KR101966892B1 - 효소분해에 의한 실크피브로인의 분해방법. - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효소분해에 의한 실크피브로인의 분해방법에 관한 것으로서, 탄산나트륨으로 견사를 처리하여 세리신을 제거하는 정련 단계; 실크피브로인을 염화칼슘, 에탄올 및 물의 혼합 용매 또는 브롬화리튬 수용액 또는 염화칼슘 수용액으로 가용화시켜 실크피브로인 용액을 제조하는 단계; 단백질 분해효소를 상기 실크피브로인 용액에 부가하여 실크피브로인을 분해하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

효소분해에 의한 실크피브로인의 분해방법.{Hydrolysis Method of Silk Fibroin by Enzymatic Hydrolysis}
본 발명은 효소분해에 의한 실크피브로인의 분해방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 저분자량의 실크단백질 용액을 제조하기 위하여 단백질 분해효소를 이용하여 실크피브로인을 분해하는 방법에 관한 것이다.
비단원료인 실크(견사)는 피브로인 (Fibroin; 75%)과 세리신 (Sericin; 25%) 으로 구성된 단백질 복합체이다. 실제 실크단백질은 탄산나트륨을 이용하는 통상의 정련과정을 거쳐 세리신을 제거한 이후 피브로인으로 구성되어 있다. 그러나 피브로인은 구조적인 특성에 의하여 세룰로스와 같은 βsheet 형태의 구조로 인하여 불용성이면서 일정한 강도를 유지하는 단백질로서 천연섬유인 비단으로 사용되어 왔다. 21세기에 들어오면서 실크피브로인의 분해산물을 이용한 샴푸 등의 기능성 생활용품을 비롯하여 당뇨, 고혈압, 숙취제거, 생분해성 고분자 등 다양한 식품용 및 인체용 소재로 실용화되고 있다.
세리신과 피브로인으로 구성된 실크(비단섬유)는 정련과정을 거쳐 세리신이 제거된 피브로인단백질이 바로 섬유로 이용하는 실크이다. 실크피브로인 단백질은 글리신과 알라닌을 다량 함유하고 타이로신이나 세린을 비롯하여 17종류의 아미노산으로 이루어져 있으며 단백질 분해효소에 대해서는 안정한 것으로 알려져 있다. 실크피브로인 단백질은 산처리 가수분해법을 이용하여 고온 및 강산조건에서 장시간 처리하여 왔다. 산처리 가수분해 이후 직접 중화법에 의하여 산도를 조절하고 색소·이취를 제거하는 탈색·탈취, 탈염, 농축 및 건조하는 방법을 사용하여 실크펩타이드와 실크아미노산을 제조하여 왔다. 기존의 실크피브로인을 분해하는 산처리 방법은 분해산물의 불규칙한 분자량, 낮은 회수율, 환경오염 등의 문제점을 갖고 있다. 특히, 단백질을 직접 산처리 가수분해의 경우 반응조건에 따라 클로로하이드린 [MCPD(3-chloro-2-propane diol)와 DCP(1,3-dichloro-2-propanal)] 등의 유해물질 생성가능성을 내포하고 있다는 제약이 있다.
정련된 실크피브로인은 불용성이기 때문에 CaCl2 또는 LiBr 등 2가의 양이온을 이용하여 가용화 시킨 다음 투석방법을 이용하여 과량의 염을 제거한 이후 식품용 단백질 분해효소를 이용하여 저분자량의 실크단백질 또는 펩타이드 및 실크아미노산을 제조하는 방법이 제시되었다. 또한 피브로인만으로 구성된 자연 상태의 실크단백질은 주요 아미노산으로 글리신 (Glycine; 50%), 알라닌 (Alanine; 30%), 세린 (Serine; 10%)으로 구성되어 있다.
최근 산처리가 아닌 단백질 분해효소를 이용한 실크단백질의 제조방법이 개발되고 있는데, 이러한 예로는 대한민국 공개특허공보 10-1998-0081941호, 10-2002-0023866호, 대한민국 등록특허공보 10-0286388호, 10-0881210호 등을 들 수 있다.
단백질 분해효소를 이용한 실크단백질의 제조방법에 있어서, 실크단백질의 분해과정이 중요한 요소가 되는데, 상기 선행기술들에서는 알칼라아제, 플라보자인, 프로테아제 등의 다양한 단백질 분해효소를 사용하고 있을 뿐, 각각의 단백질 분해효소의 분해 특성과 이를 조합한 단백질 분해 효율의 향상은 특별히 고려하고 있지 않다.
자연상태의 실크단백질은 아미노산 성분으로 글리신 약 50%, 알라닌 약 30%, 세린 약 10%로 구성되어 있는데, 분해공정을 통해 얻을 수 있는 다른 아미노산 성분의 함량에 의해 실크단백질 제품의 품질이 결정되는 점에서 이러한 단백질 분해 효율에 대한 최적화가 요구되고 있다.
대한민국 공개특허공보 10-2002-0023866호 대한민국 등록특허공보 10-0286388호 대한민국 등록특허공보 10-0881210호 대한민국 등록특허공보 10-0335702호
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 기존의 산처리 가수분해방법의 단점을 보완하고, 생산수율을 향상시키는 방법으로 식품용 효소처리로 실크피브로인을 분해하여 식용 가능한 저분자량의 실크단백질이나 실크펩타이드, 실크아미노산을 제조하기 위하여 실크피브로인을 효율적으로 분해하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 효소분해에 의한 실크피브로인의 분해방법은 탄산나트륨으로 견사를 처리하여 세리신을 제거하는 정련 단계; 실크피브로인을 염화칼슘, 에탄올 및 물의 혼합 용매 또는 브롬화리튬 수용액 또는 염화칼슘 수용액으로 가용화시켜 실크피브로인 용액을 제조하는 단계; 단백질 분해효소를 상기 실크피브로인 용액에 부가하여 실크피브로인을 분해하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 실크피브로인 용액에 Alcalase, FoodPro Alkaline Protease, Alphalase, 및 Delvolase 중 어느 하나를 실크피브로인 대비 0.1~5 중량% 부가하여 실크피브로인을 분해하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 실크피브로인 용액에 Collupulin, Flavourzyme, Promod 278, 및 Promod 279 중 어느 하나를 실크피브로인 대비 0.1~5 중량% 부가하여 실크피브로인을 분해하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 실크피브로인 용액에 FoodPro Alkaline Protease, Collupulin 및 Alphalase의 혼합물을 실크피브로인 대비 0.1~5 중량% 부가하여 실크피브로인을 분해하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 실크피브로인 용액에 Alkaline Protease를 부가하여 1차 분해하는 단계; 상기 1차 분해물에 Neutral 또는 Acidic Protease를 부가하여 2차 분해하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 실크피브로인 분해방법은 다양한 식품용 단백질 분해효소의 조합에 의해 효소 분해 공정을 실시하기 때문에 종래의 산 처리 가수분해법이나 일반적인 효소 가수분해법에 비해 높은 효율로 실크피브로인을 분해할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 CaCl2 용액으로 가용화시킨 실크피브로인의 Bacterial Protease에 의한 분해반응을 나타낸 그래프이다.
도 2는 LiBr 용액으로 가용화시킨 실크피브로인의 Bacterial Protease에 의한 분해반응을 나타낸 그래프이다.
도 3은 Bacterial Protease에 의한 실크피브로인의 분해반응을 나타낸 그래프이다.
도 4는 Fungal & Plant Protease에 의한 실크피브로인의 분해반응을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실크피브로인 대비 1%의 단백질 분해효소 처리에 의한 실크피브로인의 분해반응을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실크피브로인 대비 0.1%의 단백질 분해효소 처리에 의한 실크피브로인의 분해반응을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실크피브로인 대비 0.5%의 단백질 분해효소 처리에 의한 실크피브로인의 분해반응을 나타낸 그래프이다.
도 8은 10% polyacrylamide를 이용한 실크단백질과 단백질 분해효소 반응물의 SDS-PAGE 결과로서, lane 1은 반응시간 0시간, lane 2는 반응시간 1.5 시간, lane 3는 반응시간 3 시간, lane 4는 반응시간 6 시간, lande 5는 반응시간 30.5 시간을 나타낸다.
이하 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
일반적으로 단백질 분해효소는 Endo 타입의 Protease와 Exo 타입의 aminopeptidase로 단백질을 분해하는 방법으로 분류되고 있다. 효소의 active site에 존재하는 아미노산의 기능에 따라 Serine protease, thiol (cysteine) protease, Aspartyl protease 등으로 분류되기도 한다. 단백질 분해효소를 생성하는 생물체에 따라 Bacterial protease와 Fungal protease로, 반응조건인 pH에 따라 acidic, neutral, alkaline protease로도 구분되고 있으며 각각의 특이성이 다른 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 실크피브로인의 분해효율을 높이기 위한 단백질 분해효소를 선발하고 이들을 복합적으로 활용하여 실크펩타이드와 실크아미노산을 제조방법을 확립하는 것을 목적으로 다양한 단백질 분해효소를 시험해왔다. 특히, 단백질 분해효소로서 식품첨가물로 허가된 계통을 사용하면 효소처리에 의해 제조된 실크단백질을 식품 또는 건강기능식품에 안전하게 활용할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 실크피브로인 분해 방법은 견사를 탄산나트륨으로 처리하여 세리신을 제거하고, 얻어진 실크피브로인을 염화칼슘(CaCl2) 또는 브롬화리튬(LiBr) 또는 이를 함유한 혼합 용매를 이용하여 가용화시킨 후, 투석과정을 거쳐 과량의 염을 제거함으로써 실크피브로인 용액을 얻고, 상기 실크피브로인 용액을 식품용으로 허가된 단백질 분해효소를 이용하여 분해하는 것을 특징으로 한다. 이러한 분해 공정을 통해 가용성인 저분자량의 실크단백질, 실크펩타이드, 실크아미노산을 제조할 수 있다.
본 발명의 실크피브로인 분해 방법을 구체적으로 설명하면 아래와 같다.
제1 공정: 세리신을 제거하는 정련 공정
견사를 0.02M의 탄산나트륨 용액에 충분히 잠기게 하여 100℃에서 20분간 끓이며, 이 과정을 3번 반복한다. 이후, 건조하여 세리신이 제거되고 피브로인으로 구성된 실크피브로인을 얻는다.
제2 공정: 실크피브로인의 용해 및 투석
정련된 20 중량부의 실크단백질에 염화칼슘, 에탄올, 및 물을 1:2:8의 몰비로 혼합하여 제조된 염화칼슘 용액 또는 10M의 브롬화리튬 용액 또는 10M의 염화칼슘 용액을 100 중량부를 가한다. 이를 80 내지 90℃에서 1 내지 3시간 교반하여 용해시킴으로써 20%(w/v)의 고점도 실크피브로인 용액을 제조한다.
상기 용액을 한계분자량이 14,000인 투석막(Sigma사)을 이용하여 3일 이상 계속하여 증류수를 교체하면서 과량의 염을 제거한다. 이 과정에서 실크피브로인 용액의 점도가 낮아진다.
투석이 완료되면 실크피브로인 용액을 원심분리하여 고형물을 제거하고 0.45㎛ 셀룰로오스아세테이트 막(Advantec사)을 이용하여 여과한다. 이때 실크피브로인의 농도는 투석 전 20%(w/v)에서 투석-원심분리-여과를 거친 후 약 4 내지 5%(w/v) 수준으로 감소한다.
제3 공정: 단백질 분해효소의 제조 및 여과
본 발명에서 단백질 분해효소는 식품첨가제 용도로 판매되는 다양한 단백질 분해효소를 구입하여 사용한다. 단백질 분해효소는 각각의 적정 pH에 해당하는 식품용 무기염을 이용한 인산염 완충용액이나 글리신 완충용액을 이용하여 제조한 후, 0.45㎛ 셀룰로오스아세테이트 막(Advantec사)을 이용하여 여과한 후 냉장보관한다. 본 발명에서 사용된 단백질 분해효소는 식품용으로 허가된 것으로서 표 1과 같다.
제품명 제조사 반응조건 효소 구분
pH 온도(°C) 타입 출처 Active site pH 기타
Alcalaseⓡ AF2.4 L Novozymes 7.0~9.0 30~65 Endo Bacteria B. licheniformis Serin Protease Alkaline Uncharged amino acids
Alphalaseⓡ NP DuPont 6.0~7.5 50~60 Endo Bacteria B. amyloliquefaciens Neutral
Delvolase™ DSM Food Specialties 7.0~10.5 45~75 Endo Bacteria B. licheniformis Serin Protease Alkaline
FoodProⓡ Alakline Protease DuPont 7.0~9.0 45~70 Endo Bacteria B. licheniformis Serin Protease Alkaline
Maxazymeⓡ NNP DS DSM Food Specialties 6.5~7.5 40~50 Endo Bacteria B. subtilis Neutral
Neutrase™ 0.8 L Novozymes 7.0 40~50 Endo Bacteria B. amyloliquefaciens Metallo(Zn) Enzyme Neutral
Protamexⓡ Novozymes 7.0~8.0 50 Endo Bacteria Bacillus protease Complex Serin Protease Alkaline
Bromelain BR1200 PT Bromelain Enzyme 6.0~8.0 45~50 Endo Plant Pineapple
(Ananas comosus)		 Thiol (Cys) Protease Neutral Lys, Arg, Tyr, Gly
Collupulin™ MG DSM Food Specialties 5.0~7.5 50~70 Endo Plant Carica papaya Thiol (Cys) Protease Acidic Hydrophobic amino acids
Flavourzymeⓡ 500 MG Novozymes 5.5~7.5 50~55 Exo/Endo Fungi A. oryzae Neutral
Promod™ 192P Biocatalysts 4.0~6.0 40~55 Exo Fungi A. oryzae Acidic
Promod™ 279MDP Biocatalysts 4.0~6.0 50~60 Exo Fungi Aspergillus sp. Acidic
Promod™ 278MDP Biocatalysts 6.0~8.5 50~70 Endo Plant + Bacteria Carica papaya
+ B. subtilis 		Neutral
Pancreatin Biocatalysts 7.0~8.0 40~50 Endo Animal Porcine pancreas Serin Protease Alkaline Lys, Arg
BC Pepsin 비전바이오켐 2.0~5.5 40~55 Endo Animal Porcine gastric mucosa Aspartyl Protease Acidic
제4 공정: 실크피브로인 분해효소의 선발 및 적용
실크피브로인 용액을 2 중량%(20g/ℓ)로 희석하여 표 1의 단백질 분해효소를 표 2와 같은 반응 조건으로 효소 분해 반응을 실시한다. 효소 반응에 의한 단백질의 분해를 정량적으로 확인하기 위해 단백질 정량방법 중에서 펩타이드 결합에 직접 반응하는 Lowry 방법을 사용한다. 상기 Lowry 방법은 효소반응액 0.2㎖에 2% Na2CO3(0.1M NaOH)와 1% CuSO4와 2% 주석산칼륨나트륨 4수화물을 98:1:1의 중량비로 혼합한 용액을 1㎖ 첨가하여 상온에서 15분간 방치한 후 Folin-Ciocaiteu Reagent(Sigma사)와 증류수를 1:1의 중량비로 혼합한 용액을 0.1㎖ 첨가하여 상온에서 30분 간 혼합한 후 595nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. 단백질의 농도 측정을 위한 표준물질은 Protein standard(Sigma사)를 사용한다.
효소 반응에 의한 분해산물인 펩타이드와 아미노산은 아미노기와 정량적으로 반응하는 Ninhydrin 방법을 사용한다. 즉, 효소반응액 0.2㎖에 Ninhydrin Reagent(Sigma사)를 0.1㎖ 혼합하고 10분 동안 가열한 후 실온으로 냉각시키고 여기에 95% 에탄올 0.5㎖를 첨가하여 혼합한 후 570nm의 파장으로 흡광도를 측정한다. 아미노산 정량을 위한 표준물질은 실크피브로인의 주요 아미노산인 글리신(Samchun사)를 0.05% 아세트산에 용해시켜 사용한다.
단백질 분해효소 실크 피브로인(%) 효소처리량
효소 : 단백질 		완충용액
(0.25 M)		 반응조건 효소 구분
pH 온도(°C) 타입 출처 Active site pH
Alcalaseⓡ AF2.4 L 2 7.3% 인산염 완충용액 8.0 50 Endo B. licheniformis Serin Protease Alkaline
Alphalaseⓡ NP 2 5.5% 인산염 완충용액 7.0 50 Endo B. amyloliquefaciens Neutral
Delvolase™ 2 4.7% 인산염 완충용액 7.0 50 Endo B. licheniformis Serin Protease Alkaline
FoodProⓡ Alakline Protease 2 4.7% 인산염 완충용액 8.0 50 Endo B. licheniformis Serin Protease Alkaline
Maxazymeⓡ NNP DS 2 5.2% 인산염 완충용액 7.0 50 Endo B. subtilis Neutral
Neutrase™ 0.8 L 2 4.1% 인산염 완충용액 7.0 50 Endo B. amyloliquefaciens Metallo(Zn) Enzyme Neutral
Protamexⓡ 2 4.3% 인산염 완충용액 7.6 50 Endo Bacillus protease Complex Serin Protease Alkaline
Bromelain BR1200 2 4.7% 인산염 완충용액 7.0 50 Endo Pineapple
(Ananas comosus)		 Thiol (Cys) Protease Neutral
Collupulin™ MG 2 2.7% 인산염 완충용액 6.0 50 Endo Carica papaya Thiol (Cys) Protease Acidic
Flavourzymeⓡ 500 MG 2 1.5% 인산염 완충용액 7.0 50 Exo/Endo A. oryzae Neutral
Promod™ 192P 2 4.7% 인산염 완충용액 6.0 50 Exo A. oryzae Acidic
Promod™ 279MDP 2 1.9% 인산염 완충용액 6.0 50 Exo Aspergillus sp. Acidic
Promod™ 278MDP 2 4.4% 인산염 완충용액 7.0 50 Endo Carica papaya
+ B. subtilis 		Neutral
Pancreatin 2 5.5% 인산염 완충용액 7.6 50 Endo Porcine pancreas Serin Protease Alkaline
BC Pepsin 2 3.0% 글리신 완충용액 2.2 50 Endo Porcine gastric mucosa Aspartyl Protease Acidic
일반적으로 고분자량의 단백질이 단백질 분해효소에 의하여 저분자량의 단백질(또는 펩타이드)로 분해되면 Lowry 방법에 의한 단백질의 량은 감소하게 되고, 이와 동시에 분해된 펩타이드 결합으로부터 아미노기가 노출되어 효소 반응에 따라 아미노산의 량은 증가하게 된다. 엔도형의 단백질 분해효소에 의해 단백질이 분해되면 단백질의 량은 감소하는 반면 아미노산의 량은 증가하게 되는 것이다.
한편, 엑소형(aminopeptidase)의 단백질 분해효소의 경우에는 단백질을 구성하고 있는 말단의 아미노산을 단백질 본체에서 격리시키기 때문에 효소반응에 따라 단백질의 량은 미량 감소하는 반면 아미노산의 량은 증가하게 된다.
단백질 분해효소 중에서 Bacterial protease 7 종류에 대하여 실크피브로인 대비 약 5%의 효소를 처리한 경우 metalloenzyme인 Neutralse를 제외하고는 모두 단백질 분해효과를 확인할 수 있었다. 이중 Alcalase, Alphalase, Delvolase, 그리고 FoodPro Alkaline Protease에서 4종류의 단백질 분해효소에 의하여 30시간 이내에 40% 이상의 실크피브로인이 분해되는 것을 확인할 수 있었다 (도 1 및 도 2). Alcalase, Alphalase, Delvolase, 그리고 FoodPro Alkaline Protease는 기존에 알려진 Protamex (대한민국 등록특허공보 10-0282252호) 보다 실크피브로인 분해력이 비슷하거나 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 실크피브로인를 가용화시키는 용액에 따른 실크단백질의 효소분해 정도는 CaCl2 용액보다는 LiBr용액으로 가용화시킨 실크피브로인의 분해가 원활하게 이루어지는 것으로 확인되었다 (도 3).
Bacterial protease 중에서 Alcalase의 경우에는 엔도형으로 알려져 있으나 아미노산의 해리 정도로 보아 일부 엑소형의 기능도 가지고 있는 것으로 예측된다. Bacterial Protease의 경우 단백질 분해력이 우수한 단백질 분해효소는 Delvolase와 FoodPro Alkaline Protease로서 모두 Seine protease로 확인되었다.
단백질 분해효소 중에서 Bacterial protease 이외의 Fungal (3 종), plant (2 종), animal (2 종), 그리고 혼합형 (1 종)인 protease 8 종류에 대하여 실크피브로인 분해효과를 조사한 결과, Collupulin, Flavourzyme, Promod 279 및 Promod 278에서 실크피브로인의 분해력을 확인할 수 있었다 (도 4). Bacterial protease의 효소반응과는 달리 Plant protease인 Collupulin은 LiBr용액보다는 CaCl2 용액으로 가용화시킨 실크피브로인의 분해가 원활하게 이루어지는 것으로 확인되었다. 그러나 Fungal, plant, animal 및 혼합형 protease의 경우에는 기존에 알려진 Flavourzyme (대한민국 등록특허공보 10-0286388호, 10-028225호)보다 단백질 분해력이 좋은 효소는 Promod 278과 Collupulin으로 확인 되었다. 그러나 단백질 분해에 의한 아미노산의 량은 Endo와 Exo 타입이 혼합된 Flavourzyme이 가장 우수하였다.
또한, 단백질 분해효소를 사용하여 2차에 걸친 분해과정을 실시할 수도 있다.
1차적으로 다양한 단백질 분해효소 중에서 실크피브로인을 단독으로 분해하는 효소로서 Bacterial protease 중 Alcalase, FoodPro Alkaline Protease, Delvolase, Alphalase를 선정하였다. 실크피브로인 대비 동일한 량의 단백질분해효소를 동일한 효소반응조건에서 처리하여 기존에 Bacilluis 유래 protease 복합체인 Protamex와 비교 실험하였다. Serin protease로 알려진 Alcalase, Delvolase, FoodPro Alkaline Protease 3종의 단백질 분해효소가 기존 Protamex보다 25% 이상 높은 단백질 분해효율을 보이고 있으며 분해된 아미노산의 량에서도 동일하게 확인되었다 (도 5 및 도 6). 또한 Protamex는 Neutral protease인 Alphalase와 유사한 반응효율을 보이고 있다. Protamex보다 25% 이상 높은 반응효율을 지닌 Alcalase, Delvolase, FoodPro Alkaline Protease 3종의 단백질 분해효소를 1:1:1로 혼합하여 동일한 효소량을 처리하여도 단백질분해효소의 혼합에 의한 시너지 효과는 일어나지 않았다. 이는 선정한 3종의 단백질 분해효소가 Serine protease이며 Alkaline protease로서 동일한 효소반응 기작을 갖고 있기 때문으로 판단된다.
2차적으로 실크피브로인을 단백질 분해효소로 효율적으로 분해하기 위하여 Serine protease (FoodPro Alakaline Protease)와 Thiol protease (Collupulin), 그리고 별도로 분류되지 않은 Protease (Alphalase)를 혼합적용 함으로서 실크피브로인의 분해에 시너지 효과를 추진하였다. 실크피브로인 대비 동일 비율로 혼합한 단백질분해효소를 0.5% 처리하여 단백질 분해반응을 시킨 결과, 혼합된 단백질 분해효소가 단독으로 사용된 경우에 비하여 시너지 효과가 있음을 확인하였다(도 7).
3가지 단백질 분해효소의 반응 pH는 7.6으로 조절함으로서 단독으로 사용된 단백질 분해효소 대비 혼합된 단백질 분해효소의 반응효율이 증가하였다. 이는 Serine protease와 Thiol protease가 작용하는 부위가 상이하고, 연속반응에 의한 결과라고 판단된다. 실제 Collupulin 자체로서는 단백질 분해가 미흡하게 확인되었고, Alphalase와 Collupulin을 1:1로 혼합 사용한 경우(pH 7.0)에도 시너지 효과는 없었지만, Alphalase, Collupulin, FoodPro Alkaline Protease를 1:1:1로 혼합하여 적용하는 경우(pH 7.6) 확실한 시너지 효과가 있었다.

아미노산		 산처리(Mol %) 효소처리(Mol %)
GLY (글리신) 55.73 55.69
ALA (알라닌) 30.57 27.75
SER (세린) 8.70 10.31
HIS (히스티딘) 1.61 1.34
ASX (아스파르트산+아스파라긴) 1.14 1.05
GLX (글루탐산+글루타민) 0.62 0.92
VAL (발린) 0.57 0.92
PRO (프롤린) 0.36 0.68
THR (트레오닌) 0.31 0.46
LYS (라이신) 0.15 0.24
LEU (류신) 0.14 0.38
ILE (아이소류신) 0.10 0.26
TYR (타이로신) - -
PHE (페닐알라닌) - -
ARG (아르기닌) - -
TRP (트립토판) - -
MET (메티오닌) - -
CYA (시스테인+시스틴) - -
소 계 100.0 100.0
또한, 표 3에서는 실크피브로인의 가수분해방법 (산처리 및 효소처리 가수분해)에 따른 아미노산 조성을 비교하였다.
표 3의 결과로부터, 50% 이상이 글리신으로 구성되어 있으나, 아미노산의 작용기에 따라 효소처리방법에 의한 가수분해의 경우 아미노산의 함량이 산처리 가수분해 방법보다 Serine을 포함하여 Mol%가 1% 미만이었던 아미노산의 함량이 높은 것으로 확인되었다.
실크피브로인을 구성하는 아미노산은 Non-polar한 아미노산 (글리신, 알라닌, 발린, 프로린, 류신, 아이소류신)이 80% 이상을 차지하고 있으며 나머지 아미노산은 Polar, Aromatic 및 Charged 아미노산이다. 실크피브로인의 분해방법에 따라 Non-polar한 아미노산의 조성이 산처리 방법에서 약간 높은 것으로 확인되었다.
도 8은 가용화시킨 실크피브로인을 단백질 분해효소와 혼합하여 반응시간에 따라 실크피브로인의 분자량 변화를 확인하기 위하여 실행한 전기영동의 결과이다.
1번 라인의 경우 실크단백질의 존재가 Running gel의 시작 부위와 중간지점에 매우 희미하게 확인되고 있다. 효소분해반응 진행에 따라 반응시간 3시간 이후에는 Running gel의 시작 부위에 고분자량의 실크단백질이 존재하는 것을 확인할 수 있을 뿐만 아니라 중간부위에서도 일정한 분자량의 단백질 밴드를 명확하게 확인할 수 있다.
이상의 결과로부터 본 발명은 식품용으로 허가된 단백질 분해효소를 이용함으로써 고분자량의 실크피브로인을 효율적으로 분해하여 저분자량의 실크피브로인, 실크펩타이드 또는 실크아미노산을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 확인하였다.
특히, 기존의 산처리 가수분해방법에서 제기되는 분해산물의 불규칙한 분자량, 낮은 회수율, 환경오염 뿐 만 아니라 산처리 과정에서 발생하는 클로로하이드린 [MCPD (3-chloro-2-propane diol)와 DCP(1,3-dichloro-2-propanal)] 등의 유해물질 생성가능성을 해결할 수 있기 ?문에 식품소재, 기능성 식품 또는 화장품 원료로 그 사용범위를 확대할 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명은 상술한 바와 같이 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형과 변경이 가능하다. 그러한 변형예 및 변경예는 본 발명과 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 한다.

Claims (5)

  1. 견사를 0.02M의 탄산나트륨 용액에 잠기게 하여 100℃에서 20분간 끓이는 과정을 3번 반복하여 세리신을 제거하여 실크피브로인을 얻는 정련 단계;
    상기 실크피브로인을 10M의 브롬화리튬 용액을 가하고 80 내지 90℃에서 1 내지 3시간 동안 교반하여 가용화시켜 20%(w/v)의 실크피브로인 용액을 제조하고, 상기 실크피브로인 용액을 투석하고 원심분리한 후 여과하여 고형물을 제거함으로써 4 내지 5%(w/v)의 실크피브로인 용액을 제조하는 단계;
    상기 실크피브로인 용액을 2 중량%로 희석하고 단백질 분해효소인 Alcalase, FoodPro Alkaline Protease, Alphalase, 및 Delvolase 중 어느 하나를 실크피브로인 대비 5 중량% 부가하여 30시간 이내에 40% 이상의 실크피브로인을 분해하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소분해에 의한 실크피브로인의 분해방법.
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