CN109072293A - Met外显子14缺失的检测和相关疗法 - Google Patents

Met外显子14缺失的检测和相关疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN109072293A
CN109072293A CN201780029236.XA CN201780029236A CN109072293A CN 109072293 A CN109072293 A CN 109072293A CN 201780029236 A CN201780029236 A CN 201780029236A CN 109072293 A CN109072293 A CN 109072293A
Authority
CN
China
Prior art keywords
exons
met
probe
primer sets
label
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780029236.XA
Other languages
English (en)
Inventor
C.张
G.希尔曼
X.M.马
C.马诺哈尔
L.黄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN109072293A publication Critical patent/CN109072293A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文提供了使用RT‑PCR检测MET外显子14跳过的方法和组合物，以及治疗具有MET外显子14缺失的癌症的个体的方法。

Description

MET外显子14缺失的检测和相关疗法
发明背景
MET是在人染色体7上编码的酪氨酸激酶和原癌基因。前蛋白被切割以形成α和β亚基，其经由二硫键保持缔合，并充当肝细胞生长因子的受体。活化的MET诱导参与细胞存活的PI3K-AKT-mTOR途径和参与细胞增殖的RAS-RAF-MEK-ERK途径。
MET中的突变与许多癌症(包括肾癌、胃癌、神经系统癌、肉瘤和肺癌)相关。导致较高活性或表达的突变，或负性调节位点的缺失经常牵涉于这些癌症。具体而言，外显子14和在Tyr 1003的负性调节位点的缺失与显著百分比的非小细胞肺癌(NSCLC)和腺癌相关。CBL(一种E3泛素蛋白连接酶)结合MET蛋白上的Tyr 1003。当该位点缺失时，MET不被正常降解。所得的MET的失调引起下游细胞增殖和存活途径的持续活化。与基因扩增或增加的mRNA或蛋白表达的检测相比，MET外显子14缺失的检测更能预测对MET抑制剂的阳性治疗响应。
引起MET外显子14缺失的突变是异质的，通常影响剪接受体或供体位点。由于异质性，目前的检测方法限于下一代测序(NGS)。
发明概述
本文提供了用于检测人核酸样品中的MET外显子14缺失的方法和组合物。在一些实施方案中，检测MET外显子14缺失的方法包括：(a)从个体获得核酸样品(例如，包含RNA、DNA或RNA和DNA两者)；(b)使用样品实施扩增/检测反应，以选择性扩增和检测MET外显子13-外显子14连接、MET外显子14-外显子15连接和MET外显子13-外显子15连接；和(c)如果检测到MET外显子13-外显子15连接，则检测到MET外显子14缺失的存在。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前使用样品实施逆转录反应以产生cDNA。在一些实施方案中，逆转录反应和步骤(b)在单个容器(管、孔、微流体室等)中发生。在一些实施方案中，步骤(b)包括使cDNA与以下接触：(i)特异性扩增和检测MET外显子13-14连接的引物组和用第一标记物标记的探针，(ii)特异性扩增和检测MET外显子14-15连接的引物组和用第二标记物标记的探针，和(iii)特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和用第三标记物标记的探针。在一些实施方案中，步骤(c)包括检测用第三标记物标记的探针。
在一些实施方案中，步骤(b)是多重反应，例如使得(i)、(ii)和(iii)的引物组和探针包括在单个容器中。在一些实施方案中，所述多重反应进一步包括内部对照，例如引物组和用第四标记物标记的探针(例如，标记的IC探针)，其特异性扩增和检测内部对照。在一些实施方案中，步骤(b)在分开的容器中进行，例如，每个容器携带(i)、(ii)和(iv)的引物组和探针之一，其任选地与内部对照多重化。在一些实施方案中，逆转录和扩增/检测反应使用定量逆转录-PCR (qRT-PCR)实施。
在一些实施方案中，用于扩增MET外显子13-14连接的引物组包括具有选自SEQ IDNO:1-8的序列的正向引物和具有选自SEQ ID No:17-24的序列的反向引物。在一些实施方案中，用于检测MET外显子13-14连接的探针具有选自SEQ ID No:44-46的序列。在一些实施方案中，用于检测MET外显子13-14连接的探针具有SEQ ID NO:44的序列。在一些实施方案中，用于检测MET外显子13-14连接的探针具有SEQ ID NO:45的序列。在一些实施方案中，用于检测MET外显子13-14连接的探针具有SEQ ID NO:46的序列。在一些实施方案中，用于扩增MET外显子14-15连接的引物组包括具有选自SEQ ID NO:9-16的序列的正向引物和具有选自SEQ ID No:25-38的序列的反向引物。在一些实施方案中，用于检测MET 14-15连接的探针具有选自SEQ ID No:47-50的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 14-15连接的探针具有SEQ ID NO:47的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 14-15连接的探针具有SEQID NO:48的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 14-15连接的探针具有SEQ ID NO:49的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 14-15连接的探针具有SEQ ID NO:50的序列。在一些实施方案中，用于扩增MET外显子13-15连接的引物组包括选自SEQ ID NO:1-8的正向引物和选自SEQ ID No:25-38的反向引物。在一些实施方案中，用于检测MET外显子13-15连接的探针具有选自SEQ ID No:39-43和51-54的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:39的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:40的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ IDNO:41的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:42的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:43的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:51的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:52的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:53的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:54的序列。
在一些实施方案中，检测MET外显子14缺失的方法包括：(a)从个体获得核酸样品(例如，包含RNA、DNA或RNA和DNA两者)；(b)使用样品实施扩增/检测反应，以选择性扩增和检测MET外显子13-外显子15连接；和(c)如果检测到MET外显子13-外显子15连接，则检测到MET外显子14缺失的存在。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前使用样品实施逆转录反应以产生cDNA。在一些实施方案中，逆转录反应和步骤(b)在单个容器(管、孔、微流体室等)中发生。在一些实施方案中，步骤(b)包括使cDNA与特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和标记的探针(例如，具有非天然存在的荧光团或荧光团和猝灭剂)接触。在一些实施方案中，所述引物组包含与MET外显子13中的序列互补的正向引物和与MET外显子15中的序列互补的反向引物。在一些实施方案中，标记的探针与引物组的扩增产物特异性杂交，并且包括与仅外显子13、仅外显子15或外显子13和15两者互补的序列。在一些实施方案中，步骤(c)包括检测标记的探针。在一些实施方案中，所述方法包括在步骤(b)中，使用样品实施扩增/检测反应，以选择性扩增和检测内部对照，且在步骤(c)中，如果检测到内部对照，则检测到内部对照的存在。在一些实施方案中，内部对照的扩增和检测包括使cDNA与特异性扩增和检测内部对照的引物组和标记的IC探针(例如，具有非天然存在的荧光团或荧光团/猝灭剂)接触。在一些实施方案中，步骤(c)包括检测标记的IC探针。
在一些实施方案中，用于扩增MET外显子13-15连接的引物组包括选自SEQ ID NO:1-8的正向引物和选自SEQ ID No:25-38的反向引物。在一些实施方案中，用于检测MET外显子13-15连接的探针具有选自SEQ ID No:39-43和51-54的序列。在一些实施方案中，用于检测MET外显子13-15连接的探针具有选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:39的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:40的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:41的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:42的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:43的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:51的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQID NO:52的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:53的序列。在一些实施方案中，用于检测MET 13-15连接的探针具有SEQ ID NO:54的序列。
在一些实施方案中，步骤(b)是多重反应，例如使得引物组和探针包括在单个容器中。在一些实施方案中，逆转录和扩增/检测反应使用定量逆转录-PCR (qRT-PCR)实施。
在一些实施方案中，在逆转录之前，对样品进行RNA富集。在一些实施方案中，所述样品来自非侵入性来源(例如，血液、血浆、血清、尿液、粘膜拭子、唾液、皮肤等)。在一些实施方案中，所述样品是活检样品，例如肿瘤活检样品，任选地FFPET样品。在一些实施方案中，所述个体具有癌症，例如肺癌、肾癌、胃癌、神经癌、肉瘤或腺癌。在一些实施方案中，所述个体具有NSCLC。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括如果检测到MET外显子14缺失，则用MET抑制剂为个体提供治疗。在一些实施方案中，所述方法进一步包括如果检测到MET外显子14缺失，则用MET的下游效应物的抑制剂(例如，PI3K-AKT-mTOR或RAS-RAF-MEK-ERK途径的抑制剂)或用标准化学疗法为个体提供治疗。
进一步提供了为个体提供治疗的方法，其包括：(a)从个体获得核酸样品(例如，包含RNA、RNA和DNA两者)；(b)使用样品实施扩增/检测反应，以选择性扩增和检测MET外显子13-外显子14连接、MET外显子14-外显子15连接和MET外显子13-外显子15连接；(c)如果检测到MET外显子13-外显子15连接，则检测到MET外显子14缺失的存在；和(d)如果存在MET外显子14缺失，则用MET抑制剂为个体提供治疗。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前使用样品实施逆转录反应以产生cDNA。在一些实施方案中，逆转录反应和步骤(b)在单个容器(管、孔、微流体室等)中发生。在一些实施方案中，步骤(b)包括使cDNA与以下接触：(i)特异性扩增和检测MET外显子13-14连接的引物组和用第一标记物标记的探针，(ii)特异性扩增和检测MET外显子14-15连接的引物组和用第二标记物标记的探针，和(iii)特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和用第三标记物标记的探针。在一些实施方案中，步骤(c)包括检测用第三标记物标记的探针。
在一些实施方案中，步骤(b)是多重反应，例如使得(i)、(ii)和(iii)的引物组和探针包括在单个容器中。在一些实施方案中，所述多重反应进一步包括内部对照，例如引物组和用第四标记物标记的探针(例如，标记的IC探针)，其特异性扩增和检测内部对照。在一些实施方案中，步骤(b)在分开的容器中进行，例如，每个容器携带(i)、(ii)和(iv)的引物组和探针之一，其任选地与内部对照多重化。在一些实施方案中，逆转录和扩增/检测反应使用定量逆转录-PCR (qRT-PCR)实施。
在一些实施方案中，为个体提供治疗的方法包括：(a)从个体获得核酸样品(例如，包含RNA、DNA或RNA和DNA两者)；(b)使用样品实施扩增/检测反应，以选择性扩增和检测MET外显子13-外显子15连接；(c)如果检测到MET外显子13-外显子15连接，则检测到MET外显子14缺失的存在；和(d)如果存在MET外显子14缺失，则用MET抑制剂为个体提供治疗。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前使用样品实施逆转录反应以产生cDNA。在一些实施方案中，逆转录反应和步骤(b)在单个容器(管、孔、微流体室等)中发生。在一些实施方案中，步骤(b)包括使cDNA与特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和标记的探针接触。在一些实施方案中，所述引物组包含与MET外显子13中的序列互补的正向引物和与MET外显子15中的序列互补的反向引物。在一些实施方案中，标记的探针与引物组的扩增产物特异性杂交，并且包括与仅外显子13、仅外显子15或外显子13和15两者互补的序列。在一些实施方案中，步骤(c)包括检测标记的探针。在一些实施方案中，所述方法包括在步骤(b)中，使用样品实施扩增/检测反应，以选择性扩增和检测内部对照，且在步骤(c)中，如果检测到内部对照，则检测到内部对照的存在。在一些实施方案中，内部对照的扩增和检测包括使cDNA与特异性扩增和检测内部对照的引物组和标记的IC探针(例如，具有非天然存在的荧光团或荧光团和猝灭剂)接触。在一些实施方案中，步骤(c)包括检测标记的IC探针。
在一些实施方案中，步骤(b)是多重反应，例如使得引物组和探针包括在单个容器中。在一些实施方案中，逆转录和扩增/检测反应使用定量逆转录-PCR (qRT-PCR)实施。
进一步提供了鉴定具有癌症的个体的方法，其包括：(a)从个体获得包含RNA的样品；(b)对RNA实施逆转录反应以产生cDNA；(c)实施扩增反应，其包括使cDNA与特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和标记的探针(外显子13-15引物组和标记的外显子13-15探针)接触；和(d)如果通过外显子13-15引物组和标记的外显子13-15探针形成并检测到扩增产物，则检测到MET外显子14缺失的存在；由此个体的样品中MET外显子14缺失突变的存在表明所述个体对MET抑制剂化合物的敏感性。在一些实施方案中，所述方法进一步包括如果检测到MET外显子14缺失，则鉴定表明对用MET的下游效应物的抑制剂(例如，PI3K-AKT-mTOR或RAS-RAF-MEK-ERK途径的抑制剂)或用标准化学疗法的敏感性的个体。
进一步提供了鉴定具有癌症的个体的方法，其包括：(a)从个体获得核酸样品(例如，包含RNA、RNA和DNA两者)；(b)使用样品实施扩增/检测反应，以选择性扩增和检测MET外显子13-外显子14连接、MET外显子14-外显子15连接和MET外显子13-外显子15连接；和(c)如果检测到MET外显子13-外显子15连接，则检测到MET外显子14缺失的存在；由此个体的样品中MET外显子14缺失突变的存在表明所述个体对MET抑制剂化合物的敏感性。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前使用样品实施逆转录反应以产生cDNA。在一些实施方案中，逆转录反应和步骤(b)在单个容器(管、孔、微流体室等)中发生。在一些实施方案中，步骤(b)包括使cDNA与以下接触：(i)特异性扩增和检测MET外显子13-14连接的引物组和用第一标记物标记的探针，(ii)特异性扩增和检测MET外显子14-15连接的引物组和用第二标记物标记的探针，和(iii)特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和用第三标记物标记的探针。在一些实施方案中，步骤(c)包括检测用第三标记物标记的探针。在一些实施方案中，步骤(b)是多重反应，例如使得(i)、(ii)和(iii)的引物组和探针包括在单个容器中。在一些实施方案中，所述多重反应进一步包括内部对照，例如引物组和用第四标记物标记的探针(例如，标记的IC探针)，其特异性扩增和检测内部对照。在一些实施方案中，步骤(b)在分开的容器中进行，例如，每个容器携带(i)、(ii)和(iv)的引物组和探针之一，其任选地与内部对照多重化。在一些实施方案中，逆转录和扩增/检测反应使用定量逆转录-PCR (qRT-PCR)实施。
在一些实施方案中，鉴定具有癌症的个体的方法包括：(a)从个体获得核酸样品(例如，包含RNA、DNA或RNA和DNA两者)；(b)使用样品实施扩增/检测反应，以选择性扩增和检测MET外显子13-外显子15连接；和(c)如果检测到MET外显子13-外显子15连接，则检测到MET外显子14缺失的存在；由此个体的样品中MET外显子14缺失突变的存在表明所述个体对MET抑制剂化合物的敏感性。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前使用样品实施逆转录反应以产生cDNA。在一些实施方案中，逆转录反应和步骤(b)在单个容器(管、孔、微流体室等)中发生。在一些实施方案中，步骤(b)包括使cDNA与特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和标记的探针接触。在一些实施方案中，所述引物组包含与MET外显子13中的序列互补的正向引物和与MET外显子15中的序列互补的反向引物。在一些实施方案中，标记的探针与引物组的扩增产物特异性杂交，并且包括与仅外显子13、仅外显子15或外显子13和15两者互补的序列。在一些实施方案中，步骤(c)包括检测标记的探针。在一些实施方案中，所述方法包括在步骤(b)中，使用样品实施扩增/检测反应，以选择性扩增和检测内部对照，且在步骤(c)中，如果检测到内部对照，则检测到内部对照的存在。在一些实施方案中，内部对照的扩增和检测包括使cDNA与特异性扩增和检测内部对照的引物组和标记的IC探针(例如，具有非天然存在的荧光团或荧光团和猝灭剂)接触。在一些实施方案中，步骤(c)包括检测标记的IC探针。
在一些实施方案中，步骤(b)是多重反应，例如使得引物组和探针包括在单个容器中。在一些实施方案中，逆转录和扩增/检测反应使用定量逆转录-PCR (qRT-PCR)实施。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括如果检测到MET外显子14缺失，则用MET的下游效应物的抑制剂(例如，PI3K-AKT-mTOR或RAS-RAF-MEK-ERK途径的抑制剂)或用标准化学疗法为个体提供治疗。
在一些实施方案中，在逆转录之前，对样品进行RNA富集。在一些实施方案中，所述样品来自非侵入性来源(例如，血液、血浆、血清、尿液、粘膜拭子、唾液、皮肤等)。在一些实施方案中，所述样品是活检样品，例如肿瘤活检样品，任选地FFPET样品。在一些实施方案中，所述个体具有癌症，例如肺癌、肾癌、胃癌、神经癌、肉瘤或腺癌。在一些实施方案中，所述个体具有NSCLC。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括鉴定具有癌症的个体的方法，其中，如果在个体的样品中检测到MET外显子14缺失，则个体的样品表明所述个体对MET的下游效应物的抑制剂(例如，PI3K-AKT-mTOR或RAS-RAF-MEK-ERK途径的抑制剂)或用标准化学疗法的敏感性。
进一步提供了试剂盒，例如用于检测核酸样品中的MET外显子14缺失的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含(a)特异性扩增和检测MET外显子13-14连接的引物组和用第一标记物标记的探针；(b)特异性扩增和检测MET外显子14-15连接的引物组和用第二标记物标记的探针；和特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和用第三标记物标记的探针。在一些实施方案中，引物和探针的序列如本文上文所述。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含(d)特异性扩增和检测内部对照的引物组和用第四标记物标记的探针。在一些实施方案中，第一、第二和第三标记物是相同的(例如，用于在分开的容器中检测)。在一些实施方案中，第一和第二标记物是相同的，但与第三标记物不同。在一些实施方案中，第一、第二和第三标记物是不同的(例如，用于多重反应)。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和标记的探针(例如，非天然标记的探针，例如，具有荧光团或荧光团/猝灭剂)。在一些实施方案中，所述引物组包含与MET外显子13中的序列互补的正向引物和与MET外显子15中的序列互补的反向引物。在一些实施方案中，标记的探针与引物组的扩增产物特异性杂交，并且包括与仅外显子13、仅外显子15或外显子13和15两者互补的序列。在一些实施方案中，引物和探针的序列如上文所述。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含(d)特异性扩增和检测内部对照的引物组和标记的探针(例如，标记的IC探针，与对MET外显子13-15连接扩增产物特异性的标记的探针不同地标记)。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括逆转录酶和热稳定DNA聚合酶，或具有两种活性的酶。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含缓冲液(例如，促进扩增的缓冲液)和/或dNTP。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含阳性对照，其包含编码MET外显子14缺失的核酸。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含阴性对照，其包含不编码MET外显子14缺失的核酸。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于从来自个体的样品纯化(富集) RNA的组分。
附图简述
图1描绘成熟MET的α和β亚基，并显示在Y1003处的泛素化位点的位置。CBL在Y1003被磷酸化(活化状态)时与其结合，并靶向MET用于泛素介导的降解。外显子14缺失的MET中不存在Y1003。
图2显示用于检测MET外显子14缺失的示例性测定设计。使用对外显子13-外显子15连接特异性的FAM标记的探针检测突变体形式，而使用对外显子13-外显子14连接特异性的HEX标记的探针和对外显子14-外显子5连接特异性的JA270标记的探针检测野生型形式。用Cy5.5标记的探针检测内部对照，例如，以针对核酸浓度和质量标准化。
图3提供了关于示例性测定设计的进一步信息。野生型MET转录物的外显子13、14和15显示于顶部小图的顶部。引物用箭头表示，且在正下方显示由引物产生的扩增子，其与特异性的标记的探针杂交。下面小图显示连接的外显子13和15，示例性引物位置，以及与特异性标记的探针杂交的所得扩增子。
图4显示图2和3中对于突变体形式描绘的多重反应的结果(FAM通道)。x轴显示突变体序列的拷贝数，且y轴显示Ct。该图显示Ct随着拷贝数增加以线性方式降低，并且该测定足够灵敏以检测30个拷贝。
图5显示野生型形式外显子13-外显子14连接的多重反应的结果(HEX通道)。与突变体反应一样，Ct与野生型拷贝数负相关，反应是线性的，且足够灵敏以检测30个拷贝。
图6显示野生型形式外显子14-外显子15连接的多重化的结果(JA270通道)。再次，数据显示，Ct与野生型拷贝数负相关，反应是线性的，且足够灵敏以检测30个拷贝。
图7显示外显子13-外显子15连接的检测是特异性的。x轴显示循环数，且y轴显示FAM信号。Mut1和Mut2是来自MET外显子14缺失细胞系的样品。来自WT1、WT2和UHR (通用人RNA)的野生型样品不生成信号。
图8显示外显子13-外显子15连接的检测的灵敏度。在野生型血浆中100个拷贝和30个拷贝突变细胞系RNA之间的Ct增加约2，而仅用10个拷贝突变细胞系RNA观察到更大的Ct增加。右侧小图显示内部对照的结果，其表明样品之间的输入大致相等。
图9显示示例性测定设计。顶部转录物代表未剪接的野生型MET，且底部转录物代表外显子14剪接掉的MET。引物组(箭头)包括位于外显子13中的第一(正向)引物和位于外显子15中的第二(反向)引物，使得当外显子14被剪接掉时形成扩增产物。设计探针以特异性结合扩增产物，其为仅外显子13中的序列，仅外显子15中的序列，或跨越外显子13-外显子15连接的序列(如所示)。
图10显示图9中描绘的测定设计的特异性。用FAM标记对外显子13-外显子15扩增产物特异性的探针(左图)，而用CY5.5标记对内部对照RNA特异性的探针(右图)。显示来自外显子14剪接掉(在左图中注明)的2种细胞系、2种野生型细胞系的RNA和UHR (通用人RNA)的qRT-PCR。
图11显示使用掺入0.1 ng/反应UHR的x轴上指示的量的MET外显子14剪接转录物的检测限值(LOD)和线性数据。剪接产物在低至10个拷贝的线性范围内可检测到。
图12显示使用以x轴上指示的量掺入来自FFPET (甲醛固定的石蜡包埋的组织)的50ng RNA中的来自2种不同细胞系的MET外显子14剪接转录物的LOD和线性。剪接产物在低至10个拷贝的线性范围内可检测到。
图13显示使用以x轴上指示的量掺入来自健康供体血浆cfRNA的RNA的来自2种不同细胞系的MET外显子14剪接转录物的LOD和线性数据。再次，LOD在线性范围内为约10个拷贝。
发明详述
I. 引言
本文提供了用于检测MET外显子14缺失(尽管引起外显子14缺失的突变的性质可变)的新型定量逆转录(qRT)-PCR测定法。本文描述的测定因此依赖于经证实的广泛采用的技术，并提供准确的、可再现的和快速的结果。本文提供的结果显示，可以将所述测定在单个管中有效地多重化和实施，同时仍提供非常特异和灵敏的结果。
II. 定义
术语“多重”是指在其中可以检测多于一种靶标的测定。例如，多重反应可以包括多于一种引物组和多于一种探针，其对基因或转录物的不同部分或变体具有特异性，或对不同基因或转录物具有特异性。
术语“贮藏器”、“容器”、“管”、“孔”、“室”、“微室”等是指可以容纳试剂或测定的容器。如果贮藏器是在试剂盒中且容纳试剂或用于扩增反应，则可以将其封闭或密封以避免污染或蒸发。如果贮藏器用于测定，其可以是开放的或可进入的，至少在所述测定的设置期间。
术语“MET外显子14缺失”、“MET外显子14跳过”和类似术语是指染色体重排或突变的MET基因，或被剪接以除去MET的外显子14的至少一部分(即，编码MET蛋白的近膜区域中的负性调节位点Tyr 1003的部分)的MET转录物。在DNA水平的各种突变可导致外显子14跳过(参见，例如，Kong-Beltran等人(2006) Cancer Res. 66; Dhanasekharan等人(2014)Nature Communications 10:1038)。在一些实施方案中，在此描述的测定法检测MET的整个外显子14 (其编码47个氨基酸)的缺失。
术语“从个体获得样品”意味着，将来自个体的生物样品提供用于测试。获得可以直接来自个体，或来自从个体直接获得样品的第三方。
术语“为个体提供治疗”意味着，将所述治疗实际上施用于个体(例如，住院患者注射)，或使其对个体可得，使得所述个体或第三方实际上施用所述治疗。
关于扩增产物，术语“形成和检测”表明以高于基线阴性水平的水平形成和检测扩增产物。基线可以基于阴性对照，例如，在扩增和检测突变序列的情况下，设定在野生型样品生成的信号的水平。基线也可以设置在略高于阴性对照的信号(例如，1-5％)，以允许测定性能的一些变化，同时避免突变序列的假阳性结果。核酸检测领域的技术人员将理解给定测定的适当对照和变化水平。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指核苷酸(例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物，且包括天然存在的(腺苷、胍、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)、非天然存在的和修饰的核酸。该术语不受聚合物的长度(例如，单体的数目)限制。核酸可以是单链的或双链的，且通常含有5'-3'磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可能具有其它键。单体通常被称作核苷酸。术语“非天然的核苷酸”或“修饰的核苷酸”是指这样的核苷酸：其含有修饰的含氮碱基、糖或磷酸酯基团，或其在其结构中掺入非天然的部分。非天然的核苷酸的实例包括二脱氧核苷酸、生物素化的、胺化的、脱氨的、烷基化的、苄基化的和荧光团-标记的核苷酸。
术语“引物”是指在合适的条件下充当通过核酸聚合酶的多核苷酸链合成的起始点的短核酸(寡核苷酸)。多核苷酸合成和扩增反应通常包括适当的缓冲液、dNTP和/或rNTP、和一种或多种任选的辅因子，并且在合适的温度实施。引物通常包括至少一个靶标杂交的区域，其与靶序列至少基本上互补(例如，具有0、1、2或3个错配)。该区域通常具有约8至约40个核苷酸的长度，例如，12-25个核苷酸。“引物组”是指这样的正向和反向引物：其相对于靶序列以相反方向朝向，且其在扩增条件下产生扩增产物。引物组还可以包括另外的正向或反向引物，例如，以实现等位基因特异性的扩增。引物组也可以与另一引物组共享正向或反向引物，例如通用的正向或反向引物。除非另有说明，术语正向引物和反向引物是任意指定的，并且不指明与编码序列相关的方向等。
如本文所用，“探针”是指能够选择性结合特别预期的靶生物分子(例如，与探针杂交的目标核酸序列)的任何分子。所述探针用至少一个非核苷酸部分(即非天然存在的部分)可检测地标记。在一些实施方案中，所述探针用荧光团和猝灭剂标记。
术语“特异性扩增”指示，与非靶序列相比，引物组以统计上显著的水平更多地扩增靶序列。术语“特异性检测”指示，与非靶序列相比，探针将以统计上显著的水平更多地检测靶序列。如本领域中将理解，可以使用阴性对照(例如，包括与测试样品相同的核酸，但不包括靶序列的样品)，来确定特异性扩增和检测。例如，特异性扩增和检测靶序列的引物和探针产生可容易地与背景(非靶序列)区分的Ct，例如，比背景小至少2、3、4、5、5-10、10-20或10-30个循环的Ct。
词语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸与第二种多核苷酸中的另一个核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T (对于RNA，A-G-U)与序列T-C-A (对于RNA，U-C-A)互补。互补性可以是部分的，其中仅一些核酸根据碱基配对匹配，或可以是完全的，其中所有核酸都根据碱基配对匹配。如果探针或引物与靶序列至少部分地互补，则所述探针或引物被视为对靶序列“特异性的”。取决于条件，与靶序列的互补性程度对于较短核酸诸如引物而言通常高于(例如，大于80%、90%、95%或更高)较长序列。
在两种或更多种核酸、或两种或更多种多肽的背景下，术语“相同的”或“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列是相同的，或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸(例如，当在对比窗或指定区域上关于最大对应性进行比较和比对时，在指定区域上的约60%同一性，例如，至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性中的任一种)，如使用BLAST或BLAST 2.0序列对比算法(用默认参数)测量的，或通过手工比对和目检测量的。参见例如，在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST处的NCBI网站。此类序列因此被称作是“基本上相同的”。通常在最佳比对的序列上确定同一性百分比，使得所述定义适用于具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。在本领域中通常使用的算法考虑缺口等。通常，同一性存在于包含至少约8-25个氨基酸或核苷酸长度的序列的区域上，或者50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或者参照序列的整个长度上。
术语“试剂盒”是指包括至少一种试剂(诸如核酸探针或探针库等)的任何制造品(例如，包装或容器)，其用于特异性扩增、捕获、标记/转换或检测RNA或DNA，如本文所述。
术语“扩增条件”是指核酸扩增反应(例如，PCR扩增)中的条件，其允许引物的杂交和模板依赖性延伸。术语“扩增子”或“扩增产物”是指这样的核酸分子：其含有靶核酸序列的全部或片段，并且其通过任意合适的扩增方法形成为体外扩增产物。技术人员会理解，正向和反向引物(引物对)限定扩增产物的边界。当应用于引物时，术语“产生扩增产物”指示，所述引物在适当的条件下(例如，在核苷酸聚合酶和NTP的存在下)将产生限定的扩增产物。各种PCR条件描述于PCR Strategies (Innis等人, 1995, Academic Press, San Diego,CA)第14章; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Innis等人,Academic Press, NY, 1990)中。
术语“扩增产物”是指扩增反应的产物。所述扩增产物包括用于起始每轮多核苷酸合成的引物。“扩增子”是靶向用于扩增的序列，且该术语也可以用于指扩增产物。扩增子的5'和3'边界由正向引物和反向引物限定。
术语“样品”或“生物样品”是指含有或假定含有核酸的任何组合物。该术语包括纯化的或分离的细胞、组织或血液的组分，例如，DNA、RNA、蛋白、无细胞部分或细胞裂解物。在本文公开的测定的背景下，所述样品通常是FFPET，例如，来自肿瘤或转移性病灶。所述样品还可以来自冷冻的或新鲜的组织，或来自液体样品，例如，血液或血液组分(血浆或血清)、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、泪液、淋巴液、脑脊液、口腔/喉冲洗液、支气管肺泡灌洗液、从拭子洗下的物质等。样品也可以包括从个体获得的细胞的体外培养物(包括细胞系)的成分和组分。样品还可以从直接得自个体的样品部分地处理，例如，细胞裂解物或除去红血细胞的血液。
“对照”样品或值是指充当参照，通常是已知的参照，用于与测试样品或测试条件比较的值。例如，测试样品可以取自测试条件，例如，来自疑似具有癌症的个体，并且与来自已知条件(例如，来自无癌个体(阴性对照)或来自已知具有癌症的个体(阳性对照))的样品进行比较。对照还可以代表从许多测试或结果收集的平均值或范围。还可以为反应条件制备对照。例如，关于核酸的存在、特性和/或量的对照(例如，内部对照)可以包括将检测已知存在于样品中的序列(例如，持家基因诸如β肌动蛋白、β珠蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白L37和L38、PPIase、EIF3、真核翻译延伸因子2 (eEF2)、DHFR或琥珀酸脱氢酶)的引物或探针。还可以添加已知的添加的多核苷酸，例如，具有指定的长度和/或序列。阴性对照的一个实例是不含核酸的对照，或包括对不存在于样品中的序列(例如，来自不同物种)特异性的引物或探针的对照。技术人员会理解，对照的选择将取决于特定测定，例如，使得所述对照是细胞类型和生物适当的。本领域技术人员会认识到，可以设计对照用于评估任意数目的参数。例如，可以设计对照以基于药理学数据(例如，半衰期)或治疗性措施(例如，益处和/或副作用的对比)来对比治疗益处。可以设计对照用于体外应用。本领域技术人员会理解哪些对照在给定的情形下是有价值的，且能够基于与对照值的对比来分析数据。对照对于确定数据的显著性也是有价值的。例如，如果给定参数的值在对照中宽泛地变化，测试样品中的变化不会被视作显著的。
术语“标记物”、“标签”、“可检测的部分”和类似术语是指通过光谱、光化学、生化、免疫化学、化学或其它物理方式可检测的组合物。例如，有用的标记包括荧光染料、发光试剂、放射性同位素(例如，32P、3H)、电子致密试剂或基于亲和力的部分，例如，聚-A (与聚-T相互作用)或聚-T标签(与聚-A相互作用)，His标签(与Ni相互作用)，或链霉抗生物素蛋白标签(可用生物素分离)。如本文所用，附接至标记物、标签或可检测部分的生物分子(DNA、RNA、蛋白等)不是天然存在的组合物。
除非另外定义，否则在本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。参见，例如，Lackie, Dictionary of Cell and MolecularBiology, Elsevier (第4版2007); Sambrook等人, Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”意图指“一个/种或多个/种”。当在步骤或要素的列举前面时，术语“包含(comprise, comprises, comprising)”意图指其它步骤或要素的添加是任选的且不被排除。
III.核酸样品
用于核酸扩增的样品可以获得自疑似含有核酸的任何来源。在本公开的背景下，所述样品来自人来源。在一些实施方案中，所述样品以非侵入性方式获得，例如血液或血液级分、尿液、皮肤、拭子或唾液。样品也可以取自福尔马林固定的石蜡包埋的组织(FFPET)、组织活检样品、支气管肺泡灌洗液或培养的细胞(例如，获得自患者，或代表对照)。在一些实施方案中，所述样品取自肺组织或包括肺细胞(例如，肺癌细胞)的细胞群体。
在包括细胞的样品中，可以分离出细胞(例如，使用基于大小的过滤或离心)，由此剩下无细胞的核酸(cfNA)，包括在外核体、微囊泡、病毒颗粒中的核酸，或自由循环的那些核酸。或者，可以在磁性玻璃颗粒(MGP)的存在下或在将细胞裂解物添加至MGP之前，裂解细胞以获得细胞核酸。
在一些实施方案中，在扩增和/或检测之前，将核酸(DNA、RNA或两者)与样品的其他组分(例如，蛋白、膜、脂质等)分离。术语“分离的”、“分开的”、“纯化的”等不表示核酸100％不含其他物质，但核酸与原始样品相比实质上富集。例如，与原始样品相比，纯化的核酸可以富集2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。在一些实施方案中，纯化的核酸在水溶液中，其具有少于20%、10%、5%、2%、1%,、0.5%或0.1％的来自样品的非核酸残余物。
在一些实施方案中，目前描述的测定法依赖于编码MET的mRNA。因为引起外显子14缺失的许多突变是体细胞的，所以预期缺失将发生在来自任何表达MET的细胞类型(例如上皮细胞)的转录物中。样品可以取自怀疑携带肿瘤核酸的任何细胞或无细胞来源(例如，癌症活检样品或循环核酸)。
用于从生物样品分离核酸的方法是已知的，例如，如在上文Sambrook中所述，且几种试剂盒是商购可得的(例如，cobas® cfRNA样品制备试剂盒，高纯RNA分离试剂盒、高纯病毒核酸试剂盒和MagNA纯LC总核酸分离试剂盒、用于细胞和组织的DNA分离试剂盒、用于哺乳动物血液的DNA分离试剂盒、高纯FFPET DNA分离试剂盒，可得自Roche)。在本文公开的方法的背景下，收集RNA，尽管在一些实施方案中，可以对先前制备的cDNA使用所述测试。
IV.扩增和检测
核酸样品(分离或未分离)可以用于检测和定量，例如，使用核酸扩增，例如，使用任何引物依赖性的方法。在一些实施方案中，实施初步的逆转录步骤(也被称作RT-PCR，不与实时PCR混淆)。参见，例如，Hierro等人(2006) 72:7148。如本文所用，术语“qRT-PCR”是指继之以定量PCR的逆转录。两个反应可以在单个管中没有间断(例如，以添加试剂)地实施。例如，可以使用聚T引物来逆转录样品中所有具有聚A尾巴的mRNA，可以使用随机寡核苷酸，或可以设计对将逆转录成cDNA的特定靶转录物特异性的引物。所述cDNA可以形成待用于定量扩增(实时或定量PCR，即，RTPCR或qPCR)的最初模板链。qPCR允许可靠地检测和测量在PCR过程的每个循环中产生的产物。此类技术是本领域众所周知的，且试剂盒和试剂是商购可得的，例如，来自Roche Molecular Systems, Life Technologies, Bio-Rad, 等。参见例如，Pfaffl, Methods: The ongoing evolution of qPCR vol. 50(4), (2010), p. 215-216。
可以使用单独的逆转录酶和热稳定的DNA聚合酶，例如，在两步(逆转录，随后添加DNA聚合酶和扩增)或组合反应(一次性添加两种酶)中。在一些实施方案中，用具有逆转录酶活性和DNA模板依赖性活性的热稳定聚合酶扩增所述靶核酸。示例性的酶包括Tth DNA聚合酶、C. therm聚合酶系统和在US20140170730和US20140051126中公开的那些。在一些实施方案中，Taq或Taq衍生物用于扩增(例如，Z05、C21等)。在一些实施方案中，逆转录酶来自MMLV、AMV或是其衍生物。
用于如本文所述的用途的探针可以用荧光团和猝灭剂(例如，TaqMan、LightCycler、Molecular Beacon、Scorpion或双标记的探针)标记。适当的荧光团包括FAM、JOE、JA270、TET、Cal Fluor Gold 540、HEX、VIC、Cal Fluor Orang 560、TAMRA、花青3、Quasar 570、Cal Fluor Red 590、Rox、德克萨斯红、花青5、Quasar 670和花青5.5。适当的猝灭剂包括TAMRA (用于FAM、JOE和TET)、DABCYL和BHQ1-3。
检测装置是本领域已知的，且可以选择为对于选定的标记适当的。适合于定量PCR的检测装置包括cobas®和Light Cycler®系统(Roche)、PRISM 7000和7300实时PCR系统(Applied Biosystems)等。可在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)和Rotorgene Q(Qiagen)上获得6-通道检测，从而允许更高程度的多重化。
结果可以以阈值循环数(缩写为Ct，且在某些情况下Cq或Cp)的方式表示。较低的Ct值反映了快速达到预定的阈值水平，例如，因为更高的靶核酸浓度或更有效的扩增。较高的Ct值可能反映较低的靶核酸浓度，或无效的或受抑制的扩增。通常将阈值循环数选择成在给定靶标的扩增的线性范围内。在一些实施方案中，将Ct设定为生长信号超过预定义的阈值线(例如，与基线有关)时的循环数，或通过确定生长曲线的二阶导数的最大值而设定。Ct的确定是本领域已知的，且描述在例如美国专利号7363168中。
V. 试剂盒
本文提供了用于检测样品中的MET外显子14缺失的多重qRT-PCR测定的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增、检测和/或定量编码MET外显子13-外显子14、外显子14-外显子15和外显子13-外显子15连接的转录物的引物和探针。
连接-特异性引物组和探针可以以任何组合混合和匹配。在具有4个通道的检测系统中，可以在单个容器中检测三个连接中的每一个，以及内部对照。或者，可以用较低程度的多重化或以非多重方式实施测定。例如，每个连接可以在例如具有内部对照的分开的容器中单独检测。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增、检测和/或定量编码MET外显子13-外显子15连接的转录物的引物和探针。这些引物(例如，RT引物，以及特异性扩增MET外显子13-外显子15连接扩增产物的正向和反向引物)和探针(对MET外显子13-外显子15连接扩增产物特异性)可以与特异性扩增和检测内部对照的引物和探针混合，或提供于分开的容器中。
在一些实施方案中，所述混合物进一步包含缓冲液、dNTP以及适合用于逆转录和扩增的其它要素(例如，辅因子或适体)。通常，将所述混合物浓缩，使得与样品(例如，RNA)、酶和/或水一起，将等分试样添加至最终的反应体积中。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含逆转录酶(或具有逆转录酶活性的酶)和/或DNA聚合酶(例如，热稳定的DNA聚合酶诸如Taq、ZO5、及其衍生物)。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括从样品(例如，血浆或FFPET样品)纯化RNA的组分。例如，所述试剂盒可以包括来自cobas® 6800/8800样品制备试剂盒、高纯或MagNA纯RNA分离试剂盒(Roche)、或miRNeasy或RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen)、PureLinkFFPE RNA分离试剂盒(Thermo Fisher)、ThruPLEX Plasma-seq (Beckman Coulter)等的组分。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括至少一种对照样品，例如，来自非癌样品(或合并的样品)，或来自已知MET外显子14缺失的样品(或合并的样品)的核酸。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括消耗品，例如，用于核酸制备的平板或管、用于样品收集的管等。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括使用说明书、对网站的参考，或软件。
VI. MET相关的癌症和疗法
MET突变与许多不同的癌症(包括肾癌、胃癌和中枢神经系统的那些以及肉瘤)相关。MET外显子14缺失尤其与非小细胞肺癌(NSCLC)和肺腺癌相关，分别在这些癌症的2％和4％中发现。2016年全国综合癌症网络(NCCN)指南现在将MET外显子14缺失包括在类别2A中，其用于具有遗传改变的肺癌患者的新兴靶向药物。
已显示MET抑制剂克唑替尼(也抑制ALK和ROS1)和卡博替尼(也抑制VEGFR2和RET)对携带MET外显子14跳过的肺腺癌患者是有效的。正在测试其他小分子MET抑制剂，包括INCB28060 (Incyte)、AMG-458 (Amgen)、PF-04217903 (Pfizer)、PF-02341066 (Pfizer)、E7050 (Eisai)、MK-2461 (Merck)、BMS-777607 (BMS)、JNJ-38877605 (Johnson &Johnson)、ARQ197 (ArQule)、GSK/1363089/XL880 (GSK/ Exelexis)和XL184 (BMS/Exelexis)。其他MET抑制剂包括生物制剂，例如对MET (例如，活化的MET)特异性的抗体或抗体片段。
具有MET外显子14缺失的患者也可以受益于标准化学疗法。这可以包括CHOP (环磷酰胺；多柔比星；长春新碱；和泼尼松龙)，或R-CHOP，其进一步包括利妥昔单抗和/或依托泊苷。可以将混合物定期施用设定的时间段，或直到检测到肿瘤大小和/或症状的减小。例如，可以每2或3周施用CHOP或R-CHOP。治疗通常开始于低剂量，使得可以确定副作用，且增加剂量直到副作用出现或在患者的耐受之内。
VII. 实施例
A. 测定设计(图2和3)
设计引物以跨越外显子13-外显子15 (突变体或外显子14缺失)和外显子13-外显子14和外显子14-外显子15 (野生型)的连接处进行扩增。还制备对每个扩增子的连接点特异性的探针，并用不同的标记物进行标记用于多重扩增和检测。还设计用于内部对照的引物和探针，在这种情况下为SDH (琥珀酰脱氢酶)。
引入非天然核酸和来自靶序列的错配以稳定特异性靶-寡核苷酸杂交。用于错配的最佳修饰和位置是不可预测的。合适的寡核苷酸序列显示于下表1中。MET13-FWD是指MET外显子13中的正向引物；MET14-FWD是指MET外显子14中的正向引物；MET14-REV是指MET外显子14中的反向引物；MET15-REV是指MET外显子15中的反向引物；MET13-15-PRB是指与MET外显子13和15的连接处的核苷酸杂交的探针；MET13-14-PRB是指与MET外显子13-14的连接处的核苷酸杂交的探针；且MET 14-15-PRB是指与MET外显子14-15的连接处的核苷酸杂交的探针。MET13-15-PRB9是反义方向探针，其不与MET外显子13-外显子15扩增产物杂交，且可用于对照。
表 1
pdU= C-5丙炔基-dU (T的非天然替代物)
pdC= C-5丙炔基-dC (C的非天然替代物)
5 Me dC= 5-甲基-2'-dC (C的非天然替代物)
G夹钳= AP-dC (C的非天然替代物)
N6 Bz dA= N6-苯甲酰基-2'-脱氧腺苷 (A的非天然替代物)
FAM, HEX, JA270= 荧光团
BHQ 2= 猝灭剂。
B. 用细胞系核酸的MET外显子14多重反应
用MET 13 FWD、MET 14 FWD、MET 14 REV和MET 15 REV引物以及每种不同标记的MET13-14-PRB、MET13-15-PRB和MET14-15-PRB探针运行多重测定。还包括内部对照引物和Cy5.5-标记的探针。
结果显示于图4-6中。图4显示MET外显子14缺失样品的信号相对于外显子14缺失RNA的拷贝数。图5和6显示野生型MET (分别为外显子13-外显子14和外显子14-外显子15)的信号相对于野生型RNA的拷贝数。每个图都显示该测定足够灵敏以检测30个拷贝的靶RNA输入。
图7显示该测定也是特异性的。显示对于突变细胞系(Mut1和Mut2)、野生型细胞系(WT1和WT2)和通用人RNA (UHR)的外显子13-外显子15连接的信号(FAM)。如图7中所示，对于缺乏MET外显子14缺失的样品，没有检测到信号。
C. 用掺入野生型血浆中的突变细胞系RNA的MET外显子14多重反应
将来自突变细胞系的核酸掺入野生型(正常)血浆中以确保血浆组分(包括野生型核酸)不会干扰突变体信号的检测。如图8中所示，可以在具有30个拷贝的突变RNA的样品中可靠地检测到MET外显子14缺失，其中用仅10个拷贝，信号略微下降。
D. 测定设计(图9)
使用图2和3中所示的测定设计，无论样品是MET野生型还是具有MET外显子14缺失，几乎总是产生外显子13-外显子14和外显子14-外显子15扩增产物。设计不同的测定形式以聚焦于外显子13-外显子15连接的扩增和检测。在这种情况下，用与外显子13中的序列互补的正向引物和与外显子15中相反方向的序列互补的反向引物，实施仅一个MET扩增反应。所得扩增产物具有来自外显子13的序列和来自外显子15的序列，并且可以用对扩增产物的任何部分特异性的探针检测。也就是说，探针可以对仅外显子13序列、仅外显子15序列或外显子序列的连接是特异性的。MET剪接是异质的，且因此可以产生多种变体扩增产物。可以设计探针以捕获多种外显子14剪接变体，或者可以设计多个探针以捕获不同的外显子14剪接变体。
E. MET外显子13-外显子15扩增和检测的性能
合适的MET13-FWD和MET15-REV引物和MET13-15-PRB探针显示于上表1中。例外是MET13-15-PRB9反义方向探针，其不与MET外显子13-外显子15扩增产物杂交，且可用于对照。
图10显示图9中描绘的测定设计的特异性。用FAM标记对外显子13-外显子15扩增产物特异性的探针(左图)，而用CY5.5标记对内部对照RNA特异性的探针(右图)。显示来自外显子14剪接掉(在左图中注明)的2种细胞系、2种野生型细胞系的RNA和UHR (通用人RNA)的qRT-PCR。仅外显子14剪接样品显示信号。
图11显示使用掺入0.1 ng/反应UHR的x轴上指示的量的MET外显子14剪接转录物的检测限值(LOD)和线性数据。外显子14剪接转录物在低至10个拷贝的线性范围内可检测到。内部对照用正方形指示，且外显子14剪接转录物用菱形指示。
图12显示使用以x轴上指示的量掺入来自FFPET (甲醛固定的石蜡包埋的组织)的50ng RNA中的来自2种不同细胞系的MET外显子14剪接转录物的LOD和线性。外显子14剪接转录物在低至10个拷贝的线性范围内可检测到。来自细胞系的外显子14剪接的细胞系转录物以正方形和菱形(沿着线)显示，其中内部对照分别以正方形和三角形显示。
图13显示使用以x轴上指示的量掺入来自健康供体血浆cfRNA的RNA的来自2种不同细胞系的MET外显子14剪接转录物的LOD和线性数据。再次，LOD在线性范围内为约10个拷贝。来自细胞系的外显子14剪接的细胞系转录物以正方形和菱形(沿着线)显示，其中内部对照分别以正方形和三角形显示。

Claims (30)

1.检测MET外显子14缺失的方法，其包括：
(a) 从个体获得包含RNA的样品；
(b) 对所述RNA实施逆转录反应以产生cDNA；
(c) 实施扩增反应，其包括使所述cDNA与特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和标记的探针(外显子13-15引物组和标记的外显子13-15探针)接触；和
(d) 如果通过外显子13-15引物组和标记的外显子13-15探针形成并检测到扩增产物，则检测到MET外显子14缺失的存在。
2.权利要求1的方法，其中所述样品是血浆或福尔马林固定的石蜡包埋的组织(FFPET)。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(b)和(c)在同一容器中实施。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)和(c)使用定量逆转录-PCR (qRT-PCR)实施。
5.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括在步骤(b)之前，对来自步骤(a)的样品进行RNA富集。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(c)进一步包括使所述cDNA与特异性扩增和检测内部对照的引物组和标记的探针(IC引物组和标记的IC探针)接触。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述个体具有癌症。
8.权利要求7的方法，其中所述个体具有非小细胞肺癌(NSCLC)。
9.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括如果检测到MET 14缺失，则用MET抑制剂为所述个体提供治疗。
10.鉴定具有癌症的个体的方法，其包括：
(a) 从所述个体获得包含RNA的样品；
(b) 对所述RNA实施逆转录反应以产生cDNA；
(c) 实施扩增反应，其包括使所述cDNA与特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和标记的探针(外显子13-15引物组和标记的外显子13-15探针)接触；和
(d) 如果通过外显子13-15引物组和标记的外显子13-15探针形成并检测到扩增产物，则检测到MET外显子14缺失的存在，
由此所述个体的样品中MET外显子14缺失突变的存在表明所述个体对MET抑制剂化合物的敏感性。
11.权利要求10的方法，其中所述样品是血浆或福尔马林固定的石蜡包埋的组织(FFPET)。
12.权利要求10或11的方法，其中步骤(b)和(c)在同一容器中实施。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中步骤(c)进一步包括使所述cDNA与特异性扩增和检测内部对照的引物组和标记的探针(IC引物组和标记的IC探针)接触。
14.试剂盒，其包含：
(a) 特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和标记的探针(外显子13-15引物组和标记的外显子13-15探针)，和
(b) 特异性扩增和检测内部对照的引物组和标记的探针(IC引物组和标记的IC探针)。
15.权利要求14的试剂盒，其进一步包含逆转录酶和热稳定DNA聚合酶，或具有两种活性的酶。
16.权利要求14或15的试剂盒，其进一步包含缓冲液和dNTP。
17.权利要求14-16中任一项的试剂盒，其进一步包含具有MET外显子14缺失的阳性对照。
18.权利要求14-17中任一项的试剂盒，其进一步包含缺乏MET外显子14缺失的阴性对照。
19.检测MET外显子14缺失的方法，其包括：
(a) 从个体获得包含RNA的样品；
(b) 对所述RNA实施逆转录反应以产生cDNA；
(c) 实施扩增反应，其包括使所述cDNA与以下接触：(i) 特异性扩增和检测MET外显子13-14连接的引物组和用第一标记物标记的探针，(ii) 特异性扩增和检测MET外显子14-15连接的引物组和用第二标记物标记的探针，和(iii) 特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和用第三标记物标记的探针；和
(d) 如果通过(iii)的引物组和探针形成并检测到扩增产物，则检测到MET外显子14缺失的存在。
20.权利要求19的方法，其中所述样品是血浆或福尔马林固定的石蜡包埋的组织(FFPET)。
21.权利要求19或20的方法，其中步骤(c)在单个容器中实施。
22.权利要求19-21中任一项的方法，其中步骤(b)和(c)在同一容器中实施。
23.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(c)进一步包括使所述cDNA与(iv)特异性扩增和检测内部对照的引物组和用第四标记物标记的探针接触。
24.前述权利要求中任一项的方法，其中所述个体具有癌症。
25.权利要求24的方法，其中所述个体具有非小细胞肺癌(NSCLC)。
26.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括如果检测到MET 14缺失，则用MET抑制剂为所述个体提供治疗。
27.试剂盒，其包含：
(a) 特异性扩增和检测MET外显子13-14连接的引物组和用第一标记物标记的探针；
(b) 特异性扩增和检测MET外显子14-15连接的引物组和用第二标记物标记的探针；和
(c) 特异性扩增和检测MET外显子13-15连接的引物组和用第三标记物标记的探针。
28.权利要求27的试剂盒，其进一步包含：
(d) 特异性扩增和检测内部对照的引物组和用第四标记物标记的探针。
29.权利要求27或28的试剂盒，其进一步包含具有MET外显子14缺失的阳性对照。
30.权利要求27-29中任一项的试剂盒，其进一步包含缺乏MET外显子14缺失的阴性对照。
CN201780029236.XA 2016-05-13 2017-05-11 Met外显子14缺失的检测和相关疗法 Pending CN109072293A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662336362P 2016-05-13 2016-05-13
US62/336,362 2016-05-13
PCT/EP2017/061310 WO2017194668A1 (en) 2016-05-13 2017-05-11 Detection of met exon 14 deletions and associated therapies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109072293A true CN109072293A (zh) 2018-12-21

Family

ID=58800788

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780029236.XA Pending CN109072293A (zh) 2016-05-13 2017-05-11 Met外显子14缺失的检测和相关疗法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11913072B2 (zh)
EP (1) EP3455375B1 (zh)
JP (1) JP7389551B2 (zh)
CN (1) CN109072293A (zh)
CA (1) CA3023839A1 (zh)
WO (1) WO2017194668A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022042575A1 (zh) * 2020-08-26 2022-03-03 北京市神经外科研究所 评价患者对met抑制剂敏感性的试剂盒
CN117230204A (zh) * 2023-11-15 2023-12-15 神州医疗科技股份有限公司 一种用于检测met基因14外显子剪接突变的引物探针组、试剂盒和检测系统

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108929908A (zh) * 2018-07-17 2018-12-04 张丽英 一种基于数字PCR平台c-MET基因Exon14跳读的检测方法
WO2020069350A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Grail, Inc. Methylation markers and targeted methylation probe panel
WO2021041764A2 (en) * 2019-08-28 2021-03-04 An Hsu Kit and methods to detect met gene fusion
US11211147B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Estimation of circulating tumor fraction using off-target reads of targeted-panel sequencing
US11211144B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for refining copy number variation in a liquid biopsy assay
US11475981B2 (en) 2020-02-18 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for dynamic variant thresholding in a liquid biopsy assay

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006056766A2 (en) 2004-11-24 2006-06-01 St George's Enterprises Limited Diagnosis of prostate cancer
CA2491067A1 (en) * 2004-12-24 2006-06-24 Stichting Katholieke Universiteit Mrna rations in urinary sediments and/or urine as a prognostic marker for prostate cancer
US8975019B2 (en) * 2009-10-19 2015-03-10 University Of Massachusetts Deducing exon connectivity by RNA-templated DNA ligation/sequencing
US20130122484A1 (en) * 2011-10-01 2013-05-16 Life Technologies Corporation Diagnostic method for determining animals persistently infected (pi) with bovine viral diarrhea virus (bvdv)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE, J.Y.等: "Gastrointestinal malignancies harbor actionable MET exon 14 deletions", 《ONCOTARGET》 *
PARK，S.等: "MET amplification, protein expression, and mutations in pulmonary adenocarcinoma", 《LUNG CANCER》 *
TOGASHI, Y.等: "MET gene exon 14 deletion created using the CRISPR/Cas9 systemenhances cellular growth and sensitivity to a MET inhibitor", 《LUNG CANCER》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022042575A1 (zh) * 2020-08-26 2022-03-03 北京市神经外科研究所 评价患者对met抑制剂敏感性的试剂盒
CN117230204A (zh) * 2023-11-15 2023-12-15 神州医疗科技股份有限公司 一种用于检测met基因14外显子剪接突变的引物探针组、试剂盒和检测系统

Also Published As

Publication number Publication date
US20170327887A1 (en) 2017-11-16
US11913072B2 (en) 2024-02-27
WO2017194668A1 (en) 2017-11-16
JP2019520802A (ja) 2019-07-25
EP3455375B1 (en) 2024-03-13
JP7389551B2 (ja) 2023-11-30
EP3455375A1 (en) 2019-03-20
CA3023839A1 (en) 2017-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109072293A (zh) Met外显子14缺失的检测和相关疗法
JP2009511008A (ja) ＥｒｂＢ受容体薬に対する患者の応答を予測またはモニタリングする方法
CN107532209A (zh) 检测基因融合的多重pcr
US20170369939A1 (en) Rapid Quantitative Detection of Single Nucleotide Polymorphisms or Somatic Variants and Methods to Identify Malignant Neoplasms
US20230061928A1 (en) Compositions and methods for detecting circulating tumor dna
JP2021513858A (ja) マイクロサテライト不安定性の改善された検出
CN106434982B (zh) 缺血性脑卒中相关的分子标记物及其应用
CN112824535A (zh) 基因突变多重检测用引物组合物及其试剂盒
CN109790568A (zh) 用于检测雌激素受体esr1突变的多路等位基因特异性pcr测定
CN101875970A (zh) Apc基因突变的快速检测
JP2013523178A (ja) Ｋｒａｓプライマーおよびプローブ
WO2019110796A1 (en) Detection of nucleic acids from platelet enriched plasma samples
CN107354197B (zh) 一种检测人类nras基因突变的试剂盒
JP7335871B2 (ja) 短い核酸の多重検出
US11248261B2 (en) RhD gene allele associated with a weak D phenotype and its uses
CN107029238B (zh) Linc01094在诊治缺血性脑卒中的应用
CN109154026A (zh) 用于将dlbcl分类的方法和组合物
JP7297902B2 (ja) 分析方法及びキット
US20070134674A1 (en) Method for the prognosis and/or diagnosis of a cancer
KR102408783B1 (ko) 알츠하이머 질환의 진단 또는 치료를 위한 ｓｃａｒｎａ１３의 용도
JP7410480B2 (ja) がんにおける融合遺伝子
KR101930818B1 (ko) 방광암의 비침습적 진단 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination