KR101960592B1

KR101960592B1 - Jak1 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 또는 노화 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101960592B1
Application number: KR1020170029932A
Authority: KR
Inventors: 김승후; 김상윤; 이향주
Original assignee: 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2016-03-09
Filing date: 2017-03-09
Publication date: 2019-03-21
Also published as: KR20170105436A; EP3461887A4; WO2017155325A1; US20190183900A1; CN109072190A; EP3461887A1

Abstract

본 발명은 JAK1 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 및 노화 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 JAK1 억제제가 처리된 줄기세포 또는 JAK1가 녹아웃된 줄기세포는 노화가 감소되고, 줄기세포의 생존율이 증대되는 활성이 있어 줄기세포의 증식, 분화 촉진 및 노화 억제용 조성물로 사용할 수 있는 효과가 있다. 또한, JAK1가 넉 아웃된 줄기세포에는 면역원성 관련 단백질인 HLA-A 또는 HLA-B의 발현을 억제 또는 감소시키고, T 세포 활성을 억제하는 단백질인 TGF-b 또는 HGF의 발현을 촉진 또는 증가시키는 활성이 있어 면역질환의 예방 또는 치료에도 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

JAK1 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 또는 노화 억제용 조성물{Composition for promoting proliferation, differentiation or anti-aging of stem cell using Janus kinase 1 inhibitor}

본 발명은 JAK1 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 및 노화 억제용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포(stem cells)는 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래하는 다분화성의 성질을 갖는 줄기 세포이다. 예를 들어, 골수(bonemarrow)로부터 유래된 중간엽 줄기세포는 지방조직, 뼈/연골 조직, 근육조직으로 분화될 수 있는 다분화성에 의해 세포치료제로서의 개발을 위해 다양한 연구가 진행되고 있다. 한편, 중간엽 줄기세포는, 다른 인체 초대배양 세포와 유사하게, 체외(in vitro) 배양시 텔로미어 소실(telomere shortening)과 무관한 노화(senescence) 기전에 의해 세포의 분열이 급격히 감소하는 것으로 알려져 있다(Shibata, K.R. et al.Stem cells, 25; 2371-2382, 2007).

이러한 노화 현상은, 그 기전이 아직 명확히 밝혀진 것은 아니나, 장기간의 체외 배양에 의한 환경적 스트레스의 축적으로 Cdk 저해 단백질인 p16(INK4a)가 발현되고 축적되어, 세포의 성장을 담당하는 Cdk 단백질의 활성이 억제되는 현상이 주요 원인으로 지적되고 있다. 중간엽 줄기세포에서는 Bmi-1이라는 종양유전자를 발현시켜 p16의 발현을 저해하였을 때, 세포의 노화가 억제되는 것이 확인되었으며(Zhang, X. et al. Biochemical and biophysical research communications 351; 853-859, 2006), 또한 배양 중에 FGF-2를 처리하여 p21(Cip1), p53, 및 p16(INK4a)의 mRNA 발현을 억제되었을 때, G1 시기의 성장 정지된 중간엽 줄기 세포가 성장 정지 억제되는 것이 보고된 바 있다(Ito, T. et al., Biochemical and biophysical research communications, 359;108-114 2007). 또한 대한민국공개특허 제 10-2009-0108141호에서는 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자를 중간엽 줄기세포에 형질전환시켜, 중간엽 줄기세포의 노화를 억제시키는 방법을 제시하였다.

그러나, Bmi-1 자체가 종양을 야기할 수 있는 종양 유전자(oncogene)이기 때문에(Haupt, Y. et al., Oncogene, 8; 3161-3164, 1993; Bruggeman, S.W. et al. Cancer cell 12; 328-341 2007), Bmi-1와 hTERT(telemorase catalytic subunit)로 처리된 중간엽 줄기세포를 세포치료제로 적용할 경우, 종양 형성의 가능성을 배제할 수 없다. 또한, 배양 중에 FGF-2를 처리하는 방법은 상대적으로 고가인 FGF-2를 배양시 지속적으로 사용하여야 하므로 비용이 상승할 뿐만 아니라, FGF-2로 인해 노화가 억제되기보다는 일시적인 세포성장 증대의 효과가 기대되므로, 노화를 억제하는 데에 한계가 있다.

또한, 종래에 다양한 성체줄기세포 치료제를 질환을 치료하려는 시도가 있었지만, 염증성 줄기세포의 노화로 인하여, 이식 후 줄기세포 생존율에 문제가 있어 줄기세포 치료효과를 확보하기 어려운 한계가 있었다.

상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 줄기세포의 증식, 분화 촉진 및 노화를 억제하여 보다 치료 효과를 증진시킬 수 있는 줄기세포를 이용한 세포치료제를 개발하던 중, JAK1의 발현 또는 활성을 억제시킨 줄기세포가 면역질환을 위한 우수한 세포치료제로 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

한국등록특허 제1299658호 한국공개특허 제2015-0132508호

그러므로 본 발명의 목적은 줄기세포의 증식, 분화 촉진 및 노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1)의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 JAK1(Janus kinase 1)을 제거(knock-out)시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 노화를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 세포이식을 위한 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 JAK1(Janus kinase 1)을 제거(knock-out)시키는 단계를 포함하는 세포치료용 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 JAK1 억제제가 처리되어 JAK1의 발현 또는 활성이 억제된 줄기세포 또는 JAK1이 제거된 줄기세포를 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 다른 목적은 JAK1(Janus kinase 1)의 발현 또는 활성이 억제된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 JAK1 억제제 및 줄기세포를 포함하는 면역질환 치료용 키트 또는 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 JAK1 억제제 및 줄기세포를 개체에 투여하여 면역질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 또는 노화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 JAK1 억제제는 토파시티닙(tofacitinib), 바리시티닙(baricitinib), 룩소리티닙(ruxolitinib) 및 필고티닙(Filgotinib)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 JAK1 억제제는 면역원성 관련 단백질인 HLA-A 또는 HLA-B의 발현을 억제 또는 감소시키고, T 세포 활성을 억제하는 단백질인 TGF-b 또는 HGF의 발현을 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 JAK1 억제제는 줄기세포의 노화를 감소시키고, 줄기세포의 생존율을 증진시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1)의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 JAK1(Janus kinase 1)의 발현 또는 활성을 억제시키는 것은 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 줄기세포 내의 JAK1(Janus kinase 1) 유전자를 넉아웃(knock-out)시키는 방법을 수행하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 JAK1(Janus kinase 1)을 제거(knock-out)시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 노화를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 JAK1 억제제는 토파시티닙(tofacitinib), 바리시티닙(baricitinib), 룩소리티닙(ruxolitinib) 및 필고티닙(Filgotinib) 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서, JAK1을 제거하는 방법은 CRISPR-Cas9 유전자 가위 시스템을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 세포이식을 위한 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 JAK1(Janus kinase 1)을 제거(knock-out)시켜 하기 특징을 갖는 세포치료용 줄기세포의 제조방법을 제공한다:

(a) 줄기세포의 염증성 세포노화 감소;

(b) 줄기세포의 세포생존율 감소 억제;

(c) 줄기세포의 세포증식 증가;

(d) 줄기세포의 줄기세포성(stemness) 증가;

(e) 줄기세포의 면역원성 감소 및

(f) 줄기세포의 면역조절능 증가.

나아가 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 류마티스 관절염, 루프스병, 베체트병 및 쇼그렌병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 JAK1 억제제 및 줄기세포를 포함하는 면역질환 치료용 키트 또는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 JAK1 억제제 및 줄기세포를 개체에 투여하여 면역질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 JAK1 억제제가 처리된 줄기세포 또는 JAK1가 녹아웃된 줄기세포는 노화가 감소되고, 줄기세포의 생존율이 증대되는 활성이 있어 줄기세포의 증식, 분화 촉진 및 노화 억제용 조성물로 사용할 수 있는 효과가 있다. 또한, JAK1가 녹아웃된 줄기세포에는 면역원성 관련 단백질인 HLA-A 또는 HLA-B의 발현을 억제 또는 감소시키고, T 세포 활성을 억제하는 단백질인 TGF-b 또는 HGF의 발현을 촉진 또는 증가시키는 활성이 있어 면역질환의 예방 또는 치료에도 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 JAK1 억제제인 토파시티닙 처리에 의한 줄기세포의 염증성 노화 저항성을 확인한 결과이다.
도 2는 JAK1 억제제인 룩소리티닙 또는 필고티닙(Filgotinib) 처리에 의한 줄기세포의 염증성 노화 저항성을 확인한 결과이다.
도 3은 JAK1 녹아웃 줄기세포에서 염증성 노화 저항성을 확인한 결과이다.

본 발명은 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 또는 노화 억제용 조성물을 제공한다.

JAK1(Janus kinase 1) 유전자는 서열번호 1로 기재되는 핵산 서열을 가지고, 상기 JAK1 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, JAK1(Janus kinase 1) 억제제는 JAK1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, sgRNA(single guide), shRNA(small hairpin RNA), siRNA(small interfering RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 sgRNA를 이용하여 JAK1 유전자의 발현을 억제시킨 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 JAK1을 제거(knock-out)하거나, JAK1 억제제를 처리한 줄기세포에서 줄기세포의 증식, 분화를 촉진할 뿐 아니라 노화를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다는 점에 기술적 특징이 있다.

이를 보다 구체적으로 설명하면, JAK1 억제제인 토파시티닙 처리 또는 JAK1의 녹아웃에 따른 줄기세포 노화 감소 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 대표적 세포노화 측정 기법인 SA-b-gal 염색을 이용하여 확인한 결과, 줄기세포에서 poly IC에 의해 유도된 염증성 세포노화가 토파시티닙 처리 또는 JAK1의 녹아웃에 의하여 확연히 감소하였음을 알 수 있었다(도 1A 및 3A 참조).

본 발명의 일실시예에 따르면, JAK1 억제제인 토파시티닙 처리 또는 JAK1의 녹아웃에 따른 이식 후 줄기세포의 생존율 감소 억제 효과를 확인하기 위하여 BrdU assay를 이용하여 관찰한 결과, 줄기세포에서 poly IC로 유도된 세포노화에 의한 세포생존율이 토파시티닙 처리 또는 JAK1의 녹아웃에 의하여 덜 감소되었음을 확인할 수 있었다(도 1B 및 3B 참조).

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, JAK1 억제제인 토파시티닙, 룩소리티닙, 필고티닙 처리 또는 JAK1의 녹아웃에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 웨스턴블롯팅을 이용하여 확인한 결과, 염증성노화에 따라 TLR3 signaling 관련 TLR3, IL6의 증가와 함께 노화(PCNA), 줄기세포성(EZH2, BMI-1), 증식(survivin, CyclinD1) 관련 단백질 발현 감소가 토파시티닙, 룩소리티닙, 필고티닙 처리, JAK1의 녹아웃에 의하여 덜 감소됨을 확인할 수 있었다(도 1C, 도 2 및 3C 참조).

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, JAK1 억제제인 토파시티닙 처리 또는 JAK1의 녹아웃에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 Real time PCR을 이용하여 확인한 결과, 염증성노화에 따라 TLR3 signaling 관련 TLR3, IL6의 증가와 함께 노화(PCNA), 줄기세포성(EZH2, BMI-1), 증식(survivin, CyclinD1) 관련 단백질 및 mRNA 발현 감소가 토파시티닙 전처리 또는 JAK1의 녹아웃 에 의하여 덜 감소됨을 확인할 수 있었다(도 1D 참조).

따라서, 본 발명은 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 또는 노화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 ‘줄기세포’는 다분화성의 성질을 갖는 한 제한되지 않으며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어, 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등으로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는 상기 줄기세포는 인간의 골수, 태반 또는 제대혈로부터 유래된 중간엽줄기세포일 수 있다.

또한, 본 발명의 JAK1(Janus kinase 1) 억제제는 토파시티닙(tofacitinib), 바리시티닙(baricitinib), 룩소리티닙(ruxolitinib) 및 필고티닙으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 가장 바람직하게는 토파시티닙, 룩소리티닙, 필고티닙을 사용할 수 있다.

본 명세서에서 “줄기세포의 노화”라 함은 중간엽 줄기 세포가 내부 혹은 외부로부터 받는 다양한 스트레스(예를 들어 연속되는 계대 배양 및 체외 배양시의 고농도의 산소 조건 등)에 대항하여, 세포 성장(cell growth)이 정지되거나 유의성 있게 늦어지는 현상을 의미하며, 중간엽 줄기세포의 텔로미어 소실(telomere shortening)과는 무관한 세포 성장 정지 혹은 지연을 포함한다.

상기 본 발명에 따른 줄기세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 방법은 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 JAK1(Janus kinase 1)을 제거(knock-out)시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 노화를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 JAK1(Janus kinase 1)을 제거(knock-out)시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 노화를 억제하는 방법을 제공한다.

상기 본 발명에 따른 줄기세포의 노화를 억제하는 방법은 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 JAK1(Janus kinase 1)을 제거(knock-out)시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 노화를 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 세포이식을 위한 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 JAK1(Janus kinase 1)을 제거(knock-out)시켜 하기 특징을 갖는 세포치료용 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

(a) 줄기세포의 염증성 세포노화 감소;

(b) 줄기세포의 세포생존율 감소 억제;

(c) 줄기세포의 세포증식 증가;

(d) 줄기세포의 줄기세포성(stemness) 증가;

(e) 줄기세포의 면역원성 감소 및

(f) 줄기세포의 면역조절능 증가.

또한, 본 발명에서는 JAK1 억제제인 토파시티닙 처리 또는 JAK1의 녹아웃이 된 줄기세포에서 면역원성 관련 단백질인 HLA-A, HLA-B 발현 정도를 확인하기 위하여 FACS 분석과 Real time PCR 수행하여 확인한 결과, 면역원성 관련 단백질인 HLA-A, HLA-B가 poly IC 처리에 따라 증가하며 이러한 증가는 토파시티닙 전처리 또는 JAK1의 녹아웃에 의하여 덜 증가함을 확인할 수 있었다(도 1E 및 3E 참조).

본 발명의 다른 일실시예에서는, JAK1 억제제인 토파시티닙 처리 또는 JAK1이 녹아웃이된 줄기세포에서 T 세포 활성을 억제하는 단백질인 TGF-b, HGF 발현 정도를 확인하기 위하여 Real time PCR 수행하여 확인한 결과, T 세포 활성을 억제하는 단백질인 TGF-b, HGF가 poly IC에 처리에 따라 감소하며 이러한 감소는 토파시티닙 전처리 또는 JAK1의 녹아웃에 의하여 덜 감소함을 확인할 수 있었다(도 1E 및 3E 참조).

따라서, 상기의 결과로 JAK1이 녹아웃된 줄기세포에서는 줄기세포의 면역원성을 감소시키고, 면역조절능을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다.

그러므로, 본 발명의 JAK1(Janus kinase 1) 억제제가 처리되거나, 제거된(knock-out) 줄기세포는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 JAK1 억제제 및 줄기세포를 질환을 가진 개체에 병용투여할 수 있으며, 상기 줄기세포는 JAK1 억제제가 전처리되지 않거나, JAK1이 제거되지 않은 줄기세포일 수 있다.

따라서, 본 발명은 JAK1 억제제 및 줄기세포를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 키트 또는 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 ‘면역질환’으로는 이에 제한되지는 않지만, 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 류마티스관절염, 루프스병, 베체트병 및 쇼그렌병으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다.

용어 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조성물에는 1×10⁴ cell/kg 내지 1×10⁸ cell/kg의 세포치료제가 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 면역질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료용 의약품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 투여하는 것을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 또한, 세포치료제로 JAK1 억제제가 처리된 줄기세포 또는 JAK1이 제거된 줄기세포 단독으로 사용할 수 있으며, 줄기세포를 JAK1 억제제와 함께 병용투여할 수 있다.

여기에서 사용된 용어 '포유동물'은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 세포치료제 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 조성물에 포함되는 세포치료제는 1×10⁴ cell/kg 내지 1×10⁸ cell/kg의 양을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

JAK1 억제제인 토파시티닙 처리에 따른 염증성 노화에 대한 저항성 확인

<1-1> 토파시티닙 처리에 따른 줄기세포 노화 감소 확인

본 발명자들은 토파시티닙 처리에 따른 줄기세포 노화 감소 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 대표적 세포노화 측정 기법인 SA-b-gal 염색을 이용하여 확인하였다.

이를 보다 구체적으로 설명하면, 줄기세포를 6 웰에 (2 X 10⁴cell/well)로 플레이팅(plating) 한 후 1일 후에 poly IC (1ug/ml)를 처리하였다. 토파시티닙(1ug/ml)은 poly IC 처리 2시간 전에 전처리하였다. poly IC 처리 2일 후에 senescence cells histochemical staining kit (CS0030, Sigma)을 이용하여 노화정도를 측정하였다. 이를 위해 먼저 PBS로 2회 세척 후 고정버퍼(fixation buffer; 2% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 7.04 mM Na₂HPO₄, 1.47 mM KH₂PO₄, 0.137 M NaCl, and 2.68 mM KCl)로 6분 고정 후 staining buffer (6 mM Potassium Ferricyanide, 6 mM Potassium Ferrocyanid, 1 mg/ml X-gal Solution in phosphate buffer (pH6))로 37℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 현미경 관찰을 통하여 b-galactoxidase-positive cell수를 측정하여 세포노화 정도를 그래프로 나타내었다.

그 결과, 도 1A에 나타난바와 같이 줄기세포에서 poly IC에 의해 유도된 염증성 세포노화가 토파시티닙 전처리에 의하여 확연히 감소하였음을 알 수 있었다.

<1-2> 토파시티닙 처리에 따른 이식 후 줄기세포의 생존율 감소 억제 확인

본 발명자들은 토파시티닙 처리에 따른 이식 후 줄기세포의 생존율 감소 억제 효과를 확인하기 위하여 BrdU assay를 이용하여 관찰하였다.

이를 보다 구체적으로 설명하면, 세포를 96 웰에 (1 X 10³cell/well)로 플레이팅(plating) 한 후 1일 후에 poly IC (1ug/ml)를 처리하였다. 토파시티닙(1ug/ml)은 poly IC 처리 2시간 전에 전처리하였다. poly IC 처리 2일 후에 BrdU cell proliferation ELISA (11647229001, Roche)을 이용하여 세포생존율를 측정하였다. 이를 위해 먼저 BrdU labeling solution을 10ul/well 처리하여 37 ℃에서 4시간 반응시켰다. 이후에 fixdenat buffer를 200ul/well를 30분 동안 처리하여 세포를 고정하고 anti BrdU-POD solution 100ul/well를 90분 동안 반응시켰다. 그 이후 기질용액(substrate solution) 100ul를 처리한 후 370nm의 파장에서의 OD값을 ELISA로 측정하였고 세포생존율을 그래프로 나타내었다.

그 결과, 도 1B에 나타난바와 같이 줄기세포에서 poly IC로 유도된 세포노화에 의한 세포생존율이 토파시티닙 전처리에 의하여 덜 감소되었음을 확인할 수 있었다.

<1-3> 토파시티닙 처리에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 웨스턴블롯팅을 이용하여 확인

본 발명자들은 토파시티닙 처리에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 웨스턴블롯팅을 이용하여 확인하였다.

보다 구체적으로 설명하면, 줄기세포를 10cm dish에 (3 X 10⁵cell/dish)로 플레이팅(plating)한 후 1일 후에 poly IC (1ug/ml)를 처리하였다. 토파시티닙(1ug/ml)은 poly IC 처리 2시간 전에 전처리하였다. poly IC 처리 2일 후에 단백질 발현분석을 위하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

이를 위해 세포에 RIPA lysis buffer (1%Np-40, 0.5% Na-deoxycholate, 0.4% SDS, 0.15M Nacl, 0.05M Tris-HCl (pH8), Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (78440, Thermo Scientific))를 처리하여 얼음에서 30분동안 반응시켜 세포를 추출(extraction)하였다. 이 세포 파쇄액을 원심분리한 후 상등액만을 모아 바이신코닉산 단백질 분석 키트(bicinchoninic acid protein assay kit; 23225, Thermo Scientific)를 이용하여 정량하였다. 단백질 추출액 10 ug을 12 % SDS-PAGE를 이용하여 분리 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 트랜스퍼(transfer)하였다. blocking buffer (0.1% Tween 20, 5% BSA in tris buffered saline)로 1시간 동안 RT에서 반응 후 1차 항체를 처리하여 4도에서 밤새도록 반응시켰다. 사용한 1차 항체로는 TLR3 (#6961, Cell Signaling), phospho-stat1 (#7649, Cell signaling), IL-6 (ab6672, abcam), p16(ab51243, abcam), PCNA (610665, BD Bioscience), EZH2 (ab3748, abcam), BMI1 (39993, Active Motif), cyclinD1 (abcam, ab134175), survivin (GTX100052, Genetex) 및 b-actin (A5441, Sigma)이다. TBST solution으로 3회 세척 후 peroxidase-conjugated 2차 항체를 RT에서 1시간 반응 시키고 C-DiGit Blot Scanner (LI-COR)를 이용하여 단백질 밴드들을 분석하였다.

그 결과, 염증성노화에 따라 TLR3 signaling 관련 TLR3, IL6의 증가와 함께 노화(PCNA), 줄기세포성(EZH2, BMI-1), 증식(survivin, CyclinD1) 관련 단백질 및 mRNA 발현 감소가 토파시티닙 전처리에 의하여 덜 감소됨을 확인할 수 있었다(도 1C 참조).

<1-4> 토파시티닙 처리에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 Real time PCR을 이용하여 확인

본 발명자들은 토파시티닙 처리에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 Real time PCR을 이용하여 확인하였다.

이를 위해 먼저 세포에 TRIzol reagent를 처리하여 세포를 용해(lysis) 시켰고 클로로폼(chloroform)을 처리하여 RNA가 존재하는 수용액층을 분리하였다. 이 분리시킨 수용액 측에 이소프로파놀(Isopropanol)을 처리하여 RNA를 침전시키고 원심 분리하여 RNA만을 추출하였다. 추출한 RNA는 나노드랍을 이용하여 정량하였다. 2ug의 RNA를 TOPscript cDNA synthesis Kit (RT200, Enzynomics) 사용하여 cDNA mixture로 합성 한 후 real time PCR을 위한 주형(template)으로 사용하였다. Real time PCR은 CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-rad)을 이용하였으며 사용한 프라이머들은 표 1로 나타내었다. 상대적인 mRNA 발현량은 comparative threshold cycles (2^-Ct)method를 이용하여 분석하였다.

상기와 같이 분석한 결과, 염증성노화에 따라 TLR3 signaling 관련 TLR3, IL6의 증가와 함께 노화(PCNA), 줄기세포성(EZH2, BMI-1), 증식(survivin, CyclinD1) 관련 단백질 및 mRNA 발현 감소가 토파시티닙 전처리에 의하여 덜 감소됨을 확인할 수 있었다(도 1D 참조).

<1-5> 토파시티닙 처리에 따른 면역원성 감소 확인

본 발명자들은 토파시티닙 처리에 따른 면역원성 관련 단백질인 HLA-A, HLA-B 발현 정도를 확인하기 위하여 FACS 분석과 Real time PCR 수행하여 확인하였다.

이에 대해 보다 구체적으로 설명하면, 줄기세포에 트립신(trypsisn/EDTA)를 처리하여 단일세포로 분리하고 Mouse Anti-Human HLA-ABC (555553, BD Biosciences)를 1시간동안 RT에서 반응시킨 후 3회 세척 후 FACS calibur instrument (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 면역원성 관련 단백질인 HLA-A, HLA-B가 poly IC 처리에 따라 증가하며 이러한 증가는 토파시티닙 전처리에 의하여 덜 증가함을 확인할 수 있었다(도 1E 참조).

<1-6> 토파시티닙 처리에 따른 면역조절능 증가 확인

본 발명자들은 토파시티닙 처리에 따른 T 세포 활성을 억제하는 단백질인 TGF-b, HGF 발현 정도를 확인하기 위하여 Real time PCR 수행하여 확인하였다.

Real time PCR의 구체적인 실험 방법은 상기 실시예 <1-4>과 같다.

그 결과, T 세포 활성을 억제하는 단백질인 TGF-b, HGF가 poly IC에 처리에 따라 감소하며 이러한 감소는 토파시티닙 전처리에 의하여 덜 감소함을 확인할 수 있었다(도 1E 참조).

<1- 7>룩소리티닙 또는 필고리닙 처리에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 웨스턴블롯팅을 이용하 여 확인

JAK1 억제제인 룩소리티닙 또는 필고리닙(GLPG0634)을 이용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 줄기세포 증식, 분화촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 확인하였다.

이의 결과를 도 2에 나타내었고, 이의 결과, 염증성 노화에 따라 TLR3 신호전달과 관련된 TLR3 및 IL6의 증가되었고, 상기 JAK1 억제제의 처리에 의하여 줄기세포성과 관련된 EZH2, BMI-1, 증식과 관련된 Survivin 및 Cyclin D1 단백질 발현감소가 덜 일어남을 확인하였다.

<실시예 2>

JAK1 knock-out 줄기세포에서 염증성노화 저항성 확인

<2-1> JAK1 knock-out에 따른 줄기세포 노화 감소 확인

본 발명자들은 JAK1 knock-out 세포 제작을 위하여 plentiCRISPRv2 벡터에 JAK1 gide RNA 서열을 클로닝(cloning)하였다. 이후 lentivirus로 패키징하기 위하여 plentiCRISPR-JAK1, pMD2.G 그리고 psPAX2 플라스미드를 293T세포에 트랜스펙션(transfection)하였다. 트랜스펙션 3일 후 바이러스가 포함된 배양액을 줄기세포에 처리하여 plentiCRISPR-JAK1 lentivirus를 주입(infection) 시켰다. plentiCRISPRv2 벡터에 존재한 푸로마이신(puromycin) 저항성 유전자를 이용하여 푸로마이신 선발(puromycin selection)을 2일 동안 시행한 후 살아남은 세포만을 배양하였다. JAK1 유전자 knock-out은 웨스턴블롯팅, 시퀀싱을 이용하여 확인하였다(웨스턴블롯팅-도 3C 참조).

상기와 같이 제작된 JAK1 knock-out 세포에 의해 줄기세포 노화 감소 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 대표적 세포노화 측정 기법인 SA-b-gal 염색을 이용하여 확인하였다. 구체적인 SA-b-gal 염색 방법은 상기 실시예 <1-1>의 방법과 같다.

그 결과, 줄기세포에서 poly IC에 의해 유도된 염증성 세포노화가 JAK1 knock-out에 의하여 확연히 감소하였음을 확인할 수 있었다(도 3A 참조).

<2-2> JAK1 knock-out에 따른 이식 후 줄기세포의 생존율 감소 억제 확인

본 발명자들은 JAK1 knock-out 세포 처리에 따른 이식 후 줄기세포의 생존율 감소 억제 효과를 확인하기 위하여 BrdU assay를 이용하여 관찰하였으며, 구체적인 BrdU assay 방법은 상기 실시예 <1-2>의 방법과 같다.

그 결과, 도 3B에 나타난바와 같이 줄기세포에서 poly IC로 유도된 세포노화에 의한 세포생존율이 JAK1 knock-out에 의하여 덜 감소되었음을 확인할 수 있었다.

<2-3> JAK1 knock-out에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 웨스턴블롯팅을 이용하여 확인

본 발명자들은 JAK1 knock-out 세포 처리에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 웨스턴블롯팅을 이용하여 확인하였으며, 구체적인 웨스턴블롯팅 방법은 상기 실시예 <1-3>의 방법과 동일하다.

그 결과, 염증성노화에 따라 TLR3 signaling 관련 TLR3, IL6의 증가와 함께 노화(PCNA), 줄기세포성(EZH2, BMI-1), 증식(survivin, CyclinD1) 관련 단백질 및 mRNA 발현 감소가 JAK1 knock-out에 의하여 덜 감소됨을 확인할 수 있었다(도 3C 참조).

<2-4> JAK1 knock-out에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 Real time PCR을 이용하여 확인

본 발명자들은 JAK1 knock-out 세포 처리에 따른 줄기세포 증식, 분화 촉진과 관련된 단백질 및 줄기세포성 증가와 관련된 단백질의 발현을 Real time PCR을 이용하여 확인하였으며, 구체적인 Real time PCR 방법은 상기 실시예 <1-4>의 방법과 동일하다.

상기와 같이 분석한 결과, 염증성노화에 따라 TLR3 signaling 관련 TLR3, IL6의 증가와 함께 노화(PCNA), 줄기세포성(EZH2, BMI-1), 증식(survivin, CyclinD1) 관련 단백질 및 mRNA 발현 감소가 JAK1 knock-out에 의하여 덜 감소됨을 확인할 수 있었다(도 3D 참조).

<2-5> JAK1 knock-out에 따른 면역원성 감소 확인

본 발명자들은 JAK1 knock-out 세포 처리에 따른 면역원성 관련 단백질인 HLA-A, HLA-B 발현 정도를 확인하기 위하여 FACS 분석과 Real time PCR 수행하여 확인하였으며, 구체적인 실험방법은 상기 실시예 <1-5>의 방법과 동일하다.

그 결과, 면역원성 관련 단백질인 HLA-A, HLA-B가 poly IC 처리에 따라 증가하며 이러한 증가는 JAK1 knock-out에 의하여 덜 증가함을 확인할 수 있었다(도 3E 참조).

<2-6> JAK1 knock-out에 따른 면역조절능 증가 확인

본 발명자들은 JAK1 knock-out 세포 처리에 따른 T 세포 활성을 억제하는 단백질인 TGF-b, HGF 발현 정도를 확인하기 위하여 Real time PCR 수행하여 확인하였으며, 구체적인 실험방법은 상기 실시예 <1-6>과 동일하다.

그 결과, T 세포 활성을 억제하는 단백질인 TGF-b, HGF가 poly IC에 처리에 따라 감소하며 이러한 감소는 JAK1 knock-out에 의하여 덜 감소함을 확인할 수 있었다(도 3E 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Composition for promoting proliferation, differentiation or anti-aging of stem cell using Janus kinase 1 inhibitor <130> PN1601-001 <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 3426 <212> DNA <213> JAK1 cDNA sequence <400> 1 atggctttct gtgctaaaat gaggagctcc aagaagactg aggtgaacct ggaggcccct 60 gagccagggg tggaagtgat cttctatctg tcggacaggg agcccctccg gctgggcagt 120 ggagagtaca cagcagagga actgtgcatc agggctgcac aggcatgccg tatctctcct 180 ctttgtcaca acctctttgc cctgtatgac gagaacacca agctctggta tgctccaaat 240 cgcaccatca ccgttgatga caagatgtcc ctccggctcc actaccggat gaggttctat 300 ttcaccaatt ggcatggaac caacgacaat gagcagtcag tgtggcgtca ttctccaaag 360 aagcagaaaa atggctacga gaaaaaaaag attccagatg caacccctct ccttgatgcc 420 agctcactgg agtatctgtt tgctcaggga cagtatgatt tggtgaaatg cctggctcct 480 attcgagacc ccaagaccga gcaggatgga catgatattg agaacgagtg tctagggatg 540 gctgtcctgg ccatctcaca ctatgccatg atgaagaaga tgcagttgcc agaactgccc 600 aaggacatca gctacaagcg atatattcca gaaacattga ataagtccat cagacagagg 660 aaccttctca ccaggatgcg gataaataat gttttcaagg atttcctaaa ggaatttaac 720 aacaagacca tttgtgacag cagcgtgtcc acgcatgacc tgaaggtgaa atacttggct 780 accttggaaa ctttgacaaa acattacggt gctgaaatat ttgagacttc catgttactg 840 atttcatcag aaaatgagat gaattggttt cattcgaatg acggtggaaa cgttctctac 900 tacgaagtga tggtgactgg gaatcttgga atccagtgga ggcataaacc aaatgttgtt 960 tctgttgaaa aggaaaaaaa taaactgaag cggaaaaaac tggaaaataa acacaagaag 1020 gatgaggaga aaaacaagat ccgggaagag tggaacaatt tttcttactt ccctgaaatc 1080 actcacattg taataaagga gtctgtggtc agcattaaca agcaggacaa caagaaaatg 1140 gaactgaagc tctcttccca cgaggaggcc ttgtcctttg tgtccctggt agatggctac 1200 ttccggctca cagcagatgc ccatcattac ctctgcaccg acgtggcccc cccgttgatc 1260 gtccacaaca tacagaatgg ctgtcatggt ccaatctgta cagaatacgc catcaataaa 1320 ttgcggcaag aaggaagcga ggaggggatg tccgtgctga ggtggagctg caccgacttt 1380 gacaacatcc tcatgaccgt cacctgcttt gagaagtctg agcaggtgca gggtgcccag 1440 aagcagttca agaactttca gatcgaggtg cagaagggcc gctacagtct gcacggttcg 1500 gaccgcagct tccccagctt gggagacctc atgagccacc tcaagaagca gatcctgcgc 1560 acggataaca tcagcttcat gctaaaacgc tgctgccagc ccaagccccg agaaatctcc 1620 aacctgctgg tggctactaa gaaagcccag gagtggcagc ccgtctaccc catgagccag 1680 ctgagtttcg atcggatcct caagaaggat ctggtgcagg gcgagcacct tgggagaggc 1740 acgagaacac acatctattc tgggaccctg atggattaca aggatgacga aggaacttct 1800 gaagagaaga agataaaagt gatcctcaaa gtcttagacc ccagccacag ggatatttcc 1860 ctggccttct tcgaggcagc cagcatgatt agacaggtct cccacaaaca catcgtgtac 1920 ctctatggcg tctgtgtccg cgacgtggag aatatcatgg tggaagagtt tgtggaaggg 1980 ggtcctctgg atctcttcat gcaccggaaa agcgatgtcc ttaccacacc atggaaattc 2040 aaagttgcca aacagctggc cagtgccctg agctacttgg aggataaaga cctggtccat 2100 ggaaatgtgt gtactaaaaa cctcctcctg gcccgtgagg gaatcgacag tgagtgtggc 2160 ccattcatca agctcagtga ccccggcatc cccattacgg tgctgtctag gcaagaatgc 2220 attgaacgaa tcccatggat tgctcctgag tgtgttgagg actccaagaa cctgtgtgtg 2280 gctgctgaca agtggagctt tggaaccacg ctctgggaaa tctgctacaa tggcgagatc 2340 cccttgaaag acaagacgct gattgagaaa gagagattct atgaaagccg gtgcaggcca 2400 gtgacaccat catgtaagga gctggctgac ctcatgaccc gctgcatgaa ctatgacccc 2460 aatcagaggc ctttcttccg agccatcatg agagacatta ataagcttga agagcagaat 2520 ccagatattg tttcagaaaa aaaaccagca actgaagtgg accccacaca ttttgaaaag 2580 cgcttcctaa agaggatccg tgacttggaa gagggacact ttgggaaggt tgagctctgc 2640 aggtatgacc ccgaagacaa tacaggggag caggtggctg ttaaatctct gaagcctgag 2700 agtggaggta accacatagc tgatctgaaa aaggaaatcg agatcttaag gaacctctat 2760 catgagaaca ttgtgaagta caaaggaatc tgcacagaag acggaggaaa tggtattaag 2820 ctcatcatgg aatttctgcc ttcgggaagc cttaaggaat atcttccaaa gaataagaac 2880 aaaataaacc tcaaacagca gctaaaatat gccgttcaga tttgtaaggg gatggactat 2940 ttgggttctc ggcaatacgt tcaccgggac ttggcagcaa gaaatgtcct tgttgagagt 3000 gaacaccaag tgaaaattgg agacttcggt ttaaccaaag caattgagac cgataaggag 3060 tattacaccg tcaaggatga ccgggacagc ccaaagtttg ggtatgctcc agaatgttta 3120 atgcaatcta aattttatat tgcctctgac gtctggtctt ttggagtcac tctgcatgag 3180 ctgctgactt actgtgattc agattctagt cccatggctt tgttcctgaa aatgataggc 3240 ccaacccatg gccagatgac agtcacaaga cttgtgaata cgttaaaaga aggaaaacgc 3300 ctgccgtgcc cacctaactg tccagatgag gtttatcagc ttatgagaaa atgctgggaa 3360 ttccaaccat ccaatcggac aagctttcag aaccttattg aaggatttga agcactttta 3420 aaataa 3426 <210> 2 <211> 1141 <212> PRT <213> JAK1 amino acid sequence <400> 2 Met Ala Phe Cys Ala Lys Met Arg Ser Ser Lys Lys Thr Glu Val Asn 1 5 10 15 Leu Glu Ala Pro Glu Pro Gly Val Glu Val Ile Phe Tyr Leu Ser Asp 20 25 30 Arg Glu Pro Leu Arg Leu Gly Ser Gly Glu Tyr Thr Ala Glu Glu Leu 35 40 45 Cys Ile Arg Ala Ala Gln Ala Cys Arg Ile Ser Pro Leu Cys His Asn 50 55 60 Leu Phe Ala Leu Tyr Asp Glu Asn Thr Lys Leu Trp Tyr Ala Pro Asn 65 70 75 80 Arg Thr Ile Thr Val Asp Asp Lys Met Ser Leu Arg Leu His Tyr Arg 85 90 95 Met Arg Phe Tyr Phe Thr Asn Trp His Gly Thr Asn Asp Asn Glu Gln 100 105 110 Ser Val Trp Arg His Ser Pro Lys Lys Gln Lys Asn Gly Tyr Glu Lys 115 120 125 Lys Lys Ile Pro Asp Ala Thr Pro Leu Leu Asp Ala Ser Ser Leu Glu 130 135 140 Tyr Leu Phe Ala Gln Gly Gln Tyr Asp Leu Val Lys Cys Leu Ala Pro 145 150 155 160 Ile Arg Asp Pro Lys Thr Glu Gln Asp Gly His Asp Ile Glu Asn Glu 165 170 175 Cys Leu Gly Met Ala Val Leu Ala Ile Ser His Tyr Ala Met Met Lys 180 185 190 Lys Met Gln Leu Pro Glu Leu Pro Lys Asp Ile Ser Tyr Lys Arg Tyr 195 200 205 Ile Pro Glu Thr Leu Asn Lys Ser Ile Arg Gln Arg Asn Leu Leu Thr 210 215 220 Arg Met Arg Ile Asn Asn Val Phe Lys Asp Phe Leu Lys Glu Phe Asn 225 230 235 240 Asn Lys Thr Ile Cys Asp Ser Ser Val Ser Thr His Asp Leu Lys Val 245 250 255 Lys Tyr Leu Ala Thr Leu Glu Thr Leu Thr Lys His Tyr Gly Ala Glu 260 265 270 Ile Phe Glu Thr Ser Met Leu Leu Ile Ser Ser Glu Asn Glu Met Asn 275 280 285 Trp Phe His Ser Asn Asp Gly Gly Asn Val Leu Tyr Tyr Glu Val Met 290 295 300 Val Thr Gly Asn Leu Gly Ile Gln Trp Arg His Lys Pro Asn Val Val 305 310 315 320 Ser Val Glu Lys Glu Lys Asn Lys Leu Lys Arg Lys Lys Leu Glu Asn 325 330 335 Lys His Lys Lys Asp Glu Glu Lys Asn Lys Ile Arg Glu Glu Trp Asn 340 345 350 Asn Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Ile Thr His Ile Val Ile Lys Glu Ser 355 360 365 Val Val Ser Ile Asn Lys Gln Asp Asn Lys Lys Met Glu Leu Lys Leu 370 375 380 Ser Ser His Glu Glu Ala Leu Ser Phe Val Ser Leu Val Asp Gly Tyr 385 390 395 400 Phe Arg Leu Thr Ala Asp Ala His His Tyr Leu Cys Thr Asp Val Ala 405 410 415 Pro Pro Leu Ile Val His Asn Ile Gln Asn Gly Cys His Gly Pro Ile 420 425 430 Cys Thr Glu Tyr Ala Ile Asn Lys Leu Arg Gln Glu Gly Ser Glu Glu 435 440 445 Gly Met Ser Val Leu Arg Trp Ser Cys Thr Asp Phe Asp Asn Ile Leu 450 455 460 Met Thr Val Thr Cys Phe Glu Lys Ser Glu Gln Val Gln Gly Ala Gln 465 470 475 480 Lys Gln Phe Lys Asn Phe Gln Ile Glu Val Gln Lys Gly Arg Tyr Ser 485 490 495 Leu His Gly Ser Asp Arg Ser Phe Pro Ser Leu Gly Asp Leu Met Ser 500 505 510 His Leu Lys Lys Gln Ile Leu Arg Thr Asp Asn Ile Ser Phe Met Leu 515 520 525 Lys Arg Cys Cys Gln Pro Lys Pro Arg Glu Ile Ser Asn Leu Leu Val 530 535 540 Ala Thr Lys Lys Ala Gln Glu Trp Gln Pro Val Tyr Pro Met Ser Gln 545 550 555 560 Leu Ser Phe Asp Arg Ile Leu Lys Lys Asp Leu Val Gln Gly Glu His 565 570 575 Leu Gly Arg Gly Thr Arg Thr His Ile Tyr Ser Gly Thr Leu Met Asp 580 585 590 Tyr Lys Asp Asp Glu Gly Thr Ser Glu Glu Lys Lys Ile Lys Val Ile 595 600 605 Leu Lys Val Leu Asp Pro Ser His Arg Asp Ile Ser Leu Ala Phe Phe 610 615 620 Glu Ala Ala Ser Met Ile Arg Gln Val Ser His Lys His Ile Val Tyr 625 630 635 640 Leu Tyr Gly Val Cys Val Arg Asp Val Glu Asn Ile Met Val Glu Glu 645 650 655 Phe Val Glu Gly Gly Pro Leu Asp Leu Phe Met His Arg Lys Ser Asp 660 665 670 Val Leu Thr Thr Pro Trp Lys Phe Lys Val Ala Lys Gln Leu Ala Ser 675 680 685 Ala Leu Ser Tyr Leu Glu Asp Lys Asp Leu Val His Gly Asn Val Cys 690 695 700 Thr Lys Asn Leu Leu Leu Ala Arg Glu Gly Ile Asp Ser Glu Cys Gly 705 710 715 720 Pro Phe Ile Lys Leu Ser Asp Pro Gly Ile Pro Ile Thr Val Leu Ser 725 730 735 Arg Gln Glu Cys Ile Glu Arg Ile Pro Trp Ile Ala Pro Glu Cys Val 740 745 750 Glu Asp Ser Lys Asn Leu Cys Val Ala Ala Asp Lys Trp Ser Phe Gly 755 760 765 Thr Thr Leu Trp Glu Ile Cys Tyr Asn Gly Glu Ile Pro Leu Lys Asp 770 775 780 Lys Thr Leu Ile Glu Lys Glu Arg Phe Tyr Glu Ser Arg Cys Arg Pro 785 790 795 800 Val Thr Pro Ser Cys Lys Glu Leu Ala Asp Leu Met Thr Arg Cys Met 805 810 815 Asn Tyr Asp Pro Asn Gln Arg Pro Phe Phe Arg Ala Ile Met Arg Asp 820 825 830 Ile Asn Lys Leu Glu Glu Gln Asn Pro Asp Ile Val Ser Glu Lys Lys 835 840 845 Pro Ala Thr Glu Val Asp Pro Thr His Phe Glu Lys Arg Phe Leu Lys 850 855 860 Arg Ile Arg Asp Leu Glu Glu Gly His Phe Gly Lys Val Glu Leu Cys 865 870 875 880 Arg Tyr Asp Pro Glu Asp Asn Thr Gly Glu Gln Val Ala Val Lys Ser 885 890 895 Leu Lys Pro Glu Ser Gly Gly Asn His Ile Ala Asp Leu Lys Lys Glu 900 905 910 Ile Glu Ile Leu Arg Asn Leu Tyr His Glu Asn Ile Val Lys Tyr Lys 915 920 925 Gly Ile Cys Thr Glu Asp Gly Gly Asn Gly Ile Lys Leu Ile Met Glu 930 935 940 Phe Leu Pro Ser Gly Ser Leu Lys Glu Tyr Leu Pro Lys Asn Lys Asn 945 950 955 960 Lys Ile Asn Leu Lys Gln Gln Leu Lys Tyr Ala Val Gln Ile Cys Lys 965 970 975 Gly Met Asp Tyr Leu Gly Ser Arg Gln Tyr Val His Arg Asp Leu Ala 980 985 990 Ala Arg Asn Val Leu Val Glu Ser Glu His Gln Val Lys Ile Gly Asp 995 1000 1005 Phe Gly Leu Thr Lys Ala Ile Glu Thr Asp Lys Glu Tyr Tyr Thr 1010 1015 1020 Val Lys Asp Asp Arg Asp Ser Pro Lys Phe Gly Tyr Ala Pro Glu 1025 1030 1035 Cys Leu Met Gln Ser Lys Phe Tyr Ile Ala Ser Asp Val Trp Ser 1040 1045 1050 Phe Gly Val Thr Leu His Glu Leu Leu Thr Tyr Cys Asp Ser Asp 1055 1060 1065 Ser Ser Pro Met Ala Leu Phe Leu Lys Met Ile Gly Pro Thr His 1070 1075 1080 Gly Gln Met Thr Val Thr Arg Leu Val Asn Thr Leu Lys Glu Gly 1085 1090 1095 Lys Arg Leu Pro Cys Pro Pro Asn Cys Pro Asp Glu Val Tyr Gln 1100 1105 1110 Leu Met Arg Lys Cys Trp Glu Phe Gln Pro Ser Asn Arg Thr Ser 1115 1120 1125 Phe Gln Asn Leu Ile Glu Gly Phe Glu Ala Leu Leu Lys 1130 1135 1140 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> JAK1 sgRNA sequence <400> 3 atgacgagaa caccaagctc 20

Claims

JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 또는 노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 JAK1 억제제는 토파시티닙(tofacitinib), 바리시티닙(baricitinib), 룩소리티닙(ruxolitinib) 및 필고티닙(Filgotinib)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 또는 노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 JAK1 억제제는 면역원성 관련 단백질인 HLA-A 또는 HLA-B의 발현을 억제 또는 감소시키고, T 세포 활성을 억제하는 단백질인 TGF-b 또는 HGF의 발현을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 또는 노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 JAK1 억제제는 줄기세포의 노화를 감소시키고, 줄기세포의 생존율을 증진시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 증식, 분화 촉진 또는 노화 억제용 조성물.
시험관내(in vitro)에서 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1)의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 방법.
제5항에 있어서,
상기 JAK1(Janus kinase 1)의 발현 또는 활성을 억제시키는 것은 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 줄기세포 내의 JAK1(Janus kinase 1) 유전자를 넉아웃(knock-out)시키는 방법을 수행하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 방법.
제6항에 있어서,
상기 JAK1 억제제는 토파시티닙(tofacitinib), 바리시티닙(baricitinib), 룩소리티닙(ruxolitinib) 및 필고티닙(Filgotinib)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 방법.
시험관내(in vitro)에서 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 JAK1(Janus kinase 1)을 제거(knock-out)시키는 단계를 포함하는, 줄기세포의 노화를 억제하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 JAK1 억제제는 토파시티닙(tofacitinib), 바리시티닙(baricitinib), 룩소리티닙(ruxolitinib)및 필고티닙(Filgotinib)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 노화를 억제하는 방법.
세포이식을 위한 줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리하거나 JAK1(Janus kinase 1)을 제거(knock-out)하는 단계를 포함하는, 하기 특징을 갖는 세포치료용 줄기세포의 제조방법:
(a) 줄기세포의 염증성 세포노화 감소;
(b) 줄기세포의 세포생존율 감소 억제;
(c) 줄기세포의 세포증식 증가;
(d) 줄기세포의 줄기세포성(stemness) 증가;
(e) 줄기세포의 면역원성 감소 및
(f) 줄기세포의 면역조절능 증가.
줄기세포에 JAK1(Janus kinase 1) 억제제를 처리되거나 JAK1(Janus kinase 1)가 제거(knock-out)되어 하기 특징을 갖는 세포치료용 줄기세포.
(a) 줄기세포의 염증성 세포노화 감소;
(b) 줄기세포의 세포생존율 감소 억제;
(c) 줄기세포의 세포증식 증가;
(d) 줄기세포의 줄기세포성(stemness) 증가;
(e) 줄기세포의 면역원성 감소 및
(f) 줄기세포의 면역조절능 증가.
제11항의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
JAK1(Janus kinase 1) 억제제 및 줄기세포를 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료 키트.
JAK1 억제제 및 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
JAK1 억제제 및 줄기세포를 인간을 제외한 개체에 투여하여, 면역질환을 예방 또는 치료하는 방법.