BR112014010708B1 - compostos, processo para a preparação de um composto, usos de um composto e medicamento compreendendo um composto - Google Patents

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Abstract

PRÓ-FÁRMACO À BASE DE POLIETILENOGLICOL DE ADRENOMEDULINA E UTILIZAÇÃO DO MESMO. A invenção refere-se a um novo pró-fármaco de polietilenoglicol (PEG) de Adrenomedulina, a processos para preparação do mesmo, à utilização do mesmo em tratamento e/ou prevenção de doenças e à utilização do mesmo para produção de medicamentos para tratamento e/ou prevenção de doenças, principalmente doenças cardiovasculares, edematosas e/ou inflamatórias.

Description

[001] A invenção refere-se a um novo pró-fármaco de polietilenoglicol (PEG) de Adrenomedulina, a processos para preparação do mesmo, à utilização do mesmo em tratamento e/ou prevenção de doenças e à utilização do mesmo para produção de medicamentos para tratamento e/ou prevenção de doenças, principalmente doenças cardiovasculares, edematosas e/ou inflamatórias.
[002] A adrenomedulina (ADM), um peptídeo hormonal de 52 aminoácidos (ADM), é produzida na glândula adrenal, pulmão, rim, músculo cardíaco e outros órgãos. Os níveis de plasma da ADM encontram-se em uma ordem picomolar baixa. ADM é um membro da família do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), dentro das famílias dos peptídeos, e como tal ligase a um receptor acoplado à proteína G heterodimérica que consiste em CRLR e RAMP 2 ou 3 (receptor do tipo do receptor da Calcitonina e proteína 2 ou 3 modificadora da atividade do receptor). A ativação do receptor da ADM origina uma elevação intracelular de adenosina 3', 5' monofosfato cíclico (cAMP) nas células que possuem o receptor. Os receptores da ADM encontram-se presentes em diferentes tipos de células em quase todos os órgãos, incluindo as células endoteliais. A ADM deverá ser metabolizada por endopeptidase neutra e é predominantemente eliminada no pulmão onde os receptores da ADM são altamente expressos [para revisão, ver, Gibbons C., Dackor R., Dunworth W., Fritz-Six K., Caron K.M., Mol Endocrinol 21(4),783-796 (2007)].
[003] Dados experimentais da literatura sugerem que a ADM se encontra envolvida em uma variedade de papéis funcionais que incluem, entre outros, regulação de tensão arterial, broncodilatação, função renal, secreção hormonal, crescimento celular, diferenciação, neurotransmissão e modulação de reposta imune. Mais ainda, a ADM desempenha um papel crucial como fator autócrino durante a proliferação e regeneração de células endoteliais [para revisão, ver, García M.A., Martín-Santamaría S., de Pascual-Teresa B., Ramos A., Julián M., Martínez A., Expert Opin Ther Targets, 10(2), 303-317 (2006)] García M.A., Martin-Santamaria S., de Pascual-Teresa B., Ramos A., Julian M., Martinez A., Expert Opin Ther Targets, 10(2), 303-317 (2006)]
[004] Existe grande evidência com base na literatura que mostra que a ADM é indispensável para a função intacta da barreira endotelial e que a administração de ADM para níveis supra fisiológicos exerce um papel muito importante no que respeita às funções anti-edematosas e anti-inflamatórias Em uma variedade de condições inflamatórias em experiências com animais, incluindo sepse, lesão pulmonar aguda e inflamação do intestino [para revisão, ver, Temmesfeld-Wollbrück B., Hocke A.C., Suttorp N., Hippenstiel S., Thromb Haemost, 98, 944-951 (2007)]
[005] Testes clínicos de ADM têm sido até agora conduzidos em indicações cardiovasculares, com um endpoint hemodinâmico medível, tal como, hipertensão pulmonar, hipertensão, insuficiência cardíaca e enfarte do miocárdio agudo. ADM revelou efeitos hemodinâmicos em alguns doentes que sofriam das condições patológicas acima referidas. No entanto, os efeitos eram de pouca duração e terminavam logo após o final da administração. Estas descobertas correlacionaram-se bem com o perfil farmacocinético de ADM conhecido. Efeitos farmacocinéticos incluíam, entre outros, a redução da tensão arterial pulmonar e sistêmica e aumento do débito cardíaco [Troughton R.W., Lewis L.K., Yandle T.G., Richards A.M., Nicholls M.G., Hypertension, 36(4), 588-93 (2000); Nagaya N., Kangawa K., Peptides,. 25(11), 2013-8 (2004); Kataoka Y., Miyazaki S., Yasuda S., Nagaya N., Noguchi T., Yamada N., Morii I., Kawamura A., Doi K., Miyatake K., Tomoike H., Kangawa K., J Cardiovasc Pharmacol, 56(4), 413-9 (2010)]
[006] Em resumo, com base em factos provenientes de uma riqueza de dados experimentais em animais e primeiros ensaios clínicos no homem, a elevação de ADM para níveis suprafisiológicos pode ser considerada como um mecanismo alvo para o tratamento de uma variedade de estados patológicos no homem e em animais. No entanto, a maior limitação da utilização de ADM como agente terapêutico é a aplicabilidade inconveniente de terapia de infusão contínua, a qual exclui a sua utilização na maioria das indicações potenciais e as margens de segurança potencialmente limitadas no que respeita a hipotensão, a qual pode resultar da administração de bolus de ADM.
[007] O objeto da presente invenção é apresentar compostos novos os quais podem ser empregues no tratamento de doenças, em particular, doenças cardiovasculares, edematosas e inflamatórias.
[008] Muitos peptídeos terapeuticamente ativos ou proteínas enfrentam uma elevada eliminação. Existem diversas abordagens para formar um “depot” injetável que envolve a utilização de macromoléculas.
[009] As matrizes de polímero que contêm a molécula do fármaco Em um estado não covalentemente ligado são bem conhecidas. Poderão existir igualmente soluções injetáveis como hidrogéis, micro partículas ou micelas. A cinética de libertação deste tipo de fármacos pode ser bastante inviável relativamente a uma variabilidade alta entre doentes. A produção destes polímeros pode prejudicar a substância sensível do fármaco ou pode ser submetido a reações secundárias indesejáveis com o polímero durante a sua degradação (D.H. Lee et al., J. Contr. Rei., 2003, 92, 291-299).
[010] Para intensificar a sua solubilidade, a peguilação permanente de peptídeos ou proteína reduz a imunogenicidade e aumenta a semivida ao reduzir a eliminação renal e é um conceito bem conhecido desde o início dos anos 80 (Caliceti P..Veronese F.M., Adv. Drug Deliv. Rev.2003, 55, 1261- 1277). Para muitos fármacos, este conceito foi utilizado com sucesso, mas com muitos exemplos a Peguilação reduz a eficácia da substância do fármaco de modo a que este conceito não seja mais adequado (T. Peleg-Shulman et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 4897-4904).
[011] Uma alternativa adequada são os pró-fármacos baseados em polímero. As definições actuals para pró-fármacos, pelo IUPAC, referem os seguintes termos (International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry: GLOSSARY OF TERMS USED IN MEDICINAL CHEMISTRY (Recommendations 1998); in Pure & Appl. Chem. Vol 70, No. 5, 1998, p. 1129-1143):
[012] Pró-fármaco: Um pró-fármaco é qualquer composto que sofra biotransformação antes de exibir os seus efeitos farmacológicos. Os pró- fármacos podem, deste modo, ser vistos como fármacos que contêm grupos protectores especializados não tóxicos utilizados de forma transiente para alterar ou eliminar propriedades indesejáveis na molécula parental.
[013] Pró-fármaco ligado ao veículo (Pró-fármaco veículo): Um pró- fármaco ligado ao veículo é um pró-fármaco que contém uma ligação temporária de uma determinada substância ativa com um grupo veículo transiente que produz propriedades físico-químicas e farmacocinéticas melhoradas e que pode ser facilmente removida in vivo, normalmente por meio de divagem hidrolítica.
[014] Pró-fármaco em cascata: Um pró-fármaco em cascata, para o qual a divagem do grupo veículo se torna eficaz apenas após desmascarar um grupo ativador.
[015] Existem inúmeros exemplos de pró-fármacos veículo baseados em PEG, sendo que a maioria destes necessita de ativação enzimática do ligante entre o pró-fármaco ativo e o veículo, e sendo a maior parte iniciada por hidrólise enzimática. Considerando que os ésteres são facilmente eliminados e imprevisíveis in vivo, os ligantes directos de éster para o pró-fármaco veículo possuem limitações na sua utilização (J. Rautio et al., Nature Reviews Drug discovery, 2008, 7 255-270).
[016] Abordagens alternativas comumente utilizadas são os ligantes em cascata ligantes a uma funcionalidade amina no peptídeo ou proteína. Nos ligantes em cascata, o grupo mascarado tem que ser removido como a fase de limitação da velocidade na cascata. Isto ativa o ligante para se decompor Em uma segunda posição para libertar o peptídeo ou a proteína. Normalmente, o grupo mascarado pode ser removido por um mecanismo enzimático (R.B.Greenwald et al. in W02002/089789, Greenwald, et al., J. Med. Chem. 1999, 42, 3657-3667, F.M.H. DeGroot et al. em W02002/083180 e W02004/043493, e D. Shabat et al. in W02004/019993).
[017] Uma ativação enzimática alternativa mas não muito segura é o conceito de Hersel et al. em W02005/099768. Nas suas abordagens, o grupo mascarado Em um fenol é removido Em uma forma puramente dependente de pH pelo ataque de um nucleófilo interno. Este ativa o ligante para decomposição adicional.
[018] Tal como mencionado por U. Hersel et al. em W02005/099768, “A desvantagem nos sistemas de pró-fármacos acima mencionados, descrita por Greenwald, DeGroot e Shabat, é a libertação de produtos secundários de pequena molécula potencialmente aromática e tóxica como metídeo quinona após divagem da ligação temporária. As entidades potencialmente tóxicas são libertadas Em uma estoicometria 1:1 com o fármaco e podem assumir altas concentrações in vivo. O mesmo problema é também válido para o sistema de Hersel et al.
[019] Para pequenas moléculas orgânicas, existe um grande número de diferentes abordagens ao pró-fármaco (J. Rautio et al., Nature Reviews Drug discovery, 2008, 7 255-270). A abordagem utilizado por U. Hersel et al., como mecanismo de libertação para o seu grupo mascarado, tem sido utilizada como uma abordagem ao fármaco para grupos fenólicos de pequenas moléculas desde os finais dos anos 80. (W.S. Saari em EP 0296 811 e W.S. Saari et al., J. Med. Chem. 1990, Vol 33, N° 1, p 97-101).
[020] Um sistema alternativo do fármaco baseado em amina tem por base a hidrólise lenta de glicina de bis-hidroxietilo como um pró-fármaco em cascata. Os grupos hidroxi de glicina bis-hidroxietilo são mascarados por ésteres que são susceptíveis à hidrólise por esterases (R. Greenwald et al., J. Med. Chem. 2004, 47, 726-734 e D. Vetter et al. em WO 2006/136586).
[021] São conhecidos derivados marcados com Adrenomedulina para utilização como imagem e também como agente terapêutico (J. Depuis et al. em CA 2567478 e WO 2008/138141). Nestes derivados ADM, uma caixa complexa como uma estrutura molecular com capacidade para ligar isotopos reativos, foi ligada ao terminal N de ADM Em uma forma potencialmente directa ou por meio de uma unidade espaçadora incluindo também pequenos espaçadores PEG. O diagnóstico ou valor terapêutico destes pró-fármaco surge da aplicação orientada da molécula radioativa.
[022] Contrariamente às abordagens do pró-fármaco acima referidas, as quais são todas baseadas em funcionalidades amina mascaradas, a presente invenção baseia-se em mascarar o grupo fenólico de uma tirosina em ADM. É utilizado um pró-fármaco ligado ao veículo com base na clivagem interna assistida do nucleófilo de um carbamato neste grupo fenólico. A vantagem- chave de outras classes de pró-fármacos acima mencionada é a inocuidade do produto de decomposição do ligante, uma ureia cíclica permanentemente ligada ao veículo. Para além disso, a decomposição do pró-fármaco não depende de mecanismos enzimáticos que possam causar variabilidade inter doente de cinética de clivagem. O mecanismo de clivagem é apenas dependente de pH assim como uma amina interna que é protonada a pH ácido é ativada a um pH (neutro) superior para actuar como um nucleófilo que ataca o carbamato fenólico baseado na tirosina.
[023] No contexto da presente invenção, os compostos são agora descritos e que actuam como pró-fármacos ADM de libertação lenta com duração prolongada de ação farmacológica comparativamente ao ADM e o qual, com base neste mecanismo de ação específico - após administração parentérica - exerce efeitos anti-inflamatórios sustentados in vivo e hemodinâmicos, tais como, estabilização da função de barreira endotelial e diminuição da tensão arterial, respectivamente.
[024] A presente invenção apresenta compostos da fórmula (I):
Figure img0001
em que n representa o número 0, 1, 2 ou 3, R1 representa hidrogênio, metilo, etilo, n-propilo ou isopropilo, R2representa PEG 20kDa a 80kDa linear ou ramificado com um grupo metoxi terminal, e sais do mesmo, solvatos do mesmo e solvatos de sais do mesmo.
[025] Compostos, de acordo com a invenção, são os compostos da fórmula (I) e sais do mesmo, solvatos do mesmo e solvatos dos sais do mesmo, os compostos que são abrangidos pela fórmula (I) e são das fórmulas especificadas abaixo e sais dos mesmos, solvatos dos mesmos e solvatos dos sais dos mesmos e os compostos que são abrangidos pela fórmula (I) e que são especificados abaixo como exemplos de trabalho e sais dos mesmos, solvatos dos mesmos e solvatos dos sais dos mesmos, se os compostos que são abrangidos pela fórmula (I) e que são abaixo especificados não forem ainda sais, solvatos ou solvatos dos sais.
[026] Dependendo da sua estrutura, os compostos de acordo com a invenção, podem existir em formas estereoisoméricas (enantiômeros, diastereômeros). A presente invenção inclui assim os enantiômeros e diastereômeros e as respectivas misturas. Os constituintes esteroisomericamente homogéneos podem ser isolados Em uma maneira conhecida a partir dessas misturas de enantiômeros e/ou diastereômeros.
[027] Quando os compostos de acordo com a invenção podem ocorrer em forma tautomérica, a presente invenção engioba todas as formas Lauloméricas.
[028] No contexto da presente invenção, os sais preferidos são sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos de acordo com a invenção. São também incluídos os sais que não são em si adequados para aplicações farmacêuticas mas que podem ser utilizados, por exemplo, no isolamento e purificação dos compostos de acordo com a invenção.
[029] Os sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos de acordo com a presente invenção incluem sais de adição de ácido de ácidos minerais, ácidos carboxílicos e ácidos sulfônicos, por exemplo, sais de ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido toluenosulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido naftalenossulfônico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico e ácido benzóico.
[030] Sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos de acordo com a invenção incluem igualmente sais de bases usuais, por exemplo e preferencialmente sais de metal alcalino (por ex. sais de sódio e de potássio), sais de metal alcalino-terrosos (por ex. sais de cálcio ou de magnésio) e sais de amónio, derivados de amónia ou aminas orgânicas com 1 a 16 átomos de carbono, por exemplo e preferencialmente etilamina, dietilamina, trietilamina, etildiisopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciclohexilamina, dimetilaminoetanol, procaína, dibenzilamina, N- metilmorfolina, arginina, lisina, etilenediamina e N-metilpiperidina.
[031] No contexto da invenção, os solvatos são aquelas formas dos compostos de acordo com a invenção que, em estado sólido ou líquido, formam um complexo por coordenação com moléculas de solvente. Os hidratos são uma forma específica dos solvatos nos quais a coordenação é com água. Os solvatos preferidos no contexto da presente invenção são hidratos.
[032] No contexto da invenção, com um grupo metoxi terminal mencionado em R2 significa que o polietilenoglicol (PEG) é substituído com um grupo metoxi na extremidade que não se encontra iigada ao oxigênio, i.e. - PEG 40kDa-OMe.
[033] É dada preferência aos compostos da fórmula (I) na qual n representa o número 1 ou 2, R1 representa hidrogênio ou metilo, R2representa PEG 40kDa linear com um grupo metoxi terminal.
[034] É dada também preferência aos compostos da fórmula (I) na qual n representa o número 1 ou 2, R1 representa hidrogênio, R2 representa PEG 40kDa linear com um grupo metoxi terminal.
[035] É dada também preferência aos compostos da fórmula (I) na qual n representa o número 1.
[036] É igualmente dada preferência aos compostos da fórmula (I) em que R1 representa hidrogênio.
[037] É igualmente dada preferência aos compostos da fórmula (I) em que o átomo de carbono ao qual os substituintes -NHR1 se encontram ligados tem uma configuração S.
[038] É igualmente dada preferência aos compostos da fórmula (I) em que R2 representa PEG 40kDa com um grupo metoxi terminal.
[039] É igualmente dada preferência aos compostos da fórmula (I) que têm a estrutura da fórmula (la)
Figure img0002
em que em que R1 e R2 são cada um como acima definido, e sais do mesmo, solvatos do mesmo e solvatos de sais do mesmo.
[040] As definições específicas de radical apresentadas nas combinações particulares ou em combinações preferidas de radicais são, independentemente das combinações particulares dos radicais especificadas, também substituídas por qualquer definição de radical de outras combinações.
[041] Dá-se particular preferência às combinações de dois ou mais dos intervalos acima referidos.
[042] A invenção apresenta ainda um processo para preparação dos compostos de fórmula (I), ou sais dos mesmos, solvatos dos mesmos ou solvatos de sais dos mesmos, em que os compostos da fórmula (II)
Figure img0003
em que em que n e R1 são cada um como acima definido, são feitos reagir com compostos da fórmula (III)
Figure img0004
em que Rz é definido como acima;
[043] A reação é normalmente realizada em solventes inertes, de preferência Em um intervalo de temperatura de 0°C a 50°C a pressão padrão.
[044] Os solventes inertes são, por exemplo, tampões citrato, tampões cloridrato de glicina, tampões fosfato ou tampões acetato de pH 3 a 5, sendo que é dada preferência ao tampão citrato de pH 4.
[045] O composto da formula (III) é conhecido ou pode ser sintetizado por processos conhecidos a partir dos compostos de partida apropriados.
[046] Os compostos da fórmula (II) são conhecidos ou podem ser preparados ao fazer reagir os compostos da fórmula (IV)
Figure img0005
em que em que n e R1 são cada um como acima definido, na primeira fase com o composto da fórmula (V)
Figure img0006
e na segunda fase com um ácido.
[047] A reação, na primeira fase, é normalmente realizada em solventes inertes, na presença de um reagente desidratante, opcionaimente na presença de uma base, de preferência a um intervalo de temperatura que varia entre temperatura ambiente e 70°C a pressão padrão.
[048] Solventes inertes são, por exemplo, halohidrocarbonos, tais como, diclorometano, triclorometano ou 1,2-dicloroetano, éteres, tais como, dioxano, tetrahidrofurano ou 1,2-dimetoxietano ou outros solventes, tais como, acetona, dimetilformamida, dimetilacetamida, 2-butanona ou acetonitrila. É igualmente possível utilizar misturas dos solventes. É dada preferência a dimetilformamida.
[049] Reagentes desidratantes adequados neste contexto são, por exemplo, carbodiimidas, por exemplo, N, N-dietil-, N, N -dipropil-, N,N'- diisopropil-, /V,/V'-diciclohexilcarbodiimida, cloridrato de A/-(3- dimetilaminoisopropil)-/V'-etilcarbodiimida (EDC), /V-ciclohexilcarbodiimida-A/- propiloximetilpolistireno (PS-carbodiimida), ou compostos carbonila, tais como, carbonildiimidazol, ou compostos 1,2-oxazólio, tais como, 3-sulfato de 2-etil-5- fenil-1,2-oxazólio ou perclorato de 2-terc-butil-5-metilisoxazólio, ou compostos acilamino, tais como, 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina, ou anidrido propanofosfônico, ou cloroformato de isobutilo, ou cloreto de bis-(2-oxo-3- oxazolidinil)fosforilo ou hexafluorofosfato de benzotriazoliloxitri(dimetilamino)fosfônio ou hexafluorofosfato de O- (benzotriazol-1-il)-/\/,/\/,A/',A/'-tetrametilurônio (HBTU), tetrafluoroborato de benzotriazol-1-il-N-tetrametil-urônio (TBTU), tetrafluoroborato 2-(2-oxo-1-(2H)- piridil)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TPTU) ou hexafluorofosfato O-(7- azabenzotriazol-1-il)-A/,/V,A/',A/'-tetrametilurônio (HATU), ou 1- hidroxibenzotriazol (HOBt) ou hexafluorofosfato benzotriazol-1- iloxitris(dimetilamino)fosfônio (BOP), ou hexafluorofosfato benzotriazol-1- Íloxitris(pirrolidino)fosfônio (PYBOP), ou A/-hidroxisuccinimÍda, ou misturas destes com bases.
[050] Bases são, por exemplo, carbonatos de metal alcalino, por exemplo, carbonato de sódio ou carbonato de potássio, hidrogenocarbonato de sódio ou hidrogenocarbonato de potássio, ou bases orgânicas, tais como, trialquilamins, por exemplo, trietilamina, /V-metilmorfolina, A/-metilpiperidina, 4- dimetilaminopiridina ou N,N-diisopropiletilamina, sendo dada preferência a N,N- diisopropiletilamina.
[051] Preferencialmente, a condensação é realizada com TBTU na presença de N,N-diisopropiletilamina.
[052] A reação de segunda fase é opcionalmente realizada em solventes inertes, de preferência a um intervalo de temperatura desde a temperatura ambiente a 50°C a pressão padrão.
[053] Os solventes inertes são, por exemplo, halohidrocarbonos, tais como, diclorometano, triclorometano, tetracloreto de carbono ou 1,2- dicloroetano, ou éteres, tais como, tetrahidrofurano ou dioxano, sendo dada preferência a diclorometano.
[054] Os ácidos são, por exemplo, ácido trifluoroacético ou cloreto de hidrogênio em dioxano, sendo dada preferência a ácido trifluoroacético concentrado. O ácido trifluoroacético concentrado pode ser utilizado com adição de absorvedores como água, fenol, tioanisole e 1,2-etanodiol. É dada preferência a 1 a 5% de cada um destes absorvedores.
[055] O composto da fórmula (V) é conhecido ou pode ser sintetizado por processos conhecidos a partir dos compostos de partida apropriados (exemplo 14a).
[056] Os compostos da fórmula (V) são conhecidos ou podem ser preparados ao fazer reagir os compostos da fórmula (VI)
Figure img0007
em que em que n e R1 são cada um como acima definido, com uma fonte de Paládio(O) e um agente redutor.
[057] A reação é normalmente realizada em solventes inertes, opcionalmente na presença de uma base fraca, de preferência Em um intervalo de temperatura de 0°C a 50°C a pressão padrão.
[058] Solventes inertes são, por exemplo, halohidrocarbonos, tais como, diclorometano, triclorometano ou 1,2-dicloroetano, éteres, tais como, dioxano, tetrahidrofurano ou 1,2-dimetoxietano ou outros solventes, tais como, acetona, dimetilformamida, dimetilacetamida, 2-butanona ou acetonitrila. É igualmente possível utilizar misturas dos solventes. É dada preferência a tetrahidrofurano.
[059] As fontes Paládio(O) são, por exemplo, tetraquis(trifenilfosfin)paládio(0), tris(dibenzilideneacetona)dipaládio(0) ou fontes Paládio(O) que são reduzidas In situ para Paládio(O) durante a reação, sendo dada preferência a tetraquis(trifenilfosfin)paládio(0).
[060] Os agentes redutores são, por exemplo, ácido fórmico ou trietilsilano, sendo dada preferência ao ácido fórmico.
[061] As bases são, por exemplo, trietilamina, N.N-diisopropiletilamina ou solução de fosfato de potássio, sendo dada preferência a trietilamina.
[062] Os compostos da fórmula (VI) são conhecidos ou podem ser preparados ao fazer reagir os compostos da fórmula (VII)
Figure img0008
em que em que n e R1 são cada um como acima definido, e com um composto da fórmula (VIII)
Figure img0009
[063] A reação é normalmente realizada em solventes inertes, na presença de um reagente desidratante, opcionalmente na presença de uma base, de preferência a um intervalo de temperatura que varia entre temperatura ambiente e 70°C a pressão padrão.
[064] Solventes inertes são, por exemplo, halohidrocarbonos, tais como, diclorometano, triclorometano ou 1,2-dicloroetano, éteres, tais como, dioxano, tetrahidrofurano ou 1,2-dimetoxietano ou outros solventes, tais como, acetona, dimetilformamida, dimetilacetamida, 2-butanona ou acetonitrila. É igualmente possível utilizar misturas dos solventes. É dada preferência a diclorometano.
[065] Reagentes desidratantes adequados neste contexto são, por exemplo, carbodiimidas, por exemplo, Δ/;Δ/'-diθtil-, N,N-dipropil-, N,N'- diisopropil-, N, N -diciclohexilcarbodiimida, cloridrato de N-(3- dimetilaminoisopropil)-/V'-etilcarbodiimida (EDC), A/-ciclohexilcarbodiimida-A/- propiloximetilpolistireno (PS-carbodiimida), ou compostos carbonila, tais como, carbonildiimidazol, ou compostos 1,2-oxazólio, tais como, 3-sulfato de 2-etil-5- fenil-1,2-oxazólio ou perclorato de 2-terc-butil-5-metilisoxazólio, ou compostos acilamino, tais como, 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina, ou anidrido propanofosfônico, ou cloroformato de isobutilo, ou cloreto de bis-(2-oxo-3- oxazolidinil)fosforilo ou hexafluorofosfato de benzotriazoliloxitri(dimetilamino)fosfônio ou hexafluorofosfato de O- (benzotriazol-1 -il)-/V, N, N', N -tetrametilurônio (HBTU), tetrafluoroborato de benzotriazol-1-il-N-tetrametil-urônio (TBTU), tetrafluoroborato 2-(2-oxo-1-(2H)- piridil)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TPTU) ou hexafluorofosfato O-(7- azabenzotriazol-1-il)-A/,/\/,/V',/\/'-tetrametilurônio (HATU), ou 1- hidroxibenzotriazol (HOBt) ou hexafluorofosfato benzotriazol-1- iloxitris(dimetilamino)fosfônio (BOP), ou hexafluorofosfato benzotriazol-1- iloxitris(pirrolidino)fosfônio (PYBOP), ou A/-hidroxisuccinimida, ou misturas destes com bases.
[066] Bases são, por exemplo, carbonatos de metal alcalino, por exemplo, carbonato de sódio ou carbonato de potássio, hidrogenocarbonato de sódio ou hidrogenocarbonato de potássio, ou bases orgânicas, tais como, trialquilaminas, por exemplo, trietilamina, A/-metilmorfolina, AZ-metilpiperidina, 4- dimetilaminopiridina ou N,N-diisopropiletilamina, sendo dada preferência a N,N- diisopropiletilamina.
[067] Preferencialmente, a condensação é realizada com HATU na presença de N,N-diisopropiletilamina.
[068] Os compostos da formula (VII) e (VIII) são conhecidos ou podem ser sintetizados por processos conhecidos a partir dos compostos de partida apropriados.
[069] A preparação dos compostos de acordo com a invenção, podem ser ilustrados pelo seguinte esquema síntese:
Figure img0010
[070] Os compostos, de acordo com a invenção, apresentam um espectro útil imprevisível de atividade farmacológica.
[071] Por conseguinte, estes são adequados para utilização como medicamentoa para tratamento e/ou prevenção de doençs em seres humanos e animais.
[072] Os compostos, de acordo com a invenão, são distinguidos como pró- fármacos de libertação de adenomedulina (ADM) específicos.
[073] A presente invenção apresenta ainda a utilização dos compostos de acordo com a invenção, para tratamento e/ou prevenção de doenças, principalmente doenças cardiovasculares, edematosas e/ou inflamatórias.
[074] Para a presente invenção, o termo “tratamento” ou "tratar” inciui inibir, atrasar, aliviar, mitigar, suspender, reduzir ou causar a regressão de uma doença, patologia, condição ou estado, o desenvolvimento e/ou progressão da mesma e/ou sintomas da mesma. O termo “prevenção" ou “prevenir” inclui a redução do risco de sofrer, contrair ou experimentar uma doença, patologia, condição ou estado, o desenvolvimento da mesma e/ou sintomas da mesma. O termo prevenção inclui profilaxia. Tratamento ou prevenção de uma doença, patologia, condição ou estado pode ser parcial ou completo.
[075] Com base nas suas propriedades farmacológicas, os compostos, de acordo com a invenção, podem ser empregues no tratamento e/ou prevençãode doenças cardiovasculares, em particular, insuficiência cardíaca, principalmente insuficiência cardiac aguda ou crônica, insuficiência cardíaca diastólica e sistólica (congestive), insuficiência cardíaca aguda descompensada, insuficiência cardíaca, doença coronária, angina de peito, enfarte do miocárdio, lesão de reperfusão isquêmica e acidente vascular cerebral hemorrágico, arteriosclerose, aterosclerose, hipertensão, principalmente hipertensão essencial, hipertensão essencial maligna, hipertensão secundária, hipertensão renovascular e hipertensão secundária para doenças renais e endocrinas, doença cardíaca hipertensiva, doença renal hipertensiva, hipertensão pulmonar, principalmente hipertensão pulmonar secundária, hipertensão pulmonar a seguir a embolia pulmonar com ou sem cor pulmonale aguda, hipertensão pulmonar primária e doença oclusiva arterial periférica.
[076] Os compostos, de acordo com a invenção, são ainda mais adequados para o tratamento e/ou prevenção de edema gestacional [induzido por gravidez] e proteinuria com ou sem hipertensão (pré-eclampsia).
[077] Os compostos de acordo com a invenção e adequados para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios pulmonares, tal como doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, edema pulmonar agudo ou crônico, alveolite alérgica e pneumonite devido a poeiras orgânicas e partículas de fungos inaladas, actinomicetos ou outros, bronquite química aguda, edema pulmonar químico agudo ou crônico (por ex. na sequência da inalação de fosgênio, óxido de nitrogênio) edema pulmonar neurogênico, manifestações pulmonares agudas oui crônicas devido a radiação, distúrbios pulmonares intersticiais agudos ou crônicos (tal como, sem constituir restrição, distúrbios pulmonares induzidos por fármacos, por ex. efeitos secundários de tratamento com bleomicina), lesões pulmonares agudas/síndrome da dificuldade respiratória aguda (ALI/ARDS em inglês) no adulto ou criança, incluindo recém- nascidos, ALI/ARDS na sequência de pneumonia e sepse, pneumonia por aspiração e ALI/ARDS na sequência de aspiração (tal como, sem constituir restrição, pneumonia por aspiração devido a inalação do conteúdo gástrico), ALI/ARDS na sequência da inalação de fumaça, lesões pulmonares agudas relacionadas com transfusões (TRALI, em inglês), ALI/ARDS u insuficiência pulmonar aguda na sequência de cirurgia, traumatismo ou queimaduras, lesões pulmonares induzidas pelo ventilador (VILI), lesão pulmonar uma sequência da aspiração de mecônio, fibrose pulmonar e mal da montanha.
[078] Os compostos de acordo com a invenção e também adequados para o tratamento e/ou prevenção de doenças renais crônicas (fases 1-5), insuficiência renal, nefropatia diabética, doença renal crônica hipertensiva, glumerolonefrite, síndrome nefrítico de rápida progressão e crônico, sindrome nerítico inespecífico, síndrome nefrótico, nefropatias hereditárias, nefrite tubulo- intersticial aguda e crônica, leões renais agudas, insuficiência renal aguda, insuficiência renal pós-traumática, leões renais traumáticas e pós-cirurgicas. síndrome cardiorrenal e melhoria da proteção e funcional dos transplantes renais.
[079] Os compostos são mais adequados para o tratamento e/ou prevenção de diabetes mellitus e sintomas consecutivos, tal como, por ex. macro e microangiopatia diabética, nefropatia e neuropatia diabética.
[080] Os compostos de acordo com a invenção podem ainda ser utilizados no tratamento e/ou prevenção de distúrbios do sistema nervoso central e periférico, tais como meningite virai e bactenana e encefalite (por ex. encefalite Zoster), lesão cerebral, neoplasmas malignos primários ou secundários [meta'stases] do cérebro e medula espinal, radiculite e polirradiculite, síndrome de Guillan-Barre [polineurite (pós)-infecciosa aguda, síndrome de Miller Fisher], esclerose lateral amiotrófica [atrofia progressiva do músculo espinal], doença de Parkinson, polineuropatias agudas e crônicas, dor, edema cerebral, doença de Alzheimer, doenças degenerativas do sistema nervoso e doenças desmielinizantes do sistema nervoso central, tal como, sem constituir restrição, a esclerose múltipla.
[081] Os compostos de acordo com a invenção são ainda adequados para o tratamento e/ou prevenção de hipertensão portal e fibrose hepática [cirrose] e respectivas sequelas, tal como varizes esofágicas e ascite, para o tratamento e/ou prevenção de efusões pleurais na sequência de doenças malignas ou inflamações e para o tratamento e/ou prevenção de linfedema e do edema na sequência de varizes.
[082] Os compostos de acordo com a invenção são ainda adequados para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios inflamatórios do trato gastrointestinal, tal como doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa e distúrbios tóxicos e vasculares do intestino.
[083] Os compostos de acordo com a invenção são ainda adequados para o tratamento e/ou prevenção de sepse, choque séptico, síndrome da resposta inflamatória (SIRS, em inglês) de origem não infecciosa, choque hemorrágico, sepse ou SIRS, com disfunção dos órgãos ou insuficiência multi-órgãos (MOF, em inglês), choque traumático, choque tóxico, choque anafilático, urticária, picadas de insectos e alergias relacionadas com mordeduras, edema angiogênico [urticária gigante], edema de Quincke], laringite aguda e traqueíte e laringite obstrutiva aguda [crupe] e epiglotite.
[084] Os compostos são ainda adequados para o tratamento e/ou prevenção de doenças do tipo reumático e outras formas patológicas que se contam entre as doenças autoimunes, tal como, sem constituir restrição, poliartrite, lupos eritematoso, escleroderma, púrpura e vascuiite.
[085] Os compostos, de acordo com a invenção, são ainda mais adequados para o tratamento da hipertensão ocular (glaucoma) retinopatia diabética e edema macular.
[086] Os compostos de acordo com a invenção podem ainda ser utilizados no tratamento e/ou prevenção de estados isquêmicos relacionados com intervenções e sintomas consecutivos dos mesmos na sequência de intervenções cirúrgicas, em particular intervenções no coração com máquina de circulação extracorpórea (por ex. operações de bypass, implantes de válvulas cardíacas), intervenções nas artérias carótidas, intervenções na aorta e intervenções com abertura instrumental ou penetração da caixa craniana.
[087] Os compostos são ainda adequados para o tratamento em geral e/ou prevenção em caso de intervenções cirúrgicas com o objetivo de acelerar a cicatrização e reduzir o tempo de convalescência. São ainda adequados para a promoção da cicatrização de feridas.
[088] Os compostos são ainda adequados para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios da densidade e estrutura óssea, tal como, sem constituir restrição, osteoporose, osteomalacia e distúrbios ósseos relacionados com hiperparatiroidismo.
[089] Os compostos são ainda adequados para o tratamento e/ou prevenção de disfunções sexuais, em particular disfunção eréctil masculina.
[090] De preferência, os compostos são adequados para o tratamento e/ou prevenção de insuficiência cardíaca, doenças coronárias, AVC isquêmico e/ou hemorrágico, hipertensão pulmonar, doença oclusiva arterial periférica, pré-eclâmpsia, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, edema pulmonar agudo e/ou crônico, alveolite alérgica e pneumonite devido a poeiras orgânicas e partículas de fungos inaladas, actinomicetos ou outros, bronquite química aguda, edema pulmonar químico agudo ou crônico, edema pulmonar neurogênico, manifestações pulmonares agudas ou crônicas devido a radiação, distúrbios pulmonares intersticiais agudos ou crônicos, lesões pulmonares agudas/síndrome da dificuldade respiratória aguda (ALI/ARDS em inglês) nu adulto ou criança, incluindo recém-nascidos, ALI/ARDS na sequência de pneumonia e sepse, pneumonia por aspiração e ALI/ARDS na sequência de aspiração, ALI/ARDS na sequência da inalação de fumaça, lesões pulmonares agudas relacionadas com transfusões (TRALI, em inglês), ALI/ARDS, insuficiência pulmonar aguda na sequência de cirurgia, traumatismo ou queimaduras, lesões pulmonares induzidas pelo ventilador (VILI), lesão pulmonar na sequência da aspiração de mecônio, fibrose pulmonar, mal da montanha, doenças renais crônicas, glumerolonefrite, lesões renais agudas, síndrome cardiorrenal, linfedema, doença do intestino inflamatório, sepse, choque séptico, resposta inflamatória sistêmica (SIRS) de origem não infecciosa, choque anafilático, doença do intestino inflamatório e/ou urticária.
[091] Mais preferencialmente, os compostos são adequados para o tratamento e/ou prevenção de insuficiência cardíaca, hipertensão pulmonar, asma, edema pulmonar agudo e/ou crônico, lesões pulmonares agudas/síndrome da dificuldade respiratória aguda (ALI/ARDS em inglês) no adulto ou criança, incluindo recém-nascidos, ALI/ARDS na sequência de pneumonia e sepse, pneumonia por aspiração e ALI/ARDS na sequência de aspiração, ALI/ARDS na sequência da inalação de fumaça, lesões pulmonares agudas relacionadas com transfusões (TRALI, em inglês), ALI/ARDS e/ou insuficiência pulmonar aguda na sequência de cirurgia, traumatismo ou queimaduras e/ou lesões pulmonares induzidas pelo ventilador (VILI), lesão pulmonar na sequência da aspiração de mecônio, sepse, choque séptico, resposta inflamatória sistêmica (SIRS) de origem não infecciosa, choque anafilático, doença do intestino inflamatório e/ou urticária.
[092] A presente invenção apresenta ainda a utilização dos compostos de acordo com a invenção, para tratamento e/ou prevenção de doenças, em particular das doenças referidas anteriormente.
[093] A presente invenção apresenta ainda a utilização dos compostos de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento e/ou prevenção de doenças, em particular das doenças referidas anteriormente.
[094] A presente invenção apresenta ainda um método destinado ao tratamento e/ou prevenção de distúrbios, em especial os distúrbios referidos anteriormente, utilizando uma quantidade ativa dos compostos de acordo com a invenção.
[095] A presente invenção apresenta ainda medicamentos compreendendo um composto de acordo com a invenção e um ou mais outros ingredientes ativos, em particular para tratamento e/ou prevenção dos distúrbios referidos anteriormente. As combinações de ingredientes ativos de exemplo e preferidas são: Inibidores ACE, antagonistas do receptor e angiotensina, agonistas do receptor beta-2, inibidores de fosfodiesterease, agonistas do receptor glucocorticóide, diuréticos ou angiotensina recombinante conversora da enzima-2 ou ácido acetilsalicílico (aspirina).
[096] Em uma realização preferida da invenção, os compostos, de acordo com a invenção, são administrados em combinação com um inibidor de ACE, tal como, por exemplo e de preferência enalapril, quinapril, captopril, lisinopril, ramipril, delapril, fosinopril, quinopril, perindopril, cilazapril, imidapril, benazepril, moexipril, spirapril ou trandopril.
[097] Em uma realização preferida da invenção, os compostos, de acordo com a invenção, são administrados em combinação com um antagonista do receptor de angiotensina, tal como, por exemplo e de preferência losartan, candesartan, valsartan, telmisartan ou embursatan.
[098] Em uma realização preferida da invenção, os compostos, de acordo com a invenção, são administrados em combinação com um antagonista do receptor de beta-2, tal como, por exemplo e de preferência salbutamol, pirbuterol, salmeterol, terbutalin, fenoterol, tulobuterol, clenbuterol, reproterol ou formoterol.
[099] Em uma realização preferida da invenção, os compostos, de acordo com a invenção, são administrados em combinação com um inibidor de fosfodiesterase (PDE), tal como, por exemplo e de preferência milrinone, amrinone, pimobendan, cilostazol, sildenafil, vardenafil ou tadalafil.
[100] Em uma realização preferida da invenção, os compostos, de acordo com a invenção, são administrados em combinação com um antagonista do receptor glucocorticoide, tal como, por exemplo e de preferência cortiosol, cortisona, hidrocortisona, prednisona, metil-prednisolonq, prednilideno, deflazacort, fluocortolona, triamcinolona, dexametasona ou betametasona.
[101] Em uma realização preferida da invenção, os compostos, de acordo com a invenção, são administrados em combinação com diuréticos, tal como, por exemplo e de preferência furosemida, torasemida e hidroclorotiazida.
[102] A presente invenção refere-se ainda a medicamentos que contêm, pelo menos, um composto de acordo com a invenção, normalmente junto com outro ou mais excipientes inertes não tóxicos farmaceuticamente adequados e utilização dos mesmos para os efeitos acima referidos.
[103] Os compostos, de acordo com a invenção, podem ter ação sistêmica e/ou local. Para este efeito, os compostos podem ser administrados Em uma forma adequada, por exemplo, por via oral, parentérica, pulmonar, nasal, sublingual, lingual, bucal, dermal, transdermal, conjuntival, óptica ou como urn implante ou stent.
[104] Os compostos, de acordo com a invenção, podem ser administrados em formas de administração adequadas para estas vias de administração.
[105] A administração parentérica pode ocorrer evitando uma fase de absorção (por exemplo, intravenosa, intra-arterial, intracardíaca, intra-espinal ou intralombar) ou incluindo absorção (por exemplo, intramuscular, subcutânea, intercutânea, percutânea ou intraperitoneal). As formas de administração adequadas para a administração parentérica incluem preparações para injeção e perfusão na forma de soluções, suspensões, emulsões, liofilizados ou pós ésteres.
[106] São adequadas para as outras vias de administração, por exemplo, formas farmacêuticas inaláveis (incluindo inaladores em pó, nebulizadores), gotas nasais, gotas oculares, soluções ou pulverizadores, comprimidos, películas/oblatos ou suspensões aquosas (loções, misturas agitadas), suspensões lipofílicas, unguentos, cremes, sistemas terapêuticos transdermais (por exemplo, pensos, leite, pastas, espumas, pós efervescentes, implantes ou stents.
[107] É preferida a administração parentérica, especialmente a administração intravenosa.
[108] Os compostos, de acordo com a invenção, podem ser convertidos nas formas de administração indicadas. Estas podem ser obtidas Em uma forma conhecida per se ao se misturarem auxiliares inertes não tóxicos farmaceuticamente adequados. Estes excipientes incluem veículos (por exemplo, celulose microcristalina, lactose, manitol), solventes (por exemplo, polietilenoglicóis líquidos), emulsionadores e agentes dispersantes ou humectantes (por exemplo, dodecilsulfato de sódio, oleato de polioxisorbitano) ligantes (por exemplo, polivinilpirrolidona), polímeros sintéticos e naturais (por exemplo, albumina), estabilizantes (por exemplo, antioxidantes, por exemplo, ácido ascórbico), cores (por exemplo, pigmentos inorgânicos, tal como, óxidos de ferro) e ocultadores do sabor e/ou de odor.
[109] Modo geral, provou-se ser vantajoso, no caso de administração parentérica, administrar quantidades de cerca de 0,001 para 5 mg/kg, de preferência cerca de 0,01 para 1 mg/kg peso corporal para se obter resultados eficazes.
[110] No entanto, pode ser necessário, nalguns casos, desviarmo-nos das quantidades indicadas, em particular em função do peso corporal, via de administração, resposta do indivíduo ao ingrediente ativo, natureza da preparação e tempo ou intervalo entre as administrações. Por exemplo, em alguns casos, poderá ser suficiente utilizar menos do que a quantidade mínima acima mencionada, enquanto que em outros casos, o limite máximo indicado deverá ser excedido. No caso da administração de grandes quantidades poderá ser recomendável dividir estas em várias doses individuais ao longo do dia.
[111] Os exemplos seguintes ilustram a invenção. A invenção não está restringida aos exemplos.
[112] As percentagens nos testes e exemplos que se seguem são, salvo indicação em contrário, percentagens por peso; partes são partes por peso. Proporções de solventes, taxas de diluição e dados da concentração das soluções líquido/líquido baseiam-se cada uma no volume. A. Exemplos Abreviaturas AA Aminoácidos Acm acetamidometil ADM adrenomedulina (ser humano) ADM(2-52) Sequência de peptídeos de ADM AA 2 a AA 52, incluindo a aprox. ligação dissulfureto e amida C-terminal aproximadamente Boc terf-butiloxicarbonila CDI carbonildiimidazol d dia(s), dubleto (em RMN) CCF cromatografia em camada fina DCI ionização química directa (em MS) dd: Dubleto de dubletos (em RMN) DIEA N,N-diisopropiletilamina DMAP 4-dimetilaminopiridina DMF N,N-dimetilformamida DMSO dimetil sulfóxido do teórico do teórico (em rendimento) eq. ESI equivalente(s) ionização por electrospray (em MS) Fmoc (9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil h hora(s) HATU Hexafl uorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N”,N”- tetrametilurônio HPLC alta pressão, cromatografia líquida de alto desempenho LC-MS cromatografia líquida - espectrometria de massa acoplada m multipleto (em RMN) min minuto(s) MS espectroscopia de massa RMN espectroscopia de ressonância magnética nuclear pbf PEG 2,2,4,6,7-pentametilldihidrobenzofuran-5-sulfonil polietileno glicol RP fase inversa (em HPLC) TA Temperatura ambiente Rt tempo de retenção (em HPLC) s singuleto (em RMN) TBTU Tetrafluoroborato de benzotriazol-1-yl-N-tetrametil-urônio tBu terc-butilo TFA ácido trifluoroacético THF tetra-hidrofurano Trt tritilo
[113] Nomenclatura das sequências dos aminoácidos e peptídeos em conformidade com:
[114] International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry: Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (Recomendações 1983). Em: Pure & Appl. Chem. 56, Vol. 5, 1984, p. 595-624 Nome Simbol Símbolo de comum o uma letra A R Asparagina Asn N Ácido Asp D aspártico Cisteína Cis C Ácido Glu e glutâmico Glutamina Gin Q glicina Gly G Histidina His H Isoleucina lie I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptofano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Vai V Métodos LC-MS e MS
[115] Método 1 (LC-MS): Tipo de instrumento: Sistema ACQUITY SQD UPLC da Waters; coluna: Acquity UPLC HSS da Waters T3 1,8 μ 50 x 1 mm; fase móvel A: 1 I água + 0,25 ml ácido fórmico a 99%, fase móvel B: 1 I acetonitrila + 0,25 ml ácido fórmico a 99%, gradiente: 0,0 min 90% A —> 1,2 min 5% A -+ 2,0 min 5% A, forno: 50 °C; fluxo: 0,40 ml/min; deteção UV: 210 — 400 nm.
[116] Método 2 (LC-MS): Instrumento MS: tipo: Waters (Micromass) Quattro Micro; instrumento HPLC: Agilent 1100 Series; coluna: Thermo Hypersil GOLD 3 μ 20 mm x 4 mm; fase móvel A: 1 I água + 0,5 ml ácido fórmico a 50%, fase móvel B: 1 I acetonitrila + 0,5 ml ácido fórmico a 50%, gradiente: 0,0 min 100% A —> 3,0 min 10% A —> 4,0 min 10% A, forno: 50 °C; fluxo: 2,0 ml/min; deteção UV: 210 nm.
[117] Método 3. (HPLC): Tipo de instrumento: HP 1200 Series; UV DAD; coluna: Phenomenex Luna 5 μm C5 100A, 150 mm x 4,6 mm; fase móvel A: 1 I água + 0,5 ml ácido fórmico a 50%, fase móvel B: 1 I acetonitrila + 0,5 ml ácido fórmico a 50%, gradiente: 0,0 min 95%A —> 5 min 5% A; —► 5,8 min 95% A —> 6,2 min 95% A; caudal: 2,5 mL/min, forno: TA; Deteção UV: 210 nm.
[118] Método 4. (HPLC): Tipo de instrumento: HP 1200 Series; UV DAD; coluna: Merck Chromolith Fastgradient RP18 50 mm x 2 mm; fase móvel A: 1 I água + 0,5 ml ácido fórmico a 50%, fase móvel B: 1 I acetonitrila + 0,5 ml ácido fórmico a 50%, gradiente: 0,0 min 95%A -> 2,9 min 5% A —> 3,2 min 5% A; caudal: 3 ml/min; forno: TA; Deteção UV: 210 nm.
[119] Método 5 (DCI MS): Tipo de instrumento: Thermo Fisher-Scientific DSQ; ionização química; reagente amoníaco gasoso; temperatura da fonte: 200 °C; energia de ionização 70eV.
[120] Método 6 (MALDI MS): Tipo do instrumento Kratos PC-Kompact SEQ V1.2.2 MALDI TOF MS, modo de ionização positiva, Linear alto, Energia: 75.
[121] Sintetizador de microondas: Sintetizador Biotage Emrys Initiator II, com tamanho variável do frasco até 20 ml do volume da reação e processador de amostras “Robot 60”
[122] tampão citrato pH 4: Fluka No 82566; tampão citrato pH 4, estabilizado com azida de sódio
[123] Composição: ácido cítrico, -0,056 M; azida de sódio, -0,05%; cloreto de sódio, -0,044 M; hidróxido de sódio, -0,068 M.
[124] metoxi poli(etileno glicol) maleimido propionamida 40kDa (linear 40k mPEG maleimida);
[125] CAS No 724722-89-8; DE Dr. Reddys Inc., Lot No 233101301; Peso molecular poderal médio, Mw (GPC) 40500 Da; Polidispersão (GPC) 1,08. Compostos de partida Exemplo 1A
[126] Alil-N-(terc-butoxicarbonil)-0- [(4-nitrofenoxi)carbonil]-L-tirosinato
Figure img0011
[127] 36,7 g (114,3 mmol) de éster alílico de N-Boc-L-tirosina, 23,0 g (114,3 mmol) de cloroformato de 4-nitrofenilo, 17,5 ml (125,7 mmol) de trietilamina e 1,40 g (11,4 mmol) de 4-dimetilaminopiridina foram combinados em 1000 ml de diclorometano e agitados à temperatura ambiente durante 2 h. A mistura reacional foi extraída com aprox. 500 ml de água e com aprox. 250 ml de salmoura e foi seca sobre aprox 100 g de sulfato de sódio. O solvente foi removido por evaporação rotativa (aprox 40 °C, aprox 200 mbar, aprox 30 min) e o produto foi dissolvido em éter dietílico quente e deixado cristalizar de um dia para outro a 4 °C. Os cristais foram removidos por filtração, lavados com éter dietílico frio e secos sob alto vácuo (aprox. 0,1 mbar, 18 h). Rendeu 29,86 g, (59,6 mmol, 52% do teórico) do produto desejado. LC-MS (método 1): Rt = 1,23 min; m/z = 487 [M+H]+ Exemplo 2A
[128] Ácido (2S)-4-{ [(4-{(2S)-3-(Aliloxi)-2- [(terc-butoxicarbonil)amino]-3- oxopropil}fenoxi)carbonil]-amino}-2- [(tert-butoxicarbonil)amino]butanóico
Figure img0012
[129] Dissolveram-se 4,0 g (8,22 mmol) do exemplo 1A em 60 ml de ácido diclorometano. Foram adicionados 1,795 (8,22 mmol) de ácido (2S)-4-Amino-2- [(terc-butoxicarbonil)amino]butanóico e 1,43 ml (8,22 mmol) de N,N- diisopropiletilamina. A mistura reacional foi dividida em 3 porções. As porções foram aquecidas durante 30 min Em um tubo selado a 75 °C, em sintetizador de microondas. A partir da mistura reacional combinada, o solvente foi removido por evaporação rotativa (aprox 40 °C, aprox 200 mbar, aprox 30 min). O produto em bruto foi dissolvido em diclorometano e cromatografado em aprox. 600 ml de gel de sílica. Os solventes utilizados foram diclorometano/acetato de etilo 4/1, diclorometano/acetato de etilo 1/1, diclorometano/metanol 4/1 e diclorometano/ metanol 1/1. As frações que continham o produto foram combinadas e concentradas à secura sob pressão reduzida. Rendeu 4,02 g, (6,54 mmol, 80% do teórico) do produto desejado. LC-MS (método 1): Rt = 1,07 min; m/z = 564 [M-H]' Exemplo 3A
[130] O-({(3S)-4-{ [(2R)-1-amino-1-oxo-3-(tritilsulfanil)propan-2-il]amino}-3- [(terc-butoxi-carbonil)amino]-4-oxobutil}carbamoil)-N-(terc-butoxicarbonil)-L- tirosinato de alilo
Figure img0013
[131] Dissolveram-se 2,50 g (4,42 mmol) do composto do exemplo 2A em 100 ml de diclorometano. Foram adicionados 1,602 (4,42 mmol) de S-tritil-L- cisteinamida, 0,77 ml (4,42 mmol) de N,N-diisopropiletilamina e 1,68 g (4,42 mmol) de HATU. A mistura reacional foi dividida em 5 porções. As porções foram aquecidas durante 30 min Em um tubo selado a 60 °C, em sintetizador de microondas. A partir da mistura reacional combinada, o solvente foi removido por evaporação rotativa (aprox 40 °C, aprox 200 mbar, aprox 30 min). O produto em bruto foi dissolvido em diclorometano e cromatografado em aprox. 600 ml de gel de sílica. Os solventes utilizados foram diclorometano/acetato de etilo 2/1, diclorometano/acetato de etilo 1/1, diclorometano/metanol 20/1 e diclorometano/ metanol 10/1 .As frações que continham o produto foram combinadas e concentradas à secura sob pressão reduzida. Rendeu 4,12 g, (3,30 mmol, 75% do teórico, 73% pureza) do produto desejado. LC-MS (método 1): Rt = 1,36 min; m/z = 911 [M+H]+ Exemplo 4A
[132] O-({(3S)-4-{ [(2R)-1-amino-1-oxo-3-(tritilsulfanil)propan-2-il]amino}-3- [(terc-butoxicarbonil)-amino]-4-oxobutil}carbamoil)-N-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosina
Figure img0014
[133] Dissolveram-se 4,14 g (4,55 mmol) do composto do exemplo 3A em 90 ml de tetra-hidrofurano. Foram adicionados 3,17 (22,8 mmol) de trietilamina, 0,86 ml (22,8 mmol) de ácido fórmico e 0,526 g (0,455 mmol) de tetraquis(trifenilfosfin)paládio(0). A mistura reacional foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. A reação foi diluída com aprox. 100 ml de água e extraída por duas vezes com aprox. 100 ml de diclorometano. As fases orgânicas combinadas foramextraídas com salmoura, secas sobre sulfato de sódio e concentradas à secura sob pressão reduzida. O produto em bruto foi dissolvido em diclorometano e cromatografado em aprox. 500 ml de gel de sílica. Os solventes utilizados foram diclorometano, diclorometano/metanol 20/1 e diclorometano/metanol 1/1 .As frações que continham o produto foram combinadas e concentradas à secura sob pressão reduzida. Rendeu 2,62 g produto em bruto com 94,5% de pureza. O produto foi ainda purificado com RP-HPLC preparatória em C18 com um gradiente água/metanol para render 2,35 g (2,70 mmol, 59% do teórico) do produto puro. LC-MS (método 1): Rt = 1,22 min; m/z = 871 [M+Hf
[134] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): δ = 7,92 (d, 1H), 7,65 (t, 1H), 7,28-7,35 (m, 12H), 7,25-7,28 (t, 3H), 7,15-7,20 (m, 4H), 6,95 (d, 2H), 4,29 (q, 1H), 4,00 (m, 1H), 3,92 (m, 1H), 3,11 (m, 3H), 2,90 (m, 1H), 2,36 (m, 2H), 1,84 (m, 1H), 1,68 (m, 1H), 1,34 (d, 18H). Exemplo 5A terc-Butil-metil(2-oxotetrahidrofuran-3-il)carbamato
Figure img0015
[135] O composto foi sintetizado de acordo com Alberico, Dino; Paquin, Jean-Francois; Lautens, Mark; Tetrahedron, 2005, vol. 61, p. 6283 -6297.
[136] 5 ,18 g (25,7 mmol) terc-Butil(tetrahidro-2-oxo-3-furanil)carbamato, 4,81 ml (77,2 mmol) iodometano foram dissolvidos em 100 ml de dimetilformamida seca. A solução foi arrefecida a 0 °C e foram adicionados 1,34 g (60% de óleo mineral, 33,5 mmol) de hidreto de sódio. A reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada de um dia para outro. A mistura reacional foi adicionada a aprox. 400 ml de água e a mistura foi extraída três vezes com aprox 300 ml de acetato de etilo. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio e concentradas à secura sob pressão reduzida.Rendeu 8,70 g, (25,7 mmol, 100% do teórico, 63% pureza) do produto desejado.
[137] Os dados analíticos estavam conformes com a literatura. O produto foi utilizado na etapa de síntese seguinte sem ser a purificação posterior. Exemplo 6A
[138] Ácido 2- [(terc-Butoxicarbonil)(methil)amino]-4-(1,3-dioxo-1,3-dihidro- 2H-isoindol-2-il)butanóico
Figure img0016
[139] Dissolveram-se 8,70 g (25 mmol, aprox 63% de pureza) do composto do exemplo 5A em 560 ml de dimetilformamida, Foram adicionados 8,23 g (44,4 mmol) de oftalimida de potássio e a mistura reacional foi aquecida a 150 °C, durante 7 h. Aprox. 400 ml do solvente foram removidos por evaporação rotativa (aprox 60 °C, aprox 10 mbar, aprox 30 min). A mistura reacional foi vertida para uma mistura de aprox. 100 ml de água, 200 g de gelo e 15 ml de ácido acético. Depois de fundir o gelo restante, a mistura reacional foi filtrada e o filtrado foi extraído 3 vezes com aprox 100 ml de diclorometano. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio e concentradas à secura sob pressão reduzida. O produto em bruto foi dissolvido em diclorometano e cromatografado em aprox. 70 ml de gel de sílica. Os solventes utilizados foram diclorometano/acetato de etilo 9/1, diclorometano/acetato de etilol 6/4.As frações que continham o produto foram combinadas e concentradas à secura sob pressão reduzida. Rendeu 2,39 g, (6,04 mmol, 24% do teórico) do produto. LC-MS (método 1): Rt = 0,92 min; m/z = 363 [M+H]+ Exemplo 7A
[140] Ácido 4-amino-2- [(terc-butoxicarbonil)(metil)amino]butanóico O
Figure img0017
[141] Dissolveram-se 11,8 g (32,6 mmol) do composto do exemplo 6A em 640 ml de etanol e adicionaram-se 23,8 ml (488 mmol) de hidrato de hidrazina à mistura reacional. Depois de ser agitada de um dia para outro, a mistura reacional foi filtrada e o filtrado foi concentrado à secura sob pressão reduzida.O produto em bruto foi dissolvido em etanol e foram adicionados aprox. 50 g de gel de sílica, o solvente foi removido sob pressão reduzida. O sólido resultante foi adicionado Em uma coluna de gel de sílica de aprox. 500 g e submetido a cromatografia. Os solventes utilizados foram diclorometano, diclorometano/metanol 9/1 e diclorometano/metanol 1/1 .As frações que continham o produto foram combinadas e concentradas à secura sob pressão reduzida. Rendeu 2,98 g, (12,8 mmol, 39% do teórico) do produto. LC-MS (método 2): Rt = 0,21 min; m/z = 233 [M+H]+ DCI MS (método 5): m/z = 233 [M+H]+ Exemplo 8A
[142] Ácido 4-{ [(4-{(2S)-3-(Aliloxi)-2- [(terc-butoxicarbonil)amino]-3- oxopropil}fenoxi)carbonil]-amino}-2- [(terc-butoxicarbonil)(metil)amino]butanóico
Figure img0018
[143] Dissolveram-se 0,931 g (1,92 mmol) do composto do exemplo 1A em 30 ml de ácido diclorometano. Adicionaram-se 0,455 g (1,92 mmol) do composto do exemplo 7A. A mistura reacional foi dividida em 2 porções. As porções foram aquecidas durante 30 min Em um tubo selado a 80 °C, em sintetizador de microondas. O solvente foi removido sob pressão reduzida da mistura reacional combinada. O produto em bruto foi purificado por RP-HPLC preparativo, Em uma coluna C18, com um gradiente água metanol de 9/1 a 1/9.As frações que continham o produto foram combinadas e concentradas à secura sob pressão reduzida. Rendeu 0,523 g, (0,85 mmol, 44% do teórico) do produto desejado sob a forma de uma mistura de 2 diastereômeros. LC-MS (método 1): Rt = 1,08 min; m/z = 578 [M-H]' Exemplo 9A
[144] O- [(4-{ [(2R)-1-amino-1-oxo-3-(tritilsulfanil)propan-2-il]amino}-3- [(tert- butoxi-carbonil)amino]-4-oxobutil}carbamoil)-N-(terc-butoxicarbonil)-L-tirosinato de alilo
Figure img0019
[145] Dissolveram-se 2,24 g (3,86 mmol) do composto do exemplo 8A em 100 ml de diclorometano. Foram adicionados 1,401 (3,86 mmol) de S-tritil-L- cisteinamida, 0,67 ml (3,86 mmol) de N,N-diisopropiletilamina e 1,47 g (3,86 mmol) de HATU. A mistura reacional foi dividida em 5 porções. As porções foram aquecidas durante 30 min Em um tubo selado a 60 °C, em sintetizador de microondas. A partir da mistura reacionai combinada, o solvente foi removido por evaporação rotativa (aprox 40 °C, aprox 200 mbar, aprox 30 min). O produto em bruto foi purificado por RP-HPLC preparativo, Em uma coluna C18, com um gradiente água metanol de 9/1 a 1/9.As frações que continham o produto foram combinadas e concentradas à secura sob pressão reduzida. Rendeu 3,26 g, (2,75 mmol, 71% do teórico, 78% pureza) do produto desejado sob a forma de uma mistura de diastereômeros. LC-MS (método 1): Rt = 1,41 min; m/z = 924 [M+H]+ Exemplo 10A
[146] O- [(4-{ [(2R)-1-Amino-1-oxo-3-(tritilsulfanil)propan-2-il]amino}-3- [(terc- butoxicarbonil)-(metil)amino]-4-oxobutil)carbamoil]-N-(terc-butoxicarbonil)-L- tirosina
Figure img0020
[147] Dissolveram-se 2,2 g (2,38 mmol) do composto do exemplo 9A em 48 ml de tetra-hidrofurano. Foram adicionados 1,66 (11,9 mmol) de trietilamina, 0,45 ml (11,9 mmol) de ácido fórmico e 0,275 g (0,238 mmol) de tetraquis(trifenilfosfin)paládio(0), A mistura reacional foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. A reação foi diluída com aprox. 50 ml de água e extraída por duas vezes com aprox. 50 ml de diclorometano. As fases orgânicas combinadas foram extraídas com saimoura, secas sobre sulfato de sódio e concentradas à secura sob pressão reduzida.O produto em bruto foi dissolvido em diclorometano e cromatografado em aprox. 100 ml de gel de sílica. Os solventes utilizados foram diclorometano, diclorometano/metanol 50/1 e diclorometano/metanol 4/1 .As frações que continham o produto foram combinadas e concentradas à secura sob pressão reduzida. Rendeu 1,44 g, (1,61 mmol, 68% do teórico) do produto sob a forma de uma mistura de diastereômeros. LC-MS (método 1): Rt = 1,20 min; m/z = 884 [M+H]+ 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): δ = 8,00 (m, 1H), 7,65-7,90 (m, 4H), 7,18-7,35 (m, 18H), 7,10 (m, 2H), 6,96 (m, 4H), 4,60 (m, 1H), 4,46 (m, 1H), 4,30 (m, 2H), 4,05 (m, 2H), 3,00 (m, 4H), 2,75 (m, 6H), 2,36 (m, 3H), 2,00 (m, 2H), 1,82 (m, 2H), 1,40 (m, 3H), 1,35 (s, 18H). Exemplo 11A
Figure img0021
[148] O solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto em bruto foi dissolvido em diclorometano e cromatografado em aprox. 600 ml de gel de sílica. LC-MS (método 1): Exemplo 12A
Figure img0022
[149] A mistura reacional foi dividida em 3 porções. As porções foram aquecidas durante 30 min Em um tubo selado a 60 °C, em sintetizador de microondas. A partir da mistura reacional combinada, o solvente foi removido por evaporação rotativa (aprox 40 °C, aprox 200 mbar, aprox 30 min). LC-MS (método 1): Exemplo 13A
Figure img0023
[150] A mistura reacional foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. A reação foi diluída com aprox. 50 ml de água e extraída por duas vezes com aprox. 50 ml de diclorometano. As fases orgânicas combinadas foram extraídas com salmoura, secas sobre sulfato de sódio e concentradas à secura sob pressão reduzida.O produto em bruto foi dissolvido em diclorometano e cromatografado em aprox. 500 ml de gel de sílica. As frações que continham o produto foram combinadas e concentradas à secura sob pressão reduzida. LC-MS (método 1): Exemplo 14A ADM ligado a resina de amida à base de tentagel (2-52)
Figure img0024
[151] O peptídeo foi montado faseadamente em resina de amida à base de tentagel, Em um sintetizador de peptídeos automático (Protein Technologies Inc. Symphony). Foram utilizados 8 reactores de polipropileno executanto em paralelo a química idêntica. Cada reactor foi carregado com 0,05 mmol de resina Rink à base de tentagel, perfazendo um lote total de 0,4 mmol.
[152] Cada aminoácido é adicionado com um excesso molar de 8 vezes relativamente ao carregamento da resina. Os aminoácidos foram protegidos por Fmoc como grupo protector N-terminal e os grupos protectores indicados abaixo foram utilizadis oara as funcionalidades da cadeia lateral. Também 188 mg (0,59 mmol, 7,8 eq.) TBTU e 0,21 ml (1,2 mmol, 16 eq.) Foi adicionado DIEA. As reações foram executadas em DMF como solvente, tendo o DMF sido utilizado Em uma quantidade suficiente para expandir a resina e agitar esta livremente. O tempo de reação por aminoácido foi de aprox. 1 hora. A clivagem com os grupos protectores Fmoc foi alcançada com 20% piperidina/DMF, tendo os 20% piperidin/DMF sido utilizados Em uma quantidade suficiente para expandir a resina e agitar esta livremente.
[153] A sequência de acoplagem foi a seguinte: Tyr(tBu) (Tyr = Y = AA 52 de ADM humano) Gly (Gly = G = AA 51 de ADM humano) Gln(Trt) (Gin = Q = AA 50 de ADM humano) Pro (Pro - P = AA 49 de ADM humano) Ser(tBu) (Ser = S = AA 48 de ADM humano) lie (lie = I = AA 47 de ADM humano) Lys(Boc) (Lys = K = AA 46 de ADM humano) Ser(tBu) (Ser = S = AA 45 de ADM humano) Arg(pbf) (Arg = R = AA 44 de ADM humano) Pro (Pro = P = AA 43 de ADM humano) Ala (Ala = A = AA 42 de ADM humano) Vai (Vai = V = AA 41 de ADM humano) Asn(Trt) (Asn = N = AA 40 de ADM humano) Asp(OtBu)(Asp = D = AA 39 de ADM humano) Lys(Boc) (Lys = K = AA 38 de ADM humano) Asp(OtBu)(Asp = D = AA 37 de ADM humano) Lys(Boc) (Lys = K = AA 36 de ADM humano) Asp(OtBu)(Asp = D = AA 35 de ADM humano) Thr(tBu) (Thr = T = AA 34 de ADM humano) Phe (Phe = F = AA 33 de ADM humano) Gln(Trt) (Gin = Q = AA 32 de ADM humano) Tyr(tBu) (Tyr = Y = AA 31 de ADM humano) He (lie = I = AA 30 de ADM humano) Gln(Trt) (Gin = Q = AA 29 de ADM humano) His(Trt) (His = H = AA 28 de ADM humano) Ala (Ala = A = AA 27 de ADM humano) Leu (Leu = L = AA 26 de ADM humano) Lys(Boc) (Lys = K = AA 25 de ADM humano) Gln(Trt) (Gin = Q = AA 24 de ADM humano) Vai (Vai = V = AA 23 de ADM humano) Thr(tBu) (Thr = T = AA 22 de ADM humano) Cys(Trt) (Cys = C = AA 21 de ADM humano) Thr(tBu) (Thr = T = AA 20 de ADM humano) Gly (Gly = G = AA 19 de ADM humano) Phe (Phe = F = AA 18 de ADM humano) Arg(pbf) (Arg = R = AA 17 de ADM humano) Cys(Acm) (Cys = C = AA 16 de ADM humano) Gly (Gly = G = AA 15 de ADM humano) Phe (Phe = F = AA 14 de ADM humano) Ser(tBu) (Ser = S = AA 13 de ADM humano) Arg(pbf) (Arg = R = AA 12 de ADM humano) Leu (Leu = L = AA 11 de ADM humano) Gly (Gly = G = AA 10 de ADM humano) Gln(Trt) (Gin = Q = AA 9 de ADM humano) Phe (Phe = F = AA 8 de ADM humano) Asn(Trt) (Asn = N = AA 7 de ADM humano) Asn(Trt) (Asn = N = AA 6 de ADM humano) Met (Met = M = AA 5 de ADM humano) Ser(tBu) (Ser = S = AA 4 de ADM humano) Gln(Trt) (Gin = Q = AA 3 de ADM humano) Arg(pbf) (Arg = R = AA 2 de ADM humano)
[154] Foi alcançada oxidação na resina com proteção Cys(Trt) e Cys(Acm) com clivagem concomitante dos grupos de proteção e oxidação Em uma ligação dissulfureto, utilizando iodo (8 equivalentes de iodo mais 8 equivalentes de DIEA com um tempo de reação de 30 minutos). A oxidação ficou confirmada por clivagem da amostra e análise utilizando HPLC e MALDI-MS.
[155] Os 8 lotes foram reunidos para uso posterior. Exemplo 15A
[156] O-{ [(3S)-3-Amino-4-{ [(2R)-1-amino-1-oxo-3-sulfanilpropan-2- il]amino}-4-oxobutil]-carbamoil}-L-tirosil-adrenomedulina (2-52)
Figure img0025
[157] Aos 0,075 mmol do composto do exemplo 14A, foram adicionados 520 mg (0,6 mmol) do composto do exemplo 4A. Também 188 mg (0,59 mmol, 7,8 eq.) TBTU e 0,21 ml (1,2 mmol, 16 eq.) Foi adicionado DIEA. A reação foi executada com DMF como solvente, tendo o DMF sido utilizado Em uma quantidade suficiente para expandir a resina e agitar esta livremente. O tempo de reação foi de aprox 1 hora à temperatura ambiente. O peptídeo foi clivado da resina com desproteção global concomitante, utilizando TFA concentrado Em uma quantidade suficiente para expandir a resina e a agitar livremente, contendo o TFA recuperadores (1 - 5% cada de água, fenol, tioanisol e 1,2- etanodiol) com um tempo de reação de 2 !6 horas. O produto em bruto foi liofilisado e purificado por cromatografia RP, utilizando 0,1% de TFA em água e 0,1% TFA em acetonitrila como fases móveis para assegurar que o pH permanece constantemente abaixo de 4 durante o processo de purificação e de liofilização. Todas as frações contendo o íon correto por análise MALDI-MS foram reunidas. O rendimento foi de 44,0 mg de peptídeo parcialmente purificado (aprox. 0,0035 mmol, aprox.. 4,7% do teórico; grau de pureza estimado: aprox.. 50%, impureza principal: ADM (2-52)).
[158] MALDI MS (método 6): m/z = 6275(M+H)+ e 5866 (impureza: (ADM(2-52)+H)+) Exemplo 16A
[159] 0-{ [4-{ [(2R)-1 -amino-1 -oxo-3-sulfanilpropan-2-il]amino}-3- (methilamino)-4-oxobutil]-carbamoil}-L-tirosil-adrenomedulina (2-52)
Figure img0026
[160] A 0,075 mmol do composto do exemplo 14A, foram adicionados 530 mg (0,6 mmol, 8 eq.) do composto do exemplo 10A. Também 188 mg (0,59 mmol, 7,8 eq.) TBTU e 0,21 ml (1,2 mmol, 16 eq.) Foi adicionado DIEA. A reação foi executada com DMF como solvente, tendo o DMF sido utilizado Em uma quantidade suficiente para expandir a resina e agitar esta livremente. O tempo de reação foi de aprox 1 hora à temperatura ambiente. O peptídeo foi clivado da resina com desproteção global concomitante, utilizando TFA concentrado Em uma quantidade suficiente para expandir a resina e a agitar livremente, contendo o TFA recuperadores (1 - 5% cada de água, fenol, tioanisol e 1,2-etanodiol) com um tempo de reação de 2 14 horas. O produto em bruto foi liofilisado e purificado por cromatografia RP, utilizando 0,1% de TFA em água e 0,1% TFA em acetonitrila como fases móveis para assegurar que o pH permanece constantemente abaixo de 4 durante o processo de purificação e de liofilização. Todas as frações contendo o íon correto por análise MALDI- MS foram reunidas. O rendimento foi de 34,0 mg de peptídeo parcialmente purificado (aprox. 0,0026 mmol, aprox.. 3,5% do teórico; grau de pureza estimado: aprox.. 50%, impureza principal: ADM (2-52)). MALDI MS (método 6): m/z = 6289(M+H)+e 5866 (impureza: (ADM(2-52)+H)+) Exemplo 17A
[161] 0-{ [(4R)-4-Amino-5-{ [(2R)-1-amino-1-oxo-3-sulfanilpropan-2- il]amino}-5-oxopentil]-carbamoil}-L-tirosil-adrenomedulina (2-52)
Figure img0027
[162] A 0,075 mmol do composto do exemplo 14A, foram adicionados 530 mg (0,6 mmol, 8 eq.) do composto do exemplo 13A. Também 188 mg (0,59 mmol, 7,8 eq.) TBTU e 0,21 ml (1,2 mmol, 16 eq.) Foi adicionado DIEA. A reação foi executada com DMF como solvente, tendo o DMF sido utilizado Em uma quantidade suficiente para expandir a resina e agitar esta livremente. O tempo de reação foi de aprox 1 hora à temperatura ambiente. O peptídeo foi clivado da resina com desproteção global concomitante, utilizando TFA concentrado Em uma quantidade suficiente para expandir a resina e a agitar livremente, contendo o TFA recuperadores (1 - 5% cada de água, fenol, tioanisol e 1,2-etanodiol) com um tempo de reação de 2 16 horas. O produto em bruto foi liofilisado e purificado por cromatografia RP, utilizando 0,1% de TFA em água e 0,1% TFA em acetonitrila como fases móveis para assegurar que o pH permanece constantemente abaixo de 4 durante o processo de purificação e de liofilização. Todas as frações contendo o íon correto por análise MALDI- MS foram reunidas. O rendimento foi de 47 mg de peptídeo parcialmente purificado (aprox. 0,0037 mmol, aprox. 5,0% do teórico; grau de pureza estimado: aprox.. 50%, impureza principal: ADM (2-52)). MALDI MS (método 6): m/z = 6289(M+H)+e 5866 (impureza: (ADM(2-52)+H)+) Exemplos práticos Exemplo 1
[163] 0-{ [(3S)-3-Amino-4-({(2R)-1-amino-3- [(2,5-dioxo-1-{3-oxo-3- [(2-{w- metoxi-poli-oxietilen [40kDa]}etil)amino]propil}pirrolidin-3-il)sulfanil]-1- oxopropan-2-il}amino)-4-oxobutil]carbamoil}-L-tirosil-adrenomedulina (2-52)
Figure img0028
[164] 44 mg do peptídeo em bruto do exemplo 15A foram agitados com 426 mg (10,5 μmol, 1,5 eq. fornecidos por Dr. Reddys) 40 kDa de metoxi poli(etilenoglicol) maleimido propionamida em 9 ml de tampão citrato de pH 4 de um dia para outro à temperatura ambiente. A mistura reacional em bruto foi injetada em duas porções Em um sistema HPLC preparativo com coluna Phenomenex Luna 10μ Proteo C5 100A AXIA 250 mm x 21,2 mm e submetida a cromatografia com gradiente de água/acetonitrila (ambos com 0,1% de TFA). As frações foram recolhidas em tubos de ensaio de 20 ml, Em um colector automático de frações. Para assegurar uma acidez suficiente, cada frasco foi cheio com 0,5 ml e ácido acético antes da recolha.
[165] ADM(2-52), que é o subproduto do exemplo 15A, e que não sofreu PEGuilação nesta reação, assim como PEG por reagir, foram completamente removidos.
[166] Todas as frações contendo exemplo 1 foram combinadas. O acetonitrila foi parcialmente removido Em um evaporador rotativo em banho de água a 30 °C e aprox 50 mbar durante aprox 30 min.
[167] Depois da adição de 0,5 ml de ácido acético, a solução restante foi liofilizada. O rendimento total do exemplo 1 foi de 109 mg (2,35 μmol, 33% do teórico). HPLC (método 3): Rt = 4,30 min Exemplo 2
[168] 0-{ [(3-N-Metii-amino-4-({(2R)-1-amino-3- [(2,5-dioxo-1-{3-oxo-3- [(2- {uj-metoxi-poli-oxietilen [40kDa]}etil)amino]propil}pirrolidin-3-il)sulfanil]-1- oxopropan-2-il}amino)-4-oxobutil]carbamoil}-L-tirosil-adrenomedulina (2-52)
Figure img0029
[169] 15 mg do peptídeo em bruto do exemplo 16A foram agitados com 145 mg (3,58 μmol, 1,5 eq. fornecidos por Dr. Reddys) 40 kDa de metoxi poli(etilenoglicol) maleimido propionamida em 5 ml de tampão citrato de pH 4 de um dia para outro à temperatura ambiente. A mistura reacional em bruto foi injetada em duas porções Em um sistema HPLC preparativo com coluna Phenomenex Jupiter 10μ C18 300A 250 mm x 21,2 mm e submetida a cromatografia com gradiente de água/acetonitrila (ambos com 0,1% de TFA). As frações foram recolhidas em tubos de ensaio de 20 ml, Em um colector automático de frações. Para assegurar uma acidez suficiente, cada frasco foi cheio com 0,5 ml e ácido acético antes da recolha.
[170] ADM(2-52), que é o subproduto do exemplo 16A, e que não sofreu PEGuilação nesta reação, assim como PEG por reagir, foram completamente removidos.
[171] Todas as frações contendo exemplo 2 foram combinadas. O acetonitrila foi parcialmente removido Em um evaporador rotativo em banho de água a 30 °C e aprox 50 mbar durante aprox 30 min.
[172] Depois da adição de 0,5 ml de ácido acético, a solução restante foi liofilizada. O rendimento total do exemplo 2 foi de 50 mg (1,08 μmol, 43% do teórico). HPLC (método 4): Rt = 2,08 min Exemplo 3:
[173] O-{ [(4S)-4-Amino-5-({(2R)-1 -amino-3- [(2,5-dioxo-1 -{3-oxo-3- [(2-{w- metoxi-poli-oxietilen [40kDa]}etil)amino]propil}pirrolidin-3-il)sulfanil]-1- oxopropan-2-il}amino)-5-oxopentil]carbamoil}-L-tirosil-adrenomedulina (2-52)
Figure img0030
[174] 15 mg do peptídeo em bruto do exemplo 17A foram agitados com 145 mg (3,58 μmol, 1,5 eq. fornecidos por Dr. Reddys) 40 kDa de metoxi poli(etilenoglicol) maleimido propionamida em 5 ml de tampão citrato de pH 4 de um dia para outro à temperatura ambiente. A mistura reacional em bruto foi injetada em duas porções Em um sistema HPLC preparativo com coluna Phenomenex 10μ Proteo 90A AXIA 250 mm x 21,2 mm e submetida a cromatografia com gradiente de água/acetonitrila (ambos com 0,1% de TFA). As frações foram recolhidas em tubos de ensaio de 20 ml, Em um colector automático de frações. Para assegurar uma acidez suficiente, cada frasco foi cheio com 0,5 ml e ácido acético antes da recolha.
[175] ADM(2-52), que é o subproduto do exemplo 17A, e que não sofreu PEGuilação nesta reação, assim como PEG por reagir, foram completamente removidos.
[176] Todas as frações contendo exemplo 3 foram combinadas. O acetonitrila foi parcialmente removido Em um evaporador rotativo em banho de água a 30 °C e aprox 50 mbar durante aprox 30 min.
[177] Depois da adição de 0,5 ml de ácido acético, a solução restante foi liofilizada. O rendimento total do exemplo 3 foi de 19.5 mg (0,42 μmol, 17% do teórico).
[178] HPLC (método 4): Rt = 2,08 min
[179] B. Avaliação da atividade farmacológica
[180] A adequação dos compostos de acordo com a invenção para o tratamento de doenças pode ser demonstrada nas experiências seguintes: 1) Descrições das experiências {in vivo) 1a) Ensaios com célula repórter receptora de adrenomedulina recombinante
[181] A atividade dos compostos de acordo com a invenção é quantificada com ajuda de uma linha de células do ovário de hamster chinês (CHO) que contém o receptor de adrenomedulina humano. A ativação do receptor por meio de ligantes pode ser medida por luminescência aequorina. A construção da linha de células e procedimento de medição foi descrita detalhadamente [Wunder F., Rebmann A., Geerts A, e Kalthof B., Mol Pharmacol, 73, 1235- 1243 (2008)]. Em resumo: As células foram semeadas em placas de microtitulação de 384 poços, a uma densidade de 4000 células/poço, e foram cultivadas durante 24h. Após a remoção do meio de cultura, as células foram carregadas durante 3h com 0,6 μg/ml de coelenterazina em solução de Tyrode isento de Ca2+ (130 mM de cloreto de sódio, 5 mM de cloreto de potássio, 20 mM de HEPES (4-(ácido 2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico), 1 mM de cloreto de magnésio e 4,8 mM de hidrogenocarbonato de sódio, pH 7,4) suplementado com 0,2 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) Em uma incubadora de cultura de células. São adicionados compostos durante 6 min em solução de Tyrode isenta de cálcio2+ contendo 0,1% de albumina de soro de bovino. Imediatamente antes de adicionar cálcio2+ a uma concentração final de 3 mM foi iniciada a medição da luminescência de aequorin através do uso de um luminómetro adequado. A luminescência é medida durante 60 s. Em uma experiência típica os compostos são ensaiados a uma concentração entre 1 x 10’13e 3 x 10'6 M.
[182] Para determinar a libertação de adreπomedulina de compostos de acordo com a invenção, os compostos são incubados a concentrações diferentes por períodos de tempo diferentes, até 24 h em solução Tyrode suplementada com soro de bezerro fetal, meio de cultura de células ou plasma de diferentes espécies a pH 7,4. O teor de cálcio2+ do respectivo meio de incubação é tamponado por meio da adição de 4 mM de EDTA (ácido etilenodiamina tetraacético) antes de adicionar amostras às células repórter receptoras de adrenomedulina.
[183] Após uma pré-incubação apropriada, os exemplos da realização ativam as células repórter receptoras de adrenomedulina com mais potência do que antes da pré-incubação. Este fator indica que os valores EC50 são determinados por um fator menor até 10 após a pré-incubação comparativamente com antes e pode ser explicado pela libertação de adrenomedulina ativa dos compostos.
[184] Os valores EC50 representativos para os exemplos da realização antes e depois da incubação durante 24 h em tampão suplementado com 2,5% de soro de bezerro fetal estão indicados no quadro 1 seguinte: Quadro 1
Figure img0031
1b) Experiências de resistência elétrica transcelular em células endoteliais
[185] A atividade dos compostos de acordo com a invenção é caracterizada pelos ensaios de permeabilidade in-vivo em células venosas de cordão umbilical humano (HUVEC, Lonza). Utilizando o dispositivo ECIS (ECIS: Electric Cell-substrate Impedance Sensing-, Applied Biophysics Inc; Troy, NY) são medidas as alterações da resistência elétrica transendotelial (TEER) na monocamada endotelial em contínuo recorrendo a um pequeno eléctrodo de ouro, onde as células foram semeadas. São cultivadas HUVEC em placas eléctrodo sensor de 96 poços 96W1E, Ibid GmbH, Martinsried) até se formarem monocamadas confluentes e se poder induzir hiperpermeabilidade através de estímulos inflamatórios, tais como trombina, TNF-α, IL-1 β, VEGF, histamina e peróxido de hidrogênio, todos os quais está demonstrado provocarem a fragmentação dos conctactos da célula endotelial e redução da TEER. A trombina é utilizada a uma concentração final de 0,5 U/ml. São adicionados os compostos experimentais antes ou depois da adição da trombina. Em uma experiência típica os compostos são ensaiados a uma concentração entre 1 x 10’10e 1 x 10’6 M.
[186] Os exemplos da realização inibem a hiperpermeabilidade induzida pela trombina nesta experiência, a concentrações de < 10'6 M. 1c) Experiências de permeabilidade in vitro em células endoteliais
[187] Noutro modelo in vitro de hipermeabilidade endotelial, a atividade dos compostos de acordo com a invenção é examinada no que respeita à modulação da permeabilidade macromolecular. Foram cultivadas células endoteliais venosas do cordão umbilical humano (HUVECS) até à confluência em membranas filtro Transwell® revestidas com fibronectina (placas de 24 poços, inserções de 6,5 mm com 0,4 μM de membrana de policarbonato; Costar #3413) que separa uma câmara de cultura de tecido superior da inferior, contendo células endoteliais em desenvolvimento no fundo da câmara superior. O meio da câmara superior é suplementado com 250 μg/ml de 40 kDa FITC- Dextrano (Invitrogen, D1844), A hiperpermeabilidade da monocamada é induzida por meio da adição de trombina até uma concentração final de 0,5 U/ml. Foram colhidas amostras do meio da câmara inferior a cada 30 min e mede-se a fluorescência relativa como parâmetro de alterações de permeabilidade macromolecular ao longo do tempo Em um fluorímetro adequado. O desafio com trombina induz quase uma duplicação da transição FITC-dextrano em todas as monocamadas endoteliais. Em uma experiência típica os compostos são ensaiados a uma concentração entre 1 x 1O'10 e 1 x 10’6 M.
[188] Os exemplos da realização inibem a hiperpermeabilidade induzida pela trombina nesta experiência, a concentrações de < 10'5 M. 2. Descrições das experiências (/n vivo) 2a) Medição da pressão arterial e ritmo cardíaco em ratos Wistar normotensos com medição remota
[189] Foram investigados os efeitos cardiovasculares induzidos por compostos de acordo com a invenção em ratos Wistar conscientes, com liberdade de movimentos (peso corporal > 200 g) mediante medições com radiotelemetria da pressão arterial e ritmo cardíaco. Em resumo, o sistema telemétrico (DSI Data Science International, MN, EUA) é constituído por 3 elementos básicos: transmissores implantáveis (TA11PA-C40), receptores (RA1010) e um software de aquisição computorizado (Dataquest™ A.R.T. 4.1 para Windows). Os ratos são instrumentalizados com implantes de pressão para uso crônico pelo menos 14 dias antes das experiências. O cateter sensor é fixo com sutura 4-0 várias vezes para proporcionar uma fixação a 0,5 cm da ponta do cateter. Durante a implantação, os ratos são anestesiados com pentobarbital (Nembutal, Sanofi: 50 mg/kg i.p.) Depois de cortar o pelo da pele abdominal é executada uma incisão na linha média abdominal e o cateter sensor cheio de líquido é inserido a montante, dentro da aorta descendente exposta, entre a bifurcação ilíaca e as artérias renais. O cateter é fixo repetidamente ao ponto de fixação. A ponta do cateter telemétrico está localizada em posição caudal em relação às artérias renais e fixa com tecido adesivo. O corpo transmissor é fixo na parede peritoneal interna antes de fechar o abdómen. É usado um encerramento em duas camadas da incisão abdominal com sutura individual do peritoneu e da parede muscular seguida de encerramento da pele. Para proteção pós-cirúrgica contra infecções e dor foi injetada uma dose única de antibiótico (Oxitetraciclina 10% R, 5,0 ml/kg s.c., beta-pharma GmbH&Co, Alemanha) e analgésicos (Rimadyl R, 5,0 ml/kg s.c., Pfizer, Germany). A configuração do hardware está preparada para 24 animais. Cada gaiola é posicionada sobre uma plataforma receptora individual. Após ativação dos transmissores implantados, um sistema de aquisição de dados on-line recolhe os dados e converte os sinais de pressão telemétrica em mm Hg. Uma referência de pressão barométrica permite relacionar a pressão absoluta (relativamente ao vácuo) com a pressão atmosférica ambiente. O software de aquisição de dados está pré-definido para recolher dadios hemodinâmicos durante intervalos de 10 s a cada 5 minutos. A recolha de dados em ficheiro é iniciada 2 horas antes da administração dos compostos experimentais e termina depois de concluídos ciclos de 24 horas. Em uma experiência típica, os compostos experimentais são administrados em bolus tanto subcutaneamente como intravenosamente em doses de 1 a 1000 pg/kg de peso corporal (como indicado relativamente ao componente peptídeo).
[190] Adrenomedulina de tipo selvagem (Bachem, H.2932) induz uma redução da pressão arterial nesta experiência com duração de < 4 h quando experimentada em doses de < 300 μg/kg de peso corporal [Figura 1],
[191] Figura 1: Perfis de 24 horas da tensão arterial média (MABP, em inglês) registados em ratos Wistar fêmeas normotensos controlados por telemetria após administração subcutânea de ADM ou veículo como indicado (linha ponteada). Foram registados pontos de dados como médias ± SEM de médias de intervalos de 30 minutos de 4 animais por grupo. Uma hora após a administração, os animais tratados com ADM revelaram uma redução média de MABP de quase 20% no pico (círculos a cheio). Após cerca de 3,5 horas, MABP regressou aos níveis de referência e encontrava-se no intervalo do dos animais tratados com veículo (círculos abertos).
[192] Nestas experiências as substâncias de acordo com a presente invenção induzem a redução da tensão arterial até 10 h em doses < 500 μg/kg de peso corporal (como indicado relativamente ao componente peptídeo) [Figura 2].
[193] Figura 2: Perfis de 24 horas da tensão arterial média (MABP, em inglês) registados em ratos Wistar fêmeas normotensos controlados por telemetria após administração subcutânea do exemplo 1 ou veículo como indicado (linha ponteada). Foram registados pontos de dados como médias ± SEM de médias de intervalos de 30 minutos de 6 animais por grupo. Administração do exemplo 1 a uma dose de 150 μg/kg (como indicado relativamente ao componente peptídeo) reduziu MABP em cerca de 15 a 19% até 6 h após a administração (círculos a cheio). Entre 6 h e 14 h após a administração de MABP regressaram gradualmente aos valores de referência até se encontrar no intervalo ao dos animais tratados com veículo. 2b) Ensaio da fga vascular cutânea em ratos Wistar
[194] Foi empregue um ensaio de desafio com histamina intracutânea para avaliar o efeito dos compostos de acordo com a invenção na função barreira vascular em animais saudáveis. Ratos Sprague Dawley macho (peso corporal >200 g) são anestesiados com isoflurano (2%-3% em ar ambiente) e colocados de costas. O abdómen é rapado e o cateter é inserido na veia femural. Administra-se só veículo (0,5 ml de PBS + 0,1% de albumina de soro de bovino) ou compostos experimentais em doses apropriadas em injecções i.v. de bolus. Ao fim de 15 min foi administrada uma segunda injeção de 100 μl/kg 2% de solução de azul de Evans (Sigma) e imediatamente a seguir 100 μl de soluções de histamina nas concentrações apropriadas (por exemplo) 0 - 2,5 - 5 - 10 - 20 -40 μg/ml) são injetadas intracutaneamente na pele abdominal. O azul de Evans é um pigmento intensamente ligado às proteínas do plasma e, por conseguinte, é utilizado como indicador de extravasamentos de fluidos e fugas vasculares ricos em proteínas. 30 min após este procedimento os ratos foram sacrificados por dose excessiva de isoflurano e subsequente deslocação do pescoço e a pele abdominal é excisada. As vesículas são excisadas com um punção de biopsia de 8 mm, as amostras de tecido são pesadas e transferidas para formamida durante 48 h a fim de extrair o azul de Evans. As amostras são medidas a 620 nM e 750 nM de comprimento de onda Em urn fotómetro adequado e o teor de azul de Eavns das amostras é corrigido para pigmentos heme de acordo com a fórmula A620 (corrigido) = A620 - (1.426 X A750 + 0,030) e calculado em comparação com uma curva padrão, [método adaptado de Wang L.F., Patel M., Razavi H.M., Weicker S., Joseph M.G., McCormack D.G., Mehta S., Am . Respir Crit Care Med, 165(12), 1634-9 (2002)].
[195] As substâncias de acordo com a presente invenção reduzem o extravasamento de fluido plasmático rico em proteínas induzido pelo desafio da histamina nesta experiência. 2c) Instilação intratraqueal de LPS em ratinhos
[196] Um desafio intratraqueal com lipossacáridos (LPS) é empregue para examinar os efeitos dos compostos de acordo com a invenção em lesões pulmonares agudas. Ratinhos BALB/c machos (peso médio 20-23 g) são anestesiados com isoflurano (7%) e LPS de E. coli (por ex. serotipo 055:B5; Sigma) é instilado em 100 μl de soro fisiológico através de uma micropipeta. As doses típicas de PLS utilizadas para o desafio situam-se entre 1 e 10 mg/kg de peso corporal. Em momentos diferentes antes e depois da instilação, os compostos experimentais são administrados por via subcutânea. As doses típicas de PLS utilizadas para o desafio situam-se entre 1 e 300 mg/kg de peso corporal. Nesta experiência, momentos t+ipicos de administração dos compostos experimentais são 15 min antes ou 1 h depois do desafio LPS. 48 h depois da instilação de LPS, os ratinhos são produndamente anestesiados com isoflurano e sacrificados por deslocação do pescoço. Depois da canulação da traqueia executa-se a lavagem do espaço broncoalveolar com 0,5 ml de soro fisiológico gelado. Os pulmões são preparados e pesados. São contadas as células do fluido da lavagem bronqueoalveolar (BALF) Em um contador de células (Cell Dyn 3700, Abbott). Nesta experiência, constata-se que o peso do pulmão enquanto escala do edema pulmonar apresenta repetidamente um aumento de cerca de 50% ou mais em relação aos controles 48 h após o desafio com LPS. Dado que o peso dos pulmões apresenta uma variabilidade muito baixa nos grupos, o peso pulmonar absoluto é utilizado como parâmetro. As contagens de glóbulos brancos estão sempre significativamente aumentadas em relação ao controle no BALF após o desafio com LPS.
[197] A administração de substâncias de acordo com a presente invenção resultou Em um peso pulmonar e contagens de glóbulos brancos em BALE significativamente reduzidos ao fim de 48 h com administração em bolus a doses de < 300 μg/kg de peso corporal (como indicado relativamente ao componente peptídeo). 2d) Indução de lesões pulmonares agudas em mini porcos.
[198] A lesão pulmonar aguda é induzida em mini porcos anestesiados por meio de lipopolissacárido (LPS) ou ácido oleico como desafios. Detalhadamente: mini porcos Gottingen fêmeas com cerca de 3,5 a 5,5 kg de peso corporal (Ellegaard, Denmark) são mantidos anestesiados por meio de perfusão contínua i.v. de Ketavet®, Dormicum® e Pancuronium® após pré- medicação com uma injeção intramuscular de Ketavet® / Stresnil®. Após intubação intratraqueal os animais são ventilados artificialmente com um respirador pediátrico (Sulla 808V; Drâger, Alemanha) com uma mistura de oxigênio ar a um volume corrente de 30 a 50 ml e frequência constante de 25 min’1. PaCO2 é arterial é ajustado a cerca de 40 mmHg por meio da regulação da fração de oxigênio inspirado (FiO2) através da proporção da mistura oxigênio ar. Por rotina são medidos os seguintes parâmetros cardiovasculares e respiratórios após a aplicação das sondas e cateteres necessários adaptados a transdutores de pressão e equipamento de registo apropriados: pressão venosa central (através da veia jugular esquerda), pressão arterial e ritmo cardíaco (PA e RC; através da artéria carótida esquerda), pressão ventricular esquerda (PVE; através de um cateter Millar [FMI, Mod.:SPC-340S, REF: 800- 2019-1, 4F] introduzido no ventrícuio esquerdo através da artéria carótida direita) pressão arterial pulmonar (PAP; utilizando cateter balão angiográfico ARROW Berman [REF.: AI-07134 4 Fr. 50cm] aplicado na artéria pulmonar através da veia jugular esquerda), débito cardíaco (DC) e índice de água pulmonar extravasai (IAPE) através do sistema PiCCO (Pulsion, Alemanha) ligado a um cateter de termodiluição Pulsion 4F (PV2014L08N) colocado na artéria femural direita. Os cateteres para a medição de CVP, PA, RC, LVP e PAP são ajustados ao sistema de registo Ponemah. A análise dos gases sanguíneos arteriais é executada para determinar PaO2/FiO2. De acordo com a American-European Consensus Conference sobre ARDS, uma PaO2/FiO2 < 300 mmHg é considerada indicadora da presença de uma lesão pulmonar aguda. Dependendo do protocolo aplicado, a duração das experiências variou entre 4 e 5 horas após a administração da lesão pulmonar indutora do desafio. No final da experiência os porcos foram sacrificados por exsanguinação e recolheu-se o fluido da lavagem broncoalveolar (BALF) dos pulmões. Teor de células de BALF é determinado através do uso de um contador de células sanguíneas (Cell DYN 3700).
[199] Em um cenário típico a lesão pulmonar aguda é induzida por instilação intratraqueal de lipopolissacáridos (LPS; E.coli 0111:B4; Sigma L2630) em soro fisiológico a uma dose de 5 mg/kg de peso corporal em cada pulmão através de tubo endotraqueal. PAP e IAPE aumentaram enquanto PaO2/FiO2 desceram a menos de 300 mmHg em resposta ao desafio. O teor celular de BALF aumentou consideravelmente. A administração do composto 1 da invenção como bolus i.v. 15 min antes do desafio LPS melhorou ou preveniu as alterações induzidas por PLS.
[200] Em um outro protocolo é perfundido ácido oleico (AO; Sigma-Aldrich, 01008) diluído com etanol (1:1) i.v. durante 15 min a uma dose final de 100 mg/kg de peso corporal. O desafio com AO conduziu a um aumento de PAP e IAPE e descida de PaO2/FiO2 abaixo de 300 mmHg. A administração do composto 1 da invenção 15 min antes do início da perfusão de AO melhorou ou preveniu as alterações.
[201] Constatou-se que as doses do exemplo 1 < 30 μg/kg de peso corporal (como indicado relativamente ao componente peptídeo) foram ativas nos sistemas experimentais descritos. Realização de exemplo da composição farmacêutica
[202] Os compostos, de acordo com a invenção, podem ser convertidos em preparações farmacêuticas das seguintes formas: Solução Lv.:
[203] Um composto de acordo com a invenção é dissolvido a uma concentração abaixo da solubilidade de saturação Em um solvente fisiologicamente compatível (por ex. tampões de pH4 a pH7, solução de cloreto de sódio isotônico, solução de glucose 5% e/ou solução de PEG 400 30%). A solução é estirilizada por filtração e colocada em recipientes para injeção ésteres, apirogênicos. solução S.C.:
[204] Um composto de acordo com a invenção é dissolvido a uma concentração abaixo da solubilidade de saturação Em um solvente fisiologicamente compatível (por ex. tampões de pH4 a pH7, solução de cloreto de sódio isotônico, solução de glucose 5% e/ou solução de PEG 400 30%). A solução é estirilizada por filtração e colocada em recipientes para injeção ésteres, apirogênicos.

Claims (13)

1. Composto caracterizado por ter a fórmula (I)
Figure img0032
na qual n representa o número 0, 1, 2 ou 3, R1 representa hidrogênio, metil, etil, n-propil ou isopropil, R2 representa PEG de 20kDa a 80kDa linear ou ramificado encapado com um grupo terminal metoxi, ou um dos sais do mesmo, solvatos do mesmo ou os solvatos de sais do mesmo.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula (I) é definido de forma que: n representa o número 1 ou 2, R1 representa hidrogênio ou metil, R2 representa PEG de 40kDa linear encapado com um grupo terminal metoxi.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula (I) é definido de forma que: n representa o número 1 ou 2, R1 representa hidrogênio, R2 representa PEG de 40kDa linear encapado com um grupo terminal metoxi.
4. Composto caracterizado por ter a fórmula (Ia)
Figure img0033
ou um dos sais do mesmo, solvatos do mesmo ou os solvatos dos sais do mesmo.
5. Processo para a preparação de um composto de fórmula (I) ou um dos sais do mesmo, solvatos do mesmo ou os solvatos dos sais do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um composto de fórmula (II)
Figure img0034
qual n e R1 são cada um conforme definidos na reivindicação 1, ser reagido com um composto da fórmula (III)
Figure img0035
na qual R2 é conforme definido na reivindicação 1.
6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por para tratar e/ou prevenir doenças.
7. Uso de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para a produção de um medicamento para tratar e/ou prevenir doenças.
8. Uso de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para a produção de um medicamento para tratar e/ou prevenir distúrbios cardiovasculares, edematosos e/ou inflamatórios.
9. Medicamento caracterizado por compreender um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em combinação com um excipiente farmaceuticamente adequado, inerte, não tóxico.
10. Medicamento caracterizado por compreender um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em combinação com um outro ingrediente ativo.
11. Medicamento, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por ser para tratar e/ou prevenir distúrbios cardiovasculares, edematosos e/ou inflamatórios.
12. Uso de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para a produção de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de insuficiência cardíaca, doenças coronárias, AVC isquémico e/ou hemorrágico, hipertensão, hipertensão pulmonar, doença oclusiva arterial periférica, pré-eclâmpsia, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, edema pulmonar agudo e/ou crônico, alveolite alérgica e pneumonite devido a poeiras orgânicas e partículas de fungos inaladas, de actinomicocetos ou de outra origem, e/ou bronquite química aguda, edema pulmonar químico agudo ou crônico, edema pulmonar neurogénico, manifestações pulmonares agudas ou crônicas devido a radiação, distúrbios pulmonares intersticiais agudos ou crônicos, lesões pulmonares agudas/síndrome da dificuldade respiratória aguda (ALI/ARDS em inglês) no adulto ou criança, incluindo recém-nascidos, ALI/ARDS na sequência de pneumonia e sepse, pneumonia por aspiração e ALI/ARDS na sequência de aspiração, ALI/ARDS na sequência da inalação de fumo, lesões pulmonares agudas relacionadas com transfusões (TRALI, em inglês), ALI/ARDS e/ou insuficiência pulmonar aguda na sequência de cirurgia, traumatismo e/ou queimaduras, e/ou lesões pulmonares induzidas pelo ventilador (VILI), lesão pulmonar na sequência da aspiração de mecónio, fibrose pulmonar, mal da montanha, doenças renais crônicas, glumerolonefrite, lesões renais agudas, síndrome cardiorrenal, linfedema, doença inflamatória intestinal, sepse, choque séptico, síndrome de resposta inflamatória sistémica (SIRS) de origem não infecciosa, choque anafilático, doença inflamatória intestinal e/ou urticária.
13. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para uso em um processo de tratamento e/ou prevenção de distúrbios cardiovasculares, edematosos e/ou inflamatórios.
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