KR101959636B1 - 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101959636B1
KR101959636B1 KR1020170139274A KR20170139274A KR101959636B1 KR 101959636 B1 KR101959636 B1 KR 101959636B1 KR 1020170139274 A KR1020170139274 A KR 1020170139274A KR 20170139274 A KR20170139274 A KR 20170139274A KR 101959636 B1 KR101959636 B1 KR 101959636B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bone
formula
compound represented
compound
cells
Prior art date
Application number
KR1020170139274A
Other languages
English (en)
Inventor
박의균
김주앙
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to KR1020170139274A priority Critical patent/KR101959636B1/ko
Priority to PCT/KR2018/012731 priority patent/WO2019083301A1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101959636B1 publication Critical patent/KR101959636B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/306—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on bone mass, e.g. osteoporosis prevention

Abstract

본 발명은 인데엔(indene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 골 재생 유도 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 화합물은 조골세포의 분화를 촉진하고, 파골세포의 분화를 억제할 수 있으므로 골 재생 또는 골 형성을 유도하여 골질환 예방 또는 치료용 약학조성물 또는, 예방 또는 개선용 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for induction of bone regeneration and preventing or treating bone disorders comprising indene compound}
본 발명은 인데엔(indene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 골 재생 유도 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체 기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 이러한 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포, 파골세포 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 조골세포는 골 형성에 주된 역할을 담당하며, 조혈모세포로부터 유래 되는 파골 세포는 파괴되거나 노화된 골의 흡수를 담당하므로, 이를 통해 조골세포와 파골세포의 균형에 의한 골의 재형성(remodeling)을 유지하게 된다.
골 대사성 질환은 생체 내에서 파골 세포와 조골세포의 평형이 깨짐으로써 발생한다. 골 대사성 질환의 예로써 골다공증을 들 수 있는데 골다공증은 조골세포에 비하여 파골 세포의 활성이 증가함으로써 총 골량(total bone mass)이 감소하면서 경미한 충격에도 뼈가 쉽게 부서지게 되는 질환을 말한다. 이 외에도 종양이 전이된 전이성 암, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염 및 세균의 감염에 의해 치조골의 파괴를 유발하는 치주질환 등이 있다. 골 대사 질환 등은 파골 세포가 과도하게 활성화되어 뼈를 쉽게 파괴하는 결과를 초래하게 된다.
파골 세포 전구체(osteoclast progenitor)는 골수에서 기원하는 단핵세포/대식세포(monocyte/macrophage) 계통의 조혈세포(hematopoietic cell)이다. 파골세포 전구체는 골수에서 생성되는 성장인자와 사이토카인에 의해 파골세포로 분화된다 (Roodman G. D., Endocr. Rev., 17, 308-332 (1996)).
조골세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성되는데 조골 세포의 분화에 의해 형성되는 칼슘 등을 포함한 무기질화는 뼈의 세기를 유지시켜줄 수 있을 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 하고 있다. 조골세포의 분화에 의한 칼슘 축적은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 세포 내에서 뼈 형태 형성단백질(bone morphogenetic protein; BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호 전달 체계의 상호 작용(cross-talk)에 의해 조골세포의 분화에 관련된 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP)와 타입 Ι 콜라겐(type 1 collagen)이 초기 분화단계에서 합성된 후, 무기질화에 관련된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin) 등이 합성됨으로써 조골 세포의 분화에 의한 골 형성이 이루어진다고 알려져있다.
그러나 이러한 인체의 골은 형성과 재형성 과정을 통해 항상성을 유지하며, 골의 재형성은 조골세포 및 파골세포로 구성된 골 다세포성 단위체(bone multicellular unit: BMU)에서 일어나며 이들 세포는 각각 조골 형성과 골 흡수 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져있다. 이 과정에서의 두 세포 간 협력체계에 손상이 올 경우 다양한 골 대사성 질환이 발병하게 되지만 현재까지 완치를 위한 효과적인 치료법이 없는 실정이다.
대한민국공개특허 제10-2013-0128302호(2013. 11. 26 공개)
본 발명은 조골세포 분화를 촉진하고 파골세포 분화를 억제하는 활성을 나타내는 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하여, 골 재생 유도 촉진 또는 골 질환 치료용 약학조성물 및 건강식품으로 사용하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 재생용 약학조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017105501576-pat00001
상기 화학식 1에서,
상기 R1은 (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, R2 및 R3은 각각 독립적으로 (C1-C4)알킬이며, X는 NH 또는 O 임.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 재생용 건강식품을 제공한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명은 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상기 화합물은 조골세포의 분화를 촉진하고, 파골세포의 분화를 억제할 수 있으므로, 골 재생 또는 골 형성을 유도하여 골 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 또는, 예방 또는 개선용 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인데엔 유도체 화합물의 구조이다.
도 2는 인데엔 유도체가 처리되거나 처리되지 않은 골형성 배지에서 사람 BMSCs를 배양한 후 28일째에 무기질화 수준을 확인한 알리자린 레드 S 염색 결과이다.
도 3은 KR-34893의 구조 및 골 형성능을 확인한 결과로, 도 3A는 KR-34893의 구조이며, 도 3B는 KR-34893 존재하에서 각 시간대 별로 사람 골수줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cell; BMSCs)의 생존능을 확인한 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-sodium bromide) 분석 결과이며, 도 3C는 KR-34893가 처리되거나 처리되지 않은 골형성 배지에서 사람 BMSCs를 배양한 후 28일째에 알리자린 레드 S를 염색한 후 염료를 추출하여 570nm 흡광도에서 분석하고 대조군과 비교한 결과이며 (**P < 0.01), 도 3D는 분화 7일째에 조골세포 분화 특이적 유전자인 RUNX2, ALP, COL1A1, ON, OPN, OC, 및 BSP의 mRNA 수준을 확인한 역전사 PCR (reverse transcription PCR; RT-PCR)분석 결과이며, 도 3E는 5 μM KR-34893가 포함된 골형성 배지에서 생쥐 두개골 세포를 배양한 후 14일째에 알리자린 레드 S로 염색하여 6×로 얻은 이미지이며, 도 3F는 배양 7일째에 조골세포 분화 마커 유전자의 mRNA 수준을 확인한 RT-PCR 결과로 KR은 KR-34893을 의미한다.
도 4는 KR-34893의 지방세포 분화효과를 확인한 결과로, 사람 BMSCs를 다양한 농도의 KR-34893이 포함된 지방생성 분화배지에서 배양하고 14일째에 오일 레드 O로 염색한 후 메탄올로 염료를 용해시키고 500 nm 흡광도에서 분석한 결과이며 KR은 KR-34893을 의미한다.
도 5는 KR-34893의 파골세포(osteoclast) 분화 억제 효과를 확인하기 위해, 1.0, 2.5, 및 5.0 μM KR-34893 존재 하에서 생쥐 골수세포에 M-CSF 및 RANKL를 4일간 처리한 결과로, 도 5A는 상기 세포를 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색하여 20×로 촬영하여 얻은 이미지이고, 도 5B는 3핵 이상의 TRAP 양성 다핵거대세포(multinucleated) 수를 확인한 결과이다 (**p < 0.01 versus the vehicle-treated control). 도 5C는 405nm의 파장 길이에서 TRAP 활성을 확인한 결과이며, 도 5D는 파골세포 포르마잔과 관련된 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인한 역전사 PCR (RT-PCR) 결과이다.
도 6은 KR-34893 화합물이 ALP, 무기물화 및 조골세포 분화에 미치는 영향을 확인한 결과로, 도 6A는 MC3T3-E1 세포를 10 μM KR-34893가 포함되거나 포함되지 않은 골형성 배지(OSM)에서 배양한 후 7일째, 14일째에 각각 ALP 및 알리자린 레드 S 염색을 수행한 결과이고, 도 6B는 10 μM KR-34893가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 6일째에 Runx2, Alp, Col1a1, Oc, 및 Bsp 유전자의 발현을 확인한 실시간 역전사 PCR 분석결과이며, 도 6C는 배양 7일째에 β-액틴을 내부 대조군으로 사용하여 Oc 및 Alp 단백질 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 6D는 10 μM KR-34893가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 배양 1일째에 Bmp2, Bmp4, 및 Bmp7의 발현 수준을 확인한 실시간 RT-PCR 결과이며, 도 4E는 배양 1일째에 Bmp2, Bmp4, 및 Bmp7의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과로, 대조군과 비교하여 *p < 0.05, ***p < 0.01, 및 ***p < 0.001 값을 나타내며, KR은 KR-34893을 의미한다.
도 7은 세포 내 신호분자의 인산화에 미치는 KR-34893의 영향을 확인한 결과로, MC3T3-E1 세포를 혈청이 없는 조건에서 24시간 배양한 후 KR-34893 (10 μM) 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 포함된 골형성 배지(OSM)를 처리하고 각 시간대 별로 AKT, MEK1/2, ERK1/2, SMAD 1/5/8, p38, JNK 및 Runx2의 인산화 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과로, β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였으며, KR은 KR-34893을 의미한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 재생용 약학조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112017105501576-pat00002
상기 화학식 1에서,
상기 R1은 (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, R2 및 R3은 각각 독립적으로 (C1-C4)알킬이며, X는 NH 또는 O 일 수 있다.
보다 상세하게 상기 화합물은 조골세포의 분화를 촉진하고, 파골세포의 분화를 억제할 수 있다.
이에 따라, 상기 화합물은 암의 골전이에 의해 초래되는 뼈 결손 부위의 골 재생을 유도할 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 재생용 건강식품을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112017105501576-pat00003
상기 화학식 1에서,
상기 R1은 (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, R2 및 R3은 각각 독립적으로 (C1-C4)알킬이며, X는 NH 또는 O 일 수 있다.
상기 골 질환은 골연화증, 구루병, 골감소증, 칼슘조절이상 등의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debrid) 등에 의해 초래되는 뼈의 용해(osteolysis), 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골손실(secondary bone loss), 파젯병(Paget disease), 골결손, 치주염에 의한 치조골 결손, 골괴사 및 섬유성 골염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 감소성 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다.
비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 인데엔 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 무기산으로는 염산, 유기산으로는 메탄설폰산을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 인데엔 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 인데엔 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품은 유효성분인 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품에 함유된 상기 화학식 1의 인데엔 화합물은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 1> 세포 및 시약
사람 골수중간엽 줄기세포(Human bone marrow mesenchymal stem cells; BMSCs)를 이미 보고되어진 방법으로 분리하였다(E.K. Park, et, al., 2004).
먼저, 사람 골수 시료를 인산완충식염수(phosphate-buffered saline; PBS), pH 7.4로 희석하고 농도 구배를 위해 histopaque (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)로 층을 분리하였다. 그 후 원심분리하여 단핵세포(mononuclear cell)를 수집하고 수집된 세포를 PBS으로 두 번 세척하였다.
10% 태아소혈청, 페니실린 100 U/mL, 및 스트렙토마이신 100 μg/mL (all purchased from Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)이 포함된 α-MEM(minimum essential medium Eagle- alpha modification)배지가 분주되어 있는 플레이트에 상기 방법으로 수집된 단핵세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 그 후 부착되지 않은 세포를 제거하고 부착된 세포는 BMSC 분획으로 수집한 후 추가 분석을 위해 세포를 확장시켰다.
3일에 한번 씩 성장 배지를 교체하였으며 모든 실험은 5 패시지 이내의 세포로 수행되었다.
성장 배지에 10 nM 덱타메타손(dexamethasone; Dex), 50 μg/mL의 아스코르브산(ascorbic acid; AA) 및 10 mM의 β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate; β-GP)를 첨가하여 골형성 배지(osteogenic medium; OSM)를 구성하였다.
MC3T3-E1 세포를 10% 태아소혈청, 페니실린 100 U/mL, 및 스트렙토마이신 100 μg/mL (all purchased from Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)이 포함된 α-MEM 배지에서 배양하고 골형성 배지(OSM)를 이용하여 조골세포 분화를 유도하였다.
상기 Dex, AA, β-GP 및 alizarin red S를 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였으며, 도 1과 같은 인데엔(indene) 유도체의 라이브러리를 한국화학연구원(the Korean Research Institute of Chemical Technology)으로부터 제공받았다.
모든 약은 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시켜 사용하였다. 항-골형성단백질(BMP)2, 항-BMP4 및 항-BMP7 항체는 Cusabio (College Park, MD, USA)에서 구입하였으며, 항-알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP) 항체는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
항-Runx2 (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, USA), 항-phospho SMAD1/5/8 (Merck Millipore Corp., Darmstadt, Germany), 항-phospho-c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 항-phospho ERK1/2 (Bethyl laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA), 항-phospho MEK1/2 (Cell Signaling Technology), 항-phospho p38 (Cell Signaling Technology), 및 항-β-액틴 (Sigma-Aldrich) 항체를 웨스턴 블롯에 사용하였다.
< 실험예 2> 골형성 분화 및 알리자린 레드 S 염색
조골세포 분화 유도를 위해, 사람 BMSCs를 성장 배지가 포함된 35-mm 디쉬(50% confluence) 당 1 × 105 세포 밀도로 접종하고, 하룻밤 동안 안정화시킨 후, 배양 배지를 KR-34893가 포함되거나 포함되지 않은 OSM으로 교체하였다.
MC3T3-E1 세포를 성장 배지가 분주된 24 웰 플레이트의 각 웰 당 7 × 104 세포의 밀도로 접종하고 다음 날, 배양 배지를 인데엔 유도체가 포함되거나 동량의 DMSO만 포함된 OSM으로 교체하였다.
배양 14일 후 무기화작용을 확인하기 위해 알리자린 레드 S 염색을 수행하였다.
알리자린 레드 S 염색을 위해, 먼저 세포를 1 × PBS로 세척하고 70% 에틸알콜로 20분간 실온에서 고정하고, 물을 이용하여 세척한 후 세포를 알리자린 레드 S(40 mM, pH 4.2)로 10분간 염색하였다.
그 후 물을 이용하여 5번 세척하여 염색되지 않은 염색액을 제거하였다.
10% 세틸피리디늄클로라이드가 포함된 0.1 M 인산 완충액(pH 7.0)으로 염색된 염료를 추출하고 560 nm에서 흡광도를 확인하였다.
또한, ALP 염색은 제조사의 설명서에 따라 수행되었다(Sigma Aldrich).
종래에 보고된 방법에 따라, 조골세포 분화를 유도하였다.
먼저, C57B6/L 생쥐로부터 얻은 골수 대식세포를 KR-34893 존재 또는 비존재 조건에서 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) 20 ng/mL 및 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor) 10 ng/mL로 4일간 배양한 후 타타르산염 내성 산성 인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphatase; TRAP)로 염색하였다.
셋 또는 더 많은 핵을 가진 TRAP 양성 다핵세포(multinucleated cells; MNCs)를 파골세포 유사 세포로 계수하였다.
< 실험예 3> 반정량적 및 정량적 RT- PCR
사람 BMSCs 및 MC3T3-E1 세포를 KR-34893가 포함되거나 DMSO만 포함된 골형성 배지(OSM)에서 적절한 시간으로 배양하고, Tri reagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 후 Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 1 μg의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
반정량적 PCR를 위해, 다음과 같은 열적 사이클링 파라미터를 사용하였다: 95℃에서 2분 후 95℃에서 60초간 적절한 수의 사이클을 진행하고, 적합한 가열냉각(annealing) 온도에서 60초, 72℃에서 90초 후 72℃에서 10분간 최종 신장(extension)을 진행하였다.
모든 PCR 생성물은 2% 아가로스 겔 전기영동 후 에티디움 브로마이드 염색을 이용하여 시각화하였다.
PCR은 특이적인 프라이머를 사용하여 수행하였으며, 사람 글리세르알데히드-3-인산디히드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH) 및 마우스 β-액틴(Actb)을 내부 대조군으로 사용하였다.
SYBR® Premix Ex Taq™ (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 이용하여 LightCycler 1.5 system (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland)으로 정량적 실시간 PCR을 수행하였다.
95℃에서 30초간 초기 변성 단계 후 변성(denaturation) 단계로 95℃에서 5초간 40 사이클을 진행하고 60℃에서 30초간 가열냉각 및 72℃에서 30초간 신장을 진행하였다.
< 실험예 4> 신호작용 분자를 위한 인산화반응 분석
MC3T3-E1 세포를 60-mm 디쉬에 분주된 성장 배지에 접종하고, 세포 합류를 확인한 후 0.3% FBS가 포함된 α-MEM (without ascorbic acid)으로 배지를 교체하였다.
24시간 후 KR-34893과 0.3% FBS가 포함된 OSM 배지로 세포를 자극하고 얼음 같이 차가운 PBS로 두 번 반복 세척하여 반응을 종료하였다.
단백질 분석을 위해, MC3T3-E1 세포에 1×자이모그래피(Zymography) 버퍼 (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% glycerol, 2% SDS, 0.0025% bromophenol blue)를 처리하고, 세포 용해물을 30초간 초음파 처리하였다.
BCA protein assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 이용하여 각 샘플의 단백질량(20 μg 단백질)을 확인하고, β-멀캅토에탄올(최종농도 5%)를 첨가하여 8% 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행한 후 니트로셀룰로스 막(Whatman, Florham Park, NJ, USA)에 옮겼다.
상기 막을 TBS-T (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 0.1% Tween 20)에 용해시킨 3% 탈지유로 인큐베이트하여 비특이적 결합을 차단(블로킹)하였다.
블로킹 후 막과 일차 항체를 인큐베이트한 후 막을 TBS-T로 3번 씻어내고 2차 항체와 인큐베이트한 다음 Absignal™ enhanced chemiluminescent substrate (Abclone, Seoul, Korea)를 이용하여 단백질을 확인하였다.
< 실시예 1> 인데엔 화합물의 조골세포 분화 자극 효과 확인
조골세포 분화에 효과적인 신규 화합물을 확인하기 위해 한국화학연구원의 화합물 라이브러리를 스크리닝한 결과, 인데엔(indene) 화합물이 MC3T3-E1 세포 내 ALP 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 화합물의 무기질화 수준을 확인한 결과, 도 2와 같이 도 1의 인데엔 화합물들은 모두 무기질화 효과가 나타났으며, 특히, KR-34893 화합물에 의한 무기질화가 가장 높게 나타났다.
상기 결과로부터 KR-34893 화합물이 MC3T3-E1 세포의 조골세포 분화를 강력하게 자극하는 화합물인 것으로 확인되었다.
이에 따라, KR-34893의 세포 독성 및 사람 BMSCs의 조골세포 분화 효과를 확인하기 위해, 사람 BMSCs에 KR-34893을 0, 1, 2.5, 5, 및 10 μM 농도로 7일간 처리한 후, MTT 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3B와 같이 KR-34893은 10 μM 농도까지 사람 BMSCs에서 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 동일한 KR-34893 농도 조건으로 사람 BMSCs에서 KR-34893의 골형성 효과를 확인하기 위해, 자극 후 28일째에 무기염류 침적물 염색을 위해 알리자린 레드 S 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 3C와 같이 KR-34893 용량 의존적으로 사람 BMSCs의 무기염류 침적이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3D와 같이 KR-34893은 조골세포 분화 마커의 발현을 현저하게 증가시켰다.
또한, KR-34893은 마우스의 일차 조골세포에서 도 3E와 같이 무기염류 침적을 매우 증가시켰으며, Runx2 (Runt-related transcription factor 2), Alp, Ocn 및 Col1을 포함한 조골세포 분화 마커 유전자의 발현을 함께 증가시켰다.
상기 결과로부터 KR-34893은 사람 BMSCs와 마우스 일차 조골세포에서 조골세포 분화를 촉진시키는 것이 확인되었다.
반면, KR-34893의 지방세포 분화효과를 확인한 결과, 도 4와 같이 KR-34893은 사람 BMSCs의 지방 생성을 조절하지 않았다.
한편, 도 5A 및 도 5B를 참고하면 KR-34893의 용량 의존적으로 파골세포(Osteoclast) 분화가 급격히 억제되는 것이 확인되었으나, 작은 파골세포는 여전히 검출되었다.
또한, 도 5D와 같이 KR-34893은 TRAP 활성을 현저하게 감소시킨 반면, Trap, Dcstamp (dendrocyte expressed seven transmembrane protein) 및 Ctsk (cathepsin k)와 같은 파골세포 마커 유전자의 발현을 약간 감소시켰다.
< 실시예 2> MC3T3 -E1 세포에서 인데엔 화합물이 조골세포 분화 마커 유전자 발현 및 신호 전달 경로에 미치는 영향 확인
KR-34893에 의해 유도되는 조골세포 분화 증진에 관여하는 분자 매커니즘을 연구하기 위해, KR-34893(10 μM)으로 자극하거나 자극하지 않은 MC3T3-E1 세포에서 유전자 발현 및 신호 분자의 인산화를 분석하였다.
먼저, KR-34893에 대한 반응으로 MC3T3-E1의 조골세포 분화를 확인하기 위해, ALP 및 알리자린 레드 S 염색하고, 마커 유전자 발현 또한 분석하였다.
그 결과, 도 6A와 같이 KR-34893은 ALP 발현 및 무기염류 침적을 매우 증가시켰으며, 도 6B와 같이 Runx2, Alp, OC 및 Bsp (bone sialoprotein)와 같은 조골세포 분화 마커 유전자의 발현 역시 증가되었다.
한편, BMPs가 조골세포 마커 유전자의 발현을 자극하는 것으로 보고되어 짐에 따라, 병행 세트에서 Bmp 유전자의 발현을 분석하였다[A. Yamaguchi, K. Sakamoto, T. Minamizato, K. Katsube, S. Nakanishi, Regulation of osteoblast differentiation mediated by BMP, Notch, and CCN3/NOV, Japanese Dental Science Review 44(1) (2008) 48-56.].
그 결과, 도 6D와 같이 1일째에 KR-34893에 의해 Bmp2, Bmp4 및 Bmp7의 발현이 유도되었으며 특히, Bmp7는 대조군과 비교하여 2.7 배로 현저하게 발현이 유도된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 단백질 수준을 확인한 결과, 도 6E와 같이 Bmp7 단백질 수준은 KR-34893에 의해 매우 증가되었으나, Bmp2 및 Bmp4 단백질 수준은 변화가 나타나지 않는 것으로 확인됨에 따라, Bmp7은 KR-34893의 주요 분자 타겟 중 하나인 것으로 제안될 수 있다.
또한, KR-34893은 1일째에 BMP의 하위 전사 인자인 SMAD1/5/8의 강한 인산화를 유도하는 것이 확인되었다. 이에 따라, BMP7는 기능적이며, 자가분비 또는 측분비 방식으로 작용하는 것으로 제안될 수 있다.
다음으로, KR-34893에 의해 BMP7 발현 증가가 유도되는 세포 내 신호 매커니즘을 이해하기 위해, MC3T3-E1 세포에서 다양한 신호 분자의 인산화를 분석하였다.
이전 보고에 따르면, 세포 외 신호조절 키나아제(ERK) 1/2, p38 (also known as mitogen-activated protein kinase 14), SMAD1/5/8, JNK 및 MEK1/2의 활성화가 BMP7의 발현에 관여하는 것으로 확인됨에 따라, 상기 유전자에 미치는 KR-34893 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 7과 같이 MC3T3-E1 세포에서 KR-34893은 대조군과 비교하여 5 내지 10분 이내에 MEK1/2와 ERK1/2의 인산화를 강하게 자극하였으나, AKT, p38 및 JNK의 인산화에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터 KR-34893은 MEK1/2 및 ERK1/2의 인산화를 통하여 BMP7의 발현을 유도하는 것이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하며, 상기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 조골세포의 분화를 촉진하고, 파골세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 골 재생 및 골 형성용 약학조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019001195303-pat00015

    [화학식 2]
    Figure 112019001195303-pat00016

    [화학식 3]
    Figure 112019001195303-pat00017
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 암의 골전이, 골괴사, 골용해(osteolysis), 골결손, 치조골 결손, 또는 내분비 이상에 의해 초래되는 뼈 손상 또는 이상 부위의 골 재생 및 골 형성을 유도하는 것을 특징으로 하는 골 재생 및 골 형성용 약학조성물.
  4. 하기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하며, 상기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물은 조골세포의 분화를 촉진하고, 파골세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 골 재생 및 골 형성용 건강식품.
    [화학식 1]
    Figure 112019501728580-pat00018

    [화학식 2]
    Figure 112019501728580-pat00019

    [화학식 3]
    Figure 112019501728580-pat00020
  5. 하기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하며, 상기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물은 생체 외(in vitro)에서 골 전구세포의 조골세포로의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 조골세포분화 촉진용 시약조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019501728580-pat00021

    [화학식 2]
    Figure 112019501728580-pat00022

    [화학식 3]
    Figure 112019501728580-pat00023
  6. 하기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하며, 상기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물은 생체 외(in vitro)에서 골 전구세포의 뼈 형태 형성단백질(bone morphogenetic protein; BMP) 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 BMP 유전자 발현 증가용 시약조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019501728580-pat00024

    [화학식 2]
    Figure 112019501728580-pat00025

    [화학식 3]
    Figure 112019501728580-pat00026
  7. 삭제
KR1020170139274A 2017-10-25 2017-10-25 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물 KR101959636B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170139274A KR101959636B1 (ko) 2017-10-25 2017-10-25 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물
PCT/KR2018/012731 WO2019083301A1 (ko) 2017-10-25 2018-10-25 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170139274A KR101959636B1 (ko) 2017-10-25 2017-10-25 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101959636B1 true KR101959636B1 (ko) 2019-07-04

Family

ID=66246971

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170139274A KR101959636B1 (ko) 2017-10-25 2017-10-25 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101959636B1 (ko)
WO (1) WO2019083301A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050100052A (ko) * 2004-04-13 2005-10-18 한국화학연구원 인덴 유도체 및 이의 제조방법
KR20130128302A (ko) 2012-05-16 2013-11-26 서울대학교산학협력단 뮤라밀-다이펩타이드를 포함하는 골소실 예방, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2861735D1 (en) * 1977-08-05 1982-05-27 Kabi Ab Geminally disubstituted indene derivatives, processes for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US6903238B2 (en) * 2001-12-13 2005-06-07 Wyeth Substituted indenones as estrogenic agents
US9185909B2 (en) * 2007-09-17 2015-11-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Synthesis of resveratrol-based natural products
KR101149529B1 (ko) * 2009-09-11 2012-05-25 한국화학연구원 인덴온 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050100052A (ko) * 2004-04-13 2005-10-18 한국화학연구원 인덴 유도체 및 이의 제조방법
KR20130128302A (ko) 2012-05-16 2013-11-26 서울대학교산학협력단 뮤라밀-다이펩타이드를 포함하는 골소실 예방, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019083301A1 (ko) 2019-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. The effect of quercetin delivery system on osteogenesis and angiogenesis under osteoporotic conditions
Oliveira et al. Milk extracellular vesicles accelerate osteoblastogenesis but impair bone matrix formation
Ying et al. Myricetin enhances osteogenic differentiation through the activation of canonical Wnt/β-catenin signaling in human bone marrow stromal cells
US20190314288A1 (en) Porous polymer microspheres for preventing or treating soft tissue diseases and method for manufacturing the same
KR101759725B1 (ko) 지골피추출물로부터 분리된 디하이드로파세익 애시드 쓰리프라임-오-베타-디-글루코피라노사이드를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물
JP2018532784A (ja) 低増殖性障害の治療のための化合物
KR101656834B1 (ko) 콜포신 다로페이트를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR101959636B1 (ko) 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR101686872B1 (ko) Tlr4에 lps와의 경쟁적 결합을 통한 항산화 및 항염증 활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 의학적 용도
Chen et al. Synergistic effect of Wnt modulatory small molecules and an osteoinductive ceramic on C2C12 cell osteogenic differentiation
US20210147482A1 (en) Peptide for inhibiting bone resorption
KR102063962B1 (ko) 캄펜을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2011007135A1 (en) Use of pro-inflammatory compounds for promoting bone formation
KR102445386B1 (ko) 안트라퀴논을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR102158980B1 (ko) 아젤라인산을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101799533B1 (ko) 텍토리게닌을 포함하는 골 형성 촉진용 조성물
KR102015488B1 (ko) 트리메틸피라진을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102139994B1 (ko) 스티그마스테롤을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101984541B1 (ko) 유칼립톨을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102161111B1 (ko) 리나로올을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN116120335B (zh) 作为Wnt信号通路激动剂的莪术醇衍生物及其制法和应用
KR101677967B1 (ko) 아미노벤조에이트 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR102393730B1 (ko) Fstl1을 유효성분으로 함유하는 골 충진용 조성물
KR101306408B1 (ko) 진세노사이드 Ｒｄ를 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 조성물
권준오 Effects of cyclic dipeptides on the musculoskeletal system and gut microbiota