KR20020023866A

KR20020023866A - 누에고치 소재 단백가수분해법에 의한 실크 아미노산과 실크 펩타이드의 제조방법 및 이의 항암, 항유전독성 효과

Info

Publication number: KR20020023866A
Application number: KR1020010084592A
Authority: KR
Inventors: 이성희; 이찬재; 최애진; 현창기
Original assignee: 이성희; 주식회사 아미노젠
Priority date: 2001-12-24
Filing date: 2001-12-24
Publication date: 2002-03-29

Abstract

본 발명은 누에고치에 존재하는 피브로인(Fibroin) 및 그 외 단백질을 가수분해시켜 제조된 저분자량의 실크아미노산 · 펩타이드 등을 함유하는 기능성 식품소재에 대한 제조방법에 관한 것이다. 누에고치는 세리신(Serisin), 피브로인(Fibroin)과 같은 단백질로 형성되어 있으며 이러한 단백질을 최근에는 기능성 식 ·음료의 소재로 이용하기 위한 개발이 활발히 진행되고 있다. 그러나 이제까지의 기술들은 누에고치로 채취되는 견단백질을 별다른 처리공정을 거치지 아니하고 원형그대로 사용하였거나 용해된 피브로인 수용액의 정제를 투석(Dialysis)에 의해 정제하는 방법을 사용하였으므로 대량 생산시 생산의 수율이 저하되는 비경제적인 면이 있었으며 견단백질이 가지고 있는 섬유상의 구조적인 특징 및 아미노산의 배열 등으로 인체내에서의 분해의 지연이나 분해가 어려워 흡수율이 저하되어 기능성 식품소재로서의 가치가 떨어지는 등의 문제점이 내포되어 있다. 이러한 문제점을 개선하기 위하여 단백가수분해법 중에서 단백질의 특정 결합에 관여하여 결합고리를 절단하여 분해율이 낮고 수율이 적은 효소 분해법 대신에 아미노산이나 펩타이드까지 분해가 되며 인체 흡수율이 90% 정도 되고, 인체에 운용한 생리활성을 가지는 아미노산의 비율이 높게 분해되는 산가수분해법을 사용한다. 정련, 세척, 가수분해, 중화, 탈색/탈취, 여과, 탈염, 농축/건조의 8가지 주요 공정을 거쳐서 생산한 실크분말을 스틱 도는 병으로 포장하여 제품화한다. 본 발명은 실크 아미노산의 제조방법을 모색하고 성분 분석을 통하여 천연실크에서 기능성 있는 아미노산을 분리, 추출하는 기술개발과 실크 아미노산 원료 및 제품개발에 기본 자료를 제공하고 실크 가수분해물이 생리적 활성을 가지고 있음을 보이고자 한다. 본 발명을 계기로 실크펩타이드 및 실크아미노산의 항산화, 콜레스테롤 저하 효과, 소화흡수 촉진 기능성, 알코올 흡수저해, 체내의 면역 능력을 증가시켜 주는 효과를 기대할 수 있으며 건강 기능성 식품으로의 탄생을 예상할 수 있다.

Description

누에고치 소재 단백가수분해법에 의한 실크아미노산과 실크펩타이드의 제조방법 및 이의 항암, 항유전독성 효과{omitted}

현대사회에서 기능성 식품 산업분야는 신소재를 찾아 인체 내에 꼭 필요한 유익 성분만들을 순수 정제 · 분리하여 영양학적 측면에서 우수한 원료들을 사용하고 있다. 누에고치는 섬유상 단백질인 피브로인과 그것을 둘러싸고 있는 고무상 단백질인 세리신으로 구성되어 있다. 실크 단백질의 아미노산은 글라이신(glycine), 알라닌(alanine), 세리신(sericine), 티로신(tyrosine) 등으로서 주요 아미노산이 90% 이상을 차지하고 있다. 이러한 단백질을 최근에는 기능성 식 · 음료의 소재로 이용하기 위한 개발이 활발히 진행되고 있다. 그러나 이제까지의 기술들은 누에고치로 채취되는 견단백질을 별다른 처리 공정을 거치지 아니하고 원형그대로 사용하였거나 용해된 피브로인 수용액의 정제를 투석(Dialysis)에 의해 정제하는 방법을 사용하였으므로 대량 생산시 생산의 수율이 저하되는 비경제적인 면이 있었으며 견단백질이 가지고 있는 섬유상의 구조적인 특징 및 아미노산의 배열 등으로 인체 내에서의 분해의 지연이나 분해가 어려워 흡수율이 저하되어 기능성 식품 소재로서의 가치가 떨어지는 등의 문제점이 내포되어 있다.

실크 아미노산의 제조 기술은 크게 산 가수분해방법과 효소분해방법이 알려져 있다. 일본에서는 이 실크 단백질을 산, 알칼리 또는 효소적 가수분해를 통해 저분자 펩타이드 또는 아미노산 형태로 분해하여 소화흡수를 용이하게 하는 방식으로 식용화하고 있다. 그 중 효소분해법은 효소의 단백질의 특정 결합에 관여하여 결합고리를 절단하게 되므로, 견단백질이 아미노산까지 분해되는 분해율이 매우 낮은데 비하여 산가수분해법은 거의 대부분이 아미노산이나 펩타이드까지 분해가 된다. 실제 대량생산 공정상에서 볼 때 효소분해법은 공정이 간단한데 비하여 분해율이 낮고, 그로 인한 수율이 저조하며, 인체 흡수율이 낮은데 비하여, 산가수분해법으로 생산된 실크 아미노산은 인체 흡수율 거의 90% 정도로 흡수되기 효과적인 형태로 구성되어 있으며, 인체에 유용한 생리활성을 가지는 기능적 아미노산은 더 많이 함유되어 있다.

본 발명에서 제시된 실크단백질의 산가수분해법은 산가수분해물의 아미노산 조성 및 생리활성을 나타내는 기능적 성분의 함량에서 더 우위를 차지하는 제품을 생산할 수 있는 새로운 것이다.

단백질원의 가수분해를 통하여 생산되는 기능성 펩타이드의 시장 및 그 연구개발은 현재 일본이 가장 앞서고 있지만 아직 펩타이드 식품의 응용범위는 아직 제한되어 있으며 시장도 형성단계에 있다. 현재 일본에서 상품화된 기능성 펩타이드식품은 소화흡수 촉진 기능성, 실크 가수분해물의 단백질 분자량의 분포 및 소화에 관한 연구, 실크 피브로인의 혈청 콜레스테롤 억제효과, 콜레스테롤의 대사에 있어서 함황아미노산의 중요성, 칼슘흡수촉진 및 골다공증 예방, 알코올 흡수저해 기능성, 고혈압 예방 기능성, 항산화 기능성, 항알레르기 기능성 등이 계속 연구되고 있는 것으로 알려져 있다.

그리고 실크 피브로인의 또 다른 기능성 연구로서 기포성의 식품가공에의 이용 및 견직물 잔사의 식품소재로서의 응용에 관한 연구결과도 보고되어 있다. 그러나 이들 생리활성에 대한 체계적인 연구가 되어 있는 것이 아니라 가수분해물을 동물에 투여하여 활성을 확인하는 정도이거나(항당뇨, 알콜대사촉진, 콜레스테롤 저하작용 등) 주요 아미노산이 나타낼 수 있는 활성이 가수분해물에서도 나타날 것으로 추정하는 정도이다. 본 발명에서 제시된 제품의 기능성은 유전자의 손상을 억제시켜주는 항암, 항유전 독성 등이다.

본 발명의 목적은 누에고치에 존재하는 피브로인(Fibroin) 및 그 외 단백질을 염산가수분해시켜 제조된 저분자량의 실크아미노산 · 펩타이드 등을 함유하는 기능성 식품 소재에 대한 제조방법에 관한 것이다. 누에고치는 세리신(Serisin)과 피브로인(Fibroin)으로 구성되어 있으며 이 중 피브로인 단백질을 최근에는 기능성 식 · 음료의 소재로 이용하기 위한 개발이 활발히 진행되고 있다. 그러나 이제까지의 기술들과는 달리 본 발명은 견단백질이 가지고 있는 섬유상의 구조적인 특징 및 아미노산의 배열 등의 특성을 고려, 문제점을 개선하여 아미노산 조성 및 생리활성을 나타내는 기능적 성분의 함량에서 더 우위를 차지하는 실크 단백질의 단백가수분해물을 제조하고자 한다. 본 발명은 산가수분해법에 의한 실크 아미노산의 제조방법을 제공하고, 이러한 공정법으로 생산된 실크 아미노산 및 실크 펩타이드의 성분 분석을 통하여 천연실크에서 기능성 있는 아미노산을 분리, 추출하는 기술개발과 실크 아미노산 원료 및 제품개발을 하고, 실크 가수분해물이 지닌 항암 작용과 항유전독성에 대한 효과 등을 확인하여 뛰어난 생리기능적 특성을 가지고 있는 제품을 개발하고자 한다.

도 1은 누에고치 소재 단백가수분해법에 의한 실크아미노산과 실크펩타이드의 제조 공정도를 나타낸 것이다.

도 2는 Sephadex G-25 컬럼을 이용하여 겔 크로마토그래피로 분자량에 따라 분리한 것으로,

a) :Pepsin으로 가수분해한 시료에 대한 겔 크로마토그래피

b) :Trysin으로 가수분해한 시료에 대한 겔 크로마토그래피

c) :Alcalase로 가수분해한 시료에 대한 겔 크로마토그래피

d) :산으로 가수분해한 시료에 대한 겔 크로마토그래피 이다.

도 3은 HPLC를 이용한 실크 산 가수분해물의 아미노산 분석 결과이다

도 4는 실크 산 가수분해물이 NHF, HeLa, H1299, PA-1에 미치는 세포독성을 도표화 한 것으로

a): NHF

b): HeLa

c): H1299

d): PA-1 에 대하여 세포독성을 나타내었다.

도 5는 실크 산 가수분해물을 처리하였을 때 변하는 세포의 모양을 사진으로 나타낸 것으로

a) : 아무것도 처리하지 않은 NHF의 모습으로 b)의 대조군

b) : 실크 산 가수분해물을 처리한 NHF의 모습

c) : 아무것도 처리하지 않은 HeLa의 모습으로 d)의 대조군

d) : 실크 산 가수분해물을 처리한 HeLa의 모습

e) : 아무것도 처리하지 않은 H1299의 모습으로 f)의 대조군

f) : 실크 산 가수분해물을 처리한 H1299의 모습

g) : 아무것도 처리하지 않은 PA-1의 모습으로 h)의 대조군

h) : 실크 산 가수분해물을 처리한 PA-1의 모습이다.

도 6은 실크 산가수분해물의 DNA 손상 억제 효과를 도표화 한 것으로

negative : 무처리군

positive : 발암원 처리군

1mg/ml : 발암원 + 실크 산 가수분해물 1mg/ml

5mg/ml : 발암원 + 실크 산 가수분해물 5mg/ml

10mg/ml : 발암원 + 실크 산 가수분해물 10mg/ml 처리한 군에 대한 DNA 손상도 이다.

도 7은 발암원에 대한 실크 산 가수분해물의 DNA 손상억제 효과를 사진으로 나타낸 것으로

a) 무처리군

b) 발암원 + 실크 산 가수분해물 10mg/ml 처리

c) 발암원 + 실크 산 가수분해물 5mg/ml 처리

d) 발암원 + 실크 산 가수분해물 1mg/ml 처리

e) 발암원 처리군

의 모습을 comet assay를 통하여 실험한 후 사진으로 나타낸 것이다.

도 8은 실크 산 가수분해물이 sarcoma-180을 복강 내에 투여한 mouse의 생존기간에 미치는 영향에 대한 실험결과를 도표화한 것이다.

이러한 목적을 달성하기 위해, 먼저 산 가수분해법과 효소가수분해법에 의해 분해되어진 누에고치 가수분해물을 비교해 본 결과 산 가수분해법에 의한 가수분해물은 효소 가수분해법에 의한 가수분해물보다 더 작은 분자량의 아미노산과 펩타이드로 가수분해 되었고, 산 가수분해물의 생리활성 또한 효소 가수분해물보다 뛰어남을 보였다.

또한 그 산 가수분해법에 의해 얻어진 실크 아미노산 및 펩타이드가 항암, 항유전독성에 뛰어난 효과를 보이고 있음을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

<실시예 1>

Trypsin, pepsin, alcalase를 이용한 피브로인 단백질의 가수분해(효소가수분해)

피브로인 단백질을 여러 단백분해효소의 최적반응조건에 따라 분해시켰다.효소는 trypsin, pepsin과 세균유래 단백분해효소 등 대량으로 산업적인 이용이 가능한 것들을 사용하였다. Trypsin과 pepsin은 동물유래의 효소로서 각각 단백질을 분해하는 펩타이드 결합의 위치를 달리한다. 산업용 세균유래 효소로는 세계적인 효소생산회사인 Novo Nordisk사(Denmark)에서 생산해내는 대표적인 산업용 protease들로서 현재 국내 식품 산업, 사료 산업, 유가공 산업에서 가장 널리 이용되고 있는 효소 제품인를 이용하였다.

동결건조하여 얻은 피브로인 분말을 trypsin 및 Alcalase의 반응을 위해서는 40 mM 인산완충액(pH 7.5)에, pepsin의 반응을 위해서는 40 mM 초산완충액(pH 4.0 완충액)을 1N HCl을 이용하여 pH 2.0로 조정)에 10mg/ml의 농도가 되도록 용해시켰다. 피브로인 용액 50 ml에 각 효소를 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1%(w/v)의 농도로 첨가하고 각각 trypsin(Sigma)과 pepsin(Sigma)은 37℃, pH 7.5 및 pH 2.0, Alcalase는 55℃, pH 7.5의 조건으로 반응시키되 매 1시간마다 3 ml의 시료를 채취하여 100℃, 5분간의 가열처리로 반응을 정지시키면서 8시간까지 반응시켰다. 이로부터 얻어지는 가수분해물들에 대해 13,000 rpm, 15분동안 원심분리하여 상등액을 얻은 후 MWCO 10,000 및 5,000 짜리 centrifugal ultrafiltation kit (Vivaspin 20, Satorius, Germany)를 이용하여 한외여과시켰다. 한외여과막을 통과시킨후 얻은 여액은 각각 동결건조하여 펩타이드 분획별 분말시료로 제조하고 실험에 이용하였다.

<실시예 2>

피브로인 단백질의 산가수분해

한편 산가수분해는 피브로인 견사에 2N HCl 용액을 견사 중량의 80배 용량으로 첨가하여 100℃에서 4시간 동안 가열하면서 피브로인을 가수분해 하였다. 제조된 가수분해물은 진한 암갈색을 나타내었고, 여기에 2N NaOH를 첨가하며 중화시켜 pH 7.4가 되도록 하였다. 중화된 가수분해물에는 활성탄을 전체 용액 용량의 6%가 되도록 첨가하여, 60분 동안 교반함으로써 각종 비용해 물질 및 이취 등을 제거한 후 여과하여 투명한 액상의 가수분해물을 얻었다. 이 가수분해물 용액을 투석막을 사용하여 증류수로 1일 동안 투석하여 염을 제거하였다. 염이 제거된 가수분해물 용액을 동결건조하여 분말로 얻고 실험에 이용하였다.

<실시예 3>

산 및 효소적 가수분해물의 분자량 비교분석

산 및 효소적 가수분해물 시료를 10 mg/ml의 농도가 되도록 증류수에 용해시킨 후 Sephadex G-25 gel chromatography column (2×60cm)에 2 ml loading하여 3차 증류수로 elution시켜 펩타이드의 크기에 따른 분획을 분리하였다. 각 분획의 크기는 약 3 mL로 하고 각 분획의 280 nm에서의 UV 흡광도를 측정하여 chromatogram을 얻었다.

본 실험에서 Sephadex G-25로 시료를 분리할 경우, 분자량 5,000 이상, 5,000∼1,500 사이, 1,500 이하의 펩타이드 분획이 각각 fraction number 60∼100번, 100∼120번, 120번 이상에서 용출되는 것으로 추정되어진다.

도 2에 나타난 그 결과를 보면 fraction number 120번 이상의 피크의 면적은 산가수분해물의 면적이 가장 넓은 것을 보게되는데, 이는 pepsin, trypsin, alcalase에 의한 가수분해보다 산가수분해가 더 효과적으로 피브로인을 가수분해하고 하였음을 보여주는 것이다.

<실시예 4>

효소가수분해물과 산가수분해물의 항유전독성 비교

1) 동물세포주 및 배양

실험에 이용된 세포주는 mouse embryo 기원의 non-tumoral normal 3T3 세포(ATCC CCL. No.163)로서 생명공학연구소 유전자 은행으로부터 분양 받았다. 세포주의 배양 및 보존을 위해서 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco)에 heat-inactivated된 calf serum(Hyclon, U.S.A) 10%, penicillin G(Sigma) 100 unit/㎖, streptomycin sulfate(Sigma) 100 mg/㎖을 첨가하여 사용하였다. 3T3 세포주는 직경 10cm의 둥근 조직배양 접시(Falcon, U.S.A)에서 4 × 10⁵cell/plate의 농도로 37℃, 5% CO₂를 유지하는 습윤 배양기(Labline instruments, U.S.A)로 배양을 실시하며, 3일에 한번씩 계대를 실시하였다.

2) 가수분해물 시료와 발암원 처리

직접발암원인 MNNG를 100㎍/㎖의 농도로 HBSS(Hank's balanced salt solution, 10mM, pH 7.4) buffer에 용해시키고 마찬가지로 가수분해물 시료를 10mg/㎖의 농도로 HBSS buffer에 녹였다. 각각 다른 농도로 용해된 가수분해물 시료에 최종농도가 1㎍/㎖이 되도록 HBSS buffer에 용해된 MNNG 10㎕를 넣고 30분간 전배양(preincubation)을 실시하였다. 이때 음성대조구로서는 HBSS buffer를, 양성 대조구는 실험구와 동일하게 MNNG의 최종농도가 1㎍/㎖이 되도록 조절한 HBSSbuffer로 하였다. 전배양 후 각각의 sample들을 직경 3cm의 둥근 조직 배양 접시(Falcon, U.S.A)에서 1 × 10⁵cell/plate의 농도로 37℃, 5% CO₂를 유지하는 습윤 배양기(Labline instruments, U.S.A)로 배양된 3T3 cell 넣고 30분간 incubation을 실시하였다.

3) In vitro 항유전독성 측정

Comet assay의 측정순서는 DNA 손상유도물질(변이원)과 손상억제 추정물질의 세포처리, 세포의 도말(embedding), 세포 단백질 및 세포막의 용해, DNA의 unwinding, 전기영동 및 염색과 측정으로 이어진다.

PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)에 녹아 있는 0.5% normal melting point agarose(NMA, Sigma, U.S.A.) 용액을 전자 렌지로 데운 후, 항온 수조에서 60℃로 유지하였다. Fully frosted slide glass (ERIE Scientific, U.S.A.)의 서리가 형성되어 있는 면에 NMA 용액 35 ㎕를 깔아서 건조시킨 후, 다시 75 ㎕를 cover glass(24 × 50 mm, Superior, Germany)로 균일하게 깔고 얼음이 들어가 있는 평평한 stainless box위에 놓아 굳혔다. 이와 같이 만들어진 pre-coated agarose gel slide는 습기가 있는 slide 보관함에 넣어 실험 전까지 4℃로 보관하였다. 항유전독성 검사를 위하여 non-tumoral 3T3 세포는 매 세포 계대시에 직경 3 cm의 둥근조직배양접시에 3 x 10⁴cell/plate로 분주하여 72시간 동안 배양하였다. 4일이 경과한 후, Ca²⁺과 Mg²⁺가 없는 PBS로 두 번 세척하고, 변이원과 펩타이드시료의 혼합액으로 교환한 다음, 진탕 항온기에서 25 rpm의 속도로 37℃에서 30 분간 배양시켰다. 배양이 끝남과 동시에 즉시 PBS 완충용액으로 철저히 3 번 세척하고, 100 ㎕의 Proteinase K (0.12㎍/㎖ in PBS buffer, Sigma, U.S.A.) 용액으로 처리하여 세포들을 조직 배양 접시로부터 완전히 떨어뜨린 후, 세포 배양액 1 ㎖을 가하여 세포들을 현탁시켜 eppendorf tube로 옮긴다. 세포 현탁액을 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액은 버린 뒤, 300㎕의 Complete media을 넣어 재현탁시켰다. 이중 30 ㎕의 세포현탁액을 다시 원심 분리하여 eppendorf tube 밑에 남은 세포 pellet을 실험에 이용하였다. 한편 본 실험에 사용된 처리구들의 3T3 세포 생존율은 slide glass에 세포를 embeding하기 전, Trypan blue exclusion test에 의해서 95% 이상이 됨을 확인하였다.

원심 분리에 의하여 남겨진 처리구별 3T3 세포 pellet은 항온 수조에서 45℃로 유지되던 0.75% low melting point agarose(LMA, in PBS buffer, Sigma, U.S.A.) 용액 75 ㎕에 현탁시키고 신속하게 앞서 제조한 pre-coated agarose gel slide 위로 micro-pipet으로 옮긴 후, coverslip을 사용하여 그 세포 현탁액이 골고루 분산되게 덮은 뒤, 얼음이 차있는 평평한 stainless box위에 놓아 굳혔다. 5분 후, coverslip을 제거하고 3T3 세포가 깔린 slide gel 위에 다시 0.75% LMA 용액 75 ㎕를 깔은 후, coverslip을 덮고, 즉시 stainless box 위에 놓아 다시 10분간 굳혔다. 다음 coverslip을 벗겨내고 냉장 보관 중인 alkali lysis buffer에 1시간 동안 담그어 핵체만 제외하고 세포내 모든 성분을 용해시켰다.

1시간 동안 lysis 용액에 담근 모든 slide들은 수평상 전기 영동판 위에 각각의 slide를 서로 밀착되게 깔고, 전기 영동용 완충 용액으로 slide 표면 위 0.7 cm까지 가득 채운 후, DNA의 unwinding과 alkali labile sites(apurine과 apyrimidine lesion, 예를 들면 DNA oxidized base 그리고 alkylated bases)의 표출을 위해 20분간 평형 시간을 주었다. 전기 영동은 25 V / 300 mA로 고정하여 20분간 실시하였다. 전기 영동 후, 각각의 slide들은 neutralization 완충용액으로 충분히 세척하고 처리구별 3T3 세포의 DNA 손상 정도를 살펴보기 위하여 형광 염색 시약 YOYO-1 (10 ㎍/㎖, Molecular Probes, U.S.A.) 80 ㎕로 염색하였다.

염색된 slide는 200W mercury lamp(Osram, Germany)가 부착된 형광 현미경 (CSB-FEI, China)에서 배율 250배로 관찰하며, CCD camera (COHU, U.S.A.)를 통해서 보내진 각각의 세포핵의 image는 Comet image analyzing system (Perceptive instrument, U.K.)이 설치된 컴퓨터에서 분석하였다. 각각의 세포핵에서 변이원에 의한 DNA 손상 및 펩타이드에 의한 손상억제 정도는 slide당 101개의 세포핵에 대하여 형성된 comet image의 말단 길이(tail length) 및 말단 모멘트(tail moment)등을 측정하고 통계처리하여 그 평균 및 표준편차의 값으로 정량화하였다.

표 1에 효소가수분해법에 의한 가수분해물과 산가수분해법에 의한 가수분해물 각각에 대하여 항유전독성 실험한 결과 수치가 나타나 있다. 표 1을 보면 가수분해 정도와 발암물질에 대한 DNA 손상도 극복력에 상관관계가 있는 것을 볼 수 있는데, 가수분해가 더 잘 이루어진 alcalase에 의한 가수분해물로 처리한 시료군은 pepsin에 의한 가수분해물을 처리한 시료군보다 더 나은 DNA 손상 극복력을 보였으며, 산가수분해물을 처리한 시료군은 그보다도 더 좋은 DNA 손상 극복력을보였다.(도2 참조)

<표1>

이러한 결과로 누에고치를 가수분해 할 때 산가수분해에 의한 분해법이 효소분해법보다 더 효과적으로 실크 펩타이드 및 아미노산을 생산해 낼 수 있으며 따라서 산가수분해법에 의한 가수분해물이 더욱 뛰어난 생리적 활성을 지니고 있음을 알 수 있었다.

<실시예 5>

제조공정

1) 제 1 공정 (정련/세척)

양질의 누에고치를 절각하여 번데기를 제거한 후 3등분하였다. NaHCO₃5% 용액에 물을 10배수하여 100℃에서 2시간 삶은 다음 정제수를 살수하여 세척하고 탈수하는 작업을 3∼4회 반복하였다. 1차 정련이 끝나면 2차로 NaHCO₃1% 용액에 10배수로 100℃에서 1시간 삶았다. 다시 3∼4회 세척탈수한 후 건조기를 이용해서 건조시켰다.

2) 제 2 공정 (가수분해)

건조된 원료를 1.5N HCl 용액에 10배수 비율로 투입하여 110℃에서 48시간 동안 무압력으로 용해시켰다.

3) 제 3 공정 (중 화)

용해가 끝난 원료를 24시간 동안 숙성시킨 후 냉각시켰다. 이때 원료의 색은 검은색이다. 냉각된 원료 용액을 NaOH를 투입하여 중성인 pH 7로 조정하였다. 이때 약 15%정도의 염이 발생되었다.

4) 제 4 공정 (탈색/탈취)

검은색의 원료 용액을 활성탄을 이용하여 탈색/탈취하였다.

5) 제 5 공정 (여 과)

탈색/탈취가 끝난 용액을 여과기를 이용해 여과하였다.

6) 제 6 공정 (탈 염)

여과 후 원료 용액을 탈염기를 이용하여 염을 제거하였다.

7) 제 7 공정 (농 축)

염을 제거한 원료 용액을 농축기를 이용하여 감압 농축하였다.

8) 제 8 공정 (건 조)

농축된 원료를 동결건조와 스프레이드라이 방식을 이용하여 건조하였다. 동결건조시에는 스프레이드라이의 분말형태로 분쇄하였다.

9) 제 9 공정 (제품화)

건조된 파우더를 스틱 또는 병으로 포장하여 제품화하였다.

실크 산 가수분해물의 공정도는 도 1에 제시되어 있다. 이제까지의 기술들과는 달리 본 발명은 견단백질이 가지고 있는 섬유상의 구조적인 특징 및 아미노산의 배열 등의 특성을 고려, 문제점을 개선하여 주요한 8가지 공정을 기본으로 하였다. 인체에 흡수되기 좋은 형태의 작은 분자량의 아미노산과 펩타이드 비율로 가수분해 되고, 생리활성 또한 효소 가수분해물보다 뛰어난 산가수분해방법을 이용하여 정련, 세척, 가수분해, 중화, 탈색/탈취, 여과, 탈염, 농축/건조의 8가지 공정으로 하여 제조하였다.

<실시예 6>

성분 분석

1) 일반성분 분석 : AOAC 방법에 의하여 측정하였다.

실크 산 가수분해물의 일반성분 분석 결과는 표2에 제시되었다. 단백질이 93.8%로 거의 대부분을 차지하고, 지질이 0.2%로 거의 지질성분이 없고 콜레스테롤은 전혀 없는 것으로 나타났다. 그리고 탄수화물이 0.1% 정도 였으며, 소량의 나트륨, Vit C, 칼슘, 철분이 함유되어 있었다. 결과적으로 실크산 가수분해물은 대부분이 단백질로만 이루어져 있는 것을 확인할 수 있었다.

<표2>

2) 아미노산 및 펩타이드의 분자량별 구성비 실험(한외여과법)

제품을 100 mg/ml의 농도로 3차 증류수에 용해시킨 용액 25 ml를 제조하여 Amicon YM-10 한외여과막(Molecular Weight Cut-Off, MWCO, 1,000) 및 Amicon YC-05 한외여과막(MWCO 500)을 순서대로 통과시켜 각각 분자량 범위가 1,000 이상인 여액, 500∼1,000 사이의 여액, 500 이하의 여액을 얻었다. 각각의 여액을 동결건조하여 무게를 측정하였다.

- Ultrafiltration 조건

1) Ultrafiltration apparatus; Amicon 제품

2) Filtration through YM-10 membrane; 압력: 45 1b_f/in², stirring : 4.5,소요시간 : 2시간 15분

3) Filtration through YCO5 membrane; 압력: 50 lb_f/in², stirring : 4.5, 소요시간 : 2시간

실크 산 가수분해물의 아미노산 및 펩타이드의 분자량별 구성비 분석결과는 표3에 제시되어 있다.

<표3>

막 분리(membrane separation) 방법에 의해 제품 중의 아미노산 성분만을 분리해낼 수는 없으며 막 분리방법에 있어서 최저 한계 MWCO인 500을 기준으로 하였다. 따라서 아미노산의 평균 분자량이 150 임을 감안하면 500 이하의 분자량 범위 내에는 free amino acid 뿐만 아니라 amino acid 2∼3개가 결합된 dipeptides 및 tripeptides가 포함되어 있게 된다. 위의 실험결과로부터 추정해 볼 때 분자량 500 이하의 분획 중에는 대부분이 free amino acids 일 것으로 판단된다. 제품 중의 아미노산 성분의 함량은 약 60%이며, 펩타이드 성분이 약 40% 정도 함유되어 있는 것으로 이는 인체에 흡수하기 가장 좋은 비율이었다.

3) 아미노산 분석

실크 산 가수분해물 10g을 정확히 달아 200mM borate buffer로 100ml mass flaske에 정용하고 교반하면서 완전히 용해시켜 주었다. 0.2㎛ syringe filter로 여과하여 분석시료로 사용하였다. OPA(o-phthaldehyde)를 200mM borate buffer로 유도체화하여 HPLC(glison305 system), Column(Merck C18), fluorescence detector(Exitation wavelength 230nm, Emission wavelength 440nm)를 사용하여 하였으며, Runnig time 40분, temperature 40℃, flow 0.9ml/min으로 분석하였다. 실크 10% 용액 OPA를 혼합한 후 1분간 발색시키고 20㎕ 주입시켰다. 실크 산 가수분해물의 아미노산 분석 결과는 표4에 제시되어 있다. <도3 참조>

<표4>

아미노산 성분 결과 실크 산 가수분해물은 18가지 종의 아미노산으로 구성되어 있으며, 그 중에서 아미노산 분석 결과 혈중 콜레스테롤 저하, 간기능 강화, 알코올 대사 촉진의 기능을 가지는 alanine이 25%, 혈중 콜레스테롤 저하, 혈당 저하의 기능을 가지는 glycine이 22%, 인슐린 생산촉진, 간기능 강화의 기능을 가지는 serine이 15% 정도로 인체에 유효한 영향을 줄 수 있는 생리기능적 성분이 약 60% 이상 함유되어 있었다. 그리고 기타 신체영양에 좋은 천연 아미노산인 proline과 숙취해소, 간장보호, 고혈압 강하에 좋은 aspartic acid 등의 아미노산이 소량 함유되어 있었다.

<실시예 7>

세포독성 실험 및 세포모양 관찰

실크 산 가수분해물이 암세포와 정상세포에 미치는 영향에 대해서 두가지 방법으로 접근하였다. 하나는 실크 산 가수분해물을 처리한 뒤 MTT assay를 통하여 각각의 세포주에 미치는 세포독성을 측정하였으며 또 하나는 실크 산 가수분해물을 처리한 뒤 세포의 모양을 육안으로 관찰한 것이였다.

1) MTT assay

Human 정상 세포주인 NHF(Normal Human Fibroblase)와 자궁경부암유래 세포주인 HeLa, 폐암 유래 세포주인 H1299, 난소암 유래 세포주인 PA-1는 모두 10 % Fetal bovine serum이 포함된 DMEM(Gibco BRL)에서 키웠다. 96 well plate에 cell을 2-3X10³/well로 깔아준 뒤 다음 날 각 well의 최종 농도가 0, 1, 5, 10 mg/ml(PBS에 녹임)이 되도록 실크 산 가수분해물을 처리해주었다. 그 후 1일, 3일, 5일 뒤에 MTT 용액(5mg/ml) 50㎕으로 바꾸어준 뒤 4시간동안 반응시킨 후 MTT용액을 제거하고 DMSO 50㎕를 넣어준 뒤 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과는 도4에 도표화 되어져 있다.

실크 산 가수분해물이 미치는 세포독성 정도는 실크 산 가수분해물을 10mg/ml로 처리한 시료군에서 두드러지게 나타나는데, 정상 세포주인 NHF는 57% 정도의 생존률을 보인 반면 암세포주들인 HeLa 세포는 18%, H1299 세포는 28%, PA-1세포는 16%로 낮은 생존률을 보였고, 이것으로 실크 산 가수분해물은 암세포에 특이적으로 세포독성을 보이는 것으로 나타났다.

2) 세포모양관찰

정상 세포주인 NHF, 암세포주인 HeLa, H2299, PA-1을 60 mm dish에 1-2 X 10⁵/dish로 세포들을 깔아준 뒤 다음 날 실크 산 가수분해물의 농도의 최종 농도가 10 mg/ml(PBS에 녹임)이 되도록 처리해주었다. 그 후 4일동안 배양시킨 후 위상차 현미경으로 관찰되어지는 cell의 morphology를 디지털 카메라를 통해 찍었다.

도 5에 나타나 있는 것과 같이 세포의 모습은 실크 산가수분해물을 처리하였을 때 정상 세포인 NHF는 세포수에 있어서 산가수분해물을 처리하지 않은 대조군과 심한 차이가 없는 반면 HeLa, H1299, PA-1의 경우는 모두 대조군과 현격한 차이를 보이고 있음을 보았다. 이것으로 실큰 산 가수분해 물은 암세포에 보다 효과적으로 독성을 나타내는 물질임을 볼 수 있었다.

<실시예 8>

항유전독성 효과 관찰(comet assay)

실시 예 4에서 사용하였던 방법과 동일한 방법으로 실크 산 가수분해물에 대해서 농도에 따라 항유전독성 효과를 관찰하였다.

mouse embryo 기원의 non-tumoral normal 3T3 cell은 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 키웠다. 1X10⁵cell/dish로 농도로 cell이 깔려있는 30mm dish에 MNNG(1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine, 1mg/ml)와 실크 산가수분해물(10mg/ml,5mg/ml, 2mg/ml, 1mg/ml)이 포함된 HBSS(Hank s balanced salt solution, 10mM, pH 7.4) buffer를 넣어주고 30분간 배양했다.

100㎕ Protease K(0.12 ㎍/ml in PBS)로 세포를 dish에서 떼어낸 후 30 ㎕ complete media로 현탁시켰다. 그 세포들을 0.5% pre-coated slide glass위에 0.75% low melting point agarose와 함께 깔아주었다. 그 후 alkali lysis buffer로 1시간 정도 세포내 모든 성분을 용해 시킨 후 25V/300mA에서 20분간 전기영동한 후 YOYO-1(10㎍/ml, Molecular Probes, U.S.A) 80 ㎕로 염색한 후 200W mercury lamp(Osram, Germany)가 부착된 형광 현미경(CSB-FEI, China)으로 관찰하였다.

그 결과 표 4와 도 6, 7에서 보이는 것처럼, 실크 산 가수분해물의 양을 증가시키면 증가시킬수록 발암물질에 의해 받게 되어지는 DNA 손상도 정도가 점점 감소함을 볼 수 있었으며 실크 산 가수분해물을 10 mg/ml을 처리한 시료균에서는 거의 음성대조군의 수준까지 DNA 손상을 억제시키는 것을 관찰하였으며, 이로서 실크 산 가수분해물이 항유전독성에 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

<표 4>

<실시예 9>

동물수명연장실험

또 다른 방법으로 항암효과를 측정하기 위하여 동물수명연장실험을 시행하였다.

ICR계 생쥐 4주령(20-25g), 수컷을 (주) 대한바이오링크에서 구입하여 1주일간 적응시켰으며 실험기간 중 사료와 급수는 제한하지 않았다. 일주일 간격으로 계대배양한 sarcoma-180 종양세포 부유액 0.1ml(1X10⁷cell/ml)씩을 생쥐의 복강 내에 투여하였다. 실크 가수분해물 경구투여군과 복강주사군으로 나눈 후 실크 가수분해물 농도별로 다시 분류하여 각 군을 10마리로 하였다. 실크 가수분해물은 멸균생리식염수에 녹여 0.2g, 0.4g, 1g, 2g/Kg B.W. 용량으로 종양이식 24시간 후부터 1일 1회 투여하여 생존여부를 30일까지 관찰하면서 평균생존일(mean survival time. MST)을 계산하여 수명연장백분율(prolongation ratio, %)을 구하였다.

실험결과는 도 8에 나타나 있으며, 실크 산 가수분해물이 sarcoma-180을 복강 내에 투여한 mouse의 생존기간에 미치는 영향에 대한 실험결과 복강주사군의 0.4g/Kg B.W. 이상의 농도에서 생존기간이 연장되는 효과가 나타났으며 2g/Kg B.W. 농도 투여군에서 생존율이 가장 높았다. 이것으로 종양을 이식하여 암을 유발시킨 mouse에서 수명 연장 효과가 있음을 볼 수 있었다.

상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명에서는 누에고치를 가수분해 하는 방법으로 효소분해법과 산가수분해법을 사용하여 산가수분해법의 우월성을 보였고, 또한 그러한 실크 산 가수분해물은 항암, 항유전독성을 나타냈다. 산가수분해법을 이용한 누에고치의 가수분해는 효소분해법에 비해 비용절감이 될 뿐 아니라 인체 흡수율이 높은 질 좋은 실크 아미노산 및 실크 펩타이드를 생산하므로 공업적으로 그 활용가치가 높다. 더구나 이러한 실크 산 가수 분해물이 생체에서 항암 및 항유전독성 등의 생리적 활성을 보이고 있어서, 실크를 이용한 천연물 소재 항암물질 개발 등의 활용 가치를 포함하고 있다. 또한 본 발명은 성인병 예방 및 치료 등에 접근할 수 있는 가능성을 제시하였으며 이를 이용한 기능성 식품 및 치료제의 탄생을 기대할 수 있다.

Claims

1. 누에고치의 염산가수분해법을 이용한 식 ·음료용 소재인 실크아미노산, 실크펩타이드 제조방법

2. 상기 1항의 제조방법을 이용하여 체내 흡수율이 높고 생리기능적활성을 가지는 실크아미노산 및 실크펩타이드의 기능성 식품 소재 개발 방법