPS) 또는 올레산을 시도제로 사용하여 급성 폐 손상을 유도하였다. 상세히 설명하면, 약 3.5 내지 5.5 kg 체중의 암컷 괴팅엔 (Goettingen) 미니 돼지 (Ellegaard, Denmark)에 Ketavet®/ Stresnil®의 근육내 주사로 예비 마취 후 Ketavet®, Dormicum® 및 Pancuronium®을 연속 i.v.-주입하여 마취를 유지하였다. 기관내 삽관 후, 소아과용 인공호흡기 (Sulla 808V; Draeger, Germany)를 사용하여 산소 공기 혼합물을 30 내지 50 ml의 호흡량 및 25 min-1의 일정 주기로 해서 동물을 인공적으로 환기시켰다. 산소 공기 혼합물의 비를 통해 흡기 산소 (FiO2)의 분율을 조절해 동맥 PaCO2를 약 40 mmHg로 조정하였다. 적절한 압력 변환기 및 기록 장비에 장착된 필요한 프로브 및 카테터의 배치후 다음의 심혈관 및 호흡 파라미터를 관례대로 측정하였다: 중심 정맥압 (좌 경정맥을 통해), 동맥 혈압 및 심박동수 (BP 및 HR; 좌 경정맥을 통해), 좌심실압 (LVP; 우 경동맥을 통해 좌심실에 도입된 Millar 카테터 [FMI, Mod.:SPC-340S, REF: 800-2019-1, 4F] 이용), 폐동맥압 (PAP; 좌 경정맥을 통해 폐동맥으로 보내진 ARROW Berman 혈관조영술 풍선 카테터 [REF.: AI-07134 4 Fr. 50 cm]), 심박출량 (CO) 및 우 대퇴 동맥으로 들어간 Pulsion 4F Thermodilution-카테터 (PV2014L08N)에 연결된 PiCCO 시스템 (Pulsion, Germany)을 사용한 혈관밖 폐 물 인덱스 (EVWLI). CVP, BP, HR, LVP, 및 PAP 측정을 위한 카테터를 Ponemah 기록 시스템에 장착하였다. 동맥 혈액 가스 분석을 행하여 PaO2/FiO2를 결정하였다. ARDS에 대한 미국-유럽 합의 회의 (American-European Consensus Conference)에 따라, PaO2/FiO2 < 300 mmHg가 급성 폐 손상이 있는 지표로서 간주된다. 적용되는 프로토콜에 따라, 실험 기간은 폐 손상 유도 시도제의 투여 후 4 내지 5 시간 사이에서 변한다. 실험 종료 후, 돼지를 방혈하여 희생시키고, 폐로부터 기관지 폐포 세척액 (BALF)을 수집하였다. 혈구 계수기 (Cell DYN 3700)로 BALF의 세포 함량을 결정하였다.
전형적인 환경에서 염수중 리포폴리사카라이드 (LPS; E.coli 0111:B4; Sigma L2630)를 체중 kg당 5 mg의 용량으로 기관 내관을 통해 각 폐에 기관지내 점적 주입하여 급성 폐 손상을 유도하였다. 시도에 반응하여 PAP 및 EVWLI는 증가한 반면, PaO2/FiO2는 300 mmHg 아래로 감소하였다. BALF의 세포 함량은 상당히 증가하였다. LPS 시도 15 분 전 본 발명의 화합물 1을 i.v.-볼러스로서 투여함으로써 LPS 유도 변화가 개선 또는 방지되었다.
다른 프로토콜로, 에탄올로 (1:1) 희석시킨 올레산 (OA; Sigma-Aldrich, O1008)을 체중 kg당 100 mg의 최종 용량으로 15 분간 i.v. 주입하였다. OA로의 시도로 PAP 및 EVLWI가 증가하였고, PaO2/FiO2는 300 mmHg 아래로 감소하였다. OA 주입 개시 15 분 전 본 발명의 화합물 1을 투여함으로써 변화가 개선되거나 방지되었다.
체중 kg당 ≤　30 ㎍의 실시예 1의 용량 (펩티드 성분에 대한 것)은 기술된 시험 시스템에서 활성인 것으로 확인되었다.
C. 약학 조성물의 예시적인 구체예
본 발명에 따른 화합물은 다음의 방식으로 약학 제제로 전환될 수 있다:
i.v. 용액 :
본 발명에 따른 화합물을 생리학적으로 허용가능한 용매 (예를 들어, pH 4 내지 pH 7의 완충액, 등장성 염화나트륨 용액, 글루코스 용액 5% 및/또는 PEG 400 용액 30%)에 포화 용해도 이하의 농도로 용해시킨다. 용액을 여과로 멸균하고, 발열물질을 함유하지 않는 멸균 주사 용기에 충전한다.
s.c. 용액 :
본 발명에 따른 화합물을 생리학적으로 허용가능한 용매 (예를 들어, pH 4 내지 pH 7의 완충액, 등장성 염화나트륨 용액, 글루코스 용액 5% 및/또는 PEG 400 용액 30%)에 포화 용해도 이하의 농도로 용해시킨다. 용액을 여과로 멸균하고, 발열물질을 함유하지 않는 멸균 주사 용기에 충전한다.

Claims (10)

  1. 불활성인 비독성의 약학적으로 적합한 부형제와의 조합으로, 화학식 (I) 의 화합물, 또는 그의 염, 그의 용매화물 또는 그의 염의 용매화물 중 하나를 포함하는 약제로서, 흡입을 위한 의약품 형태인, 심혈관, 부종 및 염증성 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 치료, 예방, 또는 치료 및 예방에서 사용하기 위한 약제:
    Figure 112019004761619-pat00037

    상기 식에서,
    n 은 0, 1, 2 또는 3 의 수를 나타내고,
    R1 은 수소, 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필을 나타내고,
    R2 는 메톡시-그룹으로 말단 캡핑된 선형 또는 분지형 PEG 20kDa 내지 80kDa를 나타냄.
  2. 제 1 항에 있어서, 화학식 (I) 의 화합물이 다음과 같이 정의되는 것을 특징으로 하는 약제:
    n 은 1 또는 2 의 수를 나타내고,
    R1 은 수소 또는 메틸을 나타내고,
    R2 는 메톡시-그룹으로 말단 캡핑된 선형 PEG 40kDa를 나타냄.
  3. 제 1 항에 있어서, 화학식 (I) 의 화합물이 다음과 같이 정의되는 것을 특징으로 하는 약제:
    n 은 1 또는 2 의 수를 나타내고,
    R1 은 수소를 나타내고,
    R2 는 메톡시-그룹으로 말단 캡핑된 선형 PEG 40kDa를 나타냄.
  4. 제 1 항에 있어서, 흡입을 위한 의약품 형태가 분말식 흡입기 및 네뷸라이저로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제.
  5. 제 1 항에 있어서, ACE 저해제, 안지오텐신 수용체 길항제, 베타-2 수용체 작용제, 포스포디에스테라제 저해제, 글루코코르티코이드 수용체 작용제, 이뇨제, 재조합형 안지오텐신 전환 효소-2 및 아세틸살리실산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추가의 활성 성분과의 추가의 조합으로의 약제.
  6. 제 5 항에 있어서, 추가의 활성 성분이 에날라프릴, 퀴나프릴, 캅토프릴, 리시노프릴, 라미프릴, 델라프릴, 포시노프릴, 페린도프릴, 실라자프릴, 이미다프릴, 베나제프릴, 모엑시프릴, 스피라프릴 및 트란도프릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 ACE 저해제; 로사르탄, 칸데사르탄, 발사르탄, 텔미사르탄 및 엠부사르탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 안지오텐신 수용체 길항제; 살부타몰, 피르부테롤, 살메테롤, 테르부탈린, 페노테롤, 툴로부테롤, 클렌부테롤, 레프로테롤 및 포르모테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 베타-2 수용체 작용제; 밀리논, 암리논, 피모벤단, 실로스타졸, 실데나필, 바르데나필 및 타달라필로 이루어지는 군으로부터 선택되는 포스포디에스테라제 (PDE) 저해제; 코르티오솔, 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손, 메틸-프레드니솔론, 프레드닐리덴, 데플라자코르트, 플루오코르톨론, 트리암시놀론, 덱사메타손 및 베타메타손으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 글루코코르티코이드 수용체 작용제; 푸로세미드, 토라세미드 및 하이드로클로로티아지드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이뇨제; 재조합형 안지오텐신 전환 효소-2 및 아세틸살리실산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제의 활성량을 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 심혈관, 부종 및 염증성 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 치료, 예방, 또는 치료 및 예방에서 사용하기 위한 약제로서, 심혈관, 부종 및 염증성 질병으로 이루어진 군이 심부전, 관상 동맥 심장 질환, 허혈성 또는 출혈성 뇌졸중, 고혈압, 폐고혈압, 말초 동맥 폐색성 질환, 전자간증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 급성 또는 만성 폐부종, 유기 분진 및 진균, 방선균 또는 다른 기원 입자의 흡입에 의한 앨러지성 폐포염 또는 폐렴, 급성 화학성 기관지염, 급성 또는 만성 화학성 폐부종, 신경성 폐부종, 방사선에 의한 급성 또는 만성 폐징후, 급성 또는 만성 간질성 폐 질병, 성인 또는 신생아를 포함한 소아에서 급성 폐 손상/급성 호흡 장애 증후군 (ALI/ARDS), 폐렴 및 패혈증에 속발하는 ALI/ARDS, 흡입에 속발하는 흡입성 폐렴 및 ALI/ARDS, 담배 연기 흡입에 속발하는 ALI/ARDS, 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI), 수술, 외상 또는 화상 후 ALI/ARDS 또는 급성 폐 기능장애, 인공호흡기 유발 폐 손상 (VILI), 아편 흡입후 폐 손상, 폐 섬유증, 고산병, 사구체 신염, 급성 신장 손상, 심신 증후군, 림프부종, 염증성 장 질환, 패혈증, 패혈성 쇼크, 비감염성 기원의 전신 염증성 반응 증후군 (SIRS), 염증성 장 질환 및 두드러기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 약제의 활성량을 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 심혈관, 부종 및 염증성 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병의 치료, 예방, 또는 치료 및 예방에서 사용하기 위한 약제로서, 심혈관, 부종 및 염증성 질병으로부터 이루어진 군이 폐고혈압, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 급성 또는 만성 폐부종, 유기 분진 및 진균, 방선균 또는 다른 기원 입자의 흡입에 의한 앨러지성 폐포염 또는 폐렴, 급성 화학성 기관지염, 급성 또는 만성 화학성 폐부종, 신경성 폐부종, 방사선에 의한 급성 또는 만성 폐징후, 급성 또는 만성 간질성 폐 질병, 성인 또는 신생아를 포함한 소아에서 급성 폐 손상/급성 호흡 장애 증후군 (ALI/ARDS), 폐렴 및 패혈증에 속발하는 ALI/ARDS, 흡입에 속발하는 흡입성 폐렴 및 ALI/ARDS, 담배 연기 흡입에 속발하는 ALI/ARDS, 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI), 수술, 외상 또는 화상 후 ALI/ARDS 또는 급성 폐 기능장애, 인공호흡기 유발 폐 손상 (VILI), 아편 흡입후 폐 손상, 폐 섬유증 및 고산병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제.
  9. 삭제
  10. 화학식 (II) 의 화합물:
    Figure 112018094277901-pat00034
    .
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