WO2019083301A1 - 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물

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WO2019083301A1
WO2019083301A1 PCT/KR2018/012731 KR2018012731W WO2019083301A1 WO 2019083301 A1 WO2019083301 A1 WO 2019083301A1 KR 2018012731 W KR2018012731 W KR 2018012731W WO 2019083301 A1 WO2019083301 A1 WO 2019083301A1
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bone
alkyl
formula
active ingredient
pharmaceutical composition
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박의균
김주앙
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경북대학교 산학협력단
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    • A23V2200/306—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on bone mass, e.g. osteoporosis prevention

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inducing osteogenesis and for preventing or treating bone diseases, which comprises an indene derivative as an active ingredient.
  • Bone tissue constitutes the cartilage and skeletal system. It plays a role of support and muscle attachment by mechanical function, protects organism and bone marrow, and preserve calcium and phosphorus to maintain homeostasis. These bone tissues consist of various kinds of cells such as collagen, glycoprotein, and osteoblast, osteoclast, and osteocyte. Osteoblasts derived from bone marrow stromal cells play a major role in osteogenesis, and osteoclasts derived from hematopoietic stem cells are responsible for the destruction or aging of osseous bone, And maintain bone remodeling due to cell balance.
  • Bone metabolic disease is caused by the breakdown of osteoclast and osteoblast in vivo.
  • An example of a bone metabolic disease is osteoporosis.
  • Osteoporosis is a disease in which the bone is easily broken even in a slight impact due to a decrease in total bone mass due to an increase in osteoclast activity compared with osteoblast.
  • metastatic tumors with metastatic tumors rheumatoid arthritis, degenerative arthritis, and periodontal disease that causes the alveolar bone destruction by infection of bacteria.
  • Bone metabolic diseases, etc. are caused by excessive activation of osteoclasts, which easily breaks the bone.
  • the osteoclast progenitor is a hematopoietic cell of the monocyte / macrophage lineage originating from the bone marrow.
  • the osteoclast precursor is differentiated into osteoclasts by the bone marrow-derived growth factors and cytokines (Roodman G. D., Endocr. Rev., 17, 308-332 (1996)).
  • Osteoblast is formed from mesenchymal stem cells.
  • the mineralization including calcium which is formed by osteoblast differentiation, not only maintains bone strength but also plays an important role in the maintenance of calcium and hormone metabolism throughout the body .
  • Calcium accumulation by osteoblast differentiation is regulated by vitamin D and parathyroid hormone, and it is known that bone morphogenetic protein (BMP), Wnt, MAP kinase, calcineurin-modulinkinase (ALP) and type I collagen (type I) associated with the differentiation of osteoblasts by cross-talk of various signal transduction systems such as calcineurin-calmodulin kinase, NF- ⁇ B and AP- 1 collagen is synthesized in the early stage of differentiation and osteopontin associated with mineralization and osteocalcin are synthesized to make bone formation by osteoblast differentiation.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • Wnt Wnt
  • MAP kinase MAP kinase
  • ALP calcineurin-modulin
  • BMU bone multicellular units
  • the present invention provides a composition containing an indeene compound as an active ingredient that promotes osteoblast differentiation and inhibits osteoclast differentiation and is intended to be used as a pharmaceutical composition for promoting osteogenesis induction or for treating bone diseases and as a health food .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for bone regeneration comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R 1 is any one selected from the group consisting of (C 1 -C 4) alkyl and (C 1 -C 4) alkoxy, and R 2 And R < 3 > are each independently (C1-C4) alkyl and X is NH or O;
  • the present invention provides a health food for bone regeneration comprising the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases, which comprises a compound represented by the following general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a health food for preventing or ameliorating bone diseases, which comprises a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition containing an indene compound as an active ingredient.
  • the compound promotes differentiation of osteoblasts and inhibits osteoclast differentiation. Therefore, Or a pharmaceutical composition for therapeutic use, or a health food for prevention or improvement.
  • Figure 1 shows the structure of an indene derivative compound.
  • FIG. 2 shows the results of alizarin red S staining, which confirmed the level of mineralization on day 28 after incubation of human BMSCs in an osteogenic medium with or without indene derivatives.
  • FIG. 3 shows the structure of KR-34893 and the structure of KR-34893.
  • FIG. 3B shows the structure of KR-34893, and bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) 2-yl) -2,5-diphenyl tetra-sodium bromide).
  • BMSCs bone marrow mesenchymal stem cells
  • 3C shows the results of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol- Human BMSCs were cultured on day 28, stained with alizarin red S, extracted with dye, analyzed at 570 nm absorbance and compared with the control group (** P ⁇ 0.01) Reverse transcription PCR (RT-PCR) analysis of mRNA levels of RUNX2, ALP, COL1A1, ON, OPN, OC, and BSP, After the mouse skull cells were cultured in the medium, the cells were stained with alizarin red S on the 14th day, And, Figure 3F by RT-PCR results confirming the mRNA levels of osteoblast differentiation marker genes in the 7 days of culture KR refers to the KR-34893.
  • RT-PCR Reverse transcription PCR
  • FIG. 4 shows the effect of KR-34893 on adipocyte differentiation.
  • human BMSCs were cultured in a fat-derived differentiation medium containing various concentrations of KR-34893, stained with oil red O on day 14, And analyzed at 500 nm absorbance.
  • KR means KR-34893.
  • FIG. 5 shows the results of treatment of mouse bone marrow cells with M-CSF and RANKL for 4 days in the presence of 1.0, 2.5, and 5.0 ⁇ M KR-34893 in order to confirm the osteoclast differentiation inhibitory effect of KR-34893
  • 5A is an image obtained by staining the cells with 20 ⁇ by TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase)
  • FIG. 5B is a result of confirming the number of TRAP-positive multinucleated cells with more than 3 nuclei (** p ⁇ 0.01 versus the vehicle-treated control).
  • FIG. 5C is a result of confirming TRAP activity at a wavelength of 405 nm
  • FIG. 5D is a result of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) in which mRNA expression levels of osteoclast-associated formazan-related genes are confirmed.
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • FIG. 6 shows the effect of KR-34893 compound on ALP, mineralization and osteoblast differentiation.
  • FIG. 6A shows that MC3T3-E1 cells were cultured in osteogenic medium (OSM) containing 10 ⁇ M KR-34893 6B shows the results of Runx2, Alp, Col1a1, Oc, and Kd at 6 days in the presence or absence of 10 [mu] M KR-34893.
  • FIG. 6C is a Western blot image showing the levels of Oc and Alp proteins using ⁇ -actin as an internal control on the 7th day of culture.
  • FIG. 6D shows real-time RT-PCR results of confirming the expression levels of Bmp2, Bmp4, and Bmp7 on the first day of incubation under the condition that 10 ⁇ M KR-34893 is present or absent.
  • FIG. 4E shows the results of real- As a result of western blot confirming the expression level of Bmp7, * p ⁇ 0.05, *** p ⁇ 0.01, and *** p ⁇ 0.001 as compared with the control, and KR means KR-34893.
  • FIG. 7 shows the effect of KR-34893 on the phosphorylation of intracellular signaling molecules.
  • MC3T3-E1 cells were cultured for 24 hours in the absence of serum, and KR-34893 (10 ⁇ M) or dimethylsulfoxide (DMSO)
  • KR-34893 10 ⁇ M or dimethylsulfoxide (DMSO)
  • OSM osteogenic medium
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for bone regeneration comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R 1 is any one selected from the group consisting of (C 1 -C 4) alkyl and (C 1 -C 4) alkoxy, and R 2 And R < 3 > are each independently (C1-C4) alkyl and X may be NH or O.
  • the compound promotes osteoblast differentiation and inhibits osteoclast differentiation.
  • the compound can induce bone regeneration in a bone defect site caused by bone metastasis of cancer.
  • the present invention can provide a health food for bone regeneration comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases, which comprises a compound represented by the following formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R 1 is any one selected from the group consisting of (C 1 -C 4) alkyl and (C 1 -C 4) alkoxy, and R 2 And R < 3 > are each independently (C1-C4) alkyl and X may be NH or O.
  • the above-mentioned bone diseases include osteolysis caused by bone metabolic diseases such as osteomalacia, rickets, osteopenia and calcium control abnormality, bone degeneration of cancer cells or wear debridement of artificial joints, secondary diseases caused by endocrine diseases or drugs Secondary bone loss, Paget disease, bone defect, alveolar bone defect due to periodontitis, osteonecrosis, and fibrous osteitis.
  • bone metabolic diseases such as osteomalacia, rickets, osteopenia and calcium control abnormality
  • bone degeneration of cancer cells or wear debridement of artificial joints secondary diseases caused by endocrine diseases or drugs Secondary bone loss, Paget disease, bone defect, alveolar bone defect due to periodontitis, osteonecrosis, and fibrous osteitis.
  • the present invention can provide a health food for preventing or ameliorating a bone-reducing disease comprising the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • compositions according to the present invention may further comprise suitable carriers, excipients or diluents conventionally used in the production of pharmaceutical compositions.
  • Examples of carriers, excipients or diluents usable in the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories and sterilized injection solutions according to a conventional method .
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
  • Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, ), Lactose, gelatin and the like.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • suspending agent examples include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like.
  • suppository base examples include witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may be increased or decreased depending on the route of administration, degree of disease, sex, weight, age, and the like.
  • the dosage amounts are not intended to limit the scope of the invention in any manner.
  • the pharmaceutical composition may be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, and the like in a variety of routes. All modes of administration may be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intratracheal, intrauterine or intracerebroventricular injections.
  • the indene compound of the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • the salt an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful.
  • free acid inorganic acid and organic acid can be used.
  • inorganic acid hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, sulfurous acid, phosphoric acid and the like can be used.
  • organic acid citric acid, acetic acid, maleic acid, fumaric acid, , Acetic acid, glycolic acid, succinic acid, tartaric acid, 4-toluenesulfonic acid, galacturonic acid, embonic acid, glutamic acid, citric acid and arpartic acid.
  • hydrochloric acid is used as the inorganic acid
  • methanesulfonic acid is used as the organic acid.
  • the indene compounds of the present invention include not only pharmaceutically acceptable salts, but also all salts, hydrates and solvates which can be prepared by conventional methods.
  • the addition salt according to the present invention can be prepared by a conventional method.
  • the indene compound of formula (1) is dissolved in a water-miscible organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, acetonitrile or the like, Or by adding an aqueous acid solution of an inorganic acid, followed by precipitation or crystallization. Subsequently, in this mixture, a solvent or an excess acid is evaporated and dried to obtain an additional salt, or the precipitated salt may be produced by suction filtration.
  • the health functional food may be provided in the form of powder, granules, tablets, capsules, syrups or beverages.
  • the health functional food may be used together with other food or food additives other than the compound represented by the formula (1) Can be suitably used according to the method of
  • the amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to its use purpose, for example, prevention, health or therapeutic treatment.
  • the indene compound of the formula (1) contained in the health functional food may be used in accordance with the effective dose of the pharmaceutical composition.
  • the active ingredient can be used in an amount of more than the above range because there is no problem in terms of safety.
  • BMSCs Human bone marrow mesenchymal stem cells
  • human bone marrow samples were diluted with phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4, and the layers were separated by histopaque (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for concentration gradient. Then, mononuclear cells were collected by centrifugation and the collected cells were washed twice with PBS.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Alpha-MEM medium containing 10% fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin, and 100 ⁇ g / mL streptomycin (all purchased from Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) And the mononuclear cells collected by the above method were dispensed into the plate, and cultured at 37 ° C and 5% CO 2 for 12 hours. The unattached cells were then removed and the attached cells were collected into the BMSC fraction and expanded for further analysis.
  • the growth medium was changed once every three days and all experiments were performed with cells within 5 passages.
  • the growth medium was supplemented with 10 nM dexamethasone (Dex), 50 ⁇ g / mL ascorbic acid (AA) and 10 mM ⁇ -glycerophosphate ( ⁇ -GP)
  • the osteogenic medium (OSM) was constructed.
  • MC3T3-E1 cells were cultured in ⁇ -MEM medium containing 10% fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin, and 100 ⁇ g / mL streptomycin (all purchased from Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) (OSM) to induce osteoblast differentiation.
  • OSM streptomycin
  • Anti-bone morphogenic protein (BMP) 2, anti-BMP4 and anti-BMP7 antibodies were purchased from Cusabio (College Park, MD, USA) and anti-alkaline phosphatase (ALP) antibodies were purchased from R & D systems , USA).
  • JNK C-Jun NH2-terminal kinase
  • human BMSCs were inoculated at a density of 1 ⁇ 10 5 cells per 35-mm dish (50% confluence) containing the growth medium, stabilized overnight, cultured medium containing KR-34893 I replaced it with an OSM that was not included.
  • Inoculated with MC3T3-E1 cells in a density of the growth medium is 7 ⁇ 10 4 cells per well of a frequency divider 24 well plate containing the following day, inde culture medium yen derivative or only was replaced with OSM equal volume of DMSO.
  • the cells were first washed with 1 ⁇ PBS, fixed with 70% ethyl alcohol at room temperature for 20 minutes, washed with water, and then incubated with alizarin red S (40 mM, pH 4.2) Lt; / RTI >
  • the dyed dye was extracted with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 10% cetylpyridinium chloride and the absorbance was confirmed at 560 nm.
  • ALP staining was performed according to the manufacturer's instructions (Sigma Aldrich).
  • osteoblast differentiation was induced.
  • bone marrow macrophages from C57B6 / L mice were treated with 20 ng / mL of RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) and 10 ng of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) in the presence or absence of KR- / mL for 4 days and then stained with tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP).
  • RANKL receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • MNCs TRAP-positive multinucleated cells with three or more nuclei were counted as osteoclast-like cells.
  • PCR was carried out using specific primers, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and mouse ⁇ -actin (Actb) were used as internal controls.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Actb mouse ⁇ -actin
  • Quantitative real time PCR was performed on a LightCycler 1.5 system (Roche Diagnostics, Rot Regen, Switzerland) using SYBR® Premix Ex Taq TM (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).
  • the denaturation step was followed by 40 cycles at 95 ° C for 5 seconds, followed by heating and cooling at 60 ° C for 30 seconds and extension at 72 ° C for 30 seconds.
  • MC3T3-E1 cells were inoculated into a growth medium which had been divided into 60-mm dishes, and cell confluence was confirmed, and the medium was replaced with ⁇ -MEM (without ascorbic acid) containing 0.3% FBS.
  • the cells were stimulated with OSM medium containing KR-34893 and 0.3% FBS, and the reaction was terminated by repeatedly washing twice with ice-cold PBS.
  • MC3T3-E1 cells were treated with 1 ⁇ Zymography buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% glycerol, 2% SDS, 0.0025% bromophenol blue) And ultrasonicated for 30 seconds.
  • the membrane was blocked (blocked) with non-specific binding by incubation with 3% skim milk in TBS-T (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl and 0.1% Tween 20).
  • the membrane and primary antibody were incubated.
  • the membrane was washed 3 times with TBS-T, incubated with secondary antibody, and the protein was identified using Absignal TM enhanced chemiluminescent substrate (Abclone, Seoul, Korea).
  • indene compound increased ALP expression in MC3T3-E1 cells.
  • the indene compounds shown in FIG. 1 were all mineralized, and the mineralization by KR-34893 compound was the highest.
  • KR-34893 compound was confirmed to be a compound that strongly stimulates osteoblast differentiation of MC3T3-E1 cells.
  • human BMSCs were treated with KR-34893 at 0, 1, 2.5, 5, and 10 ⁇ M for 7 days and MTT assay Respectively.
  • KR-34893 showed no cytotoxicity in human BMSCs up to a concentration of 10 ⁇ M.
  • KR-34893 dose-dependent increase in inorganic salt deposition of human BMSCs was confirmed as shown in FIG. 3C. Also, as shown in Fig. 3D, KR-34893 markedly increased the expression of osteoblast differentiation markers.
  • KR-34893 greatly increased deposition of inorganic salts in primary osteoblast cells of mouse as shown in Fig. 3E.
  • Expression of osteoblast differentiation marker gene including Runx-related transcription factor 2, Alp, Ocn and Col1 Respectively.
  • KR-34893 promotes osteoblast differentiation in human BMSCs and mouse primary osteoblasts.
  • KR-34893 did not regulate fat production of human BMSCs as shown in Fig.
  • KR-34893 markedly decreased TRAP activity, while slightly reduced the expression of osteoclast marker genes such as Trap, Dcstamp (dendrocyte expressed seven transmembrane protein) and Ctsk (cathepsin k).
  • KR-34893 greatly increased ALP expression and inorganic salt deposition, and expression of osteoblast differentiation marker gene such as Runx2, Alp, OC, and Bsp (bone sialoprotein) was also increased as shown in FIG. 6B .
  • BMP7 protein level was greatly increased by KR-34893 as shown in Fig. 6E, but BMP2 and Bmp4 protein levels showed no change.
  • Bmp7 is a major molecular target of KR-34893 It can be proposed to be one.
  • KR-34893 was found to induce strong phosphorylation of SMAD1 / 5/8, a sub-transcription factor of BMP, on the first day. Accordingly, BMP7 is functional and can be suggested to act in a self-secretion or side secretion manner.
  • KR-34893 strongly stimulated phosphorylation of MEK1 / 2 and ERK1 / 2 within 5 to 10 minutes compared to the control group in MC3T3-E1 cells as shown in FIG. 7, but did not affect phosphorylation of AKT, p38 and JNK .
  • KR-34893 induces the expression of BMP7 through phosphorylation of MEK1 / 2 and ERK1 / 2.

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Abstract

본 발명은 인데엔(indene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 골 재생 유도 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 화합물은 조골세포의 분화를 촉진하고, 파골세포의 분화를 억제할 수 있으므로 골 재생 또는 골 형성을 유도하여 골질환 예방 또는 치료용 약학조성물 또는, 예방 또는 개선용 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 재생 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 인데엔(indene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 골 재생 유도 및 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체 기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 이러한 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포, 파골세포 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 조골세포는 골 형성에 주된 역할을 담당하며, 조혈모세포로부터 유래 되는 파골 세포는 파괴되거나 노화된 골의 흡수를 담당하므로, 이를 통해 조골세포와 파골세포의 균형에 의한 골의 재형성(remodeling)을 유지하게 된다.
골 대사성 질환은 생체 내에서 파골 세포와 조골세포의 평형이 깨짐으로써 발생한다. 골 대사성 질환의 예로써 골다공증을 들 수 있는데 골다공증은 조골세포에 비하여 파골 세포의 활성이 증가함으로써 총 골량(total bone mass)이 감소하면서 경미한 충격에도 뼈가 쉽게 부서지게 되는 질환을 말한다. 이 외에도 종양이 전이된 전이성 암, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염 및 세균의 감염에 의해 치조골의 파괴를 유발하는 치주질환 등이 있다. 골 대사 질환 등은 파골 세포가 과도하게 활성화되어 뼈를 쉽게 파괴하는 결과를 초래하게 된다.
파골 세포 전구체(osteoclast progenitor)는 골수에서 기원하는 단핵세포/대식세포(monocyte/macrophage) 계통의 조혈세포(hematopoietic cell)이다. 파골세포 전구체는 골수에서 생성되는 성장인자와 사이토카인에 의해 파골세포로 분화된다 (Roodman G. D., Endocr. Rev., 17, 308-332 (1996)).
조골세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성되는데 조골 세포의 분화에 의해 형성되는 칼슘 등을 포함한 무기질화는 뼈의 세기를 유지시켜줄 수 있을 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 하고 있다. 조골세포의 분화에 의한 칼슘 축적은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 세포 내에서 뼈 형태 형성단백질(bone morphogenetic protein; BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호 전달 체계의 상호 작용(cross-talk)에 의해 조골세포의 분화에 관련된 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP)와 타입 Ι 콜라겐(type 1 collagen)이 초기 분화단계에서 합성된 후, 무기질화에 관련된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin) 등이 합성됨으로써 조골 세포의 분화에 의한 골 형성이 이루어진다고 알려져있다.
그러나 이러한 인체의 골은 형성과 재형성 과정을 통해 항상성을 유지하며, 골의 재형성은 조골세포 및 파골세포로 구성된 골 다세포성 단위체(bone multicellular unit: BMU)에서 일어나며 이들 세포는 각각 조골 형성과 골 흡수 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져있다. 이 과정에서의 두 세포 간 협력체계에 손상이 올 경우 다양한 골 대사성 질환이 발병하게 되지만 현재까지 완치를 위한 효과적인 치료법이 없는 실정이다.
본 발명은 조골세포 분화를 촉진하고 파골세포 분화를 억제하는 활성을 나타내는 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하여, 골 재생 유도 촉진 또는 골 질환 치료용 약학조성물 및 건강식품으로 사용하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 재생용 약학조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018012731-appb-I000001
상기 화학식 1에서,
상기 R1은 (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, R2 및 R3은 각각 독립적으로 (C1-C4)알킬이며, X는 NH 또는 O 임.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 재생용 건강식품을 제공한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명은 인데엔 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상기 화합물은 조골세포의 분화를 촉진하고, 파골세포의 분화를 억제할 수 있으므로, 골 재생 또는 골 형성을 유도하여 골 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 또는, 예방 또는 개선용 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인데엔 유도체 화합물의 구조이다.
도 2는 인데엔 유도체가 처리되거나 처리되지 않은 골형성 배지에서 사람 BMSCs를 배양한 후 28일째에 무기질화 수준을 확인한 알리자린 레드 S 염색 결과이다.
도 3은 KR-34893의 구조 및 골 형성능을 확인한 결과로, 도 3A는 KR-34893의 구조이며, 도 3B는 KR-34893 존재하에서 각 시간대 별로 사람 골수줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cell; BMSCs)의 생존능을 확인한 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-sodium bromide) 분석 결과이며, 도 3C는 KR-34893가 처리되거나 처리되지 않은 골형성 배지에서 사람 BMSCs를 배양한 후 28일째에 알리자린 레드 S를 염색한 후 염료를 추출하여 570nm 흡광도에서 분석하고 대조군과 비교한 결과이며 (**P < 0.01), 도 3D는 분화 7일째에 조골세포 분화 특이적 유전자인 RUNX2, ALP, COL1A1, ON, OPN, OC, 및 BSP의 mRNA 수준을 확인한 역전사 PCR (reverse transcription PCR; RT-PCR)분석 결과이며, 도 3E는 5 μM KR-34893가 포함된 골형성 배지에서 생쥐 두개골 세포를 배양한 후 14일째에 알리자린 레드 S로 염색하여 6×로 얻은 이미지이며, 도 3F는 배양 7일째에 조골세포 분화 마커 유전자의 mRNA 수준을 확인한 RT-PCR 결과로 KR은 KR-34893을 의미한다.
도 4는 KR-34893의 지방세포 분화효과를 확인한 결과로, 사람 BMSCs를 다양한 농도의 KR-34893이 포함된 지방생성 분화배지에서 배양하고 14일째에 오일 레드 O로 염색한 후 메탄올로 염료를 용해시키고 500 nm 흡광도에서 분석한 결과이며 KR은 KR-34893을 의미한다.
도 5는 KR-34893의 파골세포(osteoclast) 분화 억제 효과를 확인하기 위해, 1.0, 2.5, 및 5.0 μM KR-34893 존재 하에서 생쥐 골수세포에 M-CSF 및 RANKL를 4일간 처리한 결과로, 도 5A는 상기 세포를 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색하여 20×로 촬영하여 얻은 이미지이고, 도 5B는 3핵 이상의 TRAP 양성 다핵거대세포(multinucleated) 수를 확인한 결과이다 (**p < 0.01 versus the vehicle-treated control). 도 5C는 405nm의 파장 길이에서 TRAP 활성을 확인한 결과이며, 도 5D는 파골세포 포르마잔과 관련된 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인한 역전사 PCR (RT-PCR) 결과이다.
도 6은 KR-34893 화합물이 ALP, 무기물화 및 조골세포 분화에 미치는 영향을 확인한 결과로, 도 6A는 MC3T3-E1 세포를 10 μM KR-34893가 포함되거나 포함되지 않은 골형성 배지(OSM)에서 배양한 후 7일째, 14일째에 각각 ALP 및 알리자린 레드 S 염색을 수행한 결과이고, 도 6B는 10 μM KR-34893가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 6일째에 Runx2, Alp, Col1a1, Oc, 및 Bsp 유전자의 발현을 확인한 실시간 역전사 PCR 분석결과이며, 도 6C는 배양 7일째에 β-액틴을 내부 대조군으로 사용하여 Oc 및 Alp 단백질 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 6D는 10 μM KR-34893가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 배양 1일째에 Bmp2, Bmp4, 및 Bmp7의 발현 수준을 확인한 실시간 RT-PCR 결과이며, 도 4E는 배양 1일째에 Bmp2, Bmp4, 및 Bmp7의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과로, 대조군과 비교하여 *p < 0.05, ***p < 0.01, 및 ***p < 0.001 값을 나타내며, KR은 KR-34893을 의미한다.
도 7은 세포 내 신호분자의 인산화에 미치는 KR-34893의 영향을 확인한 결과로, MC3T3-E1 세포를 혈청이 없는 조건에서 24시간 배양한 후 KR-34893 (10 μM) 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 포함된 골형성 배지(OSM)를 처리하고 각 시간대 별로 AKT, MEK1/2, ERK1/2, SMAD 1/5/8, p38, JNK 및 Runx2의 인산화 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과로, β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였으며, KR은 KR-34893을 의미한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 재생용 약학조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018012731-appb-I000002
상기 화학식 1에서,
상기 R1은 (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, R2 및 R3은 각각 독립적으로 (C1-C4)알킬이며, X는 NH 또는 O 일 수 있다.
보다 상세하게 상기 화합물은 조골세포의 분화를 촉진하고, 파골세포의 분화를 억제할 수 있다.
이에 따라, 상기 화합물은 암의 골전이에 의해 초래되는 뼈 결손 부위의 골 재생을 유도할 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 재생용 건강식품을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018012731-appb-I000003
상기 화학식 1에서,
상기 R1은 (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, R2 및 R3은 각각 독립적으로 (C1-C4)알킬이며, X는 NH 또는 O 일 수 있다.
상기 골 질환은 골연화증, 구루병, 골감소증, 칼슘조절이상 등의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debrid) 등에 의해 초래되는 뼈의 용해(osteolysis), 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골손실(secondary bone loss), 파젯병(Paget disease), 골결손, 치주염에 의한 치조골 결손, 골괴사 및 섬유성 골염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 감소성 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다.
비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 인데엔 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 무기산으로는 염산, 유기산으로는 메탄설폰산을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 인데엔 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 인데엔 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품은 유효성분인 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품에 함유된 상기 화학식 1의 인데엔 화합물은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예 1> 세포 및 시약
사람 골수중간엽 줄기세포(Human bone marrow mesenchymal stem cells; BMSCs)를 이미 보고되어진 방법으로 분리하였다(E.K. Park, et, al., 2004).
먼저, 사람 골수 시료를 인산완충식염수(phosphate-buffered saline; PBS), pH 7.4로 희석하고 농도 구배를 위해 histopaque (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)로 층을 분리하였다. 그 후 원심분리하여 단핵세포(mononuclear cell)를 수집하고 수집된 세포를 PBS으로 두 번 세척하였다.
10% 태아소혈청, 페니실린 100 U/mL, 및 스트렙토마이신 100 μg/mL (all purchased from Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)이 포함된 α-MEM(minimum essential medium Eagle- alpha modification)배지가 분주되어 있는 플레이트에 상기 방법으로 수집된 단핵세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 12시간 동안 배양하였다. 그 후 부착되지 않은 세포를 제거하고 부착된 세포는 BMSC 분획으로 수집한 후 추가 분석을 위해 세포를 확장시켰다.
3일에 한번 씩 성장 배지를 교체하였으며 모든 실험은 5 패시지 이내의 세포로 수행되었다.
성장 배지에 10 nM 덱타메타손(dexamethasone; Dex), 50 μg/mL의 아스코르브산(ascorbic acid; AA) 및 10 mM의 β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate; β-GP)를 첨가하여 골형성 배지(osteogenic medium; OSM)를 구성하였다.
MC3T3-E1 세포를 10% 태아소혈청, 페니실린 100 U/mL, 및 스트렙토마이신 100 μg/mL (all purchased from Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)이 포함된 α-MEM 배지에서 배양하고 골형성 배지(OSM)를 이용하여 조골세포 분화를 유도하였다.
상기 Dex, AA, β-GP 및 alizarin red S를 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였으며, 도 1과 같은 인데엔(indene) 유도체의 라이브러리를 한국화학연구원(the Korean Research Institute of Chemical Technology)으로부터 제공받았다.
모든 약은 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시켜 사용하였다. 항-골형성단백질(BMP)2, 항-BMP4 및 항-BMP7 항체는 Cusabio (College Park, MD, USA)에서 구입하였으며, 항-알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP) 항체는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
항-Runx2 (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, USA), 항-phospho SMAD1/5/8 (Merck Millipore Corp., Darmstadt, Germany), 항-phospho-c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 항-phospho ERK1/2 (Bethyl laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA), 항-phospho MEK1/2 (Cell Signaling Technology), 항-phospho p38 (Cell Signaling Technology), 및 항-β-액틴 (Sigma-Aldrich) 항체를 웨스턴 블롯에 사용하였다.
<실험예 2> 골형성 분화 및 알리자린 레드 S 염색
조골세포 분화 유도를 위해, 사람 BMSCs를 성장 배지가 포함된 35-mm 디쉬(50% confluence) 당 1 × 105 세포 밀도로 접종하고, 하룻밤 동안 안정화시킨 후, 배양 배지를 KR-34893가 포함되거나 포함되지 않은 OSM으로 교체하였다.
MC3T3-E1 세포를 성장 배지가 분주된 24 웰 플레이트의 각 웰 당 7 × 104 세포의 밀도로 접종하고 다음 날, 배양 배지를 인데엔 유도체가 포함되거나 동량의 DMSO만 포함된 OSM으로 교체하였다.
배양 14일 후 무기화작용을 확인하기 위해 알리자린 레드 S 염색을 수행하였다.
알리자린 레드 S 염색을 위해, 먼저 세포를 1 × PBS로 세척하고 70% 에틸알콜로 20분간 실온에서 고정하고, 물을 이용하여 세척한 후 세포를 알리자린 레드 S(40 mM, pH 4.2)로 10분간 염색하였다.
그 후 물을 이용하여 5번 세척하여 염색되지 않은 염색액을 제거하였다.
10% 세틸피리디늄클로라이드가 포함된 0.1 M 인산 완충액(pH 7.0)으로 염색된 염료를 추출하고 560 nm에서 흡광도를 확인하였다.
또한, ALP 염색은 제조사의 설명서에 따라 수행되었다(Sigma Aldrich).
종래에 보고된 방법에 따라, 조골세포 분화를 유도하였다.
먼저, C57B6/L 생쥐로부터 얻은 골수 대식세포를 KR-34893 존재 또는 비존재 조건에서 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) 20 ng/mL 및 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor) 10 ng/mL로 4일간 배양한 후 타타르산염 내성 산성 인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphatase; TRAP)로 염색하였다.
셋 또는 더 많은 핵을 가진 TRAP 양성 다핵세포(multinucleated cells; MNCs)를 파골세포 유사 세포로 계수하였다.
<실험예 3> 반정량적 및 정량적 RT-PCR
사람 BMSCs 및 MC3T3-E1 세포를 KR-34893가 포함되거나 DMSO만 포함된 골형성 배지(OSM)에서 적절한 시간으로 배양하고, Tri reagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 후 Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 1 μg의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
반정량적 PCR를 위해, 다음과 같은 열적 사이클링 파라미터를 사용하였다: 95℃에서 2분 후 95℃에서 60초간 적절한 수의 사이클을 진행하고, 적합한 가열냉각(annealing) 온도에서 60초, 72℃에서 90초 후 72℃에서 10분간 최종 신장(extension)을 진행하였다.
모든 PCR 생성물은 2% 아가로스 겔 전기영동 후 에티디움 브로마이드 염색을 이용하여 시각화하였다.
PCR은 특이적인 프라이머를 사용하여 수행하였으며, 사람 글리세르알데히드-3-인산디히드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH) 및 마우스 β-액틴(Actb)을 내부 대조군으로 사용하였다.
SYBR® Premix Ex Taq™ (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 이용하여 LightCycler 1.5 system (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland)으로 정량적 실시간 PCR을 수행하였다.
95℃에서 30초간 초기 변성 단계 후 변성(denaturation) 단계로 95℃에서 5초간 40 사이클을 진행하고 60℃에서 30초간 가열냉각 및 72℃에서 30초간 신장을 진행하였다.
<실험예 4> 신호작용 분자를 위한 인산화반응 분석
MC3T3-E1 세포를 60-mm 디쉬에 분주된 성장 배지에 접종하고, 세포 합류를 확인한 후 0.3% FBS가 포함된 α-MEM (without ascorbic acid)으로 배지를 교체하였다.
24시간 후 KR-34893과 0.3% FBS가 포함된 OSM 배지로 세포를 자극하고 얼음 같이 차가운 PBS로 두 번 반복 세척하여 반응을 종료하였다.
단백질 분석을 위해, MC3T3-E1 세포에 1×자이모그래피(Zymography) 버퍼 (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% glycerol, 2% SDS, 0.0025% bromophenol blue)를 처리하고, 세포 용해물을 30초간 초음파 처리하였다.
BCA protein assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 이용하여 각 샘플의 단백질량(20 μg 단백질)을 확인하고, β-멀캅토에탄올(최종농도 5%)를 첨가하여 8% 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행한 후 니트로셀룰로스 막(Whatman, Florham Park, NJ, USA)에 옮겼다.
상기 막을 TBS-T (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 0.1% Tween 20)에 용해시킨 3% 탈지유로 인큐베이트하여 비특이적 결합을 차단(블로킹)하였다.
블로킹 후 막과 일차 항체를 인큐베이트한 후 막을 TBS-T로 3번 씻어내고 2차 항체와 인큐베이트한 다음 Absignal™ enhanced chemiluminescent substrate (Abclone, Seoul, Korea)를 이용하여 단백질을 확인하였다.
<실시예 1> 인데엔 화합물의 조골세포 분화 자극 효과 확인
조골세포 분화에 효과적인 신규 화합물을 확인하기 위해 한국화학연구원의 화합물 라이브러리를 스크리닝한 결과, 인데엔(indene) 화합물이 MC3T3-E1 세포 내 ALP 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 화합물의 무기질화 수준을 확인한 결과, 도 2와 같이 도 1의 인데엔 화합물들은 모두 무기질화 효과가 나타났으며, 특히, KR-34893 화합물에 의한 무기질화가 가장 높게 나타났다.
상기 결과로부터 KR-34893 화합물이 MC3T3-E1 세포의 조골세포 분화를 강력하게 자극하는 화합물인 것으로 확인되었다.
이에 따라, KR-34893의 세포 독성 및 사람 BMSCs의 조골세포 분화 효과를 확인하기 위해, 사람 BMSCs에 KR-34893을 0, 1, 2.5, 5, 및 10 μM 농도로 7일간 처리한 후, MTT 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3B와 같이 KR-34893은 10 μM 농도까지 사람 BMSCs에서 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 동일한 KR-34893 농도 조건으로 사람 BMSCs에서 KR-34893의 골형성 효과를 확인하기 위해, 자극 후 28일째에 무기염류 침적물 염색을 위해 알리자린 레드 S 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 3C와 같이 KR-34893 용량 의존적으로 사람 BMSCs의 무기염류 침적이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3D와 같이 KR-34893은 조골세포 분화 마커의 발현을 현저하게 증가시켰다.
또한, KR-34893은 마우스의 일차 조골세포에서 도 3E와 같이 무기염류 침적을 매우 증가시켰으며, Runx2 (Runt-related transcription factor 2), Alp, Ocn 및 Col1을 포함한 조골세포 분화 마커 유전자의 발현을 함께 증가시켰다.
상기 결과로부터 KR-34893은 사람 BMSCs와 마우스 일차 조골세포에서 조골세포 분화를 촉진시키는 것이 확인되었다.
반면, KR-34893의 지방세포 분화효과를 확인한 결과, 도 4와 같이 KR-34893은 사람 BMSCs의 지방 생성을 조절하지 않았다.
한편, 도 5A 및 도 5B를 참고하면 KR-34893의 용량 의존적으로 파골세포(Osteoclast) 분화가 급격히 억제되는 것이 확인되었으나, 작은 파골세포는 여전히 검출되었다.
또한, 도 5D와 같이 KR-34893은 TRAP 활성을 현저하게 감소시킨 반면, Trap, Dcstamp (dendrocyte expressed seven transmembrane protein) 및 Ctsk (cathepsin k)와 같은 파골세포 마커 유전자의 발현을 약간 감소시켰다.
< 실시예 2> MC3T3 -E1 세포에서 인데엔 화합물이 조골세포 분화 마커 유전자 발현 및 신호 전달 경로에 미치는 영향 확인
KR-34893에 의해 유도되는 조골세포 분화 증진에 관여하는 분자 매커니즘을 연구하기 위해, KR-34893(10 μM)으로 자극하거나 자극하지 않은 MC3T3-E1 세포에서 유전자 발현 및 신호 분자의 인산화를 분석하였다.
먼저, KR-34893에 대한 반응으로 MC3T3-E1의 조골세포 분화를 확인하기 위해, ALP 및 알리자린 레드 S 염색하고, 마커 유전자 발현 또한 분석하였다.
그 결과, 도 6A와 같이 KR-34893은 ALP 발현 및 무기염류 침적을 매우 증가시켰으며, 도 6B와 같이 Runx2, Alp, OC 및 Bsp (bone sialoprotein)와 같은 조골세포 분화 마커 유전자의 발현 역시 증가되었다.
한편, BMPs가 조골세포 마커 유전자의 발현을 자극하는 것으로 보고되어 짐에 따라, 병행 세트에서 Bmp 유전자의 발현을 분석하였다[A. Yamaguchi, K. Sakamoto, T. Minamizato, K. Katsube, S. Nakanishi, Regulation of osteoblast differentiation mediated by BMP, Notch, and CCN3/NOV, Japanese Dental Science Review 44(1) (2008) 48-56.].
그 결과, 도 6D와 같이 1일째에 KR-34893에 의해 Bmp2, Bmp4 및 Bmp7의 발현이 유도되었으며 특히, Bmp7는 대조군과 비교하여 2.7 배로 현저하게 발현이 유도된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 단백질 수준을 확인한 결과, 도 6E와 같이 Bmp7 단백질 수준은 KR-34893에 의해 매우 증가되었으나, Bmp2 및 Bmp4 단백질 수준은 변화가 나타나지 않는 것으로 확인됨에 따라, Bmp7은 KR-34893의 주요 분자 타겟 중 하나인 것으로 제안될 수 있다.
또한, KR-34893은 1일째에 BMP의 하위 전사 인자인 SMAD1/5/8의 강한 인산화를 유도하는 것이 확인되었다. 이에 따라, BMP7는 기능적이며, 자가분비 또는 측분비 방식으로 작용하는 것으로 제안될 수 있다.
다음으로, KR-34893에 의해 BMP7 발현 증가가 유도되는 세포 내 신호 매커니즘을 이해하기 위해, MC3T3-E1 세포에서 다양한 신호 분자의 인산화를 분석하였다.
이전 보고에 따르면, 세포 외 신호조절 키나아제(ERK) 1/2, p38 (also known as mitogen-activated protein kinase 14), SMAD1/5/8, JNK 및 MEK1/2의 활성화가 BMP7의 발현에 관여하는 것으로 확인됨에 따라, 상기 유전자에 미치는 KR-34893 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 7과 같이 MC3T3-E1 세포에서 KR-34893은 대조군과 비교하여 5 내지 10분 이내에 MEK1/2와 ERK1/2의 인산화를 강하게 자극하였으나, AKT, p38 및 JNK의 인산화에는 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터 KR-34893은 MEK1/2 및 ERK1/2의 인산화를 통하여 BMP7의 발현을 유도하는 것이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 재생용 약학조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018012731-appb-I000004
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1은 (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 (C1-C4)알킬이며,
    X는 NH 또는 O 임.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 조골세포의 분화를 촉진하고, 파골세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 골 재생용 약학조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 암의 골전이에 의해 초래되는 뼈 손상 부위의 골 재생을 유도하는 것을 특징으로 하는 골 재생용 약학조성물.
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 재생용 건강식품.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018012731-appb-I000005
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1은 (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 (C1-C4)알킬이며,
    X는 NH 또는 O 임.
  5. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018012731-appb-I000006
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1은 (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 (C1-C4)알킬이며,
    X는 NH 또는 O 임.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 골 질환은 골연화증, 구루병, 골감소증, 칼슘조절 이상 등의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debris) 등에 의해 초래되는 뼈의 용해(osteolysis), 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골소실(secondary bone loss), 파젯병(Paget disease), 골결손, 치주염에 의한 치조골 결손, 골괴사 및 섬유성 골염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 개선용 건강식품.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018012731-appb-I000007
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1은 (C1-C4)알킬 및 (C1-C4)알콕시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 (C1-C4)알킬이며,
    X는 NH 또는 O 임.
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