KR102003609B1 - 난청 진단을 위한 miR-205 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 난청 진단을 위한 miR-205에 관한 것으로, 보다 구체적으로 이독성 난청 마우스에서 난청 조기 진단을 위한 마이크로 RNA로 miR-205를 선별하였고, 이독성 난청 마우스의 혈청 시료 및 귀의 혈관선조 및 와우축 조직 시료에서 정상 대조군 마우스에 비해 마이크로 RNA-205의 발현이 난청 유발 초기부터 지속적으로 증가하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 miR-205를 난청 조기 진단을 위한 바이오마커로 이용할 수 있다.

Description

난청 진단을 위한 miR-205 및 이의 용도{Use of miR-205 for diagnosis of hearing loss}
본 발명은 난청 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 난청 진단용 바이오마커로서 miR-205 및 이의 난청 진단 용도에 관한 것이다.
청각소실 즉, 난청(hearing loss)은 소리를 전달하는 기관인 외이와 중이가 염증 같은 질병에 감염되었을 경우 생기는 전음성 난청(conductive hearing loss)과 소리를 감지하는 기관인 달팽이관, 전기적 에너지로 소리를 전달하는 청신경 및 소리의 변별, 이해 등 종합적인 역할을 하는 청각을 담당하는 뇌에 문제가 생겨 발생하는 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)로 나뉘며, 전 인구의 약 15-20%가 가지고 있는 흔한 질환이다. 감각신경성 난청은 미로염이나 뇌수막염 등의 염증성 질환, 소음, 이독성 약물, 측두골 골절 등의 외상, 노인성 난청, 메니에르병, 갑상선 기능저하 등의 대사이상, 뇌의 허혈성 질환, 백혈병 등의 혈액 질환, 다발성 경화증 등의 신경학적 이상, 면역 이상, 청신경 종양 등의 종양성 질환 또는 골질환 등에 의해 발생할 수 있다.
아미노글리코사이드(Aminoglycoside)계 항생제는 대표적인 이독성(ototoxicity) 약물 중 하나이다. 스트렙토마이신(streptomycin), 카나마이신(kanamycin), 젠타마이신(gentamicin), 네오마이신(neomycin), 아미카신(amikacin), 토브라마이신(tobramycin), 네틸마이신(netilmicin), 디베카신(dibekacin) 및 시소마이신(sisomycin) 등이 포함되며 이는 일반 항생제에 잘 반응하지 않는 그람음성균 감염, 결핵, 심부감염 등에 주로 사용된다. 아미노글리코사이드계 항생제는 내이에서 청력과 평형 기능장애를 유발하는 이독성과 신장독성 등의 부작용을 가지고 있는데, 이는 과다복용뿐만 아니라 치료용량으로 장기간 복용시 발생할 수 있으며 일부에서는 단기간 적정용량에도 이독성이 발생하는 경우도 있다. 아미노글리코사이드계 항생제에 의한 이독성은 사용자의 약 15%에서 전정기능 장애, 10-30%에서 청력감소를 보이며 주로 4000Hz 이상의 고주파수에서 급격한 고도난청의 형태로 양측 귀 모두에 발생한다. 특히, 미국에서는 약 400 만 명의 환자가 아미노글리코시드계 항생제로 치료를 받고 있으며, 이들 중 상기 항생제를 정맥 내로 투여받은 환자의 최대 10%가 아미노글리코사이드에 의해 난청(hearing loss)으로 고통받고 있다.
이러한 난청은 일시적일 수 있지만 대부분의 환자에서는 돌이킬 수 없는 상태로 발병한다. 난청의 발병 초기에는 예측이 어려우며, 항생제의 1회 투여 후에도 현저한 난청이 발생할 수 있다. 또한 난청은 항생제 또는 항암 치료 완료 후 몇 주 또는 몇 달이 지나서 발생하기도 하기 때문에, 항생제를 투여한 환자에서 난청이 발병한 후에 항생제에 의한 이독성을 판정하는 경우가 많다. 현재 약물의 효과적인 혈청 농도를 얻고 이독성의 위험을 최소화하기 위하여 이용되는 치료 약물 모니터링(therapeutic drug monitoring; TDM)만이 아미노글리코사이드계 항생제 치료 중 유일한 난청의 예후를 예측하는 방법이다. 따라서 난청의 조기 발견을 통해 환자의 난청 발병 이전에 잠재적인 치료의 대안을 마련하는 것이 필요하다.
한편, 유전자 발현의 강력한 조절인자인 마이크로 RNA(microRNA)는 증식, 세포사멸, 분화, 기관 형성 등을 포함한 거의 모든 주용 생물학적 과정에 관여한다. Lawrie et al.에서는, 마이크로 RNA가 혈청에서 안정적으로 검출되고, 유액 시료에 따라 순환하는 마이크로 RNA가 200에서 450 이상까지 다양한 수로 발견되는 것을 최초로 보고하였다. 이러한 순환하는 마이크로 RNA는 진단을 위한 도구로서 임상적 유용성을 제공할 수 있다. 또한, 질병의 발생 초기 단계에서 마이크로 RNA를 이용하여 질병을 진단함으로써 빠른 처치를 통한 질병의 진행을 예방할 수 있다. 일예로, Rosetta Genomics는 이미 원발성 폐종양(primary lung tumor)을 확인하기 위해 8개의 마이크로 RNA 패널로 구성된 miRView Lung을 상업적으로 출시하였다. 또한, Henegan et al.에서는 순환하는 마이크로 RNA-195의 수준을 측정하여 87.7% 의 민감성 및 91% 특이성으로 유방암 환자를 진단할 수 있다고 보고하면서, 상기 마이크로 RNA가 CEA(Carcino-Embryonic Antigen) 및 CA-15-3(Carcinoma Antigen-15-3)의 대안이 될 수 있음을 제안하였다.
이에, 본 발명자들은 난청의 조기 진단에 이용할 수 있는 마이크로 RNA를 개발하기 위해 노력한 결과, 이독성 난청 마우스에서 난청 조기 진단을 위한 마이크로 RNA로 miR-205를 선별하였고, 이독성 난청 마우스의 혈청 시료 및 귀의 혈관선조 및 와우축 조직 시료에서 정상 대조군 마우스의 것에 비해 마이크로 RNA-205의 발현이 난청 유발 초기부터 지속적으로 증가하고, 상기 시료에서 기존에 난청 유발 시 증가하는 것으로 잘 알려진 마이크로 RNA-183보다 난청 진단의 정확도가 우수함을 확인하여, 상기 miR-205를 난청 조기 진단을 위한 바이오마커로 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
Whelton, A. Therapeutic Initiatives for the Avoidance of Aminoglycoside Toxicity. The Journal of Clinical Pharmacology 25, 67-81 (2013). Ariano, R. E. et al. Aminoglycoside-Induced Vestibular Injury: Maintaining a Sense of Balance. Annals of Pharmacotherapy 42, 1282-1289 (2008). Huth, M. E. et al. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. International Journal of Otolaryngology 2011, 937861-19 (2011). Baek, D. et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature 455, 64-71 (2008). De Guire, V. et al. Circulating miRNAs as sensitive and specific biomarkers for the diagnosis and monitoring of human diseases: Promises and challenges. Clinical Biochemistry 46, 846-860 (2013). Lawrie, C. H. et al. Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Haematology 141, 672-675 (2008). Helen M. Heneghan et al. Circulating microRNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer. Annals of Surgery 251(3), 499-505 (2010).
본 발명의 목적은 마이크로 RNA-205를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 난청의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 피검체로부터 분리된 시료에서 마이크로 RNA-205의 발현 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 난청 발병 및 예후를 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
1) 마이크로 RNA-205가 발현되는 귀 세포에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 귀 세포 내에서 마이크로 RNA-205의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 측정 결과 마이크로 RNA-205의 발현양이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하는 경우 상기 피검물질을 난청의 예방 또는 치료용 조성물로 판별하는 단계를 포함하는, 난청의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로 RNA-205를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 난청의 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피검체로부터 분리된 시료에서 마이크로 RNA-205의 발현 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 난청 발병 및 예후를 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 마이크로 RNA-205가 발현되는 귀 세포에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 귀 세포 내에서 마이크로 RNA-205의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 측정 결과 마이크로 RNA-205의 발현양이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하는 경우 상기 피검물질을 난청의 예방 또는 치료용 조성물로 판별하는 단계를 포함하는, 난청의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 마이크로 RNA-205는 이독성 난청 마우스의 혈청 시료 및 귀의 혈관선조 및 와우축 조직 시료에서 정상 대조군 마우스의 것에 비해 난청 유도 초기부터 지속적으로 증가하고, 기존 난청 유발 시 증가하는 것으로 알려진 마이크로 RNA-183보다 정확한 진단능을 나타내므로, 본 발명의 마이크로 RNA-205를 난청 진단용 바이오마커로 이용할 수 있다.
도 1a는 청성뇌간반응(auditory brainstem response, ABR) 검사를 통해 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스 실험군, 대조군 및 비교군의 청력을 확인한 도이다(***p<0.0001, Student t-test).
도 1b는 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스 실험군, 대조군 및 비교군의 BUN(blood urea nitrogen) 및 크레아티닌(creatinine) 수치를 확인한 도이다(*p<0.01, Student t-test).
도 2는 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스 실험군 및 대조군의 혈청 시료에서 마이크로 RNA 발현을 확인한 도이다.
도 3a 및 도 3b는 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스 실험군, 대조군 및 비교군의 혈청 시료(도 3a) 및 신장 조직 시료(도 3b)에서 본 발명의 마이크로 RNA-205와 기존 연구를 통해 알려진 이독성 난청 유발 시 증가하는 miR-183의 발현 수준을 확인한 도이다(평균±SE; *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001, Student t-test).
도 4a 내지 도 4c는 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스 실험군, 대조군 및 비교군의 귀의 혈관선조(stria vascularis) 조직 시료(도 4a), 코르티기관(organ of Corti) 조직 시료(도 4b), 와우축(modiolus) 조직 시료(도 4c)에서 본 발명의 마이크로 RNA-205와 기존 연구를 통해 알려진 이독성 난청 유발 시 증가하는 miR-183의 발현 수준을 확인한 도이다(평균±SE; *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001, Student t-test).
도 5a 및 도 5b는 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스 실험군(도 5b) 및 대조군(도 5a)의 귀 조직을 이용한 in situ 혼성화 결과를 나타낸 도로서, 도 5a 및 도 5b의 이미지는 광학 현미경으로 얻었고, 도 5a 및 도 5b의 왼쪽 이미지의 배율은 x400, 스케일 바는 100 μM이며, 도 5a 및 도 5b의 오른쪽 이미지의 배율은 x600, 스케일 바는 50 μM이다. 또한, 약어 St는 혈관선조(stria vascularis), Sg는 나선신경절(spiral ganglion), OHC는 외유모세포(outer hair cell), Tm은 덮개막(tectorial membrane)을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 miRNA 및 miR은 마이크로 RNA를 나타내는 것으로, "miRNA", "miR" 및 "마이크로 RNA"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 마이크로 RNA-205를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 난청 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 "마이크로 RNA"는 유전자 발현을 제어하는 역할을 하는 21~25개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이의 짧은 비코딩 RNA이고, 상기 마이크로 RNA는 세포 내부의 mRNA와 서열 특이적으로 결합하여 mRNA의 분해를 유발하거나 번역 억제를 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서, 상기 마이크로 RNA-205를 검출할 수 있는 제제는 상기 마이크로 RNA-205와 특이적으로 결합 또는 반응하여 이의 존재 또는 농도를 확인할 수 있는 제제를 의미하며, 구체적으로 상기 마이크로 RNA-205에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer), 핵산(nucleic acid), 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 마이크로 RNA-205의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프라이머, 프로브(probe), 항체(antibody) 또는 이의 단편, 펩타이드 및 PNA(Peptide nucleic acid)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 상기 마이크로 RNA-205는 서열번호 1로 기재된 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 그 서열은 5'-UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG-3'과 같다.
상기 용어 "상보적"은 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건하에서 본 발명의 마이크로 RNA-205의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 상기 용어 "상보적"은 완전히 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브가 miR-205의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
상기 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 상기 프로브는 자연발생(naturally occurring)의 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 상기 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 상기 프라이머는 주형인 마이크로 RNA-205의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
또한, 상기 프라이머는 유전자 증폭반응(amplification reaction)에 사용될 수 있다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소연쇄반응(ploymerase chain reaction), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction), 복구연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재증폭(transcription-mediated amplification), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기 서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소연쇄반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction), 임의적 프라이밍 중합효소연쇄반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction), 핵산염기서열 기반증폭(nucleic acid sequence based amplification), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항체는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우 에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서, 상기 난청은 아미노글리코사이드계 항생제에 의한 이독성 난청, 돌발성 난청 또는 소음성 난청일 수 있고, 보다 구체적으로 아미노글리코사이드계 항생제에 의한 이독성 난청일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 아미노글리코사이드계 항생제는 아미카신(amikacin), 아르베카신(arbekacin), 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin), 네틸마이신(netilmicin), 파로모마이신(paromomycin), 디베카신(dibekacin), 시소마이신(sisomycin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 토브라마이신(tobramycin)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 보다 편리하고 정확한 난청 진단에 이용할 수 있는 바이오마커를 선별하기 위하여, 마우스에 아미노글리코사이드계 항생제인 카나마이신과 푸로세마이드를 병용 투여하여 이독성 난청 마우스 모델을 제작하였고, 청성뇌간반응(auditory brainstem response, ABR) 검사 및 신장 기능 검사를 통해 상기 이독성 난청 마우스에서 신장 손상 없이 난청이 유도되었음을 확인하였다(도 1a 및 도 1b 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 제작한 이독성 난청 마우스의 혈액을 채취하고 혈청을 분리한 후 마이크로어레이 분석을 수행하여, 정상 대조군 마우스에 비해 혈청 내 발현이 높은 마이크로 RNA로 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 마이크로 RNA-205를 선별하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 제작한 이독성 난청 마우스의 혈청, 신장 조직 및 귀 조직 시료에서 miR-205와 기존 연구를 통해 알려진 이독성 난청 유발 시 증가하는 miR-183의 발현 수준을 확인한 결과, 혈청 및 혈관선조 및 와우축 조직에서 miR-205의 발현 수준이 난청 유도 초기부터 지속적으로 증가해 있음을 확인하였다(도 3a 및 도 3b, 도 4a 내지 도 4c, 및 도 5a 및 도 5b 참조).
따라서, 본 발명은 이독성 난청 마우스의 혈청 시료 및 귀의 혈관선조 및 와우축 조직 시료에서 정상 대조군 마우스의 것에 비해 miR-205의 발현이 난청 초기부터 지속적으로 증가하고, 상기 시료에서 기존 난청 유발 시 증가하는 마이크로 RNA로 알려진 miR-183보다 난청 진단의 정확도가 우수함을 확인하였으므로, 상기 miR-205를 난청 진단을 위한 바이오마커로 이용할 수 있고, 상기 miR-205를 검출할 수 있는 제제를 난청 진단용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 피검체로부터 분리된 시료에서 마이크로 RNA-205의 발현 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 난청 발병 및 예후를 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 시료는 조직, 혈장, 혈청, 혈액, 타액 또는 소변일 수 있고, 보다 구체적으로 조직 또는 혈청일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 조직은 귀 조직일 수 있고, 예를 들어 귀의 혈관선조(stria vascularis), 코르티기관(organ of Corti) 또는 와우축(modiolus) 조직일 수 있으며, 보다 구체적으로 귀의 혈관선조 또는 와우축 조직일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction)으로 수행할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 난청은 아미노글리코사이드계 항생제에 의한 이독성 난청, 돌발성 난청 또는 소음성 난청일 수 있고, 보다 구체적으로 아미노글리코사이드계 항생제에 의한 이독성 난청일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 아미노글리코사이드계 항생제는 아미카신, 아르베카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 파로모마이신, 디베카신, 시소마이신, 스트렙토마이신 또는 토브라마이신일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 이독성 난청 마우스의 혈청 시료 및 귀의 혈관선조 및 와우축 조직 시료에서 정상 대조군 마우스의 것에 비해 miR-205의 발현이 난청 초기부터 지속적으로 증가하고, 상기 시료에서 기존 난청 유발 시 증가하는 마이크로 RNA로 알려진 miR-183보다 난청 진단의 정확도가 우수함을 확인하였으므로, 상기 시료에서 miR-205의 발현 수준을 측정하여 난청의 발병 및 예후를 예측 또는 진단하는 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 마이크로 RNA-205가 발현되는 귀 세포에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 귀 세포 내에서 마이크로 RNA-205의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 측정 결과 마이크로 RNA-205의 발현양이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소하는 경우 상기 피검물질을 난청의 예방 또는 치료용 조성물로 판별하는 단계를 포함하는, 난청 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액 또는 동물조직 추출액일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 난청은 아미노글리코사이드계 항생제에 의한 이독성 난청, 돌발성 난청 또는 소음성 난청일 수 있고, 보다 구체적으로 아미노글리코사이드계 항생제에 의한 이독성 난청일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 아미노글리코사이드계 항생제는 아미카신, 아르베카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 파로모마이신, 디베카신, 시소마이신, 스트렙토마이신 또는 토브라마이신일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 이독성 난청 마우스의 혈청 시료 및 귀의 혈관선조 및 와우축 조직 시료에서 정상 대조군 마우스의 것에 비해 miR-205의 발현이 난청 초기부터 지속적으로 증가하는 것을 확인하였으므로, 상기 miR-205의 발현 수준을 감소시키는 물질을 스크리닝하여 난청 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 이독성 ( ototoxicity ) 난청 동물모델 제작
난청을 조기 진단할 수 있는 마이크로 RNA(micro RNA)를 선별하기 위하여, 이독성(ototoxicity) 난청 동물모델을 제작하였다.
구체적으로, 5주령 수컷 C57BL/6 마우스를 주문하여 동물 시설에서 1주 동안 유지시켰다. 1일 1회 14일 동안 아미노글리코사이드계 항생제인 카나마이신(kanamycin) 550 mg/kg을 피하에 주사하고, 그 다음 푸로세마이드(furosemide) 130 mg/kg을 복강에 주사하여 이독성 난청 마우스를 제작하였다.
대조군은 카나마이신 및 푸로세마이드 대신 생리식염수를 처리하여 제작하였다.
또한, 비교군으로 급성 신장 허혈(acute kidney ischemia; AKI) 유도 마우스를 제작하여 사용하였다.
< 실시예 2> 이독성 난청 동물모델에서 난청 유도 확인
상기 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스에서 신장 손상 없이 난청이 유도되었는지 확인하기 위하여, 청성뇌간반응(auditory brainstem response, ABR) 검사 및 신장 기능 검사를 수행하였다.
구체적으로, 청성뇌간반응 검사는 ABR 기기(Tucker-Davis Technologies)를 이용하여 16 kHz, 32 kHz의 단음(toneburst)을 주어 파장 I 또는 II(wave I or II)의 파형이 나오는 최소자극음 크기(dB)를 청력역치로 판정하며, 상기 <실시예 1>에서 카나마이신 및 푸로세마이드를 투여하고 3일, 5일, 7일 및 14일이 지난 후의 이독성 난청 마우스, 대조군 및 비교군의 청력을 측정하였다.
또한, 신장 기능 검사로 상기 카나마이신 및 푸로세마이드를 투여하고 3일, 5일, 7일 및 14일이 지난 후의 이독성 난청 마우스, 대조군 및 비교군의 혈액을 채취하여 BUN(blood urea nitrogen) 및 크레아티닌(creatinine) 수치를 측정하였다.
그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 청성뇌간반응 검사를 통해 대조군 및 비교군의 청력역치값은 17 dB인 반면, 이독성 난청 마우스의 청력역치값은 난청 유도 후 3일째에 45 dB, 14일째에 80 dB로, 4배 이상 증가해 있음을 확인하였다(도 1a). 또한, 신장 기능 검사를 통해 이독성 난청 마우스의 BUN 및 크레아티닌 수치가 난청 유도 후 3일째에 대조군에 비해 각각 1.5배, 3배 정도 상승하였으나, 난청 유도 후 14일째에 대조군과 동일한 수치로 회복되는 것을 확인하였다. 반면, AKI를 유도한 비교군의 경우 BUN 및 크레아티닌 수치가 대조군에 비해 현저히 증가해 있음을 확인하였다(도 1b). 따라서 상기 결과를 통해 상기 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스는 신장 손상이 없이 난청이 유도되었음을 확인하였다.
< 실시예 3> 이독성 난청 마우스에서 마이크로 RNA 발현 확인
기존 연구를 통해 달팽이관에 있는 코르티기관(organ of Corti)에서 이독성 난청 유발 시 마이크로 RNA-183이 증가해 있음이 알려졌다. 이에, 보다 편리하고 정확한 난청의 조기 진단에 이용할 수 있는 혈청 내 마이크로 RNA를 선별하기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스의 혈청 샘플을 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스의 난청 유도 후 14일째에 혈액을 채취하였다. 또한, 대조군에서도 혈액을 채취하였다. 그 다음, TRIzol(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 절차에 따라 상기 이독성 난청 마우스 실험군 및 대조군의 혈액 샘플 각각에서 총 RNA를 분리하였다. RNA 정성 및 정량 분석을은 Agilent bioanalyzer 2100 analysis를 이용하여 수행하였다. 상기 획득한 총 RAN 250 ng 각각에 폴리-A 중합효소(poly-A polymerase)를 처리하여 RNA 가닥에 폴리-A 테일링(tailing)을 하고 바이오틴-표지된 3DNA 덴드리머(dendrimer)의 라이게이션(ligation)을 수행하여 RNA를 표지화(labeling)하였다. 상기 바이오틴-표지화된 RNA를 Affymetrix GeneGhip miRNA 4.0 Array(Affymetrix, Santa Clara, CA, US)에 처리하고 48℃에서 18시간 동안 반응시켜 혼성화하였다. 그 다음, Affymetrix GeneGhip miRNA 4.0 Array를 세척하고 Affymetrix Fluidics Station 450을 이용하여 염색한 후 3DNA 덴드리머에 의해 증폭된 형광 신호를 Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G를 이용하여 스캔하였다. 마이크로어레이 분석은 Agilent scanner에 연결된 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 마이크로 RNA 발현 수준은 Expression Console 1.4 (Affymetrix, Santa Clara, CA, US)를 이용하여 계산하였다. 각각의 마이크로 RNA에 대한 상대적 신호 강도는 Robust Multi-Array Average algorithm을 이용하여 확인하였고, 표적예측(target prediction)은 miRBase, miRDB, GargetScan 및 microRNA DB를 이용하여 분석하였다. 마이크로 RNA ID는 다음 사이트를 이용하여 확인하였다: http://www.mirbase.org/help/nomenclature.shtml.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 15 종의 마이크로 RNA가 이독성 난청 유도에 관련이 있고, 23 종의 마이크로 RNA가 대조군에 비해 2배 이상 발현이 증가(도 2, 빨간색) 또는 감소(도 2, 초록색)해 있음을 확인하였다. 23 종의 마이크로 RNA 중 라이스너막(Reissner's membrane), 나선연(spiral limbus), 나선이내(spiral ligament)에서 발현되는 것으로 알려진 마이크로 RNA-205를 난청 조기 진단을 위한 혈청 내 후보 마이크로 RNA로 선별하였다.
< 실시예 4> 이독성 난청 마우스의 혈청 내 miR -205의 발현 확인
보다 편리하고 정확한 난청의 조기 진단에 이용할 수 있는 혈청 내 마이크로 RNA로 miR-205를 이용할 수 있는 알아보기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스의 혈청 시료에서 miR-205와 기존 연구를 통해 알려진 이독성 난청 유발 시 증가하는 miR-183의 발현 수준을 비교하였다. 상기 비교를 위해 qRT-PCR(Quantitative real time-polymerase chain reaction)을 수행하였다.
구체적으로, 혈청 내 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제작한 카나마이신 및 푸로세마이드를 투여하고 3일, 5일, 7일 및 14일이 지난 후의 이독성 난청 마우스, 대조군 및 비교군의 혈액을 채취한 후, 혈청을 분리하였다. 그 다음, qRT-PCR을 위해 Qiazol 시약 및 miRNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 이용하여 상기 혈청으로부터 총 RNA를 분리하였다. 특정 miRNA에 대한 cDNA를 합성하기 위하여 TaqMan 마이크로 RNA 역전사 키트 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)가 사용되었다. miR-205, miR-183 및 miR-103의 증폭을 위한 프라이머 및 iTaq™ Universal SYBR　 Green supermix (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 상기 qRT-PCR 반응을 수행하였으며, iQ™-5 (Bio-Rad)에 의해 실시간으로 모니터링하였다. 상기 miR-103의 발현 수준은 정규화를 위한 내부 대조군으로서 사용되었다.
또한, miR-205 및 miR-183의 발현 수준은 평균±표준 오차(SE)로 나타내었다. 각 군 간의 통계적 차이는 GraphpadTM 5.0 소프트웨어를 이용하여 Student t-test에 의해 평가되었다(*p<0.01, **p<0.001, ***p<0.0001).
또한, 혈액 시료 이외의 조직 시료로 신장에서 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하기 위하여 카나마이신 및 푸로세마이드를 투여하고 3일, 5일, 7일 및 14일이 지난 후의 이독성 난청 마우스, 대조군 및 비교군을 희생하고, 신장 조직을 적출하였다. 그 다음, 상기 기재된 방법과 동일한 방법으로 신장 조직에서 총 RNA를 분리하고 qRT-PCR을 수행하여 miR-205 및 miR-183의 발현 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 이독성 난청 마우스의 혈청 내에서 miR-105의 발현 수준은 대조군에 비해 난청 유도 후 3일째에 현저히 증가하며 14일째까지 지속적으로 증가해 있는 반면, miR-183의 발현 수준은 대조군에 비해 난청 유도 후 5일째 및 14일째 증가하긴 하나 유의성이 없고 3일째의 경우에는 오히려 대조군에 비해 발현 수준이 감소하는 것을 확인하였다(도 3a). 한편, 이독성 난청 마우스의 신장 조직에서 miR-183의 발현 수준은 대조군에 비해 꾸준히 증가해 있는 반면, miR-105 발현 수준은 이와 달리 7일째에 대조군에 비해 발현 수준이 감소하는 것을 확인하였다(도 3b). 따라서, 상기 결과를 통해 보다 편리하고 정확한 난청의 조기 진단에 이용할 수 있는 혈청 내 마이크로 RNA로는 miR-105가 적절함을 확인하였다.
< 실시예 5> 이독성 난청 마우스의 귀 부위별 마이크로 RNA 발현 확인
추가적으로 혈청 이외 귀 조직에서 난청의 조기 진단을 위해 miR-205를 이용할 수 있는지 알아보기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제작한 이독성 난청 마우스의 귀 부위별 조직 시료에서 miR-205와 기존 연구를 통해 알려진 이독성 난청 유발 시 증가하는 miR-183의 발현 수준을 비교하였다. 또한, in situ 혼성화(in situ hybridization)를 통해 귀 조직 시료에서 miR-205의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 귀 부위별 조직에서 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제작한 카나마이신 및 푸로세마이드를 투여하고 3일, 5일, 7일 및 14일이 지난 후의 이독성 난청 마우스, 대조군 및 비교군을 희생하고, 귀의 혈관선조(stria vascularis), 코르티기관(organ of Corti) 및 와우축(modiolus) 조직을 적출하였다. 그 다음, 상기 조직 각각에서 상기 <실시예 4>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 miR-205 및 miR-183의 발현 수준을 측정하였다.
또한, in situ 혼성화를 위하여, 상기 카나마이신 및 푸로세마이드를 투여하고 14일이 지난 후의 이독성 난청 마우스와 대조군에서 귀 조직을 적출하였다. 그 다음, miR-205 프라이머를 이용하여 in situ 혼성화를 수행한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4a 내지 도 4c에 나타낸 바와 같이, 이독성 난청 마우스의 귀의 혈관선조(도 4a) 및 와우축(도 4c) 조직에서 miR-205의 발현 수준이 대조군에 비해 난청 유도 후 지속적으로 증가해 있음을 확인하였다.
또한, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 실제로 이독성 난청 마우스의 귀 혈관선조에서 miR-2505의 발현 수준이 대조군에 비해 현저히 높게 증가해 있음을 확인하였다.
따라서 상기 결과를 통해 귀의 혈관선조 및 와우축 조직에서도 난청 조기 진단을 위한 마이크로 RNA로 miR-205를 이용할 수 있음을 확인하였다.
<110> Industry-academic cooperation foundation of Yonsei University <120> Use of miR-205 for diagnosis of hearing loss <130> PB2017-134 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> micro-RNA 205 <400> 1 uccuucauuc caccggaguc ug 22

Claims (11)

  1. 마이크로 RNA-205를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 이독성 난청 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제제는 마이크로 RNA-205의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프라이머, 프로브 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 이독성 난청 진단용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로 RNA-205는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 이독성 난청 진단용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 이독성 난청은 아미노글리코사이드계 항생제에 의한 이독성 난청인 것을 특징으로 하는, 이독성 난청 진단용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 아미노글리코사이드계 항생제는 아미카신(amikacin), 아르베카신(arbekacin), 젠타마이신(gentamicin), 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin), 네틸마이신(netilmicin), 파로모마이신(paromomycin), 디베카신(dibekacin), 시소마이신(sisomycin), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 토브라마이신(tobramycin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 이독성 난청 진단용 조성물.
  6. 피검체로부터 분리된 시료에서 마이크로 RNA-205의 발현 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 이독성 난청 발병 및 예후를 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 시료는 혈청, 귀의 혈관선조 조직 및 귀의 와우축 조직으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 시료인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 6항에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction)으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 이독성 난청 발병 및 예후를 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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